Автореферат и диссертация по медицине (14.01.16) на тему:Биологические свойства возбудителя и оптимизация этиологической диагностики туберкулезного спондилита

На правах рукописи

Соловьева Наталья Сергеевна

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВОЗБУДИТЕЛЯ И ОПТИМИЗАЦИЯ ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО СПОНДИЛИТА

14.01.16 - Фтизиатрия 03.02.03 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005568156

2 9 АПР 2015

Санкт-Петербург 2015

005568156

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмоноло-гии» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук Олейник Владимир Васильевич, заведующий отделением хирургии туберкулеза позвоночника ФГБУ «СПб НИИФ» Минздрава России доктор медицинских наук, профессор Нарвская Ольга Викторовна, заведующая лабораторией молекулярной микробиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Официальные оппоненты:

Пантелеев Александр Михайлович - доктор медицинских наук, профессор кафедры социально-значимых инфекций Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Смирнова Татьяна Геннадьевна - кандидат медицинский наук, старший научный сотрудник отдела микробиологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза федерального агентства научных образований

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится 17 июня 2015 года в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 208.092.01 при ФГБУ «СПб НИИФ» Минздрава России (191036, г. Санкт- Петербург, Литовский пр., д. 2/4, тел. (812) 579-25-54).

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке и на официальном сайте ww.spbniif.rn ФГБУ «СПб НИИФ» Минздрава России (191036, Санкт-Петербург, Литовский пр., д. 2-4, тел. (812) 579-25-87).

Автореферат разослан «

»

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Актуальность темы исследования.

Туберкулез - хроническое инфекционное заболевание, характеризующееся многообразием клинических проявлений. Статистические показатели за 2012 г. свидетельствуют об улучшении эпидемической ситуации по туберкулезу в РФ в сравнении с 2011 г.: регистрируемая заболеваемость туберкулезом снизилась на 6,7% и составила 68,1 на 100 тыс. населения. Показатель заболеваемости внелегочным туберкулезом (ВТ) в 1992-2001 гг. оставался стабильным, составляя 3,3-3,5 на 100 тысяч населения. С 2003 г. заболеваемость ВТ ежегодно уменьшалась и достигла 2,2 на 100 тысяч населения в 2012 г.

На фоне снижения показателей заболеваемости доля впервые выявленных больных с поражением костей и суставов, составлявшая 23,1% в структуре ВТ в 1995-2006 гг. (Картавых А. А. и др., 2009), с 2010 г. увеличилась до 33,1% и впервые превысила таковую при других локализациях ВТ (Кульчавеня Е.В. и др., 2010; Туберкулез в Российской Федерации, 2011, 2013). Вместе с тем отмечен рост частоты лекарственной устойчивости (включая множественную лекарственную устойчивость, МЛУ) возбудителя ВТ: с 39,4 % в 1984-1998 гг. (Вишневский Б.И. и др., 1997, 1998; Огген Т.Ф. и др., 1997) до 59,3% в 2007 г. (Вишневский Б.И. и др., 2008).

В последние годы среди впервке выявленных пациентов значительно увеличилась (до 87%) доля больных костно-суставным туберкулезом (КСТ), диагностированным на поздних сроках заболевания (Лавров В.Н. и др., 2001; Хафизова З.Х. и др., 2008; Валиев Р.Ш. и др., 2011; Бурлаков С. В. и др., 2013). В России в структуре КСТ до 60% составляет туберкулезный спондилит (ТС), который характеризуется мультифокальными поражениями позвоночника и генерализацией процесса (Олейник В .В. и др., 2008; Кульчавеня Е.В. и др., 2009; Советова Н.А. и др., 2014), высокой частотой осложнений (абсцессы, свищи, деформации позвоночника, неврологические нарушения - до 80%) и инвалидизацией до 70-90% больных (Лавров В.Н. и др., 2001; Павлов Л.А. и др., 2010; Валиев Р.Ш. и др., 2011; Бурлаков С. В. и др., 2013).

Характеристике особенностей биологических свойств возбудителя КСТ посвящены единичные исследования небольших по объему выборок штаммов Mycobacterium tuberculosis (Вишневский Б.И. и др., 1998, 2006, 2008; Lai С. et al., 2011; Li С. et al., 2012; Suarez-Garcia I. et al., 2012; Zhang Z.et al., 2012).

Степень разработанности темы исследования.

В настоящее время в соответствии с положениями доказательной медицины обоснована необходимость внедрения в практику этиологической диагностики туберкулеза органов дыхания новых технологий культивирования и определения фенотипической лекарственной устойчивости (ФЛУ) микобактерий (автоматизированная система ВАСТЕС MGIT 960), методов анализа специфической ДНК и мутаций, ассоциированных с устойчивостью возбудителя к

противотуберкулезным препаратам (ПТП). Однако большинство работ, посвященных КСТ, касаются, в основном, клинико-эпидемиологических аспектов заболевания (Соколов Н.И. и др., 2006; Хафизова З.Х. и др., 2008; Картавых А. А. и др., 2009; Кульчавеня Е.В. и др., 2009; Тарасенко Л.Ю. и др., 2011; Вишневский А.А. и др., 2012; Нечаева О.Б., 2013; Tuli S., 2010; Garg R„ 2011; Rasouli M. et al., 2012). Вместе с тем, отсутствие единой методологии исследования операционного материала затрудняет сравнительную оценку эффективности классических и современных микробиологических, а также молекулярно-генетических методов этиологической диагностики КСТ (Merino Р. et al., 2012).

Проблема этиологической диагностики ТС затронута лишь в двух диссертационных работах российских исследователей. Так, в работе Е.Б. Вишневской (2000) основное внимание уделено разработке преаналитического этапа исследования костного материала методом ПЦР. Е.Ю. Камаев и др. (2013) оценивают возможность использования метода ПЦР в формате реального времени (ПЦР-РВ) для детекции ДНК М. tuberculosis в операционном и архивном гистологическом материале взрослых и детей с поражениями позвоночника, а также эффективность микробиологических методов в зависимости от фаз активности туберкулезного воспаления, определяемых при патоморфологическом исследовании.

Цель исследования - оптимизация этиологической диагностики туберкулезного спондилита на основе комплекса бактериологических и молекулярно-генетических методов исследования с учетом биологических свойств возбудителя.

Задачи исследования

1. Оценить эффективность микроскопического и культурального методов в этиологической диагностике туберкулезного спондилита.

2. Обосновать использование современных микробиологических технологий (автоматизированная система ВАСТЕС MGIT 960) и молекулярно-генетических методов в верификации диагноза туберкулезного спондилита.

3. Определить клиническую значимость результатов оценки лекарственной чувствительности и мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью возбудителя туберкулезного спондилита.

4. Изучить генотипическую принадлежность и оценить клиническую значимость штаммов М. tuberculosis различных генотипов, выделенных из операционного материала больных туберкулезным спондилитом.

Научная новизна

Впервые доказана высокая эффективность использования технологии MGIT и молекулярно-генетического исследования при выявлении, идентификации и определении лекарственной чувствительности возбудителя ТС. Впервые дана комплексная фенотипическая и генетическая характеристика лекарственной устойчивости штаммов M.tuberculosis, выделенных из операционного материала больных ТС. Получены новые знания о генотипической структуре популяции

возбудителя внелегочного туберкулеза, описаны новые сполиготипы M. tuberculosis и определена взаимосвязь с клиническими проявлениями специфического процесса.

Практическая значимость

Разработан преаналитический этап для комплекса культуральных и молекулярно-генетических методов исследования операционного материала. Проведена оценка информативности исследования различных видов операционного материала для этиологической диагностики ТС. Обоснована диагностическая эффективность автоматизированного метода культивирования в системе ВАСТЕС MGIT 960 и м.олекулярно-генетического исследования операционного материала. Обосновано применение тест-системы «ТБ-БИОЧИП» для экспресс-диагностики ЛУ на основе генетической характеристики возбудителя ТС. С учетом полученных данных разработан алгоритм этиологической диагностики туберкулезного спондилита. Представлены новые сполиготипы для депонирования в международной базе данных SITVIT.

Методология и методы исследования. Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение методов научного познания. Исследование проводилось на репрезентативной выборке. Предметом исследования явились возбудитель заболевания и методы этиологической диагностики ТС. Выявление возбудителя и изучение его биологических свойств проводили валидированными методами. Анализ научной литературы проведен на основе формально-логических методов исследования. Для статистического анализа данных использованы адекватные поставленным задачам методы прикладной статистики.

В анализ включены результаты слепого проспективного микробиологического исследования операционного материала из очагов деструкции позвоночника больных туберкулезом, проходивших лечение, в ФГБУ «Санкт-Петербургском НИИ фтизиопульмонологии» Минздрава России. Критерии включения в исследование: хирургическое вмешательство с января 2007 г. по декабрь 2011 г.; морфологически доказанный диагноз инфекционного спондилита. Из сплошной когорты оперированных были отобраны пациенты с морфологически подтвержденными диагнозами: «туберкулезный спондилит» (группа 1) - 359, «неспецифический остеомиелит позвоночника» (группа 2, контрольная) - 225 пациентов. Среди больных ТС жителями Санкт-Петербурга и Ленинградской области являлись 71 (19,7%) человек, 288 (80,3%) представляли другие регионы РФ. У 50 (13,9%) пациентов выявлена ВИЧ-инфекция, у 74 (20,6%) - вирусный гепатит В и/или С. Распространенные формы поражения позвоночника с вовлечением тел трех и более позвонков выявлены в 44,6% (160 чел.) случаев, мультифокальные поражения - 8,6% (31 чел.). Поражение грудного отдела позвоночника имели 39,3% (141 чел.), грудопоясничного - 20,3% (73 чел.), поясничного - 37,9% (136 чел.), шейного - 2,5% (9 чел.). Поражение только

позвоночника было у 134 (37,3%) пациентов. У 225 (62,7%) больных наблюдали сочетанное поражение органов, при этом процесс в легких был выявлен у 212 (94,2%) пациентов. Преобладали инфильтративные и диссеминированные формы туберкулеза легких - 58,1%.

Изучено 440 образцов операционного материала (гной/грануляции, костные фрагметы) пациентов группы 1 и 233 образца - группы 2. Материал гомогенизировали в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия, отмывали 2-3 раза фосфатным буфером в соотношении 1:1 (BBL MycoPrep Phosphate Buffer). Суспензию (0,5 мл) инокулировали в пробирку MGIT со средой Middlebrook 7Н9, содержащей антибактериальную (MGIT PANTA) и ростовую (MGIT Growth Supplement) добавки. В пробирки с плотными средами вносили 0,2 мл суспензии; 1-2 капли наносили на предметное стекло для люминесцентной микроскопии. Этап деконтаминации гомогенизированной пробы раствором BBL MycoPrep NALC-NaOH был исключен. Флюорохромные красители 0,1% аурамин О и 0,01% родамин С готовили согласно инструкции (Приказ № 1091). Результат микроскопии считали положительным при обнаружении не менее 3 кислотоустойчивых бактерий в 300 полях зрения. Для культивирования микобактерий использовали плотные яичные питательные среды Левенштейна-Иенсена и Финна-II (Приказ Лг°109) и сертифицированные наборы реагентов для работы с системой ВАСТЕС MGIT 960. На плотные среды засевали 440 и 233 образцов материала, в среду Middlebrook 7Н9 - 289 и 159 образцов материала пациентов групп 1 и 2 соответственно. Рост микобактерий на плотных средах учитывали в течение 10 недель (Приказ № 109). В системе ВАСТЕС MGIT 960 учитывали нарастание флуоресценции («ростовые единицы»): положительный результат >70 ед.; при меньшем значении по истечении 42 дней (максимальный срок наблюдения) проводили дополнительный цикл культивирования. Принадлежность культуры к М. tuberculosis-complex подтверждали с помощью микроскопии (окрашивание по Циль-Нильсену) и амплификации нуклеотидной последовательности IS6110 методом ПЦР в формате реального времени (ПЦР-РВ) на анализаторе iCycleriQ5, BioRad (США).

Чувствительность 158 культур М. tuberculosis к ПТП (рифампицину, изониазиду, стрептомицину, этамбутолу, пиразинамиду, этионамиду, офлоксацину, канамицину, амикацину, циклосерину, каприомицину, ПАСК) определяли непрямым методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена (Приказ №109) и модифицированным методом пропорций в среде Middlebrook 7Н9, ВАСТЕС MGIT 960. В случае устойчивости к одному из ПТП штаммы М. tuberculosis считали монорезистентными, двум и более препаратам - полирезистентными, одновременной устойчивости к рифампицину и изониазиду - мультирезистентными (МЛУ).

1 Здесь и далее: Приказ № 109 РФ от 21 марта 2003 г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации». - М., 2003. - 345 с

Широкую лекарственную устойчивость (ШЛУ) определяли как устойчивость штаммов М. tuberculosis кизониазиду, рифампицину, фторхинолонам и к одному из инъекционных ПТП - канамицину, амикацину или капреомицину.

ДНК М. tuberculosis-complex выделяли из суспензии (0,1 мл) материала: 268 (группа 1) и 121 (группа 2) с использованием набора "Амплитуб-РВ" "М-сорб-туб-2" (ООО «Синтол», Россия). Для выявления МЛУ возбудителя туберкулеза непосредственно в материале использовали тест-систему «ТБ-БИОЧИП» (№ ФС 03262004/0889-04) ИМБ РАН (Россия). Результаты ПЦР выявляли методом электрофореза в агарозном геле в системе документации гелей «GelDoc» (BioRad, США). Ампликоны Ш110 (309 п.н.), гроВ (212 п.н.), kalC (166 п.н.), in ИЛ (133 п.н.) и ahpC (126 п.н.) служили для получения одноцепочечных ПЦР-продуктов с одновременным введением в них флуоресцентной метки. Мутации в генах гроВ (устойчивость к рифампицину), katG, inhA и ahpC-oxyR (устойчивость к изониазиду) определяли в 181 образце исследуемого материала и соответствующих чистых культарах М. tuberculosis.

ДНК из чистых культур М. tuberculosis выделяли с использованием смеси SDS, протеиназы К и CTAB2/NaCL (Van Embden J. et al., 1993). Генотипирование 124 штаммов M. tuberculosis осуществляли методами сполиготипирования (Kamerbeek J. et al., 2997) и MIRU-VNTR (Supply P. et al., 2000, 2006) в лаборатории молекулярной микробиологии Федерального бюджетного учреждения науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера. Профили сполиготипирования сравнивали с имеющимися в локальной базе данных «Сполигопрофили Mycobacterium tuberculosis на Северо-Западе России» (свидетельство о государственной регистрации базы данных № 2014620898) и международной обновляемой базе данных cпoлигoтипиpoвaния/MIRU-VNTR-типиpoвaния SITVITWEB (URL: http://www.pasteur-euadeloupe.fr:80Sl/Srrvrr ONLINEA (Demay С. et al., 2012). Профили MIRU-VNTR-типирования no 12 и 24 локусам оценивали с помощью базы данных MIRU-VNTR-pfoi.

Методы статистической обработки. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета компьютерных программ EpiCalcv.1.02. и VassarStats. Оценку диагностической эффективности методов проводили путем расчета показателей чувствительности, специфичности, положительной и отрицательной прогностической ценности с использованием таблицы 2x2 для ввода данных. Чувствительность метода определяли как долю положительных результатов при исследовании материала больных ТС, специфичность - как долю отрицательных результатов при исследовании материала больных остеомиелитом нетуберкулезной природы (Altman D., Bland J., 1994). Результативность посева на питательные среды (эффективность питательной среды) определяли как долю культур М. tuberculosis, выросших на данной среде, от общего числа культур, выделенных на

всех исследуемых средах (Финн Э.Р., 1973; Дорожкова И.Р. и др., 2011). Расчеты относительных показателей различий между группами проводили с использованием таблиц сопряженности. Результаты представляли в виде «отношения шансов» (OR). Применяли критерии t и х2 Пирсона, вычисляли моду, медиану, средние значения, доверительный интервал. Значимыми считали различия при доверительном интервале 95% (р<0,05). Полученные данные представлены в виде таблиц. Для оценки вариабельности генетических локусов использовали индекс Хантера-Гастона (HGDI), который рассчитывали с использованием алгоритма (URL: http://www.hpa-bioinform). Связи между штаммами графически отображали с помощью филогенетического древа, построенного с учетом полиморфизма локусов MIRU-VNTR (URL: http://wwv.mim-vntrplus.org). Положения, выносимые на защиту

1. Посев на питательную среду Финна-II повышает выявляемость возбудителя туберкулеза в операционном материале из очагов костной деструкции.

2. ПЦР в формате реального времени и автоматизированная технология культивирования ВАСТЕС MGIT 960 эффективны в этиологической диагностике туберкулезного спондилита.

3. В популяции возбудителя туберкулезного спондилита значительна доля штаммов, обладающих МЛУ преимущественно за счет мутаций в генах гроВ Ser531 —»Leu и katG Ser315-*Thr.

4. В генетически неоднородной популяции возбудителя туберкулезного спондилита доминируют штаммы генотипа Beijing. Принадлежность к генотипу Beijing и МЛУ возбудителя ассоциированы с распространенной формой туберкулезного спондилита и генерализацией туберкулезного процесса.

Апробация результатов исследования. Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФГБУ «СПб НИИФ» Минздрава России (протокол № 8 от 23 декабря 2014 г.). Результаты и основные положения работы представлены на Российских и международных конференциях: «Междисциплинарные аспекты дифференциальной диагностики и лечения больных туберкулезом» (Москва, 2012); 1-й и 3-й Конгресс Национальной ассоциации фтизиатров (Санкт-Петербург, 2012, 2014); Конгресс по инфекционным болезням (Москва, 2013); 44th World Conference on Lung Health of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease (TheUnion) (Париж, Франция, 2013); Ежегодный Кейстонский симпозиум по молекулярной и клеточной биологии «Tuberculosis: Understanding the Enemy X8» (Вистлер, Канада,

2013); 23th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. ECCMID (Берлин, Германия, 2013); 45th World Conference on Lung Health of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease (Барселона, Испания,

2014).

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в практическую работу бактериологической лаборатории ФГБУ «СПб НИИФ»

Минздрава России с целью этиологической диагностики спондилитов инфекционной природы, в программы обучения учебного отдела ФГБУ «СПб НИИФ» Минздрава России (05.09.2014г.), кафедры фтизиопульмонологии ГБОУ ВПО СГМУ Минздрава России (г. Архангельск) (15.09.2014г.), и кафедры специализированной терапии и микробиологии, иммунологии и инфекционных болезней Института медицинского образования ФГБОУ ВПО НовГУ им. Ярослава Мудрого Минобрнауки России (г. Великий Новгород) (17.11.2014г.).

Публикации результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 22 научных работы, в том числе 5 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России. Зарегистрирован объект интеллектуальной собственности: база данных «Сполигопрофили Mycobacterium tuberculosis на Северо-Западе России» (свидетельство о государственной регистрации № 2014620898).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 124 страницах текста компьютерного набора к состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов работы и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 187 источников, из которых 71 -отечественные и 116 - иностранные. Текст диссертации иллюстрирован 29 таблицами и 2 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Эффективность микроскопического и культурального методов в этиологической диагностике туберкулезного спондилита

Методом люминесцентной микроскопии (JIM) с параллельным посевом на плотные среды Левенштейна-Иенсена (ЛИ), Финна-П (Ф-П) и в жидкую среду Middlebrook 7Н9 исследовано 440 образцов материала больных ТС (группа 1) и 233 образца контрольной группы (2).

Методом ЛМ М. tuberculosis выявили в 135 и 3 образцах групп 1 и 2 соответственно. Таким образом, чувствительность метода ЛМ составила 30,6%, специфичность - 98,7%.

Возбудитель туберкулеза выявлен методом ЛМ в 78 (36,1%) из 216 образцов, из которых выделены культуры М. tuberculosis (Таблица 1).

Таблица 1 — Результативность метода ЛМ

Метод исследования ЛМ (+), абс., (%) ЛМ (-), абс., (%)

Посев (+) 78 (17,7) 138(31,4)

Посев (-) 57(13,0) 167 (37,9)

(+) - наличие роста, (-) - отсутствие роста М. tuberculosis.

На плотных средах выделено 197 (группа 1) и 2 (группа 2) культуры М. tuberculosis. Таким образом, чувствительность культурального метода составила 44,8%, специфичность - 99,1. Продолжительность роста - 40,6+3,2 дня. Доля контаминированных посевов составила лишь 3,9%, несмотря на исключение этапа деконтаминации операционного материала.

От больных ТС выделено 197 культур М. tuberculosis: на среде ЛЙ - 148 (75,1 %), на среде Ф-П - 180 (91,4%) и на обеих средах - 131 (66,6%) (Таблица 2).

Таблица 2 - Высеваемость М. tuberculosis из операционного материала больных ТС

Рост М. tuberculosis на питательных средах, абс. (%)

ЛИ Ф-П ЛЙ и Ф-П одновременно

17 (8,6)* 49 (24,9)* 131 (66,6)

Чувствительность культурального метода при посеве на среду Ф-П была существенно выше, чем при посеве на среду Л-Й (р=0,031) при одинаковой специфичности (Таблица 3).

Таблица 3 - Эффективность культурального метода

Питательная Группа Рост М. tuberculosis Se, % Sp, %

среда пациентов есть нет

Л-Й 1 148 292 33,6 99,1

2 2 231

Ф-И 1 180 260 40,9 99,1

2 2 231

Se - чувствительность, Sp - специфичность метода.

Современные микробиологические технологии (автоматизированная система ВАСТЕС, молекулярно-генетический метод): эффективность и место в этиологической диагностике туберкулезного спондилита

При культуральном исследовании диагностическая информативность различных видов материала не различалась (Таблица 4).

Таблица 4 - Информативность различных видов операционного материала при исследовании культуральным методом

Материал Рост на среде Middlebrook 7Н9, абс. (%) Рост на средах Л-Й и Ф-П, абс. (%)

есть нет есть нет

Гной/грануляции 100 (37,6) 166(62,4) 175 (44,7) 216(45,3)

Костные фрагменты 10(43,5) 13 (56,5) 22 (44,9) 27(45,1)

(+) - наличие роста, (-) - отсутствие роста М. tuberculosis

При посеве в индикаторные пробирки со средой Middlebrook 7Н9 рост М. tuberculosis был выявлен в 110 (38,1%) из 289 образцов материала больных ТС (группа 1) и лишь в одном (0,6%) из 159 образцов группы (2). Таким образом, чувствительность культурального метода исследования в системе ВАСТЕС MGIT 960 составила 38,1%, специфичность — 99,3%.

Методом ПЦР-РВ ДНК М. tuberculosis-complex была выявлена в 233 (86,9%) из 268 образцов операционного материала пациентов с гистологически подтвержденным диагнозом ТС и в 4 из 121 образца пациентов контрольной группы. Таким образом, чувствительность метода составила 86,9%, специфичность - 96,6%. Время получения результата - от 4-х часов.

Совпадение результатов посева и ПЦР-РВ для выявления возбудителя в образцах операционного материала 268 больных ТС составило 43,7% (Таблица 5).

Таблица 5 - Эффективность выявления возбудителя ТС

Результат ПЦР-РВ (+), (%) ПЦР-РВ (-), (%)

Посев (+) 117(43,7) 13 (4,9)

Посев (-) 116(43,3) 22 (8,2)

(+) — наличие, (-) — отсутствие М. tuberculosis.

Молекулярно-генетический метод выявления возбудителя в операционном материале показал бесспорное преимущество над другими методами по критерию чувствительности (87,1%) и скорости получения результата исследования при сравнимой специфичности (таблица 6).

Таблица 6 - Эффективность методов этиологической диагностики ТС

Метод Группа Результат Se, Sp, PPV, NPV, Время

пациентов (+) (-) % . % % %

ЛМ 1 135 305 30,6 98,7 97,8 42,9 1 день

2 3 233

Посев на ПС 1 197 243 44,8 99,1 98,9 51,3 40,6+3,2 дн

2 2 231

Посев на ЖС 1 110 179 38,1 99,3 99,1 46,8 23,0+2,3 дн

2 1 158

ПЦР-РВ 1 233 35 87,1 96,6 98,1 77,0 1 день

2 4 121

ПС - плотные среды, ЖС - жидкая среда, Se - чувствительность, Sp -специфичность; PPV - положительная, NPV - отрицательная прогностическая ценность, (+) — наличие, (-) - отсутствие М. tuberculosis.

Таким образом, ПЦР-РВ и культуральный метод с применением двух питательных сред (Финна-П и М]с1с11еЬгоок: 7Н9) являются оптимальным комплексом технологий для верификации диагноза ТС (рисунок 1).

Рисунок 1 - Алгоритм этиологической диагностики туберкулезного спондилита.

Фенотипическая и генотипическая (мутации) устойчивость к противотуберкулезным препаратам возбудителя туберкулезного споидилита

Характеристика лекарственной чувствительности штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных ТС, представлена в таблице 7.

Таблица 7 - Лекарственная устойчивость штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезным спондилитом

Противотуберкулезный препарат Число изученных штаммов Число устойчивых штаммов Доля, %

Стрептомицин (S) 158 112 70,8

Изониазид (Н) 158 106 67,1

Рифампнцин(R) 158 98 62,0

Этамбутол (Е) 158 71 44,9

Пиразинамид (Z) 92 45 48,9

Этионамид (Eto) 149 58 38,9

Офлоксацин (Of) 149 14 9,3

Капреомицин (Cm) 97 27 27,8

Амикацин (Ат) 97 23 23,7

Канамицин (Km) 114 44 38,6

ПАСК (PAS) 110 11 10,0

Циклосерин (Cs) 110 0 0

Устойчивостью хотя бы к одному препарату 1-го ряда обладало большинство изученных штаммов М. tuberculosis2 (п=158); более половины были резистентны к стрептомицину, изониазиду и рифампицину, практически каждый второй штамм -к этамбутолу, а также к пиразинамиду. В целом в структуре лекарственной устойчивости превалировала МЛУ (включая ШЛУ) - 57,7%, причем все МЛУ штаммы М. tuberculosis (91 из 158), выделенные от больных ТС, проявляли устойчивость к стрептомицину; более половины - к каждому из препаратов: этамбутолу, этионамиду, канамицину и пиразинамиду, около трети - к капреомицину и амикацину. Более 40% (38 из 91) МЛУ штаммов были также устойчивы ещё к трем и более препаратам. Наиболее частой была сочетанная устойчивость штаммов М. tuberculosis к стрептомицину и изониазиду - 59,1% (13 из 22).

Сопоставление профиля ЛУ изученных штаммов М. tuberculosis с клиническим течением заболевания позволило установить, что частота выделения МЛУ штаммов М. tuberculosis была значительно выше при вовлечении в процесс тел трех и более позвонков (распространенный процесс), чем при ограниченном поражении позвоночника (Таблица 8).

Таблица 8 — Профиль ЛУ штаммов М. tuberculosis

Характеристика процесса Число штаммов М. tuberculosis Структура ЛУ

МЛУ/ШЛУ Поли- и монорезистентность ЛЧ

Распространенный 84 56 (66,7%)* 15(17,9%) 13(15,5%)

Локальный 74 35 (47,3%)* 11 (14,9%) 28 (37,8%)

V=10,36; OR=2,23 [1,17-4,24],р<0,01

Частота выделения штаммов М. tuberculosis с МЛУ от больных с генерализованным процессом была значительно выше, чем от больных с поражением только позвоночника - 67,0% (65 из 97) против 42,6% (26 из 61) соответственно (OR=2,73 [1,41-5,29], р<0,01).

Таким образом, частота МЛУ (включая ШЛУ) среди штаммов М. tuberculosis, выделенных из очагов костной деструкции больных ТС, достигала 57,7%. Наличие у возбудителя МЛУ является одним из факторов, способствующих развитию тяжелых форм ТС с поражением тел трех и более позвонков (OR=2,23 [1,17-4,24], р=0,01) и генерализации туберкулезного процесса (OR=2,73 [1,41-5,29], /7=0,002). Мутации в гене гроВ, ассоциированные с устойчивостью микобактерий к

2 148 (93,7%) из 158 штаммов М. tuberculosis выделены из операционного материала впервые; 10 штаммов Ы. tuberculosis, выделенные из очатов костной деструкции при повторной операции, не отличались по профилю ЛУ от полученных ранее от тех же пациентов (промежуток между от трех месяцев до двух лет).

рифампицину, были обнаружены в 61,3% (111 из 181) образцов ДНК возбудителя, полученных из операционного материала больных ТС. В большинстве случаев присутствовала несинонимическая замена нуклеотида в 531-м кодоне, обусловливающая замену аминокислоты серии (Ser) в молекуле белка-мишени рифампицина, причем в 11 случаях - в сочетании с заменами в других кодонах: 533, 335, 511, 526, 513, 512. Всего выявлено 24 варианта мутаций, среди которых превалировала замена гроВЪЪ\ Ser->Leu - 74,8% (83 из 111), ассоциированная с высоким уровнем устойчивости рифампицина in vitro.

Одиночные и сочетанные мутации kaíG, inhA, ahpC, контролирующие устойчивость микобактерий к изониазиду, выявлены в 72,9% (132 из 181) образцов ДНК операционного материала; в большинстве случаев - замены в гене katG -81,8% (108 из 132), причем в 16 (14,8%) - в сочетании с мутациями в гене inhA. Наиболее частой была замена Ser—Thr в кодоне 315 гена katG - 90,7% (98 из 108).

В целом мутации, ассоциированные с устойчивостью к обоим препаратам (рифампицину и изониазиду), выявлены в 107 (59,1%) из 181 образцов, что свидетельствует о наличии возбудителя, обладающего МЛУ.

Параллельно из 181 образца выделено 138 (76,2%) культур М. tuberculosis, из них 102 (73,9%) были устойчивы к рифампицину и/или изониазиду. Среди них превалировали МЛУ/ШЛУ штаммы (85 - 83,3%); полирезистентны были 16 (18,8); монорезистентность (к рифампицину) выявлена у одного штамма М. tuberculosis.

В 138 образцах материала (из которых были выделены упомянутые штаммы М. tuberculosis) выявлены мутации устойчивости: к рифампицину - в гене гроВ - 98 (71,0%) и к изониазиду - в генах katG - 87 (63,0%), inhA - 21 (15,2%) и ahpC- 1 (0,7 %). Сочетанные мутации (в двух и/или трех генах), ассоциированные с МЛУ, выявлены в 83 образцах ДНК: rpoB/katG - 68 (81,9%), rpoB/inhA - 2(2,4%), rpoB/ahpC- 1 (1,2%), троВ/katG/inhA - 12 (14,5%).

Мутации в гене гроВ определены в 94,5% (86 из 91) образцов материала, содержащих фенотипически устойчивые к рифампицину микобактерии туберкулеза (Таблица 9).

Таблица 9 - Соотношение фено - и генотипической устойчивости штаммов М. tuberculosis к рифампицину

Отношение к рифампицину штаммов М. tuberculosis Наличие мутаций гроВ в образце ДНК клинического материала Отсутствие мутаций гроВ в образце ДНК клинического материала

устойчивость 86 5

чувствительность 12 35

Таким образом, чувствительность и специфичность молекулярно-генетического метода определения ЛУ к рифампицину составили 87,7% и 87,5% соответственно.

Из 138 штаммов М. tuberculosis 96 (69,6%) обладали фенотипической устойчивостью к изониазиду, при этом в 88 (91,6%) образцах клинического материала выявлены мутации: katG/inhA - 70 (79,6%), katG - 13 (14,8%), inhA (4,5%)-4, ahpC- 1 (1,1%) (таблица 10).

Таблица 10 - Соотношение фено- и генотипической устойчивости штаммов М. tuberculosis к изониазиду

Отношение к изониазиду штаммов М. tuberculosis Наличие мутаций (katG, inhA, ahpC) в образце ДНК клинического материала Отсутствие мутаций в образце ДНК клинического материала

устойчивость 88 8

чувствительность 12 30

Чувствительность и специфичность молекулярно-генетического метода выявления устойчивости возбудителя ТС к изониазиду составили 88,0% и 78,9% соответственно.

Сравнительное исследование 34 парных препаратов ДНК, выделенной из образцов диагностического материала и соответствующих культур М. tuberculosis, выявило практически полное совпадение результатов определения спектра мутаций, ассоциированных с устойчивостью микобактерий к рифампицину и изониазиду (лишь в двух случаях выявлены дополнительные мутации в генах katG315 и inhATlS в ДНК, выделенной из культур М. tuberculosis, но не из образцов операционного материала). Из 43 образцов материала (п=181) чистые культуры М. tuberculosis выделены не были, однако в 13 из них выявлены замены в разных кодонах гроВ, причем в 11 - в сочетании с katG Ser315—>Thr. В 10 образцах выявлена только замена Ser315—>Thr в гене katG.

Генотипическая характеристика штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезным спондилитом

Сполиготипирование 124 штаммов М. tuberculosis выявило 23 варианта сполиготипов, из которых семь были представлены кластерами (таблица 11). К генотипу Beijing было отнесено большинство (73,4%) штаммов (сполиготипы SIT1, SIT265 и SIT269). Остальные штаммы принадлежали к другим (non-Beijing) генетическим линиям/семействам: Т, Н, в том числе H3(Ural), Н4, LAM, Manu, S. Выявлены 2 новых профиля сполиготипирования (new), отнесенных к семействам Х2 и Т. Изучение аллельного полиморфизма 91 штамма М. tuberculosis генотипа Beijing методом MIRU-VNTR по 12 локусам MIRU выявило 9 вариантов с различными числовыми профилями (HGDI 0,63), из них четыре были представлены кластерами. Наиболее крупные кластеры MIT 16 и MIT 17 (согласно SITVIT_WEB) включали 39 и 29 штаммов соответственно. У остальных 12

штаммов генотипа Beijing определены следующие типы (MIT): 86, 101, 135, 571, 592, 642 и 706. Все 5 штаммов MIT 135 проявляли МЛУ.

MIRU-VNTR -типирование по 24 локусам позволило углубить дискриминацию штаммов генотипа Beijing и выявило 24 варианта (HGDI 0,83) профилей, в т.ч. 7 кластеров, включавших 2-23 штамма. Наиболее многочисленный кластер (100-32 согласно MIRU-VNTRp/г«) включал 23 (28,8%) штамма генотипа Beijing. У штаммов М. tuberculosis кластера 100-32 (20 обладали МЛУ) в локусах MIRU26 и QUB26 выявлено по 7 тандемных повторов.

Среди штаммов М. tuberculosis, принадлежащих к генетическому семейству Beijing, превалировали (76,9%) МЛУЛПЛУ штаммы (Таблица 12), причем половина из них одновременно проявляла устойчивость и к остальным препаратам первого ряда (стрептомицину, этамбутолу, пиразинамиду).

Таблица 12 - Отношение к ПТП штаммов М. tuberculosis различных генотипов

Число штаммов

Генотип ЛЧ (%) поли-/моно-резистентные (%) МЛУЛПЛУ (%) всего

Beijing 8 (8,8) 13(14,3) 70 (76,9) 91

LAM 9 2 (66,7) 1 (33,3) 0 3

Т, Т2, Т4, T5-RUS1 11 (78,6) 2 (14,3) 1 (7,1) 14

НЗ, H3-Ural-1 6 (46,2) 0 7 (53,8) 13

MANU1 1 0 0 1

S 1 0 0 1

Х2 1 0 0 1

У 2 фенотипически чувствительных и 9 полирезистентных штаммов Beijing выявлены мутации в генах гроВ и katG, что потенциально увеличивает долю МЛУ/ШЛУ штаммов данного генотипа до 89,0%.

В группе штаммов М. tuberculosis (п=33) других генотипов («He-Beijing») преобладали ЛЧ штаммы (п=22), суммарная доля которых составила 66,7% (/><0,001). Заслуживает внимания группа семейств Haarlem (Н), а именно надсемейство НЗ-Ural, в котором сосредоточено 3/4 (6 из 8) МЛУ/ШЛУ штаммов группы non-Beijing. В 93 образцах (80 - Beijing и 13 - He-Beijing) из 124 образцов материала, содержащего М. tuberculosis были выявлены различные комбинации мутаций, ассоциированных с ЛУ М. tuberculosis к основным ПТП - рифампицину и изониазиду. Мутации гроВ обнаружены в 95,0% (76 из 80) образцов материала, содержавшего М. tuberculosis семейства Beijing.

При этом в структуре мутаций гроВ превалировала замена Ser531-Leu, доля которой (в том числе в сочетании с другими мутациями гроВ) составляла 86,8% (66 из 76 образцов). Мутации в гене katG были выявлены в 69 (86,3%) из 80 образцов материала, содержавшего М. tuberculosis Beijing.

Таблица 11 - Генотипическая характеристика штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных ТС (п=124)

Международный код сполиготипа, SIT Сполигопрофиль (схематическое изображение) Восьмеричный код сполигопрофиля Генотипическая линия/сублиния (SITVITWEB) Число штаммов Доля, % Суммар ная доля, %

1 □□ассйппспппсооспрсппс]спгх]йпг;сг]сс«ишшиш«м 000000000003771 Beijing 87 70,9 73,4

265 гх1гппаасхх:ааосхтт1пгт:поосс10[х1соосоав1пшииш1и 000000000003371 1 0,8

269 рспагшпссаоайасюсппоппсппоаапаарасосвииш"«" 000000000000771 3 2,4

53 777777777760771 Т 8 6,5 10,5

1252 777777177760771 1 0,8

52 777777777760731 Т2 1 0,8

263 777600003760771 T5-RUS1 1 0,8

254 777760007760771 1 0,8

1582 777777377760700 Т4 1 0,8

262 774777777420771 H3-Ural-1 2,4 9,7

1134 777737777420731 2,4

35 777737777420771 1 0,8

777 777777777420771 0,8

50 777777777720771 НЗ 1,6

36 777737777720771 1 0,8

294 577777777720771 1 0,8

42 777777607760771 LAM9 1,6 1,6

3783 574777777423771 MANU2 1 0,8 1,6

3784 777777607762771 1 0,8

3785 676337737760771 S 1 0,8 0,8

1050 777730000000771 Unknown 1 0,8 0,8

NEW ■■■■■■□свимиаапппппсппппимшимйппоивмвии 771740003760771 T5-RUS1 1 0,8 0,8

NEW 777736377000000 Х2 1 0,8 0,8

Доля замены Ser3I5-Thr составила 92,8% (64 из 69). В гене inhA мутации выявлены в 12 пробах, причем превалировала замена в положении Т15 (7 случаев). В одном образце обнаружена сочетанная с katG мутация в гене ahpC с заменой в двух положениях - ahpC А9 и TIO.

Образцы материала, содержавшие М. tuberculosis группы He-Beijing, характеризовало наличие мутаций гроВ в 10 (76,9%) из 13 случаев, причем в половине их них наблюдалась замена Ser531-Leu. Мутация в гене katG Ser315-Tbr была выявлена в 9 (90,0%) из 10 образцов материала, содержавших М. tuberculosis группы He-Beijing, в гене inhA - в 6 образцах.

Частота выделения штаммов М. tuberculosis, принадлежащих к семейству Beijing, из операционного материала больных с генерализованным процессом была значительно выше, чем в группе больных ТС (р=0,002) (Таблица 13).

Таблица 13 - Генотипы штаммов М. tuberculosis

Характеристика процесса Число больных Генотип штамма

Beijing He-Beijing

ТС 48 28 (58,3%) 20(41,7%)

Генерализация процесса 76 63 (82,9%)* 13 (17,1%)

* наличие устойчивой связи между факторами: OR=3,46 [1,51-7,92]

У больных ТС с вовлечением тел трех и более позвонков частота выделения штаммов М. tuberculosis Beijing была значительно выше, чем у больных с ограниченным поражением позвоночника (у?=11,7; р=0,0006) (Таблица 14).

Таблица 14 - Генотипы штаммов М. tuberculosis при разных уровнях распространенности туберкулезного процесса по позвоночному столбу

Характеристика процесса Число больных Генотип штамма

Beijing non-Beijing

Распространенный ТС 69 59 (85,5%)* 10(14,5%)

Ограниченный ТС 55 32 (58,2%) 23 (41,6%)

* наличие устойчивой связи между факторами: OR=4,24 [1,79-10,0]

У 17 (из 124) больных ТС было поражение нескольких отделов позвоночника (мультифокальное), при этом у 16 из них возбудитель принадлежал к семейству Beijing и у одного - к T5-RUS1.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на исключение этапа деконтамннации при посеве операционного материала больных ТС, доля контаминированных посевов была невелика (3,9%) и не превышала рекомендуемые значения (3-8%).

Сравнительная оценка показателей роста микобактерий не выявила преимущества какой-либо из питательных сред по показателю высеваемости: Финна-П (79,2%) > Middlebrook 7Н9 (77,1%) > Левенштейна-Йенсена (71,5%) (р=0,383). Преимущество жидкой среды Middlebrook 7Н9 заключалось во временном факторе: средняя продолжительность роста культуры М. tuberculosis в системе ВАСТЕС MGIT 960 составила 23+2,3 против 40,6+3,2 дней на плотных средах. Кроме того, время ожидания результата теста лекарственной чувствительности при использовании ВАСТЕС MGIT 960 составило в среднем 37 дней, плотных сред - 61 день. Однако самым быстрым (3-4 дня) и эффективным способом выявления и определения ЛУ возбудителя туберкулеза в материале из очагов костной деструкции путем детекции мутаций, ассоциированных с устойчивостью к рифампицину и изониазиду, был метод ПЦР-РВ. Профили мутаций устойчивости к рифампицину и изониазиду, определяемые молекулярно-генетическим методом непосредственно в образцах диагностического материала и в выделенных из этих образцов культурах М. tuberculosis, практически не различались.

Большинство штаммов М. tuberculosis, выделенных из очагов костной деструкции больных ТС, отнесены к генотипу Beijing - 73,4% (91 из 124), принадлежность к которому была ассоциирована с генерализацией туберкулезного процесса и более тяжелыми (в том числе мультифокальными) формами ТС с поражением тел трех и более позвонков. Вместе с тем, в группе Beijing превалировали МЛУ/ШЛУ штаммы - 76,9%, тогда как среди штаммов других генотипов преобладали ЛЧ - суммарная доля 66,6% (р<0,001). Штаммы М. tuberculosis Beijing, имеющие одинаковый сполиготип (SIT1), были неоднородны по профилю MIRU-VNTR. Особый интерес представляли штаммы кластера 100-32 (20 из 23 обладали МЛУ), в ДНК которых определили по 7 тандемных повторов в локусах MIRU26 и QUB26, что свидетельствует о принадлежности к эпидемиологически и клинически значимому в России клону B0AV148 М. tuberculosis Beijing (Мокроусов И.В. и др., 2012).

Выводы

1. Питательная среда Финна-П превосходила среду Левенштейна-Йенсена по высеваемости М. tuberculosis (91,4% против 75,1%, р=0,0001) из очагов костной деструкции.

2. Культивирование операционного материала, содержащего гной/грануляции и костные фрагменты, в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960 по сравнению с посевом на плотные питательные среды снижало продолжительность роста микобактерий в 2 раза (с 23±2,3 до 40,6+3,2 суток) при сравнимой чувствительности методов (38,1% и 44,8%, ¿>=0,23 6).

3. ПЦР в формате реального времени - более эффективный метод выявления М. tuberculosis в материале из очагов костной деструкции по сравнению с методом культивирования на плотных питательных средах (чувствительность - 87,1% против 44,8% при сравнимой специфичности - 99,6% и 99,1%).

4. Комплексное применение ПЦР в формате реального времени и культурального исследования операционного материала позволило верифицировать диагноз туберкулезного спондилита у 91,8% пациентов.

5. В структуре лекарственной устойчивости возбудителя туберкулезного спондилита преобладала МЛУ/ШЛУ (57,7%), обусловленная мутациями преимущественно в генах rpoB Ser531^Leu (74,8%) и katG Ser315~*Thr (90,7%).

6. В генетически неоднородной популяции возбудителя туберкулезного спондилита, представленной 23 сполигопрофилями и 24 MIRU-VNTR-типами, доминировали штаммы генотипа Beijing (73,4%). Остальные штаммы принадлежали к генетическим семействам - Т, Н, H3(Ural), Н4, LAM.

7. Множественная лекарственная устойчивость и принадлежность возбудителя к генотипу Beijing способствовали более тяжелому течению туберкулезного спондилита с поражением тел трех и более позвонков (р=0,01) и генерализации туберкулезного процесса (р=0,002).

Практические рекомендации

1. На этапе нробоподготовки проведение деконтаминации образцов операционного материала раствором MycoPrep NALC_NaOH не рекомендуется.

2. Метод люминесцентной микроскопии не целесообразно использовать в алгоритме этиологической диагностики туберкулезного спондилита в связи с его низкой чувствительностью (30,7%) и наличием быстрого, высокочувствительного метода ПЦР в формате реального времени для выявления возбудителя в диагностическом материале.

3. Использовать питательные среды Финна II и Middlebrook 7Н9 (в системе ВАСТЕС MGIT 960) для ускорения культивирования и повышения высеваемости

возбудителя из диагностического материала, содержащего гной/грануляции и костные фрагменты

4. Этиологическая диагностика туберкулезного спондилита должна включать комплекс бактериологических и молекулярно-генетических методов, направленных на выявление возбудителя непосредственно в диагностическом материале и исследование биологических свойств М tuberculosis (профиль мутаций лекарственной устойчивости, сполиготип).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Публикации в изданиях, рекомендованных Минобрнауки России

1. Вишневский, А.А. О клеточном и гуморальном иммунитете при туберкулезном спондилите / А.А. Вишневский, С.В. Бурлаков, В.Н. Гусева, В.Ю. Журавлев, Б.Е. Кноринг, НА. Ница, Е.И. Потапенко, Е.В. Решетнева, Н.С. Соловьева, Л.П. Чурилов, П.К. Яблонский // Вестник СПбГУ. - Сер. 11.-2012.-№ 4.-С. 56-65.

2. Вязовая, А.А. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных туберкулезным спондилитом / А.А. Вязовая, Н.С. Соловьева, В.Ю. Журавлев, И.В. Мокроусов, О.А. Маничева, Б.И. Вишневский, О.В. Нарвская // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2013. - № 5. - С. 20-26.

3. Соловьева, Н.С. Эффективность системы ВАСТЕС MGIT 960 для исследования операционного материала больных туберкулезным спондилитом / Н.С. Соловьева, О.А. Маничева, Л.Н. Стеклова, В.В. Олейник, М.В. Шульгина // Клиническая и лабораторная диагностика. - 2013. - № 12. - С. 45-48.

4. Советова, Н.А. Туберкулезный спондилит у взрослых (клинико-лучевые проявления) / Н.А. Советова, Г.Ю. Васильева, Н.С. Соловьева, В.Ю. Журавлев, И.А. Баулин //Туберкулез и болезни легких. - 2014. - №-2 - С. 10-14.

5. Решегнева, Е.В. Клинические особенности туберкулезного спондилита у больных ВИЧ-инфекцией / Е.В. Решетнева, А.А. Вишневский, Н.С. Соловьева, В.В. Олейник // Туберкулез и болезни легких. - 2014. - № 2 - С. 19-21.

Работы, опубликованные в зарубежных изданиях

6. Vyazovaya, A. Tuberculous spondylitis in Russia and prominent role of multidrug-resistant successful clone Mycobacterium tuberculosis Beijing B0/W148 / A. Vyazovaya, I. Mokrousov, N. Solovieva, A. Mushkin, O. Manicheva, B. Vishnevsky, V. Zhuravlev, O. Narvskaya // Antimicrob. Agents Chemother. - 2015. - Vol. 59, № 4. - P. 2349-2357.

Работы, опубликованные в других изданиях

7. Васильева, Г.Ю. Роль молекулярно-генетических методов в диагностике туберкулезного спондилита / Г.Ю. Васильева, В.Ю. Журавлев, Н.С. Соловьева, Е.В. Решетнева, В.В. Олейник, А.Н. Макаровский, В.Н. Бурлаков, А.А. Вишневский //

Инновационные технологии в организации фтизиатрической и пульмонологической помощи населению: мат. Всерос. науч.-практ. конф. - СПб, 2011 - С. 81.

8. Маничева, О.А. Взаимосвязь биологических свойств Mycobacterium tuberculosis и течения туберкулезного процесса / О.А. Маничева, А.О. Барнаулов, О.В. Нарвская, И.В. Мокроусов, А.А. Вязовая, В.Ю. Журавлев, М.З. Догонадзе, Н.В. Сапожником, Н.С. Соловьева, Г.Ю. Васильева, Т.Ф. Огтен, Б.И. Вишневский // Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом: мат. Всерос. науч.-практ. конф. - СПб., 2011. - С. 446-448

9. Решетнева, Е.В. Клинические и диагностические особенности туберкулезного спондилита у больных ВИЧ-инфекцией / Е.В Решетнева, А.А. Вишневский, Н.С. Соловьева, А.Н. Макаровский, В.В. Олейник // Вопросы травматологии и ортопедии. - 2012. - № 4 (5). - С. 43-46.

10. Соловьева, Н.С. Биологические свойства M.tuberculosis, выделенных от больных туберкулезным спондилитом и туберкулезом органов дыхания / Н.С. Соловьева, О.А. Маничева, М.З. Догонадзе, В.Ю. Журавлев, И.В. Мокроусов, О.А. Нарвская, Б.И. Вишневский // Актуальные проблемы и перспективы развития противотуберкулезной службы в Российской Федерации: мат. I Конгресса Ассоциации «Национальная Ассоциация фтизиатров». - СПб., 2012. - С. 220-221.

11. Журавлев, В.Ю. Легитимизация молекулярно-генетических подходов (МГП) в верификации туберкулезного спондилита (ТС) / В.Ю. Журавлев, Н.С. Соловьева,

B.В. Олейник // Актуальные проблемы и перспективы развития противотуберкулезной службы в Российской Федерации: мат. I Конгресса Ассоциации «Национальная Ассоциация фтизиатров». - СПб., 2012. - С. 296-297.

12. Маничева, О.А. Клиническая значимость комплексной характеристики возбудителя туберкулеза / О.А. Маничева, В.Ю. Журавлев, А.О. Барнаулов, Н.С. Соловьева, М.З. Догонадзе, А.А. Вязовая, Н.Н. Мельникова, М.В. Павлова, И.В. Мокроусов, Б.И. Вишневский, О.В. Нарвская, М.В.Шульгина // Медицинский альянс. - 2013.-№ 2. - С. 29-35.

13. Мушкин, А.Ю. 14-летний мониторинг бактериологической идентификации туберкулеза костей и суставов у детей / А.Ю. Мушкин, Е.Ю. Малярова, Д.Б. Маламашин, Т.Ф. Оттен, Н.С. Соловьева // Медицинский альянс. - 2013. - № 2. -

C.49-52.

14. Соловьева, Н.С. Особенности этиологических исследований при туберкулезном спондилите / Н.С. Соловьева, В.Ю. Журавлев, О.А. Маничева, М.В. Шульгина, Б.И. Вишневский // Материалы V Ежегодного Всерос. Конгресса по инфекционным болезням. -М., 2013. - С. 373-374.

15. Журавлев, В.Ю. Генерализованный туберкулез у ВИЧ-инфицированных пациентов. Лабораторные аспекты верификации / В.Ю. Журавлев, С.В. Мазохина, Н.С. Соловьева, А.Е. Змазнова, М.В. Шульгина // «Молекулярная диагностика-

2014» Сб. тр.: V1H Всерос. науч.-практ. конф. с международным участием; под ред. В.И. Покровского. - М.: МБА, 2014. - Т.1. - С.73-74.

16. Соловьева, Н.С. Оценка взаимосвязи клинического течения туберкулезного спондилита и биологических свойств возбудителя [Электронный ресурс] / Н.С. Соловьева, А.А. Вязовая, A.M. Бурлаков, OA. Маничева, В.В. Олейник, В.Ю. Журавлев // Материалы 3-го Конгресса Ассоциации «Национальная Ассоциация фтизиатров». - СПб., 2014. -Реф.0097. - URL: http://nasph.ru/tezisv NASPH 2014.pdf

17. Назаров, С.С. Структура лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза при распространенном туберкулезном спондилите у ВИЧ-позитивных и ВИЧ-негативных пациентов / С.С. Назаров, Е.В. Решетнева, Н.С. Соловьева, А.А. Вишневский, В.В. Олейник//Медицинский альянс. -№1. -2014. - С. 25-30.

18. Solovieva, N. Aetiological diagnostics of tuberculous spondylitis in HIV-positive and HIV-negative patients / N. Solovieva, E. Reshetneva, V. Zhuravlev, G. Vasilieva, A. Vishnevskij B. Vishnevsky, P. Yablonskiy // J. Clin. Microbiol. Infect. - 2012. - Vol. 18, № 3. - P. 828.

19. Chernyaeva, E. Whole genome sequencing of Two Mycobacterium tuberculosis Isolates from St.Petersburg and Volgograd region (Russia) / E. Chernyaeva, P. Dobrynin, V. Zhuravlev, N. Solovieva, A. Lapidus, A. Kozlov, S. O'Brien // «Tuberculosis: Understanding the Enemy Х8». - Whistler, British Columbia, Canada, 2013. - P.31.

20. Solovieva, N. Mycobacterium tuberculosis drug resistance prevalence in tuberculosis spondylitis patients / N. Solovyeva, V. Zhuravlev, O. Manicheva, B.Vishnevskiy, M.V. Shulgina, P. Yablonskiy // J. Tuberc. Lung Dis. - 2013. - Vol. 17, № 12, Supp.2. - P. 215216.

21. Zhuravlev, V. Molecular characterisation of the rpoB, katG, inhA, ahpC gene mutation in Mycobacterium tuberculosis isolates from patients with tuberculosis spondylitis (TS) [Электронный ресурс] / V. Zhuravlev, N. Solovieva, O. Manicheva, B. Vishnevskiy, M. Shulgina, P. Yablonsky // Abstracts of the 23 European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. - Berlin, 2013. - R 2899. - URL: https://www.escmid.org,research_proiects/eccmid/'past eccmids/

22. Mushkin, A. The peculiarities of bone and joint ТВ (BJTB) confirmed by M. tuberculosis isolates (Mtb) in pediatric patients / A. Mushkin, N. Solovieva, E. Malyarova, V. Vatutina, A. Inozemtseva, S. Mazokhina // J. Tuberc. Lung Dis. - 2014. -Vol. 18, № 11.-P. 256.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВТ - внелегочный туберкулез

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

КСТ - костно-суставной туберкулез

Л-Й - плотная питательная среда Левенштейна-Йенсена

ЛУ - лекарственная устойчивость

ЛЧ - лекарственная чувствительность

МИК - минимальная ингибиругощая концентрация

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость (устойчивость, по меньшей

мере, к рифампицину и изониазиду)

ПДС - позвоночно-двигательный сегмент

п.н. - пары нуклеотидов

ПТП - противотуберкулезные препараты

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в формате реального времени

ТС - туберкулезный спондилит

ФЛУ - фенотипическая лекарственная устойчивость

ШЛУ - широкая лекарственная устойчивость

ВАСТЕС MGIT 960 - автоматизированная система культивирования и определения лекарственной чувствительности микобактерий (Becton Dickinson, США).

MGIT - Mycobacteria Growth Indicator Tube (индикаторная пробирка для

выращивания микобактерий)

OR - Odds Ratio (отношения шансов)

Подписано в печать 13.04.2015 Формат 60x90/16. Объем 0,875 усл.п.л. Печать ризографическая. Бумага офсетная. Тираж 100 экз. Заказ №68 Отпечатано в типографии ООО "Фирма "Стикс" 196128, Санкт-Петербург, ул. Кузнецовская, 19.