Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Диагностическая и прогностическая роль активационных антигенов опухолевых клеток при диффузной B-крупноклеточной лимфоме

На прш|

шписи

Зейналова Первин Айдын кызы

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ И ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ РОЛЬ АКТИВАЦИОННЫХ АНТИГЕНОВ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ПРИ ДИФФУЗНОЙ В-КРУПНОКЛЕТОЧНОЙ ЛИМФОМЕ

14.01.12 - онкология

-8 ИЮЛ 2015

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

005570417

Москва-2015

005570417

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» (директор -академик РАН М.И.Давыдов)

Научный консультант:

Академик РАН

Михаил Иванович Давыдов

Официальные оппоненты:

Голенков Анатолий Константинович - доктор медицинских наук, профессор, руководитель отделения клинической гематологии и иммунотерапии Государственного бюджетного учреждения здравоохранения Московской области «Московский областной научно-исследовательский клинический институт имени М.Ф. Владимирского»

Пинегин Борис Владимирович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом иммунодиагностики И иммунокоррекции Федерального государственного бюджетного учреждения «Государственный научный центр Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства

Возный Эдуард Кузьмич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделением химиотерапии Государственного бюджетного учреждения здравоохранения города Москвы «Городская клиническая больница №57 Департамента здравоохранения города Москвы»

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «15 года

у/-* часов

на заседании диссертационного совета (Д.001.017.01) при ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» (115478, г. Москва, Каширское шоссе, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» (115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24) и на сайте www.ronc.ru

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В структуре лимфом у взрослых первое место занимает диффузная В-крупноклеточная лимфома (ДВКЛ). Это высокоагрессивная лимфома, частота которой составляет до 40% среди неходжкинских злокачественных лимфом. Несмотря на то, что ДВКЛ относится к лимфомам высокой степени злокачественности, она считается потенциально излечимой использованием полихимиотерапии. Внедрение в клиническую практику лечения ДВКЛ моноклональных антител (препарат ритуксимаб) к антигену CD20 существенно улучшило выживаемость (Coiffier В., 2007).

Несмотря на успехи, достигнутые в лечении ДВКЛ за счет внедрения ритуксимаба, стандартом лечения на сегодняшний день является программа CHOP (с ритуксимабом - R-CHOP). Главными факторами прогноза остаются клинические признаки (международный прогностический индекс, IPI), разработанные ещё 20 лет назад, и результаты лечения в целом нельзя назвать удовлетворительными. Важно то, что интенсификация программ терапии не привела к улучшению результатов лечения.

На рубеже 2000-х годов в диагностике ДВКЛ наметился существенный прорыв. Он связан с внедрением в диагностическую практику высокотехнологичного метода оценки профилей генной экспрессии (GEP). Внедрение этого метода позволило установить, что ДВКЛ в действительности представляет собой 2 заболевания. Вариант, при котором опухолевые клетки биологически близки В-клеткам зародышевых центров фолликулов лимфатических узлов, носит название GCB-тип. При другом варианте болезни злокачественные клетки ДВКЛ по профилям генной экспрессии соответствуют активированным В-лимфоцитам крови, то есть В-лимфоцитам пост-фолликулярных этапов дифференцировки (ABC-тип). Уже в первой работе Alizadeh А.А. et al. (2000) была показана различная чувствительность данных вариантов к проводимому лечению и различный прогноз заболевания. Это было неоднократно подтверждено в последующих работах (Dunleavy К. et al., 2009; Hemandez-Ilizaliturri F.J. et al., 2011).

Маркеры CD10, BCL6, IRF4, LM02, GCET1 и FOXP1 экспрессированы на клетках ДВКЛ вариабельно, их комбинации представляют собой основу алгоритмов иммуногистохимического воспроизведения GEP (Meyer P.N. et al., 2011; Choi W.W. et al., 2009; Hans C.P. et al., 2003). Вместе с тем, единства относительно возможности использования GEP и иммуногистохимических суррогатных маркеров GEP в научной медицинской среде не существует, и на сегодняшний день они не рекомендованы к клиническому использованию для диагностики вариантов ДВКЛ и принятия лечебных решений (Ghelmini М. et al., 2013).

Диффузная В-крупноклеточная лимфома любого подтипа (GCB, ABC) происходит из периферических активированных В-клеток. Однако маркеры активации, присутствующие на клетках светлых центров и на клетках постгерминальных этапов активации периферических В-лимфоцитов, систематизировано не изучались. Являясь геопоэтической опухолью, ДВКЛ достаточно часто поражает костный мозг. Однако детального изучения гемопоэза при ДВКЛ не проводилось.

Исследование активационного иммунофенотипа ДВКЛ, опухолевого микроокружения, а также состояния гемопоэза при диффузной В-крупноклеточной лимфоме представляют актуальную задачу. Её решение будет способствовать более глубокому пониманию механизмов активации опухолевых клеток и состояния интратуморального иммунитета, а также нарушений в системе кроветворения, таргетное воздействие на которые может помочь в разработке патогенетических подходов лечения ДВКЛ.

Цель нашей работы — комплексное изучение диагностической и прогностической роли экспрессии активационных антигенов опухолевых клеток при диффузной В-крупноклеточной лимфоме.

Задачи исследования:

1. Изучить прогностическую роль клинических и лабораторных факторов прогноза (IPI) в условиях современного лечения ДВКЛ.

2. Охарактеризовать состояние гемопоэза у больных ДВКЛ.

3. Изучить роль изменений кроветворения в прогнозе ДВКЛ.

4. Оценить значение мембранных и цитоплазматических обще-В-клеточных маркеров в диагностике ДВКЛ и разработке показаний к лечению ритуксимабом.

5. Изучить роль экспрессии молекул HLA-DR при ДВКЛ (диагностика, связь с иммунофенотипом и микроокружением, влияние на гемопоэз, клиника и прогноз).

6. Изучить роль экспрессии молекул CD38 при ДВКЛ (диагностика, связь с иммунофенотипом и микроокружением, влияние на гемопоэз, клиника и прогноз).

7. Изучить роль экспрессии общелейкоцитарного антигена CD45 при ДВКЛ (диагностика, связь с иммунофенотипом и микроокружением, влияние на гемопоэз, клиника и прогноз).

8. Изучить роль экспрессии рецепторов CR2 (CD21) и FcsRII (CD23) на клетках ДВКЛ (диагностика, связь с иммунофенотипом и микроокружением, влияние на гемопоэз, клиника и прогноз).

9. Изучить роль экспрессии антигена CD 10 при ДВКЛ (диагностика, связь с иммунофенотипом и микроокружением, влияние на гемопоэз, клиника и прогноз).

10. Изучить роль экспрессии антигена Ki-1 (CD30) при ДВКЛ (диагностика, связь с иммунофенотипом и микроокружением, влияние на гемопоэз, клиника и прогноз).

11. Оценить роль клеточного состава (Т-клетки, плазмоциты, макрофаги, фолликулярные дендритные клетки двух субпопуляций) микроокружения при ДВКЛ (диагностика, связь с иммунофенотипом и микроокружением, влияние на гемопоэз, клиника и прогноз).

Научная повизпа.

На большом клиническом материале (338 больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой) проведено изучение роли клинических факторов прогноза (IPI) и установлено, что ведущим из них в прогнозе в условиях современного лечения является стадия заболевания, другие факторы IPI либо тесно ассоциированы со стадией (ECOG, наличие более одного очага экстранодального

поражения), либо утратили свое прогностическое значение (возраст больных, уровень ЛДГ в сыворотке крови).

Впервые показано, что В-линейная природа ДВКЛ в 100% случаев подтверждается обнаружением цитоплазматической детерминанты антигена СБ20 (Ь2б), однако, экспрессия СО 19 и мембранных С 020 может быть слабой и в редких случаях отрицательной, что высоко коррелирует (р<0,001) с утратой экспрессии общелейкоцитарного антигена СБ45.

Характерными особенностями гемопоэза у больных ДВКЛ являются увеличение процента бластов в миелограмме и изменения эритробластограммы (снижение базофильных и полихроматофильных нормобластов, увеличение процента оксифильных форм с повышением индекса созревания эритрокариоцитов в 86% случаев).

Нарушения гемопоэза у больных ДВКЛ имеют прогностическое значение: повышение бластных клеток (>=1%) ухудшает общую выживаемость больных (р=0,048); задержка созревания клеток гранулоцитарного ряда с увеличением числа нейтрофильных миелоцитов или снижением процента сегментоядерных нейтрофилов также ухудшают прогноз (р=0,008 и р= 0,003). Снижение показателей общей выживаемости наблюдается при увеличении процента оксифильных нормобластов в миелограмме.

НЬА-ОЯ-негативный вариант ДВКЛ составляет 9,3% случаев (32 из 331), характеризуется благоприятным прогнозом, крайней редкостью (2,8%) двух и более экстранодальных локализаций. Опухоль не имеет иных специфических иммунофенотипических признаков, характеризуется сниженной Т-клеточной инфильтрацией, достоверно более редким снижением нейтрофильных метамиелоцитов.

Экспрессия СЭ38 наблюдается в 55,9% (184 из 329) и не влияет на прогноз ДВКЛ. Иммунобиологические особенности С038-позитивных ДВКЛ состоят в более выраженной интратуморальной инфильтрации клетками опухолевого микроокружения (макрофагами, плазмоцитами, зрелыми Т-лимфоцитами), чаще присутствуют С023+ ФДК. Опухоль характеризуется спецификой иммунофенотипа (С021, С023), связью с гемопоэзом (сегментоядерные нейтрофилы, плазмоциты), более низкими уровнями ЛДГ.

К редким вариантам относится С045-негативная ДВКЛ - 3,9% (13 из 332). Опухоль наблюдается при III, IV стадиях и характеризуется чертами иммунологической анаплазии: снижением СВ19, СБ20 (р<0,001), экспрессией в 55,6% случаев антигена Кл-1 СБЗО.

Экспрессия рецепторов СВ21 и СТ)2Ъ высоко коррелирует между собой и наблюдается в 12,4% (33 из 266) и 12,0% (39 из 326) ДВКЛ, соответственно. Эти две группы ДВКЛ совершенно различны. С021-позитивные лимфомы в сравнении с С Э21-негативными чаще наблюдаются у женщин (р=0,046) и характеризуются частым отсутствием признаков неблагоприятного прогноза. Установлена достоверная связь экспрессии С021 с уровнями промиелоцитов и лимфоцитов в костном мозге. В С021+ группе ДВКЛ не наблюдали СВЗО-позитивных случаев (р=0,098). СИ23+ ДВКЛ характеризуются неблагоприятным прогнозом (р=0,029) и наблюдается у лиц более молодого возраста (р=0,002), вдвое чаще повышены уровни сегментоядерных нейтрофилов в костном мозге. Отмечена корреляция экспрессии С023 с СБ38 на опухолевых клетках, высокая частота выраженных интратуморальных Т-клеточных реакций при С023+ иммунофенотипе.

Впервые установлено, что особую группу ДВКЛ представляют СБЗО-позитивные случаи (23,9% - 21 из 88), характеризующиеся хорошим прогнозом (все больные живы, срок наблюдения до 110 мес), р=0,02. Установлены связь с эритропоэзом (отсутствие повышения оксифильных нормобластов) в миелограмме и отсутствие выраженных реакций плазмоцитов в опухолевом микроокружепии.

Убедительно доказано, что из числа клеток микроокружения (макрофагов -СВ163+, плазмоцитов - СБ38++, фолликулярных дендритных клеток двух субпопуляций -С021+, С023+ и Т-лимфоцитов - СИЗ, СЭ5, С07) наиболее клинически важными являются Т-лимфоциты. Наличие Т-клеточной интратуморальной иммунной реакции (СИ7) характеризует группу ДВКЛ с благоприятным прогнозом (р=0,021) по выживаемости и отсутствию двух и более экстранодальных локализаций. Т-клеточная инфильтрация связана с активационными маркерами опухоли, наличием фолликулярных дендритных клеток и макрофагов микроокружения.

Научпо-практпческая значимость.

В работе убедительно показано, что основными направлениями совершенствования результатов лечения ДВКЛ являются ранняя диагностика и повышение частоты достижения рмиссий при проведении программного лечения ДВКЛ. Ритуксимаб улучшает результаты лечения ДВКЛ за счет повышения частоты полных ремиссий у больных на 11,6%, достоверно повышает 8-летнюю общую выживаемость больных (р=0,047) и может быть рекомендован к включению в схемы программного лечения больных ДВКЛ.

Исследование иммунофенотипа клеток ДВКЛ на свежезамороженных (криостатных) срезах опухолевой ткани существенно расширяет возможности рутинной иммуногистохимии за счет изучения маркеров активации (HLA-DR, CD38), пан-В-клеточных антигенов (CD19, мембранные CD20), пан-Т-клеточных (CD7) в дополнение к стандартно используемым CD45, CD20 (L26), CD 163, CD30, CD3, CD5, CD10, CD23, CD21. Это позволяет диагностировать редкие варианты лимфом, оценивать особенности иммунофенотипа во взаимосвязи с клетками микроокружения опухоли.

Отсутствие мембранной экспрессии CD20 по нашим наблюдениям встречается в 1,5% случаев ДВКЛ (4 из 272 больных) и должно учитываться при назначении препарата Ритуксимаб (моноклональные антитела к мембранной детерминанте антигена CD20).

Работа на основе обширных иммунологических, гематологических и клинических исследований позволила рекомендовать внедрение в клинику дифференцированного подхода к лечению больных ДВКЛ:

• не нуждаются в интенсификации лечения больные с прогностически благоприятными иммуноподвариантами ДВКЛ (HLA-DR-негативный, СБЗО-позитивный, С045-негативный, случаи с наличием Т-клеточной инфильтрации);

• нуждаются в интенсификации лечения прогностически неблагоприятные варианты (CDlO-позитивный, СВ23-позитивный);

• отдельного патогенетического подхода к коррекции заслуживают прогностически значимые нарушения гемопоэза при ДВКЛ и роль экспрессии CD38 в индукции микроокружения.

8

Личный вклад.

Соискатель лично участвовала в диагностике и лечении больных ДВКЛ, анализировала иммунологические и гематологические показатели, создала базу данных и полностью провела статистический обсчет результатов, включая анализ показателей выживаемости, роли клинических гематологических и иммунологических факторов в прогнозе ДВКЛ.

Соответствие паспорту специальности

Диссертация соответствует паспорту специальности 14.01.12 онкология, конкретно пункту 2. Исследования по изучению этиологии и патогенеза злокачественных опухолей, на основанные на достижениях ряда естественных наук (генетики, молекулярной биологии, морфологии, иммунологии, биохимии и Др-)-

Научные положения, выносимые на защиту.

На основании проведенных углубленных исследований у 338 больных неспецифицированной диффузной В-крупноклеточной лимфомой установлена роль клинических, гематологических и иммунологических факторов в прогнозе ДВКЛ, рекомендован алгоритм обследования, включающий, наряду с традиционными методами диагностики, иммунофенотипирование опухолевых клеток и клеток микроокружения, оценку состояния гемопоэза на основании углубленного исследования костного мозга.

1. Международный прогностический индекс (1Р1) сохраняет значение в выделении групп риска при ДВКЛ. Наиболее важным признаком являются распространенность опухолевого процесса при диагностике (наличие III, IV стадий), в то время как возраст больных и уровни ЛДГ в условиях современного программного лечения не имеют достоверного влияния на прогноз. Применение ритуксимаба позволяет увеличить число полных ремиссий и достоверно улучшает показатели общей выживаемости больных.

2. Исследование костного мозга больных ДВКЛ является абсолютно необходимым, так как позволяет установить нарушения гемопоэза, имеющие важное прогностическое значение - повышение уровня бластных клеток,

нарушения дифференцировки гранулоцитов, увеличение оксифильных нормоб ластов.

3. Для диагностики и оценки прогноза ДВКЛ показано детальное исследование иммунофенотипа опухолевых клеток и клеток микроокружения на криостатных срезах. Прогностическое значение имеют отсутствие экспрессии молекул ПЬА-ЭЯ, СОЗО, С023, СОЮ и уровни Т-клеточной инфильтрации.

4. На основании полученных данных рекомендовано выделение групп больных, у которых показана интенсификация лечения, и больных с хорошим прогнозом, у которых существующие методы лечения позволяют получить удовлетворительные результаты.

Апробация работы.

Апробация диссертационной работы состоялась 9 сентября 2014 г. на совместной научной конференции с участием отделения химиотерапии гемобластозов, лаборатории клинической иммунологии опухолей, лаборатории иммунологии гемопоэза, лаборатории клинической биохимии, отдела патологической анатомии опухолей человека научно-исследовательского института клинической онкологии, отделения химиотерапии гемобластозов научно-исследовательского института детской онкологии и гематологии ФГБНУ «РОНЦ имени Н.Н.Блохина», кафедры онкологии и кафедры детской онкологии ГБОУ ВПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России. Публикации.

Автором опубликовано 15 научных работ, из них 11 статей в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация написана на 217 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, главы по клинической характеристике пациентов и использованных методов исследования, трех глав собственных результатов, обсуждения и выводов. Библиографический указатель включает 189 источников, в том числе 19 -отечественных и 170 - зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 61 таблицей,

27 рисунками: схемами и кривыми выживаемости.

10

ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено у 338 больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой (164 мужчины и 174 женщины) в возрасте от 14 до 90 лет (медиана 58).

Всем больным диагноз диффузной В-крупноклеточной лимфомы был установлен иммуноморфологическим методом в ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» с 1995 по 2009г. В исследование включены только больные неспецифицированной диффузной В-крупноклеточной лимфомой (ДВКЛ), больные со специфическими вариантами ДВКЛ (лимфомы ЦНС, первичная медиастинальная В-крупноклеточная лимфома и т.д.) были исключены из анализа.

Анализ клинических факторов и результатов лечения проведен у больных, проходивших обследование и лечение в поликлинике для взрослых или в отделении химиотерапии гемобластозов ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина». Всем больным было проведено стандартное общеклиническое обследование, включающее современные методы диагностики онкогематологических заболеваний.

Исследование гемопоэза.

Морфологическое исследование пунктатов костного мозга проведено в лаборатории иммунологии гемопоэза РОНЦ им. H.H. Блохина (зав. лабораторией проф. Н.Н.Тупицын) ведущим научным сотрудником д.м.н. профессором МЛ.Френкель.

В лаборатории определялась клеточность аспирата костного мозга на гематологическом анализаторе Micros 60, подсчитывалось число мегакариоцитов в камере Горяева, готовились мазки для морфологического исследования. Далее двумя экспертами-гемоцитологами выполнялось микроскопическое исследование костного мозга - подсчет и описание миелограммы.

В качестве норм показателей аспиратов костного мозга и периферической крови использовали данные Соколова В. В. и Грибовой И. А. (1972). Более полную информацию для оценки костномозгового кроветворения получали при расчете индексов миелограммы:

- индекс созревания нейтрофилов (ИСН) отражает соотношение молодых (юных) нейтрофильных гранулоцитов к зрелым нейтрофилам костного мозга. В норме данное соотношение составляет 0,5 - 0,9.

- индекс созревания эритрокариоцитов (ИСЭ) показывает соотношение гемоглобинизированых эритрокариоцитов (полихроматофильных и оксифильных) к количеству всех клеток эритроидного ростка. Нормальное значение этого индекса составляет 0,7 — 0,9.

- лейкоэритробластическое соотношение (Л/Э). Это индекс процентного соотношения суммы гранулоцитов общему содержанию ядерных элементов эритроидного ряда (от пронормобластов до оксифильных нормобластов). В норме соотношение составляет 2,1 - 4,5.

Приводим в качестве примера основные показатели миелограммы с указанием норм, используемых в лаборатории иммунологии гемопоэза РОНЦ имени Н.Н.Блохина.

МИЕЛОГРАММА

N ист.болезни Дата

Ф.И.О. Отделение:

Диагноз

Миелокариоциты (41,6-195) Мегакариоциты в препарате:

Бласты (0,2-0,6)

Гранулоцитарный росток

Промиелоцигы (1,0-4,1)

нейтроф эоэиноф базофилы

Миелоциты (7,0-12,2) (0-1,0)

Метамиелоциты (8,0-15,0) (0-1,2)

Палочкоядерные (12,8-23,7) (0,1-1,2)

Сегментоядерные (13,1-24,1) (0,4-2,4) 0-0,4

Сумма гранулоцитов (57,1-66,5)

Индекс созревания нейтрофилов (0,5-0,9)

Моноцитарный росток

Монобласты 0

Промоноциты 0

Моноциты (0,7-3,1)

Лимфоидный росток

Лимфоидные

клетки 0 Ппазмобласты 0

Пролимфоциты 0 Проплазмоциты 0

Лимфоциты (4,3-13,7) Плазмат. клетки (0,1-1,8)

Эритроидный росток

Пронормобласты (0,2-1,1)

Нормобласты базофильные (1,4-4,6)

Нормобласты полихроматофильные (8,9-16,9)

Нормобласты оксифильные (0,8-5,6)

Сумма клеток эритроидного ряда (14,5-26,5)

Индекс созревания эритроидных клеток (0,7-0,9)

Лейко-эритробластическое соотношение (2,1-4,5)

Иммунологическое исследование опухолевых клеток для установления варианта неходжкинской лимфомы осуществлялось в соответствии с критериями классификации ВОЗ (2008). Иммунофенотипирование клеток материала биопсии опухоли в большинстве случаев проводилось методом иммунофлуоресцентного окрашивания свежезамороженных (криостатных) срезов в лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ клинической онкологии ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» к.м.н. в.н.с. Е.Н.Шолоховой. Панель моноклональных антител включала антитела к В-линейным антигенам (CD19, CD20, CD21, CD23, CD37), Т-линейным антигенам (CD3, CD5, CD7), антигенам гистиоцитов и макрофагов (CD163), антигенам фолликуляных дендритных клеток (CD21, CD23), антигенам плазматических клеток (CD38), нелинейным антигенам (CD10, CD38, HLA-DR), общелейкоцитарному антигену CD45, антитела к bcl-2.

Для установления степени распространенности опухолевого процесса использовалась классификация, принятая в Ann Arbor (1971г.) и дополненная в Costswald (1989). Распределение пациентов по стадиям приведено в таблице 1.

Таблица 1.

Распределение больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой по стадиям (Ann Arbor, 1971)

Стадия заболевания Число пациентов

Абс %

I 13 10,7

II 35 28,7

III 15 12,3

IV 59 48,4

Факторы прогноза при диффузной В-крупноклеточной лимфоме оценивали на основе международного прогностического индекса - 1Р1. Выделяли группы

риска диффузной В-крупноклеточной лимфомы: низкий риск, низкий промежуточный риск, высокий промежуточный риск, высокий риск. Общее состояние пациентов оценивали по шкале ECOG в баллах.

В ФГБУ «РОНЦ имени Н.Н.Блохина» больные получали стандартную полихимиотерапию, применяемую при лечении диффузной В-крупноклеточной лимфомы, в абсолютном большинстве случаев - протокол CHOP. В последние годы обязательным компонентом проводимого лечения были моноклональные CD20 антитела (ритуксимаб), протокол R-CHOP.

В работе была проведена оценка эффективности примененных методов полихимиотерапии. Анализ непосредственных и отдаленных результатов терапии проведен с учетом международных стандартизованных критериев ответа на лечение при неходжкинских лимфомах (Cheson B.D. et al., 1999).

Отдаленные результаты лечения оценивали путем построения кривых общей выживаемости. Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием программы SPSS 16.0 for Windows. Статистический анализ общей выживаемости с расчетом медианы и сроков жизни больных производился по методике Kaplan-Meier (1958).

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. РОЛЬ КЛИНИЧЕСКИХ И ЛАБОРАТОРНЫХ ФАКТОРОВ В ПРОГНОЗЕ ЛВКЛ

Основной целью работы была оценка значимости результатов углубленного иммунологического исследования опухолевой ткани (иммунофенотип опухоли, роль микроокружения) и гемоцитологического анализа клеток костномозгового пунктата в клиническом течении и прогнозе ДВЬСЛ. Однако прежде, чем анализировать эти специальные данные мы оценили, насколько стандартные клинические и лабораторные признаки сохраняют свое прогностическое значение в условиях современного лечения диффузной В-крупноклеточной лимфомы.

В работе оценены факторы прогноза, учитываемые при формировании групп риска в соответствии с Международным прогностическим индексом (IPI) и расцениваемые как неблагоприятные: возраст больных 60 лет и старше, III и IV стадии болезни, повышенные уровни лактат-дегидрогеназы, оценка по шкале

ЕСОО >= 2, наличие более одного экстранодального участка поражения. Кроме того, изучена роль суммарного балла 1Р1, а также принадлежность больного к той или иной группе риска (низкий, промежуточный низкий, промежуточный высокий, высокий).

Возраст больных. Согласно индексу 1Р1 прогноз у больных 60 лет и старше значительно хуже, чем у больных моложе 60 лет. В анализируемой нами группе больных 60 лет и старше было 153. Анализ общей выживаемости проведен у 135 больных, из них к прогностически неблагоприятной (старше 60 лет) группе относилось 50 (37%). У больных моложе 60 лет средний период наблюдения составил 100,8±121,3 мес (80,7-121,3 мес); медиана 71,0±36,7 мес. В старшей возрастной группе средняя продолжительность наблюдения составила 111,0±17,2 мес (77,3-144,7 мес), медиана 57,0±21,1 мес. Сравнение показателей общей выживаемости не выявило различий в зависимости от возраста пациентов, р=0,65.

Важным фактором международного прогностического индекса, ухудшающим прогноз ДВКЛ, являются поздппе стадии заболевания. Сравнили показатели общей выживаемости больных с I и II стадиями (41 больной) с выживаемостью больных III и IV стадиями (60 больных), рис. 1. Получены высокодостоверные результаты, р = 0,005.

Рисунок 1. Сравнение общей выживаемости больных 1-Н и Ш-1У стадиями диффузной В-крупноклеточной лимфомы.

Повышенный уровень лактатдегндрогеназы в сыворотке крови больных ДВКЛ расцениваются в 1Р1 как прогностически неблагоприятный признак. Уровни ЛДГ были оценены у 97 больных, они находились в диапазоне 228,0 - 5090,0, медиана 583. Общая выживаемость оценена у 78 больных: нормальные уровни ЛДГ - 26, повышенные - 52. Различия в выживаемости между этими группами были близки к достоверным (р = 0,168).

Общая активность пациентов, оцениваемая по шкале ЕСОСг, достоверно влияла на прогноз ДВКЛ. У больных с наличием ЕС Ой >=2 показатели общей выживаемости были достоверно хуже (р=0,01) в сравнении с больными с ЕСОв <2.

У 109 (33,4%) больных ДВКЛ анализируемой нами группы имела место экстранодальная локализация опухолевого поражения. Достоверного влияния на прогноз наличие экстранодальной опухоли не оказывало, р=0,45. При оценке прогноза у 103 больных случаев с наличием 2 или более экстранодальных локализаций опухолевого поражения было 33. Они характеризовались достоверно худшими показателями общей выживаемости в сравнении с больными, у которых было не более 1 участка экстранодального поражения при диффузной В-крупноклеточной лимфоме, р=0,005, рисунок 2.

Рисунок 2. Показатели выживаемости больных ДВКЛ при наличии не менее 2 участков экстранодального поражения являются более низкими.

В нашей выборке больных наличие 2 или более очагов экстранодального поражения ассоциировалось с распространенными стадиями ДВКЛ: Ш-Г/ стадии ДВКЛ в группе пациентов с наличием 2 или более экстранодальных поражений встречались в 97,4% случаев и лишь в 1 наблюдении (2,6%) была II стадия. По этим причинам, определить, что важнее в прогнозе ДВКЛ - поздние стадии или наличие 2 или более экстранодальных поражений достаточно сложно.

В зависимости от количества неблагоприятных прогностических факторов при ДВКЛ выделяют группы риска. К группе низкого риска (0 или 1 фактор неблагоприятного прогноза) нами отнесены 33 больных, к низкому/промежуточному риску (2 фактора) - 6 больных, к промежуточному/высокому (3 фактора) - 3, к высокому (4 или 5 факторов) - 36. Сравнение кривых выживаемости показало существование близких к достоверным (р=0,081) различий в прогнозе больных в зависимости от их принадлежности к той или иной группе риска. При объединении пациентов низкого риска с больными низкого/промежуточного риска, а больных высокого риска с пациентами промежуточного/высокого риска и сравнении выживаемости в этих 2 группах (по 39 больных) получены достоверные различия в общей выживаемости (р=0,01), рисунок 3.

Месяцы

Рисунок 3. Общая выживаемость выживаемость больных ДВКЛ в группах условно «низкого риска» (включены больные групп низкого и промежуточного низкого рисков по 1Р1) и условно «высокого риска» (включены больные групп высокого и промежуточного высокого рисков по 1Р1).

Таким образом, из числа оцененных нами клинико-лабораторных признаков, включенных в систему оценки групп риска по 1Р1, только три - стадия болезни, показатель активности больного по ЕСОО, наличие не менее двух экстранодальных зон опухолевого поражения - были достоверно связаны с прогнозом. Следует отметить, что ЕСОв напрямую взаимосвязан со стадией ДВКЛ и был >=2 только при распространенных стадиях ДВКЛ. Аналогичные связи имели место в анализируемой группе больных и для 2 или более экстранодальных локализаций опухоли.

Хорошо известно, что при абсолютном большинстве неходжкинских лимфом и острых лейкозов чувствительность к проводимой терапии, полнота полученного эффекта также являются важным прогностическим фактором.

Эффективность терапии оценена нами у 105 больных ДВКЛ. В 83% случаев достигнут выраженный клинический эффект - полная или частичная ремиссия. Общей выживаемость оценена в 86 случаях: полная ремиссия (СЯ) - 17 пациентов, частичная (РЯ) - 51, стабилизация процесса - 9, прогрессирование заболевания - 9.

Рисунок 4. Влияние непосредственного эффекта лечения на общую выживаемость больных ДВКЛ.

Как видно на рисунке 4, различия в выживаемости в зависимости от эффекта лечения были высокодостоверными, р = 0,001 (лог-ранк). Таким образом, достижение полной или, по крайней мере, частичной ремиссии должно являться главной целью при проведении терапии ДВКЛ.

Разумеется, непосредственный эффект терапии определяется схемой проведенного лечения. Как мы уже отмечали, лечение больных ДВКЛ проводится достаточно однотипно, и в нашем исследовании абсолютное большинство пациентов получали лечение по схеме CHOP. В последние годы обязательным компонентом лечения стали моноклональные антитела к антигену CD20 (Ритуксимаб). Мы оценили, насколько добавление ритуксимаба к схемам CHOP (R-СНОР) улучшает результаты лечения больных ДВКЛ. Ритуксимаб был использован у 36 из 121 больного ДВКЛ, получавшего лечение в РОНЦ имени Н.Н.Блохина. Анализ общей выживаемости проведен у 100 больных, из которых 29 получали ритуксимаб. Статистически значимого влияния на прогноз в целом по группе больных ДВКЛ препарат не оказывал: р = 0,625 (лог-ранк).

При анализе эффекта лечения в группах с добавлением ритуксимаба и без такового статистически значимой связи не получено (р=0,64). Однако частота

полных ремиссий в группе больных, получавших ритуксимаб, составила 31,3%, что значительно выше, чем частота полных ремиссий в группе сравнения (без ритуксимаба) - 19,7%. Соответственно этому, при применении ритуксимаба снизился процент случаев прогрессирования, стабилизации и частичных ремиссий. Всё это говорит о важном значении добавления ритуксимаба к программному лечению ДВКЛ. При проведении анализа общей выживаемости больных ДВКЛ в сроки наблюдения до 8 лет в зависимости от включения ритуксимаба в схемы лечения получены достоверные результаты, рисунок 5.

Рисунок 5. 8-летняя выживаемость больных в зависимости от включения ритуксимаба в схемы программного лечения: сплошная кривая (0) - без ритуксимаба; пунктирная кривая (1) - с применением ритуксимаба.

Как видно, получены высокодостоверные результаты - 8-летняя выживаемость больных ДВКЛ, получавших ритуксимаб, значительно выше, чем у больных, не получавших данный препарат, р=0,047 (тест лог-ранк). Следовательно, добавление ритуксимаба в схемы программного лечения ДВКЛ позволяет существенно увеличить частоту полных ремиссий (с 19% до 33%) и достоверно улучшить 8-летнюю выживаемость больных ДВКЛ.

-S

Таким образом, в условиях современной терапии ДВКЛ градация на группы риска в соответствии с международным прогностическим индексом (IPI) сохраняет свое значение и взаимосвязана с прогнозом ДВКЛ. Вместе с тем, такие признаки неблагоприятного прогноза как пожилой возраст больных (60 лет и старше) утратили свое значение. Повышенный уровень ЛДГ также не имел достоверной связи с выживаемостью больных ДВКЛ. Наличие двух и более зон экстранодального опухолевого поражения явилось важным фактором неблагоприятного прогноза, однако, как правило, наблюдалось при поздних стадиях ДВКЛ. По существу, главным фактором неблагоприятного прогноза явились поздние стадии опухоли (и взаимосвязанный с ними ECOG). Очень важным является достижение полной ремиссии при проведении специфического лечения у больных ДВКЛ, именно эта группа пациентов характеризуется наилучшими результатами лечения и большей продолжительностью жизни.

На основании полученных нами данных можно заключить, что главным направлением улучшения прогноза ДВКЛ в современных условиях является совершенствование ранней диагностики болезни. Диагностика ДВКЛ на ранних стадиях позволит существенно улучшить прогноз при этой крайне неблагоприятной, агрессивной форме неходжкинских злокачественных лимфом. Другим важным направлением улучшения результатов лечения ДВКЛ является совершенствование терапии заболевания, достижение максимального числа полных клинико-гематологических ремиссий. Добавление ритуксимаба к схемам лечения ДВКЛ позволяет повысить частоту полных ремиссий на 11,6% и достоверно (р=0,047) улучшает общую 8-летнюю выживаемость больных.

2. КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГЕМОПОЭЗА У БОЛЬНЫХ ДИФФУЗНОЙ В-КРУПНОКЛЕТОЧНОЙ ЛИМФОМОЙ

Исследование костного мозга широко используется для оценки степени распространенности опухолевого процесса у больных ДВКЛ.

При анализе клинического значения состояния костномозгового кроветворения при ДВКЛ нами были отобраны 118 миелограмм без явного поражения костного мозга. В исследование включены только миелограммы больных, у которых проводилось иммунофенотипирование опухоли по свежим

(криостатным) срезам. Это сделано с целью анализа взаимосвязи первичного фенотипа опухоли с особенностями кроветворения у больных ДВКЛ. Процентное содержание основных клеточных элементов в анализируемых миелограммах представлено в таблице 2.

Таблица 2. Уровни основных клеточных элементов костного мозга больных

ДВКЛ

Показатель N Минимум Максимум Среднее Сгд. ошибка

Кпеточность (х109/л) 18 15,00 462,00 86,0212 7,25721

Властные клетки 18 ,00 5,70 1,4780 ,09141

Промиелоциты 18 ,00 2,80 ,4534 ,04309

Нейтрофилы::

Миелоциты 18 1,60 20,50 9,4102 ,34039

Метамиелоциты 18 2,40 14,80 7,8686 ,23066

Палочкоядерные 18 4,50 32,40 21,0890 ,49891

Сегментоядерные 18 2,10 54,20 20,8797 ,79601

Индекс созр. гранулоц. 18 ,10 1,30 ,4614 ,02088

Моноциты 18 ,00 8,00 2,4576 ,13362

Лимфоциты 18 1,60 24,00 11,6729 ,48364

Плазматические клетки 18 ,00 3,20 ,9025 ,06934

Нормобласгы:

Базофильные 18 ,00 7,60 1,2873 ,11191

Полихроматофильные 18 ,80 30,20 9,1703 ,54573

Оксифильные 18 1,60 33,80 10,8153 ,57010

Сумма эритрокариоцитов 18 3,60 64,40 21,3517 1,12212

Индекс созр. эритр. кл. 18 ,80 1,00 ,94 ,003

Лейко-эритроидн. соотн. 18 0,4 18,9 4.2525 0,28509

Ориентируясь на показатели нормы, мы выделили различные типы изменений по каждому показателю - снижение, нормальное содержание или повышение процентного содержания клеток. Данные представлены в таблице 3.

Таблица 3. Частота изменений показателей миелограммы у больных ДВКЛ

Показатель миелограммы Характер изменений признака (п=118)

Снижение Норма Повышение

Клеточность 36 (30,5)* 73 (61,9) 9 (7,6)

Мегакариоциты 21 (17,8) 90 (76,3) 7 (5,9)

Бласты 0(0) 36 (30,5) /<1%/ 82 (69,5) />=1%/

Промиелоциты 100 (84,7) 18(15,3) 0

Нейтрофилы: Миелоциты Метамиелоциты Палочкоядерные Сегменто ядерные 32 (27,2) 62 (52,5) 24 (20,3)

61 (51,7) 57 (48,3) 0

5 (4,2) 75 (63,6) 38 (32,2)

19(16,1) 61 (51,7) 38 (32,2)

Сумма гранулоцитов 33 (28,0) 47 (39,8) 38 (32,2)

Индекс созревания нейтрофилов 66 (56,0) 47 (39,8) 5 (4,2)

Моноциты 9 (7,6) 76 (64,4) 33 (28,0)

Лимфоциты 10 (8,5) 65 (55,1) 43 (36,4)

Плазматическ. клетки 12 (10,2) 92 (78,0) 14(11,8)

Нормобласты базофильные 81 (68,6) 35 (29,7) 2(1,7)

Нормобласты полихроматофильные 67 (56,8) 39(33,1) 12(10,2)

Нормобласты оксифильные 0 27 (22,9) 91 (77,1)

Сумма клеток эритроидного ряда 38 (32,2) 50 (42,4) 30 (25,4)

Индекс созревания эритроидных клеток 0 16(13,6) 102 (86,4)

Лейко-эритробласти-ческое отношение 27 (22,9) 49(41,5) 42 (35,6)

*Абсолютное число (процент)

Наряду с отклонениями в сторону снижения или повышения тех или иных показателей миелограммы, наблюдающимися у определенного процента больных, мы обнаружили типичные нарушения гемопоэза, характерные для значительной части больных ДВКЛ и взаимосвязанные с прогнозом заболевания: повышение процента бластных клеток в миелограмме, изменения в гранулоцитарном ряду дифференцировки, ускоренное созревание эритрокариоцитов.

Остановимся подробно на этих показателях миелограммы.

Интересные данные получены при анализе процентного содержания бластных клеток в миелограмме. Диапазон содержания бластных клеток в нормальной миелограмме колеблется от 0,2 до 0,6%. В нашей выборке среднее содержание бластов составило 1,5±0,09%, диапазон от 0 до 5,7%. Даже если относить к повышенным уровням таковые с наличием более 1% бластов, то повышение процента бластов отмечается у 69,5% больных.

Увеличение процента бластов в миелограмме выше нормы (>0,6%) не играло роли в прогнозе ДВКЛ (не получено достоверной связи с общей выживаемостью). Однако использование в качестве порогового уровня >=1% бластов оказалось информативным. В этом случае нормальное содержание бластов отмечено у 36 больных (30,5%), повышенное - у 82 (69,5%).

Выживаемость была прослежена у 57 больных ДВКЛ (максимальный срок наблюдения - 10 лет). У 17 больных содержание бластных клеток было близко к норме (<1%), у 40 больных содержание бластных клеток было повышено (>= 1%). Нормальные уровни бластных клеток были достоверно взаимосвязаны с лучшим прогнозом у больных ДВКЛ, р=0,048%, рисунок 6.

Рисунок 6. Кривые общей выживаемости в группах больных ДВКЛ с нормальным и повышенным (>=1%) содержанием бласгных клеток в миелограмме.

Не отмечено ассоциации повышения уровня бластов в миелограмме с поздними (НМУ) стадиями ДВКЛ. Имела место определенная связь процента бластов с иммунофенотипом опухоли. В С021-позитивной группе ДВКЛ уровни бластных клеток были достоверно выше, чем в СБ21 -негативной группе (1,99±0,35% и 1,4±0,09%, р=0,032).

Грапулоцитарный росток. При анализе гранулоцитарного ростка гемопоэза у больных ДВКЛ получены новые данные. Два главных фактора влияли на прогноз - уровень нейтрофильных миелоцитов и содержание сегментоядерных форм.

Нейтро<Ьилъные миелоииты при ДВКЛ находились в диапазоне 1,6-20,5%, среднее 9,4±0,34%. Нормальные уровни этих клеток отмечены у 62 больных (52,5%), сниженные - у 32 больных (27,2%), повышенные - у 24 (20,3%). Показатели выживаемости изучены у 59 больных (снижение нейтрофильных миелоцитов - 16, норма - 27, повышение - 16).

Повышение уровней нейтрофильных миелоцитов достоверно ассоциировалось с ухудшением общей выживаемости больных. При сравнении выживаемости больных в 2 группах (с нормальным /п=25/ и повышенным /п=15/

числом нейтрофильиых миелоцитов в миелограмме) получены высокодостоверные различия, р=0,008, рисунок 7.

Мссяцы

Рисунок 7. Кривые общей выживаемости больных ДВКЛ в зависимости от числа нейтрофильных миелоцитов.

Сегментоядерные нейтрофипы. Содержание этих клеток в костном мозге оценено у 118 больных ДВКЛ. Средние уровни сегментоядерных нейтрофилов в миелограмме составили 20,9±0,8%, диапазон 2,1-54,2%. В 19 (16,1%) случаях отмечалось снижение процента сегментоядерных нейтрофилов менее 13,1%, у 61 больного (51,7%) - нормальные уровни, у 38 (32,2%) пациентов отмечались повышенные (более 24,1%) уровни. Выживаемость оценена у 59 больных ДВКЛ (снижение - 9, норма - 28, повышение - 22). Случаи с нормальными и повышенными уровнями не различались по прогнозу, а пациенты со снижением сегментоядерных нейтрофилов характеризовались плохим прогнозом. Сравнение выживаемости в группах больных ДВКЛ со сниженным /п=9/ и повышенным /л=2б/ содержанием сегментоядерных нейтрофилов костного мозга выявило высоко достоверные различия, р= 0,003, рис. 8.

С«гмвктояд«ри

-сжчсеиы

смскты-ЦрМур**»«*.*

Месяцы

Рисунок 8. Показатели выживаемости больных ДВКЛ с повышенным содержанием сегментоядерных нейтрофилов костного мозга достоверно выше, чем в случаях снижения этих клеток.

Мы не обнаружили взаимосвязи повышения уровня нейтрофильных миелоцитов с иммунофенотипическими признаками первичной опухоли. Снижение уровня сегментоядерных нейтрофилов наблюдалось вдвое чаще у больных с СЭ38+ иммунофенотипом ДВКЛ (20,3% и 10,2%, р=0,016). Установлена взаимосвязь уровней сегментоядерных нейтрофилов в костном мозге с экспрессией антигена СЭ45 на клетках первичной опухоли. Процент сегментоядерных нейтрофилов в С045-негативной группе был достоверно выше, чем в случаях экспрессии антигена на опухолевых клетках: 27,7±6,3% (п=6) и 20,5±0,8% (п=112), соответственно, р=0,04б. При оценке взаимосвязи показателей миелограммы с клетками опухолевого микроокружения значимая связь снижения уровня сегментоядерных нейтрофилов отмечена с наличием в опухолевых срезах С023+ ФДК. При наличии СЭ23+ ФДК снижение сегментоядерных гранулоцитов наблюдалось вдвое реже, чем в случаях отсутствия этих клеток (9,1% и 17,0%, р=0,008).

В эуитроидном ростке костного мозга больных ДВКЛнаиболее типичным и связанным с прогнозом было повышение уровня оксифильных нормобластов У большинства больных ДВКЛ отмечено повышение процента оксифильных нормобластов - 91 (77,1%), и лишь в 27 случаях (22,9%) - отмечены нормальные уровни этих клеток. Индекс созревания эригрокариоцитов был повышен в 86,4% случаев. Нормальные уровни оксифильных нормобластов характеризовали группу более благоприятного прогноза (п=12) в сравнении с группой больных с повышением оксифильных форм (п=43), р=0,041, рисунок 9.

Рисунок 9. Кривые общей выживаемости больных ДВКЛ в зависимости от числа оксифильных нормобластов в миелограмме.

Из числа изученных иммунофенотипических маркеров ДВКЛ только экспрессия антигена СБЗО была взаимосвязана с содержанием оксифильных нормобластов в миелограмме. У больных с наличием антигена СБЗО на клетках ДВКЛ уровни оксифильных нормобластов были близки к норме (в среднем 6,96±1,1%, п=10) в то время как при отсутствии антигена уровни оксифильных нормобластов были повышены (11,84±1,37%, п=26), р=0,044. Следовательно, экспрессия на клетках ДВКЛ антигена СОЗО характеризуют группу больных, для

которых прогностически неблагоприятные изменения гемопоэза (увеличение процента оксифильных нормобластов) не являются характерными.

Таким образом, три главных признака, характеризующих взаимосвязь гемопоэза с прогнозом ДВКЛ, впервые установлены в нашей работе: уровень бластных клеток в миелограмме, изменения в ' гранулоцитарном ростке дифференцировки и изменения в эритроидном ростке дифференцировки.

3. ИММУНОФЕНОТИП ДИФФУЗНОЙ В-КРУПНОКЛЕТОЧНОЙ ЛИМФОМЫ

3.1. УСТАНОВЛЕНИЕ В-ЛИНЕЙНОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ДВКЛ С ЦЕЛЬЮ НАЗНАЧЕНИЯ ИММУНОТЕРАПИИ РИТУКСИМАБОМ

Установление В-клеточной природы опухоли необходимо для выбора правильной тактики лечения, которое при ДВКЛ включает применение Мабтеры или Ритуксимаба - моноклональных антител к антигену С020. Поскольку диагностика проводится по парафиновым блокам, то чаще всего используются наиболее надежные антитела Ь26 (СП20).

Ритуксимаб взаимодействует с внеклеточным доменом антигена В-клеток СЭ20, а антитела к Ь26, используемые для диагностики ДВКЛ, распознают цитоплазматическую углеводную детерминанту антигена. Примеры практически полного отсутствия антигена на мембране, но четкой реакции с антителами Ь2б на срезах хорошо известны. При ДВКЛ слабая или отрицательная экспрессия СЭ20 на мембране злокачественных клеток хорошо известна. Для диагностики ДВКЛ мы пользовались иммуногистохимическим методом на криостатных срезах, что позволяло определять мембранную экспрессию С020 с использованием антител ЬТ20.

Результаты оценки диагностической ценности антител к СЭ19 и С020 у больных ДВКЛ представлены в таблице 4.

Таблица 4. Диагностическая значимость обще-В-клеточных антител при ДВКЛ

Маркер Тип реакции антител Всего

отрицательный слабый выраженный

СЭ19 10 (3%)* 81 (24,6%) 238 (70%) 329(100%)

СЭ20 4(1,5%) 24 (8,8%) 244 (71,8%) 272 (100%)

С020 (1,26) 0 2 (2,9%) 67(97,1%) 69 (100%)

При параллельном одновременном использовании антител к мембранной детерминанте CD20 и антител CD19 у 270 больных ДВКЛ выявлено высокое совпадение результатов (р=0,000): в 193 из 270 наблюдений (71,5%) выявлена выраженная экспрессия обоих антигенов, в 22 (8,1%) - экспрессия обоих антигенов была слабой и лишь в 3 случаях (1,1%) экспрессия антигенов отсутствовала. Во всех случаях слабой или отрицательной реакции на CD19 или мембранные CD20 использование антител L26 позволяло верифицировать В-клеточную природу опухоли.

Таким образом, в целом частота отрицательных и слабоположительных по CD20 случаев ДВКЛ невелика, составляет 10,3%. Однако именно эти случаи нуждаются в дополнительной верификации с целью назначения Мабтеры.

Экспрессия мембранных антигенов CD19 и CD20 высоко коррелировала с экспрессией общелейкоцитарного антигена CD45. В пределах С045-негативных опухолей частота случаев отрицательных или слабоположительных по CD19 была достоверно выше (77%, 10 из 13), чем в группе С045-положительных ДВКЛ -только 25% (80 из 312). Связь между этими признаками высоко достоверна (Хи-квадрат=16,4; р=0,000). Частота случаев отрицательной или слабо положительной реакции на CD20 в пределах С045-негативных ДВКЛ была в 6 раз выше, чем при СЕ)45-позитивных опухолях (50% и 8,2%, соответственно). Признаки достоверно взаимосвязаны (Хи-квадрат=22,2; р=0,000).

3.2. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ИММУНОФЕНОТИПИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ДВКЛ

В данном разделе мы представляем детальное описание иммунофенотипических особенностей ДВКЛ. Внимание уделено маркерам опухолевых клеток, обычно не используемым для диагностики ДВКЛ и взаимосвязанным с активацией или иными биологическими особенностями клеток опухоли.

Детально охарактеризована клиническая картина особых вариантов ДВКЛ на основе совокупности признаков, включенных в перечень Международного прогностического индекса (возраст больных, пол, стадия ДВКЛ, уровни ЛДГ, наличие двух или более экстранодальных локализаций опухоли, принадлежность к группам риска по IPI), описаны взаимосвязи особых иммунофенотипических

вариантов с кроветворением, иммунофенотипом и микроокружением у больных ДВКЛ.

Молекулы гистосовместпмостп И класса - НЬА-ВИ Наиболее дискутабельными с позиций необходимости использования при диагностике ДВКЛ являются молекулы гистосовместимости II класса - ШЛ-РЯ. Наши данные подтвердили высокую частоту экспрессии НЬА-ОЯ при ДВКЛ. Исследование проведено на опухолевых срезах 331 больного ДВКЛ. Частота экспрессии составила 90,7% (299 из 331).

Общая выживаемость была оценена у 136 больных ДВКЛ (11 - НЬА-ПЯ-негативных и 125 - НЬЛ-ОЯ-позитивных). По всем критериям оценки достоверности различий в выживаемости отмечена значимость молекул НЛА-БИ опухолевых клеток в прогнозе ДВКЛ: тест Лог-Ранк (Мантела-Кокса) р=0,041; тест Бреслоу (генерализованный Вилкоксона) р=0,044; Тарон-Уоре р=0,038. Медиана выживаемости в НЬА-011-негативной группе не достигается, в то время как в группе сравнения (НЬА-ВЯ-позитивной) она составила 55 мес, рисунок 10.

Н1А0Я

■Н-А-ОР-

, И А

Месяцы

Рисунок 10. Выживаемость больных ДВКЛ в группах с наличием (сплошная линия) или отвутствием (пунктирная линия) экспрессии молекул НЬА-ОЛ на опухолевых клетках.

При НЬЛ-ОЯ-негативных ДВЬСЛ практически не встречается двух или более экстранодальных локализаций опухоли (2,8%, 1/36). Отличия показателей гемопоэза от основной группы ДВКЛ состоят в том, что не наблюдается снижения уровня нейтрофильных метамиелоцитов. Иммунологические особенности этих опухолей состоят в том, что при них практически не наблюдается выраженной инфильтрации зрелыми Т-лимфоцитами (р=0,029).

Экспрессия АДФ-рибозил-циклазы (СБ38) на опухолевых клетках ДВКЛ.

Весьма интересными при диагностике ДВКЛ являются молекулы СР38. Данный маркер практически не используется при иммуногистохимической диагностике лимфом по парафиновым блокам. Молекулы СБ38 присутствуют на активированных В-клетках, В-клетках светлых центров фолликулов лимфатических узлов, плазмоцитах, В-лимфоидных предшественниках, активированных Т-клетках, макрофагах, что указывает на отсутствие их линейной или стадийной специфичности.

Исследование проведено на опухолевых срезах 329 больных ДВКЛ. Частота экспрессии составила 55,9% (184 из 329) - в 70 случаях (21,2%) отмечена экспрессия на части клеток, в 114 случаях (34,7%) на всех клетках.

Общая выживаемость была оценена у 136 больных ДВКЛ, достоверной связи с прогнозом не отмечено, р=0,34.

Из числа клинико-лабораторных признаков в группе С038+ ДВКЛ вдвое реже, чем при С038(-) ДВКЛ наблюдались повышенные уровни сывороточной ЛДГ (78% и 55%, р=0,019). Отмечена связь С038-позитивного субтипа ДВКЛ с особенностями гемопоэза - реже, чем в группе сравнения (С038-негативной) отмечены нормальные диапазоны сегментоядерных нейтрофилов и плазмоцитов. Антигены СВ23 и СБ21 вдвое чаще присутствуют на клетках СИЗ 8+ опухолей, что является несомненной иммунофенотипической особенностью СЭ38-позитивных ДВКЛ. Иммунобиологические особенности этих опухолей состоят в том, что они сопровождаются выраженной интратуморальной инфильтрацией практически всеми клетками, входящими в состав опухолевого микроокружения -макрофагами, плазмоцитами, зрелыми Т-лимфоцитами. Кроме того, при С038+ ДВКЛ в 4 раза чаще, чем в группе сравнения (СЭ38-) наблюдается присутствие в

опухолевых срезах выраженного количества фолликулярных дендритных клеток CD23+. ДВКЛ с подобными характеристиками ранее не были описаны. Это особенно важно, поскольку С038-позитивные опухоли представляют не минорную группу, а практически половину всех диффузных В-крупноклеточных лимфом.

Общелейкоцитарный airrnreu CD45

Крайне редко встречаются СЕ>45-негативные опухоли. Обычно ДВКЛ характеризуются отчетливой экспрессией этого антигена. Он может отсутствовать на анапластических крупноклеточных лимфомах и лимфомах из клеток-предшественниц. При исследовании 332 случаев ДВКЛ отсутствие общелейкоцитарного антигена отмечено лишь в 13 (3,9%).

СЕ>45-негативные опухоли были представлены только III и IV стадиями, что достоверно отличает их от группы сравнения. Прогноз в этой группе больных был несколько более благоприятным, однако, различия не являются статистически значимыми. Малочисленность данной группы лимфом не позволила достоверно оценить связи с гемопоэзом, обнаруженные достоверные различия в среднем содержании нейтрофильных гранулоцитов, нуждаются в подтверждении на большем клиническом материале. Экспрессия CD30 наблюдается достоверно чаще (55,6%) в С045-негативных случаях. Иммунофенотип этих опухолей не имеет связи с клетками микроокружения.

Экспрессия CR2-peaenTopa комплемента (CD21) на клетках ДВКЛ

Антиген CD21 в нормальных лимфатических узлах экспрессирован на клетках фолликулов и фолликулярных дендритных клетках. Исследование проведено на опухолевых срезах 266 больных ДВКЛ. Частота экспрессии составила 12,4% (33 из 266) - в 18 случаях (6,8%) отмечена экспрессия на части опухолевых клеток, в 15 случаях (5,6%) на всех клетках опухоли.

Общая выживаемость была оценена у 114 больных ДВКЛ, достоверной связи с прогнозом не отмечено, р=0,8.

С клинических позиций интересно то, что в CD21-позитивной группе достоверно (р=0,046) преобладали женщины (67%), и отмечалось меньшее число признаков неблагоприятного прогноза по IPI: не было случаев с наличием 5

признаков, преобладали больные с отсутствием этих признаков. Позитивные по СЭ21 ДВКЛ характеризуются достоверно более частым снижением лимфоцитов и повышением среднего процента бластных клеток костного мозга в сравнении с С021-негативными ДВКЛ. Патогенетический механизм этого явления пока не совсем ясен. Иммунобиологические особенности этих опухолей состоят в том, что экспрессия С112 на опухолевых клетках высоко достоверно коррелирует с экспрессией другого рецептора опухолевых клеток - низкоаффинного рецептора для (С023). Клетки микроокружения не взаимосвязаны с экспрессией на опухоли рецептора СБ21.

Экспрессия низкоаффинного Рс рецептора II для ^Е (РсеШ1)

Низкоаффинный Рс рецептор II для ^Е (РсеЫ1) в нормальных лимфатических узлах экспрессирован на клетках светлых центров фолликулов, активированных В-клетках и фолликулярных дендритных клетках. Согласно номенклатуре лейкоцитарных антигенов он носит название СБ23.

Исследование экспрессии СВ23 проведено на опухолевых срезах 326 больных ДВКЛ, частота выявления антигена составила 12,0% (39 из 326). С023-позитивные случаи ДВКЛ формируют особую группу с точки зрения прогноза и ответа на терапию: при 10-летнем периоде наблюдения (15 больных СИ23+ и 92 С023-) различия в выживаемости высокодостоверны, р=0,029 (лог-ранк тест), рисунок 11.

Рисунок 11. Достоверное ухудшение прогноза в С023-позитивной группе ДВКЛ при 10-летнем периоде наблюдения за больными.

Следует отметить, что речь идет о взрослых больных, средний возраст которых при диагностике превышал 54 года, поэтому период наблюдения в 10 лет можно считать вполне достаточным. На основе этих данных можно сделать обоснованное заключение о том, что С023-позитивные ДВКЛ характеризуются худшим прогнозом в сравнении с С023-негативной группой.

С клинических позиций интересно то, что С023-позитивная группа больных характеризовалась значительно худшим прогнозом, снижением показателей выживаемости в сравнении с СВ23-негативной группой пациентов, причем достоверно преобладали лица молодого возраста. Средний возраст больных С023-негативной группы ДВКЛ составил 54,7±1,1 года (п=281), что было достоверно выше, чем в С023-позитивной группе (45,1±2,9 года, п=38), р=0,002. В С023-негативной группе частота больных пожилого возраста была вдвое выше 49,8% (140 из 281), чем в С023-позитивной группе - 26,3% (10 из 38), р=0,006.Из числа показателей гемопоэза С023-позитивный фенотип ассоциирован только с достоверным увеличением процентного содержания сегментоядерных нейтрофилов в миелограмме. Объяснения данному факту пока нет, и, по-видимому, углубленное изучение кроветворения при периферических лимфомах может пролить свет на понимание патогенеза данного явления. Иммунобиологические

35

особенности этих опухолей состоят в том, что экспрессия РсеШ1 на опухолевых клетках высоко достоверно коррелирует с экспрессией другого рецептора опухолевых клеток - рецептора комплемента С112. Т-клетки микроокружения взаимосвязаны с экспрессией С023 и нарастают в антигенпозитивной группе.

В нормальных лимфатических узлах антиген СБЮ представлен на клетках светлых центров фолликулов. Наши данные указывают на низкую частоту экспрессии СОЮ при ДВКЛ. Исследование проведено на опухолевых срезах 238 больных ДВКЛ. Частота экспрессии составила 6,3% (15 из 238). Интерес к этому антигену обусловлен тем, что он используется как один из иммуногистохимических маркеров ОСВ-типа ДВКЛ.

Общая выживаемость была оценена у 96 больных ДВКЛ (92 - СО 10-негативных, 4 - СОЮ-позитивных). Несмотря на крайнюю малочисленность СО 10-позитивной группы больных ДВКЛ, все эти пациенты характеризовались крайне неблагоприятным прогнозом и погибли в сроки до 2 лет, что позволило расценить экспрессию СОЮ как неблагоприятный признак, имеющий достоверную связь с прогнозом, р=0,035 (лог-ранк тест), рисунок 12. Среднее время дожития в СОЮ-негативной группе составило 114,5±14,2 мес, (86,7-142,3 мес); медиана - 57 мес. В антиген позитивной группе - 16,8±4,0 мес (8,9-24,6 мес); медиана 14 мес.

Нейтральная эндопептидаза (CD10)

С010_ДВКЛ

.'-поютитвльм

о:

—I-1-1-1-1-1-1-

О 50 100 1 50 200 Й0 ЭСЮ

Месяцы

Рисунок 12. Неблагоприятный прогноз при CD10+ДВКЛ.

СОЮ+ ДВКЛ практически не имели связи с гемопоэзом, а также с иммунофенотипическими маркерами опухоли. Этот тип лимфом характеризуется несколько более выраженной макрофагальной инфильтрацией. Для окончательного заключения о значении диагностики данного редкого варианта ДВКЛ необходимо дальнейшее накопление клинических данных.

К-1 антиген (СШО)

Наши данные указывают на весьма значительную частоту экспрессии СОЗО при ДВКЛ. Исследование проведено на опухолевых срезах 88 больных ДВКЛ. Частота экспрессии составила 23,9% (21 из 88).

Общая выживаемость была оценена у 31 больного ДВКЛ (23 - СОЗО-негативных, 8 - СОЗО- позитивных). Ни один из 8 больных С08-позитивной группы не умер за период наблюдения до 110 мес, что объясняет высокую достоверность связи экспрессии антигена с выживаемостью (рисунок 13), р=0,02.

Рисунок 13. Высокие показатели выживаемости в группе СОЗО-позитивных больных.

С клинических позиций интересно то, что в СОЗО-позитивная группа

характеризовалась наиболее благоприятным прогнозом (ни один больной не умер в

сроки наблюдения до 110 мес). Позитивные по СОЗО ДВКЛ характеризуются

37

достоверно более частым увеличением суммарного процента клеток гранулоцитарного ростка, нормальным содержанием оксифильных нормобластов, а также более низким средним уровнем суммарного содержания эритрокариоцитов (в пределах нормы), что отражается на более высоком лейко-эритроидном соотношении в данной группе. Для опухолей этой группы не характерна выраженная плазмоклеточная реакция микроокружения.

3.3. РОЛЬ КЛЕТОК ОПУХОЛЕВОГО МИКРООКРУЖЕНИЯ В КЛИНИЧЕСКОМ ТЕЧЕНИИ И ПРОГНОЗЕ ДВКЛ Изучены макрофаги (CD163), плазматические клетки (CD38++), 2 популяции фолликулярных дендритических клеток (CD21, CD23), а также зрелые Т-лимфоциты (CD3, CD5, CD7) в срезах биопсийного материала опухолевой ткани больных лим фомой.

Уровни макрофагов (Dll, CD163) в ткани ДВКЛ Макрофаги изучены у 326 больных. В 63 случаях (19,3%) выявлялись единичные клетки или их практически полное отсутствие, в остальных 263 наблюдениях (80,7%) наблюдалась умеренная (205 случаев, 62,9%) или выраженная (58 случаев, 17,8%) макрофагальная реакция. Роль макрофагов в прогнозе ДВКЛ оценена у 134 больных - 28 с отсутствием реакции макрофагов, 85 с умеренным типом реакции и 21 с выраженной макрофагальной инфильтрацией. Уровень инфильтрации ткани ДВКЛ макрофагами не влиял на продолжительность жизни больных ДВКЛ, р=0,97.

Из числа клинико-лабораторных данных отмечены более низкие уровни ЛДГ и более старший возраст больных с наличием выраженной макрофагальной инфильтрации. Макрофагальная инфильтрация не была связана с гемопоэзом у больных ДВКЛ. Выраженность макрофагальной инфильтрации зависела от иммунофенотипических особенностей ДВКЛ и нарастала при экспрессии CD38 на опухолевых клетках. Уровень макрофагальной инфильтрации достоверно положительно коррелировал с Т-клеточной инфильтрацией, оцениваемой по всем трем маркерам (CD3, CD5, CD7).

Уровии плазматических клеток (CD38++) микроокружения в ткани ДВКЛ

Уровни плазмоклеточной реакции изучены у 329 больных ДВКЛ. В 212

случаях (64,4%) выявлялись единичные клетки или их практически полное

38

отсутствие, в остальных 117 наблюдениях (35,6%) наблюдалась умеренная (89 случаев, 27,1%) или выраженная (28 случаев, 8,5%) плазмоклеточная реакция.

Роль того или иного типа реакции плазмоцитов в прогнозе ДВКЛ оценена у 136 больных - уровень инфильтрации ткани ДВКЛ плазмоцитами не влиял на продолжительность жизни больных ДВКЛ, р=0,9.

Не отмечено связи с клинико-лабораторными данными. Плазмоклеточная инфильтрация была связана с гемопоэзом у больных ДВКЛ - показателями клеточности, содержанием лимфоцитов и моноцитов, индексом созревания эритрокариоцитов. Выраженность плазмоклеточной инфильтрации зависела от иммунофенотипических особенностей ДВКЛ (экспрессии СБ38). Уровень плазмоклеточной инфильтрации достоверно коррелировал только с фолликулярными дендритными клетками из числа клеток микроокружения.

Фолликулярные дендритические клетки (С021+ и СБ23+)

В опухолевых срезах ДВКЛ могут присутствовать в различных количествах фолликулярные дендритные клетки. Мы изучили 2 типа этих клеток - СЭ21+ (присутствуют в фолликулах вне зависимости от наличия в них светлых центров) и С023+ (характерны для светлых центров).

СР21-позитивные фолликулярные дендритические клетки

Оценка наличия С021-позитивных фолликулярных дендритических клеток (ФДК) проведена у 266 больных ДВКЛ. Наличие С021+ ФДК установлено в 18,4% (49 больных). Роль С021+ ФДК в прогнозе ДВКЛ оценена у 114 больных - уровень С021+ ФДК в ткани ДВКЛ не влиял на продолжительность жизни больных, р=0,34.

Не отмечено связи плазмоклеточной реакции в ткани ДВКЛ с клинико-лабораторными данными. Присутствие фолликулярных дендритных клеток (С021+) было связано с гемопоэзом у больных ДВКЛ - индексом созревания гранулоцитов, лейко-эритробластическим соотношением. Наличие СП21+ ФДК не зависело от иммунофенотипических особенностей ДВКЛ. Уровни этих клеток достоверно коррелировали с клетками микроокружения (Т-клетки, плазмоциты) и с другой субпопуляцией ФДК - СЭ23+.

СР23-позитивные фолликулярные дендритические клетки

Оценка наличия С023-позитивных фолликулярных дендритических клеток (ФДК) проведена у 325 больных ДВКЛ. Наличие CD23+ ФДК установлено в 11,1% (36 больных). Роль CD23+ ФДК в прогнозе ДВКЛ оценена у 132 больных -наличие CD23+ ФДК в ткани ДВКЛ не влияло на продолжительность жизни больных ДВКЛ, р=0,65.

Не отмечено связи CD23+ ФДК с клинико-лабораторными данными. Присутствие фолликулярных дендритных клеток (CD23+) было связано с гемопоэзом у больных ДВКЛ - большей частотой повышения уровня сегментоядерных нейтрофилов, снижением индекса созревания гранулоцитов. Присутствие CD23+ ФДК в ткани ДВКЛ зависело от иммунофенотипических особенностей ДВКЛ - экспрессии CD38. Наличие этих клеток достоверно коррелировало с Т-клетками микроокружения (CD3, CD5, CD7) и с другой субпопуляцией ФДК - CD21+.

Уровни Т-лимфоцитов в опухолевом микроокружепип ДВКЛ и их клиническое значение

Полуколичественная оценка Т-лимфоцитов в срезах ДВКЛ проведена с использованием трех маркеров: CD3, CD5, CD7. Количество клеток, выявляемых на основании экспрессии этих маркеров, хорошо коррелировало между собой. В таблице представлена частота выраженности Т-клегочной реакции при использовании 3 типов антител, таблица 5.

Таблица 5. Типы инфильтрации опухолевой ткани ДВКЛ Т-лимфоцитами

Маркер Тип реакции Т-клеток в ткани ДВКЛ Всего

слабая умеренная выраженная

CD3 84 (35)* 134 (55,8) 22 (9,2) 240

CD5 105(31,5) 195 (58,6) 33 (9,9) 333

CD7 105(31,5) 195 (58,6) 33 (9,9) 333

♦количество (процент в строке)

Оценена роль каждого из Т-клеточных маркеров в прогнозе ДВКЛ. Различия в выживаемости были недостоверны по всем трем маркерам. Наиболее близкие к достоверны данные получены для CD7 (р log-rank - 0,061) Лучшие показатели выживаемости были в группе с больных ДВКЛ с наличием Т-клеточной инфильтрации. Мы обратили внимание на тот факт, что к выраженной Т-клеточной инфильтрации могут быть отнесены случаи с наличием сохранных Т-клеточных

зон в опухолевой ткани, что не в полной мере соответствует выраженной инфильтрации опухоли. Если исключить из анализа эту немногочисленную группу больных, то различия в выживаемости больных с наличием Т-клеточной (СЭ7) инфильтрации и с отсутствием таковой являются достоверными, р=0,038 (лог-ранк), рисунок 14.

• .умерчшя*

ммтшльнэя ■+- имфшътрацЩ'

Месяцы

Рисунок 14. Достоверное увеличение продолжительности жизни больных с умеренной Т-клеточной инфильтрацией опухоли (п=7б) в сравнении с больными, у которых инфильтрация отсутствовала (п=47).

Роль Т-клеточной инфильтрации первичной опухоли представляется,

пожалуй, наиболее интригующей при ДВКЛ, поскольку именно с этими клетками

связывают своего рода иммунореактивность организма в ответ на опухоль. И наши

данные на очень большом материале (более 300 больных) позволили выделить

типы реакций CD3, CD5, CD7 Т-клеток в опухолевой ткани. Т-клеточная

инфильтрация ДВКЛ характеризовала группу более благоприятного прогноза, что

убедительно доказано при более чем 10 летнем наблюдении за больными. В числе

клинических особенностей лимфом с Т-клеточной инфильтрацией - достоверно

более редкая частота встречаемости такого признака неблагоприятного прогноза

как наличие двух и более экстранодальных локализаций опухоли. ДВКЛ с

наличием интратуморальной Т-клеточной реакции, действительно, формируют

вполне очерченную группу. Т-клеточная реакция напрямую зависит от

41

иммунофенотипических особенностей опухоли и, что особенно важно, экспрессии активационных антигенов НЬА-ОЛ и С038. Уровень Т-клеток тесно связан с опухолевым микроокружением - макрофагами и фолликулярными дендритными клетками обоих изученных типов (С021+ и С023+). Все это позволяет сделать заключение о целесообразности дальнейшего изучения и использования в клинике такого нового показателя как Т-клеточная инфильтрация опухоли.

ВЫВОДЫ

1. На основании проведеннных углубленных исследований у 338 больных неспецифицированной диффузной В-крупноклеточной лимфомой установлена важная роль оценки показателей гемопоэза, иммунофенотипа первичной опухоли и субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов неопухолевого микроокружения в диагностике, патогенезе, клиническом течении и прогнозе ДВКЛ.

2. Важнейшим неблагоприятным признаком международного прогностического индекса (1Р1) в выделении групп риска ДВКЛ является распространенность опухолевого процесса при диагностике (наличие III, IV стадий). Наличие двух или более экстранодальных локализаций опухоли и показатель ЕСОв (>=2), как правило, соотносятся с III, IV стадиями ДВКЛ, а прогностическая роль пожилого возраста больных и повышенных уровней ЛДГ утратили свое значение. Поэтому главной задачей улучшения прогноза при ДВКЛ являются совершенствование ранней диагностики заболевания и достижение большей частоты ремиссий при проведении специфического лечения.

3. Включение препарата ритуксимаб (моноклональные антитела к антигену С020) повышает частоту достижения полных ремиссий у больных ДВКЛ и достоверно увеличивает общую выживаемость больных при сроке наблюдения 8 лет (р=0,047).

4. В-линейная природа ДВКЛ в 100% случаев подтверждается обнаружением цитоплазматической детерминанты антигена С020 (Ь2б). Экспрессия С019 и мембранных С020 может быть слабой и в редких случаях отрицательной, что высоко коррелирует (р<0,001) с утратой

42

экспрессии общелейкоцитарного антигена CD45. Отсутствие мембранной экспрессии CD20 по нашим наблюдениям встречается в 1,5% случаев ДВКЛ (4 из 272 больных) и должно учитываться при назначении препарата Ритуксимаб (моноклональные антитела к мембранной детерминанте антигена CD20).

5. Характерными особенностями гемопоэза у больных ДВКЛ являются увеличение процента бластов в миелограмме и изменения эритробластограммы (снижение базофильных и полихроматофильных нормобластов, повышение оксифильных форм с повышением индекса созревания эритрокариоцитов в 86% случаев).

6. Нарушения гемопоэза у больных ДВКЛ имеют прогностическое значение:

■ повышение бластных клеток (>=1%) ухудшает общую выживаемость больных (р=0,048);

■ задержка созревания клеток гранулоцитарного ряда с увеличением числа нейтрофильных миелоцитов или снижением процента сегментоядерных нейтрофилов также ухудшают прогноз (р=0,011 и р= 0,013);

■ нарушение дифференцировки эритрокариоцитов с повышением уровня оксифильных нормобластов ухудшает прогноз ДВКЛ (р=0,041).

7. Иммунофенотипирование клеток ДВКЛ на свежезамороженных (криостатных) срезах опухолевой ткани существенно расширяет возможности рутинной иммуногистохимии за счет изучения маркеров активации (HLA-DR, CD38), пан-В-клеточных антигенов (CD19, мембранные CD20), пан-Т-клеточных (CD7) в дополнение к стандартно используемым CD45, CD20 (L26), CD163, CD30, CD3, CDS, CD10, CD23, CD21. Это позволяет диагностировать редкие варианты лимфом, оценивать особенности иммунофенотипа во взаимосвязи с клетками микроокружения опухоли.

8. HLA-DR-негативный вариант ДВКЛ составляет 9,3% случаев (32 из 331), характеризуется благоприятным прогнозом, крайней редкостью (2,8%)

двух и более экетранодальных локализаций. Опухоль не имела иных специфических иммунофенотипических признаков, характеризовалась сниженной Т-клеточной инфильтрацией, достоверно более редким снижением нейтрофильных метамиелоцитов.

9. Экспрессия СБ38 наблюдается в 55,9% (184 из 329) и не влияет на прогноз ДВКЛ. Иммунобиологические особенности С038+ ДВКЛ состоят в более выраженной интратуморальной инфильтрации клетками опухолевого микроокружения (макрофагами, плазмоцитами, зрелыми Т-лимфоцитами), чаще присутствуют СВ23+ ФДК. Опухоль характеризуется спецификой иммунофенотипа (С021, С023), связью с гемопоэзом (сегментоядерные нейтрофилы, плазмоциты), более низкими уровнями ЛДГ.

10. К редким вариантам относится С045-негативная ДВКЛ - 3,9% (13 из 332). Опухоль наблюдается при III, IV стадиях и характеризуется чертами иммунологической анаплазии: снижением СВ19, С020 (р<0,001), экспрессией в 55,6% случаев антигена КМ СЭЗО.

11. Экспрессия рецепторов СП21 и С023 высоко коррелирует между собой и наблюдается в 12,4% (33 из 266) и 12,0% (39 из 326) ДВКЛ, соответственно. Эти две группы ДВКЛ различны:

• С Э21-позитивные лимфомы в сравнении с С021-негативными чаще наблюдались у женщин (р=0,046) и характеризовались частым отсутствием признаков неблагоприятного прогноза. Отмечена достоверная связь с уровнями промиелоцитов и лимфоцитов в костном мозге. В С021+ группе ДВКЛ не наблюдали СИЗО-позитивных случаев.

• СБ23+ ДВКЛ характеризовались неблагоприятным прогнозом (р=0,029), преобладали больные более молодого возраста (р=0,002). В этой группе вдвое чаще были повышены уровни сегментоядерных нейтрофилов в костном мозге. Отмечена корреляция экспрессии С023 и С038 на опухолевых клетках, а также высокая частота выраженных интратуморальных Т-клеточных реакций при СБ23+ иммунофенотипе.

12. Особую группу ДВКЛ представляют СЭЗО-позитивные случаи (23,9% -21 из 88), характеризующиеся хорошим прогнозом (все больные живы, срок наблюдения до 110 мес), р=0,02. Характерна связь с эритропоэзом и отсутствие выраженных реакций плазмоцитов в опухолевом микроокружении.

13. Из числа клеток микроокружения (макрофагов - CD163+, плазмоцитов -CD38++, фолликулярных дендритных клеток двух субпопуляций -CD21+, CD23+ и Т-лимфоцитов - CD3, CD5, CD7) наиболее клинически важными являются Т-лимфоциты. Наличие Т-клеточной интратуморальной иммунной реакции (CD7) характеризует группу ДВКЛ с благоприятным прогнозом (р=0,021) по выживаемости и отсутствию двух и более экстранодадьных локализаций. Т-клеточная инфильтрация связана с акгивационными маркерами опухоли, наличием фолликулярных дендритных клеток и макрофагов микроокружения.

14. Полученные данные дают основание для более точного назначения иммунопрепаратов (ритуксимаб). Интенсификация лечения не показана у больных с HLA-DR+, CD30+ ДВКЛ, а также при наличии Т-клеточной инфильтрации опухоли. Результаты лечения больных CD 10+ и CD23+ ДВКЛ, а также пациентов с повышением бластов в костном мозге, нарушением гранулоцитарной дифференцировки, повышением оксифильных нормобластов являются менее удовлетворительными -целесообразно совершенствование программ терапии.

Список работ, опубликованных по теме дпссетации в рецензируемых журпалах, рекомендованных ВАК РФ

1. Фалалеева, H.A. Клиническая характеристика, результаты лечения и прогноз при фолликулярной лимфоме с поражением костного мозга. / H.A. Фалалеева, P.A. Хакуй, П.А. Зейналова, A.M. Ковригина, А.И. Павловская, М.А. Френкель и др. // Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. — 2008. — Т. 19. — №5. — С. 72-80.

2. Тупицына, Д.Н. Факторы прогноза при фолликулярной лимфоме / Д.Н.

Тупицына, A.M. Ковригина, E.H. Шолохова, E.H. Сорокин, П.А.

Зейпалова, Д.А. Быков, OA. Коломейцев, Г.С. Тумян, Е.А. Османов //

45

Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. —2012. —Т.5, №4. — С.328-337.

3. Тумян, Г.С. Фолликулярная лимфома. 10 лет терапии. / Г.С. Тумян, А.А Леонтьева, H.A. Фалалеева, Д.Н. Тупицына, П.А. Зейналова, A.A. Чекан, Д.А. Быков, Т.Т. Кондратьева, O.A. Коломейцев, В.Б. Ларионова, Е.А. Османов // Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. —2012. — Т.5, №3. — С.204-214.

4. Зейналова, П.А. Саркома из интердигитирующих клеток: клиническое наблюдение и данные литературы / П.А. Зейналова, А.И. Павловская, Т.Т. Валиев, Н.В. Кокосадзе // Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. — 2013. — Т.б, №3. — С.318-314.

5. Зейналова, П.А. Диффузная В-крупноклеточная лимфома CD20-негативная. I. Верификация и детализация диагноза / П.А. Зейналова, E.H. Шолохова, Е.А. Османов, H.H. Тупицын //Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина — 2014. — Т.25, №3-4. — С. 71-74

6. Зейналова, П.А. Клиническое значение клеток опухолевого микроокружения при диффузной В-крупноклеточной лимфоме / П.А. Зейналова, E.H. Шолохова, Е.А. Османов, H.H. Тупицын // Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина — 2014. — Т.25, №3-4. — С. 81-85

7. Шолохова, E.H. Иммунофенотипические особенности редких вариантов диффузной В-крупноклеточной лимфомы / E.H. Шолохова, П.А. Зейналова, Е.А. Османов, H.H. Тупицын // Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина -2014— Т.25, №3-4. — С. 74-81

8. Тупицын, H.H. Роль костного мозга в прогнозе диффузной В-крупноклеточной лимфомы / H.H. Тупицын, П.А. Зейналова, М.А. Френкель, Е.А. Османов // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. —2015. — №1. — С.72-77.

9. Зейналова, П.А. Взаимосвязь иммунофенотипа диффузной В-крупноклеточной лимфомы с особенностями кроветворения у больных / П.А. Зейпалова, E.H. Шолохова, М.А. Френкель, ЕА. Османов, H.H. Тупицын // Технологии живых систем. — 2015. — №1. — С.63-68.

10. Зейналова, П.А. Прогноз при диффузной В-крупноклеточной лимфоме. II. Клиническое значение утраты экспрессии молекул HLA-DR при диффузной В-крупноклеточной лимфоме / П.А. Зейналова, Е.Н. Шолохова, Е.А. Османов, Н.Н. Тупицын // Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. — 2015. -Т.26, №1. -С.50-53

11. Зейналова, П.А. Прогноз при диффузной В-крупноклеточной лимфоме. I. Необходимо ли выделять GCB и ABC типы диффузной В-крупноклеточной лимфомы / П.А. Зейналова, Е.Н. Шолохова, Н.Н. Тупицын // Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. -2015.-Т.26, №1. -С.43-49.

Другие работы, опубликованные по теме диссертации:

1. Tupitsyna, D.N. CD4+ T-cell populations in different microanatomical lymph node compartments of follicular lymphoma / D.N. Tupitsyna, A.M. Kovrigina, P.A. Zeinalova et al. // 17th Congress EHA, Amsterdam, the Netherlands, June 14-17 2012.— Abstract book. — 2012. — P. 644 - 645

2. Chekan, A. Prognostic impact of BCL6 gene rearrangement in diffuse large B-cell lymphoma / A. Chekan, G. Tumyan, A. Kovrigina, D. Bikov, P. Zeynalova et al. // 17th Congress EHA, Amsterdam, the Netherlands, June 1417 2012—Abstract book. —2012. — P. 1662

3. Lepkov, S. Antiviral therapy of the patients with indolent B-cell non-Hodgkin lymphomas associated with chronic hepatitis С / S. Lepkov, O. Kolomeytsev, A. Kovrigina, T. Kondratieva, Y. Ryabukhina, P. Zeynalova, G. Tumyan, O. Timofeeva, O. Kosura // 17th Congress EHA, Amsterdam, the Netherlands, June 14-17 2012. —Abstract book. — 2012. —P. 0802

4. Lepkov, S. Therapy for the patients with diffuse large B-cell lymphoma associated with chronic hepatitis С / S. Lepkov, A. Kovrigina, T. Kondratieva, P. Zeynalova, G. Tumyan, O. Timofeeva, O. Kosura // 17th Congress EHA, Amsterdam, the Netherlands, June 14-17 2012. —Abstract book. — 2012. — P. 1202

Подписано в печать 14.04.15 Формат 60x84/16.' Бумага офисная «БуйоСору». Тираж 100 экз. Заказ №230 Отпечатано на участке множительной техники ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блоюша» 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24