Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Фенотипическая характеристика лимфоцитов и реактивность их с агонистическими моноклональными антителами у здоровых павианов гамадрилов

1 1 Л \' г I

1 5 ДЬН 'Д28

На правах рукописи

ЧЕПНЯН ЕЛЕНА РАЗМИКОВНА

ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИМФОЦИТОВ И РЕАКТИВНОСТЬ ИХ С АГОНИСТИЧЕСКИМИ МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ У ЗДОРОВЫХ ПАВИАНОВ ГАМАДРИЛОВ.

14.00.36- Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1996

Работа выполнена в Институте медицинской приматологии РАМН г.Сочи

Научный руководитель: Кандидат медицинских наук

Л.В. Инджия

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук: Кандидат биологических наук:

Е.Г. Славина Т.К. Лопатина

Ведущая организация- Институт иммунологии МЗ России

К 176.01.02. Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского (125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИИЭМ им. Н.Г.Габричевского с

Автореферат разослан 1996 года

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат медицинских наук Л.И.Новикова

Защита диссертации состоится "Ль в " " часов на заседании диссер

".Ж " 1996 г.

нацИонного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Фундаментальные знания о функционировании различных звеньев клеточного и гуморального иммунитета на молекулярном уровне, включающие подробную фенотипическую характеристику нормальных лимфоцдных клеток, в частности Т- и В- лимфоцитов, и процессов их активации, необходимы для понимания механизмов регуляции иммунного ответа, процессов активации, трансформации и малнгниза-ции, природы иммунодефицитных состояний при различных патологических процессах, а также для разработки путей рациональной иммунокоррекции и иммунотерапии.

Т- и В- лимфоциты павианов, аналогично клеткам человека,. зкспресснруют различные поверхностные антигены, определение которых имеет большое значение для изучения их роли в иммунном ответе. Эти антигены являются специфическими мембранными рецепторами, определяемые соответствующими моноклональными антителами (МоАТ). Часть этих МоАТ к лейкоцитарным дифференцировочным антигенам человека перекрестно реагирует с поверхностными антигенами лимфоцитов приматов, в том числе павианов (Clark et al., 1983; Магауа-ma 1986; Инджия и др., 1990; Indzhiia, Chepnian 1994). Имеющиеся в литературе сведения в отношении фенотипических особенностей лимфовдных клеток павианов разных видов ограничены небольшим спектром использованных МоАТ. В них также отсутствует сравнительный анализ экспрессии различных антигенов лимфоцитами периферической крови и лимфатических узлов.

В современных исследованиях МоДТ к лейкоцитарным антигенам используются не только для определения того или иного антигена, но и в качетве активаторов пролиферации лимфоцитов. Из более чем тысячи известных в настоящее время мышинных МоАТ к дифференцировочным лейкоцитарным антигенам человека, объедененных в 130 кластеров дифференци-ровки (СД), лишь небольшое их количество имеет агонистичес-кую активность, т.е. после контакта со специфической клеточ-

.') -

ной детерминантой они активируют соответствующие субпопуляции лимфоцитов и вызывают их пролиферацию и дифференци-ровку. Так МоАТ СД2, СДЗ, СД5, СД28» СД451Ю стимулируют пролиферацию Т- клеток (Ledbetter et al., 1985; Clark et al., 1986), а В- клеточные МоАТ СД20, СД21, СД22, СД23 и С-Д40, а также airra- slgM могут активировать покоящиеся B-клетки и/или усиливать пролиферацию активированных В- клеток (Ledbetter et al., 1987; Beiske et al., 1988; Clark et al., 1989; 1990).

Эти данные свидетельствуют в пользу того, что некоторые поверхностные дифференцировочные молекулы регулируют клеточную активацию и дифференцировку, однако действие этих маркеров ин виво до конца не изучено. Агонистические свойства некоторых МоАТ изучены для лимфоцитов человека, и некоторых видов макак (Clark, Draves 1987), но неизвестны для широко используемого в различных экспериментах вида- павианов гамадрилов.

Цель работы. Определение фенотипических и функциональных особенностей мононуклеаров периферической крови (МПК) и клеток, лимфатических узлов (КЛУ) здоровых павианов гамадрилов в сравнительном аспекте в отряде приматов (обезьяны, человек).

Задачи исследования.

1. Изучить фенотипические особенности лимфоидных клеток крови и лимфатических узлов здоровых павианов разного возраста (детеныши, подростки., половозрелые) с панелью из 20-ти Т- и В- клеточных МоАТ к лейкоцитарным дифференциро-вочным антигенам человека и макак.

2. Установить параметры пролиферативного ответа лимфоцитов на стимуляцию Т- клеточными митогенами (ФГА и Кон А).

3. Определить влияние супрессоров моноцитоидной серии (липнущих к пластику и индометацин-чувствительных) на уровень бласттрансформации лимфоцитов, индуцированной митогенами.

4. Изучить агонистические свойства некоторых МоАТ в отношении МПК и КЛУ павианов самостоятельно, в комбинации

друг с другом, а также с ФГА или клеточным промотором РМА.

Научная новизна работы.

Изучены фенотипические и функциональные параметры лимфоидных клеток здоровых павианов гамадрилов в сравнительном аспекте в отряде приматов, с использованием широкой панели Т- и В- клеточных МоАТ к лейкоцитарным антигенам человека, которые использованы как для фенотипирования, так и изучения процессов активации и пролиферации с использованием агонистических свойств некоторых МоАТ. Показано, что МоАТ 9.3 анти- СД28. ЗАС5 анти- СД451Ю, G28-5 анти- СД40, G28-8 анти- Bgp95 и 2СЗ анти- slgM распознают свои функциональные гомологи на лимфоцитах павианов, а молекулы, распознаваемые этими МоАТ, в частности, СД28 п СД40 очень консервативны в процессе эволюции приматов.

Научно-практическая ценность работы.

Обезьяны, вследствие уникального биологического сходства с человеком, являются наиболее адекватными экспериментальными объектами для решения многочисленных задач экспериментальной биологии и медицины. Вследствие этого, большую значимость приобретают сведения о функционировании различных систем, в том числе клеточного иммунитета, у обезьян в норме, а также в сравнительном аспекте в отряде приматов (обезьяны, человек). Изучение антигенной структуры и определение функциональной значимости различных поверхностных регулирующих белков здоровых павианов с использованием широкой панели МоАТ к дифференцировочным лейкоцитарным антигенам человека имеет существенное значение для понимания процессов нормальной дифференцировки лимфоидных клеток приматов, в том числе человека, механизмов активации, пролиферации и опухолевой трансформации с последующим развитием лим фоидных опухолей, а также разработки методов иммунокоррекцин п эффективной иммунотерапии различных патологических состояний.

Основные положения выносимые на зашэту.

1. Т- и В- лимфоциты павианов экспрессируют большинство поверхностных антигенов, которые распознают МоАТ против лейкоцитарных дифференцировочных антигенов человека.

2. МоАТ против лейкоцитарных дифференцировочных антигенов человека, обладающие агонистической активностью для лимфоцитов павианов, регулируют их процессы активации и дифференцировки, т.е. эти МоАТ распознают свои функциональные гомологи на лимфоцитах павианов.

Апробация диссертации.

Основные положения работы представлены на Всесоюзном симпозиуме: "Злокачественные лимфомы и ассоциированные с ними лимфотропные вирусы", проходившем на базе НИИЭПиТ (Дагомыс, 15- 17 май 1984 г.), на Республиканском слете молодых медиков (Тбилиси, 15-20 май, 1986г.), а также на XV Международном Приматологическом конгрессе (Бали, Индонезия, 3- 8 август 1994). Апробация проведена на ученом совете Института медицинской приматологии РАМН, г. Сочи- Адлер, 3 октября 1996.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 научные работы.

Объем и структура диссертации. Работа представлена на 126 стр. машинописного текста, иллюстрирована таблицами и рисунками, состоит из введения, 3- х глав, обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Библиографический указатель включает 215 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования. Изучались мононук-леары периферической крови (МПК) и клетки биопсированных лимфатических узлов (КЛУ) 110 здоровых павианов гамадрилов (Papio hamadryas) разных возрастных групп, родившиеся в Сухумском питомнике и МПК 20 сотрудников института. Использованы 19 МоАТ к лейкоцитарным дифференцировочным антигенам 10- ги СД кластеров человека и одно МоАТ FN18 против СДЗ макак; Т- клеточные митогены: фитогемагглютинин (ФГА) и конканавалин (Кон А); ингибитор простоглацдинов-индометацин; клеточный промотор 12- форбол 13- меристат ацетат (РМА).

В работе использованы современные методы фенотипи-рования лимфоцитов с использованием МоАТ в непрямом имму-нофлюоресцентном тесте, а также методы активации лимфоцитов поликлональными митогенами и МоАТ. МПК выделялись в градиенте фиколл-верографина по стандартной методике (Воу-um 1968), с некоторыми модификациями.

Фенотипирование проводилось на живых клетках, прикрепленных к стеклу поли- L-лизином (молекулярный вес 6-9 К, "Serva"). В качестве второй антисыворотки использовались анти- мышинные F(ab/)2 козьи антитела, меченные ФИТЦ.

В пролиферативных тестах МПК и КЛУ культивировали в концентрации lxlO^/мл в 96- луночных плоскодонных планшетах (Linbro "Flow Lab".) в общем объеме 0,2 мл (lxlO5- 2x10s клеток на лунку) в полной среде RPMI- 1640, содержащей 2 мл L- глютамина (100 мкг/мл "Flow Lab"), 100 ЕД/мл пени-цилина и стрептомицина (0,1 мкг/мл) с 20% эмбриональной телячей сывороткой (ЭТС), в три или квадриплетах в течение 72- 96 часов при 37°С + 5% С02. За 18-20 часов до окончания инкубации клетки метились тимидином по 0,5 мкКи/лунка (удельная активность 5,4 мкКи). Затем клетки переносились на стекловолокнистые фильтры с помощью автоматического хор-вестра ("Tltertek"). Нерастворимая радиоактивность просчи-

тывалась с использованием толуольного сцинтиллятора в р-сцингиляционном счетчике "Весктап".

При использовании одного активатора (митоген, МоАТ) определялся индекс стимуляции (ИС), расчитанный по следующей формуле:

включение метки в культуры с митогеном (имп/мин)

ИС=------------------------------------------------------------------

включение метки в культуры без митогена (имп/мин)

При сочетанном действии двух активаторов (два МоАТ или МоАТ + активатор) определялись два индекса усиления (ИУ1-отношение включения ^Н- тимидина в культуры с двумя активаторами по отношению к включению с первым и ИУ2- то же по отношению к включению со вторым активатором). Во всех экспериментах МоАТ и/или факторы добавлялись к клеткам с начала культивирования. МоАТ предварительно титровались. Их конечная концентрация в 1 мл обозначена в таблицах или подписях к рисункам.

Статистическая обработка проводилась общепринятыми методами. Достоверность различий между сравниваемыми величинами определяли с помощью 1- критерия Стюден-та.

Соавторами в работах являются: Инджия Л.В., Яковлева Л.А., Кокоша Л.В., Чикобава М.Г., Деменкова Н.П.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Фенотипически охарактеризованы МПК и КЛУ павианов в сравнительном аспекте с человеком.

Таблица 1 иллюстрирует частоту экспрессии различных антигенов на лимфоцитах крови и лимфоузлов павианов, а также на лимфоцитах человека. Показано, что количество клеток, экспрессирующих пан-Т- клеточные маркеры СД2, СДЗ и СД4 у павианов ниже, чем у человека. Однако, для Т- клеточных маркеров статистически значимые различия между МПК павианов и человека определяются лишь для ОКТ 11 анти- СД2 (53±3 против 69±5 у человека, Р<0,0001>, а также для ОКТ4 анти- СД4 (32±1 против 48±3, Р<0,0001). Обращает внимание, что содержание клеток, экспрессирующих СД8 у павианов при использовании обоих анти- СД8 MoAT ОКТ8 и G10-1 практически не отличается от такового у человека и примерно равно содержанию позитивных клеток СД4. В связи с чем, соотношение СД4/СД8 у павианов, также, как и у других видов обезьян (шимпанзе, гибоны, разные виды макак, Clark et al., 1983) колеблется от 0,9 до 1,3 и никогда не достигает классических параметров у человека (1,8- 2,0).

Не обнаружено также статастически значимых различий между павианами и человеком в содержании в крови клеток, экспрессирующих анти- СД28 (40±12 против 49±8 у человека) и анти- СД45ИО (37±14 против 36±25 у человека). Также не зарегестрировано статистических различий в содержании разных субпопуляций Т- клеток среди МПК и КЛУ.

Количество В- лимфоцитов в крови у павианов, экспрессирующих СД19 и СД20 несколько выше, чем у человека (16±7 против 11±5 и 21±7 против 13±5 для СД19 и СД20 соответственно), но эти различия статистически не значимы. Количество клеток, экспрессирующих антигены

Таблица 1.

Фенотипическая характеристика МПК и КЛУ здоровых павианов и МПК человека (%±БО).

МоАТ АГ* Человек Павианы

МПК МПК КЛУ

ОКТ 11 СД2 69±5 53±3 н.д**

(10) (10)

9.6 СД2 61±7 48±14 52±16

- . (10) (14) (12)

НИв сдз 41±15 49±12

(9)

(13)

БР34 сдз 55±2 46±10 51±12

(10) (10) (5)

ОКТ4 СД4 4&3 - 32± 1 38± 9

(10) (32) (15)

С17-2 СД4 44±2 26±11 40± 9

(10) (19) (14)

ОКТ8 СД8 27± 2 27± 9 н.д.

(10) (30)

ОЮ-1 СД8 28± 8 34± 9 28±10

(10) (20) (14)

9.3 СД28 49±8 40±12 45±12

(10) (16) (11)

НВ37 СД19 11±5 16± 7 13±6

(10) (25) (11)

1Р5 СД20 13±5 21±7 18±9

(10) (25) (15)

028-5 СД40 26±10 28±9 25±9

(20) (11) (10)

С28-8 Bgp95 25±9 27±5 24±5

(20) (10) (10)

НВЮа НЕА- 24±10 23±9 23±5

(19) (13) (8)

Продолжение таблицы 1.

МоАТ АГ* Человек МПК Павианы МПК КЛУ

ИК01 НЬА- ои н.д. 11±1 (31) н.д.

ОК1а НЬА- н<д. 12±2 (23) н.д.

2СЗ в^М 10±4 (10) 15±2 (20) 14±б (15)

стТА4 4±Г (10) 10±б (20) 10±5 (14)

ЗАС5 СД45 КО Зб±25 (20) 37±14 (12) 31±11 (12)

2АЗ СД25 1±1 (10) 27±11 (22) 32±14 (16)

180 н.д. 13±3 (б) 10±3 (б)

каппа н.д. 9±3 (б) 5±2 ( б)

лямбда н.д. 7±2 (б) 3±2 ( 5)

*- антигены нет данных

СД40, В§р95 и НЬА- БЕ среди МПК павианов и человека примерно одинаково.

Содержание Б- лимфоцитов среди МПК, экснресси-рующих поверхностные ^М и у павианов также выше, чем у человека, но и эти различия статистически не достоверны. Показано, что количество клеток, экспрессирующих

В- клеточные маркеры среди МПК и КЛУ павианов, существенно не различается для СД19, СД20, СД40 и Bgp95, также как и уровень экспрессия легких цепей каппа и лямбда как среди МПК (9±3) и (7±2), так и среди КЛУ (5 ±3) и (3±2) соответственно. Это отличается от классических параметров для человека, у которого содержание клеток с легкими цепями каппа примерно в два раза выше клеток с цепями лямбда.

Необходимо подчеркнуть, что у исследуемых нами здоровых павианов Сухумского стада, регистрируется повышенное содержание клеток, экспрессирующих рецепторы к интерлейкину 2, как среди МПК, так и КЛУ, составляя в среднем 27% и 32% соответственно против 1% у человека. Это, вероятнее всего, связано с широким носительством вируса STLV- 1 в этом стаде. У макак, а также павианов гамадрилов других колоний содержание СД25 позитивных клеток не превышает 5% (Indzhiia et al., 1992).

При изучении МПК группы детенышей в-возрасте от 8- 12 месяцев с панелью из 12- ти Т- и В- клеточных МоАТ обнаружено сниженное содержание клеток, экспрессирующих как Т-, так и В- клеточные антигены (за исключением СД8 и slgM), в сравнении со взрослыми особями (табл.2 и табл.3).

Обращает внимание умеренное повышение содержания клеток, экспрессирующих рецепторы к интерлейкину 2- (8,5±1,3). Это свидетельствует об активации части Т- клеток у детенышей уже в возрасте 8- ми месяцев.

Не обнаружено существенных различий в уровне экспрессии Т- клеточных антигенов лимфоцитами крови подростков 2- 4- х лет и взрослых обезьян (табл. 4).

Это касается как общего содержания Т- клеток, выявляемых ОКГ11 антн- СД2, а также СД4+ и СД8+ субпопуляций.

Показатели соотношения СД4/СД8 также близки у животных этих двух возрастных групп.

Количество клеток, экспрессирующих В- клеточные антигены СД20 и slgM, у подростков и половозрелых

- и -

Таблица 2.

Содержание лимфоцитов у детенышей в возрасте от 8 до 12 месяцев, экспрессирующих Т- клеточные антигены.

М о А Т (%)

9.3 010-1 017-2 ОКТ4а ЗАС5 2АЗ

NN

1411 37,8 36,1 15,0 21,1 36,8 9,0

1398 26,1 25,0 18,0 21,0 20,8 8,0

1399 22,5 30,2 17,0 20,3 15,9 10,0

1333 26,7 25,8 25,0 13,4 23,7 7,0

М±т 28,0 29,1 19,0 19,0 24,3 8,5

(6,5)* (5,0) (4,1) (4,0) (8,9) (1,3)

*- ш (средняя ошибка средней арифметичекой)

Таблица 3.

Содержание лимфоцитов у детенышей в возрасте от 8 до 12 месяцев, экспрессирующих В- клеточные антигены.

М о А Т (%) * ЬШ37 1Р5 028-5 2СЗ аТА4 НВЮа

NN

1411 9,6 16,1 19,5 14,7 2,0 17,7

1398 7,0 18,4 27,1 11,3 7,0 16,5

1399 15,1 19,5 18,1 22,5 6,0 16,0

1333 10,0 14,8 14,4 17,2 3,9 17,9

М±т 10,4 (3,4)* 17,2 (2,1) 19,7 (5,3) 16,4 (4,7) 4,7 (2,2) 17,0 (0,9)

*- т (средняя ошибка средней арифметичекой)

Таблица 4.

Экспрессия поверхностных антигенов лимфоцитами павианов гамадрилов разных возрастных групп.

М о А Г (М ± т)

ОКТ11 ОКТ4 ОКТ8 ОКТ4/ ОКТ8 1Б5 2СЗ оТА4

Подростки 1,1- 4 лет 48,4±1.8 <Л1=5 )* 31,3±1,6 (ц=32) 2б,5±1,1 (п=25) 1,28±0,1 (п=23) 23,4±5,9 (п=5) 19,4±б,3 (п=6) 10,б±3,7 (п=4)

Половозрелые 4,1- 15 лет 53,0±3,0 (п=10) 32,0±1,3 (п=32) 27,1±1,0 (п=30) 1,21±0,1 (п=2б) 21,0±2,0 (п=25) 15,0±2,0 (п=20) 10,6±6,0 (п=20)

количество исследованных животных

животных также существенно не отличаются, а содержание клеток, экспрессирующих в^О уже у подростков достигает уровня половозрелых обезьян (10,6±3,7 и 10,6±6,0 соответственно), что свидетельствует о "взрослом" характере экспрессии поверхностных иммуноглобулинов.

Таким образом, показана перекрестная реактивность со всеми 19- тью использованными МоАТ против лейкоцитарных дифференцировочных антигенов человека и одним МоАТ РЫ18 против СДЗ макак с поверхностными антигенами МПК и КЛУ павианов гамадрилов. Клетки павианов, без возрастных отличий, экспрессируют все изученные антигены, которые выявляются на клетках человека, с использованными МоАТ к человеческим лейкоцитарным антигенам. Как правило, процент Т- клеток, выявляемых Т-клеточными МоАТ анти- СД2, СДЗ и СД4 в периферической крови ниже, а В- клеток, зкспресирующих В- клеточные антигены СД19 и СД20, а также поверхностные 1£М и

выше, чем у человека. Эти различия статистически значимы для ОКТ11 анти- СД2 и ОКТ4 анти- СД4. Не обнаружено статистически значимых различий в содержании Г- клеток, выявляемых МоАТ СД2, СДЗ и СД28, а также клеток, несущих В- клеточные маркеры СД19, СД20, СД40 а я^М среди МПК и КЛУ павианов. У детенышей до года з крови снижено содержание лимфоцитов, зкспрессирую-цих как Т-, так и В- клеточные антигены (за исключением ЗД8 и в^М), которое практически достигает величин по-ювозрелых животных у подростков в возрасте 2- х лет.

Поскольку иммунный ответ сопряжен с пролиферацией и щфференцировкой различных иммунокомпетентных клеток, гаки первоначально были изучены параметры пролифератив-юго ответа лимфоцитов павианов на ФГА и Кон А. По данным >азных авторов ответ на стимуляцию митогенами у здоро-1ых людей широко варьирует и коэффициент вариабельнос-и превышает 60% (Оогеу, 218Ье1Ьо1т 1980; 218Ье1Ьот е1 1., 1981). Механизмы этой вариабельности мало изучены. Тзвестно, что ответ на стимуляцию Т- клеточными митоге-

нами у человека зависит от многих факторов (среда, сыворотка, концентрация клеток и митогенов, условия и длительность культивирования и др.). Клетки моноцитоидной серии способствуют стимуляции или ингибируют пролифе-ративный ответ в зависимости от их концентрации и используемого митогена (Novogrodsky et а1., 1979).

После определения оптимальныой концентрации митогенов, которая для ФГА составила 1 мкг/мл, а для Кон А- 30 мхг/мл и оптимального времени культивирования лимфоцитов павианов- 72 часа, изучен уровень пролиферативного ответа у группы половозрелых животных (табл. 5).

Таблица 5.

Пролиферативный ответ лимфоцитов крови половозрелых . павианов гамадрилов на ФГА и Кон А.

Митоген Концтра- имп./мин.* Колебания СУ*

ция

мкг/мл

С.В."* 1188±618 395-2880

1 4629,3±745,4 286-35453 125,2

ФГА

2,5 -234,6±125,9 192-11353 125,9

(19)

10 4143,3±133,0 289-23690 133,0

Кон А (23)

30 10257,б±98Ю 420-32304 98,1

(51)

включение 3Н- тимиднна " коэффициент вариабельности

спонтанное включение (без митогена) количество проведенных исследований

Как видно из представленных данных Кон А является более сильным мшогеном для МПК павианов. Средняя величина включения ^Н- тимидина на оптимальную концентрацию Кон А (10257±9180) более чем в два раза превышает аналогичные значения для ФГА (4649±745.4), Р<0,001. Обращает на себя внимание значительная вариабельность уровня ответа как на оба митогена (СУ от 98- 133), так и уровня спонтанного включения.

Не обнаружено четкой зависимости пролиферативного ответа на оба митогена от возраста (подростки, половозрелые обезьяны).

Изучение влияния супрессоров моноцитоидной серии (липнущих к пластику и ицдометацин-чувствительных) на уровень пролиферативного ответа МПК павианов, индуцированной ФГА и Кон А, показало, что у 40-45% животных после отделения липнущих к пластику клеток ответ на стимуляцию ФГА возрастал в 3 раза, а на Кон А- в 4 раза. Это свидетельствует в пользу того, что у павианов в части случаев низкий пролифе-ративный ответ на стимуляцию поликлональными Т- клеточными митогенами связан с ингибирующим влиянием липнущих к пластику клеток, большая часть которых представлена циркулирующими моноцитами.

Известно, что индометацин является ингибитором просто-гландинов, в частности простогландина Е (ПГЕ), выделяемого моноцитами (Уатапк^о е1 а1., 1980). Нами показано, что при добавлении в культуры одновременно с митогенами индо-метацина, у 42 и 47% животных соответственно на ФГА и Кон А значительно усиливался уровень пролиферативного ответа. ИУ для ФГА составил- 2,49±1,56, а для Кон А- 2,06±1,04. Это свидетельствует в пользу того, что у части животных низкий уровень пролиферативного ответа на ФГА и Кон А связан с индометацин-чувствительными супрессорами, причем супрессор-ный эффект этих клеток несколько выше на стимуляцию ФГА, чем Кон А. Это согласуется и с более низким уровнем ответа лимфоцитов павианов гамадрилов на стимуляцию ФГА, чем Кон А.

Изучены агонистяческие свойства 6- ти Т- и В- клеточных МоАТ с известной агонистической активностью по отношению к лимфоцитам человека и макак (Clark, Draves 1987).

В таблицах 6 и 7 суммированы результаты стимуляции МПК и КЛУ павианов исследуемыми МоАТ, ФГА и РМА самостоятельно, а в таблицах 8 и 9 результаты сочеганного действия двух активаторов.

Так как пролиферативный ответ значительно варьировал у разных обезьян, при статистической обработке они были разбиты на несколько групп в зависимости от уровней индексов стимуляции.

Умеренную агонистическую активность по отношению к МПК павианов, в отличие от клеток человека и макак (Clark, Draves 1987), проявили МоАТ 9.3 анти- СД28 (ИС 5/9*1,8) и ЗАС5 анти- СД45ИО (5,9±3,2, табл. 6), причем последние, в отличие от анти- СД28 также активировали КЛУ, правда менее интенсивно (ИС 2,2±1.6, табл. 7). При использовании РМА (он также самостоятельно активировал как МПК- ИС 5,0±1,8, так и КЛУ- ИС 4,3±3,0), в качестве костимулятора к анти- СД28, значительно повышался пролиферативный ответ МПК (ИУ1 4,9 ±4,8, ИУ2 2,7±2,4, табл. 8), и лишь незначительно КЛУ (ИУ1 1,9±1,7, ИУ2 2,2±2,7, табл. 9).

Активация же анти- СД451Ю при костимуляции РМА повысилась лишь незначительно для МПК (ИУ1 1,3±1,0, ИУ2 1,7±1,6, табл.8), а для КЛУ практически не изменилась (табл.9). То же самое наблюдалось и при использовании в качестве костимулятора к анти- СД451Ю ФГА как для МПК (ИУ1 1,9*1,8, ИУ2 2,4±2,0), так и для КЛУ (ИУ1 0,7±0,2, ИУ2 1,6*1,4).

Высокий костимулирующий эффект РМА для анти- СД28 при стимуляции МПК павианов сходен с анологичным для Т-лимфоцитов человека и макак (Ledbetter et al., 1985; Ledbetter et al., 1986; Martin et al., 1986; Clark, Draves 1987). Не заре-гестрировано агонистической активности для FN18 анти- СДЗ, как в отношении МПК, так и КЛУ (табл. 6, табл. 7).

Таблица б.

Оценка стимуляции лимфоцитов крови павианов гамадрилов МоАТ, ФГА иРМА

ИС" мин.- кол-во

Стимулы (М±БО) макс. жив-ных

ФГА 1) 1,7±0,5 1,1-2,7 6

1 мкг/мл 2) 4,8±1,4 4,7-9,2 12

3)30,6±19,0 11,7-52,0 5

РМА 1) 2,5±0,3 2,2-2,9 3

2 нг/мл 2) 5,0±1,8 3,2-8,7 10

3)20,6±б,3 15,2-27,7 4

ЕЫ18 1) 1,0±0,5 0,7-1,9 18

анти- СДЗ 2>

1 мкг/мл 3)21,0±14,0 11,0-30,6 2

9.3 1) 1,7±0,3 1,1-2,1 10

анти- СД28 2) 5,9±1,8 3,7-9,6 10

1 мкг/мл 3)192±135 110-347 3

АС5 антн- 1) 2,б±0,5 1,9-3,0 4

СД451Ю 2) 5,9±3,2 3,7-9,6 4

0,2 мкг/мл 3)498 1

2СЗ 1) 1,4±0,5 1,0-2,7 9

анти- 2) 8,7 1

50 мкг/мл 3)73,3 1

028-5 1) 1,7±0,5 1,1-2,5 14

анти- СД40 2) з,з±о,з 3,1-3,5 2

1 мкг/мл 3)72.0±87,0 14,5- 5

221,5

028-8 1) 1,4±0,б 0,9-2,5 5

aнти-Bgp95 2) 3,7 1

10 мкг/мл 3)16,6±7,2 11,5-21,7 2

*- индекс стимуляции

1)- слабая стимуляция; 2)- умеренная; 3)- высокая.

Таблица 7.

Оценка стимуляции КЛУ павианов гамадрилов МоАТ, ФГА и РМА.

Стимулы ИС мин.- кол-во

(M±SD) макс. жив-ных

ФГА 1) 2,0±0,4 1,6-2,5 2

1 мкг/мл 2) 4,8±2,5 3,1-6,7 3

3)21,8±9,5 11,6-30,5 4

РМА 1)

2 нг/мл 2) 4,3*3,0 2,5-9,4 5

3)

FN18 1) 1,4±0,9 0,7-1,9 6

анти- СДЗ 2)

1 мкг/мл 3)

•9.3 1) 1,9±0,9 1,1-2,9 3

анти- СД28 2) 3,7 1

1 мкг/мл 3)

ЗАС5 авгги- 1) 2,2±1,б 1.1-3.1 7

СД45ЯО 2)

0,2 мкг/мл 3)

2СЗ 1) 1,5±0,3 1,2-1,9 3

анти- slgM 2) 5,9±3,0 3,8-8,1 3

50 мкг/мл 3)

G28-5 1) 1,8±0,6 1,0-2,7 8

анти- СД40 2) 7,9 1

1 мкг/мл 3)

G28-8 1) 0,9±0,8 0,3-2,1 4

анш-Вбр95 2)

10 мкг/мл 3)

Условные обозначения (см. табл. 6)

Таблица 8.

Оценка сочетанной стимуляции МПК МоАТ или сочетаниями их с DTA или РМА.

Зтиму- ИУ1 1Ы (M±SD) мин./ кол-во ИУ2 макс, жив-ных (M±SD) мин./ кол-во макс, жив-ных

7N18 + j28-5 2,0±1 6 0,2-5,7 15 2,5±2,б 0,1-10,7 15

?N18 + 3gp95 1,9±1,6 0,8-6,3 И 1,2±0,8 0,6-2,8 10

Э.З + 4,9±4,8 PMA 48,5±17,3 0,3-12,3 28,5-70,0 17 2,7± 2,4 5 109,1±19,6 0,2-13,6 95,2-123,0 19 2

ЭАС5+ 1,9±1,8 0,2-5,2 ФГА 29,9±19,3 16,3-43,5 11 2 2,4± 2,0 28,1±18,7 0,2-6,5 4,9-41,3 11 2

3AC5+ 1,3±1,0 PMA 15,2±6,9 0,5-3,0 11,2-25,4 10 4 1,7±1,6 0,2-5,8 13

2C3 + G28-5 2,8±4,3 0,7-17,8 16 3,6±4,6 0,5-13,8 15

2C3 + G28-8 1,4±0,9 0,3-2,53 7 1,3±1,0 0,2-2,9 7

G28-5 + ФГА 5,6±8,8 0,3-38,5 31 3,9±7,0 0,3-34,2 31

G28-5 + PMA 4,3±5,9 0,4-26,0 25 2,7±3,7 0,3-14,6 24

G28-8 + ФГА 3,7± 5,7 0,6-20,0 15 4,5±7,6 0,4-29,8 16

Таблица 9.

Оценка сочетанной стимуляции КЛУ МоАТ или сочетаниями их с ФГА или РМА.___

Стимулы ИУ1 (M±SD мин./ кол-во макс, жив-ных ИУ2 (M±SD) мин./ кол-во макс, жив-ных

FN18+ G28-5 1,6±0,9 0,6-3,2 6 2,2±2,2 0,4-6,0 6

FN18+ G28-8 1,8±1,1 1,1-2,6 2 4,3±4,9 0,8-7,8 2

9.3+ РМА 1,9±1,7 222,5 0,7-5,3 6 1 2,2± 2,7 2,23 0,3-8,2 6 1

ЗАС5+ ФГА 0,7±0,2 0,4-1,0 5 1,6±1,4 0,5-3,6 4

ЗАС5+ РМА 1,1±0,2 8,3 1,0-1,3 3 1 0,8±0,7 26,4 0,1-1,5 3 1

С23+ G28-5 б,4±7,7 0,8-20 8 9,5±12,3 0,4-33,9 7

2СЗ+ Bgp95 25,8 1 11,6 1

G28-5+ ФГА 3,2±3,9 0,3-11,8 9 2,9±3,5 0,4-4,6 9

G28-5+ РМА 2,3±2,7 0,4-7,4 6 1,6±1,2 0,3-3,4 7

G28-8+ ФГА 5,1±6,7 0,7-15,1 4 2,4±3,7 0,1-9,0 5

Ни анти- СД40, ни анти- Bgp95 не оказывали заметного костимулирующего эффекта на FN18, как для МПК, так и для КЛУ (табл. 8, табл. 9).

Использованные В- клеточные МоАТ G28-5 анти- СД40, G28-8 анти- Bgp95 и 2СЗ анти- slgM в большинстве случаев самостоятельно также не обнаруживали агонистической активности по отношению к МПК (табл. 8) и КЛУ (табл. 9) павианов.

В отличие от клеток павианов, анти- Bgp95 обладает агонистической активностью по отношению к лимфоцитам человека (Clark, Draves 1987), а анти- slgM- как к лимфоцитам человека, так и макак (Clark, Ledbetter 1986; Clark, Draves 1987).

Наибольшая активация для МПК регистрировалась при сочетанном действии G28-5 анти- СД40+ФГА (ИУ1 5,6±8,8, ИУ2 3,9±7,0) и СД40+РМА (ИУ1 4,3±5,9, ИУ2 2,7±3,7, табл. 8). Сходный ответ МПК регистрировался на анти- Bgp95+ ФГА (ИУ1 3,7±5,7, ИУ2 4,5±7,6). Для этих двух МоАТ характер ответа МПК и КЛУ сходен, но уровень ответа МПК несколько выше при использовании первых двух комбинаций.

Ответ КЛУ как на 2СЗ анти- slgM, так и комбинации 2C3+G28-5 анти- СД40 был выше (ИУ1 6,4±7,7, ИУ2 9,5±12,3, табл. 9), чем МПК (ИУ1 2,8±4,4, ИУ2 3,б±4,б, табл. 9), т.е. для КЛУ наивысший уровень активации регистрировался при использовании именно этой комбинации.

Таким образом, показано, что все 5 использованных Т- и В- клеточных МоАТ к лейкоцитарным дифференцировочным антигенам человека обнаруживают агонистическую активность для лимфоидных клеток павианов или самостоятельно или в сочетании друг с другом, с ФГА или РМА.

Обнаруженная перекрестная реактивность всех 19- ти Ти В- клеточных МоАТ против лейкоцитарных антигенов человека с поверхностными молекулами на лимфоцитах павианов в сочетании с показанной агонистической активностью для антн-СД28, анти- СД451Ю, анти- slgM, анти- СД40 и анти- Bgp95 свидетельствуют в пользу того, что эти антитела распознают свои функциональные гомологи на лимфоцитах павианов.

Полученные результаты, с анализом литературных данных в отношении человека и двух видов макак позволяют сделать вывод, что такие поверхностные молекулы, как СД28 и СД40, имеющие напвысщую агоппстическую активность, очень консервативны и сохранились в процессе эволюции приматов.

ВЫВОДЫ .

1. Фенотнпически охарактеризованы Т- и В- лимфоциты периферической крови и лимфатических узлов павианов гамадрилов с панелью из 19- ти МоАТ к лейкоцитарным дифференпировочным антигенам 10- ти СД кластеров человека в сравнительном аспекте б отряде приматов (обезьяны, человек). Наибольшие и статистически значимые различия лимфоцитов обезьян с человеком обнаружены лишь для Т-клеток, экспрессирующих ОКТ11 анти- СД2 и ОКТ4 анти-СД4 в сторону их снижения. Характерным отличием для В-клеток павианов является сниженное соотношение между содержанием клеток, экспрессирующих легкие цепи каппа и лямбда, как в периферической крови, так и в лимфоузлах.

2. Показано, что у детенышей обезьян (8- 12 месяцев) в крови снижено содержание лимфоцитов, экспрессирующих как Т-, так В- клеточные антигены (за исключением СД8 и БГдМ), которое достигает величин половозрелых животных к двум годам жизни.

3. Определены параметры пролиферативного ответа моно-нуклеаров периферической крови на фитогемаглютинин (.ФГА) и конканавалин (Кон А). Показано, что Кон А является более мощным Т- клеточным митогеном для лимфоцитов павианов, чем ФГА.

4. Обнаружено, что низкий пролиферативный ответ лимфоцитов павианов на ФГА и Кон А в половине случаев связан с ингибирующим влиянием супрессоров моноцитоидной серии (липнущих к пластику и индометацинчувствительных). 5- Показана неизвестная ранее способность индуцировать пролиферативный ответ лимфондных клеток павианов для

9.3 анти- СД28, ЗАС5 анти- СД454ЕЮ, 2СЗ аяти- sIgMf G28-5 антн- СД40, G28-8 анти- Bgp95 самостоятельно или в сочетании с друг другом, а также с ФГА или РМА. Как правило, пролпферативный ответ клеток лимфатических узлов был ниже, чем лимфоцитов периферической крови.

6. Обнаруженная перекрестная реактивность поверхностных молекул на лимфоцитах павианов со всеми 19- тью Т- и В-клеточными МоАТ против лейкоцитарных антигенов человека в сочетании с показанной агонистической активностью для пяти изученных МоАТ свидетельствуют в польз}' того, что эти антитела распознают свои функциональные гомологи на лимфоцитах павианов.

7. Показанная перекрестная реактивность со всеми изученными МоАТ делает обезьян, и, в частности, павианов, чрезвычайно удобными экспериментальными животными для изучения которых можно использовать большинство коммерческих антител против лейкоцитарных дифференциро-вочных антигенов человека.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Чепнян Е.Р. Использование некоторых методических подходов при стабилизации уровня пролиферативного этвета на стимуляцию ФГА с помощью устранения влияния :упрессоров моноцитоидной серии.//Материалы Респуб-гаканского слета молодых медиков. -Тбилиси. -1986. -С. 136- 437.

!. Иццжия Л.В., Яковлева Л.А., Кокоша Л.В., Чепнян Е.Р., -Гикобава М.Г., Деменкова Н.П. Дисбаланс иммунорегуля-орных клеток и снижение естественных киллеров в период гредлимфомы павианов.//Вестник Академии Медицинских иук СССР. М.:Медшцша. -1987. N.10. -С. 78-82.

Indzhiia L.V., Chepnian E.R. Т- and В- cell panel reactivity on iaboon normal Jimphoid tissues and T- cell malignant lympho-

mas.//In materials of XVth congress of the international primatological society. Bali- Indonesia. -1994. -P. 198.