Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Диагностика и прогноз рака предстательной железы с использованием факторов роста и молекулярно-генетических маркеров

На правах рукописи

ШЕГАЙ ПЕТР ВИКТОРОВИЧ

ДИАГНОСТИКА И ПРОГНОЗ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФАКТОРОВ РОСТА И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЙЯЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ

14.00.14 - онкология 14.00.40 - урология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва -2008

003164935

Работа выполнена на кафедре онкологии ФППОВ ГОУ ВПО Московской медицинской академии имени И М Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию на базе ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологического институт им. П А Герцена» Росмедтехнологии

(Директор - академик РАМН, профессор В И Чиссов)

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Русаков Игорь Георгиевич доктор медицинских наук, профессор Иванов Алексей Алексеевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Винаров Андрей Зиновьевич,

ГОУ ВПО «ММА им И М. Сеченова» Росздрава

доктор биологических наук, профессор

Якубовская Раиса Ивановна

ФГУ «МНИОИ им. П А. Герцена» Росмедтехнологии

Ведущее учреждение - ФГУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Росмедтехнологии

Защита состоится 18 марта 2008 года в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д 208 047 01 при ФГУ «МНИОИ им П А Герцена» Росмедтехнологии

по адресу 125284, Москва, 2-ой Боткинский проезд, 3.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ФГУ «МНИОИ им. П А Герцена» Росмедтехнологии

Автореферат разослан « 76»

.2008 года

Ученый секретарь Диссертационного совета ФГУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Росмедтехнологии

доктор медицинских наук, профессор

Седых Сергей Анатолье

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Проблема диагностики и лечения рака предстательной железы (РПЖ) является наиболее актуальной в современной онкоурологической практике Это связано, прежде всего, с продолжающимся увеличением заболеваемости данной патологией

В США РПЖ занимает первое место в структуре онкологической заболеваемости и второе место по частоте летальных исходов, находясь на четвертом месте среди всех причин смертности (Матвеев Б П и др , 2003) В странах Европы опухоли предстательной железы также являются наиболее распространенными новообразованиями, наравне с раком легкого, ежегодно выявляют более 85000 новых случаев заболевания, что служит причиной 9% смертей мужского населения от онкологических заболеваний По темпам прироста РПЖ занимает ведущее место в большинстве стран

В России в 2006 г зарегистрировано 18092 новых случаев РПЖ, заболеваемость составила 21,4 на 100 тыс мужского населения Опухоли предстательной железы составляют 8,2% от всех злокачественных новообразований у мужчин, занимая 4 место По величине прироста показателя заболеваемости в России РПЖ занимает 1-ое место за период 1996-2006г (128,26%) Смертность от РПЖ составляет 10,08 на 100 тыс мужского населения Столь широкое распространение рака предстательной железы ставит его в ряд наиболее важных социальных проблем современности (Чиссов В И и др 2008)

«Золотым» стандартом диагностики РПЖ является пальцевое ректальное исследование (ПРИ), трансректальное ультразвуковое исследование предстательной железы (ТРУЗИ) и определение уровня простат-специфического антигена (ПСА) Определение ПСА имеет наибольшие чувствительность и специфичность из трех основных исследований ПСА является одним из самых исследованных и широко применяемых биомаркеров ранней диагностики РПЖ

Однако ПСА имеет ряд серьезных недостатков В частности, причиной повышения уровня ПСА является не только РПЖ, но и ДГПЖ, хронический и острый простатит, массаж железы, эякуляция, биопсия, что говорит о невысокой специфичности метода Кроме того, в 20—40% случаев РПЖ уровень ПСА не превышает принятой в настоящее время нормы 4 нг/мл Для решения данной проблемы многими специалистами было предложено снизить пороговое значение ПСА с 4 до 2,5 нг/мл, что, в свою очередь, привело к выявлению относительно благоприятных опухолей — небольших, высоко-дифференцированных, представляющих невысокий риск для жизни и здоровья пациента Клинически эти опухоли трудно дифференцировать, имеющимися в «арсенале» уролога средствами И, поэтому, в большинстве случаев, применяется агрессивное лечение даже относительно благоприятного РПЖ

Применение ПСА в сочетании с трансректальной мультифокальной биопсией предстательной железы под ультразвуковым контролем позволяет выявлять больший процент заболеваний на ранних стадиях, а также дает возможность на дооперационном этапе определить агрессивность и распространенность РПЖ Однако нельзя забывать, что при биопсии часто происходит недооценка имеющейся злокачественности и степени распространенности опухолевого процесса в предстательной железе

Для определения тактики ведения больного с локализованным РПЖ важное значение имеет не только своевременная постановка диагноза, но и возможность прогнозировать дальнейшее течение, выявление потенциально агрессивных форм РПЖ Очевидна необходимость поиска и внедрения в клиническую практику новых, более чувствительных, специфичных и прогностически эффективных маркеров РПЖ Мы считаем, что современный подход к диагностике, выбору тактики лечения и прогнозирования его результатов должен базироваться на глубоких знаниях молекулярных и генетических основ этиологии и патогенеза злокачественного процесса

Исходя из вышесказанного, очевидна актуальность проблемы выявления и оценки новых молекулярно-биологических факторов, которые могли бы стать, с одной стороны, маркерами дифференциальной диагностики и прогноза РПЖ,

а, с другой, явиться мишенью для таргетной терапии Это и побудило нас провести собственное исследование по данной проблеме

Цель исследования

Оптимизация ранней диагностики РПЖ и определения прогноза течения заболевания на основании изучения клинического значения ростовых факторов и метилирования генов опухолевой супрессии

Задачи исследования

1 Изучить количественное содержание растворимых факторов HGF, EGF и VEGF в супернатантах первичных культур аденокарциномы предстательной железы и доброкачественной гиперплазии предстательной железы и провести сравнительный анализ их концентраций

2 Провести корреляционный анализ концентраций HGF, EGF и VEGF и основных клинико-морфологических характеристик опухолевого процесса и определить прогностическую значимость данных факторов роста

3 Изучить профиль метилирования генов Р16, HIC1, N33 и GSTP1 в биопсийном материале от больных раком предстательной железы, простатической интраэпителиальной неоплазией и доброкачественной гиперплазией предстательной железы и провести их сравнительный анализ

4 Оценить прогностическую значимость метилирования генов Р16, HIC1, N33 и GSTP1 для ранней диагностики рака предстательной железы и разработать показания для проведения повторных биопсий

Научная новизна исследования

В исследовании впервые проведено изучение содержания ростовых

факторов HGF, EGF и VEGF в супернатантах первичных культур, полученных

от больных РПЖ и ДГПЖ, что позволило провести наиболее точный анализ роли данных факторов в развитии опухолевого процесса

На большом клиническом материале впервые проведен дифференцированный анализ прогностической роли различных факторов роста и продемонстрировано их значение для прогноза распространенности опухолевого процесса

В работе исследована рочь гормональной регуляции в продукции факторов роста 1ЮР, ЕСИ и УБОР и впервые показана стимуляция синтеза НОР на фоне проведения неоадъювантной гормональной терапии (НеоГТ), что, возможно, является одним из механизмов гормональной резистентности опухоли

Выявлена достоверная корреляция продукции НОР с метастатическим потенциалом опухоли

Впервые проведен анализ частоты метилирования генов Р1б, Н1С1, N33 и С?5ТР7 в биопсийном материале при РПЖ, ПИН и ДГПЖ При этом показана чувствительность и специфичность метилирования данных генов для каждого патологического процесса

Проведенное исследование показало возможность использования анализа метилирования генов Р16, Н1С1, N33 и СЕТРI для ранней диагностики РПЖ и определения показаний для повторной биопсии ПЖ

Практическая значимость результатов исследования

На основании изучения содержания НОР, ЕОР и УГЮР в первичных культурах аденокарциномы и доброкачественной гиперплазии ПЖ, показана возможность использования данных факторов роста для диагностики РПЖ и оценки распространенности опухолевого процесса

Показано, что экспрессия НОР связана с высоким метастатическим потенциалом РПЖ, а концентрация УЕОР достоверно коррелирует с распространенностью первичной опухоли ПЖ В то же время продемонстрирована низкая специфичность ЕОР для оценки распространенности опухолевого процесса

Проведенный в исследовании анализ профиля метилирования генов опухолевой супрессии в биопсийном материале показал значение определения метилирования для дифференциальной диагностики РПЖ, ПИН, ДГПЖ

Выявлено, что частота метилирования гена GSTP1 при РПЖ достоверно выше, чем при ПИН и ДГПЖ, а метилирование гена N33 определяется в биопсийном материале только из участков аденокарциномы В исследовании показано, что изучение профиля метилирования GSTP1 и N33 может быть использовано для определения показаний к повторной биопсии предстательной железы у больных с ДГПЖ и ПИН с целью ранней диагностики РПЖ

Апробация работы

Основные положения и материалы диссертации доложены на Всероссийской конференции «Онкологическая урология от научных исследований к клинической практике» (Москва, декабрь 2004), 21 European Association of Urology Congress (Paris, апрель 2006), 17 European Society for Urological Researcher Congress (Malmo, сентябрь 2006), 1-м Конгрессе Российского Общества Онкоурологов (Москва, октябрь 2006), Всероссийской Школе Молодых Онкоурологов (Москва, октябрь 2006), VI-й Всероссийской Конференции Молодых Онкологов (Москва, сентябрь 2007)

Апробация проведена на совместной научной конференции кафедры онкологии ФППОВ ММА им И M Сеченова, клинических и диагностических отделений МНИОИ им П А Герцена 20 декабря 2007 года

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 4 - в центральных периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 156 страницах машинописного текста, иллюстрированы 17 таблицами и 65 рисунками Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов

собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 184 источника из них - 18 отечественных и 166 зарубежных

Содержание работы

Материалы и методы исследования

В нашем проспективном исследовании были выделены 2 основные группы 111 больных, имевших морфологически подтвержденный рак предстательной железы (РПЖ) или рак мочевого пузыря (РМП), операционный материал от которых использовали для создания первичной культуры аденокарциномы ПЖ, и 106 больных с подозрением на РПЖ, которым выполняли мультифокальную биопсию Полученный от них материал подвергали анализу метилирования генов Р16, HIC1, N33 и GSTP1 (Рисунок 1)

Рисунок 1: Принципы формирования групп

Больным с РПЖ проводилось оперативное лечение в объеме радикальной

позадилонной, промежностной или лапароскопической простатоктомии (РПЭ)

б

Больные с РМП подвергались стандартной радикальной цистпростатвезикулэктомии (ЦПВЭ)

Характеристика больных подвергшихся РПЭ и ЦПВЭ. Для выполнения поставленных задач пациенты были разделены на подгруппы В группе прооперированных больных у 91 диагностирован РПЖ, в 20 случаях, отнесенных в подгруппу контроля, был диагностирован РМП + доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ)

Средний возраст больных РПЖ на момент операции составил 64 (46-75 лет) При анализе распределения больных в зависимости от уровня общего ПСА в доминантной группе больных (55%) уровень сывороточного ПСА был менее 20 нг/мл, среднее значение составило 14,5 нг/мл Медиана уровня ПСА у больных РПЖ составила 10,59 нг/мл (интерквартильный размах от 7,11 до 21,3 нг/мл), а медиана плотности ПСА в подгруппе больных РПЖ составила 0,25 нг/мл/см3 (интерквартильный размах от 0,13 до 0,61 нг/мл/см3)

Распределение прооперированных больных РПЖ по патоморфологической стадии представлено в таблице 1 При стадировании РПЖ мы руководствовались системой стадирования ТЫМ 2002 (6 редакция)

Таблица 1 Распределение больных по патоморфологической стадии РПЖ

Стадия ТМИ Число больных п (%)

II рТ2а-2в1М0М0 11 (12%)

рТ2сК0М0 32 (35%)

III рТЗаШМО 24 (27%)

рТЗвШМО 7 (8%)

IV рТ2сЫ1М0 1 (1%)

рТЗаШМО 3 (3%)

рТЗвШМО 13 (14%)

Всего 91 (100%)

Распределение больных с аденокарциномой предстательной железы в зависимости от степени дифференцировки опухоли по шкале Глисона на основании патоморфологического исследования послеоперационного материала представлено в таблице 2

Таблица 2 Распределение больных по степени опухолевой дифференцировки (РПЭ и ЦПВЭ)

Сумма балов по шкале Глисона Число больных п (%)

2-4 11 (12%)

5-6 47 (52%)

7 11 (12%)

8-10 3 (3%)

Гормональный патоморфоз 19(21%)

Всего 91 (100%)

При сравнении до- и послеоперационной суммы баллов по Глисону подгруппы больных были статистически сопоставимы по степени дифференцировки (р>0,05) 28 (31%) прооперированных больных РПЖ получали ноеадъювантную гормональную терапию в режиме МАБ, из них только у 19 (68%) больных выявлен гормональный патоморфоз разной степени выраженности В 58% случаев гормональный патоморфоз был слабой степени, в 41,5% случаев отмечался умеренно-выраженный патоморфоз, а выраженный патоморфоз был отмечен только в 0,5% случаев Средняя продолжите чьность неоадъювантной гормональной терапии на момент операции составила 3,5 месяца (от 1 до 8 месяцев)

Контрольная подгруппа оперированных пациентов, сформированная для получения условно нормальных первичных культур и дальнейшего сравнения их свойств с культурами аденокарцином, была представлена 20 больными РМП без признаков инвазии рака в ПЖ или в простатический огдел уретры

Средний возраст больных контрольной подгруппы составил 60 лет (от 45 до 71 года) При сравнении подгрупп больных с РПЖ и ДГПЖ подгруппы больных были статистически сопоставимы по возрасту (р>0,05)

Характеристика больных подвергшихся мультифокальной биопсии ПЖ 106 пациентам с подозрением на РПЖ проведена трансректальная мультифокальная биопсия под контролем ТРУЗИ В этой группе больных было, в свою очередь выделено 3 подгруппы 53 больных с гистологически

8

подтвержденным диагнозом аденокарциномы, у 29 выявлена только простатическая интраэпителиальная неоплазия (ПИН), 24 больным, поставлен диагноз ДГПЖ

Средний возраст больных РПЖ на момент выполнения биопсии составил 68 лет (54-80 лет) Уровень сывороточного ПСА более 2,5 нг/мл, являлся показанием к проведению мультифокальной биопсии ПЖ В подгруппе больных с подтвержденным РПЖ у 19 (34%) пациентов уровень общего ПСА составлял более 20 нг/мл. Среднее значение сывороточного ПСА в этой подгруппе составило 23 нг/мл, а медиана - 16,7 нг/мл (интерквартильный диапазон - 8,4 - 30 нг/мл) У 10 (18,9%) пациентов был диагностирован местно-распространенный РПЖ с признаками экстракапсулярной инвазии (ЭИ). Распределение больных РПЖ по клинической стадии представлено в таблице 3

Таблица 3 Распределение больных по клинической стадии РПЖ

Стадия Т1ЧМ Число больных п (%)

II Т2а№Мо 22(41,5%)

Т2сЫхМо 21 (39,6%)

III ТЗа№Мо 10(18,9%)

Всего 53 (100%)

У 2 больных была выявлена высокодифференцированная аденокарцинома (2-4 балла по Глисону), в 34 случаях определялся умеренно-дифференцированный РПЖ (5-6 баллов по Глисону), у 17 больных имелась низкодифференцированная опухоль (7 баллов по Глисону)

Средний возраст больных с ПИН на момент выполнения биопсии составил 66 лет (54-80 лет) Средний уровень сывороточного ПСА больных в этой группе на момент выполнения биопсии соответствовал 11 нг/мл (1-30 нг/мл), в свою очередь медиана уровня ПСА составила 10,17 нг/мл (интерквартильный диапазон - 6 - 16 нг/мл)

Контрольная подгруппа, выделенная для анализа и дальнейшего сравнения профиля метилирования генов супрессоров опухолевого роста, состояла из 24 больных с, поставленным по результатам мультифокальной биопсии,

диагнозом ДГПЖ Средний возраст больных контрольной подгруппы на момент выполнения биопсии составил 67 лет (51 -76 лет) В подгруппе больных с ДГПЖ значение общего ПСА превышало 20 нг/мл только в 1 (5,7%) случае Среднее значение ПСА составляло 11 нг/мл (1-21,9 нг/мл), а медиана уровня ПСА в этой подгруппе - 10,6 нг/мл (интерквартильный диапазон - 7,1 - 15,7 нг/мл)

При сопоставлении больных с диагностированной аденокарциномой, ПИН и ДГПЖ группы больных были статистически сопоставимы между собой как по возрасту, так и по уровню сывороточного ПСА (р>0,05)

Характеристика методов исследования и лечения. Всем больным проводили стандартное общеклиническое обследование, включающее сбор анамнеза, физикальное обследование, исследование клинических анализов крови и мочи, биохимического анализа крови, ЭКГ Пациентам, которым выполняли РПЭ, также исследовали свертывающую систему крови (гемостазиограмма) Обязательным методом обследования являлось пальцевое ректальное исследование (ПРИ) ПРИ расценивали наряду с трансректальным ультразвуковым исследованием (ТРУЗИ) как основной метод определения клинической стадии РПЖ в отношении распространенности опухоли ПЖ (символ Т) Всем больным выполняли УЗИ брюшной полости и забрюшинного пространства, а также ТРУЗИ ПЖ и органов малого таза Уровень ПСА в сыворотке крови определяли всем больным, включенным в исследование Забор крови для определения концентрации ПСА осуществляли не ранее чем через неделю после ПРИ или ТРУЗИ и не ранее чем через 28 дней после биопсии ПЖ Общее количество столбиков ткани, которые получали при трансректальной пункционной биопсии ПЖ, зависело от клинической ситуации и составляло от 6 до 12 биоптатов и более Для определения распространенности опухолевого процесса и исключения отдаленного метастазирования всем больным проводили сцинтиграфию скелета и рентгенографию легких Больным в группе хирургического лечения проводили КТ или магнито-резонансную томографию (МРТ) ПЖ

Основное внимание при гистологическом исследовании всех препаратов после РПЭ уделялось следующим параметрам локализация и объем опухолевых узлов, степень дифференцировки опухоли по шкале Глисона, присутствие ПИН и степень ее выраженности, выраженность гормонального патоморфоза, наличие выхода процесса за пределы капсулы, позитивный хирургический край, наличие инвазии в семенные пузырьки, метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов

Полученный в результате мультифокальной биопсии материал оценивали по следующим параметрам процент положительных биоптатов, сторону и локализацию (верхушка, середина, основание) рака, протяженность опухолевой ткани в биоптате, степень дифференцировки опухоли по шкале Глисона, присутствие ПИН и степень ее выраженности, наличие признаков периневральной инвазии и капсулы ПЖ

Первичная культура аденокарциномы предстательной железы. Для исследований использовали операционный материал Забор ткани производился в стерильных условиях преимущественно из периферической зоны предстательной железы Исследования проводили в НИИ молекулярной медицины ММА им ИМ Сеченова Учитывая гетерогенность большинства карцином предстательной железы, каждый исследуемый фрагмент наряду с культивированием подвергался гистологическому исследованию с целью уточнения морфологической картины Окончательную верификацию инвазивного роста опухоли проводили с помощью иммуногистохимической реакции с антителами к высокомолекулярному цитокератину как на парафиновых срезах, так и в культуре Количественное содержание растворимых факторов НОР, ЕОР и УЕОР в супернатантах первичных культур ткани аденокарциномы предстательной железы проводили с помощью твердофазного иммуноферментного анализа

Анализ метилирования ДНК. Биологический материал сразу после биопсии отправляли в лабораторию молекулярной генетики человека НИИ молекулярной медицины ММА им И М Сеченова, где затем замораживали и хранили в жидком азоте, а также фиксировали в формалине с последующей

парафинизацией Часть материала использовали для гистологического анализа, а другая часть для выделения ДНК Для получения ДНК из ткани опухоли использовали метод выделения ДНК (Sambrook et al 1989) Для выявления метилирования ДНК проводилась обработка соответствующими метилчувствительными рестриктазами Hpall Для определения метилирования CpG-островков промоторных областей исследуемых генов применяли метод метил-чувствительной полимеразной цепной реакции (МЧ-ПЦР) Для подтверждения результатов анализа метилирования промоторных областей генов, полученных с помощью метил-чувствительной ПЦР было проведено метил-специфическое секвенирование этих последовательностей

Методы статистической обработки данных. Для хранения данных использовали электронные таблицы Excel 2003 (Microsoft Corp, США) Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ STATIST1CA 6 0 (StatSoft, Inc , США) Для описания данных использовались методы описательной статистики В отношении непрерывных переменных указаны количество случаев (п), среднее значение (М), стандартное отклонение (а) или стандартная ошибка среднего (ш), минимум, максимум, медиана (Me) и квартили (25%, 75%) В отношении дискретных переменных - распределение различных частот Для сопоставления исследуемых параметров сначала проводилось тестирование на нормальность распределения При соответствии закону нормального распределения использовался - критерий Стьюдента (t-тест) При сравнении трех групп применялся однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) При характере распределения, отличающемся от нормального, были использованы непараметрические статистические методы (критерий Вилкоксона, Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса) Для оценки взаимосвязи изучаемых признаков применялись методы корреляционного анализа Пирсона (параметрический) и Спирмена (непараметрический) Для сравнения долей в подгруппах использовались проба у2 и точный критерий Фишера Уровень статистической значимости различий был принят равным 0,05

Результаты исследования

Анализ и оценка количественного содержания растворимых факторов EGF, HGF, и VEGF в супернатантах первичных культур ткани

В нашем исследовании проведен анализ и оценка достоверности корреляции количественного содержания эпидермального фактора роста (EGF), гепатоцитарного фактора роста (HGF) и фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), в супернатантах первичных культур ткани ПЖ, полученной в результате оперативного лечения больных в объеме РПЭ и ЦПВЭ

Средняя концентрация пептидного фактора EGF в группе больных РПЖ составила 310,36 pg/ml (от 113,8 до 697,1 pg/ml) В подгруппе контроля средняя концентрация того же фактора роста составляла 242,04 pg/ml (от 156,7 до 347,4 pg/ml)

При сравнении подгрупп больных с РПЖ и ДГПЖ выявлена статистически достоверная слабая прямая корреляция между уровнем EGF и наличием РПЖ, коэффициент корреляции R=0,21 (р=0,031) Концентрация ростового фактора EGF в этих подгруппах также достоверно различалась (р=0,032) (рисунок 2) Рисунок 2 Сравнение больных из группы РПЖ и ДГПЖ по уровню EGF

0 Median

[ I Z5%-75%

1 Min-Max

Что касается HGF, то его средний уровень в группе больных РПЖ составил 1505,15 pg/ml (от 186,5 до 4858 pg/ml) В подгруппе контроля средняя концентрация того же фактора составила 107,79 pg/ml (от 67,2 до 170,1 pg/ml)

Между наличием РПЖ и уровнем НОР нами выявлена сильная статистически достоверная прямая корреляция, коэффициент корреляции 11=0,67 (р<0,001) На рисунке 3 видно, что концентрация НвБ в подгруппах больных с РПЖ и ДГПЖ также достоверно различалась (р<0,002)

Рисунок 3 Сравнение больных из группы РПЖ и ДГПЖ по уровню ЖгР

Средняя концентрация ростового фактора УЕСБ в группе больных РПЖ составила 725,58 р^ш! (от 189,7 до 1720 р^ш1) В подгруппе больных с ДГПЖ его средняя концентрация составила 162,4 р§/ш1 (от 126,3 до 237,9 р§/ш1) Рисунок 4 Сравнение бо чъных из группы РПЖ и ДГПЖ по уровню УЕСГ

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200

о Мейшп { | 25%-75% "'!,. Мт-Мах

При сравнении подгрупп больных с РПЖ и ДГПЖ выявлена статистически достоверная сильная прямая корреляция между уровнем УЕОР и наличием

РПЖ, коэффициент корреляции Я=0,66 (р<0,001) Как видно на рисунке 4, концентрация УЕОР в этих подгруппах гакже достоверно различалась (р<0,001)

Таким образом, наиболее выраженная корреляция с наличием РПЖ была продемонстрирована при анализе достоверности различий количественного содержания таких факторов как НОР и УЕОР ЕОР, в свою очередь, демонстрирует слабую прямую корреляцию и сравнительно низкую специфичность

Анализ ассоциации уровня растворимых факторов роста и объема ПЖ В нашем исследовании объем ПЖ с изучаемыми факторами роста коррелировал выборочно Так при анализе зависимости концентрации факторов роста от объема ПЖ были отмечены равные по силе, но диаметрально противоположные по направленности корреляции ростовых факторов ЕОР -прямая корреляция 11=0,23 (р=0,044) и - обратная корреляция Я= -0,23 (р=0,045) Фактор УЕОР, в свою очередь, продемонстрировал свою независимость от объема ПЖ (р=0,098)

Анализ ассоциации уровня растворимых факторов роста и уровня сывороточного ПСА Следует отметить фактор роста НОР, обладающий выраженной, по сравнению с остальными, ассоциацией как с абсолютным значением сывороточного ПСА, так и с рассчитанной плотностью простат специфического антигена коэффициент корреляции 11=0,36 (р=0,0008) и 11=0,45 (р=0,0001) соответственно (рисунок 5)

На рисунке 6 видно, что между концентрацией фактора роста УЕОР и уровнем общего ПСА выяваена достоверная прямая ассоциация, где 11=0,26 (р=0,015) Концентрации ростового фактора УЕвР и плотность ПСА достоверно не коррелировали (р=0,53)

Рисунок 5 График рассеяния корреляг^ии уровня сывороточного ПСА а концентрации НОГ

45

40 35 I 30

8. >

5 0 -5

1000 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

Концентрация НвЯ рд/т!

Рисунок 6 График рассеяния корреляции уровня сывороточного ПСА и концентрации УЕСГ

45 40 35

30

1 25 <

У 20

10 5 О 5

О 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1300 Концентрация \JEGF р&т!

При анализе зависимости концентрации ЕйР от уровня предоперационного ПСА статистически достоверной корреляции не отмечено (р=0,25), при оценке ассоциации того же фактора роста и плотности ПСА выявлена слабо выраженная обратная корреляция коэффициент корреляции Я= -0,27 (р=0,017)

Анализ ассоциации уровня растворимых факторов роста и процента «позитивных» биоптатов При анализе ассоциации уровня факторов роста с

процентом «позитивных» биоптатов наиболее выраженная корреляция была продемонстрирована НОР, где Я= 0,47 (р=0,0006) (рисунка 7)

Рисунок 7 График рассеяния корреляции процента позитивных биоптатов и концентрации НйГ

Равные по силе - умеренно выраженные, но диаметрально противоположные по направленности корреляции были выявлены в случаях EGF - обратная корреляция, где R= -0,31 (р=0,032) и VEGF - прямая корреляция, где R= 0,34 (р=0,018)

Анализ ассоциации уровня растворимых факторов роста и патоморфологической стадии РПЖ При анализе ассоциации уровня EGF и патоморфологической стадии РПЖ отмечена статистически достоверная слабая обратная корреляция, где коэффициент корреляции R= -0,21 (р=0,044) Также была выявлена достоверная умеренно выраженная отрицательная корреляция между этим фактором роста и наличием экстракапсулярной инвазии, где коэффициент корреляции R= -0,26 (р=0,015) Концентрация EGF в подгруппах больных с ЭИ и без также достоверно различалась (р=0,016) (рисунок 8)

Однако при оценке ассоциации уровня EGF и наличия пораженных лимфатических узлов pNl, статистически достоверной корреляции отмечено не было (р=0,058)

Рисунок 8 Сравнение групп больных с наличием ЭИ и без ЭИ по уровню ЕвР

1

500

0 МеЙ1вп

| | 25%-75%

1 Мю-Мах

При анализе другого ростового фактора - НС Б, выявлена статистически достоверная достаточно сильная прямая корреляция между его концентрацией и патоморфологической стадией РПЖ, коэффициент корреляции Я= 0,48 (р=0,00002) Более сильно этот фактор коррелировал с наличием экстракапсулярной инвазии, что подтверждает коэффициент корреляции Я= 0,57 (р<0,0010) Уровень НОР в подгруппах больных с ЭИ и без также статистически Достоверно различался (р<0,001) (рисунок 9)

Рисунок 9 Сравнение групп больных с наличием ЭИ и без ЭИ по уровню НОР

о Мей 1эп [71 25%-75% ]" Мт Мах

Еще одна статистически достоверная прямая корреляция выявлена между уровнем этого фактора роста и наличием метастатически пораженных лимфатических узлов р№, где коэффициент корреляции Я= 0,51 (р<0,001) Концентрация НОР в подгруппах больных с наличием метастатического поражения регионарных лимфатических узлов и без также статистически достоверно различалась (р<0,001) (рисунок 10)

Рисунок 10 Сравнение больных из групп с рЫ1 и рЫО по уровню НОР

£ 2000

а Мейвап 1 1 25% 76% ! Мт Мах

Статистически достоверная выраженная прямая корреляция была выявлена при анализе ассоциации уровня УЕОР и патоморфологической стадии РПЖ, где коэффициент корреляции 11=0,58 (р<0,001) Так же достоверно уровень УЕОР коррелировал с наличием экстракапсулярной инвазии, коэффициент корреляции 11=0,54 (р<0,001) Концентрация УЕСР в подгруппах больных с ЭИ и без также статистически достоверно различалась (р<0,001) (рисунок И)

Рисунок 11 Сравнение групп больных с наличием ЭИ и без ЭИ по уровню УЕвР

Корреляция выявленная между уровнем УБОР и наличием метастатически пораженных лимфатических узлов рШ, была статистически достоверной, коэффициент корреляции 11= 0,39 (р=0,0001) Концентрация УЕСР в подгруппах больных с рШ и рМО достоверно различалась (р=0,0002) (рисунок 12)

Рисунок 12 Сравнение больных из групп с N1 и N0 по уровню УЕОР

1800 1600 1400 1200 1000 воо 600 400 200

а Ме<3|ап I I 25%-75% I. Мт Мах

Таким образом, наиболее сильно с патоморфологической стадией, экстракапсулярной инвазией и наличием регионарных метастазов коррелировал НОР, к тому же он обладал более высокой специфичностью

Анализ ассоциации уровня растворимых факторов роста и степени дифференцировки по шкале Глисона РПЖ При анализе ассоциаций количественного содержания ростовых факторов и степени дифференцировки по Глисону РПЖ слабее всех оказался ЕОР, где Я= -0,28 (р=0,017) (рисунок 13) Рисунок 13 График рассеяния корреляг;ии степени дифференцировки РПЖ и концентрации ЕОР (РПЭ и ЦПВЭ)

При анализе же ассоциаций его уровня и степени дифференцировки по Глисону, поставленной при гистологическом исследовании биопсийных образцов, статистически достоверной корреляции отмечено не было

Факторы роста НвР и УЕОР продемонстрировали схожие по силе корреляцию и специфичность в отношении степени дифференцировки РПЖ, поставленной при гистологическом исследовании как биопсийных (Я= 0,34 (р=0,004) и 0,35 (р=0,003) соответственно), так и послеоперационных препаратов (11= 0,44 (р=0,0001) и Я= 0,43 (р=0,0001) соответственно) (рисунок 14, 15)

Однако, необходимо отметить, что корреляции этих двух факторов роста со степенью дифференцировки РПЖ, поставленной на основании биопсии ПЖ, по сравнению с послеоперационной, были слабее, что можно объяснить

техническими ограничениями мультифокальной биопсии ПЖ и гетерогенностью ткани ПЖ

Рисунок 14 График рассеяния корреляции степени дифференцировки РПЖ и концентрации НвГ (РПЭ и ЦПВЭ)

Рисунок 15 График рассеяния корреляции степени дифференцировки РПЖ и концентрации УЕвГ (РПЭ и ЦПВЭ)

Анализ ассоциации уровня растворимых факторов роста и неоадъювантной гормональной терапий В нашем исследовании мы оценили ассоциацию концентрации факторов роста с неоадъювантной гормональной терапий, количеством курсов и степенью гормонального патоморфоза Наиболее сильно с медикаментозной кастрацией коррелировал Нвр, Ы=0,57

(р<0,001) Концентрация НСР в подгруппах с НеоГТ и без нее также достоверно различалась (р<0,001) (рисунок 16)

Ассоциация ЕвР с медикаментозной кастрацией была слабее и обратно направленной И—О,43 (р<0,001) Концентрация ростового фактора ЕвР в этих подгруппах также достоверно различалась (р<0,001) (рисунок 17)

Рисунок 16 Сравнение групп больных получавших и не получавших НеоГТ по уровню НОР

0 Мейшп

I | 25% 75%

1 М(П Мах

Без НеоГТ НеоГТ

Рисунок 17 Сравнение групп больных получавших и не получавших НеоГТ по уровню ЕСГ

2.

| зоо

0 Ме<1ап

I I 25% 75%

1 Ыоп ОиНюг Рапде О ОиКюгз

Ех^гетвз

Без НеоГТ НеоГТ

Что же касается фактора УЕОР, то корреляция его уровня с неоадъювантной гормональной терапией оказалась статистически недостоверной (р=0,07)

Многофакторный анализ клинико-морфологических факторов прогноза и растворимых факторов роста В нашей работе с целью оценить влияние различных клинико-морфологических факторов и факторов роста на экстракапсулярную инвазию мы использовали регрессионную модель (таблица 4) Прогностическая модель оказалась статистически значимой (р-0,0001)

Таблт1а 4 Результаты регрессионного анализа зависимости экстракапсулярной инвазии от факторов прогноза и факторов роста

Фактор Р Стандартная ошибка р р

ПСА -0,32 0,2 0,11

Сумма Глисона (РПЭ) 0,37 0,16 0,02

ЕС¥ -0,05 0,12 0,65

ШЕ 0,22 0,15 0,16

ИБС/" 0,34 0,13 0,02

Мы также оценили влияние тех же факторов прогноза и факторов роста на метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов (таблица 5) Так же как и предыдущая эта модель оказалась прогностически значимой (р=0,0004)

Таблица 5 Результаты регрессионного анализа зависимости метастазирования от факторов прогноза и факторов роста

Фактор р Стандартная ошибка р Р

ПСА 0,56 0,21 0,009

Сумма Глисона (РПЭ) 0,03 0,16 0,87

БОБ 0,06 0,13 0,64

0,37 0,16 0,03

0,09 0,14 0,54

Таким образом, в проведенном многофакторном регрессионном анализе влияния различных факторов на ЭИ - статистически достоверное влияние оказывали послеоперационная сумма баллов по Глисону (р=0,02) и УЕОР (р=0,02), а при анализе влияния тех же факторов на метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов достоверное значение имели дооперационный уровень сывороточного ПСА (р-0,009) и ЬЮР (р=0,03)

Анализ профиля метилирования генов Н1С1, р16, N33 и в

биоптатах предстательной железы.

Пациенты, на основании патоморфологического заключения, были условно поделены на 3 подгруппы Так пациенты, имеющие хотя бы в одном из фрагментов биопсии аденокарциному, относились к группе РПЖ Пациенты, имеющие в одном и более участков ПЖ очаги ПИН, были включены в труппу ПИН Больные, у которых морфологически не было данных ни за аденокарциному, ни за ПИ11, относились к группе ДГПЖ

Таблица б Частоты метилирования генов pió, HIC1, N33 и GSTP1

Паточорфо догический диагноз Н1С1 р16 GSTP1 N33

РПЖ 32\50 (65%) 19\45(42%) 22\53 (41%) 9\47 (19%)

ПИН 19\29 (66%) í 14\29(48%) 4\29 (13%) 0\29

ДГПЖ 8\24 (33%) j 2\11(18%) 3\24(13%) ОМ 2

В отличии от генов Н1С1 и р16 метилирование генов N33 и £75777 достоверно коррелировало с выявлением при биопсии РПЖ (р=0,013 и р=0,005) (таблица 6) Выраженность ассоциаций была слабой в силу гистологической гетерогенности 1кани ПЖ Также, с целью определения возможности использования профиля метилирования генов в диагностике РПЖ и определении показаний к повторной биопсии ПЖ нами проведено изучение чувствительности и специфичности метода (таблица 7)

Таблица 7 Чувствительность и спег{ифичностъ метода определения метипирования генов С8ТР1 р16, Н1С1, N33

Метилирование гена

Н1С1 р16 GSTP1 N33

Специфичность (%) 49 60 87 100

Чувствительность (%) 64 1 42 41 19

Учитывая специфичность и чувствительность метода определения метилирования для генов N33 (специфичность 100%, а его чувствительность оказалась не больше 19%) и GSTP1 (специфичность 87%, а его чувствительность - 41%) (таблица 7), использование системы прогностических маркеров метилирования, в частности N33 и GSTPI, как дополнительного метода к гистологическому исследованию, может помочь в ранней диагностике РПЖ.

Анализ ассоциации профиля метилирования генов HICl. pió, N33 и GSTP1 с уровнем сывороточного ПСА При анализе взаимосвязи профиля метилирования генов pió, HICl, GSTP1, N33 и уровня сывороточного ПСА, статистически достоверной корреляции отмечено не было (р>0,05)

Анализ ассоциации профиля метилирования генов HICl. pió, N33 и GSTP1 со стадией заболевания При оценке ассоциации опухолевой распространенности и профиля метилирования генов HICl, pió, GSTP1 статистически достоверной корреляции отмечено не было (р>0,05) Что касается гена N33, то его профиль метилирования достоверно коррелировал с количеством пораженных опухолью долей ПЖ, (р=0,046)

Анализ ассоциации профиля метилирования генов HICl. pió, N33 и GSTP1 со степенью дифференцировки РПЖ по шкале Глисона При анализе взаимосвязи профиля метилирования генов pió, HICl, GSTP1, N33 и степени дифференцировки РПЖ, статистически достоверной корреляции отмечено не было (р>0,05)

На основании полученных результатов нами сформулированы лечебно-диагностические алгоритмы с использованием изученных факторов роста и молекулярно-генетических маркеров (таблица 8)

Таблица 8 Лечебно-диагностические алгоритмы с использованием

факторов роста и молекулярно-генетических маркеров

Клинический Рутинные Опухолевые Лечебно-диагностический

диагноз исследования маркеры (гомогенат) алгоритм действий

ДГПЖ или GSTP1 и N33 - Повторьая мультифокальная

ПИП (легкой и метилированы биопсия ПЖ через 1,5 месяца

средней GSTP1 и N33 - Динамическое набтюдение,

степени) не метилированы мониторинг ПСА

Низкий риск экстракапсуяярной

инвазии

VEGF < 190 пг/мч — Гщатетьное наблюдение

HGF < ПО пг/мл - Брахигерапия - Первосберегающая радикальная

Т1Ь-Т2с ПСА < Юнг/мл Глисон < 6 простатэктомия (РПЭ) - Дистанционная лучевая терапия (ДОТ)

VLGT < 190 гн/мл Высокий риск экстракапсу трной

HGF > 170 пг/мл инвазии и чимфочгенного иетастширования - РПЭ + расширенная лимфаденэктомия - ДЛТ + тазовая лимфаденэктомия - ДЛТ+ГТ

Выводы:

1 В культурах гкани, полученных от больных РПЖ и ДГПЖ, концентрация факторов роста достоверно различалась Медиана концентрации ЕОБ в подгруппе РПЖ составила 298,1 р&т\, в подгруппе ДГПЖ - 233,15 р^т1 (р=0,031), у больных РПЖ медиана уровня НОР - 1162,6 р^т1, ДГПЖ -104,85 р^т1 (р<0,001), медиана уровня УЕОР в подгруппе РПЖ составила 606,5 р§/ш1, в подгруппе ДГПЖ - 148,6 (р<0,001)

2 Уровень экспрессии факторов роста достоверно коррелировал с такими характеристиками опухолевого процесса, как ЭИ, наличие метастазов в регионарных лимфатических узлах, уровень сывороточного ПСА, % «позитивных» биоптатов, степень дифференцировки по шкале Глисона

27

Концентрация VEGF является наиболее прогностически значимым фактором в прогнозе ЭИ опухоли ПЖ (коэф корреляции = 0,54, р<0,001), а уровень HGF - для метастатического поражения лимфатических узлов (коэф корреляции = 0,51, р<0,001)

3 Концентрация EGF статистически достоверно обратно пропорционально коррелировала с проведением неоадъювантной гормональной терапии (коэф корреляции = -0,43, р<0,001), что косвенно свидетельствует о гормональной зависимости выработки этого фактора роста при РПЖ Уровень экспрессии HGF сильно коррелировал с применением медикаментозной кастрации (коэф корреляции = 0,57, р<0,001), что говорит об андроген-независимой регуляции этого фактора роста в развитии РПЖ

4 Частота метилирования генов GSTP1 и N33 при РПЖ достоверно выше, чем при ДГПЖ и ПИН (р=0,005 и р=0,013 соответственно) Профиль метилирования генов pió, HIC1 при РПЖ, ПИН и ДГПЖ достоверно не различается

5 Чувствительность метода определения метилирования составила для GSTP1 41%, для N33 19%, а специфичность для GSTP1 87%, для N33 составила 100%

Практические рекомендации

1 Определение факторов роста НОР и УЕОР в биопсийном материале позволяет более точно прогнозировать патоморфологическую стадию опухолевого процесса

2 Уровни УЕОР в биопсийном материале, превышающие пороговое значение (190 р^ш1), свидетельствуют о более высоком риске развития ЭИ В связи, с чем при высоких значениях УЕОР выполнение нервосберегающей РПЭ нецелесообразно

3 Уровни НОР в биопсийном материале, превышающие пороговое значение

(170 р^ш1), свидетельствуют о более высоком риске лимфогенного

28

метастазирования, что позволяет рекомендовать выполнение расширенной лимфаденэктомии при РПЭ или перед проведением ДЛТ 4 Гипермегилирование генов N33 и GSTP1 в биопсийном материале от больных с неопухолевыми изменениями ПЖ (ПИН, ДГПЖ) является дополнительным показанием для проведения повторной биопсии ПЖ вне зависимости от динамики ПСА

Список работ по теме диссертации-

1 The role of Iamimn-5, VLA-6 and tenascin m prostate adenocarcinoma spreading - О P Popova, A V Kouznetzova, TI Damlova, A A Ivanov, Y Y Andreeva, P V Shegai, В Y Alekseev , G A Frank, M A Paltsev// Virchows Archiv - 2005, Vol 447, №2, p 446

2 Methylation profile of N33, HIC, GSTP1 and CDKN2 at different stages of prostate carcinogenesis -TV Kekeeva, В Y Alekseev, P V Shegai, M V Nemtsova, D V Zaletaev// European Society of Human Genetics Congress "European journal of human genetics" - Czech Republic, 2005, Vol 13, p 201

3 Молекулярно-генетические маркеры рака предстательной железы в плазме крови -ТВ Кекеева, Б Я Алексеев, П В Шегай, Д В Залетаев, М В Немцова// II международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность» Материалы научно-практической конференции -Москва, 2005, стр 152

4 Methylation profile of N33, HIC, GSTP1 and CDKN2 at different stages of prostate caicmogenesis - BY Alekseev, PV Shegai, TV Kekeeva, MV Nemtsova, D V Zaletaev, I G Rusakov// 21 European Association of Urology Congress European urology supplements - France, 2006, Vol 5, №2, p 51

5 Молекулярно-1енетические маркеры рака предстательной железы в плазме крови - Б Я Алексеев, Г1В Шегай, Т В Кекеева, Д В Залетаев, MB Немцова// IV съезда онкологов и радиологов СНГ Материалы научно-практической конференции -Баку, 2006, сip 37

6 р16 promoter hypermethylation could not be a candidate marker of prognosis

29

in prostate cancer -BY Alekseev, P V Shegai, 0 P Popova, T V Kekeeva, A.V Kouznetzova, A A Ivanov, I G Rusakov// 17 European Society for Urological Researcher Congress European urology supplements - Sweden, 2006, Vol 5, №14, p 792

7 Hypermethylation of CpG islands of N33, ШС, GSTP1 and CDKN2 in prostate carcinogenesis -BY Alekseev, P V Shegai, T V Kekeeva, G V Verechtchagine, M V Nemtsova, D V Zaletaev// 17 European Society for Urological Researcher Congress European urology supplements - Sweden, 2006, Vol 5, №14, p 792

8 RNA alterations in plasma of prostate cancer patients - TV Kekeeva, В Y Alekseev, P V Shegay, M V Nemtsova// European Society of Human Genetics Congress "European journal of human genetics" - Netherlands, 2006, Vol 14, p 228

9 Аномальное метилирование генов pl6, HIC1, N33 и GSTP1 в эпителии и стромальных клетках рака предстательной железы - ПВ Шегай, ТВ Кекеева, О П Попова, Д В Залетаев, М В Немцова// Всероссийская школа молодых онкоурологов Материалы научно-практической конференции - Москва, 2006, стр 66

10 Аномальное метилирование генов р16, HIC1, N33 и GSTP1 в эпителии и опухолевом микроокружении рака предстательной железы -ТВ Кекеева, Б Я Алексеев, П В Шегай, О П Попова, Д В Залетаев, М В Немцова// I конгресс Российского общества онкоурологов Материалы научно-практической конференции - Москва, 2006, стр 37

11 Аномальное метилирование генов р16, ШС1, N33 и GSTP1 в эпителии и стромальных клетках рака предстательной железы -ТВ Кекеева, Б Я Алексеев, П В Шегай, Ю Ю Андреева, О П Попова, Д В Залетаев, М В Немцова//Молекулярная биология -Москва, 2007, №1, стр 79-85

12 Анализ потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности в стромальных и эпителиальных клетках рака предстательной железы - Т В Кекеева, П В Шегай, Л Э Завалишина, Ю Ю Андреева, О П Попова, Д В Залетаев, М В Немцова// Молекулярная биология - Москва, 2007,

Т42, стр 96-109

13 Анализ молекулярно-генетических изменений при раке предстательной железы - Т В Кекеева, Б Я Алексеев, П В Шегай, М В Немцова, В В Стрельников, Е Б Кузнецова, О В Бабенко, М А Иванов, О П Попова, Ю Ю Андреева, Л Э Завалишина, И Г Русаков, Г А Франк, Д В Залетаев// Вестник НИИ молекулярной медицины - Москва, 2007, №7, стр 23-41

14 Молекулярно-генетические маркеры в онкоурологии - ТВ Кекеева, Б Я Алексеев, П В Шегай, О А Кузнецова, С В Башкатов, Р В Курынин, А М Попов, О П Попова, Ю Ю Андреева, М Э Еникеев, Ю Г Аляев, О Б Карякин, И Г Русаков, Г А Франк, Д В Залетаев// Молекулярная медицина - Москва, 2007, № 3, стр 43-54

15 Особенности экспрессии химерного транскрипта TMPRSS2/ERG4 при раке предстательной железы - Г1В Шегай, Б Я Алексеев, Т В Кекеева, Ю Ю Андреева, Д В Залетаев, М В Немцова// VI всероссийская конференция молодых онкологов Материалы научно-практической конференции - Москва, 2007, стр 118

16 Экспрессия химерного транскрипта TMPRSS2/ERG4 при раке предстательной железы -ТВ Кекеева, Б Я Алексеев, П В Шегай, О П Попова, Л Э Завалишина, Ю Ю Андреева, Д В Залетаев, М В Немцова// II конгресс Российского общества онкоурологов Материалы научно-практической конференции - Москва, 2007, стр 36

17 Высокая частота химерного транскрипта TMPRSS2/ERG4 при раке предстатечыюй железы - ТВ Кекеева, ПВ Шегай, О П Попова, Л Э Завалишина, Д В Залетаев, М В Немцова// Русский медицинский форум Материалы научно-практической конференции - Москва, 2007, стр 134

18 Молекулярные механизмы развития рака предстательной железы корреляция EGF, HGF и VEGF с клинико-морфологическими параметрами - ОП Попова, ПВ Шегай, А А Иванов, ТИ Данилова, Б Я Алексеев, Ю Ю Андреева, Г А Франк, М А Пальцев// Молекулярная биология - Москва, 2008, №4 (в печати)

19 A dual role of androgen ablation therapy in growth factor production suggests a possible mechanism of prostate cancer hormone resistance - В Y Alekseev, P V Shegai, О P Popova, TI Danilova, A A Ivanov, IG Rusakov//23 European Association of Urology Congress European urology supplements -Italy, 2008, Vol 5 (в печати)

Подписано в печать 15 02 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 76 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Актуальность темы

Проблема диагностики и лечения рака предстательной железы (РПЖ) является наиболее актуальной в современной онкоурологической практике. Это связано прежде всего с продолжающимся увеличением заболеваемости данной патологией.

В США РПЖ стоит на первом месте в структуре онкологической заболеваемости и второе место по частоте летальных исходов, занимая четвертое место среди всех причин смертности [1, 10]. В странах Европы опухоли предстательной железы также являются наиболее распространенными новообразованиями наравне с раком легкого; ежегодно выявляют более 85000 новых случаев заболевания, что служит причиной 9% смертей мужского населения вызванных онкологическими заболеваниями [2, 3]. Ежегодно число больных РПЖ возрастает во всем мире, а по темпам прироста РПЖ занимает ведущее место в большинстве стран.

В России в 2006 г. зарегистрировано 18092 новых случая РПЖ, причем заболеваемость составила 21,4 на 100 тыс. мужского населения. На долю опухолей предстательной железы приходиться 8,2% от всех злокачественных новообразований у мужчин, занимая 4-е место по заболеваемости после опухолей легких, желудка и кожи. По величине прироста показателя заболеваемости в России РПЖ занимает 1-е место за период 1996-2006 г. (128,26%). Смертность от РПЖ составила 10,08 на 100 тыс. мужского населения. Столь широкое распространение РПЖ ставит это заболевание в ряд наиболее важных социальных проблем современности [17].

Золотым» стандартом диагностики РПЖ являются пальцевое ректальное исследование (ПРИ), трансректальное ультразвуковое исследование предстательной железы (ТРУЗИ) и определение уровня простатспецифического антигена (ПСА). Определение ПСА имеет наибольшую чувствительность и специфичность из трех основных исследований. ПСА является одним из самых исследованных и широко применяемых биомаркеров ранней диагностики РПЖ.

Биомаркерная диагностика РПЖ не является инновационной методикой. Еще в 1938 г. A.B. Gutman и соавт. [2] отметили значительное повышение уровня кислой фосфатазы сыворотки крови у мужчин с метастазами РПЖ. В дальнейшем был разработан более точный метод определения простатспецифической субфракции кислой фосфатазы (ПКФ). Несмотря на невысокую чувствительность и специфичность (повышение ПКФ в 70—80% случаев сопутствовало метастатическому РПЖ и лишь в 10—30% -локализованному), этот биомаркер на протяжении почти 50 лет являлся основным в диагностике РПЖ.

Простатспецифический антиген впервые был выделен M.C.Wang из ткани предстательной железы в 1979 г. В 1980 г. Papsidero создал серологический тест для определения сывороточного ПСА. Концентрация ПСА в эякуляте составляет примерно 1 млн мкг/мл, тогда как в сыворотке крови при отсутствии заболеваний предстательной железы - не более 4 нг/мл. Начиная с 1987 г., ПСА широко используется в диагностике РПЖ, при установлении стадии процесса, оценке эффективности лечения [2, 11].

С конца 80-х годов частота выявления РПЖ почти удвоилась, свидетельствуя об улучшении диагностики РПЖ, что, безусловно, связано с широким внедрением ПСА-диагностики в клиническую практику [11].

Однако ПСА имеет ряд серьезных недостатков. В частности, причиной повышения уровня ПСА являются не только РПЖ, но и ДГПЖ, хронический и острый простатит, массаж железы, эякуляция, биопсия, что говорит о невысокой специфичности метода. Кроме того, в 20—40% случаев РПЖ уровень ПСА не превышает принятую в настоящее время норму 4 нг/мл [2, 11, 15]. Для решения данной проблемы многими специалистами было предложено снизить пороговое значение ПСА с 4 до 2,5 нг/мл [2, 15], что, в свою очередь, привело к выявлению относительно благоприятных опухолей - небольших и высокодифференцированных, представляющих невысокий риск для жизни и здоровья пациента. Клинически эти опухоли трудно дифференцировать имеющимися в арсенале уролога средствами, поэтому в большинстве случаев применяют агрессивное лечение даже относительно благоприятного РПЖ.

Применение ПСА в сочетании с трансректальной мультифокальной биопсией предстательной железы под ультразвуковым контролем позволяет выявлять больший процент заболеваний на ранних стадиях, а также дает возможность на дооперационном этапе определить агрессивность и распространенность РПЖ. Нельзя забывать, однако, что при биопсии часто недооцениваются злокачественность и степень распространенности опухолевого процесса в предстательной железе [8, 9, 15].

К сожалению, на сегодняшний день еще не найден «идеальный онкомаркер» для РПЖ, способный различать агрессивные опухоли от медленнорастущих или латентных заболеваний с относительно хорошим прогнозом и, таким образом, дающий возможность тонкой индивидуализации терапевтической тактики для каждого больного.

Для определения тактики ведения больного с локализованным РПЖ важное значение имеет не только своевременная постановка диагноза, но и возможность прогнозировать дальнейшее течение и выявление потенциально агрессивных форм РПЖ. Очевидна необходимость поиска и внедрения в клиническую практику новых, более чувствительных, специфичных и прогностически эффективных маркеров РПЖ.

Современный подход к диагностике, выбору тактики лечения« и прогнозирования его результатов должен базироваться на глубоких знаниях молекулярных и генетических основ этиологии и патогенеза злокачественного процесса. Сегодня одним из исследовательских направлений является изучение клеточно-клеточного и клеточно-матриксного взаимодействия. В последнее время, достигнуты также большие успехи в изучении генетических факторов, влияющих на различные этапы канцерогенеза РПЖ [2, 9, 10].

С учетом вышесказанного, становится очевидной актуальность проблемы выявления и оценки новых молекулярно-генетических факторов, которые могли бы стать, с одной стороны, маркерами дифференциальной диагностики и прогноза РПЖ, а с другой - явиться мишенью для таргетной терапии, что и побудило нас провести собственное исследование по данной проблеме.

Цель исследования

Оптимизация ранней диагностики РПЖ и определения прогноза течения заболевания на основании изучения клинического значения ростовых факторов и метилирования генов опухолевой супрессии.

Задачи:

1. Изучить количественное содержание растворимых факторов HGF, EGF и VEGF в супернатантах первичных культур аденокарциномы предстательной железы и доброкачественной гиперплазии предстательной железы, провести сравнительный анализ их концентраций.

2. Провести корреляционный анализ концентраций HGF, EGF и VEGF и основных клинико-морфологических характеристик опухолевого процесса и определить прогностическую значимость данных факторов роста.

3. Изучить профиль метилирования генов PI б, HIC1, N33 и GSTP1 в биопсийном материале от больных раком предстательной железы, простатической интраэпителиальной неоплазией и доброкачественной гиперплазией предстательной железы, провести их сравнительный анализ.

4. Оценить прогностическую значимость метилирования генов PI 6, HIC1, N33 и GSTP1 для ранней диагностики рака предстательной железы и разработать показания к проведению повторных биопсии.

Научная новизна

В исследовании впервые проведено изучение содержания ростовых факторов ЬЮБ, ЕОБ и УЕОБ в супернатантах первичных культур, полученных от больных РПЖ и ДГПЖ, что позволило наиболее точно проанализировать роль данных факторов в развитии опухолевого процесса.

На большом клиническом материале впервые проведен дифференцированный анализ прогностической роли различных факторов роста и продемонстрировано их значение для прогноза распространенности опухолевого процесса.

В работе исследована роль гормональной регуляции в продукции факторов роста НОБ, ЕОБ и УЕОБ и впервые показана стимуляция синтеза ЬЮР на фоне проведения НеоГТ, что, возможно, является одним из механизмов гормональной резистентности опухоли.

Выявлена достоверная корреляция продукции НвБ с метастатическим потенциалом опухоли.

Впервые проведен анализ частоты метилирования генов Р16, Н1С1, N33 и С8ТР1 в биопсийном материале при РПЖ, ПИН и ДГПЖ, при этом показаны чувствительность и специфичность метилирования данных генов для каждого патологического процесса.

Проведенное исследование показало возможность использования анализа метилирования генов Р16, Н1С1, N33 и С8ТР1 для ранней диагностики РПЖ и определения показаний к повторной биопсии ПЖ.

Практическая значимость

На основании изучения содержания HGF, EGF и VEGF в первичных культурах аденокарциномы и доброкачественной гиперплазии ПЖ показана возможность использования данных факторов роста для диагностики РПЖ и оценки распространенности опухолевого процесса.

Установлено, что экспрессия HGF связана с высоким метастатическим потенциалом РПЖ, а концентрация VEGF достоверно коррелирует с распространенностью первичной опухоли ПЖ. В то же время продемонстрирована низкая специфичность EGF для оценки распространенности опухолевого процесса.

Проведенный в исследовании анализ профиля метилирования генов опухолевой супрессии в биопсийном материале показал значение определения метилирования для дифференциальной диагностики РПЖ, ПИН, ДГПЖ.

Выявлено, что частота метилирования гена GSTP1 при РПЖ достоверно выше, чем при ПИН и ДГПЖ, а метилирование гена N33 определяется в биопсийном материале только из участков аденокарциномы. В исследовании показано, что изучение профиля метилирования GSTP1 и N33 может быть использовано для определения показаний к повторной биопсии предстательной железы у больных с ДГПЖ и ПИН с целью ранней диагностики РПЖ.

Выводы

1. В культурах ткани полученных от больных РПЖ и ДГПЖ концентрация факторов роста достоверно различалась. Медиана концентрации EGF в подгруппе РПЖ составила 298,1 pg/ml, в подгруппе ДГПЖ - 233,15 pg/ml (р=0,031); у больных РПЖ медиана уровня HGF - 1162,6 pg/ml, ДГПЖ - 104,85 pg/ml (р<0,001); медиана уровня VEGF в подгруппе РПЖ составила 606,5 pg/ml, в подгруппе ДГПЖ - 148,6 pg/ml (р<0,001).

2. Уровень экспрессии факторов роста достоверно коррелировал с такими характеристиками опухолевого процесса, как ЭИ, наличие метастазов в регионарных лимфатических узлах, уровень сывороточного ПСА, % «позитивных» биоптатов, степень дифференцировки по шкале Глисона. Концентрация VEGF является наиболее прогностически значимым фактором в прогнозе ЭИ опухоли ПЖ (коэф. корреляции = 0,54; р<0,001), а уровень HGF для метастатического поражения лимфатических узлов (коэф. корреляции = 0,51; р<0,001).

3. Концентрация EGF статистически достоверно обратно пропорционально коррелировала с проведением неоадъювантной гормональной терапии (коэф. корреляции = -0,43; р<0,001), что косвенно свидетельствует о гормональной зависимости выработки этого фактора роста при РПЖ. Уровень экспрессии HGF сильно коррелировал с применением медикаментозной кастрации (коэф. корреляции = 0,57; р<0,001), что говорит об андроген-независимой регуляции этого фактора роста в развитии РПЖ.

4. Частота метилирования генов GSTP1 и N33 при РПЖ достоверно выше, чем при ДГПЖ и ПИН (р=0,005 и р=0,013 соответственно). Профиль метилирования генов pió, HIC1 при РПЖ, ПИН и ДГПЖ достоверно не различается.

5. Чувствительность метода определения метилирования составила для GSTP1 41%, для N33 19%, а специфичность для GSTP1 87%, для N33 составила 100%.

Практические рекомендации

1. Определение факторов роста НОР и УЕОР в биопсийном материале позволяет более точно прогнозировать патоморфологическую стадию опухолевого процесса.

2. Уровни УЕОБ в биопсийном материале превышающие пороговое значение (190 р£/ш1), свидетельствуют о более высоком риске развития ЭИ. В связи, с чем при высоких значениях УЕОБ выполнение нервосберегающей РПЭ не целесообразно.

3. Уровни НвБ в биопсийном материале превышающие пороговое значение (170 р§/ш1), свидетельствуют о более высоком риске лимфогенного метастазировании, что позволяет рекомендовать выполнение расширенной лимфаденэктомии при РПЭ или перед проведением ДЛТ.

4. Гиперметилирование генов N33 и ОБТР1 в биопсийном материале от больных с неопухолевыми изменениями ПЖ (ПИН, ДГПЖ) является дополнительным показанием для проведения повторной биопсии ПЖ вне зависимости от динамики ПСА.