Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Депо оксида азота в кровеносных сосудах и его роль в адаптационной защите организма

На правах рукописи

РГБ ОД

2 9 Я К В 2002

СМИРИН БОРИС ВЛАДИМИРОВИЧ

ДЕПО ОКСИДА АЗОТА В КРОВЕНОСНЫХ СОСУДАХ И ЕГО РОЛЬ В АДАПТАЦИОННОЙ ЗАЩИТЕ ОРГАНИЗМА

14.00.16- патологическая физиология

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2001

Работа выполнена в лаборатории патофизиологии сердца Научно исследовательского института общей патологии и патофизиологи] Российской АМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Е.Б.Манухина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессо! В.Б.Кошелев

доктор биологических наук А.М.Мелькумянц

Ведущее учреждение: Московская медицинская академи

им.И.М.Сеченова

Автореферат разослан 21, ноября 2001 года

Защита диссертации состоится « 2^ » 2002 го;:

в //Г' с> на заседании Диссертационного совета' Д 0010.03.01 пр Научно-исследовательском институте общей патологии патофизиологии РАМН по адресу: 125315, Москва, Балтийскг улица, дом 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинск

наук ЛН.Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования.

Оксид азота (NO) является важнейшим фактором-регулятором многих процессов, ¡отекающих в организме. NO представляет собой лабильную, короткожи вущую шекулу свободнорадикальной структуры. Эта молекула может стабилизироваться, о позволяет ей выполнять не только парахринные, но и аугокринные функции, габилизгция молекулы N0 происходит путем включения последней в [нитрозилыше комплексы железа с тиоловыми лигандами или S-нитрозотиолы, торые могут в дальнейшем постепешо высвобождать N0. Таким образом, эти мплехсы являются физиологически активным депо N0 в тханях (Ванин, 1998).

В предыдущих исследованиях была показана возможность формирования и явления депо N0 в условиях in vitro. Однако возможные механизмы и апологическая роль депонирования N0 в целом организме остались неизученными, неются данные, которые позволяют предположить, что депо N0 формируется при шышении концентрации N0 во внеклеточной среде или клетке (Ванин, 1998). В спериментах для повышения уровня NO в организме в качестве фармакологических ¡тодов наиболее часто применяется введение доноров N0, липополисахаридов или L-гишша (Ванин, 1998), а в качестве нефармакологических - тепловой шок (Манухина и >., 1996) или дозированная адаптация организма к факторам среды, таким как стресс íeerson et al., 1994) или физическая нагрузка (Манухина и др., 1996). Однако до стоящего времени не удавалось выявить депо N0, сформировавшееся в этих [ловиях in vivo, в связи с недостаточной чувствительностью используемых для этого тодов.

Известно, что умеренное повышение уровня N0 в организме сопровождается щшшми эффектами, обеспечивающими устойчивость организма к повреждающим здействиям. Развитие таких защитных эффектов наиболее характерно для зированной адаптации к факторам среды. При этом было показано, что ингибиторы итеза N0 препятствуют адаптационной защите, тогда как доноры NO ее успешно ¡¡производят (Малышев, Манухина, 1998; Malyshev et al., 1999). Защитные эффекты, условленные транзиторным повышением NO в результате введения донора N0 или 1мулирования эндогенного синтеза N0, могут сохраняться даже после возвращения ) к исходному уровню (Малышев и др., 1998). Такая долговременная NO-зависимая цита может быть связана либо с тем, что N0 индуцирует синтез вторичных зтекторных факторов, например, белков теплового шока (Malyshev et al., 1995), либо бразованием депо N0, которое при необходимости может служить дополнительным югенным источником N0. Однако физиологическое значение депонирования NO и можность участия депонированного NO в защите организма от повреждающих действий до сих пор не изучалась.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы состояла в изучении условий и механизмов формирования ■о NO in vivo, а также его возможной физиологической роли.

В рамках поставленной цели решались следующие задачи:

1. Разработать способ выявления in vitro депо NO, сформировавшееся в creí сосудов in vivo в результате повышения уровня N0, вызванного введением донора Ь тепловым шоком или адаптацией организма к факторам среды. Изучить локализащ динамику образования и распада депо N0 в стенке сосуда.

2. Изучить соотношение между объемом депо NO в стенке сосуда и концентрат конечных стабильных метаболитов N0 — нитритов и нитратов в плазме крови.

3. Изучить особенности и закономерности депонирования N0 у животных различным врожденным уровнем синтеза N0.

4. Изучить роль депо NO в повышении устойчивости организма к нарушети связанным как с избытком так и с дефицитом N0.

Научная новизна исследования определяется следующими основны результатами.

Впервые продемонстрирована возможность выявления и оценки in vitro депо К сформировавшегося в стенке кровеносных сосудов in vivo при воздействи повышающих уровень N0 в организме. В отсутствие повышения уровня N0 депо I не выявляется. Депо N0 выявляется по реакции расслабления изолированного сосу под действием диэтилдитиокарбамата, разрушающего это депо с выделени свободного N0. Реакция расслабления опосредована активацией растворим гуанилатциклазы.

Установлено, что депо N0 локализуется преимущественно в эндотелиальном сх стенки сосуда. При повреждении эндотелия депонирование N0 может происходил сосудистой гладкой мышце.

Формирование депо NO как в изолированном сосуде, так и в условиях целс! организма происходит при любом повышении уровня N0, соответственно, в сре инкубации или плазме крови независимо от причины, вызвавшей это повышение.

В процессе адаптации животных к периодической гипобарической гипокс происходит постепенное увеличение концентрации в плазме стабильных метаболи! N0 нитратов и нитритов, которая является показателем суммарного синтеза NC организме. Активация синтеза NO сопровождается формированием и закономерн увеличением депо NO в стенке сосудов. При этом между объемом депо N0 и уровь нитритов и нитратов имеется достоверная прямая корреляция. Впервые показано, чт крыс линии Август, которые характеризуются врожденно более высоким уров! базального и стимулированного синтеза N0, эффективность депонирования NO i адаптации к гипоксии значительно выше, чем у крыс линии Вистар.

Установлено, что антигипертензивный эффект адаптации к гипоксии у спонтан гипертензивных крыс линии SHRSP, характеризующихся выраженным дефици эндотелиального N0, сопровождается формированием депо N0 в сосудистой creí Этот антигипертензивный эффект с сопутствующим образованием депо воспроизводится курсовым введением донора N0 — динитрозильного комплс железа (ДНКЖ). Защита от вызванной тепловым шоком гиперпродукции NO, коте наблюдалась при адаптации к стрессу, также была тесно связана с формированием д

i в стенке сосудов в ходе адаптации. Частичное ингибирозание NO-синтазы во время ттации препятствовало как формированию защитного эффекта, так и 1утствующему депонированию N0 в сосудистой стенке. С другой стороны, введение юра N0 ДНКЖ, вызывавшее образование депо, полностью воспроизводило цитный эффект адаптации. В процессе адаптации происходит увеличение "емкости" то N0, т.е. потенциальной способности ткани к депонированию N0.

Теоретическое значение работы определяется тем, что в ней впервые □демонстрирована и обоснована возможность выявления и оценки депо N0, ормировавшегося в условиях целого организма, и показано физиологическое эчение депонирования NO для защиты сосудистой системы от повреждающих здействий.

Практическое значение работы определяется тем, что в ней показана зможность направленного модулирования процесса депонирования N0 с целью ■вышения устойчивости организма к повреждающим факторам.

Положения, выносимые на защиту.

1. При воздействиях, повышающих уровень N0 в организме, в эндотелии ювеносных сосудов образуется физиологически активное депо N0, которое может ль выявлено на изолированном сосуде. Между объемом депо N0 и концентрацией абильных метаболитов N0 в плазме крови имеется достоверная прямая корреляция.

2. Эффективность депонирования NO в стенке сосудов связана с генетичесхн ■терминированной мощностью NO-продуцирующих систем.

3. Депонирование N0 играет важную роль в формировании устойчивости организма повреждениям, вызванным как дефицитом, так и гиперпродукцней N0

Апробация дпесептаяни. Основные результаты проведенных исследований были вставлены на Конференции с международным участием «Роль монооксида азота в юцессах жизнедеятельности» (Минск, Беларусь, 1998), Международном конгрессе iiochemestry and Molecular Biology of Nitric Oxide» (Лос-Анжелес, США, 1998), еждународном симпозиуме «Biological Chemistry and Cellular Targets of Nitric Oxide» рац, Австрия, 1998), объединенной конференции МГУ и Секретариата INTAS Microbial and Cellular Systems for Pharmacology, Biotechnology, Medicine and ivironment» (Москва, 1999), международном симпозиуме "Nitric Oxide: From olecular Level to Clinical Application" (Братислава, Словакия, 1999), конференции ипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 1999), II Всероссийском ¡нгрессе по патофизиологии (Москва, 2000), III Национальном конгрессе тофюиологов Украины (Киев, Украина, 2000), XVIII Съезде физиологов России азань, 2001), Национальной научно-практической конференции с международным астием «Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека» (Смоленск, 2001), 8 Международной конференции "Hypoxia in Medicine" (Женева, Швейцария, 2001).

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 124 страницах и состоит из введения, обзора литературы, бственных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Список литературы [держит 210 источников. Диссертация иллюстрирована 1 таблицей и 22 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты были выполнены на 290 самцах крыс линий Вистар массой 230-2 г, 42 самцах спонтанно-гипертензивных крыс, предрасположенных к инсульту лип SHRSP в возрасте от 5 до 14 недель, которые являлись моделью сниженного уров продукции эвдотелиального N0, 45 самцах крыс линии Вистар-Киото (WKY) возрасте от 5 до 14 недель, которые являются генетически родственным контролем линии SHRSP, а также на 50 самцах крыс линии Август массой 190-210 г, котор: являются моделью повышенного уровня продукции NO (Микоян и др., 1996).

Эксперименты по выявлению депо NO производились на кольцевых препарат аорты. Для регистрации сокращений препарата использовали двухканальш регистратор Gemini (Ugo Basile, Италия). Интактность эндотелия тестировали ] реакции расслабления на ацетилхолин (10 М) на фоне предварительного сокращен* вызванного норадрзналином (5Х10"?М). После отмывки снова вызывали сокращен: кольцевого препарата аорты добавлением в камеру норадреналина в концентрации 5 10"7 М. После стабилизации тонуса добавлялся б локатор NO-синтазы Ы^-нитро^ аргинин (L-NNA) в концентрации 10"4 М. Для выявления депо NO на фоне пла' сокращения в камеру добавляли диэтилдитиокарбамат (ДЭТК, 3 X 10*4 М) и оценива; величину вызванного им расслабления препарата.

Для формирования депо NO in vitro препарат инкубировали с донором NO, качестве которого использовался дишпрозильный комплекс железа с глютатионом качестве тиолового лиганда (ДНКЖ, Ю^М) (синтезирован и любезно предоставлю профессором А.Ф.Ваниным, Институт химической физики РАН, Москва). Поа полного распада ДНКЖ в камере и возвращения тонуса препарата к уровш предшествовавшему введению ДНКЖ, проводилась оценка депо N0 по реакции i ДЭТК.

Для оценки роли (уакнлатциклазы в вазодилататорном эффекте ДЭТК препар инкубировался с донором N0 ДНКЖ (10"6 M), а затем с ингибитором хуанилатциклаз - метиленовым синим (3 X 10"5М), и реакция расслабления на ДЭТК сравнивалась реакцией контрольного препарата, не инкубированного с метиленовым синим.

Для определения локализации депо NO в стенке сосуда сравнивали депо N0 дезндотелизованных и ингактных препаратах изолированных сосудов животных пос. инкубации препарата с ДНКЖ или после введения ДНКЖ крысам. Деэндотелизац] осуществлялась механическим путем. Эндотелий считался удаленным полностью, ecj препарат не реагировал расслаблением на ацетилхолин (10"5М) на фоне сокращен* вызванного норадреналином (5 X 10"'М).

Для повышения уровня NO в организме применялось однократное введен донора NO ДНКЖ в хвостовую вену крыс в дозе 170 мкг/кг. Животных брали эксперимент через 5 часов после введения ДНКЖ.

Тепловой шок вызывали путем прогрева бодрствующих животных в термостат« течение 20 минут после достижения ректальной температуры 41.5±0.50С. Обш длительность прогрева не превышала 25 минут. Животных брали в эксперимент чере: час после окончания теплового шока (Манухина и др., 1995). В отдельных сери

сспериментов для создания депо N0 использовали кратковременный прогрев ивотных в течение 5 минут при температуре воздуха в камере 65°С.

Измерение артериального давления (АД) проводили непрямым бескровным пособом на хвостовой артерии. Для регистрации использовали пневматический датчик neumatic Pulse Transducer DY-4 и PhysiogTaph DMP-4F (Narco Bio-System, США).

Адаптацию к периодической гипобарической гипоксии проводили в барокамере ри разрежении воздуха, соответствующем высоте 4000 м над уровнем моря. Полный урс адаптации составлял 40 сеансов с постепенным увеличением времени (токсического воздействия к 10-му сеансу до 5 часов.. Адаптацию к гипоксии SHRSP WKY начинали в возрасте 5-6 недель, который соответствовал у SHRSP ранней ипертензивной стадии.

Адаптация к иммобнлизационному стрессу производилась путем фиксации сивотных в положении на спине. Курс адаптации состоял из 8 сеансов иммобилизации о 30 минут. Животных брали в эксперимент через 24 часа после первого и последнего еансов адаптации.

Для воспроизведения адаптивного повышения уровня NO в организме применялось урсовое введение ДНКЖ. ДНКЖ вводили внутримышечно в дозе 170 мкг/кг каждые 4 дя в течение 40 дней. Животных брали в эксперимент через 24 часа после последней нъекции ДНКЖ.

В качестве ингибитора NO-синтазы использовали №-ншро-Ь-аргинин (L-NNA, ligma). Для хронического ограничения активности NO-синтазы во время адаптации к грессу L-NNA вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг за 30 минут до каждого ганса адаптации.

Продукция NO в организме оценивалась по суммарному содержанию в плазме етаболитов NO - нитритов и нитратов (Moshage et al., 1995). Плазму получали гнтрифугированием цельной крови при 3000 g в течение 15 мин. и гпротеинизнровали путем добавления 1/20 объема Z11SO4 в концентрация 300 г/л. осле центрифугирования при комнатной температуре (15 мин. при 3000 g) в тернатанте проводили восстановление нитратов до нитритов с помощью реакторов itralyzer™ (World Precision Instruments, Inc. США) в присутствии 0,5М NH4OH, pH 9,0 качестве буфера. После восстановления аликвоту плазмы смешивали с равным 5ъемом реактива Грисса, и измеряли интенсивность поглощения ¡ектрофотометрически на 540 нм. Концентрацию нитритов определяли по дибровочной кривой (5-50 мкМ NaNOj).

У крыс, помещенных в метаболические клетки, проводили сбор суточной мочи, энцентрацию нитритов и нитратов определяли спектрофотометрически, а затем шожали на объем суточной мочи.

Эффективность депонирования NO (ЭД чо) рассчитывали для каждого животного сдельности как отношение величины депо NO к суммарной концентрации нитритов пиратов в плазме.

Статистическая обработка данных. Полученные данные обрабатывали; статистически с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали* достоверными при р<0,05. Результаты представлены в виде М+т.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе исследований изучалась возможность формирования депо N0 условиях in vivo, а также некоторые условия формирования и деградации депо N0.

ДЭТК не вызывал расслабления контрольного препарата. По-видимому, контроле депо N0 отсутствует или его объем находится ниже уровня определение, После инкубации с донором NO ДНКЖ препарат отвечал на ДЭТК расслаблением которое составляло 10.48% ± 2.76%. После инкубации с ДНКЖ в разньг концентрациях и в течение разного времени было установлено, что ответ на ДЭТК : диапазоне концентраций донора N0 от Ю-6 до 10"5М и в диапазоне времени инкубацш от 15 до 60 мин. не изменялся. Следовательно, выбранная рабочая концентраци ДНКЖ (10"6 М) и время инкубации (15 мин.) приводили к формированию максимальн! возможного депо N0 и поэтому использовались во всех дальнейших экспериментах.

Для доказательства истощаемости депо N0 была предпринята попытка вызват повторный ответ препарата на ДЭТК, однако повторного ответа препарата на ДЭТ. вызвать не удалось. Невозможность воспроизвести повторно ответ на ДЭТК поел отмывки препарата свидетельствует о том, что данная реакция не являлас неспецифической и не была опосредована синтезируемым, т.е. восполняемы продуктом.

Для использования описанного метода детекции депо необходимо было преж^ всего доказать участие N0 в реализации эффекта ДЭТК. Следует отметить, что пр использовании других методов выявления депо N0, в частности хемилюменисцентши газового анализа (Liu et al., 1993), фоторелаксации (Megson et al., 1995) или реакци депо N0 с низкомолекулярными тиолами (Muller et al., 1996) роль N0 была доказана г возникновению активации гуанилатциклазы высвобождающимся из депо N0. В нал» экспериментах по выявлению N0 депо по реакции с ДЭТК ингибитор растворим« гуанилатциклазы — метиленовый синий полностью предупреждал расслаблеш препарата, вызванное ДЭТК. Это доказывает, что расслабление было опосредовано N< зависимой активацией растворимой гуанилатциклазы (Ignarro, 1989).

Формирование депо NO in vivo было продемонстрировано на препаратах аорт взятых у крыс, которым за 5 часов до эксперимента была сделана внутривенн инъекция донора N0 ДНКЖ. Аорта, выделенная у таких животных, реагировала ДЭТК расслаблением, составлявшим 10,88±1,67% (Рис.1) Механизм депонирован экзогенного ДНКЖ in vivo, по-видимому, аналогичен механизму депонирования

[Ц-О. Сразу же после введения животным ДНКЖ с низкомолекулярным таоловым

О 15 30 45 во во 105

Рисунок 1.

А - Влияние ДЭТК на контрольный препарат. Б - Влияние ДЭТК на препарат, инкубированный с донором МОВ- Повторное воздействие ДЗТК на препарат, инкубированный с донором N0.

1гандом (в наших экспериментах - глютатионом), группы Бе(£Ю)2 переходят на рные сульфгидрилыше группы белков крови и тканей. Этот механизм ранее был

установлен с помощью ЭПР-анализа (Клещев и др., 1988).Дня изучения локализащ депо N0 в стенке сосуда препарат аорты, выделенный у животных, получивш* инъекцию ДНКЖ за 5 часов до эксперимента, деэндотелизировали. Такой препарат ответ на ДЭТК не изменял своего тонуса. Следовательно, депо МО в живо организме формируется в эндотелиальном слое сосудистой стенки. В литерату[ имеются данные, которые говорят о возможности депонирования N0 в гладкс мышце сосуда. Так гистохимическое окрашивание на Ре(П) иногда выявляло дел N0 в гладкомышечных клетках непосредственно примыкающих к эндотелм (Р1кпеу « а1., 1992). В наших экспериментах после введения животным ДНЮ реакция релаксации на ДЭТК после деэндотелизации была незначительной возникала не во всех препаратах, что согласуется с результатами, полученным БИЩеу ег а!. Инкубация выделенного у интактного животного и деэндотелизованиог препарата с ДНКЖ приводила к пятикратному по сравнению с контрольны: препаратом ответу на ДЭТК (51% ± 18.31%) (Рис.2). Такое эффективно депонирование N0 в гладкой мышце может служить компенсаторной реакцией обеспечивающей дилататорный тонус сосудов при повреждении эндотели» вызванного, например, атеросклерозом, процедурой катетеризации сердца ил: трансплантацией сосудов.

Для оценки возможности депонирования N0 под влиянием активаци: эндогенного синтеза N0 животных подвергали интенсивному тепловому шоку Препараты, выделенные у этих животных, отвечали на ДЭТК расслаблением н 7,6313,33%. Главной особенностью этих экспериментов было то, что формирование депо происходило без участия фармакологических агентов и было вызван' активацией эндогенных ЫО-продуцирующих систем. Поскольку гиперпродукцня М( при тепловом шоке обладает выраженным повреждающим действием, и даж приводит к гибели животных (Манухина и др., 1996), удаление избытка N0 пути его депонирования может служить адаптивной защитной реакцией.

Интенсивный тепловой шок является повреждающим воздействие?, приводящим к глубокой гипотензии и гибели значительной части крыс. Поэтом была изучена возможность индукции формирования депо N0 с помощы неповреждающего внешнего воздействия, повышающего уровень N0 в организме. 1 качестве такого воздействия использовали кратковременный, 5-минутный прогре крыс в термостате. Ранее было показано, что такой прогрев не вызывает изменени ни одного из исследованных показателей жизненно важных функций у животных не индуцирует синтез белков теплового шока НВР70 (Ма1уБЬеу ег а!., 2000). Поел кратковременного прогрева препараты аорты отвечали на ДЭТК расслабление величиной 13,2 ± 1,91%. Далее от первых суток к четвертым набшодалос уменьшение амплитуды ответа (9,7±2,1% - на третьи сутки, 5,3+1,8%: - на четверть; сутки), а на пятые сутки расслабление в ответ на ДЭТК не наблюдалось. Таки образом сформировавшееся после однократного прогрева депо N0 сохраняется стенке сосуда в течение 4 суток.

Рисунок 2. А - Влияние метиленового синего на дилататорный аффект ДЭТК у препарата, проинкубированного с донором N0.5- Влияние ДЭТК на препарат, взятый у животного, получившего за 5 часов внутривенную инъекцию ДИКЖ В- Реакция на ДЭТК доэндотелизозанного препарата, взятого у животного, получившего инъекцию ДНЮК (пунктирная линия) и препарата, который после деэндотелизации инкубировался сДНКЖ..

Количественное определение концентрации N0 в тканях затруднено из-за коротко времени жизни этого свободного радикала. Поэтому для оценки продукции N наиболее часто применяется измерение концентрации в биологических жидкост стабильных метаболитов N0 - нитратов и нитритов. Этот анализ обладает высок« точностью и воспроизводимостью и адекватно отражает реальный урова продукции N0 в организме (Моз1^е й а1., 1995). Диаграмма на рис.3 отража изменение суммарного содержания в плазме крыс стабильных метаболитов N нитратов/нитритов в процессе адаптации к гипоксии. Видно, что адаптация вызва. постепенное увеличение концентрации этих соединений, что свидетельствует соответствующем усилении синтеза и/или высвобождения N0 из депо. Если после и 6 дней адаптации прирост концентрации нитратов/нитритов был, хотя закономерным, но не достоверным, что позволяет говорить лишь о налич! тенденции, то к концу полного курса адаптации концентрация метаболитов N достоверно увеличилась почти в два раза по сравнению с контролем (с 18,8+1,71 32,3+2,0 мкМ, р<0,001). На рис.4 приведена диаграмма, показывающая величш реакции расслабления изолированной аорты крыс на ДЭТК, которая соответству< величине депо N0. Видно, что уже после первых трех сеансов адаптации примерно 50% животных выявлялось депо N0, которое закономерно увеличилось по мер формирования адаптации к гипоксии. При сопоставлении величины депо N0 уровня нитратов/нитритов в плазме можно видеть, что накопление депо N происходило параллельно и однонаправлено с увеличением концентрации эта стабильных метаболитов N0. Во всех экспериментальных сериях величина депо N в стенке сосудов достоверно коррелировала с концентрацией нитратов/нитритов плазме (гЧ),7513, р=0.0017).

В связи с обнаруженной корреляцией между уровнем продукции N0 и объемо сформировавшегося депо N0 представляло интерес оценить эффективное! депонирования N0 у животных с разной врожденной интенсивностью базального стимулированного синтеза N0. Поэтому на следующем этапе экспериментов бьи сопоставлена эффективность депонирования N0 в процессе адаптации к гипоксии крыс Вистар и Август.

На рис.5 показана динамика суммарного содержания в плазме крь нитратов/нитритов в процессе адаптации крыс Август к гипоксии в сравнении крысами Вистар. В контроле концентрация нитратов/нитритов в плазме крыс Авгу< была достоверно выше, чем у Вистар (20,3+1,2 мкМ уб. 16,1+1,3 мне* соответственно, Р<0,05). После 3 и 6 дней адаптации у крыс Август, как и у крь Вистар, присутствовала лишь тенденция к росту метаболитов N0 в плазме. Поел полного курса адаптации этот показатель достоверно увеличился по сравнению контролем. При этом, хотя исходно концентрация нитратов/нитритов у крыс Авгу< была выше, ее прирост в процессе адаптации происходил медленнее, и концу кур* этот показатель у крыс Август оказался ниже, чем у Вистар (26,9+1,7 уб. 32,3+1 мкМ, соответственно, р<0,05).

Рисунок 3. Влияние адаптации к гипоксии на концентрацию & плазм« крови метаболитов N0 - нитритов/нитратов. (\ • контроль. 2 • после 3-го сеанса адаптации, 3 - после 6-го сеанса адаптации, 4 - после 40-го сеанса едптации).

* - Достоверное отличие ст контроля, р<0,05

Рисунок 4. влияние адаптации х гипоксии на формирование депо N0 в стенке аорты крыс. Гистограмма отражает реакцию расслабления сосуда в ответ на ДЭТК а % от максимального сокращения, вызванного нсрадренэлином (1 - контроль, 2' после сеанса адаптации, 3 - после 6-1 о сеанса адаптации, 4 • посла 40-го сеанса адптации). * - Достоверное отличив от контроля. р<0,05

40

35 «

А

30 1 25 1

20 { 2«-------

.. ! 1

10 -И

о I......и...................-....... - -.

контроль 3 дня 9 дней 40 дней

• Рисунок 5.Сравнение концентрации нитритов/нитратов у крыс Вистер и процессе адаптации к гипоксии .Горизонтальная ось - срок днях. Вертикальная ось общая концентрация нитрмтоа/нитратов ! Кривая 1 - крысы Вистар. Кривая 2 - крысы

После первых трех сеансов адаптации у всех крыс Август выявлялось депо Ь которое закономерно увеличивалось по мере формирования адаптащ Депонирование N0 у крыс Август происходило значительно быстрее, чем у Вист и к концу курса адаптации величина дело у Август превышала таковую у Вист почти в 2 раза (36,0+6,3% уз. 18,9+2,9%, соответственно, Р<0,05).

Как и для крыс Вистар, для крыс Август во всех экспериментальных сери величина депо N0 в стенке сосудов достоверно коррелировала с концентрацн нитратов/нитритов в плазме (г2=0,6864, р=0,00254).

Расчет эффективности депонирования (ЭДко) показал, что эта величи достоверно не менялась в пределах одной линии крыс на протяжении всего кур адаптации, но у крыс Август была постоянно выше, чем у Вистар. Общая ЭД. рассчитанная как среднее по всем индивидуальным значениям ЭДцо, состава 0,37±0,09 у крыс Вистар и 0,92±0,15 у крыс Август (Р<0,05).

Полученные в настоящей работе результаты показывают, что у крыс Август 1 только базальная продукция N0 значительно превышает таковую у крыс Вистар, I и сильнее выражена гиперпродукция N0 в ответ на МО-стимулирующие воздейств! (Микоян и др., 1996). Поэтому можно предположить, что крысы Август должн обладать более мощной системой зашиты организма от повреждающего действ! избытка N0. Действительно, показатель эффективности депонирования N0 у крь Август достоверно выше, чем у Вистар, а депонирование N0 в стенке сосудов процессе нарастания продукции N0, вызванного адаптацией к гипоксии, протекает первых значительно быстрее. В результате концентрация в плазме крови ншри™11 нитратов, отражающая реальный уровень синтеза N0 в организме (Веп)

. Vallance, 1994), которая исходно у крыс Август была выше, чем у Ви увеличивалась в ходе адаптации с меньшей скоростью и к концу курса адаптации гипоксии стала ниже, чем у Вистар.

Ранее было показано (Пшенникова и др., 1999), что непродолжительная (6 дне! адаптация к гипоксии предупреждает образование язв желудка при длительно иммобилизационном стрессе, тогда как длительная (40 дней) адаптация к гипоксн напротив, усиливает стрессорные поражения слизистой желудка у крыс обе» линий. В наших экспериментах аналогичная длительная адаптация приводила резкому усилению депонирования N0, причем объем сформировавшегося депо бь значительно больше, чем при адаптации к мягким стрессорным воздействиям ш при введении донора N0. Можно предположить, что в результате интенсивно! депонирования слишком много активного N0 оказалось связанным в депо, ч-вызвало его относительный дефицит и создало предрасположенность к стрессорнс вазоконстрикции и образованию язв в желудке (Elliott, Wallace, 1998). Не исключен что избыточное депонирование N0, возникающее при определенных условия может оказать неблагоприятное воздействие на резистентность организма стрессорным повреждениям. Таким образом степень депонирования NO следу*

принимать во внимание при разработав схем дозированной адаптации, применяемой в профилактических и лечебных целях.

Чтобы оценить особенности депонирования N0 и возможную защитную роль депо N0 у животных с врожденно сниженным уровнем продукции N0, продукцию и депонирование N0 при адаптации к гипоксии сравнивали у нормотензивных и спонтанно-гипертензивных крыс линий \*/КУ и БЬШЗР, соответственно. В этих экспериментах адаптацию к гипоксии использовали не только в качестве способа стимулирования синтеза и депонирования N0, но и как хорошо известное антигипертензивное средство (Обрезчшсова и др., 1997).

АД у бодрствующих крыс, измеренное до и после курса адаптации к гипоксии у 5НИ8Р в ходе развития гипертензии повышалось с 136±3 мм рт. ст. на ранней гипертензивной стадии до 216+7 мм рт. ст. на стадии сформировавшейся гипертензии. Адаптация существенно замедляла прирост АД у спонтанно-гипертензивных крыс и практически не оказывала влияния на давление у нормотензивных крыс 'Л'КУ. У взрослых ЗШ-БР, адаптированных к гипоксии, АД повысилось только до 156+3 мм рт. ст.

Эндотелийзависимое расслабление изолированной аорты у БНЯЗР на предгипертензивной стадии было несколько уменьшено по сравнению с WKY того же возраста (28,0+4,2% и 38,5+5,2%, соответственно, р<0,05). Адаптация к гипоксии не влияла на эндотелийзависимое расслабление аорты нормотензивных крыс. В то же время у гипертензивных крыс адаптация не только предупредила прогрессирующее уменьшение эндотелийзависимого расслабления, но даже в значительной степени нормализовала этот показатель.

Суточная экскреция с мочой нитратов и нитритов, отражающая суммарную продукцию N0 в организме, у ЭИКБР в возрасте 5-6 недель достоверно не отличалась от \УКУ. С возрастом, по мере формирования гипертензии у ЗНИБР происходило достоверное снижение продукции N0 (0,47±0,062 уб. с 0,17±0,023 мкмоль/сут., р<0,05), которого не наблюдалось у \УКУ (0,43+0,067 уз. с 0,32±0,060 мкмоль/сут., р>0,05). Адаптация к гипоксии достоверно увеличивала экскрецию штратоп и нитритов у крыс обеих линий, причем у адаптированных ЗНЛЗР этот юказатель практически не отличался от такового у \УКУ того же возраста.

Депо N0 в стенке аорты отсутствовало у всех неадаптированных МУКУ и шявлялось примерно у половины неадаптированных ЯНК^Р с развившейся ипертензией. Адаптация к гипоксии приводила к формированию депо N0 в стенке юрты у всех крыс, причем величина этого депо N0 была значительно больше у УКУ, чем у БИТ^Р (19,6+5,5 уб. 9,4+1,5, р<0,05). По-видимому, более интенсивное (епонирование N0 у крыс \ViCY может объяснить отсутствие у них гипотензивного (ействия адаптации к гипоксии (рис. 6).

Как адаптация к гипоксии, гак и введение донора N0 вызывают формирование ,епо N0 в стенках сосудов, однако донор N0, в отличие от адаптации, не вызывает всличения мощности МО-продуциругощих систем, которое необходимо для нормализации эндогелийзависимого расслабления сосудов. Поэтому можно

предполагать, что введение донора N0 будет сопровождаться только тем защитными эффектами, которые обусловлены непосредственно повышением уровн N0 и его депонированием. Для проверки этого предположения были поставлен] эксперименты с курсовым введением донора N0, в ходе которых были измерены т же параметры, что и в предыдущих сериях.

% расслаб- за лени» препарата И

20

15

10

5

О

0.9

*

в.

р [И!

□ WKY BSHRSR

До адаптации После адаптации

Рисунок 6. Влияние адаптации к гипоасми на д«локирование N0 у спонтанно-гилвртезианых крыс (линия SHRSP) и нориотаизнаных крыс (линия WKY) Звездочка- достоверное отлмив от показателя у неадаптированных «рис, р<0,05.

У SHRSP на стадии сформировавшейся шпертензии АД составляло 21б±7 мм рт. ст. После курсового введения ДНКЖ АД у этих крыс достоверно снизилось до 168117 мм рт. ст. (р<0,05). У нормотензивных крыс курсовое введение ДНКЖ . изменений давления практически не вызвало (124+3,2 vs. 113+2,5 мм рт. cr. до и после введений ДНКЖ, соответственно).

Эндотелийзависимое расслабление изолированной аорты у SHRSP в возрасте 14-15 недель составляло 20,6+2,3%. Курсовое введение ДНКЖ на этот показатель не повлияло; после окончания курса инъекций эндотелийзависимое расслабление составляло 18,3+5,3% (р>0,05).

Введение донора N0 приводило к формированию депо N0 в стенке аорты у крыс обеих линий, но, в отличие от адаптации к гипоксии, величина этого депо была практически одинаковой как у WKY, так и у SHRSP (20,6±7,0 vs. 22,5±7,5, р>0,05).

У SHRSP с развившейся стойкой гипертензией мы наблюдали, как и другие авторы (Borgonio et al., 1999), уменьшение эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижение выделения с мочой стабильных метаболитов N0. Это согласуется с литературными данными об ослаблении базальной активности и экспрессии белка eNOS в эндотелии сосудов (Wu, Yen, 1997).

Таким образом, при адаптации к гипоксии усиливается не только продукция N0 в организме, но и формирование депо N0 в стенке сосудов. При этом депонирование NO, по-видимому, нарастает быстрее, чем скорость его синтеза. Это позволяет, с одной стороны, связать избыток N0, синтезируемый ¡NOS в гладкой мышце сосудов

понтанно-гипертензивных крыс (Wu, Yen, 1997), и тем самым предупредить его овреждающее действие на клетки сосудов и eNOS, а, с другой стороны, создать в вдотелии "резерв" N0, который может компенсировать недостаточную активность NOS. Эффективность депонирования N0, как уже указывалось выше, по-видимому, етерминирована генетически. Поэтому тот факт, что у WKY, в отличие от SHRSP, ри адаптации к гипоксии, несмотря на усиление продукции N0, не происходит шскения давления, вероятно, можно объяснить более эффективным епонированием N0, чем у SHRSP.

В обобщенном виде связь между уровнем NO, депонированием N0 и ртериальным давлением для нормотензивных и спонтанно-гипертензивных крыс ¡охсет быть представлена следующим образом. Введение донора N0 или тимулирование эндогенного синтеза N0 приводит к повышению его уровня в рганизме. При этом часть избыточного N0 связывается в депо, а несвязанная часть Ю проявляет свое биологическое действие, вызывая вазодилатацию и снижение

При высокой эффективности депонирования количество связанного N0, т.е. ■бьем депо оказывается большим, а снижение АД незначительным. Эта ситуация ¡меет место у WKY. Напротив, при низкой эффективности депонирования остается (кого свободного N0, который оказывает более выраженное гипотензивное ¡ействие. Такую картину мы наблюдаем у SHRSP.

Исходя из перечисленных нарушений метаболизма N0 и NO-зависимых осудистых реакций, можно предположить, что в основе благоприятного действия даптации к гипоксии на продукцию N0 в организме, эндотелийзависимое послабление сосудов и артериальное давление лежат и другие механизмы, такие как ктивация eNOS (Hample et al., 1995) и увеличение экспрессии ее гена (Xue et al., 994), активация антиоксидантных ферментов (Меерсон и др., 1992; Sazontova et al., 994), усиление выведения из организма натрия и воды (Меерсон, 1993), снижение цренореактивности сосудов (Манухина и др., 1991), уменьшение структурного ампонента сосудистого бассейна (Кошслев и др., 1985) и т.д. Поскольку ормалнзадия давления в результате любого хронического гипотензивного лечения фаштчивает экспрессию ¡NOS и частично восстановливает активность eNOS Zlozel et al., 1991; Young et al., 1995; Wu, Yen, 1994), любой из этих механизмов ожет способствовать нормализации метаболизма N0.

Таким образом, формирование адаптации к гипоксии сопровождается стивацпей ряда взаимосвязанных механизмов, которые могут лежать в основе »ррегсции метаболизма NO, NO-зависимых нарушений сосудистого тонуса и АД. оскольку дефицит эндотелиального N0 играет важную роль в развитии не только гаертензии, но многих других сердечно-сосудистых заболеваний и патологических «тояиий, таких как атеросклероз, ишемическая болезнь сердца и сердечная ¡достаточность, диабетическая ангиопатия и др. (Marin, Rodriguez-Martinez, 1997), дотация к гипоксии может найти широкое применение для их лечения и юфнлактихи.

В отличие от адаптации к гипоксии, курсовое введение ДНКЖ, хотя i приводило к снижению АД у SHRSP, не оказывало нормализующего действия к; эндотелийзависимое расслабление сосудов. Это согласуется с описанными i литературе клиническими наблюдениями, о том, что даже эффективна) гипотензивная терапия, далеко не всегда нормализует функциональное состояни< эндотелия (Clozel et al., 1991). Это объясняется тем, что свободный N0 способ« оказывать гипотензивное действие, независимо от источника этого N0, тогда кш эндотелийзависимое расслабление обусловлено только эндогенным NO образующимся из L-аргинина в результате активации eNOS.

Таким образом, формирование депо N0 сопровождается развитием эффективной защиты от нарушений, связанных с недостаточной продукцией N0. № следующем этапе исследований была изучена возможная роль депо N0 i предупреждении повреждений, обусловленных гиперпродукцией N0.

В качестве модели повреждающего воздействия, вызывающего гшерпродукцию N0, был выбран тепловой шок. Поскольку адаптация к факторам среды применяется для профилактики состояний, связанных не только с недостатком, но и с избытком N0 (Малышев, Манухина, 1998), для защиты от гиперпродукции N0 использовали адаптацию к неповреждающим стрессорным воздействиям. Была изучена зависимость защитных эффектов адаптации от присутствия в стенке сосудов депо N0.

Тепловой шок приводил к падению АД у неадаптированных животных с 111±6 до 81±3 мм рт.ст. У адаптированных крыс АД после теплового шока практически не отличалось от контроля. Курсовое введение L-NNA во время адаптации полностью отменяло ее защитный эффект. Ингибитор NO-синтазы при курсовом введении несколько ограничивал падение давления после теплового шока (до 94±5 мм рт.ст.) (рис.7).

Смертность крыс от теплового шока у неадаптированных животных составляла 57%, а у крыс, прошедших адаптацию к стрессу, она достоверно снизилась до 8%. У животных, прошедших адаптацию на фоне ингибитора NO-синтазы L-NNA, смертность достоверно не отличалась от контроля. При этом само по себе курсовое введение L-NNA не влияло на показатель смертности (рис.7).

Депо N0 у животных, перенесших тепловой шок, обнаруживалось пс расслаблению изолированной аорта в ответ на ДЭТК, составлявшему 7,6±3,3% Препараты, взятые у животных, прошедших полный курс адаптации i иммобилизационному стрессу, отвечали на ДЭТК расслаблением, которое было в 2,i раза больше, чем после первого сеанса адаптации (9,7±2,96% и 23,7±4,17% соответственно). Таким образом, объем депо N0 значительно нарастал в процессе адаптации. Если на фоне адаптации животным вводился ингибитор NO-синтазы, тс депо N0 не формировалось.

У неадаптированных животных, предварительно получивших курс инъекщн ДНКЖ, смертность от теплового шока, как и после адаптации, составила 8%. Сам гн себе курс ДНКЖ не вызвал достоверных изменений артериального давления, но :

значительной степени предупредил развитие острой гипотензии при тепловом шоке. Внутривенное введение донора N0, как и адаптация, вызывало формирование депо N0 в стенке аорты, которое составляло 10,88+1,67%.

4 5

Рисунок 7. Влияние адаптации, донора N0 и ингибитора ЫО-синтазы на показатели артериального давления (А) и выживаемости животных (В) после теплового шока.

A) По оси ординат • давление в мм рт. ст. Серые столбики - до теплового шока. Черные столбики - после теплового шока. 1 ■ Контроль. 2 - Адаптация к стрессу. 3 - Курсовое

ведение 1-ЫМА. 4 - Адаптация к стрессу на фоне курсового введения 1_-ША. 5 -Внутривенное введение донора N0.

* - Достоверность эффекта теллозого шока, Р<0,05.

B) Серый сектор - процент выживших животных, белый сектор - процент погибших животных. 1-Контроль. 2 - Адаптация к стрессу. 3 - Курсовое введение 1-ММА. 4 -Адаптация к стрессу нэ фоне 1-ММА. 5- Инъекция донора N0.

Тот факт, что адаптация к стрессу эффективно защищала животных от гиперпродукции N0, наводит на мысль о возможном увеличении мощности N0-депоннрующих систем, т.е. потенциальной «емкости» депо N0 в процессе

адаптации. Для проверки этого предположения препараты, выделенные у адаптированных и неадаптированных животных, инкубировали в одинаковых условиях с донором N0, а затем оценивали объем сформировавшегося депо NO. У препаратов неадаптированных животных ответ на ДЭТК после инкубации с донором составлял 10,48±2,76%. Препараты, выделенные у адаптированных животных, после инкубации с ДНКЖ отвечали на ДЭТК расслаблением величиной 47,9±10,6%, т.е. почти в 5 раз более сильным, чем препараты неадаптированных животных.

Таким образом, в результате адаптации способность сосудистой стенки к связыванию N0 в депо значительно увеличилась.

Применение в наших экспериментах адаптации к периодическим стрессорным воздействиям было обусловлено тем, что она закономерно приводит к увеличению продукции N0 в организме (Meerson et al., 1994; Маленюк и др., 1998). При этом такая адаптация, в отличие от теплового шока, не оказывает повреждающего действия, а напротив, обладает широким спектром прямых и перекрестных защитных эффектов (Меерсон, Пшенникова, 1988). Поэтому было важно выяснить, формируется ли при такой адаптации депо N0, которое потенциально могло бы играть роль в ее защитных эффектах. Действительно, оказалось, что адаптирующие врздействия стимулируют образование депо N0, причем величина депо нарастает по мере развития адаптации. При этом ингибитор NO-синтазы, вводившийся перед каждым сеансом адаптации в невазоактивных дозах, предупреждал образование депо.

Запасание избытка N0 путем депонирования является, по-видимому, адаптивной реакцией, которая обеспечивает защиту организма от нарушений, связанных как с избытком, так и с дефицитом N0. Действительно, известно, что , предварительное повышение уровня NO в организме, вызванное адаптацией к стрессу или введением донора NO, эффективно предупреждает гиперпродукцию N0 и сопутствующие сердечно-сосудистые нарушения при тепловом шоке (Манухина и др., 1997), а предварительный тепловой шок ограничивает повреждающее действие липополисахаридов, опосредованное гиперпродукцией NO (Hauser et al., 1996). С другой стороны, установлено, что адаптирующие воздействия, которые повышают продукцию N0 в организме, как, например, физическая тренировка, оказывают стойкое гипотензивное действие (Tanaka et al., 1997).

В последнее время появляется все больше данных о том, что защитные эффекты адаптации к факторам среды опосредованы повышением продукции N0 в организме. Поэтому их удается воспроизвести с помощью экзогенных источников NO (Маленюк и др., 1998; Малышев и др., 1998; Манухина и др., 1997). При этом особый интерес представляет тот факт, что защитные эффекты доноров N0 сохраняются в течение длительного времени после возвращения уровня N0 к контрольному (Малышев и др., 1998). В основе этого явления могут лежать два наиболее вероятных взаимосвязанных механизма. Во-первых, при повышении концентрации N0 может происходить его запасание в клетках в виде относительно стабильного депо, которое при необходимости может служить дополнительным

догенным источником NO. В этом случае N0 будет оказывать прямое защитное йствие. Во-вторых, защитное действие N0 может быть опосредовано N0-дуцированным синтезом протекторных факторов, которые обеспечивают ставленные защитные эффекты. К числу таких факторов относятся белки готового шока (Malyshev et al., 1995), простагланидины (Uno et al., 1997), тиоксидантные ферменты (Nunoshiba et al., 1993). Этот механизм не исключает зможность индукции синтеза подобных факторов оксидом азота, ювобождающимся из депо.

Главный результат, полученный в наших экспериментах, состоял в том, что ¿звитие защитных эффектов адаптации был о тесно связано с формированием депо О в стенке сосудов, объем которого закономерно возрастал в процессе адаптации, гйствительно, курсовое введение L-NNA, которое ограничивало активацию N0-[нтазы, препятствовало как формированию защитных эффектов адаптации, так и (путствующему депонированию N0 в сосудистой стенке. С другой стороны, ¡едение донора N0, вызывавшее образование депо, полностью воспроизводило )фекты адаптации. Защитный эффект донора N0 нельзя объяснить его ¡посредственным действием, поскольку время распада ДНКЖ в организме нвотного после внутривенного введения составляет для использованной нами дозы 5 более 3—5 часов, а эффект этого введения как на выживаемость животных после ялового шока, так и на синтез эндогенного N0 сохраняется не менее суток Агнухина н др., 1997). Таким образом фармакологическое модулирование процесса шокирования N0 с помощью доноров N0 и ингибиторов NO-синтазы может «производить или ограничивать развитие устойчивости организма к эвреждающим факторам.

Механизм защитного действия депо N0 может быть связан либо,с ограничением ггивности и/или экспрессии NO-синтазы при тепловом шоке по механизму рицательной обратной связи (Assreuy et al., 1993), либо с удалением избытка ггивного N0. По-видимому, такой компенсаторный механизм предназначен не шько для защиты организма при острых воздействиях, сколько для )едупреждения токсического действия избытка NO, который образуется в процессе [аптации.

Полученные в настоящей работе данные позволяют предположить, что имулом для депонирования N0 в сосудистой стенке служит любое воздействие, >Еышающее уровень NO в организме. В этом случае любое такое воздействие >лжно предупреждать гиперпродукцию N0 и связанные с ней нарушения, гйствительно, как указывалось выше, тепловой шок, который использовался в шей работе в качестве повреждающего фактора, также является стимулом для понирования N0. В то же время имеются данные, что предварительный тепловой эк может защищать клетки от цитотоксического действия избытка NO (Wong et al., 95).

Изучение механизмов депонирования N0 и физиологической роли депо N0 в ганизме практически тольхо начинается. Данные, полученные к настоящему

времени, свидетельствуют о том, что способность к депонированию N0, как мощность ЫО-продуцирующих систем, генетически детерминирована. Люб повышение уровня N0 в организме сопровождается депонированием его избытка сосудистой стенке. С одной стороны, связывание избытка »0 в депо защищг организм от его цитотрксического и чрезмерного вазодилататорного действия, другой стороны, депо N0 может служить резервом N0, который будет использов организмом в случае необходимости. По-видимому, формирование и распад де; N0 может играть роль в предупреждении нарушений, связанных как с избытком, т и с дефицитом N0, что ставит вопрос о необходимости изучения возможное направленного модулирования этого процесса.

Выводы

1. Депо N0, сформировавшееся в стенке сосуда в виде КОсодержацц комплексов в условиях целого организма, выявляется по реакции релакеащ изолированного сосуда крысы в ответ на диэтилдитиокарбамат натрия (ДЭТК) условиях блокады эндогенного синтеза N0. В основе этой реакции лежит активащ растворимой гуанилатциклазы под действием N0, высвобождающегося из депо.

. 2. Формирование депо N0 в сосудах животных происходит в результат повышения уровня N0 в организме, вызванного активацией его синтеза ил введением экзогенного N0 в виде донора. Сформировавшееся депо КО мож( сохраняться в течение нескольких суток.

3. Депо N0 локализуется в интактном эндотелиальном слое стенки сосуда, условиях нарушения целостности эндотелия депо N0 может формироваться гладкой мышце стенки сосуда.

4. Адаптация к периодической гипобарической гипоксии эффективп стимулирует синтез N0 в организме, что проявляется в постепенном увеличени концентрации нитритов и нитратов в плазме крови и моче крыс. Одновременно стенке кровеносных сосудов происходят формирование и нарастание в объеме дел N0. Объем депо положительно коррелирует с суммарным содержанием нитритов нитратов в плазме, независимо от генетически детерминированного уров» продукции N0.

5. У крыс линии Август, имеющих более высокий геиетическ детерминированный уровень продукции N0, эффективность депонирования N0 стенке сосудов при адаптации к гипоксии выше, чем у крыс линии Вистар.

6. У спонтанно-гипертензивных крыс линии БНкБР, имеющих снижении уровень продукции N0 по сравнению с нормотензивными крысами линии \iVK1 объем депо N0, формирующегося в результате адаптации к гипоксии, меньше, чем >МСУ. Менее эффективное связывание N0 в депо у крыс вНИЯР сопровождает? выраженным гипотензивным действием и усилением зндотелийзависимо! расслабления сосудов, которого не наблюдается у '^КУ. Гипотензивный эффез адаптации успешно воспроизводится курсовым введением донора N

шитрозильного комплекса железа (ДНКЖ), который, как и адаптация, вызывает армирование депо N0.

7. Формирование депо N0 в ходе адаптации к стрессу сопровождается ¡фекгивной защитой организма от нарушений, вызванных гиперпродукцией N0 >и тепловом шоке. Частичное ингибирование NO-синтазы во время адаптации )епятствует как депонированию N0 в сосудистой стенке, так и развитию ¡аптацнонной защиты. Курсовое введение донора NO ДНКЖ, вызывающее ¡разование депо, полностью воспроизводит защитный эффект адаптации. В зоцессе адаптации происходит увеличение потенциальной способности сосудов к тонированию N0.

8. Депонирование N0 играет важную роль в защите организма от нарушений, язанных как с дефицитом, так и с избытком NO.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Депонирование оксида азота в кровеносных сосудах in vivo. // Роль данооксида азота в процессах жизнедеятельности. - Минск, Полибиг, 1998. - С. 147-149. (соавт. Ваинн А.Ф., Малышев И.Ю., Покидышев Д. А., Манухина Е.Б.)

2. Оксид азота как фактор защиты организма при экстремальных состояниях. И Роль монооксида азота в процессах жизнедеятельности. II Минск, Толибиг, 1998. - С. 203-205. (соавт. Манухина Е.Б., Покидышев Д.А., Малышев 1.Ю., Микоян В.Д., Кубрина Л.Н., Ванин А.Ф.)

3. Vasodilator activity of the mixture of N-methyl-D-glucamine lithyocarbamate and its mononithrosyl iron complex. // Biochemestry and Molecular tiology of Nitric Oxide. University of California. - Los Angeles, 1998. P. 129. (соавт. Данухина Е.Б., Сереженьков B.A., Микоян В.Д., Ванин А.Ф.)

4. Possible pathways of Fe2+-N-methyl-D-glucamine dithyocarbamate omplexes. II Biological Chemistry and Cellular Targets of Nitric Oxide. RESOWI enter, Karl-Fnmzens-University Graz. - Austria. - 1998. P.63. (соавт. Манухина Е.Б., 'ереженьков B.A., Ванин А.Ф.)

5. Manukhina Е.В., Pokidyshev D.A., Malyshev I.Yu., Mikoyan V.D., Kubrina .N., Vasiin A.F. Formation of nitric oxide store can underlie delayed protective effects. In: Biological Chemistry and Cellular Targets of Nitric Oxide. RESOWI Center, Karl-ranzens-University Graz, Austria, 1998, p. 108. (соавт. Покидышев Д.А., Малышев .Ю., Кубрина Л.Н., Манухина Е.Б., Микоян В.Д, Ванин А.Ф.)

6. Продукция и депонирование оксида азота при адаптации к гипоксии. // звестия РАН. Серия биологическая. - 1999. - № 2. - С. 211-215. (соавт. анухина Е.Б., Малышев И.Ю., Машина С.Ю., Салтыкова В. А., Ванин А.Ф.)

7. Nitric oxide storage as a factor of adaptive defense. // Microbial and Cellular stems for Pharmacology, Biotechnology, Medicine and Environment Moscow liversity and INTAS Secretariat. Moscow, Dialogue-MSU, 1999. P. 16-17. (соавт.

Вшухина Е.Б., Малышев И.Ю., Покидышев Д.А., Кубрина Л.Н., Микоян В.Д.,

Ванин А.Ф.)

8. Production and storage of nitric oxide in adaptation to hypoxia: a possible contribution to adaptive defense. // Nitric Oxide: From Molecular Level to Clinical Application. Bratislava. - 1999. - p. 28. (соавт. Манухина Е.Б., Машина С.Ю., Малышев И.Ю.)

9. Депонирование оксида азота в кровеносных сосудах in vivo. // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1999. - Т. 127. - Ка 6. - С. 629-632 (соавт. Ванин А.Ф., Малышев И.Ю. Покидышев Д. А., Манухина Е.Б.)

10. Production and storage of nitric oxide in adaptation to hypoxia. // Nitric Oxide: Biology and Chemistry. - 1999. - V. 3. - № 5. - P. 393-401. (соавт. Манухина Е.Б., Машина С.Ю., Малышев И.Ю., Салтыкова В. А., Ванин А.Ф.)

11. Продукция и депонирование оксида азота при адаптации к гипоксии: возможная роль в адаптационной защите. // Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция. Материалы Второй Всероссийской конференции. БЭБиМ, 1999. - С. 46. (соавт. Манухина Е.Б., Машина С.Ю., Пшенникова М.Г., Малышев И.Ю., Ванин А.Ф.)

12. Влияние адаптации к гипоксии на язвообразование в желдукс при стрессе у крыс разных генетических линий и роль оксида азота в этом процессе. // Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция. Материалы Второй Всероссийской конференции. БЭБиМ, 1999. - С. 62. (соавт.Пшеннюсова М.Г., Бондарснко О.Н., Шимковнч М.В., Малышев И.Ю., Манухина Е.Б.)

. 13. Role of nitric oxide in adaptation to hypoxia and adaptive defense. // Physiol. Res. - 2000. - V. 49. - P. 89-97. (соавт.Манухина Е.Б., Машина С.Ю., Лямина Н.П., Сенчихян В.Н., Ванин А.Ф., Малышев И.Ю.)

14. Депонирование оксида азота у крыс разных генетических линий и его роль в антистрессорном эффекте адаптации к гипоксии. // Российский физиол. журнал им. И.М.Сеченова. - 2000. - Т. 86. - № 2. - С. 174-181. (соавт. Пшенникова М.Г., Бондаренко О.Н., Малышев И.Ю., Манухина Е.Б.)

15. Роль оксида азота в антипшертензивном эффекте адаптации к гипоксии. И Физиологический журнал. - 2000. - Т. 46. - № 2 (приложение). - С. 3233. (соавт. Манухина Е.Б., Машина С.Ю., Покидышев Д.А., Лямина Н.П., Сенчихян В.И., Малышев И.Ю.)

16. Депонирование оксида азота как фактор адаптационной защиты. // Российский физиол. журнал им. ИМ.Сеченова. - 2000. - Т. 86. - № 4. - С. 447-454. (соавт.Покидышев Д.А., Малышев И.Ю., Ванин А.Ф., Манухина Е.Б.)

17. Роль оксида азота в антипшертензивном эффекте адаптации к гипоксии. И Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы (экспериментальные и клинические аспекты). II Всероссийский Конгресс по патофизиологии. - М. - 2000. - С. 194-195. (соаэт. Манухина Е.Б., Машина С JO., Покидышев Д. А., Лямина Н.П., Сенчихин В.Н.)

18. Гипоксия и оксид азота. // Вестник РАМН. - 2000. - № 9. - С. 44-48. (соавт.Малышев И.Ю., Монастырская Е.А., Манухина Е.Б.)

19. Коррекция КЮ-зависимых сердечно-сосудистых нарушений с помощью дотации к гипоксии. // Российский физнол. журнал им. И.М. Сеченова. - 2001. -. 87. - № 1. - С. 110-117. (соавт. Машина С.Ю., Малышев И.Ю., Лямина Н.П., енчихнн В.Н., Покидышев Д.А., Манухина Е.Б.)

20. Роль предупреждения дефицита оксида азота в антигипертензивном 5>фекте адаптации к гипоксии. // Известия РАН. Серия биологическая. - 2001. -2 5. - С. 593-601. (соавг. Машина С.Ю., Покидышев Д.А., Малышев И.Ю., ямина Н.П., Сенчихин В Л., Марков Х.М., Манухина Е.Б.)

21. Оксид азота и адаптация к гипоксии. // Физиологический журнал. -001. - Т. 47. - № 1 (часть 2) - С. 28-35. (соавт. Манухина Е.Б., Машина С.Ю., [окидышев ДА., Малышев И.Ю.)

Оксид азота (N0) является важнейшим фактором-регулятором многих процессов, протекающих в организме. N0 представляет собой лабильную, короткоживущую молекулу свободнорадикальной структуры. Эта молекула может стабилизироваться, что позволяет ей выполнять не только паракринные, но и аутокринные функции. Стабилизация молекулы N0 происходит путем включения последней в динитрозильные комплексы железа с тиоловыми лигандами или S-нитрозотиолы, которые могут в дальнейшем постепенно высвобождать N0. Таким образом, эти комплексы являются физиологически активным депо N0 в тканях (3).

В предыдущих исследованиях было показано, что формирование депо N0 происходило в результате продолжительной инкубации культуры клеток или изолированного сосуда с донорами N0, т.е. соединений, спонтанно высвобождающих N0, предшественником N0 L-аргинином или с индукторами NO-синтазы, такими как бактериальные липополисахариды (3, 135, 138). В культурах клеток это депо N0 удавалось выявить, применяя метод электронного парамагнитного резонанса (138). Была показана возможность визуализации NO-депонирующих комплексов в стенке сосудов с использованием гистохимического окрашивания препаратов (63). В препаратах изолированных сосудов депо N0 выявлялось по реакции вазорелаксации в ответ на препараты или факторы, разрушающие это депо с выделением свободного N0 -диэтилдитиокарбамат натрия (ДЭТК) или N-ацетилцистеин (136,137), - и под воздействием ультрафиолетового излучения (125, 126).

Таким образом, была показана возможность формирования и выявления депо N0 в условиях in vitro. Однако возможные механизмы и физиологическая роль депонирования N0 в целом организме остались неизученными. Поэтому представляет интерес демонстрация возможности формирования депо NO in vivo, причем не только в результате действия химических агентов, но и под влиянием нефармакологических факторов. Имеются данные, которые позволяют предположить, что депо N0 формируется при повышении концентрации N0 во внеклеточной среде или клетке. В экспериментах для повышения уровня N0 в организме в качестве фармакологических методов наиболее часто применяется введение доноров N0, липополисахаридов или L-аргинина (3, 94), а в качестве нефармакологических - тепловой шок (17) или дозированная адаптация организма к факторам среды, таким как стресс (124) или физическая нагрузка (15). Однако до настоящего времени не удавалось выявить депо N0, сформировавшееся в этих условиях in vivo в связи с недостаточной чувствительностью используемых для этого методов.

Известно, что умеренное повышение уровня N0 в организме сопровождается защитными эффектами, обеспечивающими устойчивость организма к повреждающим воздействиям. Развитие таких защитных эффектов наиболее характерно для дозированной адаптации к факторам среды. При этом было показано, что ингибиторы синтеза N0 препятствуют адаптационной защите, тогда как доноры N0 ее успешно воспроизводят (11). Защитные эффекты, обусловленные транзиторным повышением N0 в результате введения донора N0 или стимулирования эндогенного синтеза N0, могут сохраняться даже после возвращения N0 к исходному уровню (10). Такая долговременная NO-зависимая защита может быть связана либо с тем, что N0 индуцирует синтез вторичных протекторных факторов, например, белков теплового шока (114), либо с образованием депо N0, которое при необходимости может служить дополнительным эндогенным источником N0. Однако физиологическое значение депонирования N0 и возможность участия депонированного N0 в защите организма от повреждающих воздействий до сих пор не изучалась.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении условий и механизмов формирования депо NO in vivo, а также его возможной физиологической роли.

В рамках поставленной цели решались следующие задачи:

1. Разработать способ выявления in vitro депо NO, сформировавшееся в стенке сосудов in vivo в результате повышения уровня N0, вызванного введением донора N0, тепловым шоком или адаптацией организма к факторам среды. Изучить локализацию, динамику образования и распада депо N0 в стенке сосуда.

2. Изучить соотношение между объемом депо N0 в стенке сосуда и концентрацией конечных стабильных метаболитов N0 — нитритов и нитратов в плазме крови.

3. Изучить особенности и закономерности депонирования N0 у животных с различным врожденным уровнем синтеза N0.

4. Изучить роль депо N0 в повышении устойчивости организма к нарушениям, связанным как с избытком так и с дефицитом N0.

Научная новизна исследования определяется следующими основными результатами.

Впервые продемонстрирована возможность выявления и оценки ¡n vitro истощаемого депо N0, сформировавшегося в стенке кровеносных сосудов in vivo при воздействиях, повышающих уровень N0 в организме. В отсутствие повышения уровня N0 депо N0 не выявляется. Депо N0 выявляется по реакции расслабления изолированного сосуда под действием диэтилдитиокарбамата, разрушающего это депо с выделением свободного N0. Реакция расслабления опосредована активацией растворимой гуанилатцикпазы.

Установлено, что депо N0 локализуется преимущественно в эндотелиальном слое стенки сосуда. При повреждении эндотелия депонирование N0 может происходить в сосудистой гладкой мышце.

Формирование депо NO как в изолированном сосуде, так и в условиях целого организма происходит при любом повышении уровня N0, соответственно, в среде инкубации или плазме крови независимо от причины, вызвавшей это повышение. В частности, формирование депо N0 продемонстрировано при введении донора N0, тепловом шоке и дозированной адаптации организма к факторам среды.

В процессе адаптации животных к периодической гипобарической гипоксии происходит постепенное увеличение концентрации в плазме стабильных метаболитов N0 нитратов и нитритов, которая является показателем суммарного синтеза N0. Активация синтеза N0 сопровождается формированием и закономерным увеличением депо N0 в стенке сосудов. При этом между объемом депо N0 и уровнем нитритов и нитратов имеется достоверная прямая корреляция. Исходя из соотношения между этими двумя величинами был разработан и введен показатель эффективности депонирования N0.

Впервые показано, что у крыс линии Август, которые характеризуются врожденно более высоким уровнем базального и стимулированного синтеза N0 эффективность депонирования N0 при адаптации к гипоксии значительно выше, чем у крыс линии Вистар.

Получены принципиально новые данные о роли депонирования N0 в защите организма от сердечно-сосудистых нарушений, связанных как с дефицитом, так и с избытком N0. Установлено, что антигипертензивный эффект адаптации к гипоксии у спонтанно-гипертензивных крыс линии вЫГ^Р, характеризующихся выраженным дефицитом эндотелиального N0, сопровождается формированием депо N0 в сосудистой стенке. Этот антигипертензивный эффект с сопутствующим образованием депо N0 воспроизводится курсовым введением донора N0 — динитрозильного комплекса железа (ДНКЖ). Защита от вызванной тепловым шоком гиперпродукции N0, которая наблюдалась при адаптации к стрессу, также была тесно связана с формированием депо N0 в стенке сосудов в ходе адаптации. Частичное ингибирование ЫО-синтазы во время адаптации препятствовало как формированию защитного эффекта, так и сопутствующему депонированию N0 в сосудистой стенке. С другой стороны, введение донора N0 ДНКЖ, вызывавшее образование депо, полностью воспроизводило защитный эффект адаптации. В процессе адаптации происходит увеличение "емкости" депо N0, т.е. потенциальной способности ткани к депонированию N0, которая оценивалась в условиях инкубации изолированного сосуда с донором N0.

Теоретическое значение работы определяется тем, что в ней впервые продемонстрирована и обоснована возможность выявления и оценки депо N0, сформировавшегося в условиях целого организма и показана физиологическое значение депонирования N0 для защиты сосудистой системы от повреждающих воздействий.

Практическое значение работы определяется тем, что в ней показана возможность направленного модулирования процесса депонирования N0 с целью повышения устойчивости организма к повреждающим факторам.

Положения, выносимые на защиту.

1. При воздействиях, повышающих уровень N0 в организме, в эндотелии кровеносных сосудов образуется физиологически активное депо N0, которое может быть выявлено на изолированном сосуде. Между объемом депо N0 и концентрацией стабильных метаболитов N0 в плазме крови имеется достоверная прямая корреляция.

2. Эффективность депонирования N0 в стенке сосудов связано с генетически детерминированной мощностью NO-продуцирующих систем.

3. Депонирование N0 играет важную роль в формировании устойчивости организма к повреждениям, вызванным как дефицитом, так и гиперпродукцией N0

Апробация диссертации. Основные результаты проведенных исследований были представлены на Конференции с международным участием «Роль монооксида азота в процессах жизнедеятельности» (Минск, Беларусь, 1998), Международном конгрессе «Biochemestry and Molecular Biology of Nitric Oxide» (Лос-Анжелес, США, 1998), Международном симпозиуме «Biological Chemistry and Cellular Targets of 8

Nitric Oxide» (Грац, Австрия, 1998), объединенной конференции МГУ и Секретариата INTAS «Microbial and Cellular Systems for Pharmacology, Biotechnology, Medicine and Environment» (Москва, 1999), международном симпозиуме "Nitric Oxide: From Molecular Level to Clinical Application". (Братислава, Словакия, 1999), конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 1999), II Всероссийском Конгрессе по патофизиологии (Москва, 2000), III Национальном конгрессе патофизиологов Украины (Киев, Украина, 2000), XVIII Съезде физиологов России (Казань, 2001), Национальной научно-практической конференции с международным участием «Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека» (Смоленск, 2001).

ВЫВОДЫ

1. Депо N0, сформировавшееся в стенке сосуда в виде 1\Ю-содержащих комплексов в условиях целого организма, выявляется по реакции релаксации изолированного сосуда крысы в ответ на диэтилдитиокарбамат натрия (ДЭТК) в условиях блокады эндогенного синтеза N0. В основе этой реакции лежит активация растворимой гуанилатциклазы под действием N0, высвобождающегося из депо.

2. Формирование депо N0 в сосудах животных происходит в результате повышения уровня N0 в организме, вызванного активацией его синтеза или введением экзогенного N0 в виде донора. Сформировавшееся депо N0 может сохраняться в течение нескольких суток.

3. Депо N0 локализуется в интактном эндотелиальном слое стенки сосуда. В условиях нарушения целостности эндотелия депо N0 может формироваться в гладкой мышце стенки сосуда.

4. Адаптация к периодической гипобарической гипоксии эффективно стимулирует синтез N0 в организме, что проявляется в постепенном увеличении концентрации нитритов и нитратов в плазме крови и моче крыс. Одновременно в стенке кровеносных сосудов происходит формирование и нарастание в объеме депо N0. Объем депо положительно коррелирует с суммарным содержанием нитритов и нитратов в плазме, независимо от генетически детерминированного уровня продукции N0.

5. У крыс линии Август, имеющих более высокий генетически детерминированный уровень продукции N0, эффективность депонирования N0 в стенке сосудов при адаптации к гипоксии выше, чем у крыс линии Вистар.

6. У спонтанно-гипертензивных крыс линии ЭНКвР, имеющих сниженный уровень продукции N0 по сравнению с нормотензивными крысами линии \Л/КУ, объем депо N0, формирующегося в результате адаптации к гипоксии, меньше, чем у \Л/КУ. Менее эффективное связывание N0 в

100 депо у крыс ЭИКЭР сопровождается выраженным гипотензивным действием и усилением эндотелийзависимого расслабления сосудов, которого не наблюдается у У\1КУ. Гипотензивный эффект адаптации успешно воспроизводится курсовым введением донора N0 динитрозильного комплекса железа (ДНКЖ), который, как и адаптация, вызывает формирование депо N0.

7. Формирование депо N0 в ходе адаптации к стрессу сопровождается эффективной защитой организма от нарушений, вызванных гиперпродукцией N0 при тепловом шоке. Частичное ингибирование КЮ-синтазы во время адаптации препятствует как депонированию N0 в сосудистой стенке, так и развитию адаптационной защиты. Курсовое введение донора N0 ДНКЖ, вызывающее образование депо, полностью воспроизводит защитный эффект адаптации. В процессе адаптации происходит увеличение потенциальной способности сосудов к депонированию N0.