Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Морфофункциональная характеристика ядрышкового аппарата клеток при фоновых, предраковых и злокачественных заболеваниях

На правах рукописи

Бобров Игорь Петрович

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЯДРЫШКОВОГО АППАРАТА КЛЕТОК ПРИ ФОНОВЫХ, ПРЕДРАКОВЫХ И ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ЖЕЛУДКА

14.00.14 - онкология 03. 00 25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск 2005

Работа выполнена в ГОУ ВПО Алтайский государственный медицинский университет Росздрава

Научные руководители'

докгор медицинских наук, профессор Лазарев Александр Федорович

Официальные оппоненты

док юр медицинских наук Тузиков Сер! ей Александрович

Ведущая организация-

Новосибирская [ осударственная медицинская академия

Диссертационного совет Д 001. 032. 01. при НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (634009, г. Томск, пер. Кооперагивный, 5) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН

доктор медицинских наук, профессор Климачев Владимир Васильевич

кандида! медицинскии наук Завьялова Марина Викторовна

Защита состойся- "

2005 1. в__часов на заседании

Автореферат разослан «_»

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

2005 г.

В.А. Евтушенко

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Рак желудка является одним из наиболее распространенных онколот иче-ских заболеваний, занимая значительное место в структуре заболеваемости и смертности [В.И. Чиссов, В.В Сгаринский, 2000, В.М. Мерабишвили, 2001]

Неудовлетворительные результаты лечения вынуждают разрабатывать новые методы морфологической и дифференциальной диагностики для своевременного выявления данной патологии.

На всех этапах исследования рака желудка возникает большое количество нерешенных вопросов: прежде всего речь идет о пато- и морфогснетических особенностях рака желудка [П.В. Юшков., 1996]. Особое внимание исследователей привлекают предраковые изменения слизистой оболочки желудка и возможное и предсказания биоло1 ического поведения опухоли.

Дисплазия меташтазированного эпителия считается наиболее вероятным предраковым изменением [Т.А. Белоус, 2000]. Причины и факторы способствующие возникновению дисплазии в метаплазированном эпителии не ясны. Дифференциальная диагностика между дисплазиями различной степени выраженное ш, а также между тяжелой дисплазией и раком при гистологическом исследовании остается трудной задачей [Б.Н. Зырянов и соавт., 1998, Л.И. Аруин, 2002].

В последние годы в онкоморфологии все чаще стали использовать методы молекулярной биологии и медицины, в том числе с применением компьютерных систем и программною обеспечения [В.И. Новик, 2000]. Одним из таких методов является оценка активности рибосомальных генов при помощи окраски ядрышка нитратом серебра [H.H. Мамаев, С.И. Мамаева, 1992, М. Dererurni, 2000, В.М. Ковардаков, М.В. Цеслюк, 2001] Данный метод позволяет характеризовать с одной стороны пролиферативный и дифференциро-вочный потенциал клетки, а с другой стороны - не дорог, прост и не занимает у онкоморфолога слишком много времени. На этом основании применение анализа морфофункционального состояния ядрышек представляет интерес в дифференциальной диагностике предраковых заболеваний и рака желудка.

Правильная оценка степени зрелости опухолей определяет оптимальный выбор лечебных мероприятий, их объем и, в конечном итоге, прогноз заболевания, что диктует необходимость поиска новых критериев, обьективно отражающих степень зрелости новообразований и особенности их клинического течения. В связи с этим имеет актуальность поиск взаимосвязей при клинико -морфолот ическом сопоставлении между активностью рибосомальных генов и общепринятыми критериями злокачественности (глубина инвазии, наличие эмболов раковых клеток в сосудах и метастазов в регионарные лимфатические узлы, количество пораженных лимфатических узлов и площадь поражения лимфатического узла, размер новообразования, гистологический тип строения, атипия опухолевых клеюк, ядерный полиморфизм).

Приведенные данные свидетельствуют о необходимости изучения мор-фофункциональной активности ядрышковото аппарата клеток при патологии желудка Решение перечисленных дппрпгпи "п-п^цщ утпчнитк клиническое

значение изучения параметров ядрышковс т^'ВЛтЩМИЮЖМЮНМЫ'о в свою очередь даст возможность улучшить морфоло ичес§$№Л1»8Я||1$Лрен11иальную ди-

агностику для своевременною выявления данной патологии и прогноза течения заболеваний

Цель исследования

Целью диссертационной работы явилось изучение роли ядрышковых ор-1 анизаторов в дифференциальной диагностике рака желудка

Задачи исследования

1 Изучить функциональную активность ядрышковых организаторов в клетках неизмененной слизистой оболочки желудка и при атрофиче-ском гастрите.

2. Установить характер изменений ядрышкового аппарата клеток при дис-плазиях различной степени выраженности и в различных гистолошче-ских вариантах рака желудка.

3 Разработать критерии дифференциальной диагностики между высоко-дифференцированной аденокарциномой и дисплазией 1Яжелой степени на основании исследования ядрышкового аппарата клеток

4 Изучить возможность применения метода компьютерного анализа изображений в исследовании ядрышкового аппарата клеток при раке желудка.

5 Выяви 1Ь взаимосвязи между параметрами характеризующими морфо-функциональную активность ядрышковою аппарата опухолевых клеток и наиболее важными клинико - морфологическими параметрами опухолей (глубиной инвазии, метастазированием в регионарные лимфатические узлы, I истологическим типом, клинико - морфологической формой и размером опухоли).

Научная новизна

Впервые с использованием комплекса современных методов исследования (I истологического, гистохимического и морфометрического с применением компьютерных программ анализа изображений) в сравнительном аспекте изучена активность ядрышковою аппарата в ядрах эпителия слизистой оболочки желудка от нормы до рака различною Iистологического строения Выявлены достоверные различия дисплазий различной степени тяжести и гисто-погических типов рака по активности ядрышкового аппарата, что может позволить проведение морфологическою дифференциального анализа между этими процессами Прослежена связь между активностью ядрышкового аппарата и опухолевой прогрессией.

Произведен анализ активности ядрышкового аппарата в метастазирующих опухолях и опухолях без метастазов Выявлено, что в мегастазирующих опухолях активность ядрышковою аппарата значительно возрастает Установлено также возрастание активности ядрышкового аппарата опухолевых клеток в новообразованиях, где в сосудах определяли раковые эмболы. Полученные результаты говорят о том, что метастазирование в регионарные лимфатические узлы как этап опухолевой прогрессии взаимосвязано с повышением активности ядрышкового аппарата опухолевых клеток и появлением более активных клонов пролиферирующих клеток Полученные данные могут бьпь использованы при решении вопросов прогноза и лечения.

Практи честй«ц здзншдадть» -

Проведение -срвв«нтв«м»01 о анализа акшвности ядрышковою аппарат при фоновых, предрЯкейЙх" заболеваниях и раке желудка позволило вырабо-

тать новые критерии в дифференциальной диагностике между эх ими процессами. Прослежена динамика изменения активности ядрышкового аппарата опухолевых клеток при снижении дифференцировки и нарастании злокачественности опухолевого процесса.

Положения, выносимые на запишу

1. В основу дифференциальной диагностики между дисплазиями различной степени выраженности и высокодифференцированной аденокарциномой може! быть положено изучение активности ядрышкового аппарата атипичных клеток. Функциональная активность ядрышковых организаторов опухолевых клеток характеризует пролиферативную активность и возрастает по мере снижения дифференцировки опухолевых клеток. Активность ядрышкового аппарага опухолевых клеток выше в метастазирующих опухолях.

2. Компьютерный анализ изображений ядрышковою аппарага опухолевых клеток при раке желудка позволяет объективизировать оценку активности нуклеолярного аппарата опухолевых клеток при раке желудка. Суммарная площадь ядрышкоорганизирующих зон на 1 ядро взаимосвязана с площадью ядра клетки и достоверно выше в опухолях с выраженной клеточной атипией, ядерным полиморфизмом и наличием метастазов в рег ионарных лимфатических узлах.

3 Наиболее важными параметрами ядрышкового аппарата опухолевых клеток являются качественные и количественные характеристики нуклеоло-немных ядрышек. Количество и площадь нуклеолонемных ядрышек коррелирует с основными прогностически значимыми клинико - морфологическими характеристиками карцином' гистоло1 ическим типом, клеточным полиморфизмом, наличием раковых "»мболов в сосудах, наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах, количеством пораженных лимфатических узлов, площадью поражения лимфатического узла и клинико - морфологической формой роста опухоли. Апробация работы и публикации

Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на 3-м Российском научном форуме «Санкт - Петербург - Гастро - 2001»; межре-шональной научно - практической конференции «Актуальные вопросы онко-урологии и онкогинекологии» с международным участием, г. Барнаул, 5-6 июня 2002 г.; межрегиональной научно практической конференции «Актуальные вопросы онкогастроэнтерологии» г Барнаул, 6-7 июня 2003 г , межрегиональной научно - практической конференции, посвященной 10 - летию диагностического центра Алтайского края «Современные методы диагностики» г. Барнаул, 10-11 июля 2003 г ; межрегиональной научно - практической конференции «Комбинированные и комплексные методы лечения в онкологии» г. Барнаул, 13-14 мая 2004 г. Основные положения диссертации опубликованы в 34 научных работах.

Структура и объем диссер гации

Диссертация изложена на 168 страницах. Работа состоит из введения, обзора литературы, 1лавы о материалах и методах исследования, 5 глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов (заключения), выводов, практических рекомендаций, списка использованной литера-

туры, включающей 234 исючников, в юм числе 72 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 16 таблицами и 33 рисунками

Материалы и мет оды исследования

В исследовании использовали операционный и биопсийный материал. Операционный материал включал желудки, удаленные по поводу тистологи-чески подтвержденною рака в 2000 - 2003 юдах в отделениях абдоминальной хируртии и колопроктолот ии ГУЗ «Алтайский краевой онкологический диспансер» юрода Барнаула (тлавный врач д м н., профессор, А.Ф. Лазарев) Фиброгастробиоисийный материал был получен из юродских больниц №11, 12 I. Барнаула Клиники - морфологические формы выделяли соишсно классификации В В. Серова (1997).

Всею было изучен ма1сриал у 119 больных; из них 88 - операционный материал и 21 гасфобиопсия (за 2002 - 2004 г.) В исследованных тастробиоп-сиях были обнаружены атрофический гастрит с юнкокишечной метаплазией - К) наблюдений, умеренная дисплазия - 7 наблюдений, тяжелая дисилазия -4 наблюдения

Для контроля использовали биопсийный материал без воспалительных изменений и без атрофии, полученный при фиброгасфодуоденоскопии у клинически здоровых людей 18 - 30 лет (10 человек).

Морфологическую характеристику ма1ериала проводили как на макро -, 1ак и на микроскопическом уровнях При макроскопическом исследовании учитывали размер опухоли (наибольший линейный размер, наименьший размер), площадь опухоли как произведение наибольшего размера на наименьший), наличие метастазов в регионарных лимфатических узлах. При оценке метастазов в регионарные лимфатические узлы учитывали' 1) количество лимфоузлов с метастазами (единичные, по всем коллекторам большого или малою сальника) по международной классификации TNM (UICC, 2002)' 2) приблизительную площадь поражения метастазами лимфоузла (до 1/3, до 2/3, более 2/3) Наличие метастазов уточняли и подтверждали при т истологическом исследовании

Tis на нашем материале не обнаруживали, Т1 - у 11 пациентов (12,9 %), Т2 - у 25 пациентов (29,4 %), ТЗ - у 44 пациентов (51,8 %) и Т4 была определена у 5 пациентов (5,9 %), N0 (отсутствие метастазов в регионарных лимфатических узлах) было выявлено у 47 пациентов (55,3 %), N1 (метастазы в 1 - 6 регионарных лимфатических узлах) - выявили у 27 пациентов (31,8 %), N2 -(метастазы в 7 - 15 ре1ионарных лимфатических узлах) у 9 пациентов (10,6 %) и N3 - (метасташ в более чем 15 регионарных лимфатических узлах) у 2 пациентов (2,3 %) TisNO мы у пациентов не диагностировали, TINO у 9 (10,7 %), ГIN1 - у 2 (2,3 %), T2N0 - у 13 (15,3 %), T2N1 - у 8 (9,5 %), T2N2 - 2 (2,3 %), T3N0 - у 22 (25.9 %), ГЗМ1 - у 15 (17,6 %), T3N2 - у 5 (5,9 %), T3N3 - у 4 (4,7 %), T4N0 - 1 (1,2 %), T4N1 - 2 (2,3 %), T4N2 - 2 (2,3 %)

Приготовленные стандартным способом мазки отпечатки и клеточные суспензии высушивали на воздухе, фиксировали смесью метиловый спирт ледяная уксусная кислот в отношении 3'1 в течении 10 минут и ополаскивали дистиллированной водой После высушивания на воздухе препараты обрабатывали 2N раствором муравьиной кислоты в течение 10 минут По окончании инкубации стекла снова ополаскивали дистиллированной водой, тщательно высушивали на воздухе и окрашивали 50% раствором нитрата серебра по

стандартным методикам W.M. Howell и D.A. Black, (1980) в модификации H.H. Мамаева (1984, 1887,1989) и Y. Daskal, 1986.

Для определения морфофункциональной активности клеток посчитывали все отдельно различимые гранулы серебра как в самих ядрышках, гак и вне-ядрышковые гранулы, расположенные в кариоплазме при увеличении х 1500 с использованием иммерсионной сис/емы микроскопа. При слиянии i ранул серебра их количество определяли исходя из площади ядрышка, занимаемого одной фанулой и путем сравнения с ней площадей блоков в районе скопления гранул. Подсчитывали среднее число гранул на 1 ядро и на 1 ядрышко в каждом отдельном случае и среднее количество гранул на ядро и ядрышко для каждой группы наблюдений и строили 1истограммы распределения в популяциях клеток с различным количеством Ag- гранул в ядрах. С помощью компьютерного анализа изображений определяли площади каждой ядрышкооргани-зирующий зоны (ЯОЗ) в ядре, среднюю площадь ЯОЗ на 1 ядро и ЯОЗ - ядерное соотношение. Измерения площадей ядра, ядрышка и гранул серебра проводили с использованием компьклерной программы UTHSCSA Image Tool 3,0 (разрабо танной в University of the Texas Health Science Center of San Antonio, Texas) Морфологические шпы ядрышек классифицировали в соответствии с морфофункциональной классификацией ядрышек, предложенной П.В. Челидзе, О.В. Зацепиной (1988).У каждого больного оценивали от 25 до 50 клеток.

Для гистологического исследования кусочки после при! отовления мазков ошечатков фиксировали в смеси Карнуа и после стандартной проводки заключали в парафин. Парафиновые срезы юлщинои от 3 до 6 микрон окрашивали 1ематоксилином эозином, железным гематоксилином по Генденгайну, по методике Браше на РНК, сулемовым методом на суммарный белок, аль-циановым синим по Стидмену и ставили ШИК- реакцию на слизь по стандартным прописям методик.

Среди гистологических типов рака желудка (WHO; 1990) выделяли аде-нокарциномы различной степени дифференцировки и типами построения структур (тубулярные, напиллярнные, муцинозные аденокарциномы высокой, умеренной или низкой степени дифференцировки) в мономорфном виде, перстневидно - клеточный рак, недифференцированный рак медуллярного и скиррозного типа.

Все цифровые данные, полученные в работе, подвергали статиетической обработке с помощью пакета анализа программы «Excel - 2000» на компьютере Pentium IV (2000 гц ). Статистическую достоверность различий сравниваемых параметров определяли с использованием критерия Стыодента. Вычисляли коэффициент корреляции по Пирсону.

Результаты исследований и их обсуждение

Изучение активности ядрышковых организаторов неизмененной оболочки желудка и при атрофическом гаетрите показало, что большинство ядрышек относилось к малоактивным тинам (кольцевидным и микроядрышкам), характерным для специализированных клегок. Активные ядрышки нуклеолонемно-I о строения определяли только в шеечных отделах неизмененной оболочки желудка и криптах метаплазированных желез. Среднее количество гранул серебра на 1 ядро клетки в норме составило 4,0±0,1, а при атрофическом гаетри-ie возрастало до 7,6±0,1. Особенностями ядрышкового аппарата клеток при афофическом гастрите стали (таблица 1) достоверное (р < 0,05) увеличение

количества ядрышек, содержания гранул серебра в клетках герминативных зон и число гранул серебра на 1 ядро.

Таблица 1

Результаты серебрения ядрышек клеток неизмененной слизистой оболочки желудка и при атрофическом гастрите

Показатели ядрышковой активности Типы эпителия желудка

Неизмененный покровно-ямочный эпителий Метаплазированный эпителий

Количество 1,2±0,4 2,0±0,03

ядрышек на 1 ядро (1-4)

Количество 4,5±1,0 7,6±0,1

Ag-гpaнyл на 1 ядро (3-7) (3-13)

Количество Лр-гранул на 1 ядрышко в герминативной юне 14,8±2,8 (10-21) 25,4±1,2 (16-42)

Таким образом, можно говорить о более высоком прерибосомальном синтезе и, следова1ельно, более высоком пролиферативном потенциале метапла-зированного эпшелия по сравнению с неизменным покровным эпителием

При дисплашях нуклеолонемные ядрышки определяли во всех отделах диспласшческих желез. В участках слабой и умеренной дисплазии их количество составило 3,0%, а при 1яжелой возросло в 4,7 раза и достигло 14,0 % (таблица 2)

В ядрышках нуклеолонемного строения клеток с тяжелой дисплазией увеличивалось среднее количество гранул серебра до 17,3+1,1 и появлялись ядрышки, содержащие до 38 гранул серебра. Среднее количество гранул серебра на 1 ядро при слабой и умеренной дисплазии достоверно (р <" 0,05) увеличилось по сравнению с нормой и атрофическим 1астритом и составило 14,2±0,3 При тяжелой дисплазии среднее количество фанул серебра на 1 ядро было достоверно (р < 0,05) выше по сравнению со слабой и умеренной дисплазиями и составило 20,5±0,6 Особенностью клеточных популяций с тяжелой дисплазии стало появление группы клеюк, содержащих от 30 до 39 гранул серебра на 1 ядро. Возрастание среднего количества гранул серебра на 1 ядро при дис-плазиях коррелировало с увеличением числа нуклеолонемных ядрышек (г = 0,84) и увеличением в них количества гранул серебра (г - 0,75)

Таблица 2

Результаты серебрения ядрышек клеток при дисплазиях

Покамтели ядрышковой активности Степень тяжести дисплазии

Слабая и умеренная дисплазии Тяжелая дисплазия

Количество нуклеолонемных ядрышек (%) 3,0% 14,0%

Количество Ag-гpaнyл на 1 нуклеотонемное ядрышко 12,9±0,5* (11-17) 17,3±1,1* (11-38)

Количество Ла-гранул на 1 ядро 14,2±0,3* (7-28) 20,5±0,6* (10 38)

* Данные достоверны при р < 0,05

Таким образом, число нуклеолонемных ядрышек и разграничение юте точных популяций по количеству гранул серебра наряду с расчетом среднего ко-

личества гранул на 1 ядро могут быгь использованы в дифференциальной диагностике дисплазий.

Рассмотрение качественных и количественных характеристик ядрышек опухолевых клеток при раке показало возрастание ядрышковой активности в зависимости от снижения уровня дифференцировки, что проявилось как увеличением числа ядрышек нуклеолонемного строения, так и возрастанием в них содержания гранул серебра (таблица 3) Число ядрышек с малым количеством гранул серебра (кольцевидных и микроядрышек) при этом уменьшалось.

Таблица 3

Показатели ядрышковой активности опухолевых клеток при раке

Показатели ядрышковой активности Степень дифференцировки опухоли

Высокодиффе-ренциророванная аденокарцинома Умеренно дифференцированная аденокарцинома Низкодифферен-цированная аденокарцинома

Количество нуклеолонемных ядрышек (%) 18,3% 32,6% 66,0%

Количество А§-гранул на 1 нуклеолонемное ядрышко 14,7±0,3* (11 30) 18,1±0,3* (11-56) 25,9±0,7* (11-78)

Количество Ag-rpaнyл на 1 ядро 23,8 £0,4* (1а 59) 46,0±0,8* (19 114) 63,0±1,0* (40 119)

"■Данные достоверны нри р < 0,05

По мере снижения дифференцировки аденокарцином среднее количество гранул серебра на 1 ядро клетки достоверно (р < 0,05) увеличивалось и составило при ВДАК 23,8±0,4, УДАК 46,0±0,8 и НДАК 63,0±1,0, соответственно. Увеличение среднего количества гранул коррелировало с возрастанием числа нуклеолонемных ядрышек (г = 0,76), количеством гранул серебра в них (г = 0,71), уменьшением содержания микроядрышек (г = -0,31) и числа кольцевидных ядрышек (г = — 0,70). В низкодифференцированной аденокарциноме и недифференцированном раке возрастало число субпопуляций клеток с большим количеством гранул серебра на 1 ядро.

Таким образом, обнаруженные динамические перестройки ядрышкового аппарата клеток при раке желудка могут указывать на повышение ассоциативной способности ядрышковых орт анизаторов при снижении степени дифференцировки Высокие показатели ядрышковой активности опухолевых клеток могут служить маркером низкой степени дифференцировки.

Критериями дифференциальной диагностики между высокодифференциро-ванной аденокарциномой и дисплазией тяжелой степени выраженности на основании исследования ядрышкового аппарата клеток явились (таблица 4): возрастание в клетках опухоли среднего количества гранул серебра на 1 ядро до 23,8±0,45 и принципиально иной вид гистограммы, характеризующей распределение популяций клеток по содержанию гранул на 1 ядро с появлением сдвига в сторону возрастания числа клеток содержащих от 39 до 59 гранул серебра (рис. 1).

При компьютерном анализе изображений суммарная площадь ядрышко-организирирующих зон (ЯОЗ) коррелировала с площадью ядра опухолевых клеток (г = 0,91).

80 75,6

70 п

60 53 7

50 н

40 ■

30 ш 1

20 10 1 1

0 ■ иш 11 - 19 20-29

14,6 15,1

□Ц ш

1,1% 50-59

„9%

30 - 39 40 - 49 Количество гранул серебра в клетках

□Тяжелая дисплазия ИВДАК

Рисунок I Гистограмма, характеризующая распределение популяций клегок по коли-чес!ву гранул серебра на I ядро при тяжелой дисплазии и высокодифференцированной

аденокарциномс (ВДЛК)

Таблица 4.

Ре{ульга1ы серебрения ядрышек клеток при тяжелой дисплазии и высокодифференцированной аденокарциноме

Показатели ядрышковои активности Патология желудка

Тяжелая дисплазия Высокодифференцированная аденокарцинома

Среднее количество Ag-гpaнyл на I ядро 20,5±0,6 (10-38) 23,8±0,4 (10- 59)

Данные достоверны при р < 0,05

Таблица 5

Средние показатели ядрышкообразующих зон (ЯОЗ) ядер опухолевых клеток в мегас1азирующих (N4-) и неметастазирующих (N0) опухолях

Параметры ядрышковои активности N0

Среднее чисто гранул на 1 ядро 42,73±0,72 (1-119) 46,04±0,73 (1-101)

Количество ЯОЗ на 1 ядро 3,3±0,07 С ^ 14) 4,0±0,15 (1 ~30)

Средняя площадь 1 ЯОЗ, мкм" 5,1±0,1 (0,4- 34,0) 13,4±0,3 (0,5- 144,7)

Средняя общая площадь ЯОЗ, мкм" 22,0±0,5 (5,5- 122,4) 53,9±2,3 (10,9-457,8)

Площадь ядра, мкм" 158,0А2,7 (48,1-740) 309,6^14,5 (73,0-2916,6)

ЯОЗ ядерное соотношение 0,140±0,001 (0,047- 0,3) 0,196^0,001 (0,068-0,3)

Данные достоверны при р < 0,05

Морфометрические параметры нуклеолярной активности опухолевых клеток были достоверно выше (р < 0,05) в опухолях с метастазами в регионарных лимфатических узлах (таблица 5). В таких карциномах отмечали наиболее высокие значения суммарной площади ЯОЗ на 1 ядро (до 458 мкм2).

Наиболее высокими значениями суммарной площади ядрышковых организаторов на 1 ядро характеризовались опухоли с выраженным клеточным полиморфизмом, площадь клеючных ядер в которых достигала до 2917 мкм2. С клеточным полиморфизмом наиболее сильно коррелировали: количество ядрышек нуклеолонемного строения (г - 0,74), их площадь (г = 0,60) и площадь I ЯОЗ (г = 0,68). Площадь 1 ЯОЗ была взаимосвязана с морфофункцио-нальным типом ядрышка и наиболее сильно коррелировала с площадью (г = 0,83) и количеством ядрышек нуклеолонемного строения (г = 0,92)

Таким образом, компышерный анализ изображений раскрывает новые возможности для исследования ядрышек и позволяет объективизировать оценку активносш ядрышковых организаторов при раке желудка

При выявлении взаимосвязей (таблица 6) между морфофункциональной активностью ядрышкового аппарата опухолевых клеток и наиболее важными клинико - морфологическими характеристиками карцином (глубиной инвазии, метастазированием в регионарные лимфатические узлы, гистологическим типом, клинико морфоло! ической формой и размером новообразования) значимыми параметрами явились среднее количество ядрышек нуклеолонемного строения (г= 0,47 - 0,80) и их шпов (г = 0,30 - 0,66) на 1 ядро, средняя площадь 1 ЯОЗ (г =-0,30- 0,71), средняя суммарная площадь ЯОЗ на I ядро (г = 0,33 - 0,55) и ЯОЗ - ядерное соотношение (г - 0,40 - 0,61). Наиболее сильные прямые положительные корреляции были отмечены с морфологическими параметрами нуклеолонемных ядрышек.

Взаимосвязи активности ядрышкового аппарата опухолевых клеток с площадью опухоли и глубиной инвазии выявлено не было. В ряде случаев в новообразованиях с небольшой площадью и с инвазией подслизистого слоя мы отмечали высокую активность ядрышковою аппарата

Положительные корреляции высокой активности ядрышек опухолевых клеток были найдены с наличием метастазов в лимфатических узлах и эмболов в сосудах опухоли (г = 0,30-0,80).

Корреляции ак1Ивнос1н ядрышек опухолевых клеток, были оIмечены как между количеством пораженных лимфатических узлов, гак и площадью их поражения. Умеренную положительную корреляцию (г = 0,46) наблюдали с количеством пораженных регионарных лимфатических узлов (Ы+, включая N1, N2, N3) и числом ядрышек нуклеолонемного строения в опухолевых клетках. Более сильную линейную положительную корреляцию (г = 0,67) количества нуклеолонемных ядрышек отмечали с площадью поражения лимфатического узла.

Наиболее сильные линейные положительные корреляции обнаружены с наличием эмболов и количеством активных нуклеолонемных ядрышек в опухолевых клетках (г = 0,80).

При анализе состава клеточных популяций в метастазирующих опухолях и новообразованиях, где были обнаружены эмболы в сосудах, выявляли широкую 1етеро1енносгь опухолевых клеток по активности ядрышек и сдвш в сторону увеличения числа клеток с высокой активное 1ыо (рис 2.)

Таблица 6

Зависимость клинико-морфологических характеристик карцином от морфофункииональной активности ядрышкового аппарата опухолевых клегок

Клинико-морфологическис характеристики карцином Параметры яд рышковои активности опухолевых клеток

1 Количество ЯОЗ 1 Среднее площадь 1 ЯОЗ на 1 ядро Средняя суммарная площадь ЯОЗ на 1 ядро ЯОЗ - ядерное соотношение Среднее количество нуклеолонемных (НЯ) ядрышек на 1 ядро НЯ ядрышки с площадью 10-20 чкм2 НЯ ядрышки с площадью более 20 мкм2 Среднее количество кольцевидных ядрышек на 1 ядро Среднее количество микроядрышек на 1 ядро

Клинико-морфоло-гическая форма 0,01 0,45 0,35 0,40 0,54 0,47 0,45 -0,52 -0,08

Площадь опухолевого узла 0,02 -0,01 -0,03 0,02 0,11 0,12 0,01 -0,03 - 0,02

Глубина инвами 0,19 0,18 0,27 ' 0,14 0,20 0,12 0,19 -0,18 0,03

Наличие метастазов в решонарных лимфатических узлах -0,10 0,62 0,29 0,57 0,67 0,51 0,58 - 0,60 -0,21

Количество пораженных лимфатических узлов - 0,06 0,40 0,18 0,20 0,46 0,30 0,44 -0,36 -0,24

Площадь поражения чимфатичеекого узла -0,05 0,64 0,33 0,51 0,67 0,49 0,60 -0,58 -0,25

Гистоло1 ичееьий тии опухоли - 0,09 0,30 0,13 0,42 0,47 0,55 0,21 -0,10 -0,10

Полиморфизм КЛС1 очного ядра 0,18 0,68 0,55 0,45 0,74 0,57 0,62 -0,59 -0 29

Эмболия сосутов раковыми клетками 0,14 0,71 0,54 0,61 0,80 0,62 0,66 -0,67 -0,29

65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

58,9

9,5% □

24 2 25 2 ^

JI4 Ш : | J о J3 oj

3-9 10- 19 20-29 30-39 40-49 50-59 60 и

более

Суммарная площадь ЯОЗ на 1 ядро ONO ¿N+1

Рисунок 2 Гистограмма, характеризующая распределение популяций клеток по суммарной площади ЯОЗ на 1 ядро в опухолях без метастазов (N0) и метастазирующих

карциномах (N-1-).

При выявлении взаимосвязи ядрышковой активности опухолевых клеток с гистологическим типом опухоли были обнаружены умеренные положительные корреляции с количеством (г = 0,47), площадью ядрышек нуклеолонемно-го строения (г = 0,55) и ядрышко - ядерным соотношением (г = 0,42)

Нами была найдена взаимосвязь между клинико морфологической формой опухоли и активностью ядрышек опухолевых клеток (г = 0,45 - 0,54). В опухолях с зндофитной формой рос га параметры ядрышковой активности были достоверно (р < 0,05) выше, чем с экзофитной (таблица 7)

Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что ядрышки опухолевых клеток при раке желудка являлись динамически изменяющимися структурами Изменение структуры ядрышек было обусловлено функциональной активностью опухолевых клеток. Изучение морфофункцио-нальных характеристик ядрышек опухолевых клеток может бьпь использовано при дифференциальной диагностике предраковых заболеваний и рака желудка. Высокие значения активности ядрышкового аппарата опухолевых клеток являются признаком низкой дифференцировки. Повышение активности ядрыш-ковых организаторов приводит к изменению клональнот о профиля опухоли и является одним из количественных признаков повышения метастатического потенциала опухолевых клеток. Компьютерный анализ изображений позволяет оптимизировать изучение ядрышковых организаторов Морфофункциональная активность ядрышек опухолевых клеток взаимосвязана с клинико-морфологическими характеристиками злокачественных новообразований желудка.

Таблица 7

Средние показатели параметров ядрышковой активности опухолевых клеток в зависимости от клинико-морфологической формы опухоли

Параметры активности ядрышек Экзофитныи рост Эндофигный рост

Среднее число гранул на 1 ядро 31,8±0,7 (10-119) 51,0±0,6 (17-117)

Средняя площадь 1 ЯОЗ, мк\Г 6,4±0,2 (0,6- 121,6) 11,5±0,3 (0,4- 144,7)

Средняя общая площадь ЯОЗ, мкм7 23,7±0,9 (5,7- 203,5) 45,1 ±2,1 (5.5-457,8)

Площадь ядра, мкм" 176,1 ±6,4 (55,1-1521,7) 264,1±12,5 (48,1-2916,6)

ЯОЗ - ядерное соотношение 0,137±0,002 (0,05- 0,3) 0,182±0,006 (0,05-0,3)

Данные достоверны при р < 0,05

Выводы

1. Клетки неизмененного покровного эпителия слизистой оболочки желудка характеризуются малой активностью ядрышкового аппарата и представлены микро- и кольцевидными ядрышками, активные ядрышки нуклеоло-немного строения определяются только в т ерминативных зонах При ат-рофическом гастрите активность ядрышкового аппарата достоверно возрастает в покровном эпителии за счет увеличения числа микро - и кольцевидных ядрышек, а в клетках кишечных крипт метагтлазированньтх желез

за счет увеличения количества фибриллярных центров в нуклеолонемных ядрышек.

2. Морфофункциональная активность ядрышковою аппарата клеток возрастает в цепочке патологических изменений от дисплазии легкой степени до рака Снижение степени дифференцировки опухолей, сопровождается увеличением суммарной площади ядрышковых организаторов и количества гранул серебра на 1 ядро до 23,8±0,4; 46,0±0,8; 63,0±1,0 при высоко-, умеренно- и низкодифференцированной аденокарциноме соответственно.

3. Критериями дифференциальной диагностики между высокодифференци-рованной аденокарциномой и дисплазией тяжелой степени можно считать: возрастание в клетках опухоли среднего количества гранул серебра на 1 ядро до 23,8±0,45 и вид гистограммы характеризующей распределение клеток по содержанию гранул на 1 ядро с появлением сдвига в сторону возрастания числа клеток, содержащих от 39 до 59 гранул серебра.

4. Компьютерный анализ изображений позволяет объективизировать оценку активности ядрышковых организаторов при раке желудка. Суммарная площадь ядрышкоорганизирующих зон коррелирует с площадью ядра опухолевых клеток и достоверно выше в опухолях с выраженным клеточным полиморфизмом и наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах

5 Параметры, характеризующие морфофункциональная активность ядрышек нуклеолонемного строения опухолевых клеток наиболее взаимосвязаны с клинико - морфологическими характеристиками опухолей Количество и площадь нуклеолонемных ядрышек опухолевых клеток коррелируй с наличием мсшстазов в регионарных лимфатических узлах (г = 0,51 - 0,67), количеством пораженных лимфатических узлов (г = 0,44 - 0,46), площадью поражения лимфатического узла (г = 0,49 - 0,67), наличием эмболии сосудов раковыми клетками (г = 0,62 - 0,80), клинико - морфологической формой роста (г = 0,45 - 0,54), гистологическим типом (г = 0,47 -0,55) и клеючным полиморфизмом (г = 0,57 - 0,74)

Практические рекомендации

1 При патогистологическом исследовании I астробиоптагов и оперативно удаленных желудков по поводу рака желудка кроме обычных рутинных меюдов окраски гистологических препаратов в качестве дополнительного метода исследования может быть использовано серебрения ядрышковых организаторов.

2 Для проведения дифференциальной диагностики между дисплазиями различной степени выраженности, дисплазией тяжелой степенью и высоко-дифференцированной аденокарциномой, а также для изучения пролифе-ративной активности и степени злокачественности опухоли может быть проведена оценка состояния ядрышкового аппарата опухолевых клеток. Оценка ядрышковой активности опухолевых клеток должна включать в себя кроме подсчета среднего числа гранул серебра на 1 ядро изучение процентных соотношений различных морфофункциональных типов ядрышек в опухолевых клетках и разфаничение различных клеточных популяций по активности ядрышкового аппарата для выявления процентного содержания наиболее злокачественных клонов.

Применение компьютерного анализа изображений может позволить ускорить и объективизировать изучение морфофункциональной активности ядрышковою аппарата клеток при патолотии желудка. Компьютерный анализ ядрышковою аппарата клеток должен включать в себя подсчет всех обнаруженных в ядре ЯОЗ, суммарной площади ЯОЗ на 1 ядро, с подсчет ЯОЗ - ядерною соотношения и разграничение различных клеточных популяций по площади ЯОЗ для выявления наиболее злокачественных клонов обнаруживающих наиболее высокие значения Для уточнения прогноза заболевания и определения метастатического потенциала опухоли патоморфологическое исследование операционного материала кроме оценки традиционных факторов прогноза рака желудка должно предусматривать определение морфофункциональной активности нуклеолярною аппарата опухолевых клеток.

Список опубликованных работ

Климачев В В., Бобров И П., Мазуров А.М Оценка активности ядрыш-ковых орт анизагоров в опухотевых клетках при раке желудка // Неотложные состояния у онкологических больных. АГМУ, комитет по здравоохранению Алтайского края, НПО АОЦ. - Барнаул, 2001. С. 112-113 Климачев В В , Мазуров A.M., Бобров И.П и др. Глубина инвазии при различных анатомических формах рака желудка // Неотложные состояния у онкологических больных АГМУ, комитет по здравоохранению Алтайского края, НПО АОЦ. Барнаул, 2001. - С 141-142. Климачев В В., Бобров И П , Мазуров A.M. Количественное изучение Ag-положительных участков ядрышек, выявляемых в опухолевых клетках методом серебрения при раке желудка Н Гасгробюллетень' Материалы 3-ю Российского научного форума ГАСТРО - Санкт-Петербурт, 2001 - № 2-3. - С 16

Климачев В В , Бобров И П , Авдалян А.М и др Количественное изучение Ag- положительных ядрышек, выявляемых в ядрах опухолевых клеток при раке желудка // Научные труды сотрудников педиатрического факультета АГМУ (к 35-легию факультета) АГМУ, МЗ РФ - Барнаул, 2001 -С. 25-28

Мазуров А.М , Климачев В.В., Бобров И П Функциональная активность лейкоцитов cipoMbi опухоли при раке желудка // Неотложные состояния у онкологических больных. АГМУ, комитет по здравоохранению Алтайскою края, НПО АОЦ - Барнаул, 2001. - С. 140-141.

Мазуров А М , Климачев В В , Бобров И.П. Метаболическая активность мононуклеаров стромы опухоли при раке желудка // Гастробюллетень. Материалы 3-го Российского научного форума ГАСТРО. - Санкт-Петербург, 2001. - № 2-3 С. 50.

Бобров И.П Характеристика ядрышковою аппарата опухолевых клеток при раке желудка // Актуальные вопросы онкоурологии и онкогинеколо-т ии / Под ред проф. Лазарева А Ф , Барнаул МЗ РФ, Алтайский краевой онкологический диспансер, АГМУ Межрегиональная научно-практическая конференция с международным участием, 5-6 июня - Барнаул, 2002 -С 240-241

Климачев В В., Петри А К , Бобров И П и др Некоторые морфолсниче-ские факторы прогноза рака желудка // Труды Всемирного конгресса по

клинической и иммунной патологии «Реабилитация в медицине и имму-нореабилшация», Сингапур, 2-6 декабря, 2002 // Int. J. Immunorehabil -2002. - V 4 - № 2. - С. 284.

9 Лазарев А Ф , Франк Г А., Бобров И.Г1 и др. Характеристика ядрышково-го аппарата опухолевых клеток при раке желудка // Актуальные вопросы онкоурологии и онкогинекологии / Под ред. проф. Лазарева А.Ф., Барнаул МЗ РФ, Алтайский краевой онкологический диспансер, АГМУ. Межрегиональная научно-практическая конференция с международным участием, 5-6 июня. - Барнаул, 2002. - С. 264- 269.

10. Лазарев А.Ф., Климачев В В., Бобров И.П , Лубенников В.А. Характеристика ядрышкового аппарата опухолевых клегок при раке желудка // Архив натоло) ии. - 2002. - 64. - № 6. - С. 30 - 32.

11 Лазарев А Ф., Климачев В.В., Бобров И П. и др. Практическая значимость современных морфологических маркеров при диагностике рака желудка // Актуальные вопросы онкогастроэнтерологии / Под ред. проф. А.Ф. Лазарева, Барнаул. МЗ РФ, РОНЦ им. H.H. Блохина, Алтайский краевой онкологический диспансер, АГМУ. Межре1 иональная научно-практическая конференция, 6-7 июня. - Барнаул, 2003. - Т 1. - С. 176.

12 Лазарев А.Ф., Климачев В.В., Бобров И.П и др. Оценка пролиферативной активности злокачественных опухолей с применением компьютерного анализатора изображений // Актуальные вопросы онкогастроэнгерологии / Под ред. проф. А.Ф Лазарева, Барнаул. МЗ РФ, РОНЦ им. H.H. Блохина, Алтйский краевой онкологический диспансер, АГМУ. Межрегиональная научно-практическая конференция, 6-7 июня. - Барнаул, 2003. - Т 1. - С 168.

13. Лазарев А . Климачев В В , Бобров И П и др Исследование акгивносхи ядрышкообразуюших зон (ЯОЗ) опухолевых клешк при раке желудка с использованием компьютерного анализатора изображений // Актуальные вопросы онкогастроэнтерологии / Под ред. проф. А.Ф. Лазарева, Барнаул. МЗ РФ, РОНЦ им. H.H. Блохина, Алтайский краевой онкологический диспансер, АГМУ Межрегиональная научно-практическая конференция, 6-7 июня. - Барнаул, 2003. - Т 1. - С. 182.

14. Лазарев А Ф , Климачев В В., Бобров И.П. Качественная и количественная характеристика ядрышек клеток при предраковых заболеваниях и раке желудка // Актуальные вопросы ohkoiастроэнтерологии / Под ред. проф. А.Ф. Лазарева, Барнаул. МЗ РФ, РОНЦ им H.H. Блохина, Алтайский краевой онкологический диспансер, АГМУ. Межрегиональная научно-пракшческая конференция, 6-7 июня - Барнаул, 2003. - Т 1. - С. 184.

15 Лазарев А Ф , Авдалян А М , Бобров И.П. и др. Митотический индекс как факюр прогноза при различных гистологических типах рака желудка // Актуальные вопросы онкогастроэнтероло! ии / Под ред. проф. А Ф Лазарева, Барнаул МЗ РФ, РОНЦ им Н.Н Блохина, Алтайский краевой онкологический диспансер, АГМУ Межрегиональная научно-практическая конференция, 6-7 июня. - Барнаул, 2003. - Т 1. - С. 173.

16 Лазарев А.Ф., Климачев В В , Бобров И П. и др. Некоторые иммуномор-фологические маркеры при раке желудка- прогностическая значимость // Актуальные вопросы онкогастроэнтерологии / Под ред проф. А Ф Лазарева, Барнаул. МЗ РФ, РОНЦ им. H.H. Блохина, Алтайский краевой онко-

логический диспансер, АГМУ. Межрегиональная научно-практическая конференция, 6-7 июня. - Барнаул, 2003. Т 1 - С. 171.

17. Лазарев Ф.Ф , Авдалян A.M., Бобров И.П и др Прогностическое значение митотического режима клеток при раке желудка // Современные меюды диагностики. 5 межрегиональная научно - практическая конференция, посвященная 10 - летию диагностического центра алтайского края 10 -11.07. 2003. Барнаул С. 70.

18. Лазарев А.Ф., Климачев ВВ., Бобров И.П Функциональная активнос1ь рибосомных генов в клетках слизистой оболочки желудка при предраковых заболеваниях и раке желудка // Современные методы диагностики 5 межре1 иональная научно - практическая конференция, посвященная 10 -летию диагностическою центра алтайского края - 10 - 11. 07 2003. Барнаул. С. 71 - 73.

19 Лазарев А Ф , В.В., Зорькин В.Т., Бобров и др Прогностическая значимость иммуноморфологических маркеров Ki - 67 и р53 в прижизненной диагностике рака желудка // Современные методы диа! нос гики. 5 межрегиональная научно - практическая конференция, посвященная 10 - летию диагностического центра алтайскою края. - 10 11. 07. 2003 Барнаул. С. 74.

20 Лазарев А.Ф., Климачев В.В., Бобров И.П. и др. Использование компьютерною анализа изображений в исследовании активности ядрышкоорга-низующих зон опухолевых клеток при раке желудка // Современные методы диат нос гики. 5 межрегиональная научно практическая конференция, посвященная 10 - летию диагностического центра алтайского края -10- 11. 07. 2003. Барнаул. С. 323 - 324.

21. Авдалян A.M., Лазарев А.Ф., Бобров И.П. и др. Влияние митотическою режима клеток на некоторые клинико - морфологические параметры рака желудка и на прогноз // Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онколотии / Материалы российской научно - практической конференции посвященной 25 - летию НИИ онколог ии ТНЦ СО РАМН - Томск, 24 - 25 июня 2004 т ода. Т 1 - С 24-25

22 Бобров И.П , Климачев В.В , Лазарев А Ф и др Морфофункциональная характеристика ядрышкового аппарата опухолевых клеток при раке желудка' клинико морфологические параллели // Современное состояние и перспективы ра{вития жспериментальной и клинической онкологии / Материалы российской научно практической конференции посвященной 25

летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН Томск, 24 - 25 июня 2004 года. Т.1.-С. 64-65.

23 Бобров И.П , Климачев В.В., Лазарев А Ф и др Нуклеолонемнос ядрышко - маркер пролиферации опухолевых клеток при раке желудка // Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии / Материалы российской научно - практической конференции, посвященной 25 - летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН -Томск, 24-25 июня 2004 года Т 1 -С 65-66

24 Зорькин ВТ, Лазарев АФ, Бобров И.П., и др Прогностическая шачи-мость иммуноморфологических маркеров Ki - 67, р53, PCNA и HER 2/ neu в изучении рака желудка // Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии / Материалы российской научно - практической конференции, посвященной 25 - летию

НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН - Томск, 24 - 25 июня 2004 года. Т.2. -С. 22-23.

25 Климачев В.В., Лазарев А.Ф., Бобров И.П. и др. Исследование активности ядрышкообразующих зон опухолевых клеток при раке желудка с использованием компьютерного анализа изображений // Современное сосюяние и перспективы развития экспериментальной и клинической онколотии / Материалы российской научно - практической конференции, посвященной 25 - летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН - Томск, 24 - 25 июня 2004 года. Т.2. - С. 49-50.

26. Климачев В.В , Лазарев А.Ф., Бобров И П . и др. Сравнительное изучение пролиферации (по выявлению гена - супрессора р53) и активности яд-рышкового аппарата в опухолевых клетках при раке желудка // Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии /' Материалы российской научно - практической конференции, посвященной 25-летию НИИ онколот ии ТНЦ СО РАМН - Томск, 24-25 июня 2004 года. Т.2. С. 50-51.

27 Климачев В.В., Лазарев А.Ф , Бобров И П. и др. Пограничная воспалительная реакция в слизистой оболочке при раке желудка // Компенсаторно - приспособительные процессы фундаментальные, экологические и клинические аспекты / Материалы Всероссийской конференции, Новосибирск, 5-7 октября, 2004 г. С. 36-37.

28 Лазарев А.Ф., Климачев В В , Бобров И.П. Сравнительное изучение пролиферации опухолевых юте ток (по выявлению антигена Кт - 67) и активности ядрышкового аппарата при раке желудка // Комбинированные и комплексные методы лечения в онкологии / Под ред. проф. А.Ф. Лазарева, Барнаул., МЗ РФ, РОНЦ им. H.H. Блохина, Алтайский краевой онкологический диспансер, АГМУ Материалы межрегиональной научно - практической конференции, 13 - 14 мая - Барнаул, 2004 -Т 1. - С. 146-148.

29. Лазарев А Ф., Климачев В.В., Бобров И П. Сравнительное изучение пролиферации опухолевых клеток (по выявлению антигена р53) и активности ядрышковото аппарата при раке желудка // Комбинированные и комплексные методы лечения в онколотии / Под ред. проф. А.Ф. Лазарева, Барнаул., МЗ РФ, РОНЦ им. Н.Н Блохина, Алтайский краевой онкологический диспансер, АГМУ. Материалы межрегиональной научно - практической конференции, 13 - 14 мая - Барнаул, 2004. - Т 1 - С. 148-150.

30. Лазарев А.Ф., Климачев В.В., Бобров И.П. Сравнительное изучение пролиферации опухолевых клеток (по выявлению антигена PCNA) и активности ядрышковот о аппарата при раке желудка // Комбинированные и комплексные методы лечения в онкологии / Под ред. проф. А.Ф. Лазарева, Барнаул., МЗ РФ, РОНЦ им. Н 11 Блохина, Алтайский краевой онкологический диспансер, АГМУ Материалы межрегиональной научно - практической конференции, 13-14 мая-Барнаул, 2004.-Т 1.-С 150-152.

31 Лазарев А.Ф., Климачев В.В., Бобров И.П. и др. Морфофункциональная характеристика ядрышкового аппарата опухолевых клеток при раке желудка клинико - морфологические параллели // Комбинированные и комплексные методы лечения в онколог ии / Под ред. проф. А.Ф. Лазарева, Барнаул., МЗ РФ, РОНЦ им. H.H. Блохина, Алтайский краевой онкологический диспансер, АГМУ. Материалы межрегиональной научно - практической конференции, 13-14 мая - Барнаул, 2004. - Т1 -С. 152-154.

32. Лазарев А Ф., Климачев В В., Бобров И.П. и др. Морфофункциональная характеристика ядрышек клеток при предраковых заболеваниях и раке желудка // Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии / Материалы российской научно -практической конференции, посвященной 25-летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН Томск, 24-25 июня 2004 I ода. Т. 2. - С. 102-103.

33. Лазарев А.Ф., Климачев В.В., Бобров И.П. и др. Сравнительное изучение пролиферации (по выявлению антигена К) - 67) и активности ядрышково-го аппарата в опухолевых клетках при раке желудка // Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онко-ло1ии / Материалы российской научно - практической конференции, посвященной 25-летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН - Томск, 24-25 июня 2004 года. Т.2. - С. 103-104.

Список условных сокращений Ag - гранула - гранула серебра

ВДАК - высокодифференцированная аденокарцинома УДАК - умеренно дифференцированная аденокарцинома НДАК - низкодифференцированная аденокарцинома ЯОЗ - ядрышкообразующая зона

Подписано в печать 18 05 2005 Бумага офсетная. Гарнитура Тайме Нью Роман Заказ 653 Тираж 100 экз

Отпечатано в типографии Некоммерческого партнерства <<Аз Бука» Лицензия на полиграфическую деятельность ПЛД №28-51 от 22.07 1999 г г Барнаул, пр. Красноармейский, 98а тел. 62-91-03,62-77-25 Б-тай azbuka@rol.ru

»'j 1

РНБ Русский фонд

2006-4 7594

Несмотря на некоторое снижение заболеваемости и смертности от рака желудка во многих европейских странах, для России эта патология остается одной из важнейших медицинских и социально - экономических проблем. В структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями желудочно - кишечного тракта населения России рак желудка устойчиво занимает 1-е место [В.И. Чиссов, В.В. Старинский, 2000; В.М. Мерабишвили, 2001]. В Алтайском крае заболеваемость раком желудка составила 40,0 для мужчин и 17,5 на 100 тыс. человек для женщин [А.Ф. Лазарев, В.А. Лубенников, 1996; А.Ф. Лазарев и соавт., 2002].

Не вызывает сомнения зависимость результатов лечения от ранней диагностики, при которой 5 и 10- летняя выживаемость больных достигает 90 -95%. В то же время эффективность раннего выявления в значительной степени определяется мерой наших знаний о структуре и критериях «предраковых состояний».

На всех этапах исследования рака желудка возникает большое количество нерешенных вопросов: прежде всего речь идет о пато- и морфогенетических особенностях рака желудка [П.В. Юшков., 1996]. Особое внимание исследователей привлекают предраковые изменения слизистой оболочки желудка и возможности предсказания биологического поведения опухоли.

Диспластические изменения в эпителии желудка стали изучать лишь в последние десятилетия [Международная группа по изучению рака желудка, 1982; М.Н. Пинская, В.В. Корлацан, 1984; З.В. Гольберт, Г.А. Лавпикова, Г.А. Франк 1985; В.В. Серов, В.Б. Золотаревский, O.A. Склянская, A.B. Берестова, 1990; Б.Н. Зырянов, Л.А. Коломиец, С.А. Тузиков, 1998; Т.А. Белоус, 2000; Л.И. Аруин, 2002; I. Bearzi et al, 1994; G. Y. Lauwers et al., 1999; R. J. Schlemper et al., 1998, 2000].

Дисплазии может подвергаться как неметаплазированный, так и метапла-зированный эпителий. Дисплазия метаплазированного эпителия считается наиболее вероятным предраковым изменением. В большинстве случаев дисплазия тяжелой степени наблюдается в метаплазированных железах [V.G. Falck et al., 1990]. Причины, приводящие к дисплазии метаплазированного эпителия не ясны.

Набор предложенных признаков характеризующих диспластические изменения и степень их выраженности достаточно велик и охватывает различные изменения архитектоники слизистой оболочки желудка, изменения структуры желез, строения и функционального состояния эпителиальных клеток. Однако до сих пор нет четкости самого понятия «дисплазия» для эпителия желудка, не определены ведущие признаки диспластических изменений. Более того, в последнее время обращают внимание в большей степени только на те признаки, которые характеризуют тяжелую дисплазию. Дифференциальная диагностика между дисплазиями различной степени выраженности, а также между тяжелой дисплазией и раком при гистологическом исследовании остается трудной [Б.Н. Зырянов, С.А. Тузиков и соавт., 1998; Л.И. Аруин, 2002].

Проблема карциномы in situ для железистого эпителия, в том числе и для эпителия желудка, также не решена окончательно. Многие исследователи сомневаются в возможности реально установить эту стадию формирования рака желудка как из-за кратковременности ее существования, так и нечеткости критериев оценки [Т.А. Белоус, 1998; Г.А. Франк, 1999; P. Hermanek, 1999]. Некоторые отождествляют прединвазивный рак с одной стороны с тяжелой дисплазией (К. Maruyama et al., 1996; Т. Aiko, М. Sasako, 1998), с другой - раком, инвазия которого не превышает пределов слизистой оболочки. Наряду с этим существуют предположения, что определенная часть ранних раков желудка возникает независимо от так называемого «морфологического фона», то есть «de novo» [Т.А. Белоус, 1998; М. Sasako, Т. Aiko, 1999].

В последнее время в клинической морфологии все чаще стали использовать методы молекулярной биологии и медицины, в том числе с применением компьютерных систем и программного обеспечения [В.И. Новик, 2000]. Одним из таких методов является окраска методом серебрения ядрышковых организаторов клеток, которые претерпевают значительные изменения при ряде патологических процессов и особенно при раке [H.H. Мамаев, С.И. Мамаева, 1992; М. Derenzini, 2000; В.М. Ковардаков, М.В. Цеслюк, 2001]. Метод хорошо зарекомендовал себя при определении пролиферативной активности опухолевых клеток в онкоморфологии и цитогенетических исследованиях, которыми было показано, что окраска ядрышковых организаторов серебром позволяет определить число активно работающих рибосомальных генов.

Изучение пролиферативной активности клеток с помощью окраски ядрышковых организаторов приобретает клинический интерес в связи с использованием полученных данных для определения характера патологического процесса от хронического воспаления до дисплазии и неопластического процесса. К тому же окраска ядрышковых организаторов проста в техническом исполнении и может быть выполнена в любой патогистологической лаборатории.

Исследование ядрышковых организаторов при предраковых заболеваниях и раке желудка немногочисленны и противоречивы и касаются только отдельных гистологических форм рака желудка.

Правильная оценка степени зрелости опухолей определяет оптимальный выбор лечебных мероприятий, их объем и, в конечном итоге, прогноз заболевания, что диктует необходимость поиска новых критериев, объективно отражающих степень зрелости новообразований и особенности их клинического течения. В связи с этим имеет актуальность изучение взаимосвязей при клинико — морфологическом сопоставлении между активностью рибосомальных генов и общепринятыми критериями злокачественности (глубиной инвазии, наличием эмболов раковых клеток в сосудах и метастазов в регионарные лимфатические узлы, количеством пораженных лимфатических узлов и площадь поражения лимфатического узла, размером новообразования, гистологическим типом строения, атипией опухолевых клеток, ядерным полиморфизмом).

Приведенные данные свидетельствуют о необходимости изучения мор-фофункциональной активности ядрышкового аппарата клеток при патологии желудка. Решение перечисленных вопросов позволит уточнить клиническое значение изучения параметров ядрышкового аппарата клеток, что в свою очередь даст возможность улучшить морфологическую и дифференциальную диагностику для своевременного выявления данной патологии и прогноза течения заболеваний.

Целью исследования явилось: изучение роли ядрышковых организаторов в дифференциальной диагностике рака желудка.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить функциональную активность ядрышковых организаторов в клетках неизмененной слизистой оболочки желудка и при атрофиче-ском гастрите.

2. Установить характер изменений нуклеолярного аппарата клеток при дисплазиях различной степени выраженности и в различных гистологических вариантах рака желудка.

3. Разработать критерии дифференциальной диагностики между высо-кодифференцированной аденокарциномой и дисплазией тяжелой степени на основании исследования ядрышкового аппарата клеток

4. Изучить возможности применения метода компьютерного анализа изображений в исследовании нуклеол опухолевых клеток при раке желудка.

5. Выявить взаимосвязи между параметрами характеризующими мор-фофункциональную активность ядрышек опухолевых клеток и наиболее важными клинико — морфологическими параметрами карцином (глубиной инвазии, метастазированием в регионарные лимфатические узлы, гистологическим типом, клинико - морфологической формой, размером опухоли).

Научная новизна.

Впервые с использованием комплекса современных методов исследования (гистологического, гистохимического и морфометрического с применением компьютерных программ анализа изображений) в сравнительном аспекте изучена активность ядрышкового аппарата в ядрах эпителия слизистой оболочки желудка от нормы до рака различного гистологического строения. Выявлены достоверные различия дисплазий различной степени тяжести и гистологических типов рака по активности ядрышкового аппарата, что может позволить проведение морфологического дифференциального анализа между этими процессами. Прослежена взаимосвязь между активностью ядрышкового аппарата опухолевых клеток и клинико - морфологическими характеристиками злокачественных новообразований.

Произведен анализ активности ядрышкового аппарата в метастазирующих карциномах и опухолях без метастазов. Выявлено, что в метастазирующих опухолях активность ядрышкового аппарата значительно возрастает. Установлено возрастание активности ядрышкового аппарата опухолевых клеток в опухолях, где в сосудах определяли раковые эмболы. Полученные результаты говорят о том, что метастазирование является следующим этапом прогрессии опухоли, оно связано с повышением активности ядрышкового аппарата опухолевых клеток и появлением новых более активных клонов пролиферирую-щих клеток. Полученные данные могут быть использованы при решении вопросов прогноза и лечения.

Практическая значимость

Проведение сравнительного анализа активности ядрышкового аппарата при фоновых, предраковых и злокачественных заболеваниях желудка позволило выработать критерии и новые подходы к дифференциальной диагностике между этими процессами. Прослежена динамика изменения активности ядрышкового аппарата опухолевых клеток при снижении дифференцировки и нарастании злокачественности опухолевого процесса.

Реализация практических рекомендаций

Результаты проведенных исследований используются на кафедре патологической анатомии АГМУ, прозектуре №2 г. Барнаула и Алтайском филиале РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН г. Барнаула, при исследовании гастробиопта-тов и операционного материала, а также при чтении лекций студентам и врачам и проведении практических занятий по патологической анатомии.

Положения выносимые на защиту

1. В основу дифференциальной диагностики между дисплазиями различной степени выраженности и высокодифференцированной аденокарци-номой может быть положено изучение активности ядрышкового аппарата клеток. Функциональная активность ядрышковых организаторов опухолевых клеток характеризует пролиферативную активность и возрастает по мере снижения дифференцировки опухолевых клеток. Активность ядрышкового аппарата опухолевых клеток выше в метастази-рующих опухолях.

2. Компьютерный анализ изображений ядрышкового аппарата опухолевых клеток при раке желудка позволяет объективизировать оценку активности нуклеолярного аппарата опухолевых клеток при раке желудка. Суммарная площадь ядрышкообразующих зон на 1 ядро взаимосвязана с площадью ядра клетки и достоверно выше в опухолях с выраженной клеточной атипией и наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах.

3. Наиболее важными параметрами ядрышкового аппарата опухолевых клеток являются качественные и количественные характеристики нук-леолонемных ядрышек. Количество и площадь нуклеолонемных ядрышек коррелирует с основными прогностическими значимыми клинико -морфологическими характеристиками опухолей: гистологическим типом, клеточным полиморфизмом, с наличием раковых эмболов в сосудах, наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах, количеством пораженных лимфатических узлов, площадью поражения лимфатического узла и клинико - морфологической формой роста опухоли.

ВЫВОДЫ

1. Клетки неизмененного покровного эпителия слизистой оболочки желудка характеризуются малой активностью ядрышкового аппарата и представлены микро- и кольцевидными ядрышками, активные ядрышки нуклеолонемного строения определяются только в герминативных зонах. При атрофическом гастрите активность ядрышкового аппарата достоверно возрастает в покровном эпителии за счет увеличения числа микро- и кольцевидных ядрышек, а в клетках кишечных крипт мебтаплазированных желез за счет увеличения количества фибриллярных центров в нуклеолонемных ядрышек.

2. Морфофункциональная активность ядрышкового аппарата клеток возрастает в цепочке патологических изменений от дисплазии легкой степени до рака. Снижение степени дифференцировки опухолей, сопровождается увеличением суммарной площади ядрышковых организаторов и количества гранул серебра на 1 ядро до 23,8±0,4; 46,0±0,8; 63,0±1,0 при высоко-, умеренно- и низкодифференцированной адено-карциноме соответственно.

3. Критериями дифференциальной диагностики между высокодифферен-цированной аденокарциномой и дисплазией тяжелой степени на основании исследования ядрышкового аппарата следует считать: возрастание в клетках опухоли среднего количества гранул серебра на 1 ядро до 23,8±0,45 и вид гистограммы характеризующей распределение клеток по содержанию гранул на 1 ядро с появлением сдвига в сторону возрастания числа клеток, содержащих от 39 до 59 гранул серебра.

4. Компьютерный анализ изображений позволяет объективизировать оценку активности ядрышковых организаторов при раке желудка. Суммарная площадь ядрышкообразующих зон на 1 ядро коррелирует с площадью ядра опухолевых клеток и достоверно выше в опухолях с выраженным клеточным полиморфизмом и наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах.

5. Морфофункциональная активность ядрышек нуклеолонемного строения опухолевых клеток наиболее взаимосвязана с клинико - морфологическими характеристиками опухолей. Количество и площадь нук-леолонемных ядрышек опухолевых клеток наиболее сильно коррелирует: с наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах (г = 0,51 - 0,67), количеством пораженных лимфатических узлов (г = 0,44 -0,46), площадью поражения лимфатического узла (г = 0,49 - 0,67), наличием эмболии сосудов раковыми клетками (г = 0,62 - 0,80), клинико - морфологической формой роста (г = 0,45 - 0,54), гистологическим типом (г = 0,47 - 0,55) и клеточным полиморфизмом (г = 0,57 - 0,74).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При патогистологическом исследовании гастробиоптатов и оперативно удаленных желудков по поводу рака желудка кроме обычных рутинных методов окраски гистологических препаратов в качестве дополнительного метода исследования следует использовать серебрение ядрышко-вых организаторов.

2. Для проведения дифференциальной диагностики между дисплазиями различной степени выраженности, дисплазией тяжелой степени и высо-кодифференцированной аденокарциномой, а также для изучения про-лиферативной активности и степени злокачественности опухоли следует проводить оценку активности ядрышкового аппарата опухолевых клеток. Оценка ядрышковой активности опухолевых клеток должна включать в себя кроме подсчета гранул серебра на 1 ядро, также изучение процентных соотношений различных морфофункциональных типов ядрышек и разграничение различных клеточных популяций по активности ядрышкового аппарата для выявления процентного содержания наиболее злокачественных клонов.

3. Применение компьютерного анализа изображений может позволить ускорить и объективизировать изучение морфофункциональной активности ядрышкового аппарата клеток при патологии желудка. Компьютерный анализ ядрышкового аппарата клеток должен включать в себя подсчет всех обнаруженных в ядре ЯОЗ, суммарной площади ЯОЗ на 1 ядро, с подсчет ЯОЗ - ядерного соотношения и разграничение различных клеточных популяций по площади ЯОЗ для выявления наиболее злокачественных клонов обнаруживающих наиболее высокие значения.

4. Для уточнения прогноза заболевания и выяснения метастатического потенциала опухоли патоморфологическое исследование операционного материала, наряду с оценкой традиционных факторов прогноза рака желудка должно предусматривать определение морфофункциональной активности нуклеолярного аппарата опухолевых клеток.