Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Домашнее и профилактическое лечение больных гемофилией; изменение иммунной системы и методы ее коррекции

РГ6 од

2 О МАО 1ВУЙ

На правах рукописи Копылов Константин Геннадьевич

ДОМАШНЕЕ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЕ ЛЕЧЕНИЕ БОЛЬНЫХ ГЕМОФИЛИЕЙ; ИЗМЕНЕНИЕ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ И МЕТОДЫ ЕЕ КОРРЕКЦИИ

14.00.29 - Гелштологня и переливание крови

А в тореферат

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 1996

Работа выполнена в Гематологическом научном Центре Российской Академии медицинских наук

Научный руководитель Доктор медицинских наук, профессор О.П. ПЛЮЩ

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор В.А. МАКАРОВ Доктор медицинских наук Р.П. МАНИШКИНА

Ведущее учреждение: Российский научно-исследовательский

институт гематологии и трансфузиологии (г.Санкт-Петербург).

Защита диссертации состоится "_"_ 1996 г. в_час.

на заседании диссертационного совета при Гематологическом научном центре РАМН, Москва, 125167, Новозыковский'проезд, 4а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ. Автореферат разослан "_"_1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

В.Д. Реук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследуемого направления обусловлена увеличением числа больных гемофилией (Casper С.К. at al., 1991; Rosendaal F.R., 1991), расширением возможностей хирургического лечения больных и необходимостью изменения тактики и стратегии консервативного лечения как заболевания в целом, так и геморрагических проявлений и инвалид!пирующих осложнений в связи с применением высокоочи-щенных внрусинактнвнрованных антигемофильных препаратов.

В связи с появлением высокоочищенных антигемофильных препаратов-концентратов факторов VIII и IX изменяется модель амбулатор-нополиклинической помощи для больных гемофилией, повысится эффективность гемостатической терапии, которая до настоящего времени является базовым методом лечения больных гемофилией.

Благодаря применению домашнего и профилактического лечения-больных гемофилией, значительно расширились возможности гемостатической терапии, но одновременно имеет место увеличение инфекционных и иммунологических осложнений, которые некоторые авторы связывают с постоянной перегрузкой аллоантигенами, нм-муномодулирующим действием ЦИК и трансмиссией вирусных агентов (Allain J.P.,1984; Brettler D.B. at al., 1989; Thorpe R. at al.,1989).

В отечественной литературе имели место публикации, в которых-были проанализированы некоторые иммунные изменения у больных гемофилией в процессе трансфузионной нагрузки.(Серебряная Н.Б., 1989; ПшощО.П., Манишкнна Р.П., 1990; Терехов Н.Т.нсоавт.,1990; Руденко В.П., 1991; Barkagan Z.S., 1987.).

Многие авторы отмечают прямое влияние антигемофильных препаратов на иммунную систему больных гемофилией, не инфицированных вирусом СПИДа. Изменения в иммунной системе могут носить достаточно индивидуальный характер (Gomperts E.D. and al., 1992).

У больных гемофилией выявлены нарушения в системе Т-лимфо-цитов и их иммунорегуляторныхсубпопз'лящш, Т-киллеров, гуморального иммунитета, системы фагоцитирующих мононуклеаров (Демидова Н.В. и др., 1989; AUain J.P.,1984; Addiego J. at al., 1993). Было отмечено уменьшение числа Т-хелперов (Ludlam С.A. at al., 1983; Cair R. at al.,1984; Antonaci S. at al.,1987; Freedman I. at al.,1987; Ragni M.V. at al, 1987). В то же время имеет место увеличение количества Т-супрессеров и снижение соотношения CD4/CD8. (Freedman I. at al., 1987; Gamba G., 1987).

Накоплен значительный материал, свидетельствующий о непосредственной связи в системе гемостаза, иммунитета и неспецифи-ческойрезистентности. Эта связь осуществляется через макрофага, лейкоциты, тромбоциты, сосудистую стенку, систему комплемента, про-стогландины, пнтерлейкины и систему интерферона, а также фиб-ронектин.(Андреев Ю.Н., 1988; Кузник Б.И. и соавт., 1989; Серебряная Н.Б. и соавт., 1989; Pfaff J.A. at al., 1993).

Однако, следует отметить, что результаты многочисленных исследований иммунного статуса больных гемофилией разнообразны и даже противоречивы. Некоторые авторы утверждают, что у больных гемофилией клеточный и гуморальный иммунитет не нарушен (Brieva J.A. at al., 1985; Provvse С., 1992; Funk М. at al., 1993). Другие авторы отмечают незначительные изменения гуморального иммунитета, в частности некоторое повышение иммуноглобулинов в ходе многолетней терапии концентратами факторов VIII средней степени очистки (Haemate HS, Faktor VIII STIM III). При этом не было обнаружено значительных изменений в субпопуляцни лимфоцитов: CD3; CD4; CD8; CD19; CD57, равно, как ив отношении CD4/CD8. (Ehrenforth S, at al., 1994).

Тем не менее, большинство исследователей считают, что гемофилии свойственны выраженные иммунные изменения иммунорегуля-ции, особенно в системе Т-лимфоцитов (Stein S.F. at al., 1985; Seifried E. at al., 1986; Caughman W.F. at al., 1990; Martin-Villar J., 1992; Lusher at al.,1993; Vulcano M. at al., 1993).

Таким образом, степень выраженности иммунологических изменений и возможности проведения иммунокоррегирующей терапии у больных гемофилией на фоне гемостатической терапии, а также отработка и внедрение в клиническую практику домашнего лечения в сочетании с профилактическим введением концентратов факторов VIII или IX являются актуальной и научно-практической проблемой современной гематологии, призванной улучшить качество диспансерного наблюдения и лечения больных гемофилией.

Целью настоящей работы явилось изучение состояния иммунной-системы и возможностей коррекции иммунных нарушений у больных гемофилией, которым осуществлялась интенсивная гемостатичес-кая терапия по программе домашнего и профилактического лечения.

Для достижения поставленной цели потребовалось решение следующих задач:

1. Определить эффективность и возможность применения домашнего лечения в сочетании с профилактическим введением концентратов факторов VIII/IX независимо от наличия или отсутствия геморрагического эпизода у больных с тяжелой формой гемофилии.

2. Обучить больных и их родственников внутривенным трансфу-зням антнгемофильных препаратов и ведению протокола в домашних условиях.

3. Изучить влияние домашнего и профилактического лечения на иммунную систему больных гемофилией, получающих длительное и массивное трансфузнонное лечение.

4. Разработать методы терапниу больных гемофилией, позволяющие коррегнровать иммунологические нарушения в процессе транс-фузионной нагрузки.

Научная новизна.

Осуществлена возможность применения в России программы домашнего лечения больных гемофилией в сочетании с профилактической терапией антигемофильными препаратами высокой степени очистки. Длительность лечения и динамического наблюдения составила более 3-х лет. Отработаны методы обучения больных самоинъекциям концентратов факторов VIII и IX, способы контроля правильности оценки геморрагических эпизодов н оказания помощи самим пациентом в домашних условиях. Разра ботан лечебный протокол, позволяющий контролировать и коррегнровать гемостатическую терапию.

Доказана высокая эффективность проводимой терапии, безопасность аллергических осложнений для пациентов (за 3 года среди 20 больных не наблюдалось ни одного случая аллергических осложнений на трансфузию концентрата фактора VIII/IX).

Определен иммунный статус больных гемофилией, получающих вирусинактивпрованные очищенные концентраты фактора VIII/IX в течение длительного времени в высоких дозах. При этом применялась иммунокоррегиругощая терапия, направленная на исправление патологии клеточного иммунитета больных гемофилией. Получены положительные результаты при иммунологической коррекции субпопуляций лимфоцитов. Выявлены нарушения в регуляторных субпопуляциях лимфоцитов с помощью иммунофенотипирования и определения антигенов различных кластеров дифференцировкп клеток лим-

фоидпого ряда у больных гемофилией в условиях многолетней транс-фузионной нагрузки до и после иммунокоррегирующего воздействия.

Научно-практическое значение работы состоит в том, что предложенные методы лечения больных - домашнее лечение, сочетаемое с профилактическим введением концентратов антигемофильных факторов позволяет качественно изменить течение заболевания, уменьшить частоту геморрагических эпизодов в 10 и более раз, значительно снизить интенсивность кровоизлияний и вызвать быструю регрессию гематомы (гемартроза), что позволяет избежать инвалидизи-рующих осложнений, дает возможность больным вести активный образ жизни, активно заниматься спортом.

Введение данной программы позволит снизить нагрузку на средний медицинский персонал, уменьшить вероятность трансмиссии вирусных агентов по схеме пациент-медицинская сестра/инструментарий - пациент.

Предложенные нами методы оценки выполнения домашней терапии самим пациентом, а также таблицы, объективно характеризующие функциональное состояние суставов, могут быть применены в амбулаторных условиях для контроля и эффективности оценки проводимой домашней терапии.

Иммунокоррешрующие методы воздействия могут использоваться как у больных гемофилией, лечение которых осуществляется криоп-ре-цнпитатом и свежезамороженной плазмой, так и у больных, получающих очищенные концентраты факторов VII1/1X в домашних условиях.

Апробации работы.

Апробация работы: Материалы диссертации доложены и обсуждены на II научной конференции "Актуальные вопросы клинической педиатрии, акушерства и гинекологии." (Киров, 1993); на конференции "Актуальные вопросы службы крови и трансфу-зиологии"(Санкт-Петербург, 1995). На XV Конгрессе "Тромбоз и гемостаз" (Израиль, 1995). На XXI (Мехико, Мексика 1995) и на XXII Конгрессах всемирной федерации гемофилии (Дублин, Ирландия, 1996).

Публикации: По теме диссертации опубликовано в центральной печати 7 печатных работ, одна методическая рекомендация.

Структура и объем диссертации. Диссертация представляет собой-рукопись объемом 105 страниц машинописного текста, и состоит из введения, 3 глав собственныхисследовашш, заключения,выводов, указателя использованной литературы, который содержит 158 наименований

работ, в том числе 7 отечественных и 151 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 11 таблицами, 3-мя графиками, 2-мя диаграмами.

Диссертация выполнялась в диспансерном научно-методическом отделении по гемофилии (руководитель - Плющ О.П.) и в лаборатории клинической иммунологии (руководитель - Булычева Т.И.) Гематологического научного центра РАМН (директор - Воробьев А.И.)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования.

Под наблюдением находилось 30 больных гемофилией, в возрасте от 6 до 40 лет, состоящих на учете в Диспансерном научно-методическом отделении по гемофилии Гематологического Научного центра РАМН.

Период наблюдения - 1992-1996 гг. Среди обследуемых больных -все лица мужского пола, страдающие тяжелой формой гемофилии.-Оценка тяжести гемофилии проведена в соответствии с классификацией, предложенной научной группой ВОЗ в 1975 г. Она предусматривает разделения тяжести течения гемофилии в зависимости от уровня дефицитного фактора: при тяжелой форме уровень дефицитного фактора ниже 2%, при средней тяжести -от 2 до 5%, при легкой форме заболевания - выше 5%.

Распределение больных по возрасту представлено в таблице N1.

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ БОЛЬНЫХ ПО ВОЗРАСТУ И ТИПУ ГЕМОФИЛИИ

Таблица № I

Кол-во больных Дети Взрослые Гемофилия

6-15 лет 16-20 21-30 31-40 А В

30 11 4 7 8 17 13

100% 37% 63% 57% 43%

Из 30 больных, 17 - страдают тяжелой формой гемофилией А, 13 пациентов с тяжелой формой гемофилии В.

Больные были распределены на две группы. В первую (I) группу-вошло 20 человек, лечение которых осуществлялось только концентратами факторов VIII и IX. Вторую группу (II) составили 10 больных гемофилией, лечение которых осуществлялось только криопре-ципитатом и свежезамороженной плазмой.

Отбор больных для участия в программе "Домашнего лечения" осуществлялся по следующим критериям:

- тяжелая форма заболевания (Фактор VIII/IX<1%);

- отсутствие ингибитора;

- возраст - старше 6 лет (что связано с техническими особенностями терапии);

- частые геморрагические эпизоды (> 12 за год);

- поражение опорно-двигательного аппарата, соответствующие I-II стадиям гемофилической артропатии;

- отсутствие пристрастия к алкоголю и наркотическим препаратам.

Обследование больных включало: клинические, коагулогические,-

иммунологические, биохимические, и серологические исследования,-Мы не останавливаемся подробно на описании, примененных нами методов, поскольку они достаточно подробно освещены в литературе.

На различных этапах настоящей работы у обследуемых больных изучалось состояние гемостаза в совокупности с изменениями иммунной системы после длительной трансфузионной нагрузки, применялась иммунокоррегирующая терапия и оценивались ее результаты.

Для оценки клинической результативности лечения нами были разработаны и внедрены в практику лечебные протоколы (приложение N1), позволяющие контролировать домашнее лечение и оценивать его эффективность. Один раз в 6 месяцев проводилась диспансеризация больных, определялась функциональное состояние суставов, для оценки которого использовались разработанные нами арт-рометрические таблицы (приложение N2).

В число лабораторных исследований входили:

1. Гемограмма;

2. Функциональные пробы печени /общий белок сыворотки крови, белковые фракции, билирубин, АЛТ, ACT, ЩФ, ЛДГ и другие/.

3. Коагулограмма, количественное определение факторов X, VII.;

4. Динамическое исследование содержания факторов VIII, IX поме-

тоду Kasper С.К.- с использованием отечественных и зарубежных (Finna Baxter M+D) реактивов на коагулометрах фирмы Amelung - КС-4, КС-10;

5. Определение титра ингибитора методом Bethesda /Kasper C.K. at al.: Thromb. Diathesis Haemoph. 34, 869 (1975));

6. Определение антител к вирусам гепатитов В, С, HIV /методом ELISA/;

Для оценки состояния иммунной системы наших пациентов, а также определение эффективности проводимой нами им му н ом о ду;ц ip ую -щей терапии проводилось определение уровня сывороточных иммуноглобулинов (IgA, IgM, IgG) методом радиальной нммуноднффу-зни; выявление субклассов иммуноглобулинов класса G; изучение фагоцитарной активности нейтрофилов; определение содержания ЦИК путем их осаждения 3,5% раствором полиэтнленглнколя - 6000;

Иммунофенотнпированне лнмфоидных клеток проводили в микролуночной модификации реакции непрямой иммунофлтооресценщш с использованием па ноли моноклональных антител (МКА) к антигенам различных кластеров дифференцировки (CD) клеток лнмфоид-ного ряда (Гематол. и трансфузиологня N4.,1990 г., стр. 10-16). Исследование проводилось в лаборатории клинической иммунологии ГНЦ РАМН (Булычева Т.П.)

Панель состояла из отечественных, и зарубежных образцов МКА,-выявляю щнх длфферешшровочные airnnxmi следующих клеток: незрелых н зрелых клеток Т - лимфоидного ряда (CD: la, 2, 3, 5, 4, 8, 38, 71); незрелых и зрелых клеток В - лимфоидного ряда (CD: 10, 19,20, 22, HLA-DR); ранних гемопоэтических предшественников и активаци-онных клеток (CD: 34, 38, 71, HLA-DR); NK-клеток (CD 16). В качестве вторичных антител при постановке реакции пспользовали-ФИТЦ-меченные F(ab) - фрагменты овечьих антител к IgG мыши (ТОО "Сорбент").

Многие исследования проводились в динамике в течение всего периода осуществления программы домашнего лечения, а также до ипосле применения иммунологических методов воздействия.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Во время диспансеризации мы проводили клинико-рентгеноло-гическое обследование детей и выявили ранние изменения в суставах, которые нарастали с возрастом: до 5 лет они встречались у 20%

больных, до 10 лет у 25%, с 11-16 лет - у 30% больных. Многократно-рецидивирующие кровоизлияния приводили к I-II-III стадиям поражения, причем переход в III стадию - необратимую у большинства детей наблюдался в возрасте с 11 до 16 лет. Учитывая это обстоятельство мы считали целесообразным начинать профилактическое лечение у детей с раннего возраста.

Домашнее лечение позволяет осуществлять эффективную гемоста-тическую терапию у больных гемофилией, т.к. при появлении ранних симптомов геморрагии пациент самостоятельно проводит внутривенную трансфузию концентрата фактора VIII (или IX), в дозе которая заранее определена лечащим врачом.

Для обучения больных внутривенным трансфузиям концентрата фактора VIII/IX нам потребовалось 2 - 4 недели.

В процессе домашнего лечения 10 больных гемофилией А и 10 больных гемофилией В внрусинактивированиыми концентратами факторов VIII/IX (в течение 3-х лет было выполнено 4 760 трансфузии) не было отмечено ни одного случая посттрансфузионных осложнений или развития ингибитора к фактору VIII/XI.

Домашнее лечение, сочетаемое с профилактическим введением высокоочищенных антигемофнльных препаратов способствовало уменьшеншо количества гемартрозов (до единичных за год), что вызывало регрессшо активности хронических синовитов за счет отсутствия рецидивов гемартрозов в один и тот же сустав.

При этом у детей наблюдалась компенсация функциональных нарушений в пораженных суставах. На наш взгляд это было связано не только с проводимой гемостатической терапией, но и с увеличением динамической физической нагрузки, что привело к уснлеииго связочно-мышеч-ного апарата и перераспределению нагрузки с костного скелета на мышечную массу. Важную роль имеет также компенсаторный рост костной ткани в условиях отсутствия, или незначительно выраженных признаков воспалительных изменений в ранее пораженном суставе.

Доза АГ препарата подбиралась индивидуально для каждого пациента. Она определялась, с одной стороны, периодом биологической инактивации присущим, данному концентрату фактора VIII/IX in vivo, который в свою очередь может определяться не только молекулярной структурой фактора VIIÍ/IX, но и особенностями биохимической утилизации, и развитостью мнкроциркуляторного русла, и способности эндотелия сосудов реципиента к аккомуляции фактора VIII.

Длительность профилактического введения АГ препаратов в домашних условиях составляла 6-12 месяцев, при этом концентрат фактора VIII/IX вводился независимо от наличия геморрагических проявлений. Концентрат фактора VIII назначался в дозе 20-40 Ед/кг каждый 2-3-й день, а концентраты фактора IX - 20-40 Ед/кг каждый 3-4 день.

Схема считалась подобранной, если спонтанные кровоизлияния в суставы, в которых до профилактического лечения имел место выраженный хронический синовнт, более не возникали. Частота проявления геморрагических эпизодов до начала лечения в 1-ой группе больных составляла 3-5 раз в месяц. Через 2-3 недели после начатой терапии кровоизлияния возникали в среднем 1 раз в 3 месяца, однако наблюдались случаи, когда геморрагические эпизоды не возникали в течение 6-9 месяцев.

Мы проанализировали количество обострений итрансфузнп в течение одного года до начала и в первый год домашнего лечения 10 больных с гемофилией А и 10 пациентов с гемофилией В (Группа I).

Благодаря проводимому профилактическому лечению концентратами фактора VIII (продолжительностью от 1 до 3 месяцев) у больных гемофилией А удалось снизить среднее чисто трансфузии на одного пациента со 105 (за 12месяцев амбулаторного лечения криопрещшитатом) до 62 (при домашнем лечении в сочетании с профилактическим введением концентрата фактора VIII в течение последующих 12 месяцев).

У больных с гемофилией В (в первой группе) существенной разницы между количеством инъекций до и после "домашнего лечения" не отмечалось. Это обусловлено тем, что группу больных гемофилией В в основном составляли дети, у которых отмечались частые гемартрозы (в некоторых случаях более 40 геморрагических эпизодов за год), в связи с чем им было назначено длительное профилактическое лечение в домашних условиях с учетом индивидуальных особенностей.-Приэтом среднее количество геморрагических эпизодов снизилось с 34 (за 1992 г.) до 9 в 1993 году.

Во второй группе у пациента М. через 9 недель после профилактического введения криопрецшпггата появился ингнбнтор к фактору VIII в титре 1,65 Бт. Ед., в связи с чем гемостатическая терапия была прекращена и назначено лечение преднизолоном per os в дозе 30 мг в день (вес 52 кг) в течение одного месяца. На фоне терапии кортикостероидами больному провели 4 сеанса шмзмафереза с одновременным изъятием 1000 мл плазмы и замещением р-ром 5% глюкозы, альбумином 20% (график N 1).

В связи с малой эффективностью лечебных мероприятий больному была назначена терапия внутривенным иммуноглобулином (график N2). Графические изменения титра ингибитора и его дальнейшая элиминация представлена на графиках N1, 2.

Цифрами на графике 2 обозначены номера (соответствующие количеству внутривенных трансфузий иммуноглобулина в дозе 5 г (125мг/кг)). Трансфузии осуществлялись ежедневно в течение 5-ти дней. На 22 день ингибитор к фактору VIII в плазме больного не определялся. Вторая точка графика соответствует пробе, взятой через час после трансфузии иммуноглобулина. Остальные точки графика соответствуют пробам, взятым через сутки после введения иммуноглобулина, т. е. непосредственно перед очередной трансфузией.

График 1

ИЗМЕНЕНИЯ ИНГИБИТОРА К ФАКТОРУ VIII У БОЛЬНОГО М. П. 16 ЛЕТ В ПРОЦЕССЕ ЛЕЧЕНИЯ ПРЕДНИЗОЛОНОМ И ПЛАЗМАФЕРЕЗОМ

Титр

ингибитора (Ед. Ег.)

Следует отметить, что перед применением внутривенного иммуноглобулина in vivo, определили способность иммуноглобулина блокировать биологическую активность ингибитора к фактору VIII у больного М. in vitro.

Определение ингибитора проводили методом Bethesda с уменьшением инкубационного периода до одного часа (Kasper C.K. at al. //Thromb. Diathesis Haemorh. -1975. -Vol. 34. -P. 869), при этом определяли его уровень после инкубации в 6-ти пробах (первая пробирка титровалась иммуноглобулином соответственно 0,01, 0,02 и 0,05 г. иммуноглобулина на 1 мл плазмы, вторая служила контролем и титровалась буфером Мнхаэлиса). Между вторыми пробирками былополу-чено снижение титра ингибитора в 2,1 раза. Рассчитав объем плазмы больного (при весе 50 кг он составляет 2050 мл),мы назначили введение иммуноглобулина в дозе 0,02 г /мл плазмы (что соответствует 0,1 г/кг), т. к. первое разведение не дало значительного снижения титра ингибитора (он снизился лишь в 1,3 раза), а третье разведение хоть и привело к снижению в 1,8 раза титра ингибитора, однако такие высокие дозы иммуноглобулина в терапевтическом плане у достаточно им-муносенсибилизированного пациента вызывали опасения из-за возможности развития анафилактических реакций. Снижение титра ингибитора, полученное in vivo и in vitro в основном совпадают, что на наш взгляд свидетельствует о возможности внутривенного иммуноглобулина непосредственно связывать ингибитор к фактору VIII. Однако, учитывая факт полиморфизма ингибитора у разных пациентов, мы не можем однозначно утверждать, что подобная терапия будет эффективна во всех случаях.

До начала терапии и в ходе ее осуществления проводилось ежедневное определение содержания сывороточных иммуноглобулинов, ЦИК, токсичность плазмы и фагоцитоз. Мы выявили изменения в соотношении субклассов иммуноглобулинов G4 и G3, происшедшие через 15 минут после первой внутривенной трансфузии иммуноглобулина. При этом исчезновение IgG4 мы связываем с механизмом взаимодействия экзогенного иммуноглобулина с эндогенным по принципу идиотип-антиидиотип, что может свидетельствовать о принадлежности anti-FVIII /возможно его части/ к иммуноглобулинам G4 субкласса, одновременно в этой же пробе обнаружено уменьшение биологической активности ингибитора в 2 раза.

График 2

ЭЛИМИНАЦИЯ ИНГИБИТОРА К ФАКТОРУ VIII У БОЛЬНОГО М. В (ВЕС 50 КГ.) ПРОЦЕССЕ ЛЕЧЕНИЯ ВНУТРИВЕННЫМ ИММУНОГЛОБУЛИНОМ

ингибитор к FVIII (Ед-Ег.) 1

оЧШШШо

£0 22 ДНИ

Цифрами обозначены номера трансфувий внутривенного иммуноглобулина в доэе 5 г. (125 мг/кг).

Пооте окончаши курса лечения внутривенным иммуноглобулином мы отметили позитивные изменения иммунной системы, а именно -активация фагоцитоза в ходе 2-3-4-5-х суток лечения и нормализация основных показателей фагоцитоза на 8-е сутки после начала лечения, а также снижение содержания ЦИК в 2 раза. Функциональная активизация клеточного иммунитета и фагоцитарной активнос-

ти может быть обусловлена как прямым воздействием внутривенного иммуноглобулина на мембраны иммунокомпетентных клеток, так и через активацию комплемента.

После проведенного лечения в течение 8-ми дней ингибитор не появлялся, однако на 9-й день его титр вновь составил 1 Ед.Бт., несмотря на то, что гемостатическая терапия не проводилась.

В течение 3-х недель титр ингибитора колебался от 0,3 до 1,0 Ед.Бт. и затем исчез. В течение 18 последующих месяцев он не определялся. Подобное отсроченное действие иммуноглобулина описывается в мировой литературе, однако механизмы этого явления остаются до конца не ясными.

Влияние длительной траисфузионной терапии на иммунный статус больных гемофилией с целью последующей иммунокоррекции было изучено в двух группах больных, лечение которых проводилось на протяжении 3-х лет.

Известно, что основной причиной иммунологической дестабилизации является заместнтельно-трансфузионная терапия (Плющ О.П. и соавт.,1990; Терехов и соавт.,1990, Руденко В.П.,1991). Учитывая это, мы провели расчеты по расход)' антигемофильных препаратов в группе тематических больных за последний год "домашнего лечения" (таб.2, 3). Подобный обьем траисфузионной терапии (более 100 ООО Ед.концентрата фактора VIII и более 60 000 Ед. концентрата фактора IX в среднем на больного в год) в процессе домашнего и профилактического лечения, не имел аналогов в Российской практике и странах СНГ, поэтому нам представлялось чрезвычайно важным изучение наиболее уязвимого звена нарушений иммунной системы у больных гемофилией - изменения в иммунорегуляторных субпопуляциях лимфоцитов, концентрации сывороточных иммуноглобулинов ДО, ^М и ЦИК.

Объем гемостатической терапии, получаемый больными второй группы, представлен в таблице N 4.

КОЛИЧЕСТВО КОНЦЕНТРАТА ФАКТОРА VIII, ЗАТРАЧЕННОЕ В ХОДЕ ДОМАШНЕГО ЛЕЧЕНИЯ НА БОЛЬНЫХ ГЕМОФИЛИЕЙ В (ГРУППА I) В ТЕЧЕНИЕ ГОДА.

За год терапии домашнего лечения было израсходовано 1 млн. 17 тысяч Ед. концентрата фактора VIII. Средний расход на одного пациента составил 101 700 Ед/год или 1768,3 Ед/кг/год на одного пациента (средний вес 61 кг).

№ Вес (кг) Количество )актора VIII

Ед. Ед/кг/год

1. 70 146 000 1933

2. 65 82 000 1262

3. 75 160 000 2133

4. 70 176 000 2500

5. 25 63 000 2520

6. 98 215 000 2193

7. 20 48 500 2425

8. 20 32 000 1600

9. 86 48 000 558

10. 85 47 500 559

КОЛИЧЕСТВО КОНЦЕНТРАТА ФАКТОРА IX, ЗАТРАЧЕННОЕ В ХОДЕ ДОМАШНЕГО ЛЕЧЕНИЯ НА БОЛЬНЫХ ГЕМОФИЛИЕЙ В (ГРУППА I) В ТЕЧЕНИЕ ГОДА.

За год терапии домашнего лечения было затрачено 614 700 Ед. концентрата фактора IX. Средний расход на одного пациента составил 61 470 Ед. за годовой период, или 1614,9 Ед/кг/год на одного пациента при среднем весе 38 кг.

№ Вес (кг) Количество фактора IX

Ед. Ед/кг/год

11. 18 20 500 1139

12. 22 36 000 1636

13. 17 21 000 1235

14. 30 55 200 1838

15. 25 49 000 1960

16. 40 70 000 1750

17. 72 120 000 1667

18. 68 115 000 1691

19. 65 83 000 1277

20. 23 45 000 1956

КОЛИЧЕСТВО АНТИГЕМОФИЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ЗАТРАЧЕННЫХ НА ЛЕЧЕНИЕ БОЛЬНЫХ П-ОЙ ГРУППЫ В ТЕЧЕНИЕ ГОДА

№ Вес (кг) Тип гемофилии Содержание РУШ/1Х в плазме (%) Количество АГ препарата, затраченное в течение года

криопреципнтат (в дозах) кнп (в дозах)

21. 48 А <1 68 —

22. 50 • А <1 216 —

23. 66 А <1 187 —

24. 89 А = 1 62 —

25. 65 А <1. 26 —

26. 72 А <1 120 —

27. 70 В <1 — 86

28. 68 В <1 — 44

29. 72 В = 1 — 39

30. 65 В <1 — 52

В среднем на одного больного б год 113,2 55,25

Особое внимание мы обращали на лиц, получивших максимально высокое количество АГ препаратов и имеющих наибольшие иммунологические отклонения. Им назначалась иммшнокоррсшрующая терапия.

Для этих целей мы использовали два вида иммунокоррекции:

- медикаментозный с применением препарата "МИЛАЙФ";

- физический - КВЧ-терапия.

Препарат "МИЛАЙФ", разработанный российской фирмой "ДИЖА" является натуральным, экологически чистым продуктом. Препарат представляет собой сухую биомассу мицелия высшего гриба РБ-64, полученную в условиях бнотехнологического индустриального производства при использовании традиционных углеводсодер-жащих сырьевых ресурсов (свекловичная и тростниковая масса). Выращивание грибов по определенной технологии позволяет получить препараты с заданным соотношением макро- и микроэлементов, и как следствие, избирательно влиять на системы организма при различных заболеваниях.

"МИЛАЙФ" является сложным комплексным препаратом, который содержит 18 аминокислот, в том числе такие незаменимые, как триптофан, лизин, метионин, аспаргиновая и глутаминовые кислоты. Содержание и распространение незаменимых аминокислот показывает, что первым лимитирующим из них комплексом является сумма метионин+цистин (в среднем степень лимитирования составляет 35%), что значительно лучше белка сои и дает преимущества перед другими растительными белками, приближаясь к животным белкам. Углеводы представлены бетта-гликанами, различными органическими кислотами, включая яблочную, лимонную, янтарную и др., из многоатомных спиртов - маннит. Липидная фракция состоит из фосфолипидов и ненасыщенных жирных кислот, 50% из которых приходятся на долю линоленовой кислоты, влияющей на синтез активных простогландинов, лейкотренов и тромбоксанов. По содержанию убихинона С?6 и <39 "МИЛАЙФ" не имеет аналогов в мировой практике. В препарате содержатся все витамины группы В, фо-лневая, никотиновая кислоты. Макроэлементы представлены фосфором, кальцием, калием, железом, а микроэлементы цинком, медыо, кобальтом, молибденом, марганцем в легко усвояемой форме.

Препарат "МИЛАЙФ" разрешен к применению Государственным комтетом санитарно-эпидемического надзора РФ N0 1-П/11-41 от 20.01.94 г., письма МЗ СССР N0 123-4/407-5 от 26.07.88 г., и сер-

тифицирован в соответствии с международными нормами агенст-вом "БОЕХ-ТЕЗТ" при ВО "Союзэкспертиза" /"БОЕХ'7, сертификат N0 029-2575. "МИЛАЙФ" назначался больным гемофилией как в первой, так и во второй группе при наличии иммунологических изменений / изменения в соотношении сывороточных иммуноглобулинов А, М, О; выраженные изменения в субпопуляциях Т- и В-лим-фоцитов/. Общая доза препарата, в качестве иммунокоррегирующе-го средста, рекомендуемая производителем - 70мг/кг массы тела в сутки делилась на 3 равных порции и принималась больными во время завтрака, обеда и ужина. Длительность лечения составляла для всех больных, независимо от выявленных иммунных изменений,- 30 дней.

Таким образом, иммунокоррегирующая терапия препаратом "МИЛАЙФ" была проведена 6-тп пациентам, страдающих тяжелыми формами гемофилии А и В (больные NN 1, 2, 22, 23, имеющие уровень фактора \ТП<1%, с множественными поражениями суставов (от 2 до 6) и больные NN 19 и 27 из второй группы с уровнем фактора 1Х<1% с деформирующими остеоартрозами локтевых, коленных и голеностопных суставов).

Больной N 2 страдал хроническим бронхитом, по поводу которого в течение 3-х месяцев получал медикаментозное лечение, включая антибиотики, без клинического эффекта. Рентгенологически отмечалось усиление легочного рисунка без признаков пневмонии. После проведенного курса Милайф-терапин состояние больного улучшилось, нормализовалась температура, исчезла потливость, кашель, к 30 дню после начатого лечения аускультативно прослушивалось везикулярное дыхание, влажные хрипы исчезли. Эффективное лечение "Милайфом" мы связываем с происшедшими иммунными изменениями клеточного и гуморального иммунитета, подтвержденных лабораторными исследованиями (таб.5)

Частота геморрагических эпизодов отслеживалась нами у всех больных за месяц до начала терапии, в течение 30 дней в ходе лечения и последующие 30 дней после полученного курса. Каких-либо существенных изменений выявлено не было (таб. N 6).

Таблица № 5

ДАННЫЕ ИММУНОФЕНОТИПИРОВАНИЯ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК КРОВИ БОЛЬНЫХ ГЕМОФИЛИЕЙ ДО И ПОСЛЕ ПРОВОДИМОГО ЛЕЧЕНИЯ

ПРЕПАРАТОМ "МИЛАЙФ"

Больной № Период обследования СШа % СЭ2 % С05 % соз % С04 % СР8 % СЦ4 / С08 С019 % С020 % С022 % ньд-ои сшо % С038 % С071 % С016 %

Г. До курса 0 48 46 78 28 42 1/1,5 25 33 27 19 0 6 1 13

после курса 0 46 63 67 44 28 1,9/1 6 13 4 31 0,5 1 0 0

2. до курса 6 53 53 45 32 43 1/1,4 30 36 20 21 0 23 5 18

после курса 0 38 37 62 35 30 1,2/1 18 23 12 22 1 28 2 16

19. до курса 1 64 52 61 30 21 1,4/1 19 32 15 19 0 9 0 16

после курса 2 60 71 60 35 20 1,7/1 16 14 13 13 1 19 0 10

22. до курса 1 30 18 47 29 24 1,2/1 16 34 17 39 0 21 0,5 9

после курса 0 70 63 64 25 31 1/1,2 3 25 18 10 0,5 26 0 7

23. до курса 2 37 19 33 21 14 1,5/1 30 50 36 50 0 13 2 23

после курса 0,5 53 39 46 19 18 1,1/1 31 19 18 26 0,5 32 0,5 8

27. до курса 0 73 63 68 43 32 1,3/1 9 14 8 15 0 19 0 23

после курса 1 61 52 65 40 31 1,3/1 22 22 23 25 0 19 8 17

Таблица № 6

ЧАСТОТА ГЕМОРРАГИЧЕСКИХ ЭПИЗОДОВ СРЕДИ ПАЦИЕНТОВ, ПОЛУЧАЮЩИХ ЛЕЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОМ "МИЛАЙФ"

Таблица демонстрирует отсутствие значительных изменений в частоте геморрагических эпизодов до-, в процессе и после лечения "Милайфом".

ПАЦИЕНТ №№ Количество геморрагических эпизодов

за месяц до терапии в ходе лечения после лечения

1 3 3 2

23 7 8 7

22 6 6 5

2 5 5 5

19 3 4 3

27 5 3 4

всего: 29 29 26

При контроле коагулограммы и количественном определении факторов II, V, VII, X, а также VIII и IX изменений не выявлено, поэтому мы считаем, что "Миланф" не влияет на гемостатический потенциал, что делает доступным применение данного препарата у больных гемофилией.

У больного N 22 отмечалась аллергическая реакция типа "крапивницы" (до начала лечения "милайф") на внутривенную трансфузию криопреципитата. В дальнейшем в течение двух последующих месяцев аллергических реакций на проводимую гемостатическую терапию у исследуемой группы больных не отмечалось, однако, мы не можем утверждать, что подобный эффект вызван препаратом "Милайф" ввиду малого количества наблюдений.

Субъективно все больные отмечали улучшение сна (пациенты N: 1, 2, 22, 23, 27), аппетита (1, 2, 19), уменьшение болевого син-

дрома при физических нагрузках в пораженных суставах, не связанного с кровоизлияниями (1, 22, 23), уменьшения чувства усталости и повышенной утомляемости (1, 19, 22, 27).

Антигенная композиция лимфоидных клеток крови 6 больных гемофилией до проведения лечения представлена в таблице N 5. У 80% больных до проведения курса терапии отмечалось снижение популяции зрелых Т-.шшфоцитов (CD2, CD3) с достаточно отчетливым снижением хелперов (CD4) практически у всех больных и повышением количества супрессеров (CD8) с нарушением соотношения CD4/CD8. В то же время отмечено повышение лимфоцитов с В-клеточнымн маркерами (CD19, 20, 22, HLA-DR). При этом у всех больных в крови отсутствовали клетки с маркерами ранних предшественников (CD10, 71, 1а) при нормальном количестве лимфоцитов с актива-ционными антигенами (CD38) и увеличении NK-клеток (CD 16).

В таблице N 5 отражены также показатели лпмфоидной популяции после 3aBq)UieHiM курса лечения "Мнлайфом". У четырех больных нормализовалось содержание общей Т-клеточной популяции (CD2, 3, 5), у одного больного наметилась тенденция к повышеншо количества Т-клеток. Отмечалось также улучшение соотношения популяций CD4/CD8 после проведенной терапии достигло нормальных значений, нормализовались основные показатели В-клеточной популяции (CD 19, 20, 22, HLA-DR).

У 4-х больных до начала курса терапии выявлялось повышение популяции лимфоцитов с антигеном активации CD38, после проведенного лечения у 3-х из них отмечалось дальнейшее увеличение количества клеток с данным маркером (больные 23, 22, 2). У одного больного было обнаружено повышение количества мононуклеаров с активационным антигеном CD38 при отсутствии на лимфоцитах до проводимой терапии.

У 4-х больных отмечено снижение содержания NK-позитивных клеток до нормальных значений.

Таким образом на основании полученных данных иммунофено-типнрования можно сделать вывод об эффективности использования милайф-терапии у больных гемофилией, как иммуномодулиру-гощего лечебного метода.

Вторым иммунокоррегирующим методом являлось применение КВЧ-терапии, т.е. физического метода воздействия на организм па-

циента с помощью электро-магнитных излучений крайне высоких частот (КВЧ) от 30 ГГц до 300 ГГц.

КВЧ-сигналы способны приводить в действие механизмы, исправляющие некоторые нарушения или сбои в работе органов и систем организма. Действующие извне на организм пациента КВЧ-излучения имитируют сигналы, вырабатываемые самим организмом; в этом случае они помогают ему быстрее и эффективнее устранять нарушения.

КВЧ-сигналы генерируются клеточными мембранами с так называемыми временными подструктурами, образующимися на их поверхности при нарушениях функционирования. (Голант М.Б. / Биофизика.-1989. -Т. XXXIV, вып.6. - с. 1007-1014.).

Известно, что КВЧ-воздействне приводит к стимуляции иммунной системы, которая проявляется в отсутствии или меньшей выраженности иммунодепрессин, при этом иммуномоделирующий эффект отмечается преимущественно в Т-лимфоцитарной системе (Н.Д. Де-вятков. - Ижевск: Удмуртия, 1991. сс.: 181-205.).

Нами было проведено изучение влияния КВЧ-терапии на иммунологический статус пациентов 1-ой и Н-ой групп с помощью аппарата "Лвь-1" с длиной волны 7,1 мм и плотностью потока мощности 10 мВт/кв.см. Рупор прибора с площадью раскрыва 2 кв.см располагался в области грудины на уровне второго ребра. Терапия осуществлялась ежедневно в течение 10 дней с перерывом на выходные (в целом 2 недели). Продолжительность одного сеанса составляла 30 минут, что соответствует общепринятым параметрам КВЧ-терапии в клинической практике.

Мононуклеарные клетки крови больных гемофилией были подвергнуты иммунофенотипированшо, как и при лечении препаратом "МИЛАЙФ". Забор крови проводился непосредственно перед началом КВЧ-терапии и через 3 дня после последнего сеанса.

На добровольной основе было отобрано 4 больных, получающих интенсивную гемостатическую терапию на протяжении 3-х последних лет (пациенты N011,12 /из первой группы/, 25 и 14 /из второй группы/). Количество пациентов ограничивалось с одной стороны желанием и возможностями самих пациентов (или их родителей), с другой стороны - высокой стоимостью проводимых лабораторных исследований по иммунофенотипированшо мононуклеарных клеток крови.

Полученные данные свидетельствуют об аналогичных изменениях в субпопуляциях лимфоцитов, которые происходили при лечении

Таблица № 7

ДАННЫЕ ИММУНОФЕНОТИПИРОВАНИЯ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК КРОВИ БОЛЬНЫХ ГЕМОФИЛИЕЙ ДО И ПОСЛЕ КВЧ-ТЕРАПИИ

Больной № Период обследования СШа % С02 % СЭ5 % соз % С04 % сох % С04/ С08 С019 % С020 % СШ2 % НЬА-ОЯ СО 10 % СШ8 % С071 % СШб %

11. до курса 0 7 23 21 11 12 1/1,1 6 52 27 44 0 21 3 20

после курса 0,5 21 33 34 3 15 1/5 30 37 23 28 0 10 0 22

12. до курса 0 18 19 25 0,5 15 1/30 13 76 23 44 0 17 0 7

после курса 0 50 67 50 26 19 1,2/1 21 17 2 2 0 1 0,5 2

14. до курса 8 50 48 47 20 33 1/1,6 40 42 32 44 3 48 2 19

после курса 5 58 52 63 42 31 1,4/1 26 21 23 34 1 39 1 8

25. до курса 1 69 70 74 3 57 1/19 20 29 20 6 0 3 0 0

после курса 2 30 29 49 37 21 1,8/1 22 28 15 22 0 14 0 20

препаратом "Мнлайф". До лечения КВЧ-воздействия мы выявили снижение Т-клеточной популяции у больных 11 и 12 и 25 в особенности за счет снижения Т-хелперов. Имеет место общее снижение пан-Т-клеточных антигенов (CD2, CD5). Одновременно отмечается активация В-клеточного иммунитета (увеличено содержание CD 19, CD20, CD22) с повышением NK-клеток.

После проведенного лечения электромагнитными волнами КВЧ-диапазона мы отмечаем значительное улучшение лабораторных показателей клеточного иммунитета: повышение CD4 и нормализация соотношения CD4/CD8, с общим нарастанием до нормальных значений Т-клеточной популяции. Изменяются соответствующим образом показатели В-клеточной популяции. Тем не менее следует отметить противоречивые результаты, полученные в отношении "натуральных киллеров" (CD 16): у больного N11 они не изменились и остались на высоком уровне, у пациента N12 их количество уменьшилось с нормальных значений до нижних границ нормы, а у N25 произошло резкое увеличение NK-клеток. У пациента N14 отмечено увеличение NK-клеток до терапии и незначительное их уменьшение после иммунокоррекцин с одновременным увеличением пролиферативной активности лимфоцитов (CD71).

Результаты иммунофенотиппрования мононуклеарных клеток крови представлены в таблице N 7.

В целом полученные результаты при использовании КВЧ-тера-пии схожи с результатами, которые мы получили при лечении препаратом "Милайфом".

Таким образом, на основании проведенных исследований можно сделать заключение о полной безопасности и высокой степени эффективности самотрансфузийконцентратов факторов VIII в домашних условиях, как непосредственно в случае обострений (домашнее лечение), так и с профилактической целью (домашнее профилактическое лечение). Однако, следует обращать внимание на изменения в субрегуляторных популяциях лимфоцитов (уменьшение Т-клеточной популяции, снижение Т-хелперов и повышение Т-супрессеров, увеличение сывороточных иммуноглобулинов М и G - классов), которые поддаются иммунокоррегирующему воздействию описанными ранее и проведенными нами методами.

В результате проведенных исследований разработана методика домашнего лечения, применены методы функциональной оценки по-

раженных суставов (артрометрнческие таблицы), разработан лечебный протокол, позволяющий контролировать домашнее лечение.

Домашнее лечение, сочетаемое с курсами профилактического введения высокоочищенных АГ препаратов, приводит к стойкой римис-сни заболевания, значительно снижает частоту обострений, препятствуя ранней инвалндизации больных, что является важной научно -практической задачей.

ВЫВОДЫ

1. Апробирована методика домашнего лечения в сочетании с профилактическим введением антигемофильных препаратов. Проведено обучение больных и родственников вну тривенным трансфузиям и веденшо лечебных протоколов в домашних условиях.

2. Домашнее и профилактическое лечение концентратами факторов VIII и IX снижает более чем в 10 раз частоту обострений, их тяжесть и благоприятно влияет на физическое состояние больных гемофилией.

3. Домашнее профилактическое лечение не привело к появлению ингибитора и не вызвало никаких "других осложнений, несмотря на периодичность трансфузий и большие однократные дозы препаратов.

4. Обнаружено количественное нарушение регуляторных субпопуляций лимфоцитов у больных гемофилией, выраженные независимо от возраста и степени очистки антигемофильных препаратов.

5. Применение иммунокоррегпрутощих методов: "Мнлайф" в дозе 70 мг/кг в сутки в течение 3-х недель приводит к исправлению имеющихся изменений в регуляторных субпопуляциях лимфоцитов.

6. Использование КВЧ-терашш (излучатель - "Явь-1") в стандартном иммунокоррегир>тощем режиме воздействия исправляет нарушения Т- и В- клеточного нммушггета, нормализуя соотношение CD4/CD8.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Копылов К.Г., Плющ О.П., Снегирева-Давыденко И.Б., Северова Т.В. // Профилактика геморрагических осложнений у детей, больных гемофилией// Мат. 2-й науч.конференции "Актуальныевопросы клин, педиатрии, акушерства и гинекологии"; Киров., 22-23 сентября 1993., с.80-82.

2. К.Г. Копылов, О.П. Плющ, И.Б. Снегирева-Давыденко / Гемостаз и профилактика гемофилии/ XV-th Congr.of Intern.Society on Thromb. and Haemost., June 11-16, p. 1039, 1995.

3. К.Г. Копылов, О.П. Плющ, И.Б. Снегирева-Давыденко, Т.В. Северова, Л.В. Букарева //Две программы профилактического лечения больных гемофилией // Тез. докл. рос. конф. "Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологип" (6-8 апреля 1995г.) - Санкт-Петербург, 1995, стр.144.

4. Kopylov K.G., Novikova M.S., Plyusch О.P., Boulycheva T.I. /Changes of limphocytes subpopulations regulators amoung haemo-philiapatients // XXII Int. Congr. of the World Federation of haemophilia., June 23/28, 1996, abstr. N 92.

5. О.П. Плющ, Л.М. Кудрявцева, К.Г. Копылов. Риск инфицирования больных гемофилией вирусными агентами, передающимися через трансфузии; XV-th Congr. of Intern. Society on Thromb. and Haemost., June 11-16, p. 1023, 1995.

6. Плющ О.П., Снегирева-Давыденко И.Б'., Копылов К.Г. // Профилактика геморрагии у детей больных гемофилией // Тез. докл. XXI Intern. Congr. of the WFH, Mexico city, 25-30 April 1994, p. 326.

7. Плющ О.П., Снегирева-Давыденко И.Б., Лаврова Г.Н., Кудрявцева Л.М., Копылов К.Г., Коняшина Н.И. и др. // Стоматологическое лечение больных гемофилией в амбулаторных условиях // Метод, рекомендации, - М., 1994. - С.22.

Приложение № 1

КРОВОИЗЛИЯНИЕ:

1. Локализация:.

2. Начало кровоизлияния:

число месяц год

3. Степень выраженности кровоизлияния:

4. Причина кровоизлияния:

Время:

часы минуты

а) Легкая.

б) Средняя.

в) Тяжелая.

а) Травма.

б) Спонтанное.

в) Другие причины.

5. Симптомы кровоизлияния:

а) болезненность;

б) отечность;

в) чувство давления, растирания;

г) ограничение движений;

д) локальная гипертермия кожи;

е) другие ощущения:_

ТРАНСФУЗИЯ

Концентрат введен: Зремя:

число месяц год часы минуты

Название препарата (фирма-производитель) число флаконов количество Ед. в одном флаконе №№ серии

Остаток препарата дома:

Название препарата (фирма-производитель) число флаконов количество Ед. в одном флаконе №№ серии

Подписано к печати 5.05.96 г. Тираж 100 экз. Заказ 703.

Типография Министерства Юстиции РФ.