Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Диагностика стадий канцерогенеза в молочной железе (морфометрическое и плоидометрическое исследование)

На правах рукописи

Григорьева Светлана Геннадьевна.

ДИАГНОСТИКА СТАДИЙ КАНЦЕРОГЕНЕЗА В МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЕ

(МОРФОМЕТРИЧЕСКОЕ И ПЛОИДОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.00.15.—патологическая анатомия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2005

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор

Автандилов Георгий Герасимович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор

Доктор медицинских наук, профессор

Тарасова Людмила Борисовна

Михалёва Людмила Михайловна

Ведущая организация: Государственное учреждение Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина РАМН

Зашита диссертации состоится « /» ßf 2005 г. в у 7 часов на заседании диссертационного совета Д 208.041.02. при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Росздрава по адресу: 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20/1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета по адресу: 125206, г. Москва, ул. Вучетича, д. 10а.

Автореферат разослан

/» №

2005 года.

Ученый секретарь диссертационнорб/бовета, доктор медицинских наук, профес/ар /

Б. М. Уртаев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДОВАНИЯ.

Карцинома молочной железы занимаем первое место в мире по распространенности среди онкологических заболеваний у женщин [Spratt J.S., Donegan W.L., Sidestad С.Р., 2003].

За последние 15 лет в России заболеваемость и смертность злокачественными новообразованиями этой локализации увеличилась более чем в 2 раза [Летягин В.П., Высоцкая И.В., Легков A.A. и др., 1997* Довгалюк А.З., 2001].

Несмотря на доступность самообследования у женщин, введение программ скрининга женского населения, применение новых методов диагностики, добиться больших успехов в снижении заболеваемости карциномой молочной железы на современном этапе не удалось. У подавляющего большинства женщин, почти в 80%, карцинома молочной железы диагностируется на второй и третьей стадии заболевания, что свидетельствует о низкой выявляемое™ заболевания в его начальных стадиях [Плетнев С.Д., Мазурин В.Г., 1985; Се-миглазов В.Ф., 1989].

Широкая распространенность новообразований молочной железы диктует необходимость решения вопросов, связанных с ранней диагностикой карцином и предраковых изменений в молочной железе. Это обусловлено тем, что многие аспекты морфогенеза гиперпластических и неопластических процессов в эпителии молочной железы остаются мало изученными, отсутствует единая и общепринятая классификация стадий неопластического процесса в эпителии молочной железы и гистологическая диагностика этого состояния связана с большой долей субъективизма. Эти данные указывают на необходимость проведения исследований по совершенствованию и повышению точности цитологической и гистологической диагностики новообразований молочной железы, особенно их переходных форм.

Необходим поиск морфологических признаков, которые могли бы послужить совершенствованию методов дифференциальной диагностики и более раннему выявлению карцином [Упоров A.B., Семигла-зов В.Ф., Пожарисский K.M., 2000; Niezabitovski A^kplyszewsky J.,

Rys J., 1997; Kuropkat Ch., Rudolph

Для достижения большей объективности в диагностике патологических изменений требуется не только подробное описание морфологических изменений в гистологических структурах органов, но и применение комплекса дополнительных методов морфологического исследования, уточняющих возможный темп про-лиферативной активности клеток новообразования и изменения их биологических свойств [Автандилов Г.Г., 1984, 1996, 2000; Kearsley I.H., Furlong K.L., Cooke R.F. et al., 1990; Page D.L., Rogers L.W., 1992].

Современные способы изучения пролиферативной активности клеток проводится с помощью методов, нуждающихся в дорогостоящих расходных материалах (электронная микроскопия, имму-ногисто- и иммуноцитохимическое исследование, молекулярно-био-логические методы). В то же время изучение содержания генетического материала в ядрах эпителиальных клеток для этой цели используется недостаточно широко, хотя гистофизические методы исследования ДНК не требуют расходных материалов [Автандилов Г.Г., 1972, 1980, 1990; Ташкэ К.,1980; Sandritter W., 1982].

Наиболее доступным из них является метод сравнительной микро-спекторфотометрии [Автандилов Г.Г.,1973, 1990, 2002; Steinbeck R.G., 1997, 1998; Haroske G., Bocking A., Kayser K. et al., 1998].

Микроспектрофотометрический анализ—важный источник диагностической информации, связанный с измерением структуры клеток и их генетического материала. На базе указанных подходов процесс канцерогенеза в молочной железе изучен недостаточно, а опубликованные данные противоречивы. Применение морфометри-ческого и плоидометрического методов исследования при изучении процесса канцерогенеза в эпителии молочной железы может открыть новые возможности для дифференциальной диагностики стадий развития неопластического процесса в молочной железе.

Цель настоящего исследования—совершенствование морфологической диагностики стадий канцерогенеза в молочной железе на основе данных морфометрического и плоидометрического исследования.

Задачи исследования

1. На гистологическом материале провести морфометрическое и плоидометрическое исследование ядер клеток долькового и прото-кового эпителия молочной железы с учетом стадии канцерогенеза.

2. Определить дифференциально—диагностические морфометпиче-ские и плоидометрические критерии нормальной эпителиальной ткани, маммарной интраэпи.елиальной неоплазии (МИН) разной степени выраженности и инфильтрирующих карцином.

3. Оценить возможность использования данных плоидометриче-ского исследования для разграничения гиперплазии нормального эпителия, степеней интраэпителиальных неоплазий, иинвазивных карцином молочной железы.

4. Установить дифференциально—диагностические значения измерений площади ядер долькового и протокового эпителия молочной железы для установления стадии канцерогенеза.

5. Создать обоснованную и объективизированную классификацию стадий канцерогенеза на основании полученных морфометрических и плоидометрических данных для применения в патогистологиче-ской практике.

6. Сравнить показатели площади и плоидности ядер клеток долькового и протокового эпителия молочной железы на разных стадиях канцерогенеза в препаратах, окрашенных по методике Фёльгена и обычной окраской гематоксилином и эозином.

7. Оценить возможность применения окраски препаратов гематоксилином и эозином для проведения морфометрического и плоидо-метрического исследования эпителия молочной железы на разных стадиях канцерогенеза.

Научная новизна полученных результатов

В данной работе использованы принципиально новые методики исследования количественной и качественной организации эпителия молочной железы на различных этапах канцерогенеза. Основой работы является применение нового направления медицинской диагностики—компьютерной микроспектрофотометрии.

На большом объеме биопсийного материала впервые микро-спектрофотометрическим способом выявлены объективные дифференциально—диагностические критерии степеней дисплазии эпителия молочной железы и инвазивных дольковой и протоковой карцином молочной железы на основании изменений плоидности и площади ядер клеток. Разработана классификация неопластических процессов в эпителии молочной железы на основании полученных плоидометрических и морфометрических параметров эпителия молочной железы на разных стадиях канцерогенеза. Проведено сравнение данных о площади и плоидности ядер клеток эпителия молочной железы, полученных при изучении препаратов, окрашенных по методике Фёльгена и гематоксилином и эозином.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Развитие неоиластических процессов и карцином молочной железы сопровождается увеличением размеров ядер клеток и нарастанием показателя плоидности доминирующего клона клеток

2. Показатель средней плоидности и площади ядер клеток эпителия молочной железы позволяет дифференцировать низкую (МИН I) и высокую (МИН II) степени маммарной интраэпителиальной не-оплазии, а также инвазивные карциномы.

3. Измерение плоидности и площади ядер эпителиальных клеток молочной железы возможно проводить на препаратах, окрашенных рутинной окраской гематоксилином и эозином с учетом увеличения возможной ошибки по мере нарастания стадии канцерогенеза.

4. Гистологические заключения, дополненные морфометрически-ми и плоидометрическими характеристиками, точнее отражают стадии неопластического процесса, повышают информативность и дают объективные основания для диагностики стадий неопластического процесса в ткани молочной железы.

5. Классификация морфологических изменений эпителиальных структур молочной железы, включающая в себя только статистически различимые информативные параметры и основанная на данных о плоидности ядер их клеток, является наиболее объективной и дает возможность принимать адекватные диагностические и клинические решения, соответствующие стадиям канцерогенеза.

Практическая значимость полученных результатов

Полученные данные имеют определенную значимость для теоретической медицины и практического здравоохранения, поскольку они дают патоморфологу объективные дифференциально—диагностические критерии при определении степени внутриэпителиальной неоплазии и карцином молочной железы.

Выбор материала исследования по диагностическому признаку обусловлен высокой заболеваемостью фиброзно - кистозной болезнью и фиброаденомой молочной железы женщин репродуктивного возраста. Инвазивные дольковая и протоковая карциномы молочной железы так же составляют большую часть в группе всех инвазивных карцином.

Результаты исследования, обладая высокой точностью и надежностью благодаря использованию метода гистофизического анализа срезов и их статистической обработки, дают возможность при любых подозрениях патологоанатома на развитие патологической клеточной пролиферации провести уточнение её характера, а также стандартизовано устанавливать степень выраженности маммарной интраэпителиальной неоплазии (МИН). При дифференциальной диагностике патологии молочной железы дополнительно к обычным гистологическим исследованиям необходимо использование морфо-метрических и плоидометрических данных для объективизации диагностического процесса.

Внедрение результатов работы в практику

Основные положения диссертации используются при ч гении лекций и проведении практических занятий на кафедре патологической анатомии Российской медицинской академии последипломного образования. Разработанная методика применяется в практической работе патологоанатомических отделений Медсанчасти № 1 AMO ЗИЛ г. Москвы и Московской городской клинической больницы № 33 им. А. А. Остроумова.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: совместном заседании кафедр патологической анатомии Московского государственного медико-стоматологического университета и Российской медицинской академии последипломного образования, VI Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2000), XVI, XVII, XVIII и XXII научно—практических конференциях Российской медицинской академии последипломного образования «Морфометрия в диагностике болезней« (Москва, 1998, 1999, 2000, 2004).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ.

Структура и объем диссертации

Текст диссертации изложен на 153 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы: главы, посвященной материалам и методам исследования; главы, в которой представлены собственные результаты; главы с обсуждением полученных результатов, заключения, выводов; библиографического указателя использованной литературы, содержащего 116 отечественных и 79 иностранных публикаций. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами, 15 рисунками, 29 фотографиями и 15 гистограммами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Проведено гистологическое исследование биоптатов, полученные при хирургических вмешательствах на молочной железе от 92 пациенток, которым в соответствии с Международной гистологической классификацией опухолей молочной железы 1984 года были установлены следующие гистологические диагнозы: фиброаденома (D-24 М9010/0)—16, фиброзно—кистозная болезнь (N-60 М74320)—31, инфильтрирующие дольковый (С-50 М8520/3)—23 и протоковый рак (С-50 М8500/3}—22 наблюдения.

По возрастным группам материал распределялся следующим образом: от 30 до 39 лет—7, от 40 до 49 лет—20. от 50 до 59 лег—19. от 60 до 69 лет—31, от 70 до 79 лет—15 биоптатов.

В группу сравнения входил секционный материал (10 наблюдений) молочных желез женщин в возрасте 30-40 лет возраста, умерших от заболеваний, не связанных с патологией репродуктивной системы.

Материал после забора фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина. Фиксацию происходила в термостате при температуре 37- 40°. После фиксации и обезвоживания кусочки ткани заливали в парафин с последующим приготовлением гистологических срезов толщиной 8 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином для проведения гистологического исследования и по методике Фёльгена для проведения микроспектрофотометрического исследования. Исследование проводили с помощью светового микроскопа с использование объективов * 10, х40.

При исследовании гистоархитектоники препаратов нормальной молочной железы, а также участков фиброаденомы, фиброз-но- кистозной болезни, протоковой и дольковой инфильтратив-ных карцином молочной железы, использовали окулярную стереометрическую сетку Автандилова, содержащую 100 тест-точек [Автандилов Г.Г., 1972]. Использовали окуляр *7 и объектив х 10. В каждом препарате, окрашенном гематоксилином и эозином, анализировали но 20 полей зрения. Процентное соотношение долей изучаемых объектов (эпителия, соединительной и жировой ткани) определяли простым подсчетом совпавших точек окулярной сетки с изучаемыми объектами.

После гистологической диагностики препараты, окрашенные по методике Фёльгена и гематоксилином и эозином, разделили на следующие группы:

1. Участки с нормальным гистологическим строением дольково-го и протокового эпителия молочной железы

2. Участки с признаками гиперплазии долькового и протокового эпителия молочной железы.

3. Участки с картиной а) легкой, б) умеренной и в) тяжелой степенями дисплазии и карциномы «in situ» долькового и протокового эпителия молочной железы.

4. Препараты с типичными участками инвазивных дольковой и протоковой карцином молочной железы.

Микроспекторфотометрическое исследование гистологических препаратов проводили на компьютерном анализаторе изображения «Имаджер ЦТ» (С; мление компьютерной бионики ИНАТ МФК, при участии кафс !;Л! атологической анатомии РМАПО, свидетель-

ство о регистрации программы для ЭВМ № 2001610674, Роспатент, 2001г., ВНИИСтандарт № 200/033660 от 26.06.01) с программой «Автан-Сан». Анализатор изображения включал в себя: микроскоп Nikon 400-Е, план-объектив 40х/0,65, светофильтр—570 нм, телевизионную камеру Pixera с разрешением 600*400 пикселей, компьютер Pentium (Celeron-333: 64 Mb, Asus V3000). Настройку и освещение микроскопа устанавливали по методике Келлера. Условия освещения и порог яркости измеряемых объектов сохраняли одинаковыми на всем протяжении исследования.

Для получения «истинного стандарта» диплоидного содержания ДНК в ядрах клеток—2с, с учетом рекомендаций Комитета по номенклатуре по аналитической цитометрии [Молекулярная клиническая диагностика, 1999], проводили микроспектрофото-метрию мазков лимфоцитов центрифугата гепаринизированной периферической крови человека. Мазок окрашивали по методике Фёльгена. Измеряли интегральную яркость (сумму яркостей всех точек—-пикселей объекта) ядра лимфоцита, свидетельствующую о содержании генетического материала (ДНК) в изучаемом ядре.

Аналогичному исследованию подвергли мазок сперматозоидов человека, окрашенный по Фёльгену, ядра которых заведомо содержат половину набора хромосом ( 1 с). На основании измерений ядер малых лимфоцитов в мазках крови были получены средние значения их интегральной яркости, которые сравнили с результатом исследования интегральной яркости ядер сперматозоидов.

Для получения «гистологического стандарта плоидности» исследовали ядра малых лимфоцитов в гистологических срезах молочной железы.

При изучении особенностей каждой стадии канцерогенеза получали данные о плоидности и площади ядер клеток протокового и долькового эпителия молочной железы, окрашенных гематоксилином и эозином и по методике Фёльгена. Данные измерений ядер клеточных клонов автоматически относились к тканевым стандартам плоидности ядер малых лимфоцитов того же гистологического среза, и на мониторе демонстрировались сведения о средних значениях плоидности ядер клеток доминирующего клона (в псевдоцветах) и гистограммах их распределения.

После проведенного плоидометрического и морфометрического исследования препаратов обнаружено, что гиперплазия и умеренная степень дисплазии эпителия молочной железы не имеет статистически достоверных различий в плоидности и площади с соседними диагностическими группами. Поэтому гиперплазию объединили с группой «норма», а умеренную дисплазию включили в группу «лег-

кая дисплазия». Таким образом, весь материал был разделен на четыре группы, имеющие высоко значимые статистические по показателям площади и плоидности различия:

1 -я группа: участки среза, имеющие нормальное гистологическое строение и участки с признаками гиперплазии эпителия в протоках и дольках молочной железы.

2-я группа: структуры молочной железы и признаками легкой и умеренной степенями дисплазии протокового и долькового эпителия, обозначаемые МИН (маммарная интраэпителиальная неопла-зия)—МИН I—первой степени.

3-я группа: препараты с морфологической картиной умеренной и тяжелой степенями дисплазии и карциномы «in situ» в эпителии протоков и долек молочной железы—МИН II—второй степени.

4-я группа: инфильтрирующие дольковые и протоковые карциномы.

Измерили площадь ядер протокового и долькового эпителия на разных стадиях канцерогенеза в гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином и по методике Фёльгена. Площадь ядра определяется по сумме хорд ядер.

Кроме прямых признаков малигнизации, проявляющихся в увеличении средних показателей плоидности и площади ядер клеток ядер, изучали и использовали косвенные диагностические морфо-метрические признаки опухолевой прогрессии: ПГЯ—показатель гетероплоидии ядер (отношение средних взвешенных к средним арифметическим показателям плоидности ядер), КА—коэффициент анеуплоидии (отношение доли анеуплоидных ядер к доле диплоидных, триплоидных и тетраплоидных), I1A-—пролиферативную активность, отражающую синтетическую активность в ядрах клеток, определяемую как превышение показателя средней плоидности клеток опухоли диплоидного уровня. Изучали «клеточную плотность» гистологического среза—относительную долю ядер в срезе в одном поле зрения [Автандилов Г.Г., 1990, 2002]. Изучали на гистограммах «профиль плоидности» долькового и протокового эпителия молочной железы на разных стадиях канцерогенеза. Все показатели, полученные при изучении гистологических срезов, окрашенных по методике Фёльгена, сравнили с показателями, полученными при изучении срезов, окрашенных гематоксилином и эозином.

Статистический анализ полученных данных проводили в программе EXEL из пакета MICROSOFT ХР и при помощи компьютерного программного обеспечения «Облегченные способы статистического анализа в клинической медицине» по методикам рас-

чета непрямых разностей и доверительных интервалов. Достоверность значений определялась по ^критерию Стьюдента [Бенс-ман В.М., 2002]. Уровень критического значения (р) в полученных параметрах плоидности и площади эпителиальных клеток молочной железы на разных стадиях канцерогенеза во всех группах выборки был < 0,001.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение гистоархитекгоники диагностических биоптатов молочной железы

Определение процентного соотношения долей эпителиальной, соединительной и жировой ткани в пределах терминальной прото-ково-дольковой единицы в биоптатах молочной железы в норме, при фиброаденомах, фиброзно-кистозной болезни и инвазивных протоковой и дольковой карциномах позволило проследить за изменением их объемных соотношений по мере развития опухолевого процесса.

Таблица 1

«Тканевой объемный профиль» биоптатов молочной железы в норме, при фиброаденомах, фиброзно-кистозной болезни, инвазивных протоковой и дольковой карциномах

Гистологический диагноз «Тканевой объемный профиль» (ОЭ 1 ОС + ОЖ), %

Нормальная ткань 2+90+8

Фиброаденома 7+ 88+5

Фиброзно-кистозная болезнь 9+72+19

Инфильтрирующая протоковая карцинома 19+ 69+12

Инфильтрирующая дольковая карцинома 18+67+15

Примечание: (ОЭ—объем эпителиальной ткани, ОС—объем соединительной ткани, ОЖ—объем жировой ткани).

Данные таблицы 1 свидетельствуют об изменении гистоархитек-тоники биоптатов, окрашенных гематоксилином и эозином в сторону увеличения объема эпителиальной ткани и уменьшения объемной доли соединительной и жировой тканей при развитии карцином. Данные о гистоархитектонике молочной железы в норме и при патологических состояниях могут учитываться при проведении пункционных биопсий, а в отдельных случаях являться одним из дифференциально-диагностических критериев в диагностике заболеваний молочной железы

2. Определение стандарта пдоидности для проведения микроспектрофометрического исследования биоптатов молочной железы

Для определения стандарта плоидности провели сравнение значений содержания ДИК в ядрах малых лимфоцитов мазка центрифу-гата крови, ядер сперматозоидов человека в мазке и тканевых лимфоцитов в гистологических срезах молочной железы.

При измерении 9 950 ядер малых лимфоцитов в мазках центри-фугата крови получены средние значения их интегральной яркости (43 255±534 отн. ед.). Исследование 189 ядер сперматозоидов в мазках показало их интегральную яркость, составившую 21 720±237 отн. ед., округлено до 10 ООО. При исследовании 1 226 лимфоцитов в гистологических срезах толщиной 8 мкм, окрашенных по Фёльгену, были получены более низкие показатели (40 053± '346 отн. ед.), которые позволили принять за относительный стандарт двойного содержания хромосом в ядре лимфоцита в срезе, интегральную яркость ядра, равную 40 ООО, а за единицу плоидности (1с)—половину этого значения—20 000 отн. ед. Далее стандарт плоидности автоматически относился как знаменатель к значениям интегральной яркости исследуемого клона эпителиоцитов в гистологических препаратах молочной железы.

3. Определение плоидности ядер эпителиоцитов молочной железы на разных стадиях канцерогенеза

Микроспектрофотометрическому исследованию с целью определения плоидности подвергли 21 678 ядер эпителиальных клеток молочной железы, в том числе 10 978 ядер долькового эпителия, и 10 700—протоковою эпителия в препаратах стандартной толщины, окрашенных по метчике Фёльгена. Так же определяли показатели площади и плоидчости 15 509 ядер эпителиальных клеток в препаратах, окрашенных °матоксилином и эозином, в том числе 8 094 ядер долькового -лия и 7 415 ядер протокового эпителия.

Таблица 2

Плоидность (М) долькового и протокового эпителия молочной железы пс мере развития стадий канцерогенеза в препаратах, окрашенных по методике Фёльгена и гематоксилином и эозином.

Диагностическая группа Число ядер Число полей зрения М т доверительный интервал р<

Дольковый эпителий, окраска по методике Фёльгена

Норма 3969 99 2,5 0,02 2,4-2,5

МИН 1 1837 75 3,1 0,02 2,9-3,3 0,001

МИН II 2684 61 4,0 0,05 3,8-4,2 0,001

Карцинома 2488 97 5,7 0,06 5,2-6,2 0,001

Дольковый эпителий, окраска гематоксилином и эозином

Норма 1532 40 2,5 0,03 2,4-2,6

МИН I 1794 40 3,1 0,04 3,0-3,3 0,001

МИН II 2259 40 4,0 0,07 3,9-4,3 0,001

Карцинома 2509 40 4,9 0,09 4,6-5,1 0,001

Протоковый эпителий, окраска по методике Фёльгена

Норма 1622 67 2,5 0,02 2,4-2,5

МИН I 4054 190 3,1 0,01 3,0-3,2 0,001

МИНН 2475 74 4,0 0,04 3,9-4,5 0,001

Карцинома 2549 110 5,8 0,09 5,1-6,3 0,001

Протоковый эпителий, окраска гематоксилином и эозином

Норма 1345 40 2,6 0,03 2,5-2,8

МИН I 1801 40 3,1 0,04 3,0-3,3 0,001

МИНИ 1697 40 4,1 0,07 3,9-4,3 0,001

Карцинома 2572 40 6,0 0,09 5,3-6,7 0,001

Примечание: т—ошибка выборки

Результаты проведенного плоидометрического исследования гистологических срезов молочной железы б таблице 2 свидетельствуют о том, что по мере развития интраэпителиальной неоплазии и инва-зивной карциномы молочной железы последовательно нарастает плоидность ядер эпителиоцитов.

Данные измерений ядер долькового и протокового эпителия молочной железы на разных стадиях канцерогенеза в препаратах, окрашенных по Фёльгену, показали, что в норме плоидность для обоих типов эпжелия составила 2,5с, при МИН I—3,1с, при МИН II—4,0с. Плоидность ядер клеток в инвазивной дольковой карциноме составила 5,7с, инвазивной протоковой—5,8с. При изучении гистологических препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином данные плоидности ядер долькового и протокового эпителия молочной железы в норме, при МИН I, при МИН II показали те же значения, что и при исследовании препаратов, окрашенных по методике Фёльгена. Отличные результаты получены при измерении ядер клонов клеток инвазивных карцином. Средняя плоидность ядер клеток дольковой карциномы составила 4,9с, протоковой карциномы—6,0с .

Результаты плоидометрии нормального эпителия молочной железы, МИН I и МИН II одинаковы для обеих методик окраски препаратов. Выявление кратности различий плоидности сравнению с нормой показало, что при МИН I она составляет 1,25 раза. МИН II—1,6 раза, карциномах—2,3 раза. Статистически достоверных различий в плоидности ядер долькового эпителия на разных стадиях канцерогенеза по сравнению с протоколым не обнаружено. Таким образом, при сравнении результатов плоидометрического исследования гистологических препаратов молочной железы, окрашенных по данным методикам можно утверждать, что возможность ошибки в диагностике препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином инвазивной дольковой карциномы может составить 14% от средней арифметической показателя, инвазивной протоковой карциномы— 3%. Этот факт, вероятно, объясняется тем, что при окраске по Фёльгену краситель связывается строго количественно, а при окраске гематоксилином и эозином работают иные механизмы связывания. Обнаружена закономерность, что чем выше степень канцерогенеза, тем сильнее различия в показателях, полученных по данным методикам окраски.

4, Определение площади ядер эпителиальных клеток молочной железы на разных стадиях канцерогенеза

Для оценки возможностей диагностики стадий канцерогенеза на основании данных о площади ядер провели исследование 7 276 ядер протокового эпителия и 6 627 ядер долькового молочной железы в препаратах, окрашенных по методике Фёльгена. Дополнительно проведено изучение площади 8 094 ядер долькового и 7 415 ядер протокового эпителия молочной железы, окрашенных гематоксилином и эозином. Проведена ои^к-а разницы показателей площади ядер в препаратах, окрашенных ¡ *> 'ёльгену и гематоксилином и эозином.

При изучении данных о площади ядер клеток долькового и протокового эпителия молочной железы в препаратах, окрашенных по Фёльгену, установлено, что в дольковом и протоковом эпителии молочной железы эти показатели находятся примерно в одинаковом диапазоне. Кратность различий площади на разных стадиях канцерогенеза в дольковом эпителии по сравнению с нормой, выглядит следующим образом: при МИН I площадь увеличивается в 1,4 раза, при МИН II—в 1,5 раза, карциноме—в 1,9 раза. Показатели площади протокового эпителия в норме составили 280 пикселей, при МИН I—360, при МИН И—430, протоковой карциноме—564. Кратность различий в площади составила при МИН I—1,2 раза, при МИН II—1,5 раза, при протоковой карциноме—2 раза.

При выявлении разницы в показателях площади, установленной при изучении препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином и по методике Фёльгена, установлено, что она не превышает 1 5% средней арифметической.

Таким образом, можно утверждать, что при невозможности проведения окраски препаратов по Фёльгену возможно в диагностических целях для определения площади ядер использовать окраску гематоксилином и эозином с учетом возможной ошибки, величина которой зависит от стадии канцерогенеза.

Таблица 3.

Площадь ядер клеток долькового и протокового эпителия

Диагностическая группа Число ядер М ±т Доверительный интервал р< к

Дольковый эпителий, окраска по методике Фёльгена

Норма 1844 286 4,8 271-300 — 1

МИН 1 1349 396 14 352-438 0,001 1,4

МИН ii 2222 435 11 402-468 0,001 1,5

Карцинома 1212 550 22,6 482-618 0,001 1,9

Дольковый эпителий, окраска гематоксилином и эозином

Норма 1532 300 4,2 278-312 — 1

МИН i 1794 367 4,9 346-388 0,001 1,2

Продолжение табл. 3

Диагностическая группа число ядер М ±т Доверительный интервал р< к

МИН II 2259 490 9,4 462-519 0,001 1,6

Карцинома 2509 595 15,5 548-641 0,001 2

Протоковый эпителий, окраска по методике Фёльгена

Норма 1221 280 5,2 263-294 — 1

МИН I 2050 360 7,3 337-381 0,001 1,2

МИН II 2309 430 8,3 406-456 0,001 1,5

Карцинома 1696 564 21 500-628 0,001 2,0

Протоковый эпителий, окраска гематоксилином и эозином

Норма 1345 306 5,8 288-323 — 1

МИН I 1801 368 8,7 342-394 0,001 1,2

МИН И 1697 473 11 440-506 0,001 1,5

Карцинома 2572 754 32 658-850 0,001 2,5

Примечание: К—кратность различий площади по сравнению с нормой, М—среднее значение площади (в пикселях), т—ошибка выборки.

5. Изучение пролиферативной активности (ПА), коэффициента анеуплои-дии (КА), показателя гетерсплоидии ядер (ПГЯ) и относительной доли ядер в срезе (ОДЯ) долькового и протокового эпителия молочной железы на разных стадиях канцерогенеза

Кроме прямых признаков малигнизации, к которым относили увеличение плоидности и площади ядер эпителиальных клеток молочной железы, изучали косвенные морфометрические признаки

опухолевой прогрессии К таким признакам относят: пролифератив-ную активность, коэффициент анеуплоидии. показатель гетероплои-дии ядер и относительная доля ядер в срезе. Полученные данные приведены в таблице 4.

Таблица 4.

Сравнительная характеристика пролиферативной активности (ПА), коэффициента анеуплоидии (КА), показателя гетероплоидии ядер (ПГЯ) и относительной доли ядер (ОДЯ, %) в срезе протокового и долькового эпителия молочной железы в процессе канцерогенеза.

Тип эпителия Показатель Диагностическая группа

Но эма МИН I МИН II Карцинома

Ф Г/Э ф Г/Э ф Г/Э Ф Г/Э

Дольковый эпителий ПА 0,5 0,5 1,1 1,1 2,0 2,0 3,7 2,9

КА 0 0 0,04 0,03 0,23 0,13 0,8 0,25

ПГЯ 1 1 1,1 1,1 1,2 1,3 1,2 1,7

ОДЯ 3,8 3,3 5,0 4,5 7,3 6,5 7,3 7,8

Протоквый эпителий ПА 0,5 0,6 1,1 1,1 2,0 2,1 3,8 4,0

КА 0 0 0,03 0,04 0,25 0,2 1,7 0,3

ПГЯ 1 1 1,1 1,2 1,2 1,3 1,2 1,7

ОДЯ 3,2 2,9 3,6 4,4 4,8 5 5,8 8,8

Примечание: Ф—окраска по методике Фёльгена, Г/Э—окраска гематоксилином и эозином.

Под пролиферативной активностью (ПА) понимали увеличение плоидности исследуемого клона клеток выше стандартного 2с. Коэффициент анеуплоидии (КА) определяли как отношение числа ядер с плоидностью более 4с к числу ядер с плоидностью менее 4с. Показатель гетероплоидии ядер (ПГЯ) определяли как отношение средней арифметической плоидности клона к средней взвешенной. Относительная доля ядер (ОДЯ) в срезе выражается в процентах и выводится автоматически в телеменю программы «Автан-Сан» при компьютерной обработке снимков гистологических препаратов.

Показатель пролиферативной активности отражает интенсивность синтетических процессов в ядре клетки. Выявлено последовательное увеличение пролиферативной активности долькового и протокового эпителия молочной железы по мере нарастания стадий канцерогенеза. В нормальном эпителии молочной железы ПА составила 0,5с, при МИН I—1,1с, при МИН II—2,0с, карциномах—3,7-3,8с. Сравнение ПА, полученной при изучении препаратов, окрашенных гематокси-

лином и эозином, показало, что в норме, при МИН I, МИН II этот показатель почти не различается.

Изучение коэффициента анеуплоидии (КА) также показало статистически достоверные различия между обозначенными нами стадиями канцерогенеза эпителия молочной железы. Под коэффициентом анеуплоидии понимали отношение процентной доли ядер клеток с плоидносгью выше 4с к доле ядер с плоидносгью ниже или равной 4с в изучаемых гистологических срезах. В нормальном эпителии молочной железы этот показатель равен нулю, так как в этой популяции клеток полностью отсутствуют ядра с плоидность выше 4с. При МИН I определяется небольшой процент клеток с плоидностью 5с (3-3%) и КА составил 0,03-0,04. Исследование популяции клеток при МИН II показало нарастание КА до 0,23-0,25. Достоверные различия КА получены при исследовании клонов клеток дольковой (КА 0,8) и прото- й ковой инвазивных карцином (КА 1,7), что можно использовать при проведении дифференциальной диагностики этих видов карцином.

Показатель гетероплоидии ядер (ПГЯ) эпителиальных клеток молочной железы так же прогрессивно нарастает по мере нарастания стадии канцерогенеза. Исследование долькового и протокового эпителия молочной железы при изучении препаратов, окрашенных по методике Фёльгена показало, чю в норме ИГ'Я составляет 1, при МИН I—1,1, при МИН II—1,2, инвазивных карциномах—1,2. Отличий ПГЯ долькового и протокового эпителия на разных стадиях канцерогенеза нет.

При изучении относительной доли ядер (ОДЯ) в срезе исследовано 318 полей зрения препаратов, окрашенных по методике Фёльгена и 324 поля зрения в препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. Выявлено нарастание этого показателя по мере нарастания стадии канцерогенеза. В препаратах, окрашенных по методике Фёльгена, в дольковом эпителии прогрессия выглядит следующим образом: В норме 3,8%, при МИН I—5%, при МИН II—7,3%, в дольковой карциноме—7,3%. В препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, распределение данного показателя в дольковом эпителии составляет: в норме 3,8%, при МИН I—5%, при МИН II—7,3%, в протоковой карциноме—7,3%. Как видно из этих данных, статистические различия высоко значимы между группой «норма» и МИН I и недостоверны между группами МИН II и карциномой как в препаратах, окрашенных по Фёльгену, так и в препаратах, окрашенных рутинной окраской.

Данный показатель, полученный при изучении протокового эпителии на разных стадиях канцерогенеза в препаратах, окрашенных по Фёльгену роставил в норме 3,2%, при МИН I—3,6%, при МИН II— 4,8%, протоковой карциноме—5,8%. В гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, относительная доля ядер составила в норме 2,9%, при МИН I—4,4%, при МИН II—5%, в протоковой карциноме—8,8%. Статистические различия высокозначимы во всех диагностических группах.

Показатель относительной доли ядер в срезе может служить косвенным признаком малигнизации эпителиальной ткани и его определение возможно как в препаратах, окрашенных по методике Фёль-гена и окраской гематоксилином и эозином.

6. Изучение профиля плоидности эпителия молочной железы на разных стадиях канцерогенеза

Изучили «профиль плоидности ядер» клеток долькового и про-токового эпителия на разных стадиях канцерогенеза в препаратах, окрашенных по методике Фёльгена. Профиль плоидности определяли как процентное распределение ядер клеток по нарастанию показателя плоидности на 1с. Результаты изучения профиля плоидности ядер долькового эпителия на разных стадиях канцеро1енеза представлены на рисунке 1, протокового—на рисунке 2. Ив дольковом, и в протоковом эпителии молочной железы присутствуют клоны клеток с плоидностью 2с и Зс, причем клон с плоидностью 2е является модальным, то есть преобладающим. При МИН I клон с плоидностью 2с остается модальным, около 30% клеток имеет плоидйость Зс и появляется около 15% клеток с плоидностью 4с и около 5% с плоидностью 5с. При МИН II количество диплоидных клеток снижается до 30%, возрастает доля ядер с плоидностью 4с до 20%, 5с— до 10-15%. Отсутствует четко выраженный модальный класс. Карциномы отличаются еще более выраженным клональным полиморфизмом. Доля диплоидного клона максимально снижается, 50% клеток имеет плоидность выше 4с. Появляется небольшое количество клеток с плоидностью 7—8-9с. Клеток с плоидность свыше 9с в дольковой карциноме не обнаружено.

1 2 3 4

Рис. 1. Распределение ядер клеток долькового эпителия по плоидности в норме (1), при МИН I (2), МИН II (3), карциноме (4). Ось абсцисс—плоидность ядер, ось ордина!—доля клеточного клона в процентах.

Протоковая карцинома отличается от дольковой более разнообразным по плоидности семейством клеток. В гистограммах выявляются клетки с плоидностью выше 9с, что для дольковой карциномы не характерно.

Для полной характеристики стадий канцерогенеза, кроме обычной гистологической оценки изменений в молочной железе, желательно дополнительно использовать, как количественные показатели плоидности и площади ядер исследованного клона, так и качественную характеристику популяции клеток в виде анализа распределения показателей плоидности ядер—«профиля плоидности ядер».

■ 2с

■ Зс

□ 4с

□ 5с

■ вс В 7с

■ 8с

□ 9с

■ 10с

■ 11с

Рис. 2. Распределение ядер клеток протокового эпителия по плоидности в норме (1), при МИН I (2), МИН II (3), карциноме (4). Ось абсцисс— плоидность, ось ординат—доля клеточного клона в процентах.

Таким образом, после проведенного морфометрическо! о и плои-дометрического исследования эпителия молочной железы в норме, при МИН I, при МИН II и инвазивных дольковой и протоковой карцином выявлено закономерное нарастание показателей плоидности и площади ядер эпителиальных клеток по мере развития стадий канцерогенеза. Эти показатели относятся к прямым признакам опухолевой прогрессии тканей. Данные о плоидности и площади получены на больших группах выборки (исследовано 21 678 ядер эпителия молочной железы, окрашенных по методике Фёльгена и 15 509 ядер, окрашенных гематоксилином и эозином) и характеризуются высокозначимой статистической достоверностью.

Установлено увеличение косвенных показателей, маркирующих интенсивность и характер неопластического процесса на разных этапах канцерогенеза: относительной доли ядер в срезе, пролифера-тивной активности, показателя гетероплоидии ядер, коэффициента анеуплоидии. Выявлено, что показатели площади и плоидности ядер долькового и протокового эпителия молочной железы в норме, при

МИН J, при МИН II и инвазивных карциномах не зависят от вида эпителия. При проведении дифференциальной диагностики долько-вой и протоковой карцином может помочь изучение коэффициента анеуплоидии ядер карцином, который при протоковой карциноме в 2 раза выше, чем при дольковой. Также при анализе «профиля пло-идности» инвазивных карцином обнаружена «клональная поли-морфность» протоковой карциномы, что отличает ее от дольковой. У морфолога во время исследования препарата появляется возможность оценить функциональное разнообразие клеток, формирующих процесс канцерогенеза. Заметим также, что патогистологические критерии тяжелой дисплазии и карциномы «in situ», в ряде наблюдений не дают полной уверенности в том, что исследуемый срез является вполне представительным данной стадии канцеро1 енеза, шк как гистологическая картина зависит от места иссечения кусочка, от уровня прохождения и плоскости среза, а также от их количества. При наличии данных о плоидности ядер клеток опухолей молочной железы, указанные ограничения почти снимаются, так как появляется возможность оценки пролиферативных свойств определенного клона клеток.

При сравнении данных, ппгтученных при изучении препаратов, окрашенных по методике Фёльгена и гематоксилином и эозином, установлено, что процент расхождения результатов исследования возрастает от группы «норма» к группе «карцинома». Применение морфометрического и плоидометрического исследования повышает качество гистологической диагностики стадий неопластических процессов. В i 0% случаев изученных нами гистологических препаратов наблюдались затруднения при обычной оценке степени выраженности дисплазии и дифференцировки неинвазивной карциномы от ин-вазивной. Для решения этих диагностических проблем применялся метод компьютерной сравнительной микроспектрофотометрии.

По-видимому, следует использовать в практике термин маммар-ная интраэпителиальная неоплазия—МИН (Mammary intraepithelial neoplasia, MIN).

В соответствии с требованиями онкологической практики, при наличии микроспектрофотометрических данных, имеются следующие гистологические диагностические критерии, которые должны отражаться в заключениях патологоанатома при исследовании био-п гатов молочной железы:

— нормальный эпителий и гиперплазия эпителия

— легкая и умеренная интраэпителиальная неоплазия (МИН I),

— тяжелая интраэпителиальная неоплазия и карцинома «in situ» (МИН И),

— инфильтрирующие дольковые и протоковые карциномы.

Предлагается в качестве клинико-морфологической классификации степени неопластического процесса использовать систему «норма-МИН 1-МИН Н-карцинома», как имеющую в своей основе объективные статистически обоснованные признаки, наиболее достоверно отражающие суть происходящих изменений в эпителии молочной железы в процессе озлокачествления. Указанное подразделение канцерогенеза дает основу для однотипных клинических вмешательств ohkojiol ов.

Следовательно, данный метод исследования дает возможность уточнять диагностику стадий канцерогенеза в молочной железе и принимать обоснованные решения в отношении доброкачественных процессов, пограничных состояний и злокачественных новообразований. Полученные данные могут быть использованы в качестве дополнительных дифференциально-диагностических критериев при морфологической диагностике стадий канцерогенеза в молочной железе.

Данные плоидометрического и морфометрического методов исследования являются объективной базой для принятия диа! ностиче-ских решений патологоанатомом.

ВЫВОДЫ

1. Метод сравнительной микроспектрофотометрии позволяет устанавливать, дополнительно к обычному гистологическому исследованию, дифференциально-диагностические объективные параметры плоидности и площади ядер эпителиальных клеток молочной железы, окрашенных на ДНК в норме, маммарной интраэпителиальной неоплазии первой (МИН I), второй (МИН II) степеней и инвазивных дольковой и протоковой карцином.

2. В нормальном дольковом и протоковом эпителиях молочной железы средний показатель плоидности ядер соответствует 2,5±0,02с, с пределом двойного стандартного отклонения до 2,9с, куда входят показатели доброкачественных гиперпластических процессов. В гистограммах распределения ядер по плоидности преобладает диплоидный модальный класс.

3. Дисплазия легкой и умеренной степени выраженности (интра-эпителиальная маммарная неоплазия I степени—МИН I) долькового и протокового эпителия молочной железы характеризуется значениями плоидности 3,1±0,02с с пределом двойного стандартного отклонения до 3,5с и появлением в гистограмме тетраплоидных ядер.

4. При тяжелой дисплазии и карциноме «in situ» (МИН II) молочной железы наблюдается дальнейшее увеличение показателя средней плоидности ядер клсгок долькового и протокового эпителия до 4,0±0,05с, с пределом двойного стандартного отклонения до 4,8с и гетероплоидность ядер клеток.

5. Инфильтрирующая дольковая карцинома молочной железы характеризуется средними значениями плоидности ядер 5,7±0,06с. с пределом двойного стандартного отклонения до 6,9с. Средняя пло-идность ядер клеток инфильтрирующей протоковой карциномы близка к показателю плоидности инфильтрирующей дольковой карциномы и составляет 5,8с±0,09с, с учетом двойного стандартного отклонения—7,6с. В гистограммах инвазивных карцином отсутствует модальный класс, наблюдается гетеро- и полиплоидия ядер, отражающие различно выраженную анеуплоидию опухолевых клеток.

6. По сравнению с ядрами эпителиальных структур нормальной молочной железы увеличение площади ядер клеток долькового эпителия при МИН I в 1,4 раза, при МИН II отмечено в 1,5 раза, при дольковой карциноме в 1,9 раз. В протоковом эпителии площадь ядер, по сравнению с нормой, при МИН I увеличивается в 1,2 раза, при МИН II в 1.5 раза, при протоковой карциноме в 2 раза. Эти данные могут также приниматься в качестве дополнительных дифференциально-диагностических признаков при оценке стадий опухолевой прогрессии.

7. С учетом полученных морфометрических и плоидометриче-ских данных предлагается при клинико—морфологической классификации стадии неопластического процесса в молочной железе использовать следующие градации процесса: «норма-МИН I-МИН II-карцинома», как имеющие достоверные статистические различия.

8. Показано, что дифференциальную диагностику можно так же проводить на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, учитывая их совпадения с описанными выше показателями, кроме группы инвазивных карцином, где возможно отклонение значений показателей до 15 %.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При диагностике доброкачественных процессов, неоплазий разных стадий и карцином молочной железы обычное гистологическое исследование следует дополнять проведением морфометрического и плоидометрического анализа гистологического препарата.

Результаты микроспектрофотометрического исследования обладают высокой точностью и надежностью, позволяют более точно дифференцировать доброкачественный и злокачественный характер новообразований молочной железы, а также устанавливать степень выраженности маммарной интраэпителиальной неоплазии, выделяя только две стадии —легкую (МИН I) и тяжелую, включающую в себя и карциному \<in situ« (МИН II), а также ипфильтративные карциномы.

Эти состояния железистого аппарата молочной железы определяют разные клинические подходы к лечению. Микроспектрофото-метрическое исследование позволяет судить о характере клонов кпе-

ток в дольковом и протоковом эпителии в процессе канцерогенеза в молочной железе. Выявленные закономерности могут лечь в основу проведения определенной лечебной тактики и оценки прогностических проблем, связанных с каждой пациенткой. Полученные данные могут быть использованы при создании компьютерной программы дифференциальной диагностики предопухолевых процессов опухолей молочной железы.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1.Григорьева С.Г. «Тканевой объемный профиль» биопсийного материала молочной железы // Успехи теоретической и клинической медицины. — М., РМАГТО, 1999,—Вып. 3,—С. 71.

2.Автандилов Г.Г., Григорьева С.Г., Лоранская И.Д., Петренко Н.В. Оценка пролиферативной активности клеток в гистопатологической диагностике // Тихоокеанский медицинский журнал. —2000.—№ 4,- С. 9-11.

3.Автандилов Г.Г., Григорьева С.Г., Зайратьянц О.В., Преображенская Т.М. Сравнительная патогистологическая и микроспектрофотометрическая диагностика стадий канцерогенеза в молочной железе // Актуальные проблемы общей и частной патологии /Сборник научных трупов. —М, Прогрессивные Био- Медицинские технологии. —2000.—С. 9-11.

4.Григорьева С.Г. Патогистологическая дифференциальная диагностика интраэпителиальных неоплазий и карцином молочной железы // Российские медицинские вести. —2001.—Том VI.—№ 2.—С. 54-57.

5.Автандилов Г.Г., Перов Ю.Л., Григорьева С.Г., Зайратьянц О.В. Патогистологическая диагностика предопухолевых процессов и опухолей молочной железы ii Архив патологии. —2001.—Том 63.—№2. —С. 26-30.

6.Автандилов 1 IГригорьева С.1. Гистофизическое исследование динамики изменений плоидности ядер эпителиальных клеток молочной железы в процессе малигнизации // Актуальные проблемы патологической анатомии и судебной медицины / Межвузовский сборник научных работ.— Саратов, 2001,—С.11-15.

7.Автандилов Г.Г., Григорьева С.Г. Оценка плоидности ядер клеток долько-вого и протокового эпителия молочной железы при диагностике стадий канцерогенеза // Клиническая лабораторная диагностика. —2001.—№ 8.— С 10-14.

8.Автандилов Г.Г., Григорьева С.Г., Гундорова Л.В., Ананян М.А.. Саниев К.Б.. Сулган-Заде Г. С., Application of «IMAGER- СН» Analyzer for Better Tumor Diagnostics // Shanghai: Neural Information Processing, ICONP. -2001.— V. 3,—P. 1401-1402.

9.Автандилов Г.Г., Перов Ю.Л., Григорьева С.Г. ,Зайратьянц О.В. Computer ploidometria in differential diagnosing cancerogenesis stages // Virchows Archiv. —2001,—V.439.—№3,—P. 308.

Ю.Григорьева С.Г. Плоидометрия в уточнении диагностики стадий опухолевого процесса в молочной железе // Диагностическая медицинская морфо-метрия / Сборник, посвященный 80-летию Георгия Герасимовича Автан-дилова.- Москва.: РМАПО, 2002 - С. 175-179.

Список сокращений:

ДНК—дезоксирибонуклеиновая кислота

КА—коэффициент анеуплоидии

МИН—маммарная интраэпителиальная неоплазия

ОДЯ—относительная доля ядер в срезе

ПГЯ—показатель гетероплоидии ядер

ТОП—-тканевой объемный профиль

Светлана Геннадьевна Григорьева

ДИАГНОСТИКА СТАДИЙ КАНЦЕРОГЕНЕЗА В МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЕ (МОРФОМЕТРИЧЕСКОЕ И ПЛОИДОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 08.06.2005 г. Формат 90x60 '/,6 Гарнитура «Тайме». Объем 1 усл. печ. лист. Тираж 100 экз Бумага офсетная №1. Печать трафаретная Отпечатано в МГМСУ, Москва, Делегатская ул, 20/1.

s

4

i I

34 5 J

РНБ Русский фонд

2006-4 11310

Актуальность темы. Карцинома молочной железы занимает первое место в мире по распространенности среди онкологических заболеваний у женщин. Уровень заболеваемости карциномой молочной железы в большинстве развитых стран в последнее время растёт [Spratt J. S., Donegan W. L., Sidestad C. P., 2003]. Спустя год с момента диагностики опухоли летальность среди пациенток достигает 12% [Состояние онкологической помощи населению России в 2000 году, 2001].

В связи с обширной распространённостью, высокой заболеваемостью и смертностью, профилактика карцином и ранняя диагностика предопухолевых изменений в молочной железе остается актуальной медицинской и социальной проблемой. У подавляющего большинства женщин (80%) карцинома молочной железы диагностируется на второй и третьей стадии заболевания, что свидетельствует о низкой выявляемости заболевания в его начальных стадиях [Плетнев С. Д., Мазурин В. Г., 1985; Довгалюк А. 3.,2001].

Проблема новообразований молочной железы содержит целый ряд нерешенных вопросов, связанных с ранней диагностикой карцином и предраковых изменений в молочной железе. Часто возникают трудности при трактовке гистогенеза, степени дифференцировки новообразований, определении стадий начальных форм неопластического процесса [Головин Д. И., 1982; Автандилов Г. Г., 1984; Лоран О. Б., Пушкарь Д. Ю., Франк Г. А., 1999; Silverstein М. J., 1994, 1997]. Группа европейских патологов оценивали 17 пограничных новообразований молочной железы, и ни в одном случае установленные ими патогистологические диагнозы не совпали [European Commision Working group on Breast Screening pathology consistency achieved by 23 European patologhists from 12 countries in diagnosing breast disease and reporting prognostic features of carcinomas., 1999]. Это обусловлено тем, что многие аспекты морфогенеза гиперпластических и неопластических процессов в эпителии молочной железы остаются мало изученными, отсутствует единая и общепринятая классификация стадий неопластического процесса в эпителии молочной железы и гистологическая диагностика этого состояния связана с большой долей субъективизма.

Своевременно начатое лечение предопухолевых процессов, обладающими потенциальной способностью к озлокачествлению, имеет большую практическую ценность [Яковлева И. А., Черный А. П., Бонтарь Э. Р., 1981; Волченко Н. Н., 2000]. Эти данные указывают на необходимость проведения исследований по совершенствованию и повышению точности цитологической и гистологической диагностики новообразований молочной железы, особенно их пограничных форм. Одинаковая воспроизводимость патогистологических диагнозов стадий развития неопластических процессов в молочной железе является одной из важных практических проблем и нуждается в максимальной объективизации процесса морфологической диагностики новообразований. Поэтому необходим поиск морфологических признаков, которые могли бы послужить совершенствованию методов дифференциальной диагностики и более раннему выявлению карцином [Упоров А. В., Семиглазов В. Ф., Пожарисский К. М., 2000; Niezabitovski А., Skolyszewsky J., Rys J., 1997; Kuropkat Ch., Rudolph O., Frahm S. et al., 1994].

В последнее время обсуждается вопрос, связанный с обозначениями легкой и умеренной степени дисплазии, а также тяжелой формы дисплазии и рака «in situ», терминами «интраэпителиальная неоплазия», которую подразделяют на три или две степени. Так, для предстательной железы [Botstwick D. J., Bravver М. К., 1987], шейки матки [Richart R. М., 1990], яичка [Dieckmann К. P., Loy V., 1997], молочной железы [Tavassoli F. А., 1997] уже широко используют соответствующие обозначения интраэпителиальных неоплазий (PIN, CIN, TIN, MIN). Данные классификации неопластических изменений в эпителиальной ткани соответствуют выбору адекватной клинической тактики с учетом требований согласованных протоколов. Для достижения большей объективности в диагностике таких патологических изменений требуется не только подробное описание морфологических изменений в гистологических структурах органов, но и применение комплекса дополнительных методов морфологического исследования, уточняющих возможный темп пролиферативной активности клеток новообразования и изменения их биологических свойств [Автандилов Г. Г., 1984, 1996, 2000; Kearsley I. Н., Furlong К. L., Cooke R. F. et al., 1990; Page D. L., Rogers L. W., 1992]. Современные способы изучения пролиферативной активности клеток проводится с помощью методов, нуждающихся в дорогостоящих расходных материалах (электронная микроскопия, иммуногисто - и иммуноцитохимическое исследование, молекулярно — биологические методы). В то же время изучение содержания генетического материала в ядрах эпителиальных клеток для этой цели используется недостаточно широко, хотя гистофизические методы исследования ДНК не требуют расходных материалов [Автандилов Г. Г., 1972, 1980, 1990; Ташкэ К., 1980; Sandritter W., 1982]. Однако, если микроспектрофотометрическое исследование цитологических препаратов связано с изучением целых клеток и их ядер, то в гистологических срезах данные измерений всегда связаны со случайными сечениями клеточных элементов и требуют специальных методов математического анализа получаемых данных. Наиболее доступным из них является метод сравнительной микроспекторфотометрии [Автандилов Г. Г., 1973, 1990, 2002; Steinbeck R. G., 1997, 1998; Haroske G., Bocking A., Kayser К. et al., 1998].

Микроспектрофотометрический анализ - важный источник диагностической информации, связанный с измерением структуры клеток и их генетического материала. Проведены обширные исследования, показавшие эффективность этого метода в диагностике и прогнозе течения онкологических заболеваний [Автандилов Г. Г., Казанцева И. А., 1973; Богатырев В. Н., 1989; Гундорова JI. В., 2001; Автандилов Г. Г., Саниев К. Б., 2002]. Исследованы морфометрические параметры клеток и изменения плоидности ДНК при различных стадиях канцерогенеза в ядрах клеток эпителия мееогих органов [Автандилов Г. Г., Пашкова В. С., 1971; Червонная JL В., Гладунова 3. Д., 1971; Болгова JI. С., 1990; Андреасян Г. О., Преображенская Т. М., 1995; Helliwell Т., Atkinson М., Cook Т. et al., 1989 и др.]. К настоящему времени сформировался устойчивый круг микроспектрофотометрическнх признаков, количественная оценка которых имеет выраженную диагностическую значимость.

Наиболее информативным методом определения пролиферативной активЕЮСти клеток является оценка плоидности ДНК в ядрах по гистограммам, где измеряется оптическая плотность ядер клеток окрашеш1ых по методике Фёльгена [Автандилов Г. Г., 1973; Berryman I., Sterrett G. F., Papadimitrou J. M.; 1984]. В 1972 была впервые выявлена закоЕЮмерность экспоненциального накоплеЕЕИя ДНК в ядрах клеток ростковых зоее озлокачествляющихся тканей и обосЕЕОваЕЕа гипотеза о суперпродукции ДНК в ядрах этих клеток в процессе каЕщерогеЕЕеза [АвтаЕ1дилов Г. Г., 1972; 2000]. ЗлокачествеЕЕЕЕые опухоли характеризуются мЕюгократным и ЕшрегулярЕЕЫм увеличением геЕЕетического материала в ядре - полиплоидией. В клсточееом цикле имеется ряд коЕггрольЕЕых точек, прохождеЕше которых возможно лишь в случае ЕЕормалыюго завершеЕЕИя предыдущих этапов. Нарушения в прохождеЕЕии фаз митоза ведет к возешкееовсееию хромосомных аберраций, мутаций, и, как следствие - к неравномерному распределению хромосомного материала между ядрами дочерних клеток, которое приводит к появлению ядер клеток с несбалансированным геномом [Автандилов Г.Г., Кижаев Е.В., Баннов С.М., 2003]. Этот процесс проявляется в гетероплоидии и анеуплоидии [Автандилов Г. Г., 1973; Ташке К., 1980; Пальцев М. А., Аничков Н. М., 2000, и др.]. Показана также тесная корреляция между содержанием ДНК в ядрах и их объемом [Бродский В. Я., 1966]. Эти данные доказывают, что гистофизические методы также могут быть использованы для уточнения гистопатологической диагностики новообразований и, в особенности, различных стадий интраэптелиальной неоплазии. Суммарное накопление качественно измененного генетического материала в ядрах опухолевых клеток дает основания для исследования этих изменений в качестве обобщающего диагностического признака.

На базе указанных подходов процесс канцерогенеза в молочной железе изучен недостаточно, а опубликованные данные противоречивы. Широко распространенный метод проточной цитофотометрии не всегда дает г основания для уточнения степеней неопластических состояний в эпителиальной ткани и уровня дисдифференцировки клеток при карциномах, так как при этом способе диагностики исследуются не только клетки опухоли, но и примесь клеток стромы, сосудов и других гистоструктур. Нет работ, связанных с исследованием связи степени дисплазии эпителия молочной железы и плоидностыо эпителиоцитов. Применение морфометрического и плоидометрического методов исследования при изучении процесса канцерогенеза в эпителии молочной железы может открыть новые возможности для дифференциальной диагностики новообразований молочной железы.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - совершенствование морфологической диагностики стадий канцерогенеза в молочной железе на основе данных морфометрического и плоидометрического исследования.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для достижения указанной цели решали следующие задачи:

1. На гистологическом материале провести морфометрическое и плоидометрическое исследование ядер клеток долькового и протокового эпителия молочной железы с учетом стадии канцерогенеза.

2. Определить дифференциально - диагностические морфометрические и плоидометрические критерии нормальной эпителиальной ткани, маммарной интраэпителиальной неоплазии (МИН) разной степени выраженности и инфильтрирующих карцином.

3. Оценить возможность использования данных плоидометрического исследования для разграничения гиперплазии нормального эпителия, степеней интраэпителиальных неоплазии, иинвазивных карцином молочной железы.

4. Установить дифференциально - диагностические значения измерения площади ядер долькового и протокового эпителия молочной железы для определения стадии канцерогенеза. v »

5. Создать обоснованную и объективизированную классификацию стадий канцерогенеза на основании полученных морфометрических и плоидометрических данных для применения в патогистологической практике.

6. Сравнить показатели площади и плоидности ядер клеток долькового и протокового эпителия молочной железы на разных стадиях канцерогенеза в препаратах, окрашенных по методике Фёльгена и обычной окраской гематоксилином и эозином.

7. Оценить возможность применения окраски гематоксилином и эозином для проведения морфометрического и плоидометрического исследования эдцтелия молочной железы на разных стадиях канцерогенеза.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В данной работе использованы принципиально новые методики исследования количественной и качественной организации эпителия молочной железы на различных этапах канцерогенеза. Основой работы является применение нового направления медицинской диагностики -компьютерной микроспектрофотометрии.

На большом объеме биопсийного материала впервые способом выявлены объективные дифференциально - диагностические критерии степеней дисплазии эпителия молочной железы и инвазивных дольковой и протоковой карцином молочной железы на основании изменений плоидности и площади ядер клеток. Разработана классификация неопластических процессов в эпителии молочной железы на основании полученных плоидометрических и морфометрических параметров эпителия молочной железы на разных стадиях канцерогенеза. Проведено сравнение данных о площади и плоидности ядер клеток эпителия молочной железы, полученных при изучении препаратов, окрашенных по методике Фёльгена и гематоксилином и эозином.

Получены также данные, подтверждающие ступенчатость стадий канцерогенеза в эпителиальной ткани [Автандилов Г. Г., 2003, 2004,2005].

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ

Полученные данные имеют определенную значимость для теоретической медицины и практического здравоохранения, поскольку они дают патоморфологу объективные дифференциально - диагностические критерии при определении степени внутриэпителиальной неоплазии и карцином молочной железы.

Выбор материала исследования по диагностическому признаку обусловлен высокой заболеваемостью фиброзно - кистозной болезнью и фиброаденомой молочной железы женщин репродуктивного возраста. Инвазивные дольковая и протоковая карциномы молочной железы так же составляют большую часть в группе всех инвазивных карцином данной локализации.

Результаты исследования, обладая высокой точностью и надежностью благодаря использованию метода гистофизического анализа срезов и их статистической обработки, дают возможность при любых подозрениях патоморфолога на развитие патологической клеточной пролиферации провести уточнение её характера, а также стандартизованнно устанавливать степень выраженности интраэпителиальной неоплазии (МИН). Выявленные закономерности процесса канцерогенеза эпителия молочной железы могут быть использованы в разработке адекватных лечебно - профилактических мероприятий. При дифференциальной диагностике патологии молочной железы дополнительно к обычным гистологическим исследованиям необходимо использование морфометрических и плоидометрических данных для объективизации диагностического процесса.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Развитие неопластических процессов и карцином молочной железы сопровождается увеличением размеров ядер клеток и нарастанием показателя плоидности доминирующего клона клеток

2. Показатель средней плоидности и площади ядер клеток эпителия молочной железы позволяет дифференцировать низкую (МИН I) и высокую (МИН II) степени маммарной интраэпителиальной неоплазии, а также инвазивные карциномы.

3. Измерение плоидности и площади ядер эпителиальных клеток молочной железы возможно проводить на препаратах, окрашенных рутинной окраской гематоксилином и эозином с учетом увеличения возможной ошибки по мере нарастания стадии канцерогенеза.

4. Гистологические заключения, дополненные морфометрическими и плоидометрическими характеристиками, точнее отражают стадии неопластического процесса, повышают информативность и дают объективные основания для диагностики стадий неопластического процесса в ткани молочной железы.

5. Классификация морфологических изменений эпителиальных структур молочной железы, включающая в себя только статистически различимые информативные параметры и основанная на данных о плоидности ядер их клеток, является наиболее объективной и дает возможность принимать адекватные диагностические и клинические решения, соответствующие стадиям канцерогенеза.

15

126 ВЫВОДЫ

1. Метод сравнительной микроспектрофотометрии позволяет устанавливать дополнительно к обычному гистологическому исследованию дифференциально — диагностические объективные параметры плоидности и площади ядер эпителиальных клеток молочной железы, окрашенных на ДНК в норме, маммарной интраэпителиальной неоплазии первой (МИН I), второй (МИН II) степеней и инвазивных дольковой и протоковой карцином.

2. В нормальном дольковом и протоковом эпителиях молочной железы средний показатель плоидности ядер соответствует 2,5±0,02с, с пределом двойного стандартного отклонения до 2,9с, куда входят показатели доброкачественных гиперпластических процессов. В гистограммах распределения ядер по плоидности преобладает диплоидный модальный класс.

3. Дисплазия легкой и умеренной степени выраженности (маммарная интраэпителиальная неоплазия I степени — МИН I) долькового и протокового эпителия молочной железы характеризуется значениями плоидности 3,1±0,02с с пределом двойного стандартного отклонения до 3,5с и появлением в гистограмме тетраплоидных ядер.

4. При тяжелой дисплазии и карциноме «in situ» (МИН II) молочной железы наблюдается дальнейшее увеличение показателя средней плоидности ядер клеток долькового и протокового эпителия до 4,0±0,05с, с пределом двойного стандартного отклонения до 4,8с и гетероплоидность ядер клеток.

5. Инфильтрирующая дольковая карцинома молочной железы характеризуется средними значениями плоидности ядер 5,7±0,06с, с пределом двойного стандартного отклонения до 6,9с. Средняя плоидность ядер клеток инфильтрирующей протоковой карциномы близка к показателю плоидности инфильтрирующей дольковой карциномы и составляет 5,8с±0,09с, с учетом двойного стандартного отклонения - 7,6с. В гистограммах инвазивных карцином отсутствует модальный класс, наблюдается гетеро- и полиплоидия ядер, отражающие различно выраженную анеуплоидию опухолевых клеток.

6. По сравнению с ядрами эпителиальных структур нормальной молочной железы увеличение площади ядер клеток долькового эпителия при МИН I в 1,4 раза, при МИН II отмечено в 1,5 раза, при дольковой карциноме в 1,9 раз. В протоковом эпителии площадь ядер, по сравнению с нормой, при МИН I увеличивается в 1,2 раза, при МИН II в 1,5 раза, при протоковой карциноме в 2 раза. Эти данные могут также приниматься в качестве дополнительных дифференциально-диагностических признаков при оценке стадий опухолевой прогрессии.

7. С учетом полученных морфометрических и плоидометрических данных предлагается при клинико — морфологической классификации стадии неопластического процесса в молочной железе использовать следующие градации процесса: «норма — МИН I — МИН II — карцинома», как имеющие достоверные статистические различия.

8. Показано, что дифференциальную диагностику можно так же проводить на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, учитывая их совпадения с описанными выше показателями, кроме группы инвазивных карцином, где возможно отклонение значений показателей до 15 %.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При диагностике доброкачественных процессов, неоплазии разных стадий и карцином молочной железы обычное гистологическое исследование следует дополнять проведением морфометрического и плоидометрического анализа гистологического препарата.

Исходя из теории информации, в дифференциальной диагностике должны быть учтены микроспектрофотометрические параметры каждой диагностической группы с различными вероятностями безошибочного суждения: р= 0,5, соответствющее отклонению среднего показателя на 0,67о, а также при более широких интервалах вариабельности признаков — р= 0,7, отлонение на1о и р = 0,95, отклонение на 2ст (Табл. 14 и 15).

Табл. 14. Диагностические пределы значений плоидности (М±2а) ядер эпителиальных клеток молочной железы (в пикселях) на разных стадиях канцерогенеза.

Диагностическая группа Окраска по Фёльгену Гематоксилин и эозин

М-2 о М М+2с М-2 о М М+2о

Дольковый эпителий

Норма 2,1 2,5 2,9 2,1 2,5 2,9

МИН I 2,7 3,1 3,5 2,5 3,1 3,7

МИН II 3,2 4,0 4,8 3 4,0 5,0

Карцинома 4,5 5,7 6,9 3,7 4,9 6,1

Протоковый эпителий

Норма 2,1 2,5 2,9 2,2 2,6 3,0

МИН I 2,7 3,1 3,5 2,5 3,1 3,7

МИН II 3,2 4,0 4,8 3,5 4,1 4,7

Карцинома 4,0 5,8 7,6 4,0 6,0 8,0

Табл. 15. Диагностические пределы значений площади (М±2ст) ядер эпителиальных клеток молочной железы (в пикселях) на разных стадиях канцерогенеза.

Диагностическая группа Окраска по Фёльгену Гематоксилин и эозин

М-2 а М М+2ст М-2 о М М+2ст

Дольковый эпителий

Норма 230 286 432 232 300 368

МИН I 334 396 518 271 367 463 .

МИН II 278 435 583 360 490 620

Карцинома 424 550 676 547 595 643

Протоковый эпителий

Норма 224 280 336 212 306 400

МИН I 260 360 460 294 368 442

МИН II 370 430 490 351 473 596

Карцинома 272 564 856 648 754 860

Результаты микроспектрофотометрического исследования обладают высокой точностью и надежностью, позволяют более точно дифференцировать доброкачественный и злокачественный характер новообразований молочной железы, а также устанавливать степень выраженности интраэпителиальной неоплазии, выделяя только две стадии — легкую (МИН I) и тяжелую, включающую в себя и карциному «in situ» (МИН II), а также инфильтративные карциномы.

Эти состояния железистого аппарата молочной железы требуют разные клинические подходы. Микроспектрофотометрия позволяет судить о характере клонов клеток в дольковом и протоковом эпителии в процессе канцерогенеза в молочной железе. Выявленные закономерности могут лечь в основу проведения определенной лечебной тактики и оценки прогностических проблем, связанных с каждой пациенткой. Полученные данные могут быть использованы при создании компьютерной программы дифференциальной диагностики предопухолевых процессов опухолей молочной железы.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

В результате проведенного комплексного гистологического и микроспектрофотометрического исследования биоптатов молочной железы получены данные к уточнению дифференциальной диагностики гиперпластических процессов, легкой и тяжелой степеней интраэпителиальной неоплазии и дольковых и протоковых карцином молочной железы при обнаружении в ней опухолей и опухолевидных образований, которые используются:

• в учебном процессе и научной работе кафедры патологической анатомии РМАПО

• в практической работе патологоанатомических отделений Медсанчасти № 1 АМО ЗИЛ г. Москвы и Московской городской клинической больницы № 33 им. А. А. Остроумова.

Апробация диссертационного материала. Основные положения диссертации отражены в работах, опубликованных в центральных медицинских журналах и других изданиях, доложены на XVI, XVII, XVIII и XXII научно - практических конференциях РМАПО "Морфометрия в диагностике болезней" (Москва, 1998, 1999, 2000, 2004), на VI Всероссийской конференции по патологии клетки (2000). Апробация диссертационной работы состоялась на совместном заседании кафедр патологической анатомии РМАПО и МГМСУ 20 апреля 2005 года.

Публикации по теме диссертации

1. «Тканевой объемный профиль» биопсийного материала молочной железы // Успехи теоретической и клинической медицины. — М., РМАПО, 1999. - Вып. 3. - С. 71.

2. Оценка пролиферативной активности клеток в гистопатологической диагностике // Тихоокеанский медицинский журнал. — 2000. - № 4.- С. 9 - 11 (соавт. Автандилов Г. Г., Лоранская И. Д., Петренко Н. В.)

3. Сравнительная патогистологическая и микроспектрофотометрическая диагностика стадий канцерогенеза в молочной железе // Актуальные проблемы общей и частной патологии /Сборник научных трудов. — М., Прогрессивные Био- Медицинские технологии. - 2000. - С. 9 - 11 (соавт. Автандилов Г. Г., Зайратьянц О. В., Преображенская Т. М.)

4. Патогистологическая дифференциальная диагностика интраэпителиальпых пеоплазий и карцином молочной железы // Российские медицинские вести. — 2001. - Том VI. - № 2. - С. 54 - 57.

5. Патогистологическая диагностика предопухолевых процессов и опухолей молочной железы // Архив патологии. — 2001. - Том 63. - №2. — С. 26 - 30. (соавт. Г. Г. Автандилов, Ю. Л. Перов, О. В. Зайратьянц)

6. Гистофизическое исследование динамики изменений плоидности ядер эпителиальных клеток молочной железы в процессе малигнизации //Актуальные проблемы патологической анатомии и судебной медицины / Межвузовский сборник научных работ. - Саратов, 2001. - С. 11 - 15 (соавт. Автандилов Г. Г.)

7. Оценка плоидности ядер клеток долькового и протокового эпителия молочной железы при диагностике стадий канцерогенеза // Клиническая лабораторная диагностика. —2001. - № 8. - С 10 - 14 (соат. Автандилов Г. Г.)

8. Application of «IMAGER - СН» Analyzer for Better Tumor Diagnostics // Shanghai: Neural Information Processing, ICONP. -2001. - V. 3. - P. 1401 - 1402 (соавт. Автандилов Г. Г., Гундорова JI. В., Ананян М. А., Саниев К. Б., Султан - Заде Т. С.)

9. Computer ploidometria in differential diagnosing cancerogenesis stages // Virchows Archiv. - 2001. - V.439. - №3. - P. 308 (соавт. Автандилов Г. Г., Перов Ю. JI., Зайратьянц О. В.)

10. Плоидометрия в уточнении диагностики стадий опухолевого процесса в молочной железе //Диагностическая медицинская' морфометрия /Сборник, посвященный 80 - летию Георгия Герасимовича Автандилова.- Москва.: РМАПО, 2002.- С. 175 - 179.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы; главы, посвященной материалам и методам исследования; главы, в которой представлены собственные результаты; главы с обсуждением полученных результатов, заключения, выводов; библиографического указателя использованной литературы, содержащего 116 отечественных и 79 иностранных публикаций. Диссертация иллюстрирована 15 рисунками, 15 цифровыми таблицами, 29 фотографиями и 15 гистограммами.