Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние афобазола на тератогенный и генотоксический эффект циклофосфамида в эмбриональных тканях и плаценте крыс

На правах рукописи

Шредер Ольга Васильевна

ВЛИЯНИЕ АФОБАЗОЛА НА ТЕРАТОГЕННЫЙ И ГЕНОТОКСИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ЦИКЛОФОСФАМИДА В ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ТКАНЯХ И ПЛАЦЕНТЕ КРЫС

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2008

003458931

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологии имени В. В. Закусова РАМН

Научный руководитель:

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор, чл. корр. РАМН Дурнев Андрей Дмитриевич

кандидат медицинских наук Смольникова Нина Михайловна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор,

Воронина Татьяна Александровна

доктор медицинских наук, профессор Арзамасцев Евгений Вениаминович

Ведущая организация: ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН

Защита состоится «_»_2009 г. в «_» часов на заседании

диссертационного совета Д 001.024.01 при ГУ НИИ фармакологии имени В. В. Закусова РАМН по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной части ГУ НИИ фармакологии имени В. В. Закусова РАМН по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д. 8.

Автореферат разослан «_»_2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Вальдман Е.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Тератогенные воздействия имеют серьезные медицинские последствия и являются причиной невынашивания беременности (до 46,6 %), младенческой смертности и инвалидизации населения, которая среди детей и подростков в России составляет 190-210 случаев на 10 ООО человек (Васильева И.Ю., 2004; Новиков П.В., 2008).

Спектр тератогенов весьма обширен - это некоторые лекарства, косметические компоненты, экотоксиканты, производственные и бытовые вредности (Ла-зюк Г.И., 1991; Вахарловский В.Г., 1999; Коденцева В.М., 2002). В наиболее авторитетном каталоге, известном как «список Шепарда» (Shepard Т.Н., 1995), указывается на возможную опасность около 1200 распространенных потенциальных тератогенных факторов. При этом доказанную тератогенную опасность для человека, представляет около 50 факторов различной природы (Bishop J. В., Witt К. L., SloaneR. А., 1997).

Широкая распространенность тератогенов определяет неизбежность их контакта с человеком и необходимость внедрения мер по профилактике тератогенеза (Серов, В.Н., 2003; Васильева И.Ю., 2004; Кошелева, Н.Г., 2004; Кулешов, Н.П., 2004; Бицадзе В.О., 2007). Поиск фармакологических средств защиты от тератогенных воздействий согласуется с поставленной государственной задачей по охране репродуктивного здоровья населения России (Постановление общего собрания РАМН, 2008). Ее решение требует изучения механизмов тератогенеза и, на этой основе, возможных путей предупреждения и коррекции тератогенных воздействий (Липатов И.С., 2006; Плеханов Л. А., 2006; Стрижаков А.Н. и соавторы, 2006; Новиков П.В., 2008).

Особое внимание в области изучения тератогенеза привлекают генотоксикан-ты - вещества, вызывающие повреждения ДНК и мутагенез (Бочков Н.П., 2001). Роль мутагенеза в становлении тератогенных повреждений широко обсуждается, в настоящий момент имеются сведения, указывающие на тесную сопряженность тератогенных и мутагенных эффектов ряда соединений (Hook Е.В., 1981; Ferguson L.R., Ford J.H., 1997). В свою очередь, роль повреждений ДНК в тератогенезе практически не исследована из-за методических трудностей. Только с появлением метода «ДНК-комет», в модификациях, позволяющих оценивать ДНК по-

врежденность клеток различных тканей in vivo (Дурнев А.Д. и соавторы, 2006), открылись новые перспективы исследования генотоксических механизмов тератогенеза.

Возможная роль мутагенных поражений и повреждений ДНК в тератогенезе позволили предположить, что в качестве средств профилактики тератогенеза могут применяться вещества, обладающие антимутагенной активностью. В частности, лекарства, антимутагенная активность которых была установлена и исследована в НИИ фармакологии им. В.В. Закусова НИИ фармакологии РАМН (Дурнев А.Д., 2008).

В этой связи внимание привлекает новый отечественный анксиолитик афоба-зол, разработанный в ГУ НИИ фармакологии РАМН им. В.В. Закусова под руководством академика РАМН С.Б. Середенина и продемонстрировавший в экспериментах на млекопитающих выраженные антимутагенные свойства (Жанатаев А.К, Дурнев А.Д, Середенин С.Б, 2000.).

Цель исследования. Целью настоящей работы явилось комплексное исследование влияния афобазола на тератогенез и ДНК-повреждения в эмбриональных тканях и плаценте, индуцированные известным мутагеном и тератогеном цик-лофосфамидом.

Основные задачи исследования.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Адаптировать циклофосфамидную модель тератогенного действия к условию получения максимального тератогенного эффекта без увеличения спонтанной гибели эмбрионов в период активного органогенеза.

2. Оценить влияние афобазола в разных дозах при однократном введении на 14 день беременности и трехдневном введении на 13-15 днях беременности, на тератогенез, индуцированный циклофосфамидом;

3. Исследовать временные и дозовые зависимости влияния афобазола на индуцированные циклофосфамидом ДНК-повреждения и апоптоз в эмбриональных тканях и плаценте.

4. Провести анализ взаимосвязи между повреждениями ДНК в эмбриональных тканях и плаценте с возникновением пороков развития эмбрионов.

Научная новизна работы. Впервые установлено, что анксиолитик афобазол, обладающий антимутагенными свойствами, при различных режимах введения, дозозависимо снижает тератогенный эффект циклофосфамида. В частности, под действием афобазола показано уменьшение количества эмбрионов с грубыми аномалиями: менингоэнцефалоцеле, краниошизис, микрогнатия, гипогнатия, протрузия языка, омфалоцеле, тератома, повреждения передних и задних конечностей, расщелина позвоночника (Spina bifida), сколиоз, гидроцефалия, урано-шизис. Антигенотоксическая активность афобазола впервые выявлена в эмбриональных тканях и плаценте, что дополняет ранее установленные данные об антимутагенных свойствах этого препарата в клетках соматических тканей. Сформулирована рабочая гипотеза о роли предмутационных поражений ДНК в эмбриональных тканях и плаценте в формировании тератогенных эффектов. Установлено, что увеличение и разнообразие аномалий развития эмбрионов коррелирует с уровнями ДНК-повреждения и апоптоза не только в эмбриональных тканях, но также в клетках плаценты.

Научно-практическая значимость. Совокупность полученных данных создает научно-обоснованную базу для поиска средств фармакологической профилактики тератогенеза и определяет актуальность изысканий антитератогенов среди соединений с антимутагенными свойствами, расширяет представления о методических возможностях метода «ДНК-комет», впервые апробированного при определении целостности ДНК в эмбриональных и плацентарной тканях.

Практически важным является выявленное совпадение доз, в которых афобазол проявляет основной анксиолитический эффект, антимутагенное и антитератогенное действие, что открывает перспективы расширения показаний его клинического применения.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на межлабораторных конференциях ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН и 3-ем съезде токсикологов России (г. Москва, 1-5 декабря 2008).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов экспериментов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 168 страницах ма-

шинописного текста, содержит 20 таблиц, 52 рисунка. Библиографический указатель включает 134 отечественных и 83 иностранных источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали самок беспородных белых крыс питомника «Столбовая» РАМН весом 200-250 г. Выборка животных состояла из 10-14 самок в каждой группе. День обнаружения сперматозоидов в вагинальных мазках считали 1-м днем беременности. Животных содержали в условиях вивария на брикетированном корме, овощах, воде, при естественном освещении.

На этапе отработки экспериментальной модели, препарат вводили в/б в дозах 10, 15 и 20 мг/кг на 14 день беременности. Основные эксперименты проводили в двух вариантах. В первом случае, беременные самки обрабатывались . афобазо-лом и циклофосфамидом на 14 день беременности. Во втором - афобазол вводили животным на 13, 14 и 15 день беременности и циклофосфамид - на 14 день беременности. Введение препаратов осуществлялось по схеме «афобазол + циклофосфамид» с интервалом 15 минут.

Афобазол (2-[2-(морфолино)этилтио]-5-этоксибензимидазола гидрохлорид) вводили перорально в дозах 1, 10 и 100 мг/кг. В указанных дозировках препарат в ранее проведенных исследованиях демонстрировал антимутагенные свойства in vivo по отношению к эффектам ряда мутагенов (Жанатаев А. К., 2001).

Афобазол по данным ГУ НИИ фармакологии РАМН им. В.В. Закусова не обладает аллергизирующими, иммунодепрессивными, мутагенными свойствами и репродуктивной токсичностью, то есть соответствует требованиям, предъявляемым к безопасности лекарственных средств.

В качестве тератогена использовали циклофосфамид (Ы'-бис-(В-хлорэтил)-N'-O-триметиловый эфир диамида фосфорной кислоты) Олайнского ХФЗ - ал-килирующий цитостатический препарат, оказывающий противоопухолевое, им-мунодепрессивное действие и обладающий мутагенным и тератогенным эффектами (Bishop J. В., Witt К. L., Sloane R. А., 1997; Китель В. В., 2007).

Общий дизайн эксперимента, принципы и методы анализа тератогенных и эм-бриотоксических исследований соответствовали требованиям методических рекомендаций, посвященных оценке тератогенной активности фармакологических

веществ (Смольникова Н.М. и соавт., 2005). О выраженности эмбриотоксиче-ского и тератогенного действия судили на основании данных внешнего осмотра и анализа плодов с помощью методов Вильсона и Доусона в модификации Ды-бана (Дыбан, А. П., 1967), позволяющих обнаруживать аномалии развития внутренних органов и дефекты скелета. Для дифференциального окрашивания скелетной ткани (костной и хрящевой) использовали метод двойного окрашивания П. Петерса (Peters Р., 1977). Метод позволяет визуально оценивать дисплазию соединительной ткани, которая является начальным звеном в развитии дегенеративных заболеваний, в том числе патологического формирования опорно-двигательной системы во время хондро- и остеогенеза (Мартынов, А.И., 1998; Чурилина A.B., Москалюк О.Н., 2006; Китель В. В., 2007).

Исследование влияния афобазола на индуцированные циклофосфамидом ДНК - повреждения проводили методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод «ДНК- комет»), в клетках эмбрионов и плацент. Метод основан на регистрации различной подвижности ДНК в постоянном электрическом поле, заключенных в агарозный гель и позволяет учитывать степень повреждения ДНК. В качестве показателя поврежденности использован параметр «% ДНК в хвосте», рекомендованный для оценки первичных ДНК - повреждений (Дурнев А.Д., Жанатаев А.К.,. Анисина Е.А. и соавт., 2006).

При проведении тератогенных исследований животных забивали на 20-й день беременности. В яичниках подсчитывали количество желтых тел. Затем вскрывали матку, эмбрионы тщательно осматривали, регистрировали внешние аномалии, взвешивали, определяли кранио-каудальный размер. У части эмбрионов после фиксации в жидкости Буэна проводили микроанатомическое исследование состояния внутренних органов (Дыбан А. П., 1967). Другую часть эмбрионов после фиксации в 96° этиловом спирте окрашивали ализарином и альциановым синим, затем исследовали состояние костной системы (Peters Р., 1977). Регистрировали аномалии костного скелета, среднее количество точек окостенения на один зародыш в области пястья, плюсны, позвоночника и грудины, а также аномалии черепа.

Эксперименты, посвященные изучению дозовых и временных зависимостей влияния афобазола на индукцию ДНК-повреждений, проводили в двух вариан-

тах. В первом - афобазол и тератоген вводили одновременно на 14 день беременности. Через 20 часов крыс забивали, полученный эмбриональный материал исследовали методом «ДНК - комет». Во втором варианте эксперимент проводился по той же схеме, но временная экспозиция составила 24 часа.

Микропрепараты эмбриональных тканей готовили методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток согласно методическим рекомендациям (Дурнев А.Д., Жанатаев А.К.,. Анисина Е.А. и соавт., 2006). Общая схема метода включала приготовление гель-слайдов, получение микропрепаратов, лизис, щелочную денатурацию, электрофорез, нейтрализацию/фиксацию, окрашивание и микроскопический анализ. Микроскопирование проводили под флуоресцентным микроскопом с использованием компьютерного анализа цифровых изображений «ДНК-комет» в программной среде CASP. Учитывали показатель «%ДНК в хвосте». На каждый микропрепарат рандомизированно анализировали не менее 100 «ДНК-комет» без наложений хвостов. Отдельно подсчитывали апоптотические клетки, выявляемые на микропрепаратах в виде слабо флуоресцирующих «ДНК-комет» с широким диффузным «хвостом».

Во всех сериях экспериментов циклофосфамид в дозе 20 мг/кг вводили внут-рибрюшинно.

Афобазол в дозах 1,10 и 100 мг/кг вводили перорально. Все растворы готовили на дистиллированной воде ex tempore. Обработку животных проводили по схеме «афобазол+тератоген» с интервалом 15 минут.

Статистическую обработку результатов в тератологических исследованиях (вычисление абсолютных и относительных частот и установление уровня статистической значимости) проводили с применением пакета прикладных программ «СТАТИСТИКА». В анализ включали всех эмбрионов, полученных в эксперименте.

В генотоксикологических исследованиях статистическую обработку результатов проводили:

1) Методом сравнения усредненных значений показателей поврежденности ДНК («% ДНК в хвосте») и долей апоптотических клеток в контрольной и экспериментальных группах (t-критерий Стъюдента, «Вероятностный калькулятор»).

2) Оценку степени поврежденности ДНК, вычисление абсолютных и относительных частот значений фрагментации ДНК проводили методом построения таблиц частот и процентов в модуле «Основные статистики» (пакет прикладных программ «СТАТИСТИКА»).

3) Сравнение групп, анализ распределения частот значений фрагментации ДНК и установление уровня статистической значимости осуществляли методом количественного анализа с применением критерия Колмогорова -Смирнова.

4) Регрессионно - корреляционный анализ проводили при помощи построения линейной регрессионной модели (метод наименьших квадратов в приложении Excel), отображающей зависимость:

- Между степенью поврежденности ДНК, индуцированной ЦФА в клетках плацент и эмбрионов, и влиянием афобазола на эти эффекты;

- Между уровнем поврежденности ДНК в клетках плаценты и выходом поврежденных ДНК и апоптотических клеток в тканях эмбрионов;

- Между степенью повреждения ДНК в эмбриональной и плацентарной тканях и появлением пороков развития у эмбрионов.

Показатель плотности связи R2 (коэффициент корреляции) рассчитывали по методу наименьших квадратов. Характеристику силы связи, выраженную через коэффициент корреляции R2 (числовое значение) осуществляли по шкале Чедо-ка.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1 .Модель тератогенеза.

Первым этапом исследования явилась отработка модели тератогенеза, индуцированного циклофосфамидом. Его целью явился подбор дозы, в которой цик-лофосфамид вызывает максимальный тератогенный эффект и наибольшее разнообразие аномалий без увеличения гибели эмбрионов. Исследование базировалось на ранее известных сведениях о тератогенных эффектах циклофосфамида. (Mirkes P.E., 1985; Кабак С. Л., Бойцов Л. Н., Аниськова Е. П., 1985; Китель В. В, 2007).

Циклофосфамид использовали в дозах 10, 15 и 20 мг/кг. Искомый эффект -100 % поражение эмбрионов, без увеличения их спонтанной гибели, наблюдали

при использовании препарата в дозе 20 мг/кг. При использовании тератогена в более низких дозах число аномальных зародышей существенно снижалось и сужался спектр врожденных аномалий развития.

Таким образом, были определены условия эксперимента (циклофосфамид 20 мг/кг, на 14 день беременности у крыс, в/б), удовлетворяющие поставленной задачи по отработке экспериментальной модели.

2. Влияние афобазола на тератогенез, индуцированный циклофосфамидом

Было проведено две серии экспериментов. В первой серии исследовали влияние афобазола на тератогенез, индуцированный циклофосфамидом. Опыты проводились с учетом дозовых и временных зависимостей, выявленных в предварительных экспериментах при отработке модели.

2.1. Влияние афобазола при однократном введении на тератогенные эффекты циклофосфамида.

Результаты проведенных экспериментов представлены в таблицах № 1 - 4.

2.1.1. Макроскопическое исследование плодов.

Афобазол в дозах 1, 10 и 100 мг/кг при однократном совместном введении с тератогеном дозозависимо уменьшал в 2 - 8 раза количество эмбрионов с грубыми повреждениями, такими как менингоэнцефалоцеле, краниошизис, микро-гнатия, гипогнатия, протрузия языка, омфалоцеле, тератома (табл. 1). Число эмбрионов с микроцефалией, микромелией (при введении афобазола в дозе 1 и 100 мг/кг), омфалоцеле, повреждениями передних конечностей (при введении афобазола в дозе 100 мг/кг) снизилось до уровня, наблюдаемого у контрольных животных.

Таким образом, при макроскопическом исследовании плодов было установлено, что афобазол при однократном введении в диапозоне доз 1 - 100 мг/кг статистически значимо, дозозависимо снижает количество внешних аномалий, вызванных циклофосфамидом. Наиболее выраженное протекторное действие наблюдалось при введении афобазола в дозе 100 мг/кг. По отношению к отдельным показателям, афобазол в дозе 10 мг/кг оказывал менее выраженное защитное действие по сравнению с дозами 1 и 100 мг/кг.

Таблица 1

Влияние афобазола при однократном введении на тератогенные эффекты циклофосфамида

Регистрируемые аномалии ЦФА 20 мг/кг ЦФА+Аф 1 мг/кг ЦФА+Аф 10мг/кг ЦФА+Аф 1 ООмг/кг

кол-во исследованных плодов 51 111 158 144

Аномалии развития4' % (число) % (число) % (число) %(число)

Кровоизлияние в мозг 75% (38) 59% (66) - 22% (35) ■ 10% (14) ■

Менингоэнцефалоцеле 100% (51) 27% (30)" 40% (63) ■ 18% (26)-

Краниошизис 100% (51) 56% (62)- 64% (101) - 48% (69) ■

Микроцефалия 57% (29) 0- 28% (44) ■ 0-

Экзофтальм 71% (36) 5% (6)- 26% (41)- 10% (15)-

Микрогнатия 25% (13) 6% (7)- 16% (25) 1% (1)-

Гипогнатия 41% (21) 5% (6)- 15% (24) ■ 6% (9)«

Протрузия языка 29% (15) 4% (4)- 10% (16) ■ 13% (19) -

Микромелия 80% (41) 0- 9% (15) ■ 0-

Омфалоцеле 27% (14) 5% (5)- 16% (25) > 0-

Тератома 88% (45) 21% (23)- 34% (54) ■ 21% (30)-

Повреждения передних конечностей 31% (16) 13% (14) ■ 3% (5) ■ 0-

Повреждения задних конечностей 86% (44) 71% (79) ■ 49% (78) • 24% (34) ■

Здесь и далее

* - процент эмбрионов с аномалиями

■ - статистически значимая разница ( Р < 0,05) по сравнению с результатами, характеризующими тератогенный эффект отдельно взятого циклофосфамида

2.1.2. Влияние афобазола при однократном введении на индуцированное

ЦФА аномальное формирование внутренних органов.

Изучение состояния внутренних органов плодов крыс, получавших цикло-фосфамид, выявило различные аномалии головного мозга, небных отростков, почек, сердца. Количество эмбрионов с патологией развития внутренних органов снижалось во всех группах животных, получавших афобазол. Наиболее эффективное действие афобазол оказывал в дозах 1 и 100 мг/кг. При его использовании в дозе 1 мг/кг количество эмбрионов с гидроцефалией, гидронефрозом и ураношизисом уменьшилось почти в 2 раза, а с дисплазией сердца в 3,4 раза. В дозе 10 мг/кг афобазол достоверно снижал гидроцефалию в 1,5 и дисплазию сердца в 2,3 раза. Наиболее выраженный защитный эффект афобазол оказывал в

дозе 100 мг/кг: число эмбрионов с гидроцефалией, гидронефрозом и ураношизи-сом снизилось в среднем в 2 раза, а с дисплазией сердца до значений контроля.

Таким образом, афобазол при однократном введении значимо уменьшает число аномалий внутренних органов плодов, индуцированных циклофосфамидом. Более выраженное, статистически значимое снижение количества аномалий под влиянием афобазола наблюдается в дозах 1 и 100 мг/кг.

2.1.3. Влияние афобазола при однократном введении на возникновение аномалий костной системы, индуцированное циклофосфамидом.

При исследовании аномалий костной системы отмечено дозозависимое снижение количества грубых аномалий под влиянием афобазола (табл. 2). Из данных, приведенных в таблице, следует, что под влиянием афобазола в дозе 1 и 10 мг/кг, количество плодов с такими грубыми дефектами, как акрания, дисморфия челюсти, сколиоз, расщелина позвоночника (Spina bifida), достоверно снижались в 4-8 раз по сравнению с результатами, характеризующими тератогенный эффект отдельно взятого циклофосфамида.

Таблица 2

Влияние однократного введения афобазола на возникновение аномалий костной системы, индуцированных циклофосфамидом

Регистрируемые аномалии ЦФА 20 мг/кг ЦФА+Аф 1 мг/кг ЦФА+Аф 10мг/кг ЦФА+Аф 100 мг/кг

Количество исследованных эмбрионов (абс. зн) 51 111 158 144

Акрания % 100 13 ■ 26- 1,4-

Дисморфия челюсти % 92,7 15- 26- 1,4 ■

Сколиоз % 71,4 19,8 ■ 16- 0"

Расщелина позвоночника (Spina bifida) % 78,6 28« 11,6 ■ 0-

Раздвоение точ. ок. груд. % 42,7 32,6 5,8 ■ 1,4-

Аномальное разрастание хрящевой ткани

Верхняя правая пястна % 67,9 63,0 5,8- 13,5-

Верхняя левая пястна % 64,3 63,0 4,3- 13,5-

Нижняя правая плюсна % 82,1 71,7 5,8- 13,5-

Нижняя левая плюсна % 78,6 71,7 7,2- 13,5-

При введении афобазола в дозе 100 мг/кг, количество эмбрионов с акранией и дисморфией челюсти уменьшилось до 1,4 %. В этой экспериментальной группе не выявлены такие аномалии как сколиоз и расщелина позвоночника.

Наблюдалось также дозозависимое снижение количества эмбрионов с аномальным разрастанием хрящевой ткани. В группе животных, обработанных ЦФА, количество эмбрионов с диспластическими изменениями в области пяст-ны было более 60 %, а в области плюсны в среднем - 80 %. Достоверное снижение количества эмбрионов с этой патологией отмечено при введении афобазола в дозе 10 и 100 мг/кг.

Таким образом, афобазол при однократном введении, статистически значимо уменьшает количество грубых аномалий костной системы в диапазоне доз 1-100 мг/кг. В дозах 10 и 100 мг/кг афобазол достоверно снижает число плодов с аномальным формированием хрящевой ткани конечностей.

Приведенные результаты позволяют заключить, что афобазол дозозависимо снижает тератогенное действие циклофосфамида при однократном введении препаратов.

3.1. Влияние афобазола при трехдневном введении на тератогенные эффекты циклофосфамида.

3.1.1. Макроскопическое исследование плодов.

Данные экспериментов с трехдневной обработкой модельных животных афо-базолом в дозах 1-100 мг/кг подтвердили способность анксиолитика дозозависимо уменьшать тератогенное действие циклофосфамида (табл. 3). При трехдневной обработке афобазолом в дозе 1 мг/кг, наблюдалось уменьшение числа эмбрионов с такими аномалиями, как кровоизлияние в мозг, менингоэнцефало-целе, краниошизис, экзофтальм, микромелия, омфалоцеле, тератома и повреждение конечностей. Результаты, полученные при трехдневном и однократном введении афобазола в дозе 10 мг/кг, практически не отличались по всему спектру анализируемых параметров. Такая же картина наблюдалась в группах животных, обработанных циклофосфамидом на фоне трехдневного и однократного введения афобазола в дозе 100 мг/кг.

В целом, при трехдневном использовании афобазола была отмечена прямая дозовая зависимость его антитератогенных эффектов по сравнению с данными, полученными при однократном введении.

Таблица 3

Влияние афобазола при трехдневном введении на тератогенные эффекты

циклофосфамида

Регистрируемые аномалии ЦФА 20 мг/кг ЦФА+Аф 1 мг/кг ЦФА+Аф 10мг/кг ЦФА+Аф 100мг/кг

кол-во исследованных плодов 51 106 125 135

Аномалии развития: % (число) %(число) % (число) % (число)

Кровоизлияние в мозг 75% (38) 43% (46)- 18% (23)- 10% (14) ■

Менингоэнцефалоцеле 100% (51) 54% (57)- 41% (51)- 24% (33) ■

Краниошизис 100% (51) 58% (62) ■ 66% (82) ■ 64% (87)-

Микроцефалия 57% (29) 0- 19% (24)- 5% (7)-

Экзофтальм 71% (36) 45% (48) ■ 31% (39)- 5% (7)-

Микрогнатия 25% (13) 49% (52)- 23% (29) 9% (12)"

Гипогнатия 41% (21) 42% (44) 22% (27)- 5% (7)-

Протрузия языка 29% (15) 34% (36) 18% (22)- 10% (14) ■

Микромелия 80% (41) 3% (3> 9% (11)- 3% (4)-

Омфалоцеле 27% (14) 13% (14)" 16% (20)- 2% (3)-

Тератома 88% (45) 48% (51)« 38% (47) • 23% (31) -

Повреждения передних конечностей 31% (16) 13% (13) - 11% (14) ■ 1% (2>

Повреждения задних конечностей 86% (44) 53% (56) ■ 31% (39)- 29% (40) ■

3.2.2. Влияние трехдневного введения афобазола на аномальное формирование внутренних органов, индуцированное ЦФА.

При трехдневном введении афобазола на фоне повреждающего действия циклофосфамида, также как и при однократном введении препарата, отмечено значимое снижение аномальных показателей. В дозе 1 мг/кг афобазол достоверно снижал количество эмбрионов с гидроцефалией, гидронефрозом и дисплазией сердца в 2 раза. При введении препарата в дозе 10 и 100 мг/кг число плодов с гидроцефалией в среднем снизилось в 2,5, а с ураношизисом в 2 раза. Отмечено снижение количества эмбрионов с гидронефрозом в 2, и дисплазией сердца в 3,4 раза.

При трехдневном введении, афобазол также эффективно снижает количество аномалий внутренних органов.

3.2.3. Влияние афобазола при трехдневном введении на формирование

аномалий костной системы, индуцированное циклофосфамидом.

При оценке результатов трехдневной обработки афобазолом была отмечена более выраженная дозовая зависимость антитератогенного действия препарата на формирование костных и хрящевых аномалий по сравнению с однакратным введением. В дозе 1 мг/кг афобазол достоверно уменьшал число эмбрионов с ак-ранией, дисморфией челюсти, сколиозом и расщелиной позвоночника (Spina bifida) в среднем в 2 раза (Табл. 4). При введении афобазола в дозе 10 мг/кг количество эмбрионов с такими же аномалиями значимо уменьшилось в среднем в 6 раз. Наиболее выраженное уменьшение анализируемых аномалий отмечено при использовании афобазола в дозе 100 мг/кг. В этой группе, как и при однократном введении, не выявлены такие аномалии как сколиоз и расщелина позвоночника.

Таблица 4

Влияние трехдневного введения афобазола на формирование аномалий костной системы индуцированное циклофосфамидом

Регистрируемые аномалии ЦФА 20 мг/кг ЦФА+Аф 1 мг/кг ЦФА+Аф 10мг/кг ЦФА+Аф 100 мг/кг

Количество исследованных эмбрионов (абс. зн) 51 46 65 79

Акрания % 100 39,1 ■ 13,9 • 6,33 ■

Дисморфия челюсти % 92,7 54,3 ■ 20- 15,2-

Сколиоз % 71,4 28,3 - 12,3 ■ 0-

Расщелина позвоночника (Spina bifida)0/» 78,6 41,3 ■ 21,5 ■ 0-

Раздвоение точ. ок. груд. % 42,7 47,8 6,2 ■ 17,7-

Аномальное разрастание хрящевой ткани

Верхняя правая пястна % 67,9 21,7- 7,7- 5.1 -

Верхняя левая пястна % 64,3 19,6- 7,7- 5,1 ■

Нижняя правая плюсна % 82,1 23,9- 15,4 ■ 11,4 ■

Нижняя левая плюсна % 78,6 21,7- 16,9 ■ 11,4 ■

Отмечено также, что афобазол в дозах 1-100 мг/кг значимо и дозозависимо снижал количество плодов с аномальным формированием хрящевой ткани конечностей.

Таким образом, афобазол при трехдневном введении, в диапазоне доз 1-100 мг/кг значимо снижает количество грубых аномалий костной системы и число плодов с аномальным формированием хрящевой ткани конечностей. При трехдневном введении афобазола во всех использованных дозах было отмечено более выраженное влияние препарата на диспластические изменения хрящевой ткани по сравнению результатами, полученные при его однократном введении.

Суммируя полученные результаты, следует заключить, что они согласуются с данными, полученными в первой серии исследования, однако при трехдневном введении афобазол демонстрирует более выраженную дозовую зависимость протекторного эффекта.

4. Исследование влияния афобазола на индукцию ДНК-повреждений под действием циклофосфшида в эмбриональных тканях и плаценте.

Следующим этапом работы явилась оценка ДНК-повреждений в эмбриональных тканях и плаценте методом ДНК-комет при использовании циклофосфамида в дозе, вызывающей максимальный тератогенный эффект.

4.1. Клетки плацент

В результате проведенных экспериментов (рис. 1) было установлено достоверное увеличение выхода ДНК повреждений в клетках плаценты под влиянием циклофосфамида при 20 и 24 часовом сроках экспозиции. Показатель «% ДНК в хвосте» по сравнению с контролем повысился в 7,6 и 2,4 раза, соответственно.

Афобазол не оказывал влияния на индукцию ДНК повреждений в клетках плаценты при 20 часовой экспозиции, что может быть связано с большей степенью выраженности ДНК-повреждающего действия циклофосфамида при этом сроке.

При 24 часовой экспозиции афобазол во всем диапазоне дозировок значимо уменьшал поврежденность ДНК до уровня контрольных значений. Использование афобазола в дозе 1 и 100 мг/кг привело к снижению повреждений ДНК в 2

раза, в дозе 10 мг/кг в 2,4 раза по сравнению с группой, подверженной действию

отдельно взятого тератогена. %

Контроль ЦФА20 ЦФА+Аф ЦФА+Аф ЦФА+Аф мг/кг 1 мг/кг 10 мг/кг 100 мг/кг

■ % ДНК в хвосте (экспозиция 24 часа) % ДНК в хвосте (экспозиция 20 часов)

Рис. I. Влияние афобазола на генотоксический эффект циклофосфамида (20 мг/кг) в плаценте. По вертикали - % ДНК в хвосте, по горизонтали - доза афобазола. * - статистически значимые различия ( Р < 0,05) по сравнению с результатами, характеризующими тератогенный эффект отдельно взятого циклофосфамида.

4.2. Клетки эмбрионов

В клетках эмбрионов после 20 часовой экспозиции циклофосфамида наблюдалось статистически значимое повышение «% ДНК в хвосте» в б раз по сравнению с контролем.

У эмбрионов, полученных от самок, обработанных афобазолом в дозах I - 100 мг/кг, отмечено достоверно пониженное количество повреждений ДНК (рис. 2), по сравнению с группой животных, подверженных только действию циклофосфамида. Более выраженное действие афобазола отмечено в дозе 10 мг/кг, при которой поврежденность ДНК уменьшилась в 2,2 раза. В дозах 1 и 100 мг/кг «% ДНК в хвосте» достоверно снизился в 1,6 и 1,4 раза, соответственно.

При 24 часовой экспозиции в клетках эмбрионов, подвергнутых действию циклофосфамида, наблюдалось значимое повышение «%ДНК в хвосте» в 1,8 раз по сравнению с контрольной группой.

Афобазол в дозах 1 и 100 мг/кг достоверно уменьшал повреждение ДНК в клетках эмбрионов, в 1,4 и 1,5 раз, соответственно. При этом в максимальной дозе афобазол полностью устранял ДНК-повреждающее действие тератогена -полученный результат не отличался от контрольных значений (Р > 0,05), характеризующих уровень поврежденности ДНК в контроле.

7.6 -

Г; 4,6 ИШ1ЯИ 3.9......Шв^^Л

%

40

30

20 ---------------------1в,а

ю о

Контроль ЦФА20 ЦФА+Аф ЦЧ>А +Аф ЦФА+Аф мг/кг 1мг/кг 10 мг/кг ЮО мг/кг

я % ДНК в хвосте (экспозиция 24 часа) % ДНК в хвосте (экспозиция 20 часов)

Рис. 2. Влияние афобазола на генотоксический эффект циклофосфамида (20 мг/кг) в клетках эмбриона. По вертикали - % ДНК в хвосте, по горизонтали - доза афобазола.

* - статистически значимые различия ( Р < 0,05) по сравнению с результатами, характеризующими тератогенный эффект отдельно взятого циклофосфамида.

4.3. Апоптотический эффект в клетках плацент

Под влиянием циклофосфамида при 20 и 24 часовом сроках экспозиции (рис. 3) наблюдалось достоверное увеличение количества апоптотических клеток в плаценте, по сравнению с контролем в 4 и 3 раза, соответственно.

Контроль ЦФА20 ЦФА+Аф ЦФА+Аф ЦФА+Аф мг/кг 1 мг/кг 10 мг/кг 100 мг/кг

* апоптотических клеток % (экспозиция 24 часа) апоптотических клеток % (экспозиция 20 часов)

Рис. 3. Влияние афобазола на апоптотический эффект циклофосфамида (20 мг/кг) в клетках плаценты. По вертикали - количество апоптотических клеток (%), по горизонтали - доза афобазола.

* - статистически значимые различия ( Р < 0,05) по сравнению с результатами, характеризующими тератогенный эффект отдельно взятого циклофосфамида.

Подсчет количества апоптотических клеток на микропрепаратах плацент животных, исследуемых экспериментальных групп, обработанных афобазолом, на

фоне введения циклофосфамида, выявил достоверное и дозозависимое снижение регистрируемого показателя.

При 20 часовой экспозиции, афобазол во всем диапазоне дозировок значимо и дозозависимо уменьшал количество апоптотических клеток в плаценте. В дозе 1 мг/кг препарат снижал количество апоптотических клеток в 1,4 раза. При введении афобазола в дозе 10 мг/кг апоптотический эффект в клетках плацент снизился в 2 раза. В максимальной дозе 100 мг/кг афобазол значимо уменьшал количество апоптотических клеток в 2,6 раз.

При 24 часовой экспозиции в экспериментальных группах под влиянием афобазола в дозах 10 и 100 мг/кг также отмечено значимое уменьшение количества апоптотических клеток в плаценте вплоть до значений, регистрируемых в контроле.

4.4. Апоптотический эффект в клетках эмбрионов

Исследование апоптотического эффекта на микропрепаратах эмбрионов, полученных от животных, обработанных циклофосфамидом, после 20 часовой экспозиции выявило достоверное увеличение количества апоптотических клеток в 2 раза по сравнению с контрольной группой (рис 4).

Сравнение результатов, полученных при исследовании апоптотического эффекта в экспериментальных группах, обработанных афобазолом, не выявило достоверных отличий от значений животных группы, подверженной действию циклофосфамида.

После 24 часовой экспозиции с циклофосфамидом на микропрепаратах эмбрионов отмечено повышение апоптотического эффекта в 6 раз по сравнению с контролем. Выявлено повышение выхода апоптотических клеток во всех экспериментальных группах, подвергнутых действию циклофосфамида, при этом отмечено достоверное и дозозависимое снижение показателя апоптоза в группах животных, обработанных афобазолом. В дозе 1 и 100 мг/кг афобазол снижал количество апоптотических клеток в эмбрионе в 1,5, а в дозе 10 мг/кг в 2,8 раза.

%

30 —------------------------------

20

10I-

о ——

Контроль ЦФА20 ЦФА+Аф ЦФА+Аф ЦФА+Аф мг/кг 1мг/кг 10 мг/кг ЮО мг/кг

■ апогттотических клеток % (экспозиция 24 часа)

апо[ттотическихклеток%(э1«:позиция20 часов)

Рис. 4. Влияние афобазола на апоптотический эффект циклофосфамида (20 мг/кг) в клетках эмбриона. По вертикали - количество апоптотических клеток (%), по горизонтали - доза афобазола.

* - статистически значимые различия ( Р < 0,05) по сравнению с результатами, характеризующими тератогенный эффект отдельно взятого циклофосфамида.

Таким образом, афобазол во всех использованных дозах снижает апоптотический эффект циклофосфамида при 24 часовой экспозиции.

5. Корреляционный анализ взаимосвязи между ДНК-повреждением и возникновением пороков развития.

Анализ долевого соотношения клеток различной степени поврежденности

ДНК проводили раздельно для 20 и 24 часового срока экспозиции. Общее количество исследованных клеток от каждой группы подвергли статистической обработке, в результате которой были сгруппированы четыре категории клеток с различной степенью фрагментации ДНК. К первой категории были отнесены клетки с «ДНК в хвосте» до 10 %. Они принимались за норму с физиологически допустимым и необходимым, для процессов жизнедеятельности, уровнем ДНК-раскручивания и/или спонтанно-обусловленных разрывов. Во вторую категорию были определены клетки с повреждениями ДНК от 10 до 30 %; к третьей категории были отнесены клетки с повреждениями ДНК от 30 до 50 %; в отдельную категорию выделяли клетки с ДНК-повреждениями выше 50 %, которые расценивались, как апоптотические.

Эти данные в совокупности с результатами, характеризующими тератогенные поражения, были подвергнуты корреляционному анализу с применением регрессионной модели для установления взаимосвязей между степенью повреждения

Контроль ЦФА20 ЦФА+Аф ЦФА+Аф ЦФА+Аф мг/кг 1 мг/кг 10 мг/кг ЮО мг/кг

ДНК в тканях плацент и эмбрионов, которая является маркером повышенного риска возникновения генных и хромосомных мутаций, и появлением пороков развития. Была выявлена взаимосвязь между уровнями поврежденности ДНК и возникновением тератогенных поражений у эмбрионов. Это, в частности, при 20-часой экспозиции, касалось протрузии языка (R2 = 0,908), гипогнатии (R2 = 0,658), микромелии (R2 = 0,752), ахейрии (R2 = 0,740), экзофтальма (R2 = 0,663 ) и тератом (R2 = 0,699), при 24 часовой - менингоэнцифалоцеле (R2 = 0,946), кра-ниошизиса (R2 = 0,921), микроцефалии (R2 = 0,826), экзофтальма (R2 = 0,956), микрогнатии (R2 = 0,698), гипогнатии (Л2 = 0,962), протрузии языка (R2 = 0,898, R2 = 0,931) микромилии {R2 = 0,693, R2 = 0,991), ахейрии (R2 = 0,667, R2 = 0,953), аподии {R2 = 0,936), омфалоцеле (R2 = 0,731) и тератом (R2 = 0,645, R2 = 0,981).

Аналогичным образом, была установлена взаимосвязь между уровнями повреждения ДНК в плаценте и возникновением аномальных эмбрионов. В частности, при 20-часой экспозиции это касалось длины плода (R2 = 0,877, R2 = 0,972), массы плода (R2 = 0,876, R2 = 0,994), кровоизлияний в мозг (R2 = 0,951, R2 = 0,955), менингоэнцифалоцеле (R2 = 0,730), ахейрии (R2 = 0,788 ), аподии (R2 = 0,779), олидактилии передних конечностей (R2 = 0,845), брахидактилии (R2 = 0,924), при 24 часовой - длины плода (R2 = 0,810), массы плода (R2 = 0,834), кровоизлияний в мозг (R2 = 0,944), менингоэнцифалоцеле (R2 = 0,897), краниошизи-са (R2 = 0,867), микроцефалии (R2 = 0,719), экзофтальма (R2 = 0,888), гипогнатии (R2 = 0,900), протрузии языка (R2 = 0,921, R2 = 0,916), микромилии (R2 = 0,694, R2 = 0,969), ахейрии (R2 = 0,647, IV = 0,965), аподия (R2 = 0,897 ), олидактилии передних конечностей (R2 = 0,835), брахидактилии (R2 = 0,950), и тератом (R2 = 0,654, R2 = 0,937).

Обращает внимание, что повреждения ДНК в плаценте взаимосвязано с большим количеством поражений эмбриона, следовательно, ассоциированы с формированием тератогенных эффектов, что согласуется с литературными сведениями, указывающими на функциональную значимость плаценты в обеспечении нормального развития эмбриона (Судакова Н. М., 2004; Кошелева, Н.Г., 2004).

Совокупность результатов проведенного исследования, позволяет заключить, что афобазол обладает антитератогенной и антигенотоксической активностью, и уменьшает выход апоптотических клеток в эмбриональных тканях и плаценте.

Выявлены и охарактеризованы дозовые зависимости антитератогенного и ан-тигенотоксического действия афобазола. Отмечен параллелизм в дозовых зависимостях антигенотоксического, антитератогенного и антиапоптотического действия афобазола (рис. 5). С помощью корреляционного анализа выявлены взаимосвязи между индукцией ДНК повреждений, апоптозом и возникновением пороков развития у эмбрионов, что указывает на значение этих процессов в нарушении эмбрионального морфогенеза.

Это позволяет с высокой вероятностью объяснить антитератогенные эффекты афобозола его взаимосвязанной антигенотоксической и антиапоптотической активностью.

При однократном введении более выраженный антитератогенный эффект афобазол проявил в дозах 1 и 100 мг/кг, при трехдневном введении установлена прямая дозовая зависимость защитного действия.

А|КИ1Г.КЧН%

Аномалии %

100

ад ™*"Ахейрия

% ДНК-коивг

ЦФА20 ЦФА+Аф ЦФА+Аф ЦФА+Аф иг/С 11Г/КГ 10 иг/кг 100 иг/кг

■♦•Доля апопт. клеток плаценты (20 часов)

-»-Spina bifida

IAF30 ЗД

2 а -О-аномалии хрящ, ткани гнстны —¿^аномаши V

хрящ, лани плюсны ~"й~Акрания

ЦФА2С ЦФА4Аф ЦФА+Аф ЦФА+Аф ит/КГ 1 МГ/«Г 101Г/КГ 100 иг/кг

-*#>»% ДНК в хвосте (эмбрион)

•^—Тератома

Рис. 5. Дозовые зависимости антигенотоксического и антитератогенного действия

афобазола.

Показано, что в возникновении аномалий развития эмбрионов вовлечены не только повреждения ДНК и апоптоз в эмбриональных тканях, но также в клетках плаценты.

На основании результатов проведенного исследования можно сделать следующие выводы.

ВЫВОДЫ

1. Определены условия эксперимента (20 мг/кг, на 14 день беременности у крыс, в/б), при которых циклофосфамид оказывает 100 % тератогенный эффект без увеличения гибели эмбрионов.

2. Афобазол при однократном пероральном введении в дозах 1, 10 и 100 мг/кг на 14 день беременности статистически значимо, дозозависимо уменьшает тератогенный эффект циклофосфамида, в дозах 1 и 100 мг/кг полностью устраняет микроцефалию и микрогнатию, в дозе 100 мг/кг - омфалоцеле и повреждения передних конечностей.

3. Афобазол при трехкратном пероральном введении в дозах 1, 10 и 100 мг/кг на 13-15 дни беременности значимо, дозозависимо уменьшает количество регистрируемых аномалий плодов и в дозе 1 мг/кг полностью устраняет микроцефалию у животных, получавших циклофосфамид.

4. Циклофосфамид, применяемый в дозе 20 мг/кг, на 14 день беременности у крыс, в/б, статистически значимо увеличивает поврежденность ДНК и количество апоптотических клеток в эмбриональных тканях и плаценте.

5. Афобазол в дозах 1, 10 и 100 мг/кг при 24 часовой экспозиции достоверно снижает повреждения ДНК, индуцированные циклофосфамидом, в клетках плацент и эмбрионов

6. Афобазол в дозах 1, 10 и 100 мг/кг при 20 и 24 часовом сроке экспозиции, статистически значимо и дозозависимо снижает количество апоптотических клеток в плаценте животных, получавших циклофосфамид.

7. Выявлена корреляция между поврежденностью ДНК в эмбриональных тканях и плаценте и количеством зарегистрированных пороков развития эмбрионов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шредер, О.В. Влияние афобазола на тератогенные эффекты циклофосфа-

мида у крыс [Текст]/Шредер О.В., Смольникова Н.М., Дурнев А.Д., Сере-денин С.Б.//Бюллетень эксперим. биол. и мед. - 2008. - № 4 - с. 414 - 417.

2. Дурнев, А.Д. Антимутагенные и антитератогенные свойства афобазола

[Текст]/ А.Д. Дурнев, А.К. Жанатаев, О.В. Шредер, С.Б. Середенин // Экспериментальная и клиническая фармакология (принято в печать)

3. Шредер, О.В. Определение циклофосфамид-индуцированных ДНК-

повреждений методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток в эмбриональной и плацентарной ткани крыс и защитный эффект афобазола [Текст]/ О.В. Шредер, А.К. Жанатаев, А.Д. Дурнев, С.Б. Середе-нин//Тезисы докладов 3-го съезда токсикологов России, 1-5 декабря, 2008. - М., 2008. - С. 349.

Заказ № 137/12/08 Подписано в печать 04.12.2008 Тираж 120 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 [Л^уу www.cfr.ru; е-таП:info@cfr.ru

Актуальность исследования. Тератогенные воздействия имеют серьезные медицинские последствия и являются причиной невынашивания беременности (до 46,6 %), младенческой смертности и инвалидизации населения, которая среди детей и подростков в России составляет 190-210 случаев на 10 ООО человек [15, 85].

Спектр тератогенов весьма обширен - это некоторые лекарства, косметические компоненты, экотоксиканты, производственные и бытовые вредности. В наиболее известном каталоге, известном как «список Шепарда» [215], указывается на возможную опасность со стороны около 1200 распространенных потенциальных тератогенных факторов. Прямо доказанную тератогенную опасность для человека представляет около 50 факторов различной природы [141].

Широкая распространенность тератогенов определяет неизбежность их контакта с человеком и необходимость внедрения мер по профилактике тератогенеза. Поиск фармакологических средств защиты от тератогенных воздействий отвечает поставленной государственной задаче по охране и сохранению репродуктивного здоровья населения России (Постановление общего собрания РАМН, 2008). Ее решение требует изучения механизмов тератогенеза и, на этой основе, возможных путей предупреждения и коррекции тератогенных воздействий.

Особое внимание в области изучения тератогенеза привлекают генотоксиканты - вещества, вызывающие повреждения ДНК и мутагенез [10]. Роль мутагенеза в становлении тератогенных повреждений широко обсуждается, в настоящий момент имеются сведения, указывающие на тесную сопряженность тератогенных и цито-генетических эффектов ряда соединений [167]. В свою очередь, роль повреждений ДНК в тератогенезе практически не исследована из-за методических трудностей. Только с появлением метода «ДНК-комет», в модификациях, позволяющих оценивать ДНК поврежденность клеток различных тканей in vivo [44], открылись новые перспективы исследования генотоксических механизмов тератогенеза.

Возможная роль мутагенных поражений и повреждений ДНК в тератогенезе позволили предположить, что в качестве средств профилактики тератогенеза могут применяться вещества, обладающие антимутагенной активностью. В частности, лекарства, антимутагенная активность которых была установлена и исследована в НИИ фармакологии им. В.В. Закусова НИИ фармакологии РАМН [43].

В этой связи внимание привлекает новый отечественный анксиолитик афобазол, разработанный в ГУ НИИ фармакологии РАМН им. В.В. Закусова под руководством академика РАМН С.Б. Середенина и продемонстрировавший в экспериментах на млекопитающих выраженные антимутагенные свойства [48, 84].

Цель исследования. Целью настоящей работы явилось комплексное исследование влияния афобазола на тератогенез и ДНК-повреждения в эмбриональных тканях и плаценте, индуцированные известным мутагеном и тератогеном циклофос-фамидом.

Основные задачи исследования.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Адаптировать циклофосфамидную модель тератогенного действия к условию получения максимального тератогенного эффекта без увеличения спонтанной гибели эмбрионов в период активного органогенеза.

2. Оценить влияние афобазола в разных дозах при однократном введении на 14 день беременности и трехдневном введении на 13-15 днях беременности, на тератогенез, индуцированный циклофосфамидом.

3. Исследовать временные и дозовые зависимости влияния афобазола на индуцированные циклофосфамидом ДНК-повреждения и апоптоз в эмбриональных тканях и плаценте.

4. Провести анализ взаимосвязи между повреждениями ДНК в эмбриональных тканях и плаценте с возникновением пороков развития эмбрионов.

Научная новизна. Впервые установлено, что анксиолитик афобазол, обладающий антимутагенными свойствами, при различных режимах введения, дозозависи-мо снижает тератогенный эффект циклофосфамида. В частности, под действием афобазола показано уменьшение количества эмбрионов с грубыми аномалиями: менингоэнцефалоцеле, краниошизис, микрогнатия, гипогнатия, протрузия языка, омфалоцеле, тератома, повреждения передних и задних конечностей, расщелина позвоночника (Spina bifida), сколиоз, гидроцефалия, ураношизис. Антигенотокси-ческая активность афобазола впервые выявлена в эмбриональных тканях и плаценте, что дополняет ранее установленные данные об антимутагенных свойствах этого препарата в клетках соматических тканей. Сформулирована рабочая гипотеза о роли предмутационных поражений ДНК в эмбриональных тканях и плаценте в формировании тератогенных эффектов. Установлено, что увеличение и разнообразие аномалий развития эмбрионов коррелирует с уровнями ДНК-повреждения и апоп-тоза не только в эмбриональных тканях, но также в клетках плаценты.

Научно-практическая значимость. Совокупность полученных данных создает научно-обоснованную базу для поиска средств фармакологической профилактики тератогенеза и определяет актуальность изысканий антитератогенов среди соединений с антимутагенными свойствами, расширяет представления о методических возможностях метода «ДНК-комет», впервые апробированного при определении целостности ДНК в эмбриональных и плацентарной тканях.

Практически важным является выявленное совпадение доз, в которых афобазол -проявляет основной анксиолитический эффект, антимутагенное и антитератогенное действие, что открывает перспективы расширения показаний его клинического применения.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

выводы

1. Определены условия эксперимента (20 мг/кг, на 14 день беременности у крыс, в/б), при которых циклофосфамид оказывает 100 % тератогенный эффект без увеличения гибели эмбрионов.

2. Афобазол при однократном пероральном введении в дозах 1, 10 и 100 мг/кг на 14 день беременности статистически значимо, дозозависимо уменьшает тератогенный эффект циклофосфамида, в дозах 1 и 100 мг/кг полностью устраняет микроцефалию и микрогнатию, в дозе 100 мг/кг - омфалоцеле и повреждения передних конечностей.

3. Афобазол при трехкратном пероральном введении в дозах 1, 10 и 100 мг/кг на 13-15 дни беременности значимо, дозозависимо уменьшает количество регистрируемых аномалий плодов и в дозе 1 мг/кг полностью устраняет микроцефалию у животных, получавших циклофосфамид.

4. Циклофосфамид, применяемый в дозе 20 мг/кг, на 14 день беременности у крыс, в/б, статистически значимо увеличивает поврежденность ДНК и количество апоптотических клеток в эмбриональных тканях и плаценте.

5. Афобазол в дозах 1, 10 и 100 мг/кг при 24 часовой экспозиции достоверно снижает повреждения ДНК, индуцированные циклофосфамидом, в клетках плацент и эмбрионов

6. Афобазол в дозах 1, 10 и 100 мг/кг при 20 и 24 часовом сроке экспозиции, статистически значимо и дозозависимо снижает количество апоптотических клеток в плаценте животных, получавших циклофосфамид.

7. Выявлена корреляция между поврежденностью ДНК в эмбриональных тканях и плаценте и количеством зарегистрированных пороков развития эмбрионов.