Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Диагностическая значимость метода полимеразной цепной реакции при генотипировании Helicobacter pylori у детей с хронической гастродуоденальной патологией

На правах рукописи

МИШКИНА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ МЕТОДА ПОЛИМЕРАЗНОЙ

/

ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ПРИ ГЕНОТИПИРОВАНИИ HELICOBACTER PYLORI У ДЕТЕЙ С ХРОНИЧЕСКОЙ ГАСТРОДУОДЕНАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИЕЙ

14.00.09 - Педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2007

Работа выполнена на кафедре педиатрии №2 с курсом гастроэнтерологии ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская Медицинская Академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, Александрова Валентина Александровна

профессор

Научный консультант:

доктор медицинских наук Суворов Александр Николаевич

профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Романюк Федор Петрович,

заведующий кафедрой педиатрии №3 с курсом неонатологии ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская Медицинская Академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

доктор медицинских наук, профессор Эрман Лев Владимирович,

заведующий кафедрой поликлинической педиатрии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова»

4с/ ¿у.-, л Защита состоится « ' » гОъОг С/п^Г_2007 года в _ часов на

заседании диссертационного совета Д. 208.089.05. при ГОУ ДПО «Санкт-

Петербургская Медицинская Академия последипломного образования

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по

адресу: 191015, Санкт-Петербург, Кирочная ул., д. 41.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская Медицинская Академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 195196, Санкт-Петербург, Заневский пр., д. 1/82.

Автореферат разослан <<года

Ученый секретарь диссертационного совета, ^

доктор медицинских наук, профессор п ' В.В. Кирьянова

/Фи-^О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Хронические заболевания верхних отделов гастродуоденального тракта являются наиболее частой патологией, встречающейся как у взрослых, так и у детей (Мазурин А В , Запруднов А М ,1995) Ведущее место среди этиологических факторов развития патологии желудочно-кишечного тракта в настоящее время занимают болезни органов пищеварения, ассоциированные с Helicobacter Pylori (HP) За прошедший период с 1983 года (Warren J R , Marshall В J , 1983) были изучены его свойства, описаны многие звенья патогенеза заболеваний, развивающихся при инвазии HP (Григорьев ПЯ, Яковенко АВ, 2001, Исаков В А, Домарадский ИВ, 2003, Chuan Z, Nobutaka Y, 2005), определены методы диагностики и оптимальные схемы лечения Особое место занимают исследования HP-ассоциированных заболеваний у детей (Корсунский А А) Остается дискутабельным ряд вопросов, касающихся степени патогенности этого микроорганизма, особенностей патогенеза, эпидемиологии Еще ждут своего решения проблемы профилактики инвазии, показаний к применению антибактериальных средств у НР(+) лиц без клинических проявлений, а также у пациентов, инфицированных одновременно несколькими штаммами хеликобактера (Корсунский А А, Щербаков П П, Исаков В А , 2002) Гастродуоденальные заболевания, ассоциированные с Helicobacter Pylori, отличаются большим разнообразием эндоскопических, морфологических и клинических проявлений Вопрос о том, что предопределяет развитие той или иной формы заболевания, сложен и до настоящего времени не решен Большинство исследователей высказывают предположение о ведущем значении внутривидового разнообразия штаммов данного микроба (Корсунский А А, Щербаков ПП, 2002, Marshall В J, 1991), генетической предрасположенности (Аруин ЛИ, 1997, Ивашкин ВТ, Лапина ТЛ, 1997), длительности заболевания (Аруин ЛИ, Григорьев ПЛ, 1993), степени обсемененности HP слизистой оболочки желудка (Говорун В М, Гущин А Е , 2000), характера иммунного ответа (Ивашкин В Т, Лапина Т Л, 1997) В последнее время во многих научных работах изучается роль особенностей мак-

роорганизма в патогенезе хеликобактериоза (Циммерман Я С ,2000, Павленко Н В , 1999, Аруин JIИ , 2007, El Omar, 2001) Многими исследователями ведется настойчивый поиск штаммов HP, специфичных для развития определенных гастродуоденальных заболеваний Сообщения о роли различных штаммов весьма противоречивы (Yamaoka Y ,1999, 2006, Mahaboob А , 2001, Van Doom L , 1998) По мнению отдельных авторов в природе не существует «ульцеро-генных» штаммов HP Однако зарубежные и отечественные публикации (Gormally SM, 1996, Hardicar W, 1996 Kolho KL, 1999, Корсунский A A, 2002, Корниенко E A ,1999), посвященные генотипированию хеликобактера в детском возрасте, не позволяют согласиться с подобным мнением

В настоящее время с использованием технологии ПЦР проводится огромное количество молекулярно-эпидемиологических исследований HP на предмет присутствия в геноме специфических генов вирулентности, в которых помимо генов «острова патогенности», определяют присутствие определенных аллелей гена vacA, iceA (Takahico К, Graham D L , 2004) Крайне актуальна диагностика не только наличия инфекции HP, но и молекулярно-генетических характеристик микроорганизма, так как в настоящее время именно его генетическим особенностям отводится ведущая роль в развитии НР-ассо-циированных заболеваний (Yamaoka Y, 2001, 2002, 2005) Все вышесказанное указывает на необходимость проведения исследования генетических особенностей HP в детском возрасте и, исходя из полученных данных, определения дальнейшей тактики ведения пациента

Цель исследования: определение специфичности генотипов Helicobacter pylori с помощью метода полимеразной цепной реакции с целью оценки их значимости в развитии определенных хронических гастродуоденальных заболеваний у детей

Задачи исследования:

1 Сопоставление диагностической значимости метода полимеразной цепной реакции и стандартных методов исследования HP

2 Оценка диагностической значимости метода полимеразной цепной реакции для определения НР в различных биологических субстратах (биоптат, зубной налет, копрофильтрат)

3 Исследование частоты встречаемости НР у детей с хроническими заболеваниями верхних отделов желудочно-кишечного тракта

4 Проведение генотипирования НР в биоптате слизистой оболочки желудка с помощью метода полимеразной цепной реакции у детей с хроническими гастродуоденальными заболеваниями

5 Выявление взаимосвязи между определенными клинико-эндоскопи-ческими проявлениями и генотипами НР

6 Исследование состояния инфицированности хеликобактером родителей обследованных детей

7 Определение уровня устойчивости штаммов НР к кларитромицину

Научная новизна. Доказана специфичность генотипов НР (са§Аса^-

уасАв 1, са§Аса§НуасАз2) для развития определенных хронических гастродуоденальных заболеваний в детском возрасте Выявлено преобладание диагностической значимости метода полимеразной цепной реакции при генотипировании НР в биоптатах СОЖ по сравнению с их определением в других биологических субстратах (зубной налет, копрофильтрат) Установлена высокая степень инфицирования НР в семьях детей с хроническими гастродуоденальными заболеваниями Выявлено повышение уровня резистентности НР к макролидам у детей Санкт-Петербурга с хроническими заболеваниями гастродуоденальной зоны с помощью метода полимеразной цепной реакции

Практическая значимость. Обнаруженная взаимосвязь определенных заболеваний гастродуоденального тракта у детей с генотипами НР, позволяет дифференцировано подходить к лечению и прогнозу хронических заболеваний верхних отделов пищеварительного тракта, ассоциированных с НР Низкая диагностическая значимость метода ПЦР в копрофильтратах и зубных налетах исключает возможность использования этих субстратов для диагностики НР

инфекции у детей с хроническими заболеваниями верхних отделов ЖКТ Инфи-цированность хеликобактером родителей является фактором риска развития HP-ассоциированных заболеваний у детей и ее установление может быть использовано для профилактики хронических гастродуоденальных заболеваний Выбор антибактериального препарата для эрадикационной терапии должен осуществляться с учетом уровня устойчивости штаммов HP, определяемой с помощью метода ПЦР или другими методами

Основные положения, выносимые на защиту:

1 При генотипировании HP методом полимеразной цепной реакции у детей с хроническими гастродуоденальными заболеваниями определяются генотипы HP, специфичные для развития определенных хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта

2 Низкая диагностическая значимость метода полимеразной цепной реакции в таких биологических субстратах, как зубной налет и копрофильтрат не позволяет использовать эти субстраты для диагностики хеликобактера в СОЖ

3 Высокий уровень инфицированное™ Н. pylon родителей 6 семьях обследованных детей способствует появлению хронических НР-ассоциирован-ных заболеваний ЖКТ у детей

4 Относительно высокая резистентность Н pylori (22%) к препаратам групппы макролидов на примере кларитромицина, выявленная с помощью метода полимеразной цепной реакции, не позволяет использовать кларитро-мицин в схемах антихеликобактерной терапии

Личное участие автора в проведении исследования Самостоятельно проведен ПЦР анализ части биоптатов слизистой оболочки желудка, копро-фильтратов Выполнен аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, проведено обобщение полученных данных, статистический анализ результатов исследования с компьютерной обработкой

Внедрение результатов. Результаты работы внедрены в практику работы консультативно-диагностического центра для детей №2 СПбГУЗ «Городская

поликлиника №23» и используются в процессе преподавания на кафедре педиатрии №2 с курсом гастроэнтерологии ГОУ ДПО СПбМАПО Росздрава

Апробация работы. Основные теоретические и практические положения диссертационной работы прошли апробацию на 8 Славяно-Балтийском форуме (г Санкт-Петербург, 2006), на XIII, XIV конгрессе детских гастроэнтерологов России «Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей» (Москва, 2006, 2007), на научно-практической конференции молодых ученых и специалистов ГОУ ДПО СПбМАПО Росздрава «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины-2006» (г Санкт-Петербург, 2006)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 1 в журнале, рекомендуемом ВАК

Объем и структура диссертации: диссертация изложена на 107 страницах, состоит из введения, 4 глав, выводов и практических рекомендаций Работа иллюстрирована 29 таблицами и 12 рисунками. Список литературы содержит 200 источников (отечественной - 67, иностранной - 133)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Работа проведена на базе консультативно-диагностического центра для детей №2 СПбГУЗ «Городская поликлиника №23» Всего было обследовано 179 детей в возрасте 7-18 лет с хроническими заболеваниями гастродуоденальной зоны У всех детей проведено общеклиническое обследование - фиброгастродуоденоскопия (ФГДС) с биопсией слизистой оболочки желудка (СОЖ) из антрального отдела и тела, ультразвуковое исследование органов брюшной полости, гастроимпе-дансометрия, осмотры врачей-специалистов Выраженность проявлений основных синдромов - болевого, диспептического и астеновегетативного, оценивали по 3-балльной шкале При лабораторном обследовании определяли показатели клинического анализа крови, анализ мочи, копрограммы, исследование на глистно-паразитарную инвазию, по показаниям - биохимическое исследование крови с определением белковых фракций, общего билирубина, холестерина, щелочной фосфатазы

g

Диагностику HP-инфекции проводили с использованием комплекса инва-зивных и неинвазивных методов Уреазную активность HP in vitro исследовали у 179 детей с помощью быстрого уреазного теста (HELPIL-test) производства ООО «Синтана», Санкт-Петербург Результат при постановке уреазного теста расценивали как положительный при изменении окраски на 1-й (+++), 2-й (++) и 3-й (+) минутах Гистологическое исследование биоптатов слизистой оболочки антрального отдела (174) и тела (157) желудка проводили в патоморфологической лаборатории ДГБ №5 Для исследования брали 2 биоп-тата, фиксировали материал в 10% растворе формалина, заключали в парафин и делали срезы Проведение метода полимеразной цепной реакции в биоптатах СОЖ антрального отдела (177) и тела желудка (154) осуществлялось в лаборатории НИИ Экспериментальной Медицины РАМН ДНК определяли наборами реагентов «ООО Интерлабсервис», «Литех» Амплификацию проводили в приборе «Терцик» Затем продукты амплификации идентифицировали в 1,5% ага-розном геле в присутствии бромида этидия

Полученные в ходе работы результаты регистрировались автором в специально разработанных таблицах, включающих данные анамнеза жизни, особенности клинического течения, данные эндоскопического, лабораторного и инструментального обследования, а также результаты обследования родителей пациентов Полученные в процессе исследования медико-биологические данные обрабатывались с использованием модулей системы STATISTICA for Windows (версия 5 5) Различия считались достоверными при р < 0,05

Результаты собственных исследований. В настоящем исследовании под наблюдением находилось 179 детей в возрасте 7-18 лет с хроническими заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки Средний возраст обследованных детей составил 13,4±0,2 года, среди них - 96 мальчиков и 83 девочки Длительность анамнеза заболевания составила в среднем 3,9 года При обследовании у наших пациентов были выявлены следующие нозологические формы хронический гастродуоденит (ХГД) - 148, эрозивный гастродуоденит (ЭГД) -21, язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки (ЯБДК) - 10

Следует отметить, что различные методы диагностики НР в нашем исследовании (быстрый уреазный тест, гистологический метод) демонстрировали различную частоту выявления НР-инфекции Поэтому, окончательное заключение о НР-статусе проводили с учетом оценки результатов ПЦР в биоп-тате слизистой оболочки антрального отдела желудка, который был принят за эталон

Хеликобактерная инфекция была выявлена у 75,7% (69,2-81,7) пациентов методом ПЦР в биоптатах слизистой оболочки желудка антрального отдела По результатам проведения быстрого уреазного теста в биоптатах СОЖ, инфекция НР была обнаружена у 140 из 179 детей (78%) Совпадение результатов уреазного теста и метода ПЦР составило 72,8% (66,1 — 79,1) Количество лож-ноположительных значений уреазного теста - 14,6%, что, вероятно, можно объяснить присутствием в слизистой оболочке других уреазопродуцентов Количество ложноотрицательных значений - 12,4%, что, возможно, является следствием недостаточной обсемененности биоптата слизистой оболочки Гистологический метод исследования был выполнен у 174 детей, положительный результат метода бы отмечен у 132 детей, что составило 75% Совпадение результатов гистологического метода и ПЦР наблюдалось в 78,4% (72,2 - 84,2) случаев Количество ложноположительных значений составило 10,4%, количество ложноотрицательных-11% Таким образом, по нашим данным диагностическая значимость этих методов выявления НР в СОЖ сопоставима, но следует отметить, что гистологический метод является более точным (больший процент совпадения результатов), кроме того, он дает информацию о состоянии слизистой оболочки желудка

При обследовании у всех детей тщательно оценивались клинические симптомы (болевой, диспептический, астено-вегетативный), а также данные анамнеза (возрастные особенности, наследственность) Результаты сравнительного анализа частоты и выраженности основных клинических симптомов у НР(-) и НР(+) пациентов приведены в таблице 1

Таблица 1

Частота различной степени выраженности болевого синдрома среди НР-позитивных и НР-негативных пациентов

НР-статус НР-негативные НР-позитивные

Степеньвйра^_ Пациенты Пациенты

женности синдрома--^

«+» 63,1%** 36,9%

«++» 20,75% 79,2%*

«+++» 17,65% 82,35%*

** различия между группами НР(-) и НР(+), р<0,01, * - р< 0,05

Болевой абдоминальный синдром у большинства НР(-) детей был представлен как слабо выраженный, а в группе НР(+) детей этот синдром достоверно чаще встречался как умеренно или сильно выраженный (р < 0,05)

У большей части пациентов проявления диспептического синдрома также были умеренными, однако, частота и выраженность диспептических проявлений не зависела от наличия НР-инфекции (р < 0,05). Следует отметить, что выраженность балльной оценки клинической симптоматики по основным синдромам не зависела от степени тяжести поражения СОЖ (р < 0,05)

При изучении данных анамнеза мы определяли зависимость инфицирования НР от возраста и отягощенной наследственности по язвенной болезни Как оказалось, в младшей и средней возрастных группах достоверных различий в уровне инфицированное™ детей хеликобактером выявлено не было У детей старшей возрастной группы (14-18 лет) наблюдалось достоверное повышение уровня НР инфекции, что согласуется с литературными данными об увеличении частоты инфицирования хеликобактериозом с возрастом (В1ескег и ,1997, БаП С Н ,1997)

Анализ влияния наследственности по язвенной болезни и хроническим эрозивным гастродуоденитам на частоту НР инфицирования у детей, представлен в таблице 2.

Таблица 2

Частота наследственной отягощенности по язвенной болезни у обследованных детей в зависимости от НР-инфицирования

^~~\НР-статус НР(+)% НР(-)%

Не отягощена 24,26 58,1

Отягощена 75,2* 41,9

* различия между группами НР(-) и НР(+), (р <0,05)

Было установлено, что в группе НР-негативных пациентов наследственность была отягощена у 41,9% детей, в то время как у НР-позитивных пациентов наследственность по язвенной болезни встречалась достоверно чаще и составила 75,2% Эти данные подтверждают значение наследственности как важного этиологического фактора в развитии хронической патологии ЖКТ (Климанская Е В , 1997, Можейко А Г , 1999, Щербаков П Л , 1999)

К настоящему времени, хорошо изучены эндоскопические и гистологические изменения СОЖ желудочно-кишечного тракта при НР-инфициро-вании У болыпинства детей при эндоскопии обнаруживаются нодулярные элементы в антральном отделе желудка, а также эрозивно-язвенные дефекты СОЖ Данные о частоте эндоскопических изменений гастродуоденальной слизистой у обследованных нами детей представлены в таблице 3 Среди НР (-) детей достоверно чаще наблюдались поверхностные повреждения или отсутствие эндоскопической патологии слизистой оболочки (р < 0,05) В группе НР(+) детей достоверно чаще встречались гиперпластические и эрозивно-язвенные повреждения СОЖ

При поверхностном гастродуодените НР-инфекция обнаруживалась у 54,3% пациентов, в то время как при нодулярном гастродуодените - у 92% Наличие эрозий и язвенных дефектов было ассоциировано с НР-инфици-рованием в 86% и 70%, соответственно Таким образом, наши результаты полностью совпали с литературными данными о тесной взаимосвязи НР-инфицирования и развития нодулярных, эрозивно-язвенных изменений СОЖ (Иса-

ков В А , Домарадский И В , 2003, СЬиап Ъ , ЫоЬШака У ,2005, Суворов А Н, Симаненков В И ,2006) (таблица 3)

Таблица 3

Частота НР-инфицирования при различных формах гастродуоденальных заболеваний у детей

Патология Норма пгд нгд ГД с мн эгд ЯБ

НР(+) N 7 19 68 15 18 7

% 41,2 54,3 91,9* 75* 85,7 70

НР(-) N 10 16 6 5 3 3

% 58,8 45,7 8,1 25 14,3 30

* различия между НР(-) и НР(+) группами, (р< 0,05)

Частота встречаемости эндоскопических изменений у НР-негативных детей представлена в таблице 4 По данным нашего исследования, при отсутствии инфекционного агента в СОЖ, эрозивно-язвенные повреждения наблюдаются лишь у 13,8% пациентов, что также согласуется с современными литературными данными (Исаков В А, Домарадский И В ,2003)

Как известно, наиболее точным методом диагностики гастритических изменений в слизистой оболочке желудка является морфологический метод Мы сопоставили эндоскопические изменения, а также степень активности и воспаления при гистологическом исследовании (таблица 5) Следует отметить, что у пациентов без эндоскопических изменений в 100% случаев при гистологическом исследовании были обнаружены изменения, характерные для хронического гастрита (выраженные активность и воспаление) Таким образом, эндоскопический метод диагностики не дает полной информации о состоянии слизистой оболочки желудка

Таблица 4

Частота эндоскопических изменений у НР-негативных детей

-\IiP- статус Энд изменения"^---^ НР-негативные дети

N (43) %

Без патологии (по ФГДС) 10 23,2*

Поверхностный ХГД 16 37,21*

Нодулярный ГД 6 13,95

ГД с моторными нарушениями 5 11,6

эгд 3 6,9

ЯБДПК 3 6,9

* различия в группе НР(-), (р< 0,05)

Таблица 5

Частота эндоскопических изменений СОЖ в зависимости от степени

активности и воспаления

Гистол Активность Воспаление

ИсследХ^ Энд ИзменешЫ, Слабо значительно Слабо значительно

выражена выражена выражено выражено

пгд 2,8 97,1 20 80

Норма - 100 27,7 72,2

нгд - 100 2,8 97,1

ГДсМН - 100 15,7 84,2

эгд - 100 4,7 95,2

ЯБ 12пк - 100 10 90

У обследованных детей были выявлены сопутствующие заболевания такие как, дискинезия желчевыводящих путей, различные нарушения осанки, аллергические заболевания, нарушения ритма сердца и проводимости, а также глистные инвазии (таблица 6) Наиболее частой сопутствующей патологией у обследованных детей были дискинезии желчевыводящих путей, глистно-протозойные инвазии, а также нарушения осанки

Таблица 6

Частота сопутствующей патологии у обследованных детей

Сопутствующая патология Число детей

N %

ДЖВП 179 100

Нарушения осанки 107 59,8

Аллергические заболевания 4 2,3

Глистные инвазии 132 75

Патология ССС 6 3,4

Большое значение имеет проведение генотипирования НР и исследование взаимосвязи генотипов с различными клинико-морфологическими изменениями СОЖ С помощью метода ПЦР мы провели генотипирование 143 НР-позитивных детей с хроническими гастродуоденальными заболеваниями (рис 1) Среди обследованных детей выявились следующие генотипы уасАэ 1 (1), уасАБ2 (2), cagAvacAsl (3), са§Аса§Н (4), cagA (5), са£Аса§НуасАв1 (6), са§Аса§НуасАз2 (7), са§АуасАз2 (8), са§НуасАэ1 (9), cagHvacAs2 (10) Для определения значимости различных генотипов хеликобактера в развитии патологических изменений в слизистой оболочке желудка большое значение имеет частота их встречаемости у детей Из диаграммы отчетливо видно преобладание у детей генотипа cagAcagHvacAsl (6) Было важно установить взаимосвязь определенного генотипа с эндоскопическими, морфологическими изменениями и выявить существование специфических генотипов для развития определенных заболеваний верхних отделов ЖКТ в детском возрасте Анализ эндоскопических изменений СОЖ у детей с различными генотипами показал, что при поверхностных поражениях слизистой оболочки наблюдались все десять генотипов (рис 1) Преобладали 1 (уасАэ1) и 2 (уасАв2) генотипы, в то время, как при нодулярных изменениях, достоверно чаще обнаруживались генотипы cagAcagHvacAsl (6) и cagAcagHvacAs2 (7) (29% и 16% соответственно), наряду с остальными генотипами (рис 2)

Рис. 1. Частота встречаемости различных генотипов у обследованных детей.

У детей с эрозивным хроническим гастродуоденигом количество определяемых генотипов НР было меньшим (6), достоверно чаще мы также наблюдали 6 генотип (cagAcagHvacAs 1) (рис.3). При язвенных дефектах наблюдалось всего два генотипа НР, и генотип са§Аса§НуасАз1 (6) встречался также достоверно чаще (рис. 4).

Таким образом, данное исследование показало, что при генотипе са§Аса§НуасАБ1 достоверно чаще встречаются нодулярные, а также эрозивно-язвенные дефекты СОЖ, что позволяет говорить о специфичности данного генотипа для развития определенных изменений в слизистой оболочке желудка, а, следовательно, и для развития определенных гастродуоденальных заболеваний в детском возрасте.

Рис.2 Частота встречаемости генотипов при нодулярном гастродуодените.

В научной литературе в последнее время все чаще появляются работы, опровергающие существование «ульцерогенных» штаммов НР (Циммерман Я.С., 2006). Результаты нашего исследования позволяют сомневаться в категоричности такого утверждения, особенно при НР-инфицировании в детском возрасте. Необходимо отметить, что присутствие обоих маркеров острова патогенности (са§А, са§Н) в геноме НР у обследованных пациентов указывает на то, что только полноценный остров патогенности является условием для развития более тяжелого патологического процесса в СОЖ.

При анализе морфологических изменений у НР(+) детей выявлена взаимосвязь степени выраженности воспаления и активности процесса с определенными генотипами НР. При поверхностных повреждениях слизистой оболочки воспаление и активность были слабо выражены. При нодулярных изменениях чаще наблюдались более выраженные воспаление (43%) и активность (63%) процесса. У детей с эрозивными изменениями СОЖ высокая степень воспаления и активности процесса наблюдались у 65% и у 95% больных соответственно.

Рис.3 Частота встречаемости генотипов при эрозивном гастродуодените

Рис.4. Частота встречаемости генотипов при ЯБДК.

При язвообразовании воспаление и активность процесса, соответствующие значительно выраженным, были обнаружены у 60 и 90% детей. Следовательно, у пациентов с нодулярными, эрозивно-язвенными изменениями СОЖ достоверно чаще имеют место выраженные морфологические изменения, что подтверждает литературные данные (Нургалиева Б.К., 2004).

Известно, что НР может быть выявлен не только из антрального отдела, но и из тела желудка. При этом выявляются неодинаковые генотипы хелико-

бактера (Russmann Н , Kempf V А , 2001) Это может стать причиной неудачных попыток лечения HP у детей с хронической гастродуоденальной патологией Поэтому в данном исследовании мы проводили определение Helicobacter Pylori не только в антральном отделе, но и в теле желудка Получены положительные результаты определения HP в теле желудка у 80% пациентов При использовании метода ПЦР, появилась возможность сравнить генотипы, выделяемые из антрального отдела и тела желудка У 12% детей из числа обследованных, мы обнаружили одновременное выделение двух генотипов хели-кобактера, что свидетельствует о нахождении в СОЖ более одного штамма HP Таким образом, учитывая полученные данные, необходимо при обследовании больных проводить определение HP и в антральном отделе, и в теле желудка С одной стороны, одновременная контаминация СОЖ более чем одним штаммом HP может явиться причиной неудачной терапии, а также реинфицирования С другой стороны, до сих пор неизвестно, может ли инфекция смешанной культурой хеликобактера увеличить риск серьезных клинических проявлений, таких как язва или рак желудка Остается также • открытым вопрос о подходе к лечению таких пациентов (Корсунский А А , П JI Щербаков, 2003)

В настоящее время активно ведется поиск неинвазивных методов диагностики HP У взрослых пациентов метод ПЦР проводится в зубном налете, копрофильтрате Мы проводили выявление HP у детей с хроническими заболеваниями верхних отделов ЖКТ в таких же субстратах, как зубной налет и копрофильтрат С помощью метода ПЦР хеликобактер в зубном налете детей с гастродуоденальными заболеваниями определялся в 27,9% случаев Учитывая разное количество зубного налета в различные возрастные периоды, мы пытались найти различия в частоте обнаружения HP в зубном налете в зависимости от возраста Наблюдалась тенденция к увеличению частоты обнаружения HP у детей старше 10 лет, но результаты оказались недостоверными Частота совпадения результатов выявления HP из биоптатов антрадь-ного отдела желудка и из зубного налета составила 43,2% Подобные

результаты проведения ПЦР по выявлению HP в зубном налете, которые наблюдаются во многих исследовательских работах, на настоящий момент рассматривается скорее, как аргумент в пользу несостоятельности попыток выявления HP из ротовой полости, чем в пользу того, что сама ротовая полость является резервуаром этого микроорганизма (Gerguson D, 1993) В копро-фильтрате методом ПЦР хеликобактер определялся также у небольшого количества детей - 27,3% Частота совпадений результатов определения HP в биоп-татах антрального отдела и копрофильтрата составила 43,8% Возможно этот факт объясняется тем, что при пассаже по кишечнику HP превращается в кокковидную форму или погибает, начинает выделять другие антигены (Suzuki N ,2002) В результате он не обнаруживается стандартным набором праймеров Следовательно, из-за низкой чувствительности метода ПЦР в зубном налете и копрофильтрате не представляется возможным на настоящий момент Пользоваться данными субстратами для выявления инфицированное™ HP, а также для контроля за эффективностью эрадикации

С целью выявления семейной инфицированности и ее значения в развитии заболеваний было обследовано 128 родителей из семей больных детей Исследования показали, что хеликобактер был обнаружен у 78% родителей, причем чаще у одного (91%) родителя и только в 9% случаев - у двух родителей Особого интереса заслуживают данные, полученные при анализе НР-статуса детей в таких семьях (рис 5) У HP-негативных родителей частота выявления HP-положительных детей составила 50% При инфицировании хеликобактером одного из родителей, частота выявления HP-позитивных детей составила 90% В семьях, где были инфицированы оба родителя, по нашим данным все дети также были HP-инфицированы Следовательно, при выделении хеликобактера от обоих родителей, по данным нашего исследования, дети будут всегда инфицированы Таким образом, подтверждаются литературные данные о значении внутрисемейного пути передачи НР-инфекции (Щербаков П JI, 2006)

Рис.5 Частота инфицирования НР в семьях обследованных детей.

Современные международные рекомендации предусматривают проведение медикаментозной терапии НР-инфекции по схемам, содержащим ингибитор протонной помпы и два антибактериальных препарата, направленных на эрадикацию хеликобактера. В связи с частым выбором кларитромицина, как антибиотика 1-й линии терапии НР инфекции, представляло интерес проанализировать чувствительность выделенных штаммов хеликобактера к этому антибиотику. Использование метода ПЦР в сочетании с рестрикционным анализом (ПДРФ) дает возможность эффективно выявлять точковые мутации в гене 23 рРНК и может служить надежным инструментом определения устойчивых к кларитромицину штаммов, что позволит выбрать средство для эради-кационной терапии более эффективно. Были обследованы 45 пациентов с целью выявления мутаций в гене 23 рРНК. В нашем исследовании у 10 детей были обнаружены штаммы НР, устойчивые к кларитромицину, что составило 22% (таблица 7).

Использование кларитромицина в терапии 1-й линии, согласно 3-ему Маастрихтскому соглашению, имеет смысл только в том случае, если первичная устойчивость к этому антибиотику составляет менее 15-20%.

Таблица 7

Определение чувствительности штаммов HP к кларитромицину

Штаммы HP Число детей

N %

0 2 4,4

Чувств к кларитромицину 33 73,3

А2142 3 6,7

А2143 6 13,3

Т2717 1 2,3

Всего 45 100

Следовательно, обнаруженный нами уровень устойчивости штаммов HP к кларитромицину, делает нецелесообразным включение антибиотиков ряда макролидов в терапию хеликобактериоза у детей с хронической гастродуоденальной патологией Санкт-Петербурга

ВЫВОДЫ

1 Метод полимеразной цепной реакции является высокоэффективным методом диагностики хеликобактера и его генотипирования с целью выявления наиболее вирулентных штаммов Н pylori

2 Распространенность HP-инфекции среди детей с хроническими гастро-дуоденальными заболеваниями, определяемая методом ПЦР в СОЖ, составила 75,7 %

3 При генотипировании у детей с HP-ассоциированными хроническими гастродуоденальными заболеваниями достоверно чаще определялись генотипы cagAcagHvacAsl, cagAcagHvacAs2 При наиболее тяжелых морфологических формах гастродуоденитов (нодулярных, эрозивно-язвенных) достоверно чаще выявлялся генотип cagAcagHvacAsl, что может свидетельствовать о специфичности данного генотипа для развития определенных гастродуо-денальных заболеваний

4 При сопоставлении диагностической значимости инвазивных методов определения HP в СОЖ, при условии взятия ПИР за эталон, диагностическая

значимость гистологического исследования составила - 78,4%, а быстрого уреазного теста — 72,8%

5 Низкая чувствительность метода ПЦР в зубном налете и копро-фильтрате не позволяет пользоваться данными субстратами для определения НР-инфицированности СОЖ и контроля за эрадикацией

6 Инфицированность хеликобактером детей в семьях, где один или оба родителя НР(+), составила 90% и 100% соответственно

7 Уровень устойчивости к кларитромицину выделенных штаммов НР среди детей Санкт-Петербурга составил 22%, что делает нецелесообразным применение препаратов группы макролидов в схемах антихеликобактерной терапии

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 С целью выявления вирулентного штамма НР для целенаправленного ведения пациентов рекомендуется проводить его генотипирование с помощью метода полимеразной цепной реакции

2 Для диагностики НР и контроля за эрадикацией хеликобактер целесообразно определять в биоптатах СОЖ антрального отдела и тела желудка

3 В случае отсутствия патологии при эндоскопическом исследовании, особенно у НР-инфицированных пациентов, необходимо обязательное проведение гистологического метода для более точного определения изменений слизистой оболочки желудка

4 При выявлении генотипа НР са^са§НуасАз1 у детей с хронической гастродуоденальной патологией следует немедленно проводить эрадикационную терапию, согласно рекомендациям Маастрихт-3

5 Необходимо проводить обследование детей НР-инфицированных родителей для выявления у них хеликобактера методом полимеразной цепной реакции или другими стандартными методами определения НР

6 При назначении эрадикационной терапии у детей Санкт-Петербурга с НР-ассоциированными хроническими заболеваниями гастродуоденальной зоны не рекомендуется использовать антибиотики из группы макролидов, в связи с уровнем резистентности, превыщающим 20%

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Осипов К В Генетический анализ устойчивости к кларитромицину штаммов Н pylori, изолированных у детей, проживающих в Санкт-Петербурге / К В Осипов, Т Г Зачепило, М А Суворова, А Н Суворов, Т В Мишкина// Гастроэнтерология Санкт-Петербурга материалы 8 Славяно-Балтийского форума-2006 - №1-2— С 114-115

2 Мишкина Т В Новые возможности полимеразной цепной реакции при генотипировании HP у детей с хроническими гастродуоденальными заболеваниями/ Т В Мишкина, В А Александрова, А Н Суворов// Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины-2006 сборник тезисов научно-практической конференции молодых ученых и специалистов СПбМАПО - СПб, 2006-С 207

3 Мишкина ТВ Возможности метода полимеразной цепной реакции в диагностике HP - ассоциированных заболеваний у детей/ Т В Мишкина, В А Александрова, А Н Суворов //Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей материалы XIII конгресса детских гастроэнтерологов России -М , 2006 -С 237-238

4 Мишкина Т В Диагностика HP у детей с хроническими заболеваниями желудочно-кишечного тракта методом полимеразной цепной реакции/ Т В Мишкина, В А Александрова, А Н Суворов //Актуальные проблемы абдоминальной патологи и у детей материалы XIV конгресса детских гастроэнтерологов России - М ,2007 - С 159-160

5 Мишкина ТВ Полимеразная цепная реакция в диагностике хели-кобактерной инфекции у детей/ Т В Мишкина, В А Александрова, А Н Суворов //Врач - 2007 -№7 -С 74-76

Подписано в печать 09.10.07 г. Формат 60x84 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ 375.

Хронические заболевания верхних отделов гастродуоденального тракта являются наиболее частой патологией, встречающейся как у взрослых, так и у детей. Ведущее место среди этиологических факторов развития патологии желудочно-кишечного тракта в настоящее время занимают болезни органов пищеварения, ассоциированные с Helicobacter Pylori (HP). Гастроэнтерологи и исследователи всего мира начали изучать проблему хеликобактериоза с 1983 года, когда был открыт этот микроорганизм [145]. За прошедшее время были изучены его свойства, описаны многие звенья патогенеза заболеваний, развивающихся при инвазии HP, определены методы диагностики и оптимальные схемы лечения. Однако многие аспекты проблемы хеликобактериоза до настоящего времени недостаточно изучены или освещены. Особое место занимают исследования ассоциированных с HP заболеваний у детей. Остается дискутабель-ным ряд вопросов, касающихся степени патогенности этого микроорганизма, особенностей патогенеза, эпидемиологии. Открыты проблемы профилактики инвазии, показания к применению антибактериальных средств у инфицированных лиц без клинических проявлений, а также у пациентов, инфицированных одновременно несколькими штаммами HP [18, 32,46, 48,57].

Гастродуоденальные заболевания, ассоциированные с хеликобактером, отличаются большим разнообразием эндоскопических, морфологических и клинических проявлений. Вопрос о том, что предопределяет развитие той или иной формы заболевания, сложен и на настоящее время не решен [41]. Большинство исследователей высказывают предположение о ведущем значении внутривидового разнообразия штаммов данного микроба [32, 143], генетической предрасположенности [4, 41], длительности заболевания [4], степени обсемененности HP слизистой оболочки желудка [15], характера иммунного ответа [23, 24]. В последнее время во многих научных работах изучается роль особенностей макроорганизма в патогенезе хелико-бактериоза [57,106].

Учеными ведется настойчивый поиск штаммов HP, специфичных для развития определенных гастродуоденальных заболеваний. Сообщения о роли различных штаммов весьма противоречивы [110, 131, 132, 139, 167, 181, 196]. По мнению отдельных авторов, в природе не существует «ульцерогенных» штаммов HP. Однако зарубежные и отечественные публикации [8, 14, 18, 32, 83, 133], посвященные гено-типированию хеликобактера в детском возрасте, не позволяют делать такое же утверждение в детской гастроэнтерологии.

В настоящее время с использованием технологии ПЦР проводится огромное количество молекулярно-эпидемиологических исследований HP на предмет присутствия в геноме специфических генов вирулентности, в которых помимо генов «острова патогенности», определяют присутствие определенных аллелей гена vacA, iceA [196, 197]. Все вышесказанное указывает на необходимость проведения исследования генетических особенностей HP в детском возрасте и, исходя из полученных данных, назначения дальнейшей тактики ведения пациента.

Стремительное накопление теоретических знаний о хелико-бактериозе, сопровождается заметным отставанием в их внедрении в повседневную врачебную практику. Этот разрыв нередко оборачивается ошибками в диагностике и выборе тактики лечения НР-инфек-ции у детей.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Определение специфичности генотипов Helicobacter pylori с помощью метода полимеразной цепной реакции с целью оценки их значимости в развитии определенных хронических гастродуоденальных заболеваний у детей.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Сопоставление диагностической значимости метода полиме-разной цепной реакции и стандартных методов исследования НР.

2. Оценка диагностической значимости метода полимеразной цепной реакции для определения НР в различных биологических субстратах (биоптат, зубной налет, копрофильтрат).

3. Исследование частоты встречаемости НР у детей с хроническими заболеваниями верхних отделов желудочно-кишечного тракта.

4. Проведение генотипирования НР в биоптате слизистой оболочки желудка с помощью метода полимеразной цепной реакции у детей с хроническими гастродуоденальными заболеваниями.

5. Выявление взаимосвязи между определенными клинико-эндо-скопическими проявлениями и генотипами НР.

6. Исследование состояния инфицированности хеликобактером родителей обследованных детей.

7. Определение уровня устойчивости штаммов НР к кпаритро-мицину.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Доказана специфичность генотипов НР (садАсадН7асАз1, садАсадНуасАэг) для развития определенных гастродуоденальных заболеваний.

Выявлено преобладание диагностической значимости метода полимеразной цепной реакции при генотипировании НР в биоптатах СОЖ по сравнению с их определением в других биологических субстратах (зубной налет, копрофильтрат).

Установлена высокая степень инфицирования НР в семьях детей с хроническими гастродуоденальными заболеваниями.

Выявлено повышение уровня резистентности НР к макролидам у детей с хроническими заболеваниями гастродуоденальной зоны Санкт-Петербурга с помощью метода полимеразной цепной реакции.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Обнаруженная взаимосвязь определенных заболеваний гастродуоденального тракта у детей с генотипами НР, позволяет дифференцировано подходить к лечению и прогнозу хронических заболеваний верхних отделов пищеварительного тракта, ассоциированных с НР.

Низкая диагностическая значимость метода ПЦР в копро-фильтратах и зубных налетах, исключает возможность использования этих субстратов для диагностики НР-инфекции у детей с хроническими заболеваниями верхних отделов ЖКТ.

Инфицированность хеликобактером родителей является фактором риска развития НР-ассоциированных заболеваний у детей и ее установление может быть использовано для профилактики хронических гастродуоденальных заболеваний.

Выбор антибактериального препарата для эрадикационной терапии должен осуществляться с учетом уровня устойчивости штаммов НР, определяемой с помощью метода ПЦР или другими методами.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. При генотипировании НР методом полимеразной цепной реакции у детей с хроническими гастродуоденальными заболеваниями, определяются генотипы НР, специфичные для развития определенных хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта.

2. Низкая диагностическая значимость метода полимеразной цепной реакции в таких биологических субстратах как зубной налет и копрофильтрат, не позволяет использовать эти субстраты для диагностики хеликобактера в слизистой оболочке желудка.

3. Высокий уровень инфицированное™ Н.pylori родителей в семьях обследованных детей способствует появлению хронических HP-ассоциированных заболеваний ЖКТ у детей.

4. Относительно высокая резистентность Н.pylori (22%) к препаратам группы макролидов на примере кларитромицина с помощью метода полимеразной цепной реакции, не позволяет использовать кларитромицин в схемах антихеликобактерной терапии.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. Результаты работы внедрены в практику работы консультативно-диагностического центра для детей №2 СПбГУЗ «Городская поликлиника №23» и используются в процессе преподавания на кафедре педиатрии №2 с курсом гастроэнтерологии СПбМАПО.

ЛИЧНОЕ УЧАСТИЕ АВТОРА В ПРОВЕДЕНИИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Самостоятельно проведен ПЦР анализ части биоптатов слизистой оболочки желудка, копрофильратов. Выполнен аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, проведено обобщение полученных данных, статистический анализ результатов исследования с компьютерной обработкой.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные теоретические и практические положения диссертационной работы прошли апробацию на Всероссийском научном форуме «Санкт-Петербург-Гастро-2006» (г.Санкт-Петербург, 2006), на 7 конгрессе гастроэнтерологов (г.Москва, 2006, 2007), на научно-практической конференции молодых ученых и специалистов СПбМАПО «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины-2006» (г.Санкт-Петербург, 2006). По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 1 - в журнале, рекомендуемом ВАК.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 107 страницах, состоит из введения, 4 глав, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 29

ВЫВОДЫ.

1. Метод полимеразной цепной реакции является высокоэффективным методом диагностики хеликобактера и его генотипирования с целью выявления наиболее вирулентных штаммов хеликобактера.

2. Распространенность НР-инфекции среди детей с хроническимим гастродуоденальными заболеваниями, определяемая методом ПЦР в СОЖ, составила 75,7%.

3. При генотипировании у детей с НР-ассоциированными хроническими гастродуоденальными заболеваниями достоверно чаще определялись генотипы: садАсадНуасАБ"!, садАсадНуасАв2. При наиболее тяжелых морфологических формах гастродуоденитов (нодулярных, эрозивно-язвенных) достоверно чаще выявлялся генотип садАсадНуасАэ"!, что может свидетельствовать о специфичности данного генотипа для развития определенных гастродуоденальных заболеваний.

4. При сопоставлении диагностической значимости инвазивных методов определения НР в СОЖ, при условии взятия ПЦР за эталон, диагностическая значимость гистологического исследования составила 78,4%, уреазного теста - 72,8%.

5. Низкая чувствительность метода ПЦР в зубном налете и копрофильтрате не позволяет пользоваться данными субстратами для определения НР-инфицированности СОЖ и контроля за эради-кацией.

6. Инфицированность хеликобактером детей, в семьях, где один или оба родителя НР(+), составила 90% и100% соответственно.

7. Уровень устойчивости к кларитромицину выделенных штамм-мов НР среди детей Санкт-Петербурга составил 22%, что делает нецелесообразным применение препаратов группы макролидов в схемах антихеликобактерной терапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. С целью выявления вирулентного штамма НР для целенаправленного ведения пациентов, рекомендуется проводить его генотипирование методом полимеразной цепной реакции.

2. Для диагностики НР и контроля за эрадикацией хеликобактер целесообразно определять в биоптатах СОЖ антрального отдела и тела желудка.

3. В случае отсутствия патологии при эндоскопическом исследовании, особенно у НР-инфицированных пациентов, необходимо обязательное проведение гистологического метода для более точного определения изменений слизистой оболочки желудка.

4. При выявлении генотипа НР садАсадНуасАБ1 у детей с гастродуоденальной патологией следует немедленно проводить эрадикационную терапию, согласно рекомендациям Маастрихт-3.

5. Необходимо проводить обследование детей НР-инфицированных родителей для выявления у них хеликобактера методом полимеразной цепной реакции или другими стандартными методами определения НР.

7. При назначении эрадикационной терапии у детей Санкт-Петербурга с НР-ассоциированными хроническими заболеваниями гастродуоденальной зоны не рекомендуется использовать антибиотики из группы макролидов, в связи с уровнем резистентности, превышающим 20%.