Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Гистоплоидометрическое исследование гастробиоптатов в совершенствовании диагностики новообразований желудка

На правах рукописи

КУПРЮШИНА Наталья Викторовна

ГИСТОПЛОИДОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГАСТРОБИОПТАТОВ В СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ ДИАГНОСТИКИ НОВООБРАЗОВАНИЙ ЖЕЛУДКА

14.00.15 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□03065194

Москва 2007

003065194

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научный руководитель- доктор медицинских наук, профессор,

Заслуженный деятель науки РФ Автандилов Г. Г.

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор

Михалева Л. М.,

доктор медицинских наук, профессор Раденска-Лоповок С. Г.

Ведущее учреждение Институт хирургии им. А. В. Вишневского

Защита состоится «_» октября 2007 г в _ часов на

заседании Диссертационного совета Д 001 004.01 ГУ НИИ морфологии человека РАМН по адресу. 117418, г. Москва, ул Цюрупы, д 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ морфологии человека РАМН

Автореферат разослан «_»_2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Л. П. Михайлова

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

За последние 10 лет в России заболеваемость и смертность от злокачественных новообразований желудка увеличилась более чем в два раза и в структуре смертности населения от онкологической патологии других локализаций занимает третье место (Чиссов В. И, Старинский В. В., Ковалев Б Н, Ременник Л В., 1996) Высокая смертность больных чаще всего бывает связана с поздней диагностикой и отсутствием онкологической настороженности при выявлении предраковых состояний слизистой оболочки желудка Однако гистологическая диагностика доброкачественных, пограничных и злокачественных новообразований, выполняемая при исследовании гастробиоптатов, нуждается в дальнейшем совершенствовании (Аруин Л. И., Капуллер Л Л., Исаков В А, 1998). Некоторые авторы приходят к неутешительным выводам о том, что гистологические диагнозы дисплазий и интраэпителиалмых неоплазий пищеварительного тракта еще длительное время не будут достаточно точными (Кононов А. В , 2005)

Известно, что на точность заключений морфолога при исследовании гастробиоптатов влияет ряд факторов, в числе которых количество участков, выбранных эндоскопистом для исследования, объем кусочков слизистой оболочки желудка, количество срезов и их ориентировка, а также разная оценка наблюдаемых морфологических изменений, что иногда способствует различной оценке одних и тех же гистологических препаратов разными специалистами Отмечено, что противоречия чаще возникают при разграничении степеней интраэпителиальных неоплазий и последних - от начальных форм рака желудка (Ковгшьский Г. Б., Рыбакова М Г , 2006)

Отмечено, что для совершенствования диагностики

новообразований желудка целесообразно применение и количественных методов анализа

Такая перспектива открывается при применении гистоплоидометрического метода исследования препаратов, включающего - в себя базовую 5 микроскопическую диагностику, выполненную по срезам биоптатов, которая дополняется результатами компьютерного плоидометрического анализа (измерения содержания ДНК в ядрах клеток)- Подобные исследования, начиная с работ Е. Г, Автандилова, И. ,А. Казанцевой и Л В. Червонной (1972), уже дали положительные результаты при уточнении стадий канцерогенеза в ряде других органов человека

Нарушения а генетическом аппарате клетки мррфологически характеризуются появлением патологических митозов, гиперплоидных и анеуплоидных ядер С учетом вероятностного характера массовых делений при смене популяции клеток в новообразованиях удалось выявить ступенчатый стадийный процесс канцерогенеза с прогрессирующей пролиферацией опухолевых клеток (Автандилов Г Г, 2004) Однако изучение общего содержания ДНК в ядрах эпителиальных клеток слизистой оболочки желудка в процессе канцерогенеза используется пока недостаточно, хотя является более экономичным методом и имеет научный интерес (Steinbeck R. G., 1998)

Совершенствование диагностики патологии слизистой оболочки желудка с помощью гастробиопсий и использованием гистоплоидометрической методики исследования препаратов должно служить повышению качества распознавания новообразований желудка.

Цель работы' разработка метода гистоплоидометрического исследования гастробиоптатов для совершенствования диагностики эпителиальных новообразований желудка. Задачи исследования

1 Провести гшоидометрическое и морфометрическое исследование ядер клеток эпителия слизистой оболочки желудка, учитывая стадии

канцерогенеза, для получения объективных и воспроизводимых диагностических критериев стадий канцерогенеза

2 Определить дифференциально-диагностические плор.дометрические и морфометрические критерии, характеризующие нормальную эпителиальную ткань, разные степени интраэпителиальной неоплазии и карциномы желудка с разной степенью снижения дифференцировки.

3 Использовать для диагностики показатели плоидности и площади сечения ядер клеток эпителия слизистой оболочки желудка на разных стадиях канцерогенеза, полученные на препаратах, окрашенных по методике Фейльгена, а также гематоксилином и эозином

4. Уточнить классификацию стадий канцерогенеза в эпителиальной ткани слизистой оболочки желудка с учетом плоидометрических и морфометрических критериев для применения ее в патоги отологической практике.

Научная новизна

• Разработан и апробирован новый метод исследования гастробиоптатов, позволяющий уточнять и контролировать результаты гистологической диагностики стадий развития шителиальных новообразований в слизистой оболочке желудка, основанный на использовании данных компьютерной плоидометрии и морфометрии ядер их клеток

• Установлен комплекс объективных критериев для проведения дифференциальной диагностики гиперпластических процессов, низкой и высокой степеней интраэпителиальной неопламш и карцином желудка

• Показано, что дифференциальную диагностику стадий канцерогенеза в слизистой оболочке желудка о учетом плоидометрических данных можно проводить на срезах, окрашенных как по методике Фейльгена, так и гематоксилином и эозином.

• Уточнена классификация неопластических процессов в эпителии слизистой оболочки желудка на разных стадиях канцерогенеза, базирующаяся на плоидометрических и морфометрических параметрах.

Практическая значимость полученных результатов

Полученные в работе данные имеют значение для теоретической медицины и практического здравоохранения, поскольку они позволяют использовать визуализацию плоидности и морфометрические характеристики ядер клеток эпителия слизистой оболочки желудка в качестве дополнительной информации к результатам обычного гистологического исследования. Новые диагностические данные являются объективными дифференциально-диагностическими критериями при определении степеней гастральной интраэпителиальной неоплазии и развития аденокарцином желудка Гистоплоидометрия препарата дает комплекс воспроизводимых количественных критериев, достаточных для проведения дифференциальной диагностики предраковых состояний и рака желудка, несмотря на небольшой объем исследуемых гастробиоптатов.

Результаты плоидометрического исследования, обладая высокой точностью и надежностью, позволяют при любых подозрениях на развитие опухолевой трансформации уточнить ее характер и установить степень выраженности гастральной интраэпителиальной неоплазии (ГИН) и начала злокачественного роста

Предлагаемый способ гистоплоидометрической диагностики предраковых состояний и рака желудка может применяться в патологоанатомических отделениях лечебно-диагностических учреждений.

Личный вклад соискателя

Автором лично выполнены гистологическое, плоидометрическое и морфометрическое исследование изучаемого материала, проведена работа

по количественной оценке, статистической обработке и анализу результатов исследований и по созданию новой гистоплоидометрической классификации эпителиальных новообразований слизистой оболочки желудка.

Апробация диссертации

Основные положения работы доложены и обсуждены на VI Международной конференции «Радиоэлектроника в медицине» (Москва, 2005); XXIV научно-практической конференции «Морфометрия в Диагностике болезней» (Москва, 2006), Межрегиональной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора И С Новицкого (Тверь, 2006), Научной сессии МИФИ-2007 (Москва, 2007)

Реализация результатов работы

Результаты исследования применяются при проведении дифференциальной диагностики гиперпластических процессов, различно выраженных степеней интраэпителиальной неоплазии и злокачественных опухолей желудка, с разной степенью дифференцировки на кафедре патологической анатомии РМАПО, в патологоанатомическом отделении Пензенской областной клинической больницы им Н. I- Бурденко и используются в лекционных курсах на кафедрах патологической анатомии Российской медицинской академии последипломного образо зания.

Объем и структура диссертации

Текст диссертации изложен на 144 страницах, состоит из введения, обзора литературы; главы, посвященной материалам и методам исследования, главы, в которой представлены собственные результаты; главы с обсуждением полученных результатов, практических рекомендаций, заключения, выводов; библиографического указателя

использованной литературы, содержащего 110 отечественных и 95 иностранных публикаций Диссертация иллюстрирована 10 таблицами, 37 рисунками.

Основные положения, выносимые на защиту

1- Применение гистоплоидометрического метода исследования гастробиоптатов позволяет повысить качество диагностики стадий развитая канцерогенеза в слизистой оболочке желудка

2 Гиперпластические, предраковые и раковые процессы в желудке характеризуются определенными средними показателями плоидности ядер клеток железистого эпителия и составами опухолевых клеток.

3. Для решения спорных диагностических задач возможен учет изменения значений плоидности и площади ядер эпителиальных клеток желез на препаратах гастробиоптатов, окрашенных как по методу Фейльгена, так и гематоксилином и эозином

Материал и методы исследования

В течение 2004—2006 гг. в патологоанатомическом отделении Пензенской областной клинической больницы имени Н. Н Бурденко (главный врач А Н Лавров) проведены гистологические исследования 3846 биоптатов слизистой оболочки желудка.

Из этого числа для углубленного изучения отобраны типичные случаи биопсийного материала от 101 больного для диагностики стадий развития новообразований В возрасте 40-49 лет было 23 пациента, 50-59 лет — 28, 60-69 лет — 31, 70-79 лет - 19. Биопсии слизистой оболочки кардиального отдела и тела, а также патологических очагов в слизистой оболочке желудка проводили для морфологической верификации клинических диагнозов хронического атрофического гастрита, хронической язвы желудка, аденом с признаками дисплазии, рака желудка

Исследован материал от 33 пациентов, имевших воспалительные процессы в стенке желудка, от 40 - с доброкачественными гипертластическими процессами и пограничными неоплазиями и от 28 - с аденокарциномами желудка. Биоптаты фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали по общепринятой методике и заливали в парафин. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином

Морфометрическое исследование гастробиоптатов

Оценивали гистоархитектонику гастробиоптатов с помощью окулярной стереометрической сетки Автандилова, содержащей 100 тест-точек (использовали окуляр и объектив *10) (Автандилов Г. Г, 1972) В каждом срезе анализировали по 20 полей зрения. Процентное соотношение долей изучаемых объектов определяли простым подсчетам- совпавших точек окулярной сетки с изучаемыми объектами Всего проведено 2020 измерений гистологических срезов гастробиоптатов

- ПлойДометричеекое исследование гастробиоптатов

После установления гистологических диагнозов дополнительно на кафедре патологической анатомии PMAIIO (заведующий кафедрой - член-корреспондент РАМН, профессор Ю JI. Перов) провели компьютерное микроспектрофотометрическое исследование тех же срезов л а анализаторе изображений «Имаджер-ЦГ» с программой для ЭВМ № 2001610674 от 5.06.2001 (Автандилов Г. Г., Саниев К Б, 2002; 2007)

На серийных парафиновых срезах толщиной* 8 мкм, окрашенных по методике Фейльгена (без окрашивания фойа), исследовали по пять полей зрения препарата при увеличении микроскопа в 400 раз. Изучали клетки в типичных участках с нормальным" гистологическим строением, с признаками гиперплазии-- легкой, умеренной и' тяжелой степеней дисплазий, карциномы «т situ», а также участки аденокарцином желудка

При постановке гистоплоидометрического диагноза учитывали требования Патента РФ на изобретение № 224099 от 10.08.2004 г. «Способ дифференциальной диагностики стадий канцерогенеза» и положения закономерности ступенчатой стадийности развития новообразований (Диплом на открытие № 300 РФ от 27 01.2006 г.)

В отличие от непосредственных измерений целых ядер клеток в цитологических мазках, при изучении одинаковых по толщине и окраске гистологических срезов получают косвенную информацию о средних значениях содержания ДНК в ядрах клеток по выборкам целых ядер и их фрагментов, используя специальную математическую обработку результатов измерений ядер клеток ростковых зон новообразований. Статистическая обработка этих результатов давала средний показатель «гистологического стандарта плоидности» (2 с).

Далее проводили микроспектрофотометрическое исследование ядер клеток железистого . эпителия и новообразований желудка путем автоматического деления интегральной яркости ядер исследуемых клеток на интегральную яркость, соответствующую единице плоидности. Толщина препарата, условия освещения и пороги яркости измеряемых объектов сохраняли одинаковыми для всех измерений.

На экран монитора компьютера и в печать выводили результаты измерений: площадь оптического сечения ядер клеток [в пикселях], их плоидностъ [в единицах , «с»], значения лимитов показателей, средние арифметические: простые [М] и взвешенные [М^ - «ИНДНК» (индекс накопления ДНК)], среднеквадратические отклонения [±о] и ошибки выборок [±/и], а также гистограммы распределения показателей плоидности выделенных ядер клеток. В зависимости от плоидности ядра клеток и количества клеток (столбики на гистограммах) представляли разными псевдоцветами. Гистограммы распределения клеток по плоидности их ядер характеризовали клеточный состав на разных стадиях

развития новообразований. Эквивалентом пролиферативной активности клеток принимали среднее количество синтезированной в ядрах ДНК, превышающем значения диплоидного уровня (Автандилов Г. Г., 1984, 1990,2002).

Тканевой стандарт плоидности ядер был получен по данным исследования ядер 2498 малых лимфоцитов (с диплоидным набором ДНК) в препаратах стандартной толщины, окрашенных по методике Фейльгена в срезах изучаемой ткани слизистой оболочки желудка

Для определения плоидности ядер клеток новообразований желудка подвергли исследованию 16911 ядер эпителиальных клегок слизистой оболочки и неоплазий желудка, из них 724 ядра эпителиальных клеток желез нормального строения, 3380 ядер — при гиперпластических процессах (аденомах), 1650 - при аденомах с наличием признаков тяжелой дисплазии эпителия, 953 - при интраэпителиальных неоплазиях с различной степенью выраженности, 3482 - при высокодифференцированной, 2667 - при умереннодифференцированной, 3505 - при низкодифференцированной аденокарциномах желудка

При проведении кариометрических исследований изучено 17642 ядра эпителия слизистой оболочки желудка (окраска по методике Фейльгена).

При сравнительной оценке результатов плоидометрия, получаемых на срезах окрашенных двумя методиками, подвергли исследованию 12906 ядер эпителиальных клеток слизистой оболочки желудка, окрашенных по Фейльгену 724 ядра клеток желез нормального строения, 3340 - при ГИН-1, 2643 - при ГИН-1Г, 6199 - при аденокарциномах различной степени дифференцировки, 6266 ядер клеток на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином: 652 ядра клеток желез нормального строения, 1243 - при ГИН-1, 1322 - при ГИН-П и 3049 - при аденокарциномах с различной степенью снижения дифференцировки

По аналогии с обозначениями, принятыми при диагностике стадий канцерогенеза в других органах (МИН, НИН и др.), для обозначения степени интраэпителиальной неоплазии использовали термин «гастральная интраэпителиальная неоплазия»: низкой степени (ГИН-I) и высокой степени (ГИН-П) Этот термин обозначает дисплазии эпителия и характеризуется различно выраженными нарушениями

гистоархитекгоникн, клеточной дифференцировки и изменениями морфологии желез слизистой оболочки желудка (Классификация ВОЗ опухолей пищеварительного тракта, 2000). Этот термин менее трагичен для больного, чем интраэпителиальный рак, и не может служить причиной Канцерофобии

Методы статистического анализа

Полученные характеристики исследуемых ядер подвергали статистической обработке в автоматическом режиме при помощи компьютерной программы анализатора изображений «Имаджер-ЦГ» Степень достоверности различий простых и взвешенных средних показателей оценивали /-критерием Стьюдента. Различия между показателями, характеризующими исследуемые группы наблюдений, принимали достоверными при 0,95 уровне вероятности безошибочного суждения (р < 0,05).

Результаты исследования и их обсуждение

Дифференциальная гистологическая диагностика легкой, умеренной, тяжелой дисплазии, рака «in situ» и аденокарцином желудка с различной степенью снижения дифференцировки клеток по биоптатам нередко оказывается затруднительной При обычной диагностике, выполняемой по гистологическим срезам, окрашенным гематоксилином и эозином,

патологоанатому сложно судить о клеточном составе опухоли, о процессе обновления и пролиферативной активности эпителия в железах желудка. Поэтому возникает необходимость проведения дополнительных дорогостоящих иммуногистохимических и других исследований. Например, для оценки интенсивности пролиферации клеток широко используют маркер Кг-67 (Лазарев А. Ф, Климачев В В, Авдалян А. М., 2006).

Установлено, что почти четверть всех гастробиоптатов, исследованных в патологоанатомическом отделении Пензенской областной клинической больницы, требовали проведения взаимных консультаций, а некоторые диагнозы, выставленные по гастробиоптатам, не совпали с результатами - послеоперационного гистологического исследования По одним и тем же срезам биоптатов иногда диагностировались разные степени тяжести > гастральной интраэпителиальной неоплазии при проведении дифференциальной диагностики слабой и умеренной дисплазии с тяжелой дисплазией и раком, «in situ» - почти в 25% случаев и рака «in situ» с высокодифференцированной аденокарциномой - в 20% наблюдений.

Общая морфометрическая характеристика гастробиоптатов

1. Изменение гистоархитектоники диагностических биоптатов слизистой оболочки желудка

Учитывая небольшой объем гастробиоптатов, важно иметь информацию об изменениях его гистоархитектоники в разных периодам развития онкологического процесса. Для этого получали сведения об объемных долях эпителиальной ткани, стромы и сосудов в каждом кусочке биоптата.

В биоптатах с морфологической картиной аденом желудка по мере нарастания втепвн« дисплазии эпителия наблюдали' изменение «ткайевого

профиля», проявлявшегося в увеличении объемной доли железистого эпителия и, соответственно, в уменьшении доли стромы и ее сосудов, отмечалось также увеличение показателей лимфоплазмоцитарной инфильтрации собственной пластинки слизистой оболочки желудка.

2. Изменение показателей плоидности ядер клеток эпителия слизистой оболочки желудка в разных стадиях канцерогенеза

При компьютерной микроскопии ядер эпителиальных клеток основное внимание уделяли трем состояниям слизистой оболочки желудка' нормальная слизистая оболочка, пограничные состояния и аденокарциномы желудка.

Как следует- из результатов проведенной компьютерной плоидометрии, наиболее значимыми диагностическими показателями при развитии неопластического процесса оказались средние показатели плоидности их ядер и показатель ИНДНК. При сравнении плоидности ядер неизмененного эпителия и ГИН-1, ГИН-1 и ГИЫ-П, а также ГИН-П и высокодифференцированной карциномы вероятность случайности различий диагностических показателей оказалась очень низкой (р < 0,001), что подчеркивает надежность шстоплоидометрической дифференциальной диагностики доброкачественных, пограничных и злокачественных эпителиальных новообразований желудка. --

, Плоидометрические данные свидетельствуют о прогрессирующем нарастании среднего значения содержания ДНК в ядрах эпителиальных клеток в соответствии со стадиям канцерогенеза, начиная с уровня 2,4 с, характерного для нормальных желез желгудка, ,и кончая. 6,7 с - при недифференцированных карциномах. При доброкачественных гиперпластических процессах (аденомах) клетки желез характеризуются наличием диплоидных и преобладающих по количеству триплоидных ядер. В аденомах также ,отмечается увеличение показателей плоидносш до 3,0-3,5 с.

Результаты исследований приведены в таблице 1 и на рисунке 1,

Таблица 1

Средние значения плоидности и индекса накопления ДНК ядер эпителиальных клеток слизистой желудка в норме и на разных стадиях канцерогенеза

Гистологический диагноз Количество изученных ядер клеток Средняя плоидность ядер, с Индекс накопления ДНК, с

М \±о ±т М ±ст ±/я

Нормальная слизистая оболочка желудка 724 2,4 0,6 0,05 2,4 0,6 0,05

Гиперпластические процессы (аденомы)?' 3380 |з,о 0,8 0,04» 3,6 0,9 0,05

Аденомы с низкой- v? Степенью i" дисплазии эпителия (ГИН-1) 1650 3,8*** 1,1 0,15 4,0 U 0,1

Наличие атипических желез (ГИН-П) 550 4,0 1,1 0,08 4,2 1,2 0,1

Высокая степень д исплазии эпителия, рак «in situ» (ГИН-П) 953 4,3*** 1,4 0,12 4,6 1,5 0,1

Карцийомьг высокодифферен-цированная 3482 5,4*** U 0,01 6,2 1,3 0,12

умереннодифферен -цированная 2667 ! 5,5 ; 1,3 1 • 0,08 6,5 1,6 0,09

низкодифферен-цированная 3505 5 6,7 | 1,2 0,1 6,9 1,2 0,1

Примечание. Вероятность случайности различия ***р < 0,001 с показателями последующих основных диагностических групп. (

Диагностическое значение увеличения показателей средней шюидностн ядер эпителиальным клеток новообразований желудка в процессе

канцерогенеза

8 7 6 5 4 3 2 1 О

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис, I Диагностическое увеличение показателей средней шюидностн ядер эпителиальных клеток новообразований желудка в процессе канцерогенеза. Ось ординат - длоидность. с. Ось абсцисс: 1 - норма: 2 - гиперллаегические процессы; 3 - аденомы с тяжелой диеплазисй эпителия; 4 — атипические железы;

5 - ГИН; 6 - высокодифференцирован ная аде но карцинома;

7 - умерен недифференцированная аденокарциномн;

8 - низ ко дифференцированная адснокарцинома

Традиционная оценка состояния железистого эпителия, как легкая диспдазия, обозначается термином «низкая степень интраэпителиальной яеоплазии» (ГИН-1), а тяжелая и рак «in situ» - «высокая степень интраэпитаииальной неоплазии» (ГИН-Ц).

Результаты проведенной нами плоидометрии гистологических препаратов слизистой оболочки желудка свидетельствуют о том, что гто

Hllllll

мере развития ГИН различной степени тяжести и аденокарвдаом с разной степенью дифференцировки последовательно увеличиваются показатели плоидности и площадь оптического сечения ядер эпителиальных клеток, нарастает ядерный полиморфизм, увеличивается число анеуплоидных клеток в ростковой зоне. Полученные результаты полностью согласуются с результатами исследований авторов, проведенных на других новообразованиях (Автандилов Г. Г., Стрижева Н. В., 2003; Гундорова JI В., 2002; Зайратьянц О. В, Пробатова Н. А., 2002; Глухова Ю К., 2004; Григорьева С. Г., 2005).

Неопластические процессы, имеющие средние показатели плоидности в пределах 4,0-4,4 с, считали предраковыми, пограничными состояниями Появление отдельных фокусов атипических желез в гастробиоптате, содержащих клетки с триплоидными и тетраплоидными ядрами, при превышении среднего показателя плоидносга их ядер уровня 4 с и ИНДНК до 4,4 с относили также к ГИН-П, а не к обычной аденоме желудка с диспластическими изменениями.

ГИН-П по гастробиоптатам обычно диагностируются в качестве тяжелой дисплазии и рака «т situ» слизистой оболочки желудка. По мере дальнейшей малигнизации слизистой оболочки желудка происходит статистически значимое увеличение показателей плоидности ядер клеток в карциномах желудка с нарастанием явлений анеуплоидии, в зависимости от степени их дисдифференцировки. Таким образом, использование плоидометрических данных снимает вопрос о невозможности проведения точных разграничений между пограничным состояниями опухоли и злокачественным ее вариантом

Кроме прямых признаков малигнизации - уэеличения средних значений плоидности ядер, при диагностике учитывали и косвенные морфометрические признаки опухолевой прогрессии, в числе которых были коэффициент анеуплоидии - КА (отношение числа ядер с

пдоидностью более 4 с к ядрам менее 4 с), пролиферативную активность (ПА), определяемую по превышению показателя средней плоидносга ядер опухолевых клеток диплоидного уровня. Для общей оценки пролиферативного клона эпителиальных клеток вычисляли индекс накопления ДНК (ИНДНК) - средневзвешенное значение плоидности ядер определенной клеточной популяции, приходящееся на «условное ядро»

Установлено, что увеличение значений ИНДНК с 2.4 с в ядрах клеток неизмененного эпителия слизистой оболочки желудка до 4,0 с при_ГИН-П и до 5,4 с при высокодифференцированных, а также до 6,7 с в низкодифференцированных аденокарциномах демонстрирует

прогрессирующее накопление патологически измененного генетического материала в ядрах клеток в ходе развития нарастающих стадий канцерогенеза

3. Изменение площади ядер эпителиальных клеток слизистой Оболочки желудка на разных стадиях канцерогенеза

Дифференциальная диагностика стадий канцерогенеза в слизистой оболочке желудка возможна не только по плоидности, но и по показателям площади оптического сечения ядер клеток эпителия в гистологических препаратах

Установлено, что полеченные кариометрические данные ядер клеток при гиперпластических процессах, ГИН и раке желудка демонстрируют увеличение размеров ядер клеток по мере развития стадий канцерогенеза Так, например, ядра эпителиальных клеток желез нормальной слизистой оболочки имели площадь оптического сечения ядер 674 пикселей, при ГИН - около 800 (увеличение почти в полтора раза),'при аденокарциноме достигала 1000—1600 пикселей (увеличение почти в 2 раза) При сопоставлении параметров площади ядер эпителиальных клеток и ИНДНК выявлена прямая ранговая корреляция этих показателей (таблица 2)

Таблица 2

Увеличение значений показателей площади ядер и индекса накопления ДНК (ИНДНК) ядер эпителиальных клеток слизистой оболочки желудка в норме и на разных стадиях канцерогенеза

; Гистологический диагноз Средняя площадь ядра, пиксели ИНДНК, с

Норма 657 2,4±0,05

; Гиперпластические процессы 1 (аденомы), ГИН-1 789 3,8 ±0,05

1 Рак «in situ», ГИН-II 871 4,4±0,01

Аденокарциномы. г

высокодифференцированные 1005 6,2±0,12

умереннодифференцированные 1167 6,5±0,09

низкодифференцированные 1489 6,9±0,1

Полученные данные демонстрируют одновременно происходящие процессы увеличения показателей площади оптического сечения ядер клеток новообразований и значений ИНДНК Увеличение эт-цс показателей по стадиям процесса демонстрирует динамику накопления генетического материала в ядрах и отражает повышение пролиферативной потенции опухолевой ткани

4. Сравнительная гистологическая и плоидометрическая характеристика ядер клеток слизистой оболочки и новообразований желудка при исследовании срезов гастробиоптатов, окрашенных по методу Фейльгена и гематоксилином и эозином

С учетом требований практической работы в патологознатомических отделениях, особенно при консультативной Деятельности и необходимости контроля выставляемых диагнозов, возникла необходимость проведения сравнительного гистологического и плоидометрического исследования

ядер клеток слизистой оболочки желудка, окрашенных как по методу Фейльгена, так и гематоксилином и эозином

В результате- проведенного сравнительного анализа плоидности ядер клеток эпителия- слизистой оболочки желудка при окраске двумя методиками получены весьма близкие показатели плоидности ядер эпителиальных клеток, формирующих различные клоны "в ходе нарастания стадий, .канцерогенеза (таблица 3)

Таблица 3

Изменение плоидности ядер клеток новообразований по стадиям канцерогенеза в гистологических препаратах, окрашенных по методикам Фейльгена и гематоксилином и эозином

Диагностическая группа Число исследованных ядер Число полей зрения М, с ±т Доверительный интервал Р<

Окраска по методике Фейльгена

Норма 724 87 2,5 0,02 2,4-2,5 •

. ГИН-1 ,3340 94 3,2 0,02 2,8-3,4 0,001

ГИН-П 2643 79 4,1 0,05 3,8-4,4 0,001

Карцинома 6199 99 5,7 0,06 5,4-6,8 0,01

Окраска гематоксилином и эозином

Норма 652 55 2,5 0,03 2,4-2,6

ГИН-1 1243 48 3,2 0,04 3,0-3,4 0,001

'ГИН-П 1322 57 4,1 0,07 4,0-4,5 0,001

Карцинома 3049 83- - 5,9 0,09 5,5-6,1 0,01

Примечании©. М - средняя плоидность, ±т — ошибка выборки, р -вероятность случайного различия показателей с последующей группой

Показано, чрэ в неизмененном, эпителии желез желудка клетки имевдт в основное диплоидные и триплоидные ядра Это отражает нормальный процесс физиологической, регенерации, клеток эпителия

слизистой оболочки. Отмечено увеличение показателей плоидности ядер клеток при гиперплазии эпителия и формировании аденом по значениям плоидности ядер, не выходящих за пределы двойного киадратического отклонения, что свидетельствует об усиленном размножении клеток с нормальным геномом. При гиперплазиях на гистограммах преобладали диплоидные и триплоидные ядра, и появляются тетраплоидные ядра, что характеризовало ускоренный тип регенерационного процесса. Средние значения плоидности ядер клеток типичных аденом достигали 3,0 с. При ГИН-1 средние показатели плоидности ядер клеток не превышают значений 3,5 с. При ГНН-П эти показатели становятся близким*, к интервалу 4,0-4,4 с (пограничные состояния).

Средний уровень плоидности ядер эпителиального новообразования -4,5 с - является пределом, при котором происходит переход неинвазивной неоплазмы в аденокарциному желудка. Значения плоидности ядер эпителиальных клеток в аденокарциномах, по сравнению с нормой, увеличиваются более чем в два раза.

Увеличение показателей содержания ДНК в ядрах клеток эпителия слизистой оболочки желудка, установленное при изучении препаратов, окрашенных двумя методиками, отмечено при всех стадиях канцерогенеза. Показатели плоидности для ГИН-1 и ГИН-П в эпителии слизистой оболочки желудка оказались практически одинаковыми.

При сравнении показателей пролиферативной активности эпителия слизистой оболочки желудка разницы между ними в группах «норма» и «ГИН-1» не определяется. При «ГИН-П» имеется небольшая разница в показателях, которая не превышала 2%. Существенные различия отмечены только при изучении препаратов аденокарцином желудка, которые достигли уровня 20%. Этот факт указывает на предпочтительность использования препаратов, окрашенных по методике Фейльгена, и учет компьютерных измерений обычных препаратов только в качестве ориентировочных.

Плоидометрические данные подтверждаются и косвенными диагностическими признаками для доброкачественных, пограничных и злокачественных стадий канцерогенеза, в слизистой оболочке желудка соответственно показателями пролиферативной активности (1,0, 2,3 и

3.4-4,7) и индексами клональной пролиферации (1,25, 1,8, 2,25-2,8). Эти показатели важны для оценки скорости роста опухоли и имеют клинико-прогностическое значение для каждого больного

Таким образом, данные компьютерной кариометрии являются дополнительными диагностическими критериями, уточняющими гистологическую диагностику стадий канцерогенеза в слизистой оболочке желудка, которую можно использовать при изучении препаратов, окрашенных любыми красителями

Предлагаемый способ исследования гастробиоптатов позволяет предложить и использовать в практике гистоплоидометрическую классификацию эпителиальных новообразований слизистой оболочки желудка, учитывая следующие варианты гистологических диагнозов, установленных по плоидометрическим данным

1) нормальная слизистая оболочка желудка (плоидность ядер—до 2,4 с),

2) гиперплазия желез и аденомы желудка (2,5-3,4 с),

3) гастральная интраэпителиальная неоплазия - ГИН

- ГИН-1 — низкая степень гастральной интраэпителиальной неоплазии (3,5-3,9 с),

- ГИН-Н - высокая степень гастральной интраэпителиальной неоплазии (4-4,4 с);

4) четыре степени * развития аденокарциномы желудка с нарастающими признакам дисдифференцировки клеток (4,5-5,4 с, 5,5-6,4 с,

6.5-7,4 с, 7,5 с и выше)

, Полученные в работе результаты подтверждают общую закономерность экспоненциального накопления ДНК в ядрах клеток разных тканей по мере их озлокачествления и закон ступенчатой стадийности канцерогенеза Установлено, что увеличение показателя

средней плоидности на одну единицу ведет к появлению новых биологических свойств опухоли, а количество единиц, превышающих нормальный уровень, считается «кодом злокачественности» новообразования (Автандилов Г. Г, 2006).

Полученные дифференциально-диагностические критерии процесса малигнизации эпителия желудка дают возможность однообразно классифицировать стадии развития опухолеподобных образований и эпителиальных опухолей желудка и принимать обоснованные решения в отношении доброкачественных процессов, пограничных состояний и злокачественных новообразований.

Широкое применение гистоплоидометрии будет способствовать объективизации морфологической диагностики стадий развитая эпителиальных новообразований различной локализации в желудочно-кишечном тракте.

ВЫВОДЫ

1 Разработан и апробирован новый метод гастоплоидометрической диагностики стадий канцерогенеза в слизистой оболочки желудка по гастробиоптатам, направленный на совершенствование дифференциальной диагностики между доброкачественными, пограничными и злокачественными эпителиальными новообразованиями.

2. Исходя из значений среднего уровня содержания ДНК в ядрах клеток нормальных желез желудка в 2,4±0,05 с, установлено, что гиперпластические процессы (аденомы) желудка характеризуются средней плоидностью ядер эпителиальных клеток, не превышающих значений 3,0±0,04 с и ИНДНК - 3,6±0,05 с

3 Низкая степень гастральной интраэпителиальной неоплазии (ГИН-1) отличается от нормы увеличением средних показателей плоидности ядер ее клеток до 3,8 с ± 0,15 с и значений ИНДНК до 4,0 ±0,1 си имеет только тенденцию к статистическим различиям с железами нормальной слизистой

оболочки желудка Полученные плоидометрические характеристики позволяют относить ГИН-1 к доброкачественным процессам

4. Высокая степень гастральной интраэпителиальной неоплазии (ГИН-П) и появление желез атипического строения характеризуется средней плоидностью ядер клеток 4,3±0,12 с и показателем ИНДНК 4,6±0,1 с Плоидность ядер клеток этой стадии процесса позволяют уверенно диагностировать пограничные (неинвазивные) новообразования слизистой оболочки желудка

5. Уровни плоидности ядер опухолевых клеток выше 4,5±0,01 с характеризуют карциномы желудка Каждая степень снижения дифференцировки опухолевой ткани далее устанавливается по увеличению показателей плоидности на одну единицу плоидности Наблюдается также превышение значений ИНДНК уровня 6,2±0,12 с.

6 По сравнению с нормой, доброкачественные, пограничные и злокачественные эпителиальные новообразования характеризуют показатели пролиферативной активности опухолевых клеток, соответственно. 0,4; 2,3 и 3,4-4,7 и индексы клональной пролиферации — 1,25, 1,8; 2,25-2,8

7 Установлено, что дифференциальную диагностику стадий канцерогенеза в желудке можно проводить на срезах, окрашенных как по Фейльгену, так и гематоксилином и эозином, при которых при ГИН-1, ГИН-П получают весьма близкие значения показателей плоидности ядер При этом следует учитывать, что при диагностике аденокарцином слизистой оболочки желудка различия определяемых показателей достигает 20%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При морфологической диагностике доброкачественных процессов, пограничных состояний и аденокарцином слизистой оболочки желудка обычные гистологические заключения можно уточнять данными

морфометрического и плоидометрического анализа препаратов гастробиоптатов.

Результаты компьютерной микроскопии обладают высокой точностью и позволяют надежно дифференцировать доброкачественный, пограничный и злокачественный характер эпителиальных новообразований слизистой оболочки желудка, устанавливать степень выраженности гастральной интраэпителиальной неоплазии, а именно, две стадии, низкую (ГИН-1) и высокую (ГИН-П), включающую в себя атипические железы и карциному «in situ», а также аденокарциномы желудка с различной степенью снижения дифференцировки клеток.

Плоидометрические данные позволяют оценивать пролиферативную активность опухоли, не прибегая к дорогостоящим иммуногистохимическим реакциям Предлагаемый способ гистоплоидометрической диагностики предрака и рака желудка следует широко применять в повседневной патологоанатомической диагностике, повышая качество гистологических заключений по гастробиоптатам.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах по списку ВАК

1 Купрюшина, Н. В. Применение метода плоидометрии при исследовании гастробиоптатов / Н. В Купрюшина // Технологии живых систем. - 2006. - 3 т - № 3. - С. 50-53.

2. Автандилов, Г Г. Морфометрическое и плоидометрическое исследование пролиферативной активности клеток аденом желудка по гастробиоптатам / Г. Г. Автандилов, Н. В. Купрюшина // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. - 2007 — № 3. - С 24—28.

3 Купрюшина, Н. В. Плоидометрическая диагностика стадий канцерогенеза в эпителии желудка по гастробиоптатам / Н В Купрюшина И Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. - 2007 - № 1 — С. 30-38 - (Медицинские науки)

Статьи в других изданиях

4 Автандилов, Г Г Гистоплоидометрическая диагностика новообразований" желудка но гастробиоптатам / Г Г:- Автандилов, Н' В Купрюшина//Российские медицинские вести —2007 — № 1 —С 50-54 ' ' 5 Купрюшина, Н*. В Плоидометрическая диагностика заболеваний желудка / Н В. Купрюшина // XV Научные чтения памяти академика Н Н Бурденко «Актуальные вопросы" современной клинической медицины» материалы областной научно-практической конференции — Пенза Информационно-издательский центр ПГУ, 2006. - 168 с

6 Купрюшина, Н В. Плоидометрическая диагностика предраковых заболеваний желудка по гастробиоптатам / П В Купрюшина // Современные проблемы клинической и экспериментальной морфологии : материалы межрегиональной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения проф. И С Новицкого -Тверь -2006 -37 с

7. Автандилов, Г Г Компьютерная микроскопия предраковых заболеваний желудка на основе данных плоидометрии / Г Г Автандичов, Н В Купрюшина V Научная сессия МИФИ-2007 сборник научных трудов -М, 2007 - 1 т - С 250-252

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

КА - коэффициент анеуплоидии

ИНДНК - индекс накопления ДНК (при плоидометрии)

СОЖ - слизистая оболочка желудка

ПИН - гастральная интраэпителиальная неоплазия

РЖ - рак желудка

ПА - показатель пролиферативной активности

Купрюшина Наталья Викторовна

Гистоплоидометрическое исследование гастробиоптатов в совершенствовании диагностики новообразований желудка

14 00 15 - патологическая анатомия

Подписано в печать 06 08.07. Формат 60x84'/16. Усл. печ. л. 1,40 Заказ №003874 Тираж 140.

Информационно-издательский центр 111У Пенза, Красная, 40, т.- 56-47-33

Актуальность темы

Одной из актуальных проблем современной онкогастроэнтерологии являются своевременная диагностика и лечение опухолей и опухолевидных образований слизистой оболочки желудка. Среди них преобладают гиперпластические процессы и рак желудка, который у лиц старше 60-ти лет сам по себе либо через свои осложнения может являться одной из основных причин смерти. За последние 10 лет в России заболеваемость и смертность от злокачественных новообразований этой локализации увеличилась более чем в два раза и занимает третье место в структуре смертности от опухолей других локализаций [104]. Рак желудка занимает третье место после злокачественных новообразований легких, молочной железы, что делает его социально значимым [51].

Смертность на первом году жизни после установления диагноза рака желудка составляет 35%, что свидетельствует о низкой выявляемое™ заболевания на ранних стадиях болезни [51].

В патологической анатомии одной из актуальных проблем является объективная оценка результатов морфологических исследований. Пути решения этой проблемы предполагают, с одной стороны, разработку и внедрение объективных методов исследования и учета, получаемых с помощью морфометриче-ских и иммуногистохимических методов данных, а с другой - изучение гисто-структур при одновременном учете возможных артефициальных изменений, возникающих в них на различных этапах морфологического исследования [37].

В онкологической практике имеют место не только различные трактовки одних и тех же гистологических и цитологических препаратов отдельными высококвалифицированными специалистами, но и расхождения в оценки стадий развития опухолевого процесса [63]. Эти трудности связаны с методами забора материала для исследования, его представительностью, способами фиксации, а также с различной плоскостью гистологических срезов [89], значительной долей субъективизма исследователя при оценки выраженности гистологических и цитологических изменений. Опыт патологоанатомов и клинических цитологов свидетельствует о затруднениях, возникающих при. трактовке разных стадий предопухолевых состояний и перехода этого процесса

Для получения достоверных результатов при функционально-морфологическом исследовании состояния слизистой оболочки желудка немаловажным является правильная ориентировка кусочка исследуемого органа, толщина и ориентировка срезов, размеры гастробиоптатов. Погрешности, допущенные во время взятия и обработки гастробиоптатов, могут не только затруднить постановку гистологического диагноза, но и привести к неправильному заключению [68, 69].

Проблема новообразований желудка содержит целый ряд нерешенных вопросов, связанных с ранней диагностикой рака и предраковых состояний желудка, имеющих как теоретическое, так и практическое значение [52]. Многие аспекты морфогенеза гиперпластических и неопластических процессов слизистой оболочки желудка остаются мало изученными или спорными, отсутствует также единая и общепринятая классификация неопластических процессов.

Гистологическая диагностика предраковых изменений и РЖ нередко представляет значительные трудности, особенно в биопсийном материале. Для морфологической диагностики рака желудка и предраковых процессов большое практическое значение приобретают поиски новых четких дифференциально-диагностических критериев.

Стремление к надежности, точности и достоверности оценки патологического процесса, важность прогнозирования и выбора лечения диктуют необходимость поиска новых методов морфологической диагностики [4, 61].

Для достижения объективности в диагностике патологических изменений требуется не только подробное описание морфологических изменений в гистологических структурах органов, но и применение комплекса дополнительных методов морфологического исследования, уточняющих возможный темп пролиферативной активности клеток новообразования и изменения их биологических свойств [4, 5, 7].

В настоящее время применяются методы изучения пролиферативной активности клеток, однако эти исследования требуют дорогостоящих расходных материалов (иммуногисто - и иммуноцитохимическое исследование, электронная микроскопия) [78,80]. Однако изучение содержания генетического материала в ядрах эпителиальных клеток для этой цели используется недостаточно широко, хотя гистофизические методы исследования ДНК проводятся на окрашенных по методу Фейльгена препаратах [1, 2, 3, 4, 5] и являются не менее диагностически значимыми, чем иммуногистохимическое исследование.

Известны различные методы морфологической диагностики опухолей желудка, включающие в себя способы гистологической и цитологической диагностики, определение степени дисдифференцировки клеток (например, электронная микроскопия). Однако указанный способ трудоемок, дорогостоящий и не всегда позволяет получить объективный результат.

К сожалению, мимо внимания гастроэнтерологов прошли многочисленные исследования, посвященные изучению диагностического значения изменения плоидности ядер эпителиальных клеток на разных стадиях развития новообразований в различных органах (молочная, предстательная, щитовидная железы, шейка матки, почка, кожа и др.) [5, 6, 7, 14, 16, 40, 42]. В этих работах была теоретически обоснована и практически подтверждена возможность объективной оценки стадий канцерогенеза с учетом ведущего признака в совокупности клеток - определяемого по средним значениям плоидности (с) ядер клеток опухоли [7, 11, 14].

На основании изучения современной литературы по этой проблеме, A.B. Кононов пришел к неутешительному выводу, что «трудно предполагать, в ближайшее время, появления какой-либо классификации предопухолевых процессов в пищеварительном тракте, основанной на исключительно объективных критериях» [64].

Известно, что развитие неоплазий любых органов, в том числе желудка начинаются с нарушения генетической регуляции и усиленной пролиферации клонов клеток, которые приобретают с каждым последующим делением новые биологические свойства. Одним из следствий нарушения прохождения фаз кле- ~~~ точного цикла в опухолевых клетках является изменение содержания ДНК (ане-уплоидия, полиплоидия), что ведет к нарастанию генетической гетерогенности клеточной популяции [4].

Превышение средних показателей плоидности клеток выше значений 2с (диплоидный набор ДНК) отражает физиологическую или патологическую пролиферативную активность клонов клеток. Современные варианты плоидо-метрического исследования, например, компьютерная плоидометрия, дают возможность более объективно оценивать участки препарата, содержащие клетки с разной пролиферативной активностью в процессах малигнизации и опухолевого роста [9, 114, 116].

Однако, несмотря на обилие иммунногистохимических исследований СОЖ с выявлением разнообразных биомаркеров при диагностике опухолевых и предопухолевых процессов, в том числе при раках разной степени дифферен-цировки, полученные результаты часто оказываются противоречивыми и даже противоположными. Результаты микроспектрофотометрического исследования содержания ДНК при предраковых состояниях и раке разной степени диффе-ренцировки также варьируют.

Процесс канцерогенеза в слизистой желудка изучен недосточно, а опубликованные данные противоречивы. Применение морфометрического и плоидо-метрического методов исследования при изучении канцерогенеза в эпителии желудка может открыть новые возможности для дифференциальной диагностики стадий развития неопластического процесса в желудке.

Между тем, сравнительное исследование гистологической картины в комплексе с изучением содержания ДНК в ядрах клеток в ткани СОЖ при ее гиперпластических и неопластических изменениях, позволило бы выявить наиболее характерные особенности таких изменений. До настоящего времени не проводилось сопоставлений результатов гистологического и плоидометрического исследований гиперпластических и неопластических изменений СОЖ для выработки оптимального алгоритма их морфологической дифференциальной диагностики.

Цель исследования - разработка нового метода гистоплоидометриче-ского исследования гастробиоптатов для совершенствования диагностики эпителиальных новообразований желудка.

Для решения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Провести плоидометрическое и морфометрическое исследование ядер клеток эпителия слизистой оболочки желудка, учитывая стадии канцерогенеза для получения объективных и воспроизводимых диагностических критериев

2. Определить дифференциально-диагностические плоидометрические и морфометрические критерии, характеризующие нормальную эпителиальную ткань, разные степени интраэпителиальной неоплазии и карциномы желудка, имеющие разную степень дисдифференцировки клеток.

3. Использовать для диагностики показатели площади и плоидности ядер клеток эпителия слизистой оболочки желудка при диагностики разных стадиях канцерогенеза, полученные на препаратах, окрашенных как по методике Фейль-гена, так и при рутинной окраске срезов ткани.

4. Уточнить классификацию стадий канцерогенеза в эпителиальной ткани слизистой оболочки желудка, на основе плоидометрических и морфометриче-ских критериев для применения её в патогистологической практике при уточнении диагнозов интраэпителиальной неоплазии и эпителиального рака желудка при решении вопросов прогноза для конкретного больного.

Научная новизна

- разработан новый метод исследования гастробиоптатов, позволяющий уточнять и контролировать результаты гистологической диагностики стадий развития эпителиальных новообразований в слизистой оболочке желудка, основанный на использовании данных компьютерной плоидометрии и морфо-метрии ядер их клеток;

- установлен комплекс объективных критериев для проведения дифференциальной диагностики гиперпластических процессов, разных степеней ин-траэпителиальной неоплазий и карцином желудка по плоидометрическим критериям;

- проведено сравнение данных о площади и плоидности ядер клеток эпителия слизистой оболочки желудка, получаемых при изучении препаратов, окрашенных как по методике Фейльгена, так и гематоксилином и эозином;

- уточнена классификация неопластических процессов в эпителии слизистой оболочки желудка на разных стадиях канцерогенеза, базирующаяся на плоидометрических и морфометрических параметрах.

Практическая значимость работы

Полученные в работе данные имеют значение не только для теоретической медицины, но и для практического здравоохранения, поскольку они позволяют использовать визуализацию плоидности и морфометрические характеристики ядер клеток эпителия слизистой оболочки желудка в качестве дополнительной информации к результатам обычного гистологического исследования - основного метода морфологической диагностики новообразований слизистой оболочки желудка. Новые диагностические данные являются объективными и хорошо воспроизводимыми дифференциально-диагностическими критериями при определении степеней гастральной интраэпителиальной неоплазии и развития аденокарцином желудка. Применение гистоплоидометрической диагностики позволяет существенно снизить количество ошибочных патоморфо-логических заключений о характере неопластического процесса в желудке.

Получение результатов компьютерной плоидометрии не требует использования дорогостоящих расходных, материалов. Гистоплоидометрия препарата дает комплекс воспроизводимых объективных количественными критериев достаточных для проведения дифференциальной диагностики предраковых состояний и рака желудка по гастробиоптатам, несмотря на небольшой объем исследуемого биоптата.

Результаты плоидометрического исследования, обладая высокой точностью и надежностью, позволяют при любых подозрениях патологоанатома на развитие опухолевой трансформации провести уточнение ее характера и установить степень выраженности гастральной интраэпителиальной неоплазии (ГИН) и начала злокачественного роста.

Предлагаемый способ гистоплоидометрической диагностики предраковых состояний и рака желудка может применяться в патологоанатомических отделениях лечебно-диагностических учреждений.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Применение гистоплоидометрического метода исследования, гастроби-оптатов повышает качество диагностики стадий развития стадий канцерогенеза в слизистой оболочке желудка.

2. Гиперпластические, предраковые и раковые процессы в желудке характеризуются определенными средними показателями плоидности ядер клеток железистого эпителия и составами опухолевых клеток.

3. Для решения спорных диагностических задач возможен учет изменения значений площади и плоидности, ядер эпителиальных клеток слизистой оболочки желудка, на препаратах гастробиоптатов, окрашенных как по методу Фейльгена, так и гематоксилином и эозином.

Апробация материалов диссертации

Основные положения работы доложены и обсуждены на: 6-ой Международной конференции «Радиоэлектроника в медицине» (Москва, 2005); межрегиональной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора И.С.Новицкого (Тверь, 2006); на XXIX научной конференции «Морфометрия в диагностике болезней» (Москва, 2006); научной сессии МИ-ФИ-2007 (Москва, 2007).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, 3 из них в журналах по списку ВАК.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования применяются при проведении дифференциальной диагностики гиперпластических процессов, различно выраженных степеней интраэпителиальной неоплазии и инвазивных опухолей желудка, с разной степенью дифференцировки на кафедре патологической анатомии РМАПО, в патологоанатомическом отделении Пензенской Областной клинической больницы им. Н.Н.Бурденко, используются в лекционных курсах на кафедрах патологической анатомии Российской медицинской академии последипломного образования.

Объем и структура и диссертации

Текст диссертации изложен на 144 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы; главы, посвященной материалам и методам исследования; главы, в которой представлены собственные результаты; главы с обсу

ВЫВОДЫ

1. Разработан и апробирован новый метод гистоплоидометрической диагностики стадий канцерогенеза в слизистой оболочки желудка по гастроби-оптатам, направленный на совершенствование дифференциальной диагностики между доброкачественными, пограничными и злокачественными эпителиальными новообразованиями.

2. Исходя из значений среднего уровня содержания ДНК в ядрах клеток нормальных желез желудка в 2,4 ± 0,05 с, установлено, что гиперпластические процессы (аденомы) желудка характеризуются средней плоидностью ядер эпителиальных клеток, не превышающих значений 3,0±0,04 с и ИНДНК -3,6±0,05с.

3. Низкая степень гастральной интраэпителиальной неоплазии

ГИН - I) характеризуется увеличением средних показателей плоидности ядер её клеток до 3,8 с+0,15 с и значений ИНДНК до 4,0 ±0,1 с и имеет только тенденцию к статистическим различиям с железами нормальной слизистой оболочки желудка. Полученные плоидометрические характеристики позволяют относить ГИН-1 к доброкачественным процессам.

4. Высокая степень гастральной интраэпителиальной неоплазии

ГИН -II) и появление желез атипического строения, характеризуется средней плоидностью ядер клеток 4,3±0,12с и показателем ИНДНК - 4,6±0,1 с. Пло-идность ядер клеток этой стадии процесса позволяет уверенно диагностировать пограничные (неинвазивные) эпителиальные новообразования слизистой оболочки желудка.

5. Уровни плоидности ядер опухолевых клеток выше 4,5±0,01с характеризуют карциномы желудка. Каждая степень снижения дифференцировки опухолевой ткани устанавливается по увеличению показателей плоидности на 1 единицу. Наблюдается также превышение значений ИНДНК уровня 6,2± 0,12с.

6. По сравнению с нормой, доброкачественные, пограничные и злокачественные эпителиальные новообразования характеризуются показателями пролиферативной активности опухолевых клеток соответственно: 0,4; 2,3 и 3,4-4,7 и индексами клональной пролиферации: 1,25; 1,8; 2,25-2,8.

7. Установлено, что дифференциальную диагностику стадий канцерогенеза в желудке можно проводить на срезах, окрашенных как по методу Фейльгена, так и гематоксилином и эозином, при которых при ГИН-1, ГИН-П получают весьма близкие значения показателей плоидности ядер. Следует учитывать, что при диагностике аденокарцином слизистой оболочки желудка различия определяемых показателей достигают 20%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для проведения гистоплоидометрической диагностики по препаратам, ок-. рашенным гематоксилином и эозином, для уточнения заключения, патологоанатомы проводят дополнительное компьютерное плоидометрическое иссле- " дование гастробиоптата. При этом учитываются изменения показателей пло-идности ядер клеток и индекса накопления ДНК ростковых зон опухоли по мере прогрессирования стадий канцерогенеза, а также увеличение значений косвенных показателей: пролиферативной активности, гетероплоидии и коэффициента анеуплоидии ядер в исследуемом биоптате.

Установлено, что доброкачественные гиперпластические процессы (аденомы) слизистой оболочки желудка характеризуются средней плоидностью ядер эпителиальных клеток, не превышающих значений 3,0 ±0,04 с и ИНДНК - 3,6± 0,05 с.

На основании данных, полученных при компьютерной плоидометрии, низкая степень гастральной интраэпителиальной неоплазии (ГИН -I) характеризуется увеличением средних показателей плоидности ядер ее клеток до 3,8 с±0,15 с и значений ИНДНК до 4,0±0,1с.

При выявлении признаков умеренной и тяжелой дисплазий эпителиальных клеток, а также рака in situ слизистой оболочки желудка используют термин высокой степени интраэпителиальной неоплазии (ГИН- II). В этих случаях наблюдаются более высокие средние показатели содержания ДНК в ядрах клеток, почти на единицу плоидности преинвазивных новообразований. Эти неопластические процессы, имеющие средние показатели плоидности в пределах 4,Ос-4,4 с, можно считать уже факультативно предраковыми 4 пограничными состояниями. Появление отдельных фокусов атипичных желез, содержащих клетки с триплоидными и тетраплоидными ядрами, при превышении среднего показателя плоидности их ядер уровня 4 с и значений ИНДНК - 4,4 с, позволяет относить этот неопластический процесс также к

ГИН - II , а не к обычной аденоме желудка с диспластическими изменениями.

Высокая степень гастральной интраэпителиальной неоплазии (ГИН — II) и появление атипических желез в гастробиоптате, характеризуется средней пло-идностью ядер клеток 4,3±0,12 с и показателем ИНДНК - 4,6±0,1 с. Плоидность ядер клеток этой стадии процесса позволяет уверенно диагностировать обли-гатно предраковые состояния слизистой оболочки желудка.

При раке желудка отмечается резкое увеличение показателей плоидности ядер опухолевых клеток, достигающих уровней от 4,5± 0,01 с до 6,7± 0,08 с и более в зависимости от степени снижения дифференцировки эпителиальных клеток новообразований.

Полученные в работе результаты подтверждают общую закономерности экспоненциального накопления ДНК в ядрах клеток тканей по мере их озлока-чествления и ступенчатую стадийность канцерогенеза и являются математическими маркерами выраженности стадий опухолевого процесса в каждом конкретном случае. Проведенное нами гистоплоидометрическое исследование эпителиальных клеток слизистой оболочки желудка и её опухолей по гастро-биоптатам, подтвердила фундаментальную закономерность ступенчатой стадийности развития новообразований (закономерность Автандилова) [13].

Использование в работе патологоанатомов плоидометрического исследования повысит качество гистологической диагностики стадий эпителиальных опухолевых процессов, так как, более чем в 25% случаев, изученных нами гаст-робиоптатов, в практической работе возникали трудности при разграничениях степеней дисплазии, рака «in situ» и аденокарцином с различной степенью снижения дифференцировки.

Использование плоидометрических данных снимает вопрос о невозможности проведения точных гистологических разграничений между пограничными состояниями и злокачественными вариантами эпителиальной опухоли при гистологических исследованиях гастробиоптатов, ошибки, диагностики которой в обычной патологоанатомической практике достигают высоких уровней.

Данные, полученные в ходе проведенного комплексного гистологического и плоидометрического исследования доброкачественных гиперпластических процессов, предраковых состояний и эпителиального рака желудка позволяют предложить для практического применения объективный критерий морфологической диагностики этих изменений, учет порогового значения плоидности для рака превышающие уровня 4,5 с, ниже этого уровня — пограничные и доброка-. чественные новообразования.

При плоидометрическом исследовании ядер эпителиальных клеток слизистой оболочки желудка появляется возможность получать данные о ранних признаках пролиферативных свойств клона клеток, формирующих новообразование, происходит отбор клонов опухолевых клеток на основе их генетического разнообразия. При проведении консультаций по препаратам, окрашенным гематоксилином и эозином, возможно использование данных плоидометрии содержания хроматина в ядрах клеток, которое почти не отличается по показателям от содержания ДНК в доброкачественных и пограничных опухолях желуд- -ка.

Для практической деятельности клинического патологоанатома предлагается следующая форма гистоплоидометрического заключения.

Гистоплоидометрическое заключение

В пределах исследованных срезов новообразований слизистой оболочки желудка обнаружены признаки изменения состава клеток и уровня среднего значения плоидности их ядер (), характерные для (процесса гиперплазии эпителия, ГИН-1, ГИН-П, аденокарциномы I -IV степени).

Данная информация хорошо понятна клиницисту, который использует её при назначении адекватного лечения.

Гистоплоидометрический метод диагностики даст возможность повысить достоверность заключения о стадиях неопластического процесса в слизистой оболочке желудка, проводить обоснованные лечебные мероприятия в отношении доброкачественных процессов, пограничных состояний и злокачественных эпителиальных новообразований.

Для унификации диагнозов в клинике и в гистологической практике предлагаются следующие диагностические обозначения, которые должны отражаться в заключение патологоанатома:

1. нормальная слизистая оболочка желудка;

2. гиперплазия желез и аденомы желудка;

3. «гастральная интраэпителиальная неоплазия» - ГИН:

• ГИН I - низкая степень;

• ГИН II - высокая степень интраэпителиальной неоплазии;

4. карциномы желудка, с разной степенью дисдифференцировки (I - IV), высоко-умеренно-низко и недифференцированные.

Указанные ступени развития неопластического процесса в слизистой оболочке желудка связаны с нарастающей патологией генома клеток. Каждая стадия трансформации опухоли желудка имеет четкие различия по составу клеток и средней плоидности их ядер, которые количественно оцениваются во время гис-топлоидометрического исследования, что имеет важное значение для конкретного больного.

Гистоплоидометрические данные позволяют оценивать пролиферативную активность опухоли, не прибегая к дорогостоящим иммуногистохимическим реакциям и должны быть, использованы для уточнения морфологической дифференциальной диагностики в спорных, неясных случаях с учетом других клини- . ко-морфологических проявлений заболевания.