Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Диагностическое значение цитоморфологических, культуральных и иммуногенных свойств Trichomonas vaginalis

На правах рукописи

0034 ГШ"

РАЗДОЛЬСКАЯ Наталья Владимировна

ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЦИТОМОРФОЛОГИЧЕСКИХ, КУЛЬТУРАЛЬНЫХ И ИММУНОГЕННЫХ СВОЙСТВ TRICHOMONAS VAGINALIS

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика 03.00.07- микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 4 СЕН 2009

Санкт-Петербург - 2009

003477514

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М.Кирова» Министерства обороны Российской Федерации

Научные руководители: доктор медицинских наук профессор

ИВАНОВ Андрей Михайлович кандидат биологических наук доцент ГАВРИЛОВА Ольга Владимировна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук профессор

ЗЫБИНА Наталья Николаевна доктор биологических наук профессор РЫБАЛЬЧЕНКО Оксана Владимировна

Ведущая организация: ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию МЗСР РФ

Защита состоится «08» октября 2009 г. в _ часов на заседании

Диссертационного совета Д 205.001.01 при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. A.M. Никифорова» МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 4/2.

С диссертацией молено ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М.Никифорова» МЧС России.

Автореферат разослан сентября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного сов< кандидат медицинских наук /

В. Санников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Trichomonas vaginalis является возбудителем одного из широко распространенных заболеваний урогенитального тракта -трихомониаза (Клименко Б.В. с соавт., 2001; Дмитриев Г.А., 2003; Healy G.R., Smith J.W., 1991). Высокий уровень заболеваемости трихомониазом в Российской Федерации, и в мире, преобладание вялотекущих, малосимптомных форм со стертой клинической картиной заболевания, а также возможные разночтения результатов клинико-лабораторных исследований создают проблемы при постановке диагноза и лечении.

На протяжении многих десятилетий исследователи занимались изучением структурно-функциональных характеристик Т. vaginalis типичной грушевидной формы (Беднова В.Н., 1989; Овчинников Н.М., Делекторский В.В., 1986; Benchimol М., 2004). Другие - нетипичные морфологические формы Т. vaginalis до сих пор описаны и изучены недостаточно полно. Сложность лабораторно-диагностических процедур при трихомониазе связана с идентификацией нетипичных округлых форм простейшего в клиническом материале, а также с их дифференцировкой от других клеточных элементов (Дмитриев Г.А., 2003; Petrin D. et al., 1998; Krieger J.N. et al., 1999). Несмотря на то, что исследователи признают наличие различных форм простейшего, нормативные документы РФ по лабораторной диагностике трихомониаза регламентируют дифференцировку исключительно типичных, грушевидных форм Т. vaginalis. В существующей ситуации является важным получение детальных описаний цитоморфологических характеристик всех морфотипов трихомонад, необходимых для идентификации возбудителя различными методами микроскопии. Актуально изучение цитоморфологического полиморфизма Т. vaginalis, оценка их жизнеспособности в условиях культивирования и в модели инфекции in vitro.

В связи с широким использованием в лабораторной практике дополнительных методов световой микроскопии, перспективно их внедрение в лабораторную диагностику трихомониаза. Однако до сих пор многие микроскопические подходы не апробированы на практике.

Предпочтительным методом диагностики трихомониаза является культивирование возбудителя на питательных средах (Сюч Н.И., 2000; Дмитриев Г.А. с соавт., 2001; Poch F., 1996). На сегодняшний день крайне ограничены сведения о метаболизме вирулентных форм, которые не удается поддерживать длительное время в периодических культурах. Составы сред не оптимальны, практически не изучено влияние условий культивирования на цитоморфологические свойства простейших. В связи с этим необходима дополнительная работа по изучению биологических свойств возбудителя in vitro.

Серологические методы исследования используются исключительно в качестве вспомогательных тестов. Сложности интерпретации результатов иммуноферментного анализа возникают из-за отсутствия экспериментальных данных по его использованию.

Эпидемиологические исследования и изучение биологических свойств Т. vaginalis невозможно без создания коллекции вирулентных штаммов. При невозможности длительного культивирования единственным способом

сохранения является криоконсервирование (Habib F.S., 2004; Matsuo A., 2007). До сих пор отсутствует методика по длительному криосохранению Т. vaginalis, а также оценки выживаемости на разных сроках.

Цель исследования: определить диагностическое значение цитоморфологических, культуральных и иммуногенных свойств Trichomonas vaginalis „и обосновать рекомендации по повышению эффективности лабораторной диагностики трихомониаза.

Задачи исследования:

1. Изучить цитоморфологический полиморфизм и дать характеристики клинических изолятов Т. vaginalis с использованием различных методов микроскопии.

2. Охарактеризовать полиморфизм Т. vaginalis на культуре клеток в модели инфекционного процесса in vitro.

3. Изучить влияние условий культивирования на цитоморфологические свойства Т. vaginalis.

4. Оценить фагоцитарную активность различных цитоморфологических форм Т. vaginalis.

5. Оптимизировать методику криоконсервации Т. vaginalis, оценить ее эффективность и сформировать банк штаммов трихомонад.

6. Получить трихомонадные антигены и изучить в иммуноферментном анализе уровень и частоту обнаружения положительных результатов при выявлении противотрихомонадных IgG-антител у больных трихомониазом.

7. Оптимизировать процедуру проведения иммуноблоттинга с лизатом чистой культуры Т. vaginalis и выявить наиболее иммуногенные антигены.

Научная новизна работы.

Впервые разработаны критерии идентификации нетипичных цитоморфологических форм клинических изолятов Т. vaginalis, выявляемых при микроскопической диагностике трихомониаза. На основе фагоцитарной активности доказана жизнеспособность нетипичных морфологических форм трихомонад. В модели инфекционного процесса in vitro установлены закономерности полиморфизма Т. vaginalis в различные стадии взаимодействия с культурами клеток. Для культуральной диагностики трихомониаза определен оптимальный состав питательной среды на основе клеточной линии MDCK с внесением сыворотки крови, позволяющей выявлять нетипичные морфотипы трихомонад на ранних сроках культивирования.

Теоретическая и практическая значимость.

Показано, что при микроскопической и культуральной диагностике трихомониаза наиболее часто выявляются нетипичные округлые и амебоидные цитоморфологические формы Т. vaginalis. Описанные формы трихомонад жизнеспособны, и в связи с этим они должны учитываться при лабораторной

диагностике трихомониаза.

Экспериментально обоснованные оптимальные составы питательной среды TYM с внесением сыворотки крупного рогатого скота, а также клеточной линии MDCK, позволяют накапливать максимальные концентрации Т. vaginalis округлого морфотипа на ранних сроках культивирования, что повышает чувствительность лабораторной диагностики трихомониаза.

Разработанная оригинальная методика криоконсервации может быть использована для создания банка референс-штаммов Т. vaginalis, необходимого для оценки качества лабораторных исследований. Сконструированная иммуноферментная тест-система для обнаружения противотрихомонадных IgG-антител может использоваться в дополнение к существующим диагностическим подходам. Установлено, что трихомонадный антиген с молекулярной массой 50 кДа является наиболее иммуногенным и перспективен для создания его искусственного аналога с целью стандартизации серологической диагностики трихомониаза.

Внедрение результатов в практику.

Результаты исследования внедрены в научную, учебную и лечебно-диагностическую работу Научно-исследовательского отдела передовых медико-биологических технологий НИЦ, кафедры и клиники кожных и венерических болезней, кафедры микробиологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, ГУЗ «КВД №4» и ГУЗ «Ленинградского областного КВД» (С.-Пегербург).

Основные положения, выносимые па защиту:

1. Нетипичные округлые и амебоидные цитоморфологические формы Т. vaginalis являются жизнеспособными, участвуют в развитии инфекционного процесса и должны учитываться в лабораторной диагностике трихомониаза.

2. Охарактеризованные цитоморфологические и ультраструктурные признаки нетипичного округлого морфотипа Т. vaginalis с применением различных методов микроскопии позволяют дифференцировать их от других клеточных элементов, что является необходимым критерием для повышения эффективности микроскопической диагностики трихомониаза.

3. Разработанная модель инфекционного процесса in vitro с использованием клеточных культур и оптимизация питательной среды позволяет изучать механизм патогенеза и особенности цитоморфологической изменчивости Т. vaginalis.

4. Серологическая диагностика трихомониаза носит вспомогательный характер. Наибольшей иммуногенностью обладает белковый антиген Т. vaginalis с молекулярной массой 50 кДа. Данный белок является перспективным для создания иммуноферментной тест-системы для выявления противотрихомонадных IgG-антител.

1*

5

5. Создание криобанка штаммов Т. vaginalis способствует стандартизации и воспроизводимости результатов лабораторной диагностики трихомониаза.

Личный вклад автора.

Данные, представленные в работе, получены лично автором. Автором выполнены все микроскопические исследования, включая электронную микроскопию; создана база микрофотографий; проведено культивирование штаммов Т. vaginalis и поддержание их в состоянии глубокой заморозки; поддерживались клеточные линии, и осуществлялось моделирование инфекционного процесса; выполнен весь комплекс серологических исследований.

Автором лично планировались исследования, формировалась база данных и проводилась статистическая обработка и обобщение полученных результатов.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 40-й научно-практической конференции дерматовенерологов и врачей смежных специальностей Санкт-Петербурга «Актуальные проблемы дерматовенерологии. Контроль и профилактика инфекций, передающихся половым путем» (С.Петербург, 2005); Научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии» (С.-Петербург, 2006); заседаниях Санкт-Петербургского общества дерматовенерологов им. В.М. Тарновского (С.-Петербург, 2006, 2008) и Санкт-Петербургского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им И.И. Мечникова .(С.-Петербург, 2007); XI Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (С.-Петербург, 2007), V Европейском конгрессе по протистологии и XI Европейской конференции по биологии беспозвоночных (С.-Петербург, 2007), Научно-практической конференции «Актуальные вопросы этиологической диагностики инфекционных заболеваний» (Екатеринбург, 2008); Международном научно-практическом семинаре «Современные методы микроскопии в исследовании живых систем» (С.-Петербург, 2008); Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009); 1-ом Евразийском конгрессе дерматовенерологии, косметологии и эстетической медицины (Астана, Казахстан, 2009).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ, в том числе 36 - в сборниках материалов конференций, 4 статьи в журналах по перечню ВАК Минобразования и науки Российской Федерации.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения собственных данных, заключения, выводов,

практических рекомендаций и списка литературы, включающего 131 источник, в том числе 47 отечественных и 84 зарубежных. Текст содержит 18 таблиц, 1 формулу и 31 рисунок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились в период с 2006-2009 гг. Культуры Т. vaginalis получали из клинического материала пациентов, обращавшихся с жалобами на урогенитальные расстройства в клиники Санкт-Петербурга: кожно-венерологические диспансеры (КВД) №3, №4; Ленинградский областной КВД; клинику кожных и венерических болезней Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, Центральный Военно-морской госпиталь №1; Окружной Военный клинический госпиталь (ОВКГ) №442 им. Соловьева.

Для анализа морфологии Т. vaginalis использовали комплекс современных микроскопических методик в сочетании с диагностическими методами окрашивания. Микроскопию нативного препарата осуществляли по методике «раздавленная капля». Окраску клинического материала проводили 1% водным метиленовым синим (НИЦФ, С.-Петербург) и по Май-Грюнвальду-Гимзе (набор Kit Ral 555) (Réactifs RAL, Франция). Для просмотра окрашенных препаратов использовали микроскоп МИКМЕД-5 и микровизор проходящего света (iVizo-103 (ЛОМО, С.-Петербург). Регистрацию изображений проводили с помощью полифункционального исследовательского микроскопа Leica DMRXA, оснащенного фазово- и дифференциально-интерференционными контрастными (ДИК) насадками и Leica DM-1000. Электронную микроскопию трихомонад проводили методом ультратонких срезов с использованием трансмиссионного микроскопа JEM-Jeol 100М.

Для культивирования и выделения Т. vaginalis использовали модифицированный вариант питательной среды TYM с добавлением лошадиной сыворотки (Биолот, С.-Петербург), сыворотки крупного рогатого скота (Биолот, С.-Петербург), сыворотки человека и эмбриональной сыворотки коров (Биолот, С.-Петербург) и коммерческий вариант среды для выделения трихомонад (СВТ), производства отдела новых технологий НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера (С.-Петербург).

Для моделирования инфекционного процесса in vitro и характеристики вирулентных форм применяли различные клеточные линии: Нер-2 - культура клеток карциномы гортани человека, L-41 - культура клеток лимфобластоидного происхождения, MDCK - культура клеток почки собаки, MA-104 - культура клеток почки эмбриона макаки-резус, культивированные по стандартным методикам (Адаме Р., 1983) в соответствии с рекомендациями соответствующего паспорта. Монослой клеток выращивали в культуральных планшетах (Orange Scientific, Бельгия) в ростовой среде (199 и а-МЕМ, в соотношении 1:1) (Биолот, С.-Петербург). Суспензию Т. vaginalis в концентрации, соответствующим задачам исследования вносили непосредственно в среду и культивировали при 37°С и 5% С02. Учет результатов проводили в инвертированном микроскопе МИП-01 (ЛОМО, С.-Петербург) через 1, 3, 6 и 24 часа инкубации.

Фагоцитарную активность различных морфологических форм Т. vaginalis изучали по захвату клеток культуры Staphylococcus aureus АТСС 25923. В суспензию Т. vaginalis вносили S. aureus (109кл/мл), смесь инкубировали и затем фиксировали нагретым (37°С) фиксатором (MTSB буфер и 4% раствор параформальдегида). После отмывки вносили DAPI (Sigma) (5 мкг/мл), инкубировали в течение 1 часа и просматривали в конфокальном микроскопе Leica TOS SP 5.

ИФА проводили с использованием коммерческой иммуноферментной тест-системы «ТрихомоноБест-IgG стрип» (Вектор-Бест, Россия) и в модифицированном варианте, в котором в качестве иммуносорбента использовали лизатный трихомонадный антиген, полученный различными методами. Твердой фазой в ИФА служили 96-луночные плоскодонные планшеты из полистирола (Costar, США). Специфический комплекс антиген-антитело выявляли с использованием пероксидазных конъюгатов на основе моноклональных антител, направленных к изотипспецифичным эпитопам IgG, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4. Все моноклоны были получены из лаборатории гибридомных технологий ФГУ Российского научного центра радиологии и хирургических технологий Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи (руководитель д.м.н., профессор Климович В.Б.). Оптическую плотность окрашенного продукта ферментативной реакции измеряли на вертикальном фотометре Multiscan-MC (Labsystems, Финляндия) при длине волны 450 нм.

Иммуноблоттинг проводили с ультраозвученным антигеном Т. vaginalis. Электрофорез осуществляли в 12,5% разрешающем геле и концентрирующем геле при градиенте напряжения 100 В и 200 В. Перенос осуществляли на поливинилиден-дифлюоридную (PVDF) мембрану с последующей инкубацией с сыворотками больных трихомониазом (I антитела) и с конъюгатом (смесь моноклональных антител против к и X цепей, меченных ферментом пероксидаза хрена) (II антитела). Проявку мембраны осуществляли в смеси Н2О2 и хлорнафтола. Результаты иммуноблоттинга обрабатывали с использованием компьютерной программы Gel-pro31.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Микроскопические исследования различных морфологических форм Т. vaginalis

В ходе работы проведено микроскопическое исследование 1912 клинических препаратов, полученных от мужчин и женщин, обратившихся с жалобами на урогенитальные расстройства. Положительный результат был получен в 252 случаях. Т. vaginalis выявлены у 187 мужчин и 65 женщин (16,3% и 8,5%, соответственно). Использование световой микроскопии витальных препаратов позволило идентифицировать различные морфологические формы Т. vaginalis: типичные грушевидные и нетипичные округлые. Грушевидные формы Т. vaginalis были выявлены у 47 больных (25,1%), округлые у 140 (74,9%).

При анализе результатов проведенных микроскопических методов установлены основные цитоморфологические признаки округлого морфотипа Т. vaginalis. При микроскопии нативных препаратов у трихомонад нетипичной

морфологии наблюдали значительную вакуолизацию и грануляцию цитоплазмы, отсутствие ундулирующей мембраны и аксосгиля. Отличающими признаками Т. vaginalis от дегенеративных хозяйских клеток являлись меньшие размеры трихомонад и вакуолизация цитоплазмы.

При исследовании фиксированных окрашенных метиленовой синью препаратов клетки округлого морфотипа трихомонад трудно дифференцировать от других клеточных элементов. По-видимому, фиксация препаратов и взаимодействие с красителем приводит к существенному изменению морфологии Т. vaginalis. Окрашивание препаратов по Май-Грюнвальду-Гимзе позволило четко дифференцировать округлые морфотипы по наличию сильно вакуолизированной цитоплазмы, с крупным ядром, имеющим неравномерно прокрашенные зоны, отчетливых жгутиковых корешков и свободных жгутиков, лежащих на поверхности клетки, окрашенного аксостиля, не выходящего за пределы клетки. В округлых клетках отсутствовала ундулирующая мембрана. При использовании данной окраски выявляли значимые дифференциальные отличия различных морфотипов Т. vaginalis.

Округлые формы Т. vaginalis отчетливо дифференцировали при использовании фазово-контрастной микроскопии и дифференциально-интерференционного контраста по отсутствию подвижности, но с наличием на переднем конце укороченных, удаленных друг от друга свободных 2-3 жгутиков, отсутствием ундулирующей мембраны. Их размер существенно не отличался у мужчин (10-12 мкм) и у женщин (12-14 мкм).

При сравнительной оценке микроскопических подходов в дифференцировке Т. vaginalis округлой формы фазово-контрастная микроскопия и дифференциально-интерференционный контраст были наиболее информативными. Данные виды микроскопии позволили однозначно дифференцировать все доступные на светооптическом уровне цитоморфологические признаки округлых клеток Т. vaginalis: форму и размеры ядра, вакуолизацию цитоплазмы, наличие жгутиков. Характерная структура цитоплазмы округлых форм Т. vaginalis была связана с наличием особых органелл - гидрогеносом.

Микроскопические методы лабораторной диагностики трихомониаза являются первоочередными при проведении скрининговых исследований. Результаты данного исследования имеют особую ценность, поскольку предоставляют экспрессные данные о характере заболевания и течении инфекционного процесса.

Для изучения ультраструктурных особенностей различных морфотипов Т. vaginalis провели электронную микроскопию. Показали, что округлая и грушевидная форма Т. vaginalis имеют общий план строения клетки. Однако у округлых форм в цитоплазме клетки отмечали характерные изменения по сравнению с грушевидными клетками (табл. 1).

У округлых морфологических форм Т. vaginalis наблюдали частичную, структурную деградацию синтетического аппарата, редукцию околоядерной эндоплазматической сети и связанной с ней аксостилярной области, редукцию транс Гольджи сети, изменение характера содержимого гидрогеносом, изменение структуры хромосомного аппарата.

Подобные изменения указывают на снижение метаболической активности Т. vaginalis округлого морфотипа по сравнению с грушевидными.

Таблица 1

Сравнительная характеристика цитоморфологических форм Т. vaginalis

Признак Проявление признака у морфотипов Т. vaginalis

грушевидная округлая

конденсация хромосом наблюдается наблюдается

зона околоядерного ЭПР присутствует отсутствует

аппарат Гольджи состоит из нескольких диктиосом типичные диктиосомы отсутствуют

расположение рибосом равномерное неравномерное

ундулирующая мембрана присутствует отсутствует

расположение кинетосом жгутиков 4 кинетосомы параллельно друг к другу, 1 - под углом 5 кинетосом параллельно друг к другу

аксостиль присутствует отсутствует

пельта отчетливо выражена частично редуцирована

содержимое гидрогеносом плотный гомогенный матрикс частичная деградация матрикса

Анализ параметров роста Т. vaginalis in vitro, моделирование инфекционного процесса и создание банка штаммов

Задача оптимизации условий культивирования и состава сред остается чрезвычайно актуальной на сегодняшний день. Особенности метаболизма и физиологии Т. vaginalis полностью не исследованы, поскольку культивирование штаммов in vitro приводит к потере вирулентности (Honinberg В.М., 1990; Benchimol М., 2004). Успешное решение проблемы культивирования существенно разовьет фундаментальные исследования биологии трихомонад и будет способствовать эффективной диагностике трихомониаза.

Оптимизация питательной среды для культивирования Т. vaginalis

В качестве основы была выбрана питательная среда Trypticase yeast medium (TYM), рекомендуемая в качестве «золотого стандарта» для культуральной диагностики трихомониаза, а таюке для поддержания штаммов (Diamond L.S., 1957; Poch F., 1996; Clärk C.G., Diamond L.S., 2002). Многие исследователи предлагают вносить в состав среды сыворотки различного происхождения. Однако в доступной литературе отсутствуют данные о влиянии источника сыворотки на рост вирулентных форм Т. vaginalis.

В исследования были включены различные варианты среды TYM с добавлением лошадиной сыворотки (№1), сыворотки крупного рогатого скота (№2), сыворотки человека (№3), эмбриональной сыворотки коров (№4), в качестве контроля использовали среду без добавления сыворотки (№5). Количественный и дифференциальный подсчет клеток проводили в камере Горяева на 3,4, 5, 7 и 9 сутки культивирования.

Все среды характеризовались длительным (2-4 суток) лаг-периодом; самую короткую лаг-фазу наблюдали на среде №3, самую продолжительную -на среде №2. Максимальный прирост клеток зарегистрировали на среде №4 (в среднем до 65,0 х 108 кл/мл) на 5-е сутки, причем концентрация клеток не сокращалась до окончания опыта. Минимальный прирост клеток был на среде №1 (в среднем до 26,0 х 108 кл/мл) на 4-е сутки. Динамика роста числа клеток на среде №2 сходна с таковой на среде №4, однако максимальные концентрации существенно ниже (до 42,0 х 108 кл/мл). Раньше всего (на 4-е сутки) наблюдали максимальные концентрации на среде №3 (до 51,0 х 108 кл/мл); при этом уже через сутки концентрация резко сокращалась (рис. 1).

Сроки культивирования, сут.

-TYM с лошадиной сыв-ой № 1 —*— TYM с сыв-ои КРС №2

— • - TYM с сыв-ой человека №3 —*— TYM с эмбриональной сыв-ой №4 ----TYM без сыв-ки №5

Рисунок 1. Сравнительная характеристика роста Т. vaginalis на среде TYM, обогащенной различными сыворотками

При микроскопировании показано, что переход грушевидных клеток в округлые происходил в период накопления максимальных концентраций; на среде №5 практически сразу, на среде №1 - на 3-й сутки, на среде №3 - на 4-е, на среде №4 - на 5-е. Дольше всего - 7 суток - поддерживались грушевидные клетки (до 75% популяции) на среде №2 (рис. 2).

Результаты проведенного исследования показали, что сыворотка крови является неотъемлемым компонентом питательной среды, в её отсутствие (среда №5) не происходило размножения трихомонад, грушевидные формы теряли подвижность, превращались в округлые.

Сроки культивирования, сут.

-TYM с лошадиной сыв-ой № 1 —— TYM с сыв-ой КРС №2

---TYM с сыв-ой человека ЛЬЗ —TYM с эмбриональной сыв-ой №4

----TYM без сыв-ки №5

Рисунок 2. Доля подвижных грушевидных клеток Т. vaginalis в процессе культивирования на разных средах.

Для накопительных культур благоприятна среда №3 (с сывороткой человека), поскольку быстрее всего происходило накопление характерных грушевидных клеток. Следует отметить, что эта стадия очень кратковременная, немедленно вслед за накоплением максимальных концентраций начинался переход в округлые формы и гибель трихомонад. Эта среда может использоваться для диагностики трихомониаза. Продолжительней всего грушевидные формы поддерживались на среде №2 (с сывороткой крупного рогатого скота). Сочетание достаточно высокого прироста числа клеток и стабильность морфологии позволило рекомендовать эту среду для поддержания штаммов и для диагностических целей.

Для накопления максимальной биомассы и поддержания штаммов трихомонад в лаборатории можно рекомендовать среду №4 (с эмбриональной сывороткой). Эта среда позволяет накапливать не только грушевидные, но и округлые формы. На 5-е сутки на этой среде происходит переход в округлые формы, причем концентрация клеток не сокращается, а даже несколько увеличивается. Однако высокая стоимость этой сыворотки ограничивает возможность ее широкого использования в клинических лабораториях.

Сыворотка крупного рогатого скота является оптимальной для внесения в основу питательной среды TYM для культуральной диагностики Т. vaginalis. Следует особо отметить, что при данном методе положительным результатом является также регистрация в образцах округлых неподвижных морфотипов трихомонад.

Оптимизация условий культивирования Т. vaginalis при моделировании инфекционного процесса

Для оптимизации условий культивирования Т. vaginalis использовали математическую модель полнофакторного эксперимента. Оптимизацию проводили при моделировании инфекционного процесса с использованием двух контролируемых факторов: клеточных линии клеток (фактор А) и вариантов питательной среды TYM, обогащенных сыворотками (фактор В). Клеточные линии подразделялись на 3 уровня - Нер-2 (рак гортани человека); МА-104 (эмбриональный почечный эпителий макаки резус); MDCK (почечный эпителий собаки), а среда TYM на 5 уровней: без сыворотки (с), с сывороткой крупного рогатого скота (КРС), эмбрионов коров (СЭК), лошадиной (J1C) и человека (СЧ).

Результаты предварительного анализа показывали, что на 3-е сутки культивирования достигается максимальный рост Т. vaginalis в среднем до 20,0 х 108 кл/мл. Этот срок культивирования был выбран для оценки степени влияния изучаемых факторов на рост Т. vaginalis.

Оценку степени влияния (Kj) факторов клеточной линии и питательной среды, а также их взаимодействия на прирост Т. vaginalis рассчитывали по величине сумм квадратов отклонений данного показателя от средних значений по формуле:

100x55;

Kj - степень влияния, в %

SSj - сумма квадратов отклонений параметра (прироста Т. vaginalis) от среднего значения вследствие влияния на него факторов (клеточной линии и среды) SS - общая сумма квадратов отклонений параметра (прироста Т. vaginalis) от среднего значения вследствие влияния на него всех контролируемых, неконтролируемых, случайных факторов и ошибок измерения.

Контролируемые факторы и их взаимодействие объяснили основную часть дисперсии на 80,0% (табл. 2).

Таблица 2

Оценка степени влияния различных факторов на величину коэффициента позитивности

Факторы SS Степень влияния (.Ш % Р

Клеточная линия 90987,6 25 <0,001

Питательная среда ТУМ 161727,7 44 <0,001

Взаимодействие линии и среды 40521,2 11 <0,01

^Контролируемые факторы 293236,8 80 <0,001

П.Неконтролируемые случайные факторы и ошибки 73917,2 20

Все факторы 367153,7 100

Степень их влияния значима (р<0,001). Из контролируемых факторов наибольшее влияние оказывала питательная среда (44,0%) и в меньшей степени взаимодейс твие двух фактором одновременно - линия клеток и среда (11,0%).

Средние значения и 95% доверительные интервалы на различных уровнях факторов представлены па рис. 3 и 4 и при их сочетаниях (рис.5).

250 t™-—----------— л зга

200 '1 250

о

X IÎ0 ! = 100 3 50 о

Нер-2 MA-104 MDCK g "

клето'шоя линял

■ I I .llll

тт гше TYM t VVMC TYM t

без с KPC DC ЛС СЧ

1-Г -ц: ......С среди

Рисунок 3. Концентрации T. vagitialis !ia 3-е сутки культивирования при использовании различных клеточных линий

Рисунок 4. Концентрации Т. vaginalis на 3-е сутки культивирования гтри Использовании различных модификаций питательной среды TYM

Рисунок 5. Концентрации Т. vaginalis при различных сочетаниях клеточных линий и питательных сред

Оценка эффективных концентраций Т. vaginalis при моделировании инфекционного процесса in vitro

Для определения минимальной инфицирующей концентрации Т. vaginalis в отношении клеточного монослоя был смоделирован инфекционный процесс с использованием клеточных линий Нер-2 и L-41.

При инфицировании монослоя штаммами Т. vaginalis в концентрации хЮ8 кл/мл его полное разрушение происходило в течение первого часа. При инфекционной дозе хЮ6 кл/мл начальную деструкцию монослоя наблюдали через 12 часов инкубации, а полное его разрушение - в течение 24 - 48 часов, в это же время концентрация паразита достигала максимума - 107 кл/мл. При инфекционной дозе х 104 и xl О2 кл/мл деструкцию клеточного монослоя отмечали через 36 ч и 48 ч, а полное разрушение - через 96 часов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что разрушение монослоя начинается при концентрациях трихомонад на порядок меньших концентраций эпителиальных клеток. Полная деструкция монослоя наступала при уравнивании концентраций паразита и хозяина. Отмечено также, что динамика инфекционного процесса не зависит от типа клеточной культуры и штамма паразита.

Анализ цитоморфологических изменений Т. vaginalis при контакте с клеточными линиями

Изучение цитоморфологических изменений Т. vaginalis проводили в условиях in vitro с использованием линий L-41 и Нер-2 путем окрашивания препаратов по Май-Грюнвальду Гимзе и нативной микроскопии.

На начальной стадии взаимодействия популяции грушевидных подвижных морфотипов Т. vaginalis с монослоем происходило их прикрепление к монослою. Морфология трихомонад изменялась с грушевидной на амебоидную форму с потерей жгутиковой подвижности, но с сохранением свободных жгутиков, происходила редукция ундулирующей мембраны, изменялось положение аксостиля, формировались псевдоподии. Через 12 ч инкубации в зонах разрушенного монослоя образовывался псевдоплазмодий трихомонад. В популяции амебоидных форм трихомонад отмечался значительный полиморфизм по размерам и форме, при этом около 25% клеток были двуядерные или многоядерные у которых отчетливо выявлена амплификация жгутикового аппарата. Эти формы являются делящимися клетками с отложенным цитокинезом. Однако при окрашивании картины деления отличались от таковых у грушевидных форм. Процент делящихся клеток в популяции грушевидных форм составил всего 6-7%. По мере разрушения монослоя часть амебоидных форм теряла контакт с клетками - хозяевами. В суспензии появлялись, округлые неподвижные, сильно вакуолизированные формы, сохраняющие морфологию амебоидных форм, но не формирующие псевдоподии. После полного разрушения монослоя у паразита прекращалось активное деление, и округлая форма переходила в типичную грушевидную с ундулирующей мембраной, выраженным аксостилем и с гомогенной цитоплазмой. Полученные на модели in vitro данные позволили описать округлые и амебоидные морфотипы как стадии инфекционного процесса. Их

морфология варьировала в зависимости от степени прикрепления простейших к клеткам-хозяевам. Наличие округлых клеток в клиническом материале моя;ет свидетельствовать о наличии активной стадии инфекции. Типичные грушевидные формы, появляющиеся при полном разрушении монослоя в эксперименте in vitro и, по-видимому, в условиях in vivo, могут рассматриваться как расселительная стадия.

Изучение фагоцитарной активности у различных морфотипов Т. vaginalis

Для оценки вирулентности и жизнеспособности различных морфотипов Т. vaginalis проводили исследование по изучению их способности к фагоцитозу. Исследовался фагоцитоз у грушевидных, округлых и амебоидных морфотипов Т. vaginalis (7,0 - 8,0 х 105 кл/мл) при инкубации со Staphylococcus aureus (xl О9 кл/мл). Фагоцитоз рассматривается некоторыми исследователями как фактор вирулентности у трихомонад (Pereira-Neves A., Benchimol М., 2007). Оценивали содержание бактерий в цитоплазме простейшего с использованием конфокальной микроскопии методом прямого учета. Только конфокальная микроскопия позволяет достоверно судить о расположении частиц: на поверхности, под клеткой, или внутри нее. Показали, что грушевидные, округлые и амебоидные морфотипы Т. vaginalis способны к фагоцитозу S. aureus. Фагоцитарная активность сокращалась в ряду амебоидные (5-12 бак./кл.) > грушевидные (5-6 бак./кл) > округлые (2-3 бак./кл.) морфотипы. На основании оценки фагоцитарной активности, наиболее вирулентными являются амебоидные морфотипы, в то же время округлые наименее вирулентные, однако их следует рассматривать как жизнеспособные, а не дегенеративные формы.

Криокоисервация штаммов Т. vaginalis

На первом этапе проводили очистку штаммов Т. vaginalis от бактериально-микотической флоры. Процедуру очистки проводили на 9 штаммах Т. vaginalis Длительность очистки составляла по срокам от двух недель до двух месяцев и зависела от исходной контаминации штамма трихомонад. В смесь культуральной среды (а-MEM и 199) вводили комплекс из пяти антибиотиков (бензилпенициллина, стрептомицина, канамицина, линкомицина, гентамицина) по 400-600 ЕД/мл, а также амфотерицин В - 5 ЕД/мл. Длительность обработки для разных штаммов Т. vaginalis различалась и находилась в пределах от 5-6 пассажей до 10-15. Далее проводили «быстрое» пассирование Т. vaginalis на образцах монослоя L-41 или Нер-2 с длительностью контакта от 3-4 часов до 24 часов и с сохранением 50% монослоя с адгезировнными трихомонадами. Данные процедуры многократно повторяли до получения чистой культуры Т. vaginalis. Полученную суспензию трихомонад ресуспендировали в криозащитной среде, содержащей 30% сыворотки КРС, 5-7% ДМБО и 5% ростовой среды для культур клеток. Проводили стадийное замораживание: +20°С +3°С —» -30 С (охлаждение 1°С в мин. в спиртосодержащей жидкости) —> -55°С (охлаждение 5°С в мин.) —*■ -70°С —» -196 С. Процесс размораживания осуществляли при температуре от +40 до +45°С. Жизнеспособность всех штаммов трихомонад

находилась в пределах от 70 до 90%. Криобанки были подготовлены для 9 штаммов Т. vaginalis.

Изучение информативности серологической диагностики трихомониаза

Для выяснения роли серологического метода, в частности, иммуноферментного анализа для диагностики трихомониаза, нами была сконструирована ИФА тест-система на основе цельноклеточного антигена Т. vaginalis, полученного методом ультраозвучивания. Оптимизация концентрации антигена проводили в пределах от 5 мкг/мл до 30 мкг/мл (рис. 6).

концентрация ультраозвученного антигена, мкг/мл

Рисунок 6. Зависимость коэффициента позитивности в ИФА от концентрации трихомонадного антигена, полученного методом ультраозвучивания.

Оптимальная концентрация антигена Т. vaginalis составила 15 мкг/мл (рис. 6). Тестировали панель сывороток крови 89 пациентов, полученных от мужчин и женщин с диагнозом трихомониаз. Общая чувствительность обнаружения специфических иммуноглобулинов составила 30,3% (п=27). У женщин частота обнаружения положительных результатов в ИФА была выше (66,7%), по сравнению с мужчинами (8,9%) (р<0,05). В частности у женщин с острой формой трихомониаза чувствительность ИФА составила 91,7%, а у мужчин 3,4%.

Высокая чувствительность ИФА у женщин обусловлена преобладанием в клиническом материале от них грушевидных, подвижных морфотипов трихомонад. В материале, полученном у мужчин, в большинстве случаев выявлялись округлые морфотипы. По-видимому, грушевидные формы обладают более выраженной иммуногенностью и характеризуются наличием большего количества антигенов. Другим предположением является анатомо-физиологические особенности урогенитального тракта. У женщин в урогенитальном тракте вследствие благоприятных условий существования - рН, наличие факторов роста наблюдается большая концентрация возбудителя. У мужчин вследствие анатомических особенностей регулярное мочеиспускание

приводит к постоянному изменению физико-химических условий в уретре и снижению концентрации возбудителя. Предполагается, что высокая интенсивность формирования пула антителопродуцирующих лимфоцитов и последующая выработка иммуноглобулинов в организме женщин может быть связана со сравнительно большей площадью взаимодействия микробных антигенов и слизистых оболочек урогенитального тракта.

Анализ результатов проведенного ИФА по обнаружению противотрихомонадных подклассов иммуноглобулинов IgG у больных трихомониазом позволил выявить несколько типов иммунного ответа. Первый тип иммунного ответа характеризовался абсолютным преобладанием субизотипов IgG2. При втором типе иммунного ответа наблюдались подклассы IgG2 и IgG3. Третий тип иммунного ответа отличался относительным преобладанием в пуле противотрихомонадных антител субизотипа G3. Известно, что по синтезу иммуноглобулинов класса G, можно предположить химическую природу антигенов, преимущественно реагирующих в составе иммуносорбента. По всей вероятности при первом типе в связывании антител основное место принадлежит полисахаридам, а при третьем антигенам белковой природы. Второй тип иммунореактивности может быть связан с антителами, как к белковым, так и полисахаридным антигенам.

Проведенный иммунноблоттинг показал, что наибольшей иммуногенностью обладает белковый антиген с молекулярной массой 50 кДа, который может быть перспективным для создания его искусственного аналога. Молекулярная масса 50 кДа соответствует массе основных цитоскелетных белков, образующих корешковую систему внутри клетки простейшего, один из этих белков - актинин уже был описан как специфичный антиген (Addis M.F. et al, 1999).

ВЫВОДЫ

1. При лабораторной диагностике трихомониаза микроскопическими и культуральными методами в большинстве случаев выделяются нетипичные округлые, неподвижные морфотипы Т. vaginalis (74,9%). Применение фазово-контрастной микроскопии и дифференциально-интерференционного контраста позволяет дифференцировать все доступные цитоморфологические признаки округлого морфотипа, что повышает эффективность витальной микроскопии. Использование электронной микроскопии показало наличие деления у округлых морфотипов Т. vaginalis, что свидетельствует об их принадлежности к одной из стадии жизненного цикла простейшего.

2. При взаимодействии типичных грушевидных морфотипов Т. vaginalis с монослоем происходит переход в амебоидные морфотипы. При потере контакта данные формы переходят в округлые морфотипы, а полное разрушение монослоя индуцирует переход в грушевидный морфотип. В разработанной модели инфекционного процесса in vitro происходит воспроизведение нетипичных цитоморфологических форм Т. vaginalis, являющихся активно размножающимися стадиями жизненного цикла.

3. Комбинация питательной среды TYM с сывороткой крупного рогатого скота и клеточной линией MDCK позволяет достичь максимальной

концентрации Т. vaginalis, что способствует повышению эффективности культуралыюй диагностики трихомониаза.

4. Наличие фагоцитарной активности доказывает жизнеспособность нетипичных округлых и амебоидных цитоморфологических форм Т. vaginalis. При лабораторной диагностике трихомониаза должны учитываться все цитоморфологические формы клинических изолятов 'Г. vaginalis.

5. Разработанная методика криоконсервации штаммов Т. vaginalis позволяет создать банк референтных штаммов простейших, сохраняющих свои биологические свойства в течение 2-х лет, что необходимо для повышения качества лабораторной диагностики трихомониаза.

6. Иммуноферментная тест-система по обнаружению противотрихомонадных IgG-ангител на основе цельноклеточного антигена Т. vaginalis имеет общую чувствительность 30,3% и может использоваться только в качестве вспомогательного метода исследования. При острой форме трихомониаза ИФА имеет высокую чувствительность у женщин (91,7%), по сравнению с мужчинами, у которых этот показатель составляет 3,4%.

7. Трихомонадный антиген с молекулярной массой 50 кДа обладает наибольшей иммуногенностью и может быть рекомендован для стандартизации серологической диагностики трихомониаза путем введения его искусственного аналога в состав иммуносорбента.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Результаты исследования предназначены для использования специалистами в области клинической лабораторной диагностики, микробиологии и дерматовенерологии в медицинских учреждениях.

2. Грушевидные, округлые и амебоидные морфотипы жизнеспособны и являются стадиями инфекционного процесса. При микроскопической диагностике трихомониаза необходимо учитывать все морфологические формы Т. vaginalis

3. Для культуральной диагностики трихомониаза предпочтительно использовать питательную среду TYM, обогащенную сывороткой крупного рогатого скота, в связи с длительным поддержанием на ней округлых морфотипов.

4. Для повышения диагностической эффективности культуральной диагностики трихомониаза по выявлению нетипичных цитоморфологических форм Т. vaginalis необходимо применять комбинацию клеточной линии MDCK и среды TYM с сывороткой крупного рогатого скота.

5. Криоконсервацию Т. vaginalis целесообразно проводить при следующих условиях: очистка штаммов смесью антибиотиков (бензилпенициллина, стрептомицина, канамицина, линкомицина, гентамицина и амфотерицин В); многократное пассирование на монослое; помещение в криозащитную среду (30% сыворотки КРС, 5-7% ДМБО и 5% ростовой среды для культур клеток), стадийное замораживание от +20°С до —* -70°С —► -196°С и размораживание при +40.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в периодических научных изданиях, рекомендованных ВАК

1. Раводин P.A. Проблемы диагностики урогенитального трихомониаза / P.A. Раводин, И.Н. Теличко, Н.В. .Раздольская // Журн. акушерства и женских болезней. - 2004. - T. LUI. - С. 129-130.

2. Теличко И.Н. Современные диагностические аспекты мочеполового трихомониаза / И.Н. Теличко, P.A. Раводин, A.M. Иванов, Н.В. Раздольская, А.Б. Криворучко // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2006. - № 2.-С. 60-63.

3. Раздольская Н.В. Особенности диагностики мочеполового трихомониаза / Н.В. Раздольская, И.Н. Теличко, P.A. Раводин, A.M. Иванов // Клин, дерматология и венерология. - 2006. - № 3. - С. 17-20.

4. Теличко И.Н. Современный взгляд на микроскопический метод диагностики мочеполового трихомониаза / И.Н. Теличко, A.M. Иванов, Н.В. Раздольская, А.Б. Криворучко // Клинич. дерматология и венерология. - 2007. -№ 2. - С. 28-32.

Статьи в журналах и тезисы конференций

5. Теличко И.Н. Проблемы лабораторной диагностики трихомоноза / И.Н. Теличко, A.M. Иванов, P.A. Раводин, Н.В. Раздольская // Мат. VI Российского съезда врачей-инфекционистов. - СПб, 2003. - С. 375.

6. Иванов A.M. Актуальные проблемы диагностики урогенитального трихомониаза / A.M. Иванов, И.Н. Теличко, P.A. Раводин, Н.В. Раздольская, Ю.Г. Горбунов // Журнал дерматовенерологии и косметологии. - 2004,- № 1. -С. 17-21.

7. Теличко И.Н. Изменение содержания половых гормонов сыворотки крови у лиц с хроническим специфическим уретрогенным простатитом / И.Н. Теличко, P.A. Раводин, Н.В. Раздольская, A.M. Иванов, Ю.Г. Горбунов // Журн. дерматовенерологии и косметологии. - 2004. - № 2. - С. 32-34.

8. Раводин P.A. Современные аспекты диагностики урогенитального трихомониаза / P.A. Раводин, И.Н. Теличко, Н.В. Раздольская // Актуальные вопросы дерматовенерологии: Сб. тр. научно-практ. конф., поев. 80-летию иркутского областного кожно-венерологического диспансера. - Иркутск, 2004. -С. 132-133.

9. Теличко И.Н. ПЦР в диагностике урогенитального трихомониаза / И.Н. Теличко, P.A. Раводин, Н.В. Раздольская, A.M. Иванов // Сб. тр. науч. конф. с международным участием «Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций». - СПб, 2004. - С. 198-199.

10. Раздольская Н.В. Совершенствование микроскопической диагностики урогенитального трихомониаза / Н.В. Раздольская, P.A. Раводин, И.Н. Теличко, A.M. Иванов // Мат. Рос. науч.-практ. конф. «Узловые вопросы борьбы с инфекцией». - СПб, 2004. - С. 198-199. "

11. Раводин P.A. Клинико-лабораторная диагностика мочеполового трихомониаза у мужчин / P.A. Раводин, Н.В. Раздольская, A.M. Иванов // Мат.

Рос. научно-практ. конф. дерматовенерологов «Санкт-Петербургские дерматологические чтения». - СПб, 2005. - С. 93.

12. Раводин P.A. Клинико-лабораторная диагностика мочеполового трихомониаза у женщин / P.A. Раводин, Н.В. Раздольская, A.M. Иванов // Мат. Рос. научно-практ. конф. дерматовенерологов «Санкт-Петербургские дерматологические чтения». - СПб, 2005. - С. 93.

13. Раздольская Н.В. Ультраструктурные особенности различных морфотипов влагалищных трихомонад / Н.В. Раздольская, О.В. Гаврилова, A.M. Иванов, И.Н. Теличко, P.A. Раводин, Е.В. Ходосевич, А.Б. Криворучко // Мат. Рос. науч.-практ. конф., посвящ. 110-летию кафедры инфекционных болезней ВМедА им. С.М. Кирова «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины». - СПб, 2006. - С. 71-72.

14. Раздольская Н.В. Цитоморфологические особенности Т. vaginalis / Н.В. Раздольская, И.Н. Теличко, A.M. Иванов, А.Б. Криворучко, О.В. Гаврилова, Е.В. Ходосевич // Мат. IV науч.-практ. конф. памяти проф. A.JI. Машкилейсона. - М., 2006. - С. 143-144.

15. Теличко И.Н. Микробиологическая характеристика хронического трихомониаза в современных условиях / И.Н. Теличко, A.M. Иванов, Н.В. Раздольская, Е.В. Ходосевич, А.Б. Криворучко, Д.В. Заславский // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2007. - № 1. - С. 453.

16. Теличко И.Н. Иммунокоррегирующая терапия у больных хроническим трихомониазом / И.Н. Теличко, Н.В. Раздольская, А.Б. Криворучко, A.C. Симбирцев, A.M. Иванов // Мат. науч.-практ. конф. «Актуальные вопросы диагностики и терапии трудноизлечимых заболеваний кожи». - СПб, 2007. - С. 79-81.

17. Теличко И.Н. Способ определения чувствительности Т. vaginalis к метронидазолу / И.Н. Теличко, A.M. Иванов, Н.В. Раздольская, А.Б. Криворучко, Д.В. Заславский // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2007. -№ 1.-С.454.

18. Теличко И.Н. Влияние комплексной терапии на показатели иммунного статуса у больных хроническим трихомониазом / И.Н. Теличко, A.M. Иванов, Н.В. Раздольская, Д.В. Заславский, A.C. Симбирцев // Аллергология и иммунология. - 2007. - Т. 8, № 1. - С. 96-97.

19. Теличко И.Н. Перспективы серологической диагностики трихомониаза / И.Н. Теличко, A.M. Иванов, Н.В. Раздольская, P.A. Раводин, Е.А. Базолина // Медицинская иммунология. - 2007. - Т. 9, № 2-3. - С. 249-250.

20. Раздольская Н.В. Подклассы специфических IgG при трихомониазе / Н.В. Раздольская, И.Н. Теличко, A.M. Иванов, В.Б. Климович, Е.А. Базолина // Медицинская иммунология. - 2007. - Т. 9, № 2-3. - С. 250.

21. Теличко И.Н. Клинические особенности хронического трихомониаза / И.Н. Теличко, A.M. Иванов, Е.В. Ходосевич, Н.В. Раздольская, А.Б. Криворучко, Д.В. Заславский // Вестник Российской Военно-мсдицинской академии. - 2007. -С. 452.

22. Теличко И.Н. Клинико-микробиологические особенности трихомониаза в современных условиях / И.Н. Теличко, A.M. Иванов, Н.В. Раздольская, А.Б.

Криворучко // Мат. науч.-практ. конф. «Актуальные вопросы диагностики и терапии трудноизлечимых заболеваний кожи». - СПб, 2007. - С. 81-82.

23. Теличко И.Н. Изучение клинической эффективности иммуномодулятора бестим при хроническом трихомониазе / И.Н. Теличко, Н.В. Раздольская, А.Б. Криворучко, A.M. Иванов, A.C. Симбирцев // Тез. докл. XIV Рос. конгресса «Человек и лекарство». - М., 2007. - С. 590-591.

24. Раздольская Н.В. Сравнительная характеристика питательных сред для культивирования Т. vaginalis / Н.В. Раздольская, A.M. Иванов, И.Н. Теличко,

B.Н. Вербов, А.Б. Криворучко // Мат. IX съезда ВНПОЭМП «Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения РФ». - М., 2007. - С. 36-37.

25. Раздольская Н.В. Изучение ультраструктурной организации вирулентных форм Trichomonas vaginalis / Н.В. Раздольская, O.B. Гаврилова, И.Н. Теличко, A.M. Иванов, А.Б. Криворучко // Рос. биомед. журн. Medline.ru. -2007.-Т. 8,№7.-С. 283-291.

26. Криворучко А.Б., Сердюцкая М.В., Овсянников Ф.А., Раздольская Н.В., Иванов A.M. Методологические подходы к созданию системы контроля качества микробиологических исследований / А.Б. Криворучко, М.В. Сердюцкая, Ф.А. Овсянников, Н.В. Раздольская, A.M. Иванов // Мат. юб. Рос. научной конф. с межд. участием, поев. 175-летию со дня рождения С.П. Боткина. - СПб, - 2007. -

C. 288-289.

27. Раздольская Н.В. Значение микроскопического и культурального методов в диагностике трихомониаза / Н.В. Раздольская, И.Н. Теличко, A.M. Иванов, А.Б. Криворучко // Мат. юбил. Рос. науч. конф. с международным участием, посвящ. 175-летию со дня рождения С.П. Боткина. - СПб, 2007. - С. 283

28. Razdolskaya N. Peculiarity of the clinical isolates of Trichomonas vaginalis / N. Razdolskaya, O. Gavrilova, A. Ivanov, I. Telichko, A. Krivoruchko // Protistology An International Journal. - 2007. - Vol. 5, №1. - P. 66-67.

29. Теличко И.Н. Клинико-иммунологические особенности урогенитального трихомоноза / И.Н. Теличко, A.M. Иванов, Н.В. Раздольская, A.C. Симбирцев, А.Б. Криворучко // Рос. биомед. журн. Medline.ru. - 2007. - Т. 8, №7. - С. 637-646.

30. Теличко И.Н. Перспективы серологической диагностики трихомоноза / И.Н. Теличко, A.M. Иванов, Н.В. Раздольская, А.Б. Криворучко // Лабораторная диагностика - Terra Medica. - 2007. - № 3. - С. 18-21.

31. Раздольская Н.В. Особенности ультраструктурной организации вирулентных форм Trichomonas vaginalis / Н.В. Раздольская, O.B. Гаврилова, A.M. Иванов, И.Н. Теличко, А.Б. Криворучко, В.А. Андреев. // Труды научно-исследоват. центра ВМедА им. С.М. Кирова, выпуск И, «Актуальные вопросы профилактической медицины». - СПб, 2008. - С. 71-80.

32. Раздольская Н.В. Перспективы микробиологической диагностики трихомониаза / Н.В. Раздольская, И.Н. Теличко, A.M. Иванов, М.В. Титова // Сиб. журн. дерматологии и венерологии. - 2008. - № 9. - С. 123.

33. Раздольская Н.В. Новый подход к повышению информативности серологической диагностики трихомоноза / Н.В. Раздольская, А.Б. Криворучко,

И.Н. Теличко, A.M. Иванов // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2008. - № 22. - С. 190.

34. Раздольская Н.В. Патогенность Trichomonas vaginalis в экспериментах in vitro / Н.В. Раздольская, Л.Ф. Литвинчук, A.M. Иванов, А.Б. Криворучко, О.В. Гаврилова, И.Н. Теличко, В.Н. Вербов // Мат. IV межд. конф., поев. 85-летию СПб НИИЭМ им. Пастсра и 120-летию Парижского ин. Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». - СПб, 2008. - С. 68.

35. Раздольская Н.В. Совершенствование метода культивирования Т. vaginalis / Н.В. Раздольская, A.M. Иванов, А.Б. Криворучко, Л.Ф. Лигвинчук // Мат. V съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. - М, 2008. - С. 283-284.

36. Раздольская Н.В. Исследование способности к фагоцитозу у различных морфотипов возбудителя трихомониаза (Trichomonas vaginalis) / Н.В. Раздольская, О.В. Гаврилова, A.M. Иванов // Мат. межд. научно-метод. семинара «Современные методы микроскопии в исследовании живых систем». - СПб, 2008.-С.28.

37. Раздольская Н.В. Особенности культуральной диагностики урогенитального трихомониаза / Н.В. Раздольская, A.M. Иванов, А.Б. Криворучко, О.В. Протасов, А.В. Апчел // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2009. - № 25. - С. 377-378.

38. Иванов A.M. Иммунологическая эффективность иммуномодулятора Ликопида в комплексной терапии хронического трихомониаза / A.M. Иванов, В.Ю. Никитин, А.В. Болехан, И.Н. Теличко, А.В. Апчел, Н.В. Раздольская, Д.В. Заславский // Astana Medical Journal. - 2009. - № 2. - С. 149.

39. Раздольская Н.В. Инфицирование клеточных культур паразитическим простейшим Trichomonas vaginalis / Н.В. Раздольская, Л.Ф. Литвинчук, A.M. Иванов, О.В. Гаврилова // Бюллетень московского общества испытателей природы, отдел биологический. - 2009, Т. 114, вып.2, прил. 1. - С. 88-90.

40. Иванов A.M. Иммунологические особенности хронического трихомониаза / A.M. Иванов, И.Н. Теличко, А.С. Симбирцев, Н.В. Раздольская, А.В. Апчел, К.В. Артамонов. - Astana Medical Journal. - 2009. - № 2. - С. 150.

Подписано в печать 03.09.09 Формат 60x84/16

Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ №620

Типография BMA им. С.М. Кирова 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, 6

Актуальность проблемы. Trichomonas vaginalis является возбудителем одного из широко распространенных заболеваний урогенитального тракта -трихомониаза (Клименко Б.В. и др., 2001; Дмитриев Г.А., 2003; Healy G.R., Smith J.W., 1991). Высокий уровень заболеваемости трихомониазом в Российской Федерации и в мире, преобладание вялотекущих, малосимптомных форм со стертой клинической картиной заболевания, а также возможные разночтения результатов клинико-лабораторных исследований создают проблемы при постановке диагноза и лечении.

На протяжении многих десятилетий исследователи занимались изучением структурно-функциональных характеристик Т. vaginalis типичной грушевидной формы (Беднова В.Н., 1989; Овчинников Н.М., Делекторский В.В., 1986; Benchimol М., 2004). Другие нетипичные морфологические формы Т. vaginalis до сих пор описаны и изучены недостаточно полно. Сложность лабораторно-диагностических процедур при трихомониазе связана с идентификацией нетипичных округлых форм простейшего в клиническом материале, а также с их дифференцировкой от других клеточных элементов (Дмитриев Г.А., 2003; Pelrin D. et al., 1998; Krieger J.N. et al., 1999). Парадоксально, но, несмотря на то, что исследователи признают наличие различных форм простейшего, нормативные документы РФ по лабораторной диагностике урогенитального трихомониаза регламентируют дифференцировку исключительно типичных, грушевидных форм Т. vaginalis. Крайне важным в существующей ситуации является получение детальных описаний цитоморфологических характеристик всех морфотипов трихомонад необходимых для идентификации возбудителя различными методами микроскопии. Актуальным является изучение цитоморфологического полиморфизма клеток Т. vaginalis и его биологического смысла, оценка их жизнеспособности в условиях культивирования и в модели инфекции in vitro.

В связи с широким использованием в лабораторной практике дополнительных видов световой микроскопии, перспективно их внедрение в лабораторную диагностику трихомониаза. Однако до сих пор многие микроскопические подходы не апробированы на практике.

Предпочтительным методом диагностики трихомониаза является их культивирование на питательных средах (Сюч Н.И., 2000; Дмитриев Г.А. и др., 2001; Poch F., 1996). На сегодняшний день крайне ограничены сведения о метаболизме вирулентных форм, которые не удается поддерживать в периодических культурах длительное время. Составы сред не оптимальны, практически не изучено влияние условий культивирования на цигоморфологические свойства простейших. В связи с этим необходима дополнительная работа по изучению роста возбудителя in vitro.

Серологические методы исследования используются исключительно в качестве вспомогательных. Сложности интерпретации результатов иммуноферментного анализа возникают из-за отсутствия экспериментальных данных по его использованию.

Эпидемиологические исследования и изучение биологических свойств Т. vaginalis невозможно без создания коллекции вирулентных штаммов. При невозможности длительного культивирования единственным способом является криоконсервирование (Habib F.S., 2004; Malsuo А., 2007). До сих пор отсутствует методика по длительному криосохраиению Т. vaginalis, а также оценки выживаемости на разных сроках.

Знание особенностей жизненного цикла Т. vaginalis, совершенствование культивирования и хранения штаммов, апробация новых микроскопических методик и разработка подходов иммуноферментного анализа позволят значительно повысить эффективность диагностических процедур.

Цель работы: определить диагностическое значение цитоморфологических, культуральных и иммуногенных свойств Trichomonas vaginalis и обосновать рекомендации по повышению эффективности лабораторной диагностики трихомониаза.

Задачи исследования:

1. Изучить цитоморфологический полиморфизм и дать характеристики клинических изолятов Т. vaginalis с использованием различных методов микроскопии.

2. Охарактеризовать полиморфизм Т. vaginalis на культуре клеток в модели инфекционного процесса in vitro.

3. Изучить влияние условий культивирования на цитоморфологические свойства Т. vaginalis.

4. Оценить фагоцитарную активность различных цитоморфологических форм Т. vaginalis.

5. Оптимизировать методику криоконсервации Т. vaginalis, оценить ее эффективность и сформировать банк штаммов трихомонад.

6. Получить трихомонадные антигены и изучить в иммуноферментном анализе уровень и частоту обнаружения положительных результатов при выявлении противотрихомонадных IgG-антител у больных трихомониазом.

7. Оптимизировать процедуру проведения иммуноблоттинга с лизатом чистой культуры Т. vaginalis и выявить наиболее иммуногенные антигены.

Научная новизна исследования.

Впервые разработаны критерии идентификации нетипичных цитоморфологических форм клинических изолятов Т. vaginalis, выявляемых при микроскопической диагностике трихомониаза. На основе фагоцитарной активности доказана жизнеспособность нетипичных морфологических форм трихомонад. В модели инфекционного процесса in vitro установлены закономерности полиморфизма Т. vaginalis в различные стадии взаимодействия с культурами клеток. Для культуральной диагностики трихомониаза определен оптимальный состав питательной среды на основе клеточной линии MDCK с внесением сыворотки крови, позволяющей выявлять нетипичные морфотипы трихомонад на ранних сроках культивирования.

Практическая значимость.

Показано, что при микроскопической и культуральной диагностике трихомониаза наиболее часто выявляются нетипичные округлые и амебоидные цитоморфологические формы Т. vaginalis. Описанные формы трихомонад жизнеспособны, и в связи с этим они должны учитываться при лабораторной диагностике трихомониаза.

Экспериментально обоснованные оптимальные составы питательной среды TYM с внесением сыворотки крупного рогатого скота, а также клеточной линии MDCK, позволяют накапливать максимальные концентрации Т. vaginalis округлого морфотипа на ранних сроках культивирования, что повышает чувствительность лабораторной диагностики трихомониаза.

Разработанная оригинальная методика криоконсервации может быть использована для создания банка референс-штаммов Т. vaginalis, необходимого для оценки качества лабораторных исследований. Сконструированная иммуноферментная тест-система для обнаружения противотрихомонадных IgG-антител может использоваться в дополнение к существующим диагностическим подходам. Установлено, что трихомонадный антиген с молекулярной массой 50 кДа является наиболее иммуногенным и перспективен для создания его искусственного аналога с целью стандартизации серологической диагностики трихомониаза.

Личное участие автора в получении результатов.

Данные, представленные в работе, получены лично автором. Автором выполнены все микроскопические исследования, включая электронную микроскопию; создана база микрофотографий; проведено культивирование штаммов Т. vaginalis и поддержание их в состоянии глубокой заморозки; поддерживались клеточные линии, и осуществлялось моделирование инфекционного процесса; выполнен весь комплекс серологических исследований.

Автором лично планировались исследования, формировалась база данных и проводилась статистическая обработка и обобщение полученных результатов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Нетипичные округлые и амебоидные цитоморфологические формы Т. vaginalis являются жизнеспособными, участвуют в развитии инфекционного процесса и должны учитываться в лабораторной диагностике трихомониаза.

2. Охарактеризованные цитоморфологические и ультраструктурные признаки нетипичного округлого морфотипа Т. vaginalis с применением различных методов микроскопии позволяют дифференцировать их от других клеточных элементов, что является необходимым критерием для повышения эффективности микроскопической диагностики трихомониаза.

3. Разработанная модель инфекционного процесса in vitro с использованием клеточных культур и оптимизация питательной среды позволяет изучать механизм патогенеза и особенности цитоморфологической изменчивости Т. vaginalis.

4. Серологическая диагностика трихомониаза носит вспомогательный характер. Наибольшей иммуногенностыо обладает белковый антиген Т. vaginalis с молекулярной массой 50 кДа. Данный белок является перспективным для создания иммуноферментной тест-системы для выявления противотрихомонадных IgG-антител.

5. Создание криобанка штаммов Т. vaginalis способствует стандартизации и воспроизводимости результатов лабораторной диагностики трихомониаза.

Реализация и внедрение результатов исследования.

Результаты исследования внедрены в научную, учебную и лечебно-диагностическую работу Научно-исследовательского отдела передовых медико-биологических технологий НИЦ, кафедры и клиники кожных и венерических болезней, кафедры микробиологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, ГУЗ «КВД №4» и ГУЗ «Ленинградского областного КВД» (С.Петербург).

Апробация и публикация материалов исследования.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 40-й научно-практической конференции дерматовенерологов и врачей смежных специальностей Санкт-Петербурга «Актуальные проблемы дерматовенерологии. Контроль и профилактика инфекций, передающихся половым путем» (С.-Петербург, 2005); Научно-практической конференции

Актуальные вопросы дерматовенерологии» (С.-Петербург, 2006); заседаниях Санкт-Петербургского общества дерматовенерологов им. В.М. Тарновского (С.Петербург, 2006, 2008) и Санкт-Петербургского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им И.И. Мечникова (С.-Петербург, 2007); XI Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (С.-Петербург, 2007), V Европейском конгрессе по протистологии и XI Европейской конференции по биологии беспозвоночных (С.-Петербург, 2007), Научно-практической конференции «Актуальные вопросы этиологической диагностики инфекционных заболеваний» (Екатеринбург, 2008); Международном научно-практическом семинаре «Современные методы микроскопии в исследовании живых систем» (С.-Петербург, 2008); Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология' и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009); 1-ом Евразийском конгрессе дерматовенерологии, косметологии и эстетической медицины (Астана, Казахстан, 2009).

По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ, в том числе 36 - в сборниках материалов конференций, 4 статьи в журналах по перечню ВАК Минобразования и науки Российской Федерации.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения собственных данных, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 139 источников, в том числе 50 отечественных и 89 зарубежных. Текст содержит 18 таблиц, 1 формулу и 31 рисунок.

1. Результаты исследования предназначены для использования специалистами в области клинической лабораторной диагностики, микробиологии и дерматовенерологии в медицинских учреждениях.

2. Грушевидные, округлые и амебоидные морфотипы жизнеспособны и являются стадиями инфекционного процесса. При микроскопической диагностике трихомониаза необходимо учитывать все морфологические формы Т. vaginalis

3. Для культуральной диагностики трихомониаза предпочтительно использовать питательную среду TYM, обогащенную сывороткой крупного рогатого скота, в связи с длительным поддержанием на ней округлых морфотипов.

4. Для повышения диагностической эффективности культуральной диагностики трихомониаза по выявлению нетипичных цитоморфологических форм Т. vaginalis необходимо применять комбинацию клеточной линии MDCK и среды TYM с сывороткой крупного рогатого скота.

5. Криоконсервацию Т. vaginalis целесообразно проводить при следующих условиях: очистка штаммов смесью антибиотиков (бензилпенициллина, стрептомицина, канамицина, линкомицина, гентамицина и амфотерицин В); многократное пассирование на монослое; помещение в криозащитную среду (30% сыворотки КРС, 5-7% ДМБО и 5% ростовой среды для культур клеток), стадийное замораживание от +20°С до —» -70°С —> -196°С и размораживание при +40.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ