Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Иммунопатогенетические особенности развития хронического воспаления у больных с гастродуоденальной патологией, обусловленной Helicobacter pylori и вирусами герпеса

485370

На правах рукописи

НЕЛЮБИН Владимир Николаевич

Иммунопатогенетические особенности развития хронического воспаления у больных с гастродуоденальной патологией, обусловленной Helicobacter pylori и вирусами герпеса.

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

о 3 ОНЗ 7ГЛ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва-2011

4853703

Работа выполнена в НУЗ Центральная клиническая больница № 6 О А О «Российские Железные Дороги» и Институте иммунофизиологии (г. Москва)

Научный консультант: Доктор медицинских наук, профессор,

академик Академии наук Грузии Сепиашвили Реваз Исмаилович

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор

Балмасова Ирина Петровна

Ведущая организация:

ФГУ «НИИ физико-химческой медицины федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (г. Москва)

Защита состоится « 16 » февраля 2011 г. в «15» часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.26 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» (117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» (117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6).

Автореферат разослан « /Г" 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета , Доктор медицинских наук, профессор

Доктор медицинских наук, профессор Нестерова Ирина Вадимовна

Доктор медицинских наук, профессор, Татаурщикова Наталья Станиславовна

Т.А. Славянская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

В настоящее время большую проблему представляют вялотекущие хронические воспалительные процессы, связанные с персистенцией микробных агентов, в том числе заболевания желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), ассоциированные с инфицированием Helicobacter pylori (Н. pylori). Этому вопросу уделяется пристальное внимание на протяжении более чем 25 лет. Н. pylori является ключевым фактором в патогенезе большинства клинически значимых нозологических форм заболеваний ЖКТ, в число которых входят: хронический гастрит, дуоденит, язвенная болезнь, адено-карцинома и В-клеточная MALT-лимфома желудка, а так же некоторая другая патология (Григорьев П.Я, Исаков В.А., 1990; Аруин Л.И., Капул-лер Л.Л., Исаков В.А., 1998; Исаков В.А., Домарадский И.В., 2003; Warren J.R., Marshall B.J.1983; Bjorkholm В. et al., 2000; О Brien D. P. et al., 2006 и ДР-)-

Актуальна эта проблема и для детей, поскольку заражение часто происходит в раннем детском возрасте и затем достигает уровня инфицированное™ взрослого населения (Щербаков П.Л., 1991; Корниенко Е.А. с соавт.,1998; Li Z.Y., 2005 и др.). Инфицированность населения Н. pylori.no различным регионам составляет от 20 до 90 %. В среднем среди взрослого населения эта цифра колеблется от 40 до 70 %.

Кроме того, на сегодняшний день существует целый ряд клинических и экспериментальных данных свидетельствующих о том, что микроорганизм Н. pylori помимо поражения ЖКТ способен вызывать ряд патологических изменений со стороны других органов и систем. К внеже-лудочным проявлениям инфекции, которые может вызывать Н. pylori, в настоящее время относят анемии, аутоиммунную патологию, поражения сердечно - сосудистой системы, головного мозга, суставов, желез внутренней секреции, глаз, кожных покровов и некоторые другие заболевания (Рудык Ю.С. с соавт., 2000; Исаков В.А., Домарадский И.В., 2003; Фаде-енко Г.Д., 2004; Кратнов А.Е., 2006;. Циммерман Я.С., 2006; van der Weg В. et al., 2006; Corcoran PA, et al, 2007; Küpeli S. et al, 2007; Ferreri AJ. et al„ 2008 и др.).

Экспериментальные и клинические исследования последних лет установили, что при развитии хронических воспалительных заболеваний ЖКТ, в частности гастродуоденальной области, помимо основного этиологического фактора Я. pylori, в слизистой оболочке обнаруживаются вирусы группы герпеса: Epstein-Barr virus, Cytomegalovirus, Human herpes virus VI, VII, VIII (Randhawa PS, Jenkins FJ, Nalesnik MA, 1997; Gonelli A., Boccia S., Boni M. et al. 2001; Ogata T, Yoshimura A, Kurihara Y, et al. 2002; Tsamakidis K., Panotopoulou E., Demitroulopoloulos D. et al., 2005). В связи с этим можно предположить, что в развитии поражений слизистой ЖКТ непосредственное участие принимают вирусы, в частности группы герпеса (Herpesviridae). Это, в свою очередь, существенно меняет подходы к этиологической диагностике воспалительных заболеваний ЖКТ и требует коррекции применяемых схем лечения этой группы заболеваний с применением противовирусных и иммуномодулирующих препаратов (Нестерова И.В., Сепиашвили Р.И. 2000; Сторожук П. Г., Сепиашвили Р. И., Быков И. М. и др. 2005; Нелюбин В.Н., Мудров В.П., Сепиашвили Р.И. 2010).

До сих пор не ясны аспекты иммунопатогенеза рассматриваемой гастродуоденальной патологии. В связи с этим, новым направлением в исследовании патогенного действия на слизистую оболочку Н. pylori и вирусов Herpesviridae стало изучение местной цитокиновой регуляции иммунного ответа. Экспериментальных и клинических данных о влиянии вирусов группы герпеса в сочетании с Я. pylori на синтез цитокинов в месте воспаления слизистой ЖКТ недостаточно.

В современных методических руководствах по диагностике воспалительных заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки описываются различные методы диагностики. Однако нет четких указаний, какие из них наиболее эффективны и рациональны при проведении лабораторной диагностики этой группы заболеваний.

Цель исследования:

Изучить иммунопатогенетические особенности развития хронического воспаления у бльных с гастродуоденальной патологией, обусловленной инфицированием H.pylori и вирусами Herpesviridae.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи.

Задачи исследования:

1) Выявить инфицированность слизистой оболочки штаммами Н. pylori и вирусами Herpesviridae при воспалительных заболеваниях гастродуоденальной области и определить зависимость степени поражения слизистой оболочки (по данным ЭГДС, цитологии и гистологии) от степени инфицирования микроорганизмами.

2) Изучить местную иммунную реакцию в очаге воспаления по уровню экспрессии мРНК цитокинов в слизистой оболочке гастродуоденальной области.

3) Оценить проявления генерализованной иммунной реакции организма при изучаемой патологии, сопоставив эти данные с наличием инфекционных агентов в биопсийном материале слизистой оболочки.

4) Выявить возможное присутствие ДНК Н. pylori в мононуклеарных клетках периферической крови при гастродуоденальной патологии.

5) Разработать способ диагностики инфекции, обусловленной Н. pylori, путем определения фрагментов ДНК микроорганизма в мононуклеарных клетках периферической крови.

6) Предложить рациональный алгоритм диагностики воспалительных заболеваний гастродуоденальной области при бактериально-вирусном инфицировании.

Научная новизна:

Получены новые данные о бактериально-вирусном инфицировании слизистой оболочки гастродуоденальной области. В период обострения хронических воспалительных заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки слизистая оболочка может быть контаминирована патогенными штаммами Н. pylori, цитомегаловирусом, вирусами Эпштейна-Барр, вари-целла зостер, герпеса человека 6-го, 7-го, 8-го типов. Если ранее в литературе встречались сообщения об участии отдельных представителей вирусов группы герпеса в патологии желудка и двенадцатиперстной кишки, то полученные результаты свидетельствуют о неслучайном присутствии представителей Herpesviridae при патологии ЖКТ.

Получены новые данные о состоянии местной иммунной реакции в слизистой оболочке гастродуоденальной зоны ЖКТ при воспалительной реакции, обусловленной патогенными штаммами Н. pylori и вирусами Herpesviridae. Экспрессия мРНК цитокинов в очаге поражения носит различный характер при бактериальном, вирусном и смешанном инфицировании. При инфицировании только Н. pylori местная реакция развивается с экспрессией преимущественно мРНК ИЛ-2, ИЛ-6, ИФ-у и ФИО- а. При вирусном инфицировании преобладает сдвиг преимущественно в сторону Тх1 с экспрессией мРНК ИЛ-lß, ИЛ-2, ИЛ-10, ИФ-у и ФИО- а. При смешанном инфицировании иммунопатологический процесс в очаге воспаления слизистой оболочки имеет разнонаправленный характер и прогрессивно развивается по «расходящейся спирали», с вовлечением в воспалительный процесс окружающей ткани и прелбладанием деструктивных изменений в слизистой оболочке.

Показана связь между характером инфицирования слизистой оболочки гастродуоденальной области, уровнем экспрессии мРНК цитокинов в очаге воспаления и провоспалительных цитокинов в сыворотке крови. Выявлена четкая прямая зависимость между степенью повреждения слизистой оболочки и уровнем ИФу в периферической крови.

Показан дисбаланс в соотношении CD3+4+/CD3+8+ клеток при деструктивном характере поражения слизистой оболочки, заключающийся непропорционально большом количеством CD3+8+ клеток при бактериально-вирусном инфицировании.

Впервые обнаружен феномен персистенции участков ДНК Н. pylori в мононуклеарных клетках (МНК) периферической крови при воспалительных заболеваниях гастродуоденальной области. Установлена его прямая зависимость от степени повреждения слизистой оболочки.

Впервые установлен факт наличия в МНК генов ureC, cagA, vacAsl, vacAs2, vacAm2, aceAl, aceA2, babA H. pylori, кодирующих факторы пато-генности микроорганизма.

Разработан новый способ диагностики инфекции, обусловленной Н. pylori, осуществляемый путем определения методом ПЦР участков генома микроорганизма в МНК периферической крови.

Обоснована общая схема иммунопатогенетических процессов, происходящих в слизистой оболочке, при бактериально-вирусном инфицировании (Н. pylori и Herpesviridae).

Разработан и обоснован алгоритм этиологической диагностики хронических воспалительных заболеваний гастродуоденальной области бактериально-вирусной природы.

Практическая значимость.

Разработан и предложен новый способ диагностики инфекции, обусловленной Н. pylori, основанный на определении фрагментов ДНК микроорганизма в МНК периферической крови.

Предложен комплекс лабораторных исследований и иммунодиагностики хронических воспалительных заболеваний гастродуоденальной области. Разработан алгоритм применения этого комплекса при обследовании больных с целью выявления комбинации патогенных микроорганизмов при хронических заболеваниях желудка и двенадцатиперстной кишки.

Даны рекомендации по диагностике и лечению заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированных с Н. pylori и вирусами группы герпеса. В схемы лечения изучаемой патологии наравне с классической эрадикационной терапией рекомендовано включение противовирусных и иммуномодулирующих препаратов, как составляющей этиотроп-ного лечения.

Внедрение результатов работы в практику.

Получен Патент РФ на изобретение № 2265219 «Способ диагностики Helicobacter pylori - инфекции». Изобретение внедрено в практику работы клинико-диагностических лабораторий: НУЗ «Центральная клиническая больница № 6 ОАО «Российские Железные Дороги», г.Москва; МУЗ Городская поликлиника г. Краснознаменск, Московская область, ФГУ 150 Центральный военный госпиталь Космических Войск, Московская область; ООО «Национальное агенство клинической фармакологии и фармации» (НАКФФ), г.Москва; ООО «Медицинский центр Авиценна», г.Москва; МУЗ «Городская клиническая больница № 4», г. Пермь.

Подана заявка на изобретение № 2010154231 «Способ прогнозирования тяжести течения воспалительных заболеваний гастродуоденальной области».

Материалы диссертации используются в учебном процессе на циклах тематического усовершенствования, проводимых на кафедре клинической лабораторной диагностики ГОУ «Российская медицинская академия последипломного образования», г. Москва.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Выявленный спектр микроорганизмов, инфицирующих слизистую оболочку при воспалительных процессах гастродуоденальной области, свидетельствует, что изучаемая патология обусловлена не только бактерией Н. pylori, но и вирусами группы герпеса.

2. Степень деструктивных изменений слизистой оболочки и характер местной клеточной реакции зависит от сочетания инфекционных агентов, присутствующих в очаге воспаления. При моноинфицировании Н. pylori или вирусами Herpesviridae местная реакция носит различный характер. При бактериальном инфицировании экспрессируются преимущественно мРНК ИЛ-2, ИЛ-6, ИФ-у и ФИО- а. При вирусном - реакция развивается по Тх1 - типу с экспрессией мРНК HJI-lß, ИЛ-2, ИЛ-10, ИФ-у и ФНО- а. При микст инфицировании местная иммунопатологическая реакция приобретает разнонаправленный характер и развивается по «раскручивающейся спирали»с вовлечением в процесс окружающей ткани, в результате чего в очаге воспаления преобладают деструктивные процессы.

3. Впервые обнаруженный феномен персистенции фрагментов генома Н. pylori в МНК периферической крови свидетельствует о том, что инфекционный процесс не ограничивается местными изменениями, но при длительном течении вызывает иммунопатологические реакции на уровне целого организма.

4. Определение специфических участков ДНК Н. pylori в МНК периферической крови методом ПЦР можно использовать в комплексной диагностике хеликобактериоза. Этот способ позволяет оценить степень вовлечения в патологический процесс всего организма и степень повреждения слизистой оболочки гастродуоденальной области.

5. Для достоверной и эффективной первичной диагностики воспалительных заболеваний гастродуоденальной области необходимо проведение ЭГДС с обязательным взятием биопсийного материала и определением наряду с Н. pylori возможного присутствия вирусов группы герпеса.

6. Включение противовирусных и иммуномодулирующих препаратов в схемы этиотропной терапии воспалительных заболеваний гастродуо-денальной области, обусловленных инфекцией Н. pylori и вирусами герпеса, обеспечит достижение более эффективных результатов лечения данной патологии.

Апробация материалов диссертации.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Российских Национальных конгрессах «Человек и лекарство» в г. Москве: VIII, 2001, IX, 2002, XV, 2008 гг.; Международной конференции «Геноми-ка, протеомика и биоинформатика для медицины» (Москва, 2002); V Конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002); Всероссийском Форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (С-Петербург, 2006); VIII Конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммуно-фармакологи» (Москва, 2007); 2-ом заседании Клуба профессиональных иммунологов (Анталия, Турция, 2007), Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология - междисциплинарные проблемы», 26-27 февраля 2008 г. (Москва); 2-ом Съезде врачей железнодорожной медицины (2008), Объединенном иммунологическом форуме в г.Санкт-Петербурге (2008); Международном симпозиуме «Иммунитет и инфекции» 5-12 октября 2008г. (Кемер, Турция, 2008); 6-ом Всемирном Форуме по клиническим испытаниям в кардиологии, 3-5 декабря, 2009 г. (Париж, Франция); Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология - практическому здравоохранению», 25-26 февраля 2010 г. (Москва), VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010», 24-26 ноября 2010 г. (Москва).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 54 научных работ, в том числе 1 монография, получен патент Российской Федерации на изобретение и подана заявка на изобретение.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 230 страницах, включает в себя 17 таблиц, 32 рисунка и состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты собственных исследований», «Обсуждение полученных результатов», «Выводы». Указатель литературы содержит 275 источников, из них 101 отечественных и 174 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Всего было обследовано 457 пациентов, находившихся на диспансерном наблюдении. Исследования проводились поэтапно. Диагноз ставился на основании данных осмотра, эзофагогастродуоденоскопии (ЭГДС), гистологического и цитологического исследований в соответствии с протоколом исследования, рекомендуемым Сиднейской системой (Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.А., 1998).

Первый этап заключался в определении критериев степени повреждения слизистой оболочки гастродуоденальной области, определении инфицированное™ Н. pylori и вирусами герпеса. Одновременно исследовали генерализованную гуморальную и клеточную иммунную реакции пациентов на эти микроорганизмы, а так же возможное присутствие фрагментов ДНК Н. pylori и вирусов герпеса в МНК периферической крови.

Таблица 1.

Группы обследованных пациентов первого этапа исследований

Диагноз по данным ЭГДС, под- Число па- Возраст Число Число

твержденным гистологиеи циентов (лет) женщин мужчин

1 Поверхностное воспаление 34 27-45 9 25

2 Деструктивное воспаление 39 27-60 17 22

3 Группа сравнения (контрольная) 31 18-37 10 21

В группу с поверхностным воспалением вошли пациенты с поверхностным гастритом.

В группу с деструктивными воспалительными изменениями слизистой оболочки гастродуоденальной области вошли пациенты с хроническим эрозивным гастритом, хроническим эрозивным гастродуоденитом и язвой желудка и двенадцатиперстной кишки.

10

Критерием для отбора пациентов в группу сравнения служили отсутствие признаков воспаления и бактериального обсеменения Н. pylori по данным ЭГДС, гистологии и цитологии, а так же с отсутствием жалоб со стороны ЖКТ. Подобное разделение пациентов по группам, по - нашему мнению, является патогенетически обоснованным.

Полученные результаты первого этапа, позволили в дальнейшем придерживаться принятых критериев в формировании групп пациентов. На втором и третьем этапах пациенты были обследованы по принятой схеме.

На втором этапе изучали местную иммунную реакцию слизистой оболочки в зависимости от характера инфекции (бактериальная, вирусная и вирусно-бактериальная) путем определения экспрессии м-РНК цитоки-нов (ИЛ-lß, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-18, ИФ-у, ФНО-а). Параллельно определяли аналогичные показатели в МНК периферической крови.

Таблица 2.

Группы обследованных пациентов вто poro этапа исследований

Диагноз по данным ЭГДС, подтвержденным гистологией Число пациентов Возраст Число женщин Число мужчин

1 Поверхностное воспаление 22 25- 47 10 12

2 Деструктивное воспаление 15 27-55 6 9

На третьем этапе проводили сравнение эффективности методов традиционной клинической лабораторной диагностики, принятых в клиниче-

ской практике.

Таблица 3.

Группы обследованных пациентов третьего этапа исследований

Диагноз по данным ЭГДС, под- Число па- Возраст Число Число

твержденным гистологией циентов (лет) женщин мужчин

1 Поверхностное воспаление 108 21-55 9 25

2 Деструктивное воспаление 165 27-60 17 22

3 Группа сравнения 43 18-37 10 21

Полимеразная цепная реакция.

Выделение ДНК Н.ру1оп из биоптатов осуществляли наборами реагентов НПФ «ЛИТЕХ», Москва, Россия. Для проведения ПЦР использовали коммерческие тест-системы и праймеры, разработанные на базе Института общей генетики РАН, Москва, Россия (д.б.н., Шейхаев Г.О.).

Кроме этого, методом ПЦР обследовали биопсийный материал слизистой оболочки на наличие участков генома вирусов группы герпеса:

И

вируса простого герпеса I и II типов (ВГЧI и 2), вируса варицелла зостер (ВГЧ-3), Эпштейн-Барр вируса (ВГЧ-4), цитомегаловируса (ВГЧ-5), вируса герпеса человека VI, VII, VIII типов (ВГЧ-6,7,8). Для этого использовали готовые наборы отечественных фирм-производителей: «Амплисенс», «Биоком», «Литех», «ДНК-технология», (г.Москва); «Вектор-Бест», (г..Новосибирск).

Иммуноферментный анализ.

Гуморальный иммунный ответ к микроорганизмам оценивали количественно методом иммуноферментного анализа (ИФА) по уровню сывороточных антител класса IgA, IgG к Я. pylori («Diagnoctic system laboratories», США и «Euroimmune», Германия); IgM к Я. pylori («Biomerica», США) и IgG к CagA-белку Я. pylori ( «Вектор-Бест», Россия); IgG к вирусу простого герпеса I и II типов, вирусу варицелла зостер, цитомегаловирусу («Diagnoctic system laboratories», США), IgG к VCA-, ЕА-, EBNA-1-бепкш вируса Эпштейн-Барр, («Gen Bio», США), IgG к вирусу герпеса человека VI, VIII типов («Вектор-Бест», Россия) в соответствии с протоколом производителя.

Цитологическое и гистологическое исследования проводили традиционными методами в патологоанатомическом отделении НУЗ «Центральная клиническая больница № 2 ОАО «РЖД» им. Н.А.Семашко (заведующий отделением д.м.н. Астраханцев А.Ф.).

Определение гематологических показателей проводили на гематологическом анализаторе «Cell-Dyn 1700», США. Популяционный и суб-популяционный состав лимфоцитов периферической крови определяли методом лазерной цитофлуориметрии на проточном цитометре «Coulter Epics XL», США. Использовали антитела против кластеров дифференци-ровки (CD) 3+4+, 3+8+, 19+, 16+56+ («Caltag Laboratories», США) в лабораторном отделении Центрального Военного Клинического Госпиталя им. Н.Н. Бурденко (начальник отделения д.м.н. Скворцов С.В.).

Иммуномагнитная сепарация мононуклеарных клеток периферической крови.

МНК получали из цельной крови по общепринятой методике на градиенте плотности 9% водного раствора фиколла 400 и верографина

(р= 1.077). В качестве антикоагулянта использовали ЭДТА в стандартной концентрации.

Выделение CD4+, CD8+, CD14+ из МНК периферической крови проводили методом иммуномагнитной сепарации с использованием готовых реактивов («Dynal», Норвегия) по протоколам производителя. Все этапы разделения проводили при температуре 2-8°С, во избежание неспецифического связывания иммуномагнитных частиц «Dynabeads» фагоцитирующими клетками. Наличие участков генома Н. pylori определяли с помощью ПЦР по методике, описанной выше.

Определение уровня экспрессии м-РНК цитокинов методом ПЦР в реальном времени.

Уровни экспрессии м-РНК цитокинов определяли в лаборатории НПФ «ДНК-технология» методом ПЦР в реальном времени (Real - time PCR). В качестве субстрата использовали биопсийный материал визуально неизмененной СО, кусочки ткани из очагов воспаления и МНК периферической крови, как общий пул, так и различные их субпопуляции.

Статистический анализ результатов исследований проводили с использованием общепринятых методов. Частоту обнаруженных явлений выражали в процентном отношении к общему числу пациентов в группе. Достоверность различий по группам и построение гистограмм осуществляли в программах «Microsoft Excel» и «SPSS. 13».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование биоптатов СО гастродуоденальной области показало высокую частоту обнаружения штаммов Я. pylori при эрозивных и язвенных поражениях. Были определены типы штаммов Я. pylori, контамини-рующих СО:

> cagA'vacA' - непатогенный штамм;

> cagA*vacA' - патогенный штамм;

> cagA+vacA+- патогенный и ульцерогенный штамм .

В группе сравнения патогенный (ульцирогенный) штамм Я. pylori cagA+vacA+ был выявлен только в 5%, непатогенные штаммы cagA' vacA' были выявлены в 10% случаев.

В группе пациентов с поверхностным воспалением слизистой оболочки непатогенные штаммы Н. pylori cagA'vacA' встречались с частотой 35,7%, а патогенные штаммы cagA+vacA~ и cagA+vacA+ - с одинаковой частотой (14,3%). При эрозивно-язвенных изменениях слизистой оболочки была выявлена высокая частота (79,5%) определения ульце-рогенных штаммов Н. pylori - cagA+vacA*. Неульцерогенный штамм cagA*vacA' был обнаружен лишь в 5,1% случаев. Безусловно, деструктивный характер воспаления связан именно с типом патогенного штамма Н. pylori - cagA*vacA*.

При корреляционном анализе с расчетом коэффициента Пирсона было получено, что выраженность воспаления, его активность и степень обсеменения Н. pylori слизистой оболочки имеют статистически достоверную связь. Чем выше степень обсеменения, тем были более выражены признаки воспаления и его активность (р= 0,01).

Дальнейшие исследования биопсийного материала слизистой оболочки методом ПЦР выявили их контаминированность вирусами группы герпеса.

В группе сравнения частота встречаемости вирусов составила: ВГЧ-4 - 5%, ВГЧ-6- 10%, ВГЧ-7- 10%.

При поверхностном воспалении: ВГЧ-4 - 30 %, ВГЧ-6 - 44,4 %, ВГЧ-7 - 10%, ВГЧ-8 -10%.

При деструктивном Повреждении: ВГЧ-3 - 7,1%, ВГЧ-4 - 17,6 %, ВГЧ-5 - 14,3%, ВГЧ-6 - 35,3%, ВГЧ-7 - 32,4%, ВГЧ-8 -17,5%.

Таким образом, обнаружено, что при патологии ЖКТ, в слизистой оболочке гастродуоденальной зоны присутствуют не только штаммы Н. pylori, но и вирусы группы герпеса. С наибольшей частотой обнаруживаются вирусы Эпштейна-Барр, герпеса человека 6, 7 и 8 типов. Причем, частота обнаружения и спектр микроорганизмов зависели от степени деструкции слизистой оболочки. Чем глубже степень повреждения, тем чаще и в более разнообразном сочетании определяются патогенные штаммы Н. pylori и представители Herpesviridae.

В профиле экспрессии м-РНК цитокинов МНК периферической крови различий между группами не обнаружили. При сравнении экспрессии м-РНК в нормальной и деструктивно изменённой слизистой оболочке

было обнаружено, что в неизмененной слизистой, рядом с очагами пора-

14

жения при поверхностном воспалении и при эрозивных изменениях различия в экспрессии цитокинов не достоверны.

При сравнительном изучении экспрессии м-РНК цитокинов в неизмененной слизистой оболочке и непосредственно на месте воспаления выявлены следующие различия. При моноинфицировании Я. pylori уровень экспрессии м-РНК ИЛ-2, ИЛ-6, ИФу и ФНО-а в очаге воспаления был существенно выше, чем в неизмененной слизистой оболочке. При инфицировании вирусами Эпштейна-Барр и герпеса человека 6 типа в отсутствии Н. pylori выявлено существенное повышение экспрессии мРНК ИЛ-4 в неизмененной слизистой оболочке и повышение уровней экспрессии мРНК ИЛ-lß, ИЛ-2, ИЛ-10, ИФу и ФНО-а в очаге воспаления. При микст-инфицировании Я pylori и вирусами группы герпеса выявлено повышение экспрессии мРНК ИЛ-4, ИЛ-6 и ФНО-а в очаге воспаления.

Определенный интерес представляет результат сравнения уровня экспрессии м-РНК в очаге воспаления при моноинфекции Я. pylori, инфицировании вирусами Эпштейна-Барр и герпеса человека 6 типа в отсутствии Я. pylori и сочетанном инфицировании Н. pylori и Herpesviridae.( рис.1).

При моноинфицировании Я pylori в очаге воспаления наблюдается повышенные уровени экспрессии мРНК ИЛ-18, что является закономерной реакцией на антигены бактериального происхождения и согласуется с литературными данными. При инфицировании только вирусами преобладает экспрессия мРНК ИЛ-2, ИЛ-10, ИЛ-18, ИНФ-у и ФНО- а , направляющих иммунную реакцию по Thl -типу. При смешанном бактериально-вирусном инфицировании отмечается высокая экспрессия мРНК всех исследуемых цитокинов, направляющих иммунные реакции как по Thl -типу (ИЛ-lß, ИЛ2, ИЛ-18, ИНФу, ФНО а), так и по Th2-типу (ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10).

dh. pylori аэБВ +■ вгч-6 иэбв+вгч-е + н. pylori

Рисунок 1. Уровень экспрессии м-РНК цитокинов при бактериальном, вирусном и микст-инфицировании Н. pylori и вирусами Нег-pesviridae в очаге воспаления.

Полученные данные могут свидетельствовать о неадекватной ци-токиновой реакции при патологии ЖКТ, обусловленной микст-инфицированием Н. pylori и Herpesviridae.

Анализ гуморального иммунного ответа к Н. pylori выявил (рис.2), что у больных хроническим поверхностным гастритом и деструктивными изменениями сывороточные антитела класса IgM были повышены незначительно (р<0,05). В то же время при деструктивном воспалении уровень антител класса IgA к H.pylori был существенно выше диагностического порога и отличался от группы сравнения и пациентов с поверхностным воспалением (р<0,01).

Уровень антител класса IgG при поверхностном и деструктивном воспалении был выше, чем в группе сравнения (р<0,05) , но в группах с различной степенью повреждения слизистой оболочки существенно не отличался.

Исследование гуморального иммунного ответа к вирусу Эпштей-на-Барр (рис.3) выявило высокий уровень IgG-антител к капсидному

антигену (УСА- ^й) при деструктивных процессах и к раннему антигену (ЕА- ^в) при поверхностном воспалении (р<0,05).

Е/мл

80,00

нрляМ нр-1еА

□ группа сравнения □ поверхностное воспаление Е деструктивное воспаленне

Рисунок 2. Уровень сывороточных антител к Н. pylori

Е/мл 1400,00 -г-

1200,00

1000,00

800,00

600,00

400,00

200.00

0,00

VCA-IsG EA-IgG

в группа сраопсппя О поосрхпостпос воспалсппс

EDNA-1-IgG В деструктивное ооспалешк

Рисунок 3. Уровень сывороточных антител к антигенным структурам вируса Эпштейна-Барр.

Повышенный уровень антител к поздним белкам репликации этого вируса (ЕВЫА-1-^0) обнаружен у всех обследуемых пациентов, однако без статистически значимых различий между группами.

Уровень сывороточных ^О-антител к вирусу герпеса человека 6-го типа был существенно выше при деструктивном воспалении, чем при поверхностном (р<0,05). Антитела класса к вирусу герпеса человека 8-го типа были обнаружены у 50% пациентов с поверхностным воспалением и 23% с деструктивным воспалением, но статистически значимых различий в уровне антител не было (рис.4).

Для оценки системной цитокиновой реакции макроорганизма провели определение сывороточных цитокинов: ИЛ 1 (3, ИЛ 2, ИНФ у. Было получено, что при изменениях в слизистой оболочке (поверхностное воспаление, деструктивные изменения) их уровень был достоверно выше (р < 0,05), чем в группе сравнения. В то же время при деструкции слизистой оболочки уровень ИНФ у существенно превышал таковой в группе сравнения и при поверхностном воспалении ( р <0,001), ( рис. 5).

Е/мл

Вгруппа сравнения □повер^ностноевоспаленне адесгрукгнвное восплжии?

Рисунок 4. Уровень сывороточных антител класса к вирусам герпеса человека 6-го и 8-го типов.

Пг/мл

В группа сравнения □поверхностное воспаление адеструктпвное воспаление

Рисунок 5. Уровень сывороточных провоспалительных цитокинов при хроническом воспалении слизистой оболочки гастродуоденаль-ной области.

При оценке субпопуляционного состава клеток периферической крови было получено, что уровень Т-лимфоцитов (СБ 3+; СБ 3+4+; СБ 3+8+) при воспалении слизистой оболочки был достоверно выше, чем в группе сравнения (р< 0,.05), (рис.6). В то же время количество №С-клеток (СБ 16+56+) было снижено при поверхностном и деструктивном воспалении слизистой оболочки относительно группы сравнения.

Тыс. кл/мкл 1800,00

1600,00 1400,00

1200,00 -I-Y

1000,00 -800,00 -600,00 400,00 200,00 -0,00

CD3+ СЮ+4+ CD3+S+ CD1S+56+ CD19+

Srwvnna сравнения сз поверхностное воспэленне Еэ лестт>\'ктивное воспаление

Рисунок 6. Субпопуляции лимфоцитов периферической крови при хронических воспалительных заболеваниях гастро-дуоденальной области.

Таким образом, проведенные исследования показали, что наблюдаются определенные различия иммунной реакции, зависящие как от степени повреждения, так и от типа инфицирования слизистой оболочки. Участие вирусов в воспалительном процессе, что происходит, как правило, при деструктивных процессах в слизистой оболочке, оказывает существенное влияние на показатели местной и генерализованной им-муной реакции организма, проявляющееся в виде дисбаланса основных показателей иммунитета.

Зарубежными исследователями было установлено, что у серопо-зитивных к Н. pylori пациентов в атеросклеротических бляшках кровеносных сосудов методом ПЦР определяется наличие фрагментов генома этого микроорганизма (Kowalski М., 2001 и др.). Данный факт является примечательным, поскольку Я. pylori , как считается, поражает слизистую оболочку желудка и двенадцатиперстной кишки. Логично предположить, что фрагменты Н. pylori попадают в стенки кровеносных сосудов посредством мигрирующих клеток из очага воспаления через крово-

ток. Однако в литературе мы не встретили указаний на обнаружение Н. pylori или его фрагментов в периферической крови. Поэтому было проведено изучение возможного присутствия Н. pylori в МНК периферической крови.

Исследование МНК периферической крови выявило наличие в них фрагментов генома Н. pylori - игеС , кодирующего С-субъединицу уреа-зы, а также прямую зависимость этого явления (г= 0.8) от степени повреждения слизистой оболочки (рис.7).

Я Контрольная группа ■ Поверхностное воспаление □ Деструктивное воспале-

Рисунок 7. Частота встречаемости фрагментов генома Н. pylori в биоптате и мононуклеарных клетках крови.

В различных субпопуляциях МНК (общей фракции, CD 4+, CD 8+, CD 14+ клеток) частота обнаружения фрагментов ДНК Н. pylori так же зависела от выраженности воспаления и степени деструкции слизистой оболочки. Как оказалось, в МНК у больных с деструктивными процессами обнаруживаются такие же участки ДНК Н. pylori, как и в очаге воспаления слизистой оболочки. При этом гены, кодирующие факторы патогенности Н. pylori cagA, vacAsl, vacAs2, vacAm2, iceA2 и babA можно обнаружить в МНК чаще, чем в биоптате.

Биоптат

МНК

Таким образом, МНК при хронических воспалительных заболеваниях гастродуоденальной области, обусловленных Я. pylori, могут являться «носителями» участков ДНК микроорганизма и вероятность их обнаружения зависит от выраженности воспаления и степени деструкции слизистой оболочки.

Обнаружение фрагментов ДНК Н. pylori в МНК периферической крови позволил предложить новый способ диагностики этой инфекции, позволяющий оценить, по нашему мнению, тяжесть развивающегося инфекционного процесса.

В исследованиях эффективности предлагаемого способа диагностики инфекции, обусловленной Я. pylori в качестве биологического субстрата для ПЦР помимо МНК и фракции Т-лимфоцитов, выделенной с помощью метода иммуномагнитной сепарации, использовали слюну и биопсийный материал слизистой оболочки ЖКТ. Параллельно проводили определение уровней специфических к Я. pylori иммуноглобулинов классов A,M,G. Для иллюстрации эффективности предлагаемого способа приведем три характерных примера из клинической практики.

Пример 1.

Больной К., 26 лет, поступил с жалобами на периодические боли умеренной интенсивности в области эпигастрия, изжогу, отрыжку. Болен в течение 2 лет.

При поступлении проведена ЭГДС с взятием биопсийного материала слизистой оболочки, который был направлен на гистологическое, цитологическое исследования и определение Я. pylori методом ПЦР. Кроме того, этим же методом Я. pylori определяли в слюне и МНК. По данным ЭГДС было сделано заключение: «Рефлюкс-эзофагит. Гастропа-тия с гиперплазией». Гистологический диагноз: Гиперпластический гастрит.

При цитологическом исследовании обнаружена умеренная гиперплазия клеток покровно-ямочного эпителия. Клетки Я. pylori найдены в значительном количестве.

В сыворотке крови определены высокие уровни специфических к Я. pylori антител (IgA - 44 ME/мл; IgM - 40МЕ/мл; IgG - 28 МЕ/мл). Больной обследован по разработанному способу. На рисунках 8 и 9

представлены эндоскопическая и гистологическая картины, полученные в результате обследования.

Рисунок 8. Рефлюкс-эзофагит (а), гастропатия с гиперплазией (б).

¡ЙЕЯШЯШЕЗ!

шЩвЖЯН

Рисунок 9. Хронический неатрофический гастрит, с гиперплазией лимфоидных фолликулов. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 400

На рис. 10 изображена электрофореграмма продуктов амплификации биологических проб, полученных от пациента в примере 1.

1 2 3 4 5 6

Рисунок 10 . Проба 1 - положительный контрольный образец; проба 2 - отрицательный контрольный образец; проба 3 - биопсийный материал слизистой оболочки; проба 4 - слюна; проба 5 - Т-лимфоциты; проба 6 - общая фракция МНК

Обследование данного пациента указанным способом и обнаружение Н. pylori в МНК позволило сделать вывод о длительном активном течении болезни, что косвенно подтверждалось высоким уровнем антител классов A,M,G к Н. pylori, а также о неблагоприятном прогнозе развития заболевания, приобретающем характер системного. На основании полученных данных была назначена адекватная терапия.

Пример 2.

Больной Д., 53 года, поступил с жалобами на боли в эпигастраль-ной области, ослабевающие после приема пищи, чувство тяжести в желудке, изжогу. Болен в течение 7 лет.

Диагноз по данным ЭГДС: «Острые эрозии антрального отдела желудка. Рубцовоязвенная деформация луковицы 12-перстной киш-ки.Хроническая язва луковицы 12- перстной кишки» (рис. 11). Гистологический диагноз: «Хронический эрозивный гастрит» (рис. 12).

При цитологическом исследовании мазка-отпечатка измененной слизистой оболочки желудка обнаружены клетки покровно-ямочного эпителия в состоянии гиперплазии, ряд из них деформирован, встречаются клетки с признаками кариорексиса. Клетки Н. pylori выявлены в большом количестве.

Рисунок 12. Хронический атрофический гастрит, высокой степени активности с дисплазией эпителия желез 1 степени.

Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 400

Рисунок 11. Острые эрозии антрального отдела желудка (а), рубцо-во-язвенная деформация луковицы 12 перстной кишки, хроническая язва луковицы 12 перстной кишки (б).

В сыворотке крови определены высокие уровни специфических к Я.pylori антител (IgA - 33 ME/мл; IgM - 57 ME/мл; IgG - 31 МЕ/мл)

Больной обследован по разработанному способу. На рис.13 изображена электрофореграмма продуктов амплификации биологических проб, полученных от пациента в примере 2.

1 2 3 4 5 6

Рисунок 13. Проба 1 - положительный контрольный образец; проба 2 - отрицательный контрольный образец; проба 3 - биопсий-ный слизистой оболочки; проба 4 - слюна; проба 5 - Т-лимфоциты; проба 6 - общая фракция МНК.

В данном примере обследование указанным способом и сопоставление его результатов с результатом инструментального метода и клинической симптоматики позволило сделать предположение о сис-I темности процесса, глубоком характере повреждения слизистой оболоч-

ки и еще до получения гистологического подтверждения начать адекватную терапию.

Пример 3.

Больная Г., 29 лет, поступила с жалобами на чувство тяжести в области желудка, отрыжку, изжогу. Больна около 2 лет

По данным ЭГДС установлен диагноз: «Грыжа пищеводного отверстия диафрагмы Эрозии антрального отдела желудка» (рис. 14). Гистологический диагноз: «Умеренные признаки хронического гастрита» (рис.15).

При цитологическом исследовании слизистой оболочки обнаружена умеренная гиперплазия клеток покровно-ямочного эпителия. Клетки Я. pylori найдены в небольшом количестве.

i В сыворотке крови обнаружены: высокий (29 ME/мл) уровень спе-

цифических антител класса А, умеренные значения (42 ME/мл) уровня специфических антител класса М, антитела класса G находились на уровне ниже диагностического порога (< 15 МЕ/мл).

а

б

Рисунок 14. Грыжа пищеводного отверстия диафрагмы (а), эрозивный гастрит антрального отдела желудка (б).

Рисунок 15. Хронический атрофический гастрит, слабой степени активности, с гиперплазией лимфоидного фолликула с кишечной метаплазией эпителия отдельных желез.

Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 400

Больная обследована по разработанному способу.

На рис. 16 представлено изображение электрофореграммы продуктов амплификации биологических проб, полученных от пациента в примере 3.

В данном клиническом случае проведение диагностики разработанным способом показало отсутствие генома Н. pylori в МНК. Подтверждена прямая корреляционная связь между незначительным характером повреждения слизистой оболочки и отсутствием Н. pylori в МНК.

Обоснованно сделан вывод о начальной фазе развития заболевания и отсутствие его системного характера. Назначена адекватная терапия.

1 2 3 4 5 6

Рисунок 16. Проба 1 - положительный контрольный образец; проба 2 - отрицательный контрольный образец; проба 3 - биопсий-кый слизистой оболочки; проба 4 - слюна; проба 5 - Т-лимфоциты; проба 6 - общая фракция МНК.

Таким образом, наблюдается прямая связь тяжести развития процесса в слизистой оболочке ЖКТ при инфекции Я. pylori и обнаружением участков ДНК этого микроорганизма в МНК.

Предлагаемый способ диагностики инфекции является малоинва-зивным способом, позволяет оценить инфицированность клеток периферической крови, степень вовлечения в инфекционный процесс организма в целом, отражает системность заболевания, чего не удается достигнуть определением возбудителя в слизистой оболочке, в слюне или фекалиях. Предлагаемый способ легко применим при мониторинге проводимых терапевтических мероприятий.

В дальнейшем был проведен цикл работ по применению комплексного подхода диагностики хеликобактериоза. В качестве методов диагностики использовали ЭГДС, цитологическое и гистологическое исследование биоптатов, определение специфических к Н. pylori антител (суммарных к CagA антигену и раздельно A, G классов), определение инфекционных агентов в слизистой оболочке и МНК по методикам, описанным выше. Параллельно проводили Quick Test (Clo-test)- быстрый уреазный тест.

Пациентов распределяли по группам, описанным выше. Дополнительно выделяли в группе с поверхностными изменениями пациентов с атрофическим и не атрофическим гастритами. Такое разделение больных с поверхностными изменениями слизистой оболочки оправдано с точки зрения состояния секреторного аппарата слизистой оболочки и ассоциированной с слизистой оболочкой лимфоидной ткани.

Чувствительность, специфичность и точность применяемых методов лабораторной диагностики рассчитывали по известной методике (Баранская Е.К., 2006) с учетом количества истинно положительных (ИП), истинно отрицательных (ИО), ложноположительных (ЛП) и ложпоогри-цательных (Л О) результатов:

Чувствительность = ИЩИП+ЛП) х 100%;

Специфичность = ИО/(ИО+ЛО) х 100%;

Точность = (ИП+ИО)/(ЛП+ЛО+ИО+ИП) х 100% .

К положительным результатам наличия специфических антител к Я. pylori относили результаты ИФА, превышающие пороговые значения. Положительными результатами ПЦР и Clo-test считали обнаружение ДНК микроорганизма и его уреазной активности соответственно.

В дальнейшем были рассчитаны чувствительность, специфичность и точность для каждого метода по указанной выше формуле (рис.17).

Расчеты показали, что практически 100% чувствительностью и специфичностью обладали определение ДНК Н. pylori в биоптате и Clo-test. Менее специфичным оказался метод ИФА, поскольку имели место положительные результаты ИФА при отрицательных результатах ПЦР, уреазного теста и нормальном состоянии слизистой оболочки, обнаруженном при ЭГДС.

Способ диагностики инфекции посредством определения фрагментов ДНК в МНК показал хорошую специфичность и чувствительность. Однако следует отметить, что не у всех пациентов с инфекцией этот способ дал положительные результаты. Только у 62% больных с инфицированных Я. pylori, ПЦР показала наличие ДНК микроба в МНК. Вероятно, что участки генома Я. pylori в МНК встречаются только в тех случаях, когда заболевание протекает длительно, приобретая системный характер. Тем не менее, этот факт, на наш взгляд, нисколько не умаляет диагностической ценности указанного способа.

29

. -се» •. ■ у .. «0!>%.j«ib

. ;! .. ■ ->. 1 J.

нРяд1 гаРяд2 ОРядЗ

Чуаствительность Специфичность Точность

пир биоптат

Quick Test

Рисунок 17. Результаты сравнения методов диагностики по чувствительности, специфичности и точности.

В научной литературе, посвященной диагностике хеликобактерио-за, постоянно обращается внимание на необходимости комплексного подхода. По рекомендациям Маастрихтских соглашений требуется использование как минимум двух независимых методов лабораторной диагностики. От достоверности определения Я. pylori - инфекции зависит назначение адекватной терапии и оценка эффективности лечения (эра-дикации). Тем не менее, многие авторы признают, что ни один из лабораторных методов диагностики инфекции, обусловленной Я. pylori, не обладает 100% достоверностью (Губергриц Н.Б. , Синяченко О.В., Бело-конь Т.М. и др.2004,Исаков, Доморадский 2003, Михайлова И.А., Кравцов., Никифоров A.M. и др. 2006, Rantelin Н., Lehours Р., Megraud F. 2003 и др).

Так, например, ПЦР определяет только наличие или отсутствие специфических для Я. pylori участков ДНК, не давая информации о жизнеспособности микроба. Так же как и определение антигена Я. pylori в фекалиях (stool- тест). Методом ИФА определяются антитела, синтези-

руемые организмом в ответ на инвазию микроорганизма. Однако известны, так называемые «следовые серологические реакции», когда возбудитель инфекции в организме отсутствует, а антитела еще циркулируют в крови. Фермент уреазу выделяет не только Я. pylori, но и некоторые другие микроорганизмы. Это следует учитывать при интерпретации уреазных тестов. Гистологические, гистохимические, цитологические методы определения Я. pylori имеют свои ограничения. Учет результатов проводится визуально, что вносит определенную долю субъективизма. И, наконец, существуют внешние факторы физической, химической, биологической природы, которые могут оказать существенное влияние на результаты исследования.

Метод определения инфицированности Я. pylori по наличию фрагментов его генома в МНК можно отнести к мало инвазивным методам и применять параллельно с другими лабораторными исследованиями. Метод показал хорошую чувствительность и специфичность. Относительно невысокая точность может быть обусловлена тем, что не у всех инфицированных пациентов фрагменты генома Я. pylori могут находиться в МНК. Вероятно, что участки генома микроорганизма, определяемые с помощью ПЦР, появляются в клетках крови тех пациентов, у которых инфекционный процесс протекает длительно с выраженными деструктивными изменениями в слизистой оболочке. Такая особенность патогенеза хеликобактерной инфекции повышает ценность предлагаемого метода, который может отражать глубину инфекционного процесса, вызванного пилорическим хеликобактером.

Проведенные исследования свидетельствуют, что главенствующий вклад в развитие хронических воспалительных заболеваний гастро-дуоденальной области безусловно вносит Я. pylori и, в первую очередь, его патогенные штаммы. Частота их выявления, а так же уровни специфических антител прямо связаны с характером и глубиной поражения слизистой оболочки.

При деструктивных процессах в слизистой оболочке с большей частотой обнаруживали один или несколько вирусов группы герпеса. Присутствие вирусов Herpesviridae в этих группах может свидетельствовать об их существенном вкладе в поддержании воспаления и длительной совместной персистенции с Я. pylori. Наши исследования под-

31

тверждают литературные данные о присутствии вирусов Herpesviridae в очаге воспаления при гастритах и деструктивных процессах в слизистой оболочке. При этом, наличие вирусов носит не случайный характер.

Вирусы группы герпеса, по-видимому, принимают непосредственное участие в патогенезе гастритов и язвенной болезни ЖКТ. Чем глубже степень повреждения слизистой оболочки, тем чаще и в более разнообразном сочетании определяются представители Herpesviridae и патогенные штаммы Я. pylori.

Неэффективность традиционных схем эрадикации Я. pylori в большинстве случаев и достаточно частые рецидивы заболевания, вероятно, обусловлены присутствием вирусов в очаге воспаления, которые направляют и развивают воспалительный процесс «по расходящейся спирали». Я. pylori - и герпес вирусная инфекция приводит к прогрессирующей деструкции слизистой оболочки, создавая условия, благоприятные для длительной персистенции Я. pylori и других патогенных микроорганизмов. Этот факт, по нашему мнению, требует переосмысления подходов к лечению данной патологии.

Известны данные, свидетельствующие об успешном применении противовирусных препаратов в терапии язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки (Смирнова Т.А., 2004). Положительный эффект включения противовирусных препаратов в схему лечения заболеваний, ассоциированных с Я. pylori, объясняется их иммуномодули-рующим действием. С нашей точки зрения, применение противовирусной терапии необходимо, как этиотропное воздействие.

Наличие в МНК фрагментов генома Я. pylori, в частности генов, кодирующих экспрессию цитотоксических и адгезивных белков микроорганизма, в настоящее время объяснить достаточно сложно. Тем не менее, этот факт, вероятно, свидетельствует о вовлечении в инфекционный процесс при хеликобактериозе организма в целом, а не ограничивается только поражением слизистой оболочки ЖКТ.

Вероятно, это явление может быть пусковым механизмом для включения в процесс других систем организма. Дальнейшее изучение этого явления поможет объяснить развитие вне желудочной патологии при хеликобактерной инфекции.

Таким образом, воспалительные заболевания слизистой оболочки гастродуоденальной зоны ЖКТ обуславливаются не только инфекцией Я. pylori, но и участием в процессе вирусов герпеса человека. Сложность лечения данной патологии обуславливается присутствием вирусов в очаге воспаления.

Приоритетным вопросом в диагностике инфекции, обусловленной Я. pylori, является достоверность способов выявления, как на этапе первичной диагностики, так и после проведенной эрадикационной терапии. Достоверная и своевременная диагностика инфекции позволяет избежать необоснованного назначения химиотерапевтических препаратов, а также адекватно контролировать проведенную антихеликобактерную терапию.

В настоящее время для диагностики данной патологии предложены бактериологический, бактериоскопический, гистологический, имму-ноферментный (ИФА) методы, метод ПЦР, быстрый уреазный и дыхательные тесты. Применяется метод иммунохроматографии, как метод экспресс-диагностики. Тем не менее, ни один из существующих методов не является универсальными и не обладает 100% чувствительностью и специфичностью.

Принципиальное значение для практики имеет разделение методики диагностики Я. pylori до лечения (первичная диагностика - обнаружение инфекции для обоснованного назначения лечения) и после проведения эрадикационной терапии (диагностика эрадикации - контроль успешности антибактериальной и противовирусной терапии).

При первичной диагностике, на наш взгляд, необходимо проведение ЭГДС с обязательным взятием бипсийного материала для выявления этиологии воспалительного процесса. Поскольку показано, что присутствие вирусов герпеса достаточно частое явление при воспалительных процессах слизистой оболочки гастродуоденальной области, необходимо тестирование биопсийного материала на наличие вирусов. Для подтверждения диагноза необходимо применение еще не менее двух - трех различных методов определения инфекционных агентов.

При контроле эффективности лечения при отсутствии жалоб у пациента, следует использовать не менее двух методов неинвазивной ди-

агностики, например, серологического исследования снижения титра специфических антител и тестирования МНК на наличие фрагментов генома Н. pylori методом ПЦР. Выбор методов лабораторной диагностики зависит от технической оснащенности лаборатории.

Для врачей, занимающихся лечением изучаемой патологии, важно понимать, что положительные результаты терапии напрямую зависят от своевременного и правильно установленного этиологического диагноза.

Алгоритм специфической диагностики воспалительных процессов гастродуоденальной области ЖКТ схематично выглядит следующим образом (рис. 18).

Типпология

Рисунок 18. Алгоритм этиологической диагностики воспалительных процессов гастро-дуоденальной зоны ЖКТ

ВЫВОДЫ.

1. У больных с хронической гастродуоденальной патологией в очагах воспаления слизистой оболочки наряду с Я. pylori обнаружено присутствие вирусов группы герпеса. Различные представители Herpesviridae в пораженной ткани встречаются с достаточно большой частотой (в среднем от 17 до 44 % случаев). Степень повреждения слизистой оболочки напрямую зависит от степени обсе-

34

менения и спектра микроорганизмов, присутствующих в очаге воспаления. Деструктивные процессы в слизистой оболочке имеют более глубокий характер при смешанном бактериально-вирусном инфицировании.

2. Местные иммунопатологические реакции при бактериальном, вирусном и бактериально-вирусном инфицировании имеют различный характер. При инфицировании только Н. pylori местная реакция развивается с экспрессией преимущественно мРНК ИЛ-2, ИЛ-6, ИФ-у и ФИО- а. При вирусном - преобладает сдвиг преимущественно в сторону Тх1 с экспрессией мРНК HJI-lß, ИЛ-2, ИЛ-10, ИФ-у и ФИО- а. При смешанном инфицировании иммунопатологический процесс имеет разнонаправленный характер, прогрессивно развивается по «расходящейся спирали», что и обуславливает глубокие повреждения слизистой оболочки.

3. Уровни специфических антител к Н. pylori и вирусам группы герпеса не отражают в полной мере защитную реакцию макроорганизма и степень повреждения слизистой оболочки. Определение IgA к Н. pylori, количества лимфоцитов с фенотипом CD 16+56+и ИФу в периферической крови могут явиться дополнительным показателем в определении активности инфекционного процесса и степени повреждения слизистой оболочки гастродуоденальной области.

4. Обнаружен ранее неизвестный феномен персистенции фрагментов ДНК Н. pylori в МНК периферической крови, проявление которого зависит от длительности течения заболевания и степени повреждения слизистой оболочки.

5. На основе этого явления разработаны и предложены новые способы диагностики инфекции и прогнозирования тяжести течения заболевания, обусловленного Н. pylori и вирусами герпеса, заключающиеся в тестировании биоптатов и МНК периферической крови на наличие ДНК Н. pylori и вирусов герпеса..

6. Предложен рациональный алгоритм этиологической диагностики хронических воспалительных заболеваний гастродуоденальной области, заключающийся в обязательном проведении ЭГДС при

первичном обследовании с взятием бипсийного материала и определением инфекционных агентов методом ПЦР.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

С целью повышения качества лабораторной диагностики хронических воспалительных заболеваний гастродуоденальной области, включающих в себя хронический эрозивный гастрит, гастродуоденит, язвенную болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, целесообразно включить в схему лабораторной диагностики исследование методом ПЦР биоптатов слизистой оболочки на вирусы группы герпеса: вируса Эпштейна-Барр, цитомегаловируса и вирусов герпеса человека 6-го,7-го,8-го типов..

Целесообразно использовать способ диагностики инфекции, обусловленной Н. pylori, основанный на определении фрагментов ДНК микроорганизма в МНК. Этот способ позволяет не только установить факт инфицирования, но в большей степени дает возможность оценить факт вовлечения в инфекционный процесс всего организма.

В целях прогноза развития хронических заболеваний и предварительного заключения о степени повреждения слизистой оболочки целесообразно включить в диагностический комплекс определение сывороточных Ig А, специфичного к ИФу.

В применяемые схемы лечения воспалительных заболеваний гастродуоденальной области при обнаружении вирусов необходимо включать противовирусные и / или иммуномодулирующие препараты.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Перелыгин В.В., Мартовецкий М.Н., Нелюбин В.Н. Отчет о НИР: Разработка препаратов на основе энтеросорбентов и бактерий для лечения функциональных расстройств кишечника // Архив ГосНИИ ПМ, инв.№ БС-240, 1991г. 41 е.;

2. Нахабин И.М., Перелыгин В.В, Нелюбин В.Н. Отчет о НИР: Разработка препаратов пробиотиков в комплексе с витаминами, иммуностимуляторами, лизоцимом для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта//Архив ГосНИИ ПМ, инв.№ БС- 241,1991г. 37 е.;

3. Прокопенко В.Д., Нелюбин В.Н., Долгова Т.И., Калинина Т.И., Мудров В.П Клинико-иммунологическая характеристика пациентов с поражениями слизистой желудка. // VII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, Россия, 10-14 апреля. Тезисы докладов, Москва, 2000г., С.177;

4. Скрнпкина Г.В., Мудров В.П., Нелюбин В.Н. Прокопенко В.Д Имудон - препарат выбора для иммунокоррекции факторов защиты слизистой полости рта. // Материалы III съезда иммунологов и аллергологов СНГ, Сочи, Россия, 16-20 сентября2000г. Аллергология и иммунология.- 2000.-Т.1.-№2, С.115;

5. Нелюбин В.Н., Пркопенко В.Д., Лолокова Н.В., Сибилев А.В, Мудров В.П. Значение инфекционных агентов в патогенезе атопических и смешанных форм генерализованных дерматитов.// VIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, Россия, 2-6 апреля. Тезисы докладов, Москва, 2001г., С.476;

6. Нелюбин В.Н., Прокопенко В.Д., Морисенкова Н.В., Мудров В.П., Жуков И.В. Стадийность изменений в иммунной системе при герпес -вирусной инфекции // VIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, Россия, 2-6 апреля. Тезисы докладов, Москва, 2001г., С.476.;

7. Прокопенко В.Д., Нелюбин В.Н., Мудров В.П., Долгова Т.Н., Азоева А.В. Особенности клеточного звена иммунной системы при инфицировании Helicobacter pylori. II VIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, Россия, 2-6 апреля. Тезисы докладов, Москва, 2001г., С.481;

8. Мудров В.П., Скрипкина Г.В., Морисенкова Н.В., Жуков И.В., Нелюбин В.Н., Прокопенко В.Д. Иммунный ответ к топическим оппортунистическим инфектам при хронических заболеваниях респираторного и желудочно-кишечного тракта.// Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. Тезисы докладов IV конгресса РААКИ. Москва, 29-31 мая 2001г., С.92;

9. Нелюбин В.Н., Мудров В.П., Прокопенко В.Д., Качармина В.А. Современные биотехнологические методы в структуре клинической лабораторной диагностики многопрофильного лечебного учреждения // Био-

медицинские технологии. Сборник МНСБТ РАМН, Москва, 2001г., с.143-147;

10. Прокопенко В.Д., Нелюбин В.Н., Мудров В.П., Скрипкина Г.В. Проблемы системности иммунопатологического процесса Helicobacter pylori -инфекции// Биомедицинские технологии. Сборник МНСБТ РАМН, Москва, 2001г., С.164-171;

11. Прокопенко В.Д., Нелюбин В.Н., Мудров В.П. и др. Клеточно-опосредованный иммунный ответ на Helicobacter pylori.// Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии.-2001.-№5.-С.25-30;

12. Прокопенко В.Д., Мудров В.П., Жуков И.В., Морисенкова Н.В Современные факторы патогенности бактериальных и вирусных микроорганизмов // Теоретические и прикладные проблемы современного здравоохранения и медицинской науки. Сборник научных трудов РНИИЖГ. В 2-х частях,- Москва.: МГИУ, 2001.- Ч.1.- С.145 -153 (соавт..);

13. Прокопенко В.Д., Морисенкова Н.В., Нелюбин В.Н., Скрипкина Г.В. и др. Варианты иммунного ответа при рецидивирующих формах герпесвирусной инфекции.// Теоретические и прикладные проблемы современного здравоохранения и медицинской науки. Сборник научных трудов РНИИЖГ. В 2-х частях,- Москва.: МГИУ, 2001.- Ч.1.- С. 306-314;

14. Мудров В.П., Нелюбин В.Н., Долгова Т.И., Азоева А.В., Прокопенко В.Д. Иммунный ответ организма человека на Helicobacter pylori -инфекцию желудочно-кишечного тракта // Теоретические и прикладные проблемы современного здравоохранения и медицинской науки. Сборник научных трудов РНИИЖГ. В 2-х частях.- Москва.: МГИУ, 2001.- 4.2, С.70-76;

15. Прокопенко В.Д., Нелюбин В.Н., Мудров В.П., Жуков И.В., Михайлов С.Е.Иммунный контроль инфекций слизистых начальных отделов желудочно-кишечного тракта, вызванных Helicobacter pylori // IX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, Россия, 8-12 апреля 2002г. Тезисы докладов, Москва, 2002, С.365;

16. Морисенкова Н.В., Качармина В.А., Нелюбин В. Лолокова Н.В. и др Формы недостаточности иммунитета при рецидивирующих герпес-вирусных инфекциях. // IX Российский национальный конгресс «Человек

и лекарство», Москва, Россия, 8-12 апреля 2002г. Тезисы докладов, Москва, 2002, С.563;

17. Нелюбин В.Н., Мудров В.П, Скрипкина Г.В., Прокопенко В.Д. Микроорганизмы слизистой рта практически здоровых лиц // «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении». Сборник трудов научно-практического симпозиума в рамках Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины». Москва 20-21 июня 2002г., С.266-268 (соавт. );

18. Прокопенко В.Д., Скрипкина Г.В., Мудров В.П., Нелюбин В.Н. и др. Иммунологические аспекты эффективности бактериальных препаратов при заболеваниях слизистой полости рта // В сборнике «Воспалительные заболевания слизистой оболочки полости рта, пародонта и глотки», Москва, 2002г., С.46-55;

19. Нелюбин В.Н., Мудров В.П., Прокопенко В.Д. К вопросу специфической диагностики хронических вялотекущих инфекций // Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии Сборник трудов 5-го конгресса РААКИ 12-14 ноября 2002 г. В 2 томах,- Москва, 2002.-T.2.-C..500;

20. Прокопенко В.Д., Скрипкина Г.В., Мудров В.П.„ Жуков И.В , Нелюбин В.Н. и др. Иммунологические аспекты эффективности бактериальных препаратов при заболеваниях слизистой полости рта // Русский медицинский журнал, 2002, том 10, № 3, С. 129-134;

21. Нелюбин В.Н., Мудров В.П., Ковальчук Л.В.Способ диагностики Helicobacter pylori - инфекции // Заявление о выдаче патента Российской Федерации на изобретение. Регистрационный № 2003118723 от 25.06.2003 года. Офиц. Бюлл. Комитета РФ по патентам и товарным знакам, 2005. -Заявка на патент № 2003118723. Патент на изобретение № 2265219,16 с;

22. Ковальчук JI.B., Мудров В.П., Нелюбин В.Н., Соколова Е.В. Роль цитокинов в иммунопатогенезе заболеваний гастродуоденальной области при Helicobacter pylori — инфекции // Иммунология. -2003.-Т.24, № 5, С.311-314 ;

23. Нелюбин В.Н., Мудров В.П., Долгова Т.И., Кузнецов Е.О. и др. Этиологическая диагностика патологии барьерных тканей, обусловленной патогенными микроорганизмами с атипичной локализацией // «Здраво-

охранение на железнодорожном транспорте стран СНГ на современном этапе: теория и практика» - Сборник научно-практических работ в 2х томах. -Москва, - 2004, -Т.1,- С..445 - 451;

24. Нелюбин В.Н., Мудров В.П Иммунопатологические аспекты хронических воспалительных заболеваний желудочно-кишечного тракта П Медицинская иммунология,- 2004.-T.6-JY® 3.-С.320;

25. Нелюбин В.Н., Мудров В.П Инфицирование мононуклеарных клеток периферической крови вирусами герпеса при различной патологии II Медицинская иммунология,- 2004.-Т.6-№ 3,- С.320 - 321;

26. Стенина М.А., Нелюбин В.Н., Мудров В.П,, Киселевич О.К.Микст инфекция M.tuberculosis, Epstain Barr virus, Human herpes virus IV у детей II Медицинская иммунология,- 2004,-Т.6-№ 3.- С. 338 - 339;

27. Мудров В.П , Нелюбин В.Н. Особенности провоспалительной цитокиновой регуляции иммунного ответа на Helicobacter pylori - инфекцию // Иммунология. - 2004.- Т.25 - № б - С.364 - 367;

28. Нелюбин В.Н., Мудров В.П Бактериально - вирусное коинфици-рование слизистой оболочки при гастродуоденальной патологии // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2004.- № 2 -Cc.l 11-115;

29.Нелюбин В.Н., Ковальчук Л.В., Мудров В.П., Скворцов С.В. и др. Характеристика иммунных нарушений при хронических воспалительных заболеваниях слизистой оболочки гастродуоденальной области, обусловленных инфицированием Н. pylori и вирусами группы герпеса // Патогенез. - 2004.-т.2-№2- С.34 - 39;

30. Нелюбин В.Н., Мудров В.П., Скворцов С.В., Кузнецов Е.О.Инфекционная составляющая и иммунопатология при хронических воспалительных заболеваниях слизистой оболочки гастродуоденальной области И Международный медицинский журнал,- 2005.- Т.11-№2- С.128 -131;

31. Нелюбин В.Н., Мудров В.П., Панова О.В., Стенина М.А., Киселевич O.K. Микст-инфекция Mycobacterium tuberculosis, Epstein-Barr virus, Herpes human virus VI у детей II Международный медицинский журнал,-2005.-Т.11-№4- С.100- 101;

32. Нелюбин В.Н., Мудров В.П., Трофимов Д.Ю., Батенсва Е.Л., Чеканов A.B. Некоторые аспекты местной цитокиновой регуляции иммунного ответа при микст-инфицировании H.pylori и Herpesviridae слизистой оболочки ЖКТ // Медицинская иммунология.- 2006.-T.8.-JV» 2-3-С.277;

33. Нелюбин В.Н., Мудров В.П. Детекция фрагментов ДНК Helicobacter pylori в мононуклеарных клетках периферической крови // Российский иммунологический журнал.- 2007.-JV» 2.- С.150 -155;

34. Нелюбин В.Н., Мудров В.П. Персистеиция Helicobacter pylori в моноиуклеарных клетках периферической крови при гастродуоде-нальной патологии // Российский аллергологический журнал.- 2007.-№ 3.- Приложение 1.- С.268;

35. Нелюбин В.Н., Гречушников В.Б., Мудров В.П. Иммунофер-ментная диагностика хеликобактериоза // Российский аллергологический журнал,- 2008.- № 1.- Приложение 1,- С.193 -194;

36. Нелюбин В.Н., Гречушников В.Б., Мудров В.П. Некоторые особенности патогенеза хеликобактерной инфекции // Российский аллергологический журнал,- 2008.- № 1.- Приложение 1.- С. 195;

37. Гречушников В.Б., Дудаева Н.Г., Головачева Т.В., Нелюбин В.Н., Мудров В.П. Влияние Helicobacter pylori на состояние микробиоценоза кишечника // XV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, Россия, 14-18 апреля 2008г. Тсзисы докладов, Москва, 2008, С.92;

38. Гречушников В.Б., Дудаева Н.Г., Нелюбин В.Н., Мудров В.П. Сравнительный анализ методов диагностики Helicobacter pylori II XV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, Россия, 14-18 апреля 2008г. Тезисы докладов, Москва, 2008, С.92 - 93;

39. Нелюбин В.Н., Гречушников В.Б.. Мудров В.П. Диагностика хеликобактериоза - новые возможности // Сборник трудов 2-го съезда врачей железнодорожного транспорта России. 18-20 июня 2008 г., Москва, с. 182- 185;

40. Нелюбин В.Н., Гречушников В.Б., Мудров В.П. Сравнительная характеристика лабораторных методов диагностики хеликобактериоза // Российский иммунологический журнал.- 2008,- т.2(11) - № 23 - С. 256;

41. Гречушников В.Б., Нелюбин В.Н., Мудров В.П. Диагностика и лечение хеликобактерной инфекции // В сборнике научно-практических работ «Обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия на объектах транспорта Российской Федерации», Москва, 2008, С. 373 - 378;

42. Нелюбин В.Н., Мудров В.П. Феномен персистенции Helicobacter pylori в мононуклеарных клетках периферической крови и его практическое применение // Сборник материалов IX Дорожной научно-практической конференции врачей учреждения здравоохранения Московской железной дороги «Новые медицинские технологии в реализации программы «Здоровье населения России», 2008, С. 270 - 273;

43. Бугаева И.О., Гречушников В.Б., Дудаева Н.Г., Нелюбин В.Н. Helicobacter pylori'. современная диагностика и терапия.// Издательство Саратовского медицинского университета, 2008,106 е.;

44. Нелюбин В.Н., Гречушников В.Б., Молчанова О.В.Состояние внешнесекреторной функции поджелудочной железы у больных хроническим панкреатитом, инфицированных Helicobacter pylori// Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. -2008.-Т.18.- №5.- Приложение №32, С.70;

45. Панова О.В.,Стаханов В.А., Стенина М.А.,Кривов Л.И.„ Нелюбин В.Н., Мудров В.П Скрининг детей раннего и дошкольного возраста, больных туберкулезом, на носительство вирусов герпеса // Вестник Российского государственного медицинского университета, 2008; № 5, с. 42-46;

46. Нелюбин В.Н., Гречушников В.Б., Молчанова О.В.Состояние внешнесекреторной функции поджелудочной железы у больных хроническим панкреатитом, инфицированных Helicobacter pylori II Международный медицинский журнал.- 2009,- т.15-№2 (58) - с.102 -108;

47. Grechushnikov V.B., Nelyubin V.N., Popov V.V. Fibrinogen as a risk factor of the development of cardiovascular diseases in patients infected by Helicobacter pylori II In abstract book of «6th Global Cardiovascular Clinical Trialists Forum» , 3-5 Desember 2009, Paris, France, p. 54;

48. Нелюбин B.H., Мудров В.П. Возрастные особенности иммунного ответа при бактериально-вирусном инфицировании слизистых

оболочек организма // Российский аллсргологическнй журнал, - 2010.-№1- вып.1- с.128 —129;

49. Мудров В.П., Нелюбин В.Н., Стамм М.В., Власенко И.В.Особенности диагностики возрастных хронических дегенеративных заболеваний // Медицинский алфавит. Лаборатория, -2010,- № 2.- С. 11 -13;

50. Нелюбин В.Н., Мудров В.П., Сепиашвили Р.И.Особенности инфицирования барьерных тканей // Аллергология и иммунология, -2010.-t.11.-JV« 2.- С.1- 5;

51. Нелюбин В.Н., Гречушников В.Б., Мудров В.П. Генодиагностика бактериально-вирусной патологии ЖКТ/// Материалы VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010», сборник трудов.- 2010. -т.2.- С370 - 372 ;

52. Нелюбин В.Н., Мудров В.П., Сепиашвили Р.И Местная регуляция иммунного ответа при гастродуоленальной патологии, обусловленной Helicobacter pylori и вирусами герпеса // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010.-JV» 8 (122).-С. 150-153;

53. Нелюбин В.Н., Брезицкий В.Б., Мудров В.П., Сепиашвили Р.И. Показана ли противовирусная терапия при гастродуоденалыюй патологии // Антибиотики и химиотерапия.- 2011.-№/-2.- С. 3&'- у/у

54. Нелюбин В.Н., Мудров В.П., Чеканов А.В., Сепиашвили Р.И. Цитокиновая регуляция иммунного ответа при бактериально-вирусной инфекции желудочно-кишечного тракта, обусловленной Helicobacter pylori и вирусами герпеса.// Вестник РУДН, серия медицина.- 2011.- № 1.- С.45 - 51.

Патенты.

1. Патент РФ на изобретение № 2265219 «Способ диагностики Helicobacter pylori - инфекции» (соавторы Мудров В.П. Ковальчук Л.В.);

2. Заявка на изобретение № 2010154231 «Способ прогнозирования тяжести течения воспалительных заболеваний гастродуоденаль-ной области» (соавторы Мудров В.П., Сепиащвили Р.И.).

Подписано в печать: 14.01.11

Объем: 2,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 765 Отпечатано в типографии «Реглета 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Актуальность темы. В настоящее время наблюдается стремительный рост числа заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Согласно статистическим данным этими заболеваниями страдает почти 100 миллионов жителей планеты. Ежегодно в мире около 10 млн. человек ставится диагноз гастрита [32]. Общеизвестна и широкая распространенность язвенной болезни. В индустриально развитых странах, по данным ряда авторов, язвенной болезнью страдает 6-10% всего взрослого населения. При этом болезнь поражает самый трудоспособный возраст - до 40 лет. Наблюдается тенденция к омоложению данной патологии. Значительно возросла частота обнаружения язвенных ■ поражений ЖКТ у детей подросткового возраста [187, 222]. По данным Дудниковой Э.В. [28] удельный вес язвенной болезни (ЯБ) составляет 13,5% от всех гастроэнтерологических заболеваний у детей, причем преобладают дуоденальные язвы (90-95%).

Большую проблему представляют вялотекущие хронические воспалительные процессы, связанные с персистенцией микробного агента, в том числе заболевания ЖКТ, ассоциированные с инфицированием Helicobacter pylori (Н. pylori). Этому вопросу уделяется пристальное внимание на протяжении более чем 25 лет. Н. pylori является ключевым фактором в патогенезе большинства клинически значимых нозологических форм заболеваний ЖКТ, в число которых входят: хронический гастрит, дуоденит, язвенная болезнь, аденокарцинома и В-клеточная MALT-лимфома желудка [3, 5, 24, 38, 43, 140, 195, 196, 197].

Согласно эпидемиологическим исследованиям распространённость хеликобактериоза увеличивается. Уровень инфицированности Н. pylori зависит от ряда факторов, в том числе социальных и экономических. Однако даже в социально благополучных и экономически развитых странах, по данным различных авторов, инфекция Н. pylori обнаруживается у 20 - 45 % населения. В Москве этот показатель достигает 64-75%, по другим регионам России колеблется от 29 до 92% [38, 101].

На сегодняшний день существует целый ряд клинических данных свидетельствующих о том, что инфекция Н. pylori помимо поражения желудочно-кишечного тракта способна вызывать ряд патологических изменений со стороны других органов и систем. К внежелудочным проявлениям этой инфекции в настоящее время относят: анемии, аутоиммунную патологию, поражения сердечно - сосудистой системы, головного мозга, суставов, желез внутренней секреции, глаз, кожных покровов и некоторые другие заболевания [38, 50, 76, 88, 93, 138, 155, 177, 266].

В 1994 г. «Международное агентство по изучению рака» и «Национальный институт здоровья США» признали, что действие Н. pylori «канцерогенно для человека», отнеся этот фактор к канцерогенам I группы (как и курение для рака лёгкого). Согласно статистическим данным, злокачественные новообразования наиболее часто локализуются в желудочно-кишечном тракте. Ежегодно во всем мире рак желудочно-кишечного тракта диагностируется примерно у 3 миллионов человек, 70% из которых погибают [38].

Известно, что не во всех случаях инфицирования Н. pylori развивается антральный гастрит или язвенная болезнь. В то же время, описаны случаи изменения слизистой ЖКТ эрозивного и язвенного характера в отсутствии Н. pylori [30,38].

Экспериментальные и клинические исследования последних лет установили, что в развитии хронических воспалительных заболеваний желудочно-кишечного тракта, и гастродуоденальной области, в частности, помимо основного этиологического фактора - Н. pylori, принимают участие вирусы группы герпеса: Epstein-Barr virus, Cytomegalovirus, Human herpes virus VI, VII, VIII, причем иногда в отсутствии пилорического хеликобактера [134, 135, 146, 163, 215, 229, 258]. В связи с этим можно предположить, что в развитии поражений слизистой ЖКТ при хеликобактериозе принимают непосредственное участие вирусы, в частности группы герпеса (Herpesviridae). Это, в свою очередь, существенно меняет подходы к этиологической диагностике воспалительных заболеваний ЖКТ pi требует коррекции применяемых схем лечения этой группы заболеваний с применением противовирусных и иммуномодулирующих препаратов [80, 81, 82, 83].

Опубликованные данные, свидетельствующие о наличии фрагментов ДНК Н. pylori в атеросклеротических бляшках кровеносных сосудов [180], вызывают закономерный вопрос о механизме и путях попадания микроорганизма или его фрагментов в сосудистое русло. Наиболее вероятным «транспортом», в этом случае, могут выступать мононуклеарные клетки. Эти клетки способны к переносу патогенов микробного происхождения в макроорганизме в различные органы и ткани [261].

В литературе широко обсуждается роль H.pylori в иммунопатогенезе хронического гастрита, язвенной болезни, В-клеточной лимфомы желудка. Тем не менее, до сих пор не совсем понятен пусковой механизм патогенетического действия микроорганизма на слизистую желудка и двенадцатиперстной кишки. Не исключено, что локально запускаемый цитокиновый каскад играет ключевую роль в прогрессировавши хронических воспалительных и деструктивных процессов в слизистой гастродуоденальной области. В связи с этим новым направлением в исследовании патогенного действия Н. pylori стало изучение цитокиновой регуляции иммунного ответа [225, 226].

Стимулирующее действие на выработку цитокинов клетками слизистой желудка инфицированных людей оказывают ЛПС, уреаза, CagA-протеин и некоторые другие антигены. В ответ на стимул синтезируются цитокины: ИЛ-lß, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-18, ФНО-а [105, 189,190, 200]. Тем не менее, экспериментальных и клинических данных о влиянии Н. pylori на синтез цитокинов в месте воспаления слизистой ЖКТ, особенно в сочетании с вирусами группы герпеса недостаточно.

За последние годы растёт число публикаций, посвященных особенностям иммунного ответа организма человека на инфицирование Н. pylori и Herpesviridae, но, в основном, эти работы носят несистемный характер. Отсутствие систематизированных данных о вирусной составляющей этиологического фактора хронических заболеваний ЖКТ, влиянии инфекционных агентов на основные функции иммунокомпетентных клеток, а так же противоречивость данных о характере иммунного ответа при развитии хронических заболеваний гастродуоденальной области определяют перспективность и актуальность данной работы.

Цель исследования

Определение местных и системных иммунопатогенетических особенностей развития хронического воспаления у больных с гастродуоденальной патологией, обусловленной инфицированием H.pylori и вирусами Herpesviridae, для создания рационального диагностического алгоритма этих патологических состояний.

Задачи исследования

1. Выявить инфицированность слизистой оболочки штаммами Н. pylori и вирусами Herpesviridae при воспалительных заболеваниях гастродуоденальной области и определить зависимость степени поражения слизистой оболочки (по данным ЭГДС, цитологии и гистологии) от степени инфицирования микроорганизмами.

2. Изучить местную иммунную реакцию в очаге воспаления по уровню экспрессии мРНК цитокинов в слизистой оболочке гастродуоденальной области.

3. Оценить проявления генерализованной иммунной реакции организма при изучаемой патологии, сопоставив эти данные с наличием инфекционных агентов в биопсийном материале слизистой оболочки.

4. Выявить возможное присутствие ДНК Н. pylori в мононуклеарных клетках периферической крови при гастродуоденальной патологии.

5. Разработать способ диагностики инфекции, обусловленной Н. pylori, путем определения фрагментов ДНК микроорганизма в мононуклеарных клетках периферической крови.

6. Предложить рациональный алгоритм диагностики воспалительных заболеваний гастродуоденальной области при бактериально-вирусном инфицировании.

Научная новизна

Получены новые данные о бактериально-вирусном инфицировании слизистой оболочки гастродуоденальной области. В период обострения хронических воспалительных заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки слизистая оболочка может быть контаминирована патогенными штаммами Н. pylori, цитомегаловирусом, вирусами Эпштейна-Барр, варицелла зостер, герпеса человека 6-го, 7-го, 8-го типов.

Получены новые данные о состоянии местной иммунной реакции в слизистой оболочке гастродуоденальной зоны ЖКТ при воспалительной реакции, обусловленной инфицированием патогенными штаммами Н. pylori и вирусами Herpesviridae.

Установлены неизвестные ранее факты о том, что экспрессия мРНК цитокинов в очаге поражения носит различный характер при бактериальном, вирусном и смешанном инфицировании.

Показана связь между характером инфицирования слизистой оболочки гастродуоденальной области, уровнем экспрессии мРНК цитокинов в очаге воспаления и провоспалительных цитокинов в сыворотке крови. Выявлена четкая прямая зависимость между степенью повреждения слизистой оболочки и уровнем ИФу в периферической крови.

Показан дисбаланс в соотношении CD3+4+/CD3+8+ клеток при деструктивном характере поражения слизистой оболочки, характеризующийся непропорционально большим количеством CD3+8+ клеток, связанный с характером смешанного бактериально-вирусного инфицирования.

Установлена прямая корреляционная зависимость уровня сывороточных антител класса А (IgA) к Н. pylori и антител класса G (Ig G) вирусу герпеса человека 6 типа от степени повреждения слизистой оболочки.

Впервые обнаружен феномен персистенции участков ДНК Н. pylori в мононуклеарных клетках периферической крови при воспалительных заболеваниях гастродуоденальной области. Установлен факт наличия в мононуклеарных клетках генов ureC, cagA, vacAsl, vacAs2, vacAm2, iceAl, iceA2, babA H. pylori, кодирующих факторы патогенности микроорганизма.

Разработан новый способ диагностики инфекции, обусловленной Н. pylori, осуществляемый путем определения методом ПЦР участков генома микроорганизма в мононуклеарных клетках периферической крови.

Предложен способ оценки и прогнозирования тяжести течения воспалительных заболеваний гастродуоденальной области, обусловленных Н. pylori и Herpesviridae, основанный на одновременном определении методом ПЦР участков генома микроорганизмов в биопсийном материале слизистой оболочки и в мононуклеарных клетках крови.

Обоснована общая схема иммунопатогенетических процессов, происходящих в слизистой оболочке, при бактериально-вирусном инфицировании (Н. pylori и Herpesviridae).

Разработан и обоснован алгоритм этиологической диагностики хронических воспалительных заболеваний гастродуоденальной области бактериально-вирусной природы.

Теоретическая и практическая значимость

Если ранее в литературе встречались единичные сообщения об участии отдельных представителей вирусов группы герпеса в патологии желудка и двенадцатиперстной кишки, то полученные результаты исследований свидетельствуют о неслучайном характере присутствии представителей Herpesviridae при патологии ЖКТ.

Было установлено, что при инфицировании только Н. pylori местная реакция развивается с экспрессией преимущественно мРНК ИЛ-2, ИЛ-6, ИФ-у и ФНО- а. При вирусном инфицировании преобладает сдвиг преимущественно в сторону Тх1 с экспрессией мРНК ИЛ-lß, ИЛ-2, ИЛ-10, ИФ-у и ФНО- а. При смешанном инфицировании иммунопатологический процесс в очаге воспаления слизистой оболочки имеет разнонаправленный характер с выраженной экспрессией мРНК всех исследованных цитокинов (ИЛ-lß, ИЛ-2, ИЛ- 4, ИЛ- 6, ИЛ-10, ИЛ- 18, ИФ-у и ФНО- а) и прогрессивно развивается по «расходящейся спирали», с вовлечением в воспалительный процесс окружающей ткани и преобладанием деструктивных изменений в слизистой оболочке.

Показана прямая зависимость наличия в мононуклеарных клетках генов патогенности Н. pylori от степени повреждения слизистой оболочки.

Разработан и предложен новый способ диагностики инфекции, обусловленной Н. pylori, основанный на определении фрагментов ДНК микроорганизма в мононуклеарных клетках периферической крови, а так же способ оценки и прогнозирования тяжести течения воспалительных заболеваний гастродуоденальной области, обусловленных Н. pylori и Herpesviridae.

Предложен комплекс лабораторных исследований и иммунодиагностики хронических воспалительных заболеваний гастродуоденальной области. Разработан алгоритм применения этого комплекса при обследовании больных с целью выявления комбинации патогенных микроорганизмов при хронических заболеваниях желудка и двенадцатиперстной кишки.

Даны рекомендации по диагностике и лечению заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированных с Н. pylori и вирусами группы герпеса. В схемы лечения изучаемой патологии наравне с классической эрадикационной терапией рекомендовано включение противовирусных и иммуномодулирующих препаратов, как составляющей этиотропного лечения.

Положения, выносимые на защиту

1. Выявленный спектр микроорганизмов, инфицирующих слизистую оболочку при воспалительных процессах гастродуоденальной области, свидетельствует, что изучаемая патология обусловлена не только бактерией Н. pylori, но и вирусами группы герпеса.

2. Степень деструктивных изменений слизистой оболочки и характер местной клеточной реакции зависит от сочетания инфекционных агентов, присутствующих в очаге воспаления. При моноинфицировании Н. pylori или вирусами Herpesviridae местная реакция носит различный характер. При бактериальном инфицировании экспрессируется преимущественно мРНК ИЛ-2, ИЛ-6, ИФ-у и ФНО-а. При вирусном — реакция развивается преимущественно по Тх1 - типу с экспрессией мРНК ИЛ-lß, ИЛ-2, ИЛ-10, ИФ-у и ФНО-а. При микст инфицировании местная иммунопатологическая реакция приобретает разнонаправленный характер и развивается по «раскручивающейся спирали» с вовлечением в воспалительный процесс окружающей ткани, в результате чего в очаге воспаления преобладают деструктивные процессы.

3. Впервые обнаруженный феномен персистенции фрагментов генома Н. pylori в мононуклеарных клетках периферической крови свидетельствует о том, что инфекционный процесс не ограничивается местными изменениями слизистой оболочки, но при длительном течении способен вызывать иммунопатологические процессы на уровне целого организма.

4. Определение специфических участков ДНК Н. pylori в мононуклеарных клетках периферической крови методом ПЦР можно использовать в комплексной диагностике хеликобактериоза. Этот способ позволяет оценить степень вовлечения в патологический процесс всего организма и степень повреждения слизистой оболочки гастродуоденальной области.

5. Для достоверной и эффективной первичной диагностики воспалительных заболеваний гастродуоденальной области необходимо проведение ЭГДС с обязательным взятием биопсийного материала и определением наряду с Н. pylori возможного присутствия вирусов группы герпеса.

Внедрение результатов работы в практику и учебный процесс

Получен Патент РФ на изобретение № 2265219 «Способ диагностики Helicobacter pylori - инфекции». Изобретение внедрено в практику работы клинико-диагностических лабораторий: НУЗ «Центральная клиническая больница № 6 ОАО «Российские Железные Дороги», г. Москва; МУЗ «Городская поликлиника» г. Краснознаменск, Московская область; ФГУ«150 Центральный военный госпиталь Космических Войск», Московская область; ООО «Национальное агентство клинической фармакологии и фармации» (НАКФФ), г.Москва; ООО «Медицинский центр Авиценна», г.Москва; МУЗ «Городская клиническая больница № 4», г. Пермь. Подана заявка на изобретение № 201054231 «Способ прогнозирования тяжести течения воспалительных заболеваний гастродуоденальной области».

Материалы диссертации используются в учебном процессе на циклах тематического усовершенствования, проводимых на кафедре клинической лабораторной диагностики ГОУ Российская медицинская академия последипломного образования, г. Москва.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:

• Российских Национальных конгрессах «Человек и лекарство» в г. Москве: VIII, 2001, IX, 2002, XV, 2008 гг.;

• Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (Москва, 2002);

• V Конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002);

• Всероссийском Форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (С-Петербург, 2006);

• VIII Конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007);

• 2-ом заседании Клуба профессиональных иммунологов (Анталия, Турция, 2007),

• Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология — междисциплинарные проблемы», 26-27 февраля 2008 г. (Москва);

• 2-ом Съезде врачей железнодорожной медицины (2008), Объединенном иммунологическом форуме в г. Санкт-Петербурге (2008);

• Международном симпозиуме «Иммунитет и инфекции» 5-12 октября 2008г. (Кемер, Турция, 2008);

• 6-ом Всемирном Форуме по клиническим испытаниям в кардиологии, 3-5 декабря, 2009 г. (Париж, Франция);

• Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология - практическому здравоохранению», 25-26 февраля 2010 г. (Москва);

• VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010», 24 -26 ноября 2010 г. (Москва).

По материалам диссертации опубликованы 54 научные работ, из них 1 монография и 10 публикаций в журналах, рекомендованных ВАК. Получен патент РФ на изобретение.

Объем и структура диссертации

Выводы

1. У больных с хронической гастродуоденальной патологией в очагах воспаления слизистой оболочки наряду с Н. pylori обнаружено присутствие вирусов семейства Herpesviridae с частотой встречаемости отдельных видов от 17 до 44 %. Степень повреждения слизистой оболочки прямо зависит от степени обсеменения и спектра микроорганизмов, присутствующих в очаге воспаления. Деструктивные процессы в слизистой оболочке имеют более глубокий характер при смешанном бактериально-вирусном инфицировании.

2. Местные иммунопатологические реакции при бактериальном, вирусном и бактериально-вирусном инфицировании имеют различный характер. При инфицировании только Н. pylori местная реакция развивается с экспрессией преимущественно мРНК ИЛ-2, ИЛ-6, ИФ-у и ФИО- а. При вирусном - преобладает сдвиг преимущественно в сторону Txl-типа с экспрессией мРНК ИЛ-lß, ИЛ-2, ИЛ-10, ИФ-у и ФНО- а. При смешанном инфицировании иммунопатологический процесс имеет разнонаправленный характер, прогрессивно развивается по «расходящейся спирали», что и обусловливает глубокие повреждения слизистой оболочки.

3. Уровени специфических антител к Н. pylori и вирусам группы герпеса не отражают в полной мере защитную реакцию макроорганизма и степень повреждения слизистой оболочки. Обнаружение IgA к Н. pylori, падение количества лимфоцитов с фенотипом CD16+/CD56+ и ИФу в периферической крови ниже референтных значений могут явиться дополнительным показателем в определении активности инфекционного процесса и степени повреждения слизистой оболочки гастродуоденальной области.

4. Обнаружен ранее неизвестный феномен персистенции фрагментов ДНК Н. pylori в МНК периферической крови, проявление которого зависит от длительности течения заболевания и степени повреждения слизистой оболочки.

5. Разработанный и предложеннный новый способ диагностики инфекции и прогнозирования тяжести течения заболевания, обусловленного Н. pylori и вирусами герпеса, заключающийся в тестировании биоптатов и МНК периферической крови на наличие ДНК Н. pylori и вирусов герпеса, обладает 100% чувствительностью и специфичностью.

6. Алгоритм этиологической диагностики хронических воспалительных заболеваний гастродуоденальной области, заключающийся в обязательном проведении ЭГДС при первичном обследовании с взятием бипсийного материала и определением инфекционных агентов методом ПЦР является рациональным диагностическим приемом при данных заболеваниях.

Практические рекомендации

1. С целью повышения качества лабораторной диагностики хронических воспалительных заболеваний гастродуоденальной области, включающих в себя хронический эрозивный гастрит, хронический эрозивный гастродуоденит, язвенную болезнь двенадцатиперстной кишки, целесообразно включить в схему лабораторной диагностики исследование методом полимеразной цепной реакции биоптатов слизистой оболочки на вирусы группы герпеса: вируса Эпштейна-Барр, цитомегаловируса и вирусов герпеса человека 6-го,7-го, 8-го типов.

2. Целесообразно использовать способ диагностики инфекции, обусловленной Н. pylori, основанный на определении фрагментов ДНК микроорганизма в мононуклеарных клетках периферической крови. Этот способ позволяет не только установить факт инфицирования, но в большей степени дает возможность оценить факт вовлечения в инфекционный процесс всего организма.

3. В целях прогноза развития хронических воспалительных заболеваний гастродуоденальной области, обусловленных Н. pylori и вирусами герпеса, необходимо одновременное исследование МНК и биопсийного материала слизистой оболочки на наличие специфических участков генома указанных микроорганизмов. При обнаружении микроорганизмов по меньшей мере двух и более видов и в биоптатах, и в клетках периферической крови следует прогнозировать тяжелое течение заболевания.

4. Для предварительного заключения о степени повреждения слизистой оболочки целесообразно включить в диагностический комплекс определение сывороточного ИФу.

5. В применяемые схемы лечения воспалительных заболеваний гастродуоденальной области ЖКТ целесообразно включать противовирусные и/или иммуномодулирующие препараты.