Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Биохимическое исследование воздействия физико-химических факторов на ферменты и метаболиты ротовой жидкости больных пародонтитом

На правах рукописи

СОВЦОВА КРИСТИНА ЭНВЕРОВНА

Биохимическое исследование воздействия физико-химических факторов на ферменты и метаболиты ротовой жидкости больных пародонтитом

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов-2009

003464939

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Саратовский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Владимир Борисович Бородулин. Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Геннадий Васильевич Коршунов; доктор медицинских наук, профессор Зураб Леванович Девдариани.

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Ростовский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Защита состоится «_»_2009 г. в_часов на заседании диссертационного

совета Д 208.094.04 при ГОУ ВПО Саратовский ГМУ Росздрава по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Б. Казачья, 112.

С авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Саратовский ГМУ Росздрава.

Автореферат разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Бородулин В.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Распространенность воспалительных заболеваний пародонта среди взрослого и детского населения Российской Федерации остается довольно высокой, несмотря на большое количество научных исследований и методов лечения (Матело С.К., Гроссер

A.B., Купец Т.В. и соавт.,2006). Одним из ведущих факторов в этиологии и патогенезе заболеваний пародонта является микробная флора полости рта. Согласно современным представлениям, бактериальная агрессия, являясь одним из инициальных факторов в развитии заболеваний пародонта, вызывает различные формы поражения пародонтального комплекса (Гаража H.H., Гарус Я.Н., Ивашова А.В и соавт., 2006). Полученные данные о роли анаэробной и смешанной бактериальной флоры в развитии заболеваний пародонта, позволили выделить группу так называемых пародонтопатогенных бактерий (Дмитриева Л.А., Царев В.Н., Романов А.Е. и соавт.,1998). Генетическая стратегия изменчивости микроорганизмов постоянно приводит к возникновению в микробных популяциях вариантов стойких к химиотерапевтическим препаратам, в том числе к антибиотикам (Самойленко A.B., 1999; Царев В.Н., Ушаков Р.В., 2004).

Микроорганизмы поражают прежде всего мембранный аппарат клеток слизистой оболочки полости рта. Необходимо отметить, что в условиях гипоксии и ацидоза резко усиливаются- процессы перекисного окисления липидов мембран клеток слизистой оболочки, что, в свою очередь, приводит к накоплению в ротовой жидкости продуктов перекисного окисления липидов, которые понижают активность амилазы слюны. Именно поэтому поиск препаратов, обладающих антиоксидантным и мембранопротекторным действием, а также выявление физических полей, способных защищать мембрану от свободных радикалов, является одним из актуальных вопросов клинической медицины и стоматологии.

Широкое применение в клинической практике излучений в КВЧ-диапазоне для улучшения реологии крови и увеличения проницаемости стенки сосудов для питательных веществ и кислорода (Шабогина A.A., 2006) предполагает более углубленное изучение воздействия подобных физических полей на ферменты и метаболиты биологических жидкостей, в том числе и на ротовую жидкость у больных пародонтитом.

В последнее время интенсивно изучается роль селена в биохимических процессах, протекающих в живых организмах, поскольку он является необходимым ультрамикроэлементом, входящим в состав ряда ферментов (Тутельян В.А., Княжев В.А., Хотимченко С.А. и соавт., 2002).

Общеизвестна связь между селенистой недостаточностью и авитаминозом Е. В последние годы найдена взаимосвязь в организмах человека и животных между селеном и другими микроэлементами, такими как цинк, йод, медь. Установлено, что селен влияет на эффективность действия не только витамина Е но и витаминов А, Вб, С и др. (Тутельян

B.А., Княжев В.А., Хотимченко С.А. и соавт., 2002; Arbur J.R., 1994).

Наиболее значимая биологическая функция селена в организме человека, животных и птиц состоит в обеспечении эффективной работы защитной антиоксидантной системы организма. Селен участвует в функционировании глутатионпероксидазы, разрушающей перекись водорода и липоперекиси и тем самым предохраняет клеточные мембраны от окислительной деструкции (Колесниченко Л.С.,Кулинский B.H.,1989;Chu F.F., Doroshow J.H., Esworthy R.S., 1993; Gamble S.C., Wiseman A., Goldfarb P.S., 1997).

Селен является необходимой составной частью ряда ферментов: формиатдегидратазы, глицинредуктазы, глутатионпероксидазы (Burk R.F.,Hill K.E.,1993;Chu F.-F., Doroshow J.H., Esworthy R.S., 1993; Sies H„ 1993.).

Несомненный интерес к селеноорганическим соединениям обусловлен также применением различных селеносодержащих препаратов в качестве пищевых добавок. Следует отметить, что большинство известных неорганических селеноорганических соединений токсично,поэтому одним из направлений органического синтеза является поиск более активных и менее токсичных соединений, таких как соли селенопирилия, селеноксантилия, селенопираны и другие.

В то же время остаются малоизученными биохимические механизмы действия селеноорганических препаратов на ферменты и метаболиты ротовой жидкости при патологии пародонта (пародонтит различной степени тяжести), что весьма актуально, так как может способствовать выбору наиболее оптимального соединения из ряда селеноорганических препаратов для лечения и профилактики воспалительных процессов в тканях пародонта.

Цель исследования

Цель настоящей работы - выявление ранних клинико-лабораторных критериев для оценки степени тяжести повреждения пародонта и влияние физико-химических факторов на ферменты углеводного обмена и метаболиты ротовой жидкости больных пародонтитом.

Задачи исследовании

1. Определить активность ферментов и концентрацию метаболитов в ротовой жидкости у пациентов с пародонтитом различной степени тяжести.

2. Изучить характер изменений в концентрации метаболитов перекисного окисления липидов - малонового диальдегида и диеновых конъюгатов - в ротовой жидкости у пациентов с пародонтитом различной степени тяжести в присутствии селено-органического препарата ДАФС-25.

3. Исследовать влияние селеноорганического препарата ДАФС-25 на активность лактатдегидрогеназы ротовой жидкости у лиц с интакгным пародонтом и у лиц с пародонтитом различной степени тяжести in vitro.

4. Оценить изменение активности селеноорганического препарата ДАФС-25 у больных пародонтитом in vitro в присутствии аминокислот аргинина и гистидина.

5. Определить активность фермента лактатдегидрогеназы при облучении ротовой жидкости у больных пародонтитом при действии KB Ч-диапазона in vitro.

Научная новизна

В результате проведенной работы установлено изменение активности ферментов и концентрации метаболитов, включая метаболиты перекисного окисления липидов, при различной степени повреждения пародонта.

Исследовано взаимодействие селеноорганического препарата ДАФС-25 с ферментами, содержащимися в ротовой жидкости у лиц с интакгным пародонтом in vitro. Обнаружено изменение активности ферментов, принимающих участие в углеводном обмене. Изучена активность ферментов ротовой жидкости у больных с пародонтитом различной степени тяжести в присутствии препарата ДАФС-25.

Выявлены биохимические критерии для селеноорганического препарата ДАФС-25, при которых данный препарат может проявлять ферментативную активность,сходную с активностью фермента ЛДГ.

Показано, что при действии излучения в КВЧ-диапазоне происходит увеличение активности фермента ЛДГ ротовой жидкости при интактном пародонте и при пародонтитах различной степени тяжести.

Практическая ценность

В результате проведенных исследований выявлены специфические особенности в изменении активности ферментов ротовой полости при наличии воспалительного процесса в пародонте. Изученные биохимические механизмы действия ДАФС-25 могут служить в дальнейшем критерием выбора наиболее оптимального селеноорганического препарата, обладающего выраженными антиоксидантными мембранопротекторными свойствами, что позволит существенно улучшить результаты лечения данной категории больных. Использование аминокислот (в случае проведенных исследований - аргинина и гистидина) в виде биологически активных добавок, особенно в сочетании с препаратами, содержащими селен, должно оцениваться с позиции возможной активации лакгатдегидрогеназы в ротовой жидкости, что имеет важное значение в лечении больных с пародонтитом.

Внедрение результатов исследования

Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс на кафедре биохимии ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава» и МУЗ «Стоматологическая поликлиника №6»

Основные положения, выносимые на защиту

1. При пародонтитах происходит изменение активности ферментов и концентрации метаболитов в ротовой жидкости. Селеноорганический препарат ДАФС-25 взаимодействует с ферментами ротовой жидкости,ДАФС-25 уменьшает концентрацию малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в ротовой жидкости.

2. Препарат ДАФС-25 может в присутствии аминокислот аргинина и гистидина проявлять слабую ферментативную активность, схожую с активностью ЛДГ.

3. Активность фермента ЛДГ возрастает при облучении ротовой жидкости действием КВЧ-диапазона на частоте 65 ГГц.

Апробация результатов исследования

Основные положения диссертации рассмотрены и обсуждены на IX международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2008); VII межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2008); на межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и наука: итоги и перспективы» (Саратов, 2008); на 69-й научно-практической конференции студентов и молодых ученых ГОУ ВПО Саратовский ГМУ Росздрава «Молодые ученые -здравоохранению региона» (Саратов, 2008).

Материалы диссертации обсуждены и одобрены на заседаниях кафедры биохимии ГОУ ВПО Саратовский ГМУ Росздрава.

По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 2 в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 155 страницах машинописного текста, включает 10 таблиц и иллюстрирована 36 рисунками. Библиография включает 147 источников, в том числе 79 отечественных и 68 зарубежных.

Содержание работы

Клипические методы исследования

Клинические данные регистрировали в разработанные нами формализованные истории болезни. При клиническом осмотре отмечали зубную формулу, состояние слизистой оболочки полости рта, наличие некариозных поражений, мягкий зубной налет, над- и поддесневые зубные отложения, наличие или отсутствие аномалий зубов и прикуса.

Для объективной оценки гигиенического состояния полости рта и тканей пародонта в процессе наблюдения использовали следующий тест:

пародонтальный индекс (Rüssel A.L., 1956) - ПИ.

Индекс ПИ необходим для выявления степени выраженности воспалительно-деструктивных изменений в тканях пародонта. Оценивают состояние пародонта у каждого зуба: 0 - нет воспаления, I - легкий гингивит, воспаление не окружает весь зуб, II -гингивит, воспаление полностью окружает зуб, но повреждения прикрепленного эпителия нет, III - гингивит с образованием патологического зубо-десневого кармана, прикрепленный эпителий поврежден, жевательная функция зуба не нарушена, зуб неподвижен, IV - выраженная деструкция тканей пародонта с потерей жевательной функции, зуб легко подвижен, может быть смещен.

Затем оценки складывают и определяют индекс по формуле:

^^ _ сумма оценок количество зубов

Интерпретация индекса: 0,1-1,5 - начальная, I стадия пародонтита; 1,5-4,0 - II стадия; 4,0-8,0 - III стадия.

Биохимические методы исследования

Объектом исследования являлась нестимулированная ротовая жидкость, полученная путем оплевывания. Собранная ротовая жидкость в количестве 2-3 мл использовалась для исследования параметров минерального обмена (кальций), углеводного обмена (глюкозы, лактата, лактатдегидрогеназы и а-амилазы), общего белка, щелочной фосфатазы. Данная часть исследования проводилась с помощью готовых наборов химических реагентов и биохимического анализатора Hospitex (Швейцария). Для получения разведений образцов ротовой жидкости использовали бидистиллированную воду.

Показатели минерального обмена. Кальций определялся колориметрическим методом с «ARSENAZO III» (о-крезолфталеином). Кальций в растворе при нейтральном значении pH образует с красителем «ARSENAZO III» окрашенный комплекс синего цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации кальция. Результаты выражались в ммоль/л (Smith H.J., Bauer P. J., 1979).

Показатели углеводного обмена. Глюкоза определялась глюкозооксидазным методом фотометрически при длине волны 500 (480-520) нм. Содержание глюкозы в ротовой жидкости выражалось в ммоль/л.

Содержание лактата определялось энзиматическим колориметрическим методом с лактатоксидазой и пероксидазой. Интенсивность окраски образованного комплекса пропорциональна концентрации лактата. Результаты выражались в ммоль/л (Персиц М.М. и соавт., 1990).

Общий белок. Принципом определения общего белка является биуретовый метод без контроля по образцу. Интенсивность окраски фиолетово-синего комплекса пропорциональна концентрации общего белка в образце. Результаты выражались в г/л (Henry A.J., 1957; Peters T.J., 1968).

Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977).Принцип метода: при 100°С в кислой среде малоновый диальдегид реагирует с 2-тиобарбитуровой кислотой, образуя окрашенный триметиновый комплекс, с максимумом поглощения при 532 нм. Молярный коэффициент экстинкции этого комплекса-е= 1,56х105 см"'хМ"'.

Расчет: количество малонового диальдегида рассчитывают, используя указанную выше величину молярного коэффициента экстинкции, и полученный результат выражают в мкмоль/л.

Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот (Стальная И.Д., 1977).Принцип метода: в ходе перекисного окисления на стадии образования свободных радикалов в молекулах полиненасыщенных высших жирных кислот возникает система сопряженных двойных связей, что сопровождается появлением нового максимума в спектре поглощения - X = 233 нм, е = 2,2x10 М"'хсм''.

Расчет: содержание диеновых конъюгатов в пробе рассчитывают в мкмоль/л, используя величину молярного коэффициента экстинкции при 233 нм.

Определение активности щелочной фосфатазы в ротовой жидкости. В работе использовали биохимический анализатор "Hospitex" (Швейцария) и набор жидких реагентов, готовых к определению активности щелочной фосфатазы в плазме крови. Производитель ЗАО «Диакон». Номенклатурный номер: 10 040 021 ; 10 040 022.

Принцип метода: кинетический УФ-анализ. Разработан в соответствии с рекомендациями DGKC (Германское Общество Клинической Химии).

Определение активности лактатдегидрогеназы в ротовой жидкости. В работе использовали биохимический анализатор "Hospitex" (Швейцария) и набор жидких реагентов, готовых к определению активности лактатдегидрогеназы в плазме крови. Производитель ЗАО «Диакон». Номенклатурный номер: 10 420 021 10 420 022.

Принцип метода. УФ-метод, оптимизированный в соответствии с требованиями DGKC (Германское Общество Клинической Химии).

Определение активности амилазы в ротовой жидкости, а-амилаза определялась колориметрическим ферментативным методом. Результаты выражались в Е/л (Ткачук В.А. и соавт., 2002).

Определение активности лактатдегидрогеназы при облучении ротовой жидкости в КВЧ-днапазоне. В работе использовался метод спектрофотометрии, так как он наиболее удобный и чувствительный, поскольку в изучаемых реакциях участвовали вещества, обладающие характерными спектральными свойствами.

Метод непрерывной регистрации скорости ферментативной реакции основан на том, что в её ходе происходит уменьшение количества вещества, обладающего характерными спектральными свойствами - НАДН («Sigma»).

Спектры поглощения НАДН регистрировались с помощью спектрофотометра «Specord UV VIS» (Германия) в диапазоне волн от 220 до 400 нм.

Скорость реакции определяли по уменьшению содержания НАДН (максимум поглощения при длине волны 340 нм) в реакционной смеси в результате восстановления пирувата в лактат.

Была проведена серия контрольных реакций, в которых проводилось облучение компонентов реакционной смеси по отдельности на резонансной частоте 65 ГГц, мощность 0,5 мкВт («Телемак»). В дальнейшем исследовали ротовую жидкость, содержащую фермент лаетатдегидрогеназу в опытном растворе, облученном на той же частоте.

В данной работе для аппроксимации кинетических кривых и графиков зависимости скорости реакции от концентрации субстрата и вычисления параметров реакции использовалась программа Origin 7.0.

Статистическая обработка результатов

На заключительном этапе исследования полученные результаты проанализированы и систематизированы математическим методом оценки с применением пакета прикладных программ «Medstat» и ПЭВМ класса IBM RS ХТ.Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с использованием методов вариационной статистики с выявлением достоверности различий по критерию Фишера-Стьюдента. Оценку точности и надежности числовых характеристик определяли по 95% доверительному интервалу истинного среднего значения. Графики и диаграммы в работе построены с использованием стандартных приложений (MICROSOFT EXCEL).

Клииико-биохимические результаты обследования стоматологических больных

У всех категорий лиц было проведено комплексное обследование состояния стоматологического статуса.

В основной группе обследованных - 45 больных, по 15 пациентов с пародонтитом I -III степеней тяжести; в группе сравнения (интактный пародонт) - 15 пациентов. Больные жаловались на значительную болезненность при приеме пищи, жжение в области десен, неприятный запах изо рта, спонтанную кровоточивость, иногда возникающую при движении губ, языка; подвижность одного или группы зубов; гноетечение и гиперемию в области десен. При объективном обследовании обнаружены диффузный характер воспалительного процесса в деснах, выраженная гиперемия слизистой оболочки десны с вовлечением переходной складки, (таблица 1); III степень кровоточивости, интенсивная болезненность десен, выбухание участков десны, которые соответствовали расположению причинного пародонтального кармана; характер экссудата был гнойным и гнойно-геморрагическим в умеренном количестве. Глубина пародонтальных карманов варьировала от 4 до 8,5мм, индекс ПИ составил в среднем 1,3 у больных 1-й группы, 2,8 - у пациентов 2-й группы и 7,3 - у пациентов 3-й группы.

В результате проведенных исследований ротовой жидкости лиц с интактным пародонтом и пациентов с пародонтитом различной степени тяжести установлено, что при поражении пародонта отмечается увеличение активности ЛДГ и ЩФ на фоне резкого снижения активности а- амилазы, что отражено в таблице 1.

Вероятно, это происходит, с одной стороны, в результате активизации пародонто-патогенной бактериальной микрофлоры, содержащей большое количество ЛДГ и ЩФ.

С другой стороны, увеличение активности ЛДГ и ЩФ может быть обусловлено разрушением тканей пародонта и выходом в ротовую жидкость данных ферментов из клеток соединительной ткани и клеток, участвующих в поддержании структуры зуба, -остеокластов и остеобластов.

Необходимо отметить, что достоверное увеличение активности ЩФ по сравнению с контрольной группой наблюдается у пациентов с пародонтитом II и III степеней. При пародонтите II степени тяжести активность ЩФ по сравнению с контролем повышается в среднем в 1,5 раза, при развитии тяжелой формы пародонтита - в 2,2 раза.

Напротив активность ЛДГ нарастает с момента инфицирования пародонта, высокая активность которой отмечается в слюне больных пародонтитом, начиная с I степени. Существенных различий в увеличении активности ЛДГ при пародонтите I и II степеней не выявлено: активность фермента (по сравнению с контролем - 100%) составила 167% и 168% соответственно. С развитием более тяжелой формы пародонтита (III степень) активность ЛДГ увеличивается в среднем до 213%.

Таблица 1

Биохимические показатели ротовой жидкости при пародонтите различных степеней тяжести.

Исследуемые группы Интактный пародонт Пародонтит 1 степени Пародонтит II степени Пародонтит III степени

показатель М±т М±т Р М±т Р М±т Р

Глюкоза, ммоль/л 7,23±0,29 7,29±0,42 >0,05 7,86±0,28 >0,05 8,82±0,33 <0,05

Лактат, ммоль/л 0,31±0,08 0,67±0,19 <0,05 1,00±0,24 <0,05 3,50«),63 <0,05

Общий белок, г/л 129,17± 10,88 236,86± 18,80 <0,05 251,8±22,29 <0,05 352,57±10,24 <0,05

Са, ммоль/л 1,87±0,16 2,40±0,35 <0,05 2,48±0,32 >0,05 2,93±0,41 <0,05

ЛДГ, ед/л 201,92±10,69 337,29±30,16 <0,05 340,00*22,01 <0,05 429,71±27,21 <0,05

ЩФ, ед/л 16,50±0,44 16,71±0,68 >0,05 25,00±1,24 <0,05 36,43±2,38 <0,05

Амилаза, ед/л 57,75±3,64 54,00±5,12 >0,05 33,00±2,21 <0,05 21,29±1,71 <0,05

Р- уровень вероятности ошибки в сравнении с контролем.

Снижение активности амилазы обусловлено, по всей видимости, поражением секреторных клеток слюнных желез продуктами жизнедеятельности микроорганизмов. Анаэробные процессы, инициируемые бактериальными клетками, приводят к увеличению концентрации молочной кислоты в ротовой жидкости. В свою очередь, лактат является слабой кислотой и, следовательно, поставляет в раствор ионы водорода, которые закисляют ротовую жидкость, сдвигают pH в кислую сторону, что в свою очередь, приводит к снижению активности амилазы, поскольку известно, что активность амилазы проявляется при нейтральных и слабощелочных значениях pH (рН=6,8-7,2). Гипоферментемия амилазы наблюдается параллельно с возрастанием концентрации лактата в слюне при пародонтите II и III степеней. Активность амилазы при средней форме пародонтита (И степень) составляет 57% относительно контроля (100%), при тяжелом пародонтите - только 37%. При этом концентрация лактата по сравнению с контролем увеличивается от 322% до 1129% при пародонтите II и III степеней соответственно.

В процессе эксперимента было оценено содержание глюкозы в слюне. Достоверное отклонение по сравнению с контрольным значением выявлено только в случае тяжелой бактериальной инфекции ротовой полости (III степень пародонтита) - концентрация глюкозы составила 122%.

При тяжелой форме пародонтита отмечено высокое содержание в слюне кальция -157% по отношению к контрольной группе(100%).

Увеличение концентрации глюкозы и кальция при развитии тяжелой формы пародонтита, вероятно, объясняется цитолизом клеток соединительной ткани, а также

разрушением остеокластов и остеобластов вследствие остеорезорбирующей агрессии патогенной микрофлоры.

В процессе работы было обнаружено изменение содержания общего белка во всех группах с инфицированным пародонтом. Концентрация общего белка возрастала пропорционально тяжести пародонтита, и, вероятно, объясняется тем, что прирост общего белка имеет бактериальное и клеточное происхождение.

Биохимическое исследование ротовой жидкости у больных пародонтитом позволило установить, что наиболее выраженный характер изменений биохимических показателей наблюдается при пародонтитах II и III степеней. Активность пародонтопатогенных

бактерий приводит к увеличению активности ЛДГ и ЩФ в 2,2 раза; подавляет активность амилазы в 1,7-2,7 раза; способствует увеличению концентрации лактата и общего белка.

Диагностика заболеваний пародонта I степени с помощью биохимических критериев слюны представляет определенные трудности, поскольку при наличии пародонтита I степени исследуемые показатели, за исключением ЛДГ и общего белка, находятся в пределах нормы.

Изменение активности ферментов ротовой жидкости у пациентов с интактным пародонтом и у больных пародонтитом различной степени тяжести в присутствии препарата ДАФС-25 (in vitro)

В результате проведенного исследования установлено, что в присутствии селеноорганического препарата происходит измененияе активности ферментов (амилаза, ЩФ, ЛДГ) ротовой жидкости у пациентов с интактным пародонтом in vitro. Установлено повышение активности всех вышеназванных ферментов. В присутствии растворителя ДМФА отмечаются более выраженный эффект снижения активности ЛДГ и некоторое увеличение активности амилазы и ЩФ, потому что являясь гидрофобным соединениемДМФА, по всей видимости, разрушает гидрофобные связи между субъединицами ЛДГ (тетрамер), что приводит к снижению активности фермента. Фермент амилаза представляет собой полипептид с молекулярной массой примерно 55 килодальтон, хорошо растворим в воде. По всей вероятности, происходят менее выраженное взаимодействие гидрофобных соединений ДМФА и ДАФС-25 с амилазой и подавление ее активности, хотя нельзя исключить возможности проникновения этих препаратов в гидрофобные домены полипептидной цепочки амилазы.

Обнаружено увеличение активности ферментов в присутствии ДАФС-25. При добавлении в раствор ротовой жидкости, взятой у пациента с интактным пародонтом, 1 мкл смеси ДАФС-25 и ДМФА наблюдалось увеличение активности амилазы с 59,95 ед/л до 75,10, что соответствовало увеличению активности в 1,25 раза. При добавлении в раствор ротовой жидкости, взятой у пациента с пародонтитом I степени, 1 мкл смеси ДАФС-25 и ДМФА наблюдалось увеличение активности амилазы с 54 до 83,35, что соответствовало увеличению активности в 1,5 раза. При добавлении в раствор ротовой жидкости, взятой у пациента с пародонтитом II степени, 1 мкл смеси ДАФС-25 и ДМФА наблюдалось увеличение активности амилазы с 32,65 до 70,60, что соответствовало увеличению активности фермента в 2,3 раза.

При добавлении в раствор ротовой жидкости, взятой у пациента с интактным пародонтом, 1 мкл смеси ДАФС-25 и ДМФА наблюдалось увеличение активности амилазы с 21,5 до 69,70, что соответствовало увеличению в 3,3 раза. Добавление в раствор ротовой жидкости, взятой у пациента с интактным пародонтом, 1 мкл смеси ДАФС-25 и ДМФА приводило к незначительному увеличению активности ЛДГ с 202,35 до 209,55, что соответствовало увеличению в 1,03 раза. Более высокие цифры активности были получены для ЛДГ при пародонтитах I, II и III степеней. При добавлении в раствор ротовой жидкости, взятой у пациента с пародонтитом I степени, 1 мкл смеси ДАФС-25 и ДМФА наблюдалось увеличение активности ЛДГ с 325,8 до 342,85, что соответствовало увеличению в 1,05 раза.

При добавлении в раствор ротовой жидкости, взятой у пациента с пародонтитом II степени, 1 мкл смеси ДАФС-25 и ДМФА наблюдалось увеличение активности ЛДГ с 340,8 до 365,25, что соответствовало увеличению в 1,075 раза. При добавлении в раствор ротовой жидкости, взятой у пациента с пародонтом III степени, 1 мкл смеси ДАФС-25 и ДМФА наблюдалось увеличение активности ЛДГ с 400,6 до 413,5, что соответствовало увеличению в 1,03 раза. Однако, если сравнивать активность ЛДГ в присутствии ДМФА с активностью ЛДГ в присутствии ДАФС-25 и ДМФА, а также в отсутствие данных соединений, то прослеживается явная закономерность, а именно, добавление ДМФА в

раствор ротовой жидкости приводило к снижению активности ДЦГ по сравнению с раствором ротовой жидкости, не содержащей ДМФА. Увеличение активности ДЦГ наблюдалось в случае добавления в реакционную смесь ДАФС-25, что, вероятно, указывает на каталитические способности данного препарата по отношению к ферменту лактатдегидрогеназе.

Активность фермента щелочной фосфатазы увеличивалась в ротовой жидкости, полученной от пациентов с интактным пародонтом, и составляла в среднем 18,8 от контрольного значения 16,25 ед/л при добавлении в среду ДМФА и несколько снижалась при добавлении в среду ДМФА и ДАФС-25 до отметки 16,05 ед/л. При исследовании активности ЩФ в растворах ротовой жидкости, полученной от больных с пародонтитами различной степени тяжести, обнаружено, что активность ЩФ монотонно возрастает при нарастании патологического процесса в тканях пародонта и имеет тенденцию к увеличению активности фермента при добавлении в среду ДМФА. Показано в экспериментальных исследованиях, что активность ЩФ снижается при добавлении в среду ДМФА и ДАФС-25.

Более выраженные тенденции в изменении активности ферментов обнаруживаются при добавлении в среду ротовой жидкости 10 мкл растворов ДМФА и ДАФС-25.

Результаты исследовании ротовой жидкости у больных пародоптнтом различной степени тяжести в присутствии ДМФА (1 мкл/мл) и ДАФС-25 + ДМФА (1мкг/1мкл ДМФАЛмл слюны)

Биохимические показатели слюны при интактном пародонте в присутствии ДМФА (1 мкл/мл) и ДАФС-25 + ДМФА (1 мкг/1 мкл ДМФАЛмл слюны)

Контроль Контроль + ДМФА Контроль + ДМФА + ДАФС-25

М±ш М±т Р М±т Р Р1

ЛДГ, ед/л 202,35±6,69 194,60±6,51 >0,05 209,55±6,87 >0,05 >0,05

ЩФ, ед/л 16,25±0,37 18,80±0,51 <0,05 16,05±0,55 >0,05 <0,05

Амилаза, ед/л 59,95±2,62 62,55±2,78 >0,05 75,10±2,67 <0,05 <0,05

Биохимические показатели слюны при пародонтите I степени в присутствии ДМФА (1 мкл/мл) и ДАФС-25 + ДМФА (1мкг/1 мкл ДМФА/1мл слюны)

Пародонтит 1 Пародонтит 1 + ДМФА Пародонтит 1 + ДМФА + ДАФС-25

М±ш М±т Р М±т Р Р1

ЛДГ, ед/л 325,80±11,47 304,05±11,64 >0,05 342,85±10,70 >0,05 <0,05

ЩФ, ед/л 16,45±0,69 20,00±0,60 <0,05 15,70±0,42 >0,05 <0,05

Амилаза, ед/л 54,00±2,63 55,90±2,65 >0,05 83,35±2,82 <0,05 <0,05

Биохимические показатели слюны при пародонтите II степени в присутствии ДМФА (1 мкл/мл) и ДАФС-25 + ДМФА (1 мкг/1мкл ДМФАЛмл слюны)

Пародонтит 2 Пародонтит 2 + ДМФА Пародонтит 2 + ДМФА + ДАФС-25

М±ш М±ш Р М±т Р Р1

ЛДГ, ед/л 340,80±13,41 321,45±13,53 >0,05 365,25±13,80 >0,05 >0,05

ЩФ, ед/л 23,90±0,88 24,95±0,83 >0,05 16,00±0,68 <0,05 <0,05

Амилаза, ед/л 32,65±1,67 36,80±1,76 >0,05 70,6(^2,08 <0,05 <0,05

Биохимические показатели слюны при пародонтите III степени в присутствии ДМФА (1мкл/мл) и ДАФС-25 + ДМФА (1 мкг/1мкл ДМФА/1мл слюны)

Пародонтит 3 Пародонтит 3 + ДМФА Пародонтит 3 + ДМФА + ДАФС-25

М±ш М±ш Р М±ш Р Р1

ЛДГ, ед/л 400,60±14,56 364,45±14,63 >0,05 413,50±15,07 >0,05 <0,05

ЩФ, ед/л 34,10±1,25 36,55±1,28 >0,05 24,40±1,06 <0,05 <0,05

Амилаза, ед/л 21,50±1,10 24,90±1,28 <0,05 69,70±1,82 <0,05 <0,05

Исследование концентрации малонового диальдегида и диеновых конъюгатов у больных пародонтитом с различной степенью тяжести

Определение малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в ротовой жидкости являются дополнительными критериями, отражающими процессы перекисного окисления липидов в организме. Процессы ПОЛ сдерживаются антиоксидантными системами, включая и фермент каталазу. Однако лечебные мероприятия, направленные на укрепление клеточных мембран, выступают на первый план наряду со специфическими лечебными приемами, которые применяются при лечении ПРД.

Следовательно, наряду со специфическими маркерами: иммунологическими, серологическими, микробиологическими, биогенными аминами, необходимо обратиться к менее специфическим, но не менее значимым биохимическим маркерам. К таким, на наш взгляд, можно отнести уровень малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в ротовой жидкости.

Малоновый диальдегид отражает процессы перекисного окисления липидов, следовательно, является маркером на процессы распада клеточных биомембран, поэтому общее нарастание или уменьшение концентрации этого метаболита в ротовой жидкости будет служить достаточно надежным критерием прогноза и течения заболевания, а также оценки эффективности проводимого лечения.

При исследовании концентрации малонового диальдегида у больных ПРД с различной степенью тяжести обнаружено изменение этого показателя в ротовой жидкости (рис. 1). При этом наибольшая концентрация МДА обнаруживается у больных с тяжелой степенью тяжести ПРД.

ДК также увеличиваются в ротовой жидкости у больных ПРД с различной степенью тяжести (рис.2). _

Норма Степень тяжести ПРД

Легкая, мкмоль/л Средняя, мкмоль/л Тяжелая, мкмоль/л

М±ю М±т Р М±т Р М±т Р

6,32±0,12 6.93±0,22 <0,05 8.13±0,4 <0,01 11,5±0,3 <0,01

Рис. 1. Концентрация малонового диальдегида (мкМ/л) в ротовой жидкости в норме и у больных пародонтитом различной степени тяжести.

При исследовании содержания малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в ротовой жидкости больных ПРД обращает на себя внимание тенденция увеличения концентрации МДА и ДК в ротовой жидкости при нарастании патологического процесса мягких тканей у больных ПРД. Можно утверждать, что концентрация МДА и ДК является общим неспецифическим показателем, который отражает выраженность патологического процесса. Действительно, при ПРД III степени тяжести обнаруживаются 8,13±0,4 мкМ/л малонового диальдегида и 2,14±0,15 мкМ/л диеновых конъюгатов, в то время как без осложнений эти показатели ниже: 6,93±0,22 мкМ/л для МДА и 1,93±0,12 мкМ/л для диеновых конъюгатов. В то же время, и МДА и ДК при ПРД 3-й степени были значительно выше по сравнению с контролем: 11.5±0,3 мкМ/л для МДА и 2.68±0,18 для ДК.

При добавлении в ротовую жидкость селеноорганического препарата отмечалось снижение концентрации малонового диальдегида и диеновых конъюгатов, что можно расценивать как проявление антиоксидантных свойств препарата ДАФС-25 (рис.3, рис.4).

Норма Степень тяжести ПРД

Легкая, мкмоль/л Средняя, мкмоль/л Тяжелая, мкмоль/л

М±ш М±ш Р М±т Р М±т Р

1,84±0,04 1,93±0,12 <0,001 2,14±0,15 <0,001 2,68±0,18 <0,001

□ ДК

норма

среди

Рис. 2. Концентрация диеновых конъюгатов (мкМ/л) в ротовой жидкости в норме и у больных парадонтитом различной степени тяжести.

Норма Степень тяжести ПРД

Легкая, мкмоль/л Средняя, мкмоль/л Тяжелая, мкмоль/л

М±т М±ш Р М±т Р М±т Р

6,32±0,12 6,65±0,14 <0,05 7,2±0,11 <0,01 9,02±0,21 <0,01

норма

легк

средн

тяж

Рис. 3. Концентрация малонового диальдегида (мкМ/л) в ротовой жидкости в норме и у больных пародонтитом различной степени тяжести при добавлении препарата ДАФС-25 в ротовую жидкость.

Норма Степень тяжести ПРД

Легкая, мкмоль/л Средняя, мкмоль/л Тяжелая, мкмоль/л

М±т М±ш Р М±т Р М±т Р

1,84±0,04 1,87±0,09 >0,05 1,96±0,12 >0,05 2,12±0,15 <0,05

норма легк средн тяж

Рис. 4. Концентрация диеновых конъюгатов (мкМ/л) в ротовой жидкости в норме и у больных пародонтитом различной степени тяжести при добавлении препарата ДАФС-25 в ротовую жидкость.

Исследование активности фермента ластатдегидрогеназы в присутствии ДАФС-25 и метаболитов в ротовой жидкости у пациентов с иитактпым пародонтом и у больных пародонтитом различной степени тяжести (in vitro).

Проводили исследования с использованием комплекса гистидина и аргинина с 1,5-ди-(2,4-дигидроксифенил)-3-селенопентадион-1,5.

В работе используют две кюветы: кювету определения и кювету сравнения. В кювету определения последовательно вносят 3000 мкл фосфатного буфера, 150 мкл NADH, 150 мкл пирувата натрия, 2 мкл аргинина, 2 мкл гистидина, 10 мкл ДАФС-25 с РА. В кювету сравнения - 3000 мкл фосфатного буфера, 2 мкл аргинина, 2 мкл гистидина, 10 мкл ДАФС-25 с РА. Спектры регистрируют после добавления фосфатного буфера, НАДН + Н+ и пирувата натрия (выдержка 10 мин), аргинина и гистидина (выдержка 10 мин) в кювету на спектрофотометре «Specord UV VIS» в диапазоне волн от 220 до 400 нм. Далее самописец спектрофотометра устанавливают на отметку 29,5, что соответствует длине волны 340 нм. С помощью секундомера определяют время прохождения реакции.

Проводят опыт с комплексом гистидин и аргинин. В работе используют две кюветы: кювету определения и кювету сравнения. В кювету определения последовательно вносят 3000 мкл фосфатного буфера, 150 мкл NADH, 150 мкл пирувата натрия, 2 мкл аргинина, 2 мкл гистидина. В кювету сравнения - 3000 мкл фосфатного буфера, 2 мкл аргинина, 2 мкл гистидина. Спектры регистрируют после добавления фосфатного буфера, НАДН + Н+ и пирувата натрия (выдержка 10 мин), аргинина, гистидина (выдержка 10 мин) в кювету на спектрофотометре «Specord UV VIS» в диапазоне волн от 220 до 400 нм. Далее самописец спектрофотометра устанавливают на отметку 29,5, что соответствует длине волны 340 нм. Засекают с помощью секундомера время и через 30 минут опускают самописец на бумагу, отмечают точку. Прослеживают ход реакции.

Было обнаружено, что при применении препарата ДАФС-25 возрастала активность ЛДГ. Это может быть объяснено разрушением клеточных мембран или увеличением активности фермента по иным механизмам, что создало предпосылку для дополнительного исследования (Древко Б.И., Бородулин В.Б., Кирова Ю.И. и соавт., 2003; Древко Б.И., Бородулин В.Б., Щинов Е.В. и соавт., 2003).

В настоящее время хорошо известен механизм действия ЛДГ в паре с НАДН+Н+, причем активность ЛДГ обычно определяют по спектральным данным, которые характеризуют равновесие НАДН+Н+ г » НАД+. При закислении среды, то есть при увеличении концентрации протонов в растворе, равновесие реакции смещается влево - в сторону образования молочной кислоты.

Общая схема механизма может быть представлена следующим образом: СН3 СНз

Н—С—ОН + NAD+ ., - С=0 + NAD+ + Н+ СОО" ¿00"

Известны данные о механизме воздействия ЛДГ на пируват в присутствии НАДН. Если рассматривать селеноэфиры как основания Льюиса, то можно заметить, что они по свойствам будут в значительной мере аналогичны свойствам гистидина (His-195) в представленной схеме, поэтому нами была высказана гипотеза возможности участия ДАФС-25 в протекании процессов, которые катализируются ферментативным гистидиновым активным центром (рис. 5).

и

соын2

,(Шэ-195)

(Аг8-171)

I

^н

а.

Я

,СОШ2

/СН2СОРЬ

о

о

б.

Рис. 5. Активный центр фермента лактатдегидрогеназы (а). Формирование активного центра с участием ДАФС-25 (б).

Следует отметить, что делокализованный отрицательный заряд на трансформируемой молекуле компенсируется аргинином. Вместо аргинина в данной реакции можно использовать мочевину, однако вероятность данного процесса невысока.

Был проведен комплекс исследований по изучению воздействия препарата ДАФС-25 на активность ЛДГ. Исследования показали, что препарат в сочетании с некоторыми аминокислотами может дублировать действие ЛДГ. Однако действие препарата имело низкую активность, что могло быть объяснено плохой растворимостью препарата в исследуемой буферной системе.

При исследовании системы,включающей аргинин и гистидин, у каталитических центров, не включенных в оболочку фермента, то есть без селеноорганического препарата, активность,аналогичная ЛДГ, практически не наблюдается. Однако добавление в данную систему минимального количества изучаемого нами препарата привело к резкому возрастанию каталитической активности.

Несколько меньшую каталитическую активность препарат проявлял в сочетании с аргинином, тогда как в сочетании с гистидином каталитическая активность практически не наблюдалась.

о -I-.—........;...........г-

0 200 400 600 800 сек

Рис. 6. Изменение концентрации НАДН в контроле и в присутствии ДАФС-25.

Экспериментальные данные показали, что препарат ДАФС-25 и его аналоги проявили незначительную активность, аналогичную ферментативной. Присутствие мочевины как заменителя аргинина не повысило активность препаратов, что позволило сделать вывод о незначительной каталитической активности препарата ДАФС-25 и его аналогов в присутствии мочевины или аргинина, хотя в присутствии данной аминокислоты была обнаружена незначительная активность ДАФС-25.Более ярко активность препарата представлена в реакции, где присутствует сам препарат ДАФС-25,а также гистидин и аргинин.

Изменение скорости восстановления пирувата в лактат в присутствии ДАФС-25 позволило сделать выводы об участии препарата в процессе, аналогичном ферментативному, хотя и протекающему с низкой скоростью.

Необходимо отметить, что активность ЛДГ увеличивалась в присутствии аминокислот аргинина и гистидина при наличии препарата ДАФС-25 в растворе ротовой жидкости, взятой от больных пародонтитом различной степени тяжести (рис. 6).

Определение активности лактатдегидрогеназы при облучении ротовой жидкости в КВЧ-диапазоне.

Облучение ротовой ротовой жидкости проводили в КВЧ-диапазоне на частоте 65 ГГц. Данная частота является резонансной для молекул воды, формирующих гидратную оболочку вокруг ферментов. Вероятно, разрушение подобной оболочки и будет приводить к усилению активности фермента ЛДГ, что, наверное, не будет являться благоприятным фактором в лечении пародонтитов, поскольку увеличение активности ЛДГ будет, в свою очередь, увеличивать концентрацию лактата в среде и, следовательно, приводить к увеличению концентрации протонов в ротовой жидкости, которые будут способствовать уменьшению активности амилазы (рис. 7).

Таким образом, при совместном использовании препарата ДАФС-25, излучения в КВЧ-диапазоне на частоте 65 ГГц и аминокислот аргинина и гистидина возможно значительное увеличение активности фермента ЛДГ в ротовой жидкости.

Контроль Пародонтит 1 Пародонтит 2 Пародонтит 3

М±ш Р М±т Р М±т Р М±т Р

Без КВЧ 202,35±6,69 325,80±11,47 340,80±23,41 400,60±44,56

С КВЧ 299,30±10.5 532,10±14.9 597,60±21.7 672,30±35.5

800

700 -

Контроль Пародонтит 1 Пародонтит 2 Пародонтит 3

Рис. 7. Изменение активности ЛДГ в ротовой жидкости под действием КВЧ-излучения в контроле и при пародонтитах различной степени тяжести.

ВЫВОДЫ

1. Биохимическое исследование ротовой жидкости у больных пародонтитом позволило установить,что наиболее выраженный характер изменений биохимических показателей наблюдается при пародонтитах II и III степеней:активность ЛДГ увеличивается в 1,64 и 2,13 раза соответственно;акгивность ЩФ увеличивается в 1,5 и 2,2 раза соответственно;активность амилазы уменьшается в 1,7 и 2,7 раза соответственно;происходит увеличение концентрации лактата и общего белка. Обнаружено увеличение концентрации малонового диальдегида и диеновых конъюгатов у больных пародонтитом. Концентрация продуктов перекисного окисления липидов - малонового диальдегида, диеновых конъюгатов - как показателей степени повреждения тканей ротовой полости у больных пародонтитом находится в прямой зависимости от степени тяжести заболевания.

2. Обнаруживается зависимость между степенью тяжести пародонтита и нарастанием активности ферментов лактатдегидрогеназы и щелочной фосфатазы, поскольку лактатдегидрогеназа является индикатором анаэробных процессов в тканях ротовой полости и косвенно определяет предрасположенность ткани к окислительному стрессу и развитию процессов ПОЛ, а щелочная фосфатаза отражает процессы повреждения слизистой оболочки ротовой полости. Обнаружено снижение активности фермента амилазы в ротовой жидкости при пародонтитах различной степени тяжести.

3. Применение препарата ДАФС-25 in vitro, обладающего антиоксидантным и мембранопротекторным действием, улучшает биохимические показатели ротовой жидкости у больных пародонтитом с различной степенью тяжести основного заболевания: происходит увеличение активности фермента амилазы на фоне снижения активности щелочной фосфатазы и незначительно меняющейся активности лактатдегидрогеназы. Отмечается снижение концентрации малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в образцах ротовой жидкости у больных пародонтитом различной степени тяжести.

4. Увеличение скорости восстановления пирувата в лактат в присутствии ДАФС-25 и аминокислот аргинина и гистидина свидетельствует об участии препарата в процессе, аналогичном ферментативному, хотя и протекающему с низкой скоростью.

5. Происходит увеличение активности лактатдегидрогеназы ротовой жидкости при интактном пародонте и при пародоптитах различной степени тяжести при использовании излучения в КВЧ-диапазоне на частоте 65 ГГц.

Практические рекомендация

1. Для определения степени тяжести заболеваний пародоита можно использовать наряду с клиническими симптомами биохимические показатели ротовой жидкости: концентрацию метаболитов и активность ферментов - амилазы, щелочной фосфатазы и лактатдегидрогеназы, особенно на ранних стадиях развития пародонтита.

2. Целесообразно использовать информативность биохимических показателей для определения на ранних стадиях развития пародонтитов средней и тяжелой степеней.

3. Препарат ДАФС-25 может использоваться после прохождения клинических испытаний как соединение, обладающее мембранопротекторным и антиоксидантным механизмом действия.

4. При применении препарата ДАФС-25 необходимо учитывать его способность незначительно стимулировать активность фермента лактатдегидрогеназы в присутствии аминокислот аргинина и гистидина.

5. При совместном использовании препарата ДАФС-25, излучения в КВЧ-диапазоне на частоте 65 ГГц и аминокислот аргинина и гистидина возможно значительное увеличение активности фермента ЛДГ в ротовой жидкости.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Совцова, К.Э. Моделирование активного центра лактатдегидрогеназы с участием селеноорганического препарата ДАФС-25 / К.Э. Совцова, В.Б. Бородулин // Обмен веществ при адаптации и повреждении: Материалы VII межвузовской конф. с междунар. участием. - Ростов-на-Дону, 2008. - С. 118-119.

2. Совцова, К.Э. Клинико-биохимическое исследование ротовой жидкости у больных пародонтитом / К.Э. Совцова, В.Б. Бородулин, H.A. Вельская // Здоровье и образование в XXI веке. Науч. труды IX междунар. конгресса. - М., 2008. - С. 460-461.

3. Совцова, К.Э. Изучение селеноорганического препарата ДАФС-25 и его аналогов в реакции восстановления пировиноградной кислоты в лактат / К.Э. Совцова // Молодые ученые - здравоохранению региона: Материалы 69-й науч.-практ. конф. студентов и молодых ученых СГМУ. - Саратов, 2008. - С. 198.

4. Совцова, К.Э. Исследование концентрации малонового диальдегида и диеновых конъюгатов у больных пародонтитом различной степени тяжести / К.Э. Совцова, В.Б. Бородулин, Н.В. Булкина // Молодежь и наука: итоги и перспективы: Материалы межрегиональной науч.-практ. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием. - Саратов, 2008. - С. 102.

5. Совцова, К.Э. Влияние низкоинтенсивного электромагнитного излучения крайне высокочастотного диапазона на активность лактатдегидрогеназы / Е.Г.Чеботарева, В.Б. Бородулин, К.Э. Совцова // Известия ВУЗов. Северо-Кавказ. регион. Естественные науки. -2008,-№6.-С. 80-81.

6. Совцова, К.Э. Клинико-биохимические показатели ротовой жидкости у больных пародонтитом / К.Э. Совцова, В.Б. Бородулин, H.A. Вельская // Вестник Российского Университета Дружбы Народов. Серия медицинская. - 2008. - №7. — С.528 - 532.

Список принятых сокращений

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

НАДН - восстановленный никотинамиддинуклеотид

ПИ - пародонтальный индекс

ЩФ - щелочная фосфатаза

ДМФА - диметилформамид

ПРД - пародонтит

Подписано в печать 13.03.09.0бъем— 1 печ. л. Тираж ЮО.Заказ №290 Отпечатано в ООО «Техно-Декор», 410012, Саратов, ул. Московская, 160

Актуальность проблемы. Распространенность воспалительных заболеваний пародонта среди взрослого и даже детского (уже с 12 лет) населения Российской Федерации остается довольно высокой, несмотря на большое количество проводимых научных исследований и предложенных методов лечения. Одним из ведущих факторов в этиологии и патогенезе заболеваний пародонта является микробная флора полости рта. Согласно современным представлениям, бактериальная агрессия, являясь одним из инициальных факторов в развитии заболеваний пародонта, вызывает различные формы поражения пародонтального комплекса в зависимости от характера и интенсивности спровоцированной ею ответной реакции организма. Полученные данные о роли анаэробной и смешанной бактериальной флоры в развитии заболеваний пародонта, позволили выделить группу так называемых пародонтопатогенных бактерий. Генетическая стратегия изменчивости микроорганизмов постоянно приводит к возникновению в микробных популяциях вариантов стойких к химиотерапевтическим препаратам, в том числе к антибиотикам.

Микроорганизмы поражают в первую очередь мембранный аппарат клеток слизистой оболочки полости рта. Необходимо отметить, что в условиях гипоксии и ацидоза резко усиливаются процессы перекисного окисления липидов мембран клеток слизистой оболочки, что, в свою очередь, будет приводить к накоплению в ротовой жидкости продуктов перекисного окисления липидов, которые будут понижать активность амилазы слюны. Поэтому поиск препаратов, обладающих антиоксидантным и мембранопротекторным действием является одним из актуальных вопросов клинической медицины и стоматологии.

Широкое применение в клинической практике излучений в КВЧ-диапазоне для улучшения реологии крови и увеличения проницаемости стенки сосудов для питательных веществ и кислорода (Шабогина А.А., 2006) предполагает более углубленное изучение воздействия подобных физических полей на ферменты и метаболиты биологических жидкостей, в том числе, и на ротовую жидкость у больных пародонтитом.

В последнее время интенсивно изучается роль селена в биохимических процессах, протекающих в живых организмах, поскольку он является необходимым ультрамикроэлементом, входящим в состав ряда ферментов (Тутельян В.А., Княжев В.А., Хотимченко С.А. и др., 2002).

Общеизвестна связь между селенистой недостаточностью и авитаминозом Е. В последние годы найдена взаимосвязь в организмах человека и животных между селеном и другими микроэлементами такими как: цинк, йод, медь и др. Установлено, что селен влияет на эффективность действия не только витамина Е но и многих других: А , Вб, С и др. (Тутельян В.А., Княжев В.А., Хотимченко С.А. и др., 2002; Arbur J.R., 1994).

Наиболее значимая биологическая функция селена в организме человека, животных и птиц состоит в обеспечении эффективной работы защитной антиокси-дантной системы организма. Он участвует в функционировании глутатионпероксидазы, разрушающей перекись водорода и липоперекиси и тем самым предохраняет клеточные мембраны от окислительной деструкции (Chu F.-F., Doroshow J.H., Esworthy R.S., 1993; Gamble S.C., Wiseman A., Goldfarb P.S., 1997; Колесниченко JI.C., Кулинский В.И., 1989).

Селен является необходимой составной частью ряда ферментов таких как: формиатдегидратаза, глицинредуктаза, глутатионпероксидаза. Известно, что селен участвует в формировании некоторых белков, в частности белка участвующего в переносе электрона между флавопротеидами и системой цитохромов (Chu F.-F., Doroshow J.H., Esworthy R.S., 1993; Sies H., 1993; Burk R.F., Hill K.E., 1993).

Несомненный интерес к селенорганическим соединениям обусловлен так же применением различных селенсодержащих препаратов в качестве пищевых добавок. Следует отметить, что большинство известных селеноорганических соединений токсичны. Неорганические соединения селена, как правило, еще более токсичны. Поэтому одним из направлений органического синтеза является поиск более активных и менее токсичных соединений, таких как соли селенопирилия, селеноксантилия, селенопираны и другие.

В то же время, остаются малоизученными биохимические механизмы действия селеноорганических препаратов на ферменты и метаболиты ротовой жидкости при патологии пародонта (пародонтит различной степени тяжести), что весьма актуально, так как может способствовать выбору наиболее оптимального соединения из ряда селеноорганических препаратов для лечения и профилактики воспалительных процессов в тканях пародонта.

Цель исследования

Целью настоящей работы является выявление клинико-лабораторных критериев для оценки степени тяжести повреждения пародонта и влияние физико-химических факторов на ферменты и метаболиты ротовой жидкости больных пародонтитом.

Задачи исследования

1. Определить активность ферментов и концентрацию метаболитов в ротовой жидкости у пациентов с пародонтитом различной степени тяжести.

2. Изучить характер изменений в концентрации метаболитов перекисного окисления липидов - малонового диальдегида и диеновых конъюгатов - в ротовой жидкости у пациентов с пародонтитом различной степени тяжести в присутствии селеноорганического препарата ДАФС-25.

3. Исследовать влияние селеноорганического препарата ДАФС-25 на активность лактатдегидрогеназы ротовой жидкости у лиц с интактным пародонтом и у лиц с пародонтитом различной степени тяжести in vitro.

4. Оценить изменение активности лактатдегидрогеназы при использовании селеноорганического препарата ДАФС-25 у больных пародонтитом in vitro в присутствии аминокислот аргинина и гистидина.

5. Определить активность фермента лактатдегидрогеназы при облучении ротовой жидкости у больных пародонтитом излучением КВЧ-диапазона in vitro.

Научная новизна

В результате проведенной работы установлено изменение активности ферментов и концентрации метаболитов, включая метаболиты перекисного окисления липидов, при различной степени повреждения пародонта.

Исследовано взаимодействие селеноорганического препарата ДАФС-25 с ферментами, содержащимися в ротовой жидкости у лиц с интактным пародонтом in vitro. Обнаружено изменение активности ферментов, принимающих участие в углеводном обмене. Изучена активность ферментов ротовой жидкости у больных с пародонтитом различной степени тяжести в присутствии препарата ДАФС-25.

Выявлены биохимические критерии для селеноорганического препарата ДАФС-25, при которых данный препарат может увеличить ферментативную активность ЛДГ.

Показано, что при действии излучения в КВЧ-диапазоне происходит увеличение активности фермента ЛДГ ротовой жидкости при интактном пародонте и при пародонтитах различной степени тяжести.

Практическая ценность

В результате проведенных исследований выявлены специфические особенности в изменении активности ферментов ротовой полости при наличии воспалительного процесса в пародонте. Можно предположить, что изученные биохимические механизмы действия ДАФС-25 могут служить в дальнейшем критерием выбора наиболее оптимального селеноорганического препарата, обладающего выраженными антиоксидантными мембранопротекторными свойствами, что позволит существенно улучшить результаты лечения данной категории больных. Использование аминокислот (в случае проведенных исследований - аргинина и гистидина) в виде биологически активных добавок, особенно в сочетании с препаратами, содержащими селен, должно оцениваться с позиции возможной активации лактатдегидрогеназы в ротовой жидкости, что имеет важное значение в лечении больных с пародонтитом.

Внедрение результатов исследования

Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс на кафедре биохимии ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава» и МУЗ «Стоматологическая поликлиника № 6» г. Саратова.

Апробация работы

Основные положения диссертации рассмотрены и обсуждены на IX международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2008); VII Межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2008); на межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и наука: итоги и перспективы» (Саратов, 2008); на 69-й научно-практической конференции студентов и молодых ученых ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет Росздрава» «Молодые ученые - здравоохранению региона» (Саратов, 2008).

Материалы диссертации обсуждены и одобрены на заседании кафедры биохимии и кафедры общей, биоорганической и фармацевтической химии ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава».

По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 2 в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 113 страницах машинописного текста, включает 1 таблицу и иллюстрирована 36 рисунками. Библиография включает 147 источников, в том числе 79 отечественных и 68 зарубежных авторов.

ВЫВОДЫ

1. Биохимическое исследование ротовой жидкости у больных пародонтитом позволило установить, что наиболее выраженный характер изменений биохимических показателей наблюдается при пародонтитах II и III степеней: активность ЛДГ увеличивается в 1,64 и 2,13 раза соответственно; активность ЩФ увеличивается в 1,5 и 2,2 раза соответственно; активность амилазы уменьшается в 1,7 и 2,7 раза соответственно; происходит увеличение концентрации лактата и общего белка. Обнаружено увеличение концентрации малонового диальдегида и диеновых конъюгатов у больных пародонтитом. Концентрация продуктов перекисного окисления липидов - малонового диальдегида, диеновых конъюгатов — как показателей степени повреждения тканей ротовой полости у больных пародонтитом находится в прямой зависимости от степени тяжести заболевания.

2. Обнаруживается зависимость между степенью тяжести пародонтита и нарастанием активности ферментов лактатдегидрогеназы и щелочной фосфатазы, поскольку лактатдегидрогеназа является индикатором анаэробных процессов в тканях ротовой полости и косвенно определяет предрасположенность ткани к окислительному стрессу и развитию процессов ПОЛ, а щелочная фосфатаза отражает процессы повреждения слизистой оболочки ротовой полости. Обнаружено снижение активности фермента амилазы в ротовой жидкости при пародонтитах различной степени тяжести.

3. Применение препарата ДАФС-25 in vitro, обладающего антиоксидантным и мембранопротекторным действием, улучшает биохимические показатели ротовой жидкости у больных пародонтитом с различной степенью тяжести основного заболевания: происходит увеличение активности фермента амилазы на фоне снижения активности щелочной фосфатазы и незначительно меняющейся активности лактатдегидрогеназы. Отмечается снижение концентрации малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в образцах ротовой жидкости у больных пародонтитом различной степени тяжести.

4. Увеличение скорости восстановления пирувата в лактат в присутствии ДАФС-25 и аминокислот аргинина и гистидина свидетельствует об участии препарата в процессе, аналогичном ферментативному, хотя и протекающему с низкой скоростью.

5. Происходит увеличение активности лактатдегидрогеназы ротовой жидкости при интактном пародонте и при пародонтитах различной степени тяжести при использовании излучения в КВЧ-диапазоне на частоте 65 ГГц.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для определения степени тяжести заболеваний пародонта можно использовать наряду с клиническими симптомами биохимические показатели ротовой жидкости: концентрацию метаболитов и активность ферментов - амилазы, щелочной фосфатазы и лактатдегидрогеназы, особенно на ранних стадиях развития пародонтита.

2. Целесообразно использовать информативность биохимических показателей для определения на ранних стадиях развития пародонтитов средней и тяжелой степеней.

3. Препарат ДАФС-25 может использоваться после прохождения клинических испытаний как соединение, обладающее мембранопротекторным и антиоксидантным механизмом действия.

4. При применении препарата ДАФС-25 необходимо учитывать его способность незначительно стимулировать активность фермента лактатдегидрогеназы в присутствии аминокислот аргинина и гистидина.

5. При совместном использовании препарата ДАФС-25, излучения в КВЧ-диапазоне на частоте 65 ГГц и аминокислот аргинина и гистидина возможно значительное увеличение активности фермента ЛДГ в ротовой жидкости