Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Биохимические пути регуляции гормональной чувствительности опухолевых клеток



..о

(• РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

КРАСИЛЬНИКОВ Михаил Александрович

БИОХИМИЧЕСКИЕ ПУТИ РЕГУЛЯЦИИ ГОШОНАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

14.00.14 - онкология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

МОСКВА 1993

Работа выполнена в лаборатория биохимии опухолей (руководитель -доктор биологических каук А.В.Лихтенштейн) Научно-исследовательского института канцерогенеза (директор - академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор Д.Г.Заридзе) Онкологического научного центра РДШ (директор - акад^.япс РАШ, профессор- Н.И.Трапездаков).

Официальные оппоненты: академик РДШ доктор медицинских наук

профессор _О.Д.Романов доктор биологических наук,

профессор Л.Б.Горбачева

доктор медицинских наук К.В.Ильин

Ведущее учреждение - Научно-исследовательский институт онкологии им.Н.Н.Петрова РАМН, г.Санкт-Петербург

Звадата состоится ■" 1993 г. в /£__ часов

на заседании Специализироваккого совета по защите докторских дассетаций (Д 001.17.01) при Онкологическом научном центре РАШ (Москва 115476, Каширское шоссе 24).

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотека Онкологического научного центра РАШ. -

Диссертация разослана " ^ 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

Ю.В.Шишшн

ООзая характеристика работы

Актуальность ппоблехи. ' Характерной особенность»

1ЛОкачвственных опухолей является активный рост клеток, независимый iT действия физиологических регуляторов деления. Во икогих случаях тот процесс сопровождается снижением чувствительности клеток к 'ост-регулирускзяу действия стероидных горионов. В то se время пухолн. сохранмвпмс чувствительность к стероидним горяонаи, тличаются кеНьгей степень» злокачественности к с Сольией ??5ктмвн0стьга . поддается горт.:онотерап::и. Пирокое использование терондных гор?гонов для лечения злокачественных новообразования злгет чрезвычайно актуальным исследование яеханизка возникновения оркональной резистентности, а такга способов ее преодоления.

Возникн о венке резистентности опухолевых клеток к действию тероадных горкомов, столь • часто зстречаетееся в клинической рактшсе, обычно связывают с нарупениеи структуры или сниязнкеи онцэнтрации специфически?: цптоялазггатических рецепторов гормонов 2,13,261. Вяесте с тел, последние исследования а этоя области оказали, что зо еногих случаях резистентность опухолевых клеток к ост-рогулирукг^яу действия стероидных гормонов не связана с апзтгшгм изкененяппй рецепторного аппарата клеток. Так, опит линичсских ксслодозанмп показал, что кэ более 503 опухолей колочноп элозы, содор.тлглх рецептора эстрогенов, в действительности казиваотся Чуистзйтельныки к действии горнона ¡20 1. Похоже гОяздэпяя известка a в отношении опухолей иаткп и некоторых других, ксаери^энти tía культквируеких клетках печени а гепатоя показали, то чувствительность ■ клеток к цитостатическоиу действия яккоиортиксидних горяонов иогат существенно изменяться в ависийости ,от , услозкл культивирования клеток, состава среды, лотноста культуру 17,231. Ситуация оказывается еез более слояюп рл анализа допствия горпона на опухоль, развиваяауюся в организяе.

этой случае появляется возкогиость опосредованного действия эркона на пролиферация опухолез'лх клеток: через изиененне ктизностк н/или секреция рост-регулирую^х факторов, синтезируемых каняни органиэ i-опухоленосителя.

<

Сходные результаты били получены и при исследовании эффектов героидных гордонов, не связанных с контролен пролиферации. В

- г -

экспериментах на клетках злокачественных опухолей различноп происхождения, в опытах на клетках стареющего организна Оил< обнаружено, что часть функция клеток моют выходить из сфер) гормонального .контроля, несмотря на . отсутствие марувенш рецепторного аппарата клеток. В частности, это относится I способности стероидных гормонов индуцировать в клетках-яивеня; синтез таких ферментов как орнитиндекарбоксилаза, тирозинаминотрансфераза, малатдегидро-еназг и др. II].

Складывается впечатление, что резистентность к горконаи кохо' возникать не только в результате нарушений рецепторного иеханызн; передачи гормонального сигнала. Вероятно, в клетках суадствует целы! ряд дополнительных биохимических путей; посредство» которы: осуществляется регуляция горпонального 1 отвота клеток. Изучены! природы некоторых из таких иутеп и легло в основу настоавгп исследования.

Целью работы является установление реакция пролифе ттивиоп цикла клеток, находяешхея под контролен стероидных горионов i изучение путей регуляции чувствительности реакций клеточного цикла i действию стероидных горконов.

Исходя из этого, были поставлены следуюско згчачн: 1 Исследовать чувствительность клеток регенерируюввй печени и гепатоп 22 к рост-ингибируюшеиу действие глвкокортикомдных горвоиоо. Изучит! влияние глажокортикоидов на экспрессию протоонкогена Ha-ras относящегося к группе протоонкогенов-регуляторов клеточного деления 2 J Изучить пути регуляции цитостатического действия стероидов условиях ln vivo. В частности, исследовать роль перитоиеадыш накрофагов - клеток с вырахенноя противоопухолевой активность» реализации цитостатического действия глахокортихондоз на кдетк гепатомы 2Г ln vivo. 3) Изучить нзсоиения скорости обраьзнн фосфолипидов при действии глюкокортмкоидов. на клетки геп-оии 22. 4 Исследовать влияние половых стероидных 'горконов (17В-эстрадиола прогестерона) м антиэстрогена тахоксифена на скорость обрассн» фосфолипидов в первичных культурах клеток аденокаршшовы катки опухолей полочной железы женшш. 5) Оценить участие протеинкиназы в регуляции синтеза отдельных клеточных фосфолипидов и реализаим цитостатического действия стероидных гормонов. б) Испольэу

перечисленные экспериментальные подходы. оцепить значимость исходного пролмферативного статуса опухолевых клеток и фактор э, регулирующих его. в формировании окончательного ответа клеток на действие стероидных гормонов - ингибиторов и активаторов пролиферации.

Научная вовиэда я практическая значимость работы определяются впервые проведеинып исследованием роли реакций пролиферативного цикла, таких ках гидролиз фосфолмпидов м, &ктив&шя протеинкинази С, в реализации рост-регулнруювего действия стероидных гормсноз на опухолевые клетки, а также анализов биохимических . яутея, контролируювдх степень гормональной зависимости клеток.

Как извес т но. во многих случаях снижение гормональной чувствительности клеток происходит в результате длительного воздействия стероида на клетки-мивени. Сравнительный анализ изменений - чувствительности клеток печени к глюкокортикоидам, проведенный по таким признакам ' как синтез юРНК тирозинаминотрансферазы С TAT), Ha-ras и скорость пролиферации показал, что в результате длительного введения глюкокортикоида жнвотным подавляется гормональная индукция TAT» d то время как горпонозависикое торможение пролифератнвних реакция клеток печени (синтез пРНК Ha-ras, включение "Н-тннидииа в ДНК! не меняется. Полученные данные позволили предположить существование в организме специфических регуляторних механнзиов, поддерживаюяих индуцированное глвкокортикоидами торможение клеточной пролиферации в условиях длительного введения гормона.

Это предположение было подтверждено в далькейсих экспериментах на перевиваемой гепатоме 22. Было показано, что однократное введение гидрокортизона животным с асиитноя гепатокой 22 не приводит к снижению скорости роста гепатоим. В то же время рост клеток геяатоны резко тормозится при перевивке опухоли на животных, длительное время получаввих гормон. Различная чувствительность клеток печени к цитостатическому действию глюкокортикоидов наблюдается и в условиях In vitro: активно пролиферируюоие клетки гепатоми нечувствительны к гормону, в то вреия как рост медленно пролиферируювих клеток подавляется в присутствии глюкокортикоида. Добавление к гормоночувствителышм клеткам гепатомы эпидермального фактора роста

(ЭФР> или эмбриональной сыворотки снимает индуцированное гормоном торможение пролиферации. Полученные результаты свидетельствует об изменении гормональной чувствительности клеток гепатомы под действием факторов- окружающей среды. В условиях in vitro в роли таких факторов выступают, в первую очередь, белково-пептидкые ростовые факторы, oOeci. -чиваюше активное деление клеток в экспоненциальной фазе роста и препятствующие реализации гормонального Олока пролиферации. Установлено, что в условиях 1п vivo важную роль в реализации рост-ингибируюпего действия глюкокортикоидов на клетки- гепатомы 22 играют перитонеальные пакрофаги. Обнаружено, что 'противоопухолевая активность макрофагов подавляется глюкокортикоидными гормонами; что может являться одним из факторов, опосредованно стняулируюоих пролиферацию опухолевых клеток и препятствующих реализации прямого цитостатического действия гормона на клетки. Оказалось, что продолжительное введение гормона животным приводит к формированию популяции макрофагов, нечувствительных к ингибируюцему действию глюкокортикоида и отличаюшххся повышенной цнтостатической активностью. Появление таких активированных макрофагов может служить одной из причин усилешм рост-ингибируюяего действия глюкокортикоидов на опухолевые клетк> при длительном введении гормона.

При исследовании механизма прямого цитостатического девств*.'

стероидных гормонов не клетки было обнаружено, что уже через 15-31

мин после Добавления i-ориона происходят значительные изменения цикл;

обращения фосфйлипидов и активности протеинкиназы С - ферментатмвны

процессов, играющих ключевую роль в инициации клеточного деления.

экспериментах На к^льтйвирумых клетках геоатомы 22 м адеиокаршшом

матки било tt0fcd9dtt0< что стероидные гормоны с выражении

цитостатическнк действие« (ГЛ(зкокортиконды, прогестшш) вызываю

32

2-кратное снижение включения Р-ортофосфата в основные фосфолипм клеток! фосфатидилхолин и фосфоинозитиды. Показано, что одним » иачалышх события, 1 вызванных действием горжоиов-цитостатиков i клетки, является торможение обращения фосфолипидов, которое привод! к целому каскаду дальнейших изменений, включая снижение активное протеинкиназы С. 0 то te время гормоны - стимуляторы пролиферац (эстрогены) вызывают значительное увеличение скорости обращен

фосфолипидов.

В дальнейших экспериментах било показано, что эффективность

действия стероидных гормонов на обмен фосфолипидов может существенно

варьировать в зависимости от условия культивирования и степени

гормональной чувствительности клеток. Так, в клетках гепатомы 22,

находяаихся в экспоненциальной фазе роста и не чувствительных к

цитостатическому действию глюкокортикоидов, дексаметазон не вызывает

изменения в скорости обращения фосфолипидов. Вместе с тем,

добавление гормона к медленно пролиферкруювши (гормонозависииыи)

32

клеткам гепатомы приводит к подавлению включения Р в фосфолипиды. Сходные наблюдения были сделаны и при изучении влияния прогестерона па обиен фосфолипидов в клетках аденокарциноии матки. Известно, что присутствие ЗФР существенно снижает цитостатический эффект прогестерона . на. клетки-мипени (221. Оказалось, что добавление к клеткам аденокарциноии натки ЭФР предотвращает прогестерон-зависимое торможение обращения фосфолипидов.

Таким образом, эффективность действия стерскдних гормонов на цикл обращения фосфолипидов, как и степень гормональной зависимости опухолевых клеток, во многом определяются присутствием в окружающей среде факторов, наряду со стероидами контролш£ух>иих пролиферацию клеток-иивеней. Полученные данные позволили сформулировать принцип яультифункциональной регуляции гормональной чувствительности клеток. Предполагается, что чувствительность клеток к гормонам регулируется как через изменение рецепторного механизма передачи гормонального сигнала, так и независимо от рецепторного аппарата клеток: через изменение 'активности ферментативных систем, контролирующих гормонзавнсииые функции клеток параллельно с гормонами. При этом в условиях ln vivo болызую роль играет окружение клеток-нишеней: продукты, секретируемые тканями организма и участвующие, наряду со стероидами, в регуляции метаболизма клеток-мишеней, могут существенно изменять чувствительность последних к гормонам.

Научно-практическое значение раОоти. Полученные результаты

позволяют разработать . новые подходи к определению гормональной чувствительности опухолевых клеток, в основе которых лежит анализ эффективности действия гормонов и антигорконов на обмен фосфолипидов в опухолевых клетках. Исследования, проведенные на опухолях матки и

- б -

водочной ходези женщин, показали возможность мсподьзованмя такого подхода для определения эффективности пост-рецепторных стадия действия стероидных гормонов в клетках-миженях. КроАе того, было установлено, что скорость обранвния отдельных фосфолмпидов находится в разной степени зависимости от протеинкинази С: если скорость обмена фосфора в фосфолноэмтмдах не зависит от активности протеинкинази С, то скорость включения фосфора в фосфатидмлхолин

положительно коррелирует с активность» протеинкинази С.

52

Следовательно, сравнительный анализ включения Р в фосфатмдмлходмн и фосфоинозмтиды может служить показателем относительного уровая актмвации протеинкинази С в мссдедуемых опухолях м использоваться для определения эффективности действия на опухоль соединения, влияюких на активность протеинкинази С. В частности, подобный подход был применен для определения эффективности действия на опухоли молочной железы тамоксифена - соединения из группы актиэстрогеноо, являювегося ингибитором протеинкмназы С.

Материалы исследования использованы в НИИ клинической онкологии ОНЦ РАИН.

Апробация работы м публикация. Основные положения работ«

представлены м обсушена на 6-м Международном симпозиуме п< молекулярным взаимодействиям в биологических системах (Берлин, 19В9), Всесоюзном симпозиуме "Биохимия опухолевой клетки' (Минск.1990 1, Иехдунар"дном семинаре по раку молочной хелезI (Львов,1992>. По материалам, представленным к завите, опубликован! 29 работ в отечественной и зарубежной печати.

(¡гтоди исследования

В экспериментах использовались крысы линии »^гаг м мыши лини СЗНА. Включение 312 -тииидина в ДНК регенерирующей печени определял через 24 час после гепатзктоиии. За 1 час до забоя животным вводил по 0,25 иКи 3Н-тимидкна (удельная радиоактивность 23 Ки/миоль), к гоиогената печени ядра выделяли в присутствии 0\2Х тритона Х-10С Радиоактивность ядер определяли в жидкостном сцинтклляторе ХС-( содержание ДНК измеряли методом Бартона.

; - 7 -

Гидрокортизон ("Рихтер", Венгрия) вводили внутрибрюшинно в дозе

5 иг на 100 г веса. Анализ числа специфических пест связывания

горвопа проводили с использованнев покрытого декстранои

активированного угля. Для оценки- внутриклеточного распределения

3Н-дексанетазона In vivo яивотньш вводили на 45 нин знутрибрюамнно i 3 по 40 нкКн Н-дексаветазона или по 40 икКм Н-дексанетазона внеств с

0,5 иг некеченого дексакетазона. Ядра клеток печени очивали

центрифугнрованиен через слой 24 сахарозы <р=1,27) и определяли

удельнув радиоактивность.

Активность тирозинаиинотрансферазы з печени icpuc определяли по

сетоду 19].

Асцатнуо гепатоиу 22 перевивали кисла линии СЗНА внутрнбрсвинко

7

кз расчета 10 клеток на животное. Для получения асцитних клеток,

содерзавях веченуо ДНК, гявотнин с асцитноп гепатоиоя вводили.

Н-тидмднн (0,025 пКи на 10 г веса) егзднёвно в течение 3 сут-> На

7-е сутки развития гепатовы отбирала асцнтные клетка и перевивали их

контрольный »вотныа. а такта гнвотния, длительно получавсмй

нн'екцми гидрокортизона. Через 5 дней после перевивки отбирали

асциту» жидкость, клетки отказали в физиологической растворе и

осагдали в 10S ТХУ. Кислотонераствораяуга фракции осазсдали па

фильтрах GF/C ("ifUathsan", Англия), определяли радиоактивность в

толуоловой сшш~ (лляторе.

Для гибридизации РНК выделяли с гуанидинтиоцманатои 1211 м после

денатурации наносили по 15 дкг на нитроцеллалозные фильтры

("Schlolchar Ь Schull", СРГ) в растворе 20 SSC (1SSC: 0.15М NaCl +

0.015М Na-цитрат), фильтры прогревали 2 час под вакууяом.

32

Дот-Тибридазашш с веченниия Р фрагвентрши генов TAT 127] н Ha-ras (111 вели о растворе 1503 форгаанид, 3 SSC, 5 х Денхардт, 0,2S DS-Na, 100 пхг/ял РНК E.coll, 50 вкг/мл ДНК сперяы лосося) п течение 20 час при 44°С.Фильтры отнывала последовательно при 50°С в растворах:2SSC + 0,IX Ds-Na и 0.1SSC + 0,1Í Ds-Na. Авторадиография на рентгеновской пленке РЯ-В а течение нескольких суток.

Клетки гепатовы 22 культивировали In vitro в среде Leibovltz L-15 с ЮХ-нои эабряоналыюп сывороткой ("Glbco", Англия). Для определения скорости синтеза-ДНК к клет^аи добавляли 3Н-тииидин 15 якКм на 1 ал среди) на 2 час, затея клетки снимали с матрасов.

в -

отмывали в физиологическом растворе и осаждали в 10%-ноп ТХУ. Кислотонерастворкмую фракцию осаждали на фильтрах GF/C и определяли радиоактивность в толуоловом сшштилляторе.;

Клетки опухолей молочной железы и аденокаршсномы катки хешами выделяли из фрагментов удаленных опухолей по методу 125 J. Измельчали 1 г ткани, добавляли 0,5 мл смеси ферментов (IX коллагеназа + 0,1% гиалуронидаза +0.02Х ДНКаза) в 5 мл среды Игла. Инкубировали, врашдя при комнатной температуре, 1в час. Затем гомогенат фильтровали и центрифугировали через слой фиколл-верографина (р=1,77) при 400 g. 30 мин. Сконцентрированные в интерфазе клетки отбирали, отмывали и ресуспендировали в среде Игла.'

Перитонеальные макрофаги выделяли из мышей СЗНА в среде Игла с гепарином (10 ед/мл) как описано в работе (41. Цитотоксиче'ску» активность макрофагов определяли при их совместном культивировании с клетками гепатомы в соотношении 4:1 в течение 20 час в среде RPMI с lOZ-ной эмбриональной сывороткой. 3Н-тимидин добавляли на 16 час, затем клетки отмывали ЮХ-ноя ТХУ и определяли удельнув радиоактивность ДНК.

Для определения -включения в фосфолипиды был кспользойаН

модифицированный метод диализа Р-фосфолипидов, основанный Hat одновременном проведении экстракции и тонкослойной хроматографии' (ТСХ) липидов из целых кЛёТок, предварительно иммобилизованных «tí силикагеле. Клетки преи1(кубй£оЩал# в присутствии или отсутствии исследуемых агентов в те ¿mié 10 Лии. Затем в кулътуральнуй fcpexy добавляли 32Р-ОртофоСфат i ¿Ú ккНЯ/Лл) и клетки инкубировали 20 МИН при 37°С. клетки снижали Ь kHp&bbÉi Промывали и ресУсПеНдйровали i растворе Xsíikca; ЬйрсАЬлклй Ши^НЬО. Образцы* toAepiámte oüHÜáKóhóó количестйд клеток; Вносили tiá ТСХ НЛастЙНЫ (около iflr клеток На точку!. tlAAbrútiú йысувнвал!» ЙЯроёОдИлИ TdX é ёИСтеМе хлороформ/метанОл/7М Нашатырный Спйрт ). tipil пЧзкЬМ

включении 32Р в фосфолипиды i 6 экспериментах с Медленно пролиферируюшнмм клетками j липйды < разделял« b сйс+емё хлороформ/метанол/вода (65:25:4), Что ЙЬЗЙОЛЙЛО ДЬЙЙЙАТЬСЙ максимальной i концентрации фосфолйййдоб , IВ 4afcíli0ct#< фосфоинозитидов) в зоне прохождения. Для идентификаций фаЬфОлМййдс1в использовали стандарты липидов I "Slgaa"). После проведений ТС&

ласт'шш высушивали, проявляли в парах иода и радиоавтографировали.

32

яя количественного определения • включения Р в фосфолипи.гм

спользовали денситометрическое сканирование радиоавтографов

Ultroscan XL,:'LKB). Предварительные исследования показали, что

рименение описанного метода позволяет добиться эффективного

азделен^я фосфолипидов на ТСХ пластинах, не уступающего по качеству

азделению фосфолипидов, предварительно экстрагированных из клеток с

спользоваиием традиционного метода Bllgh, Dayer [б]. Эффективность

азделения фосфолипидов контролировалась с помощью двумерной.

роиатографии 1171. ,

Для определения фосфорилирования эндогенных белков клетки 32 1

епатомы 22 инкубировали с Р-ортофосфатом как описано выше. Клетки

нимали с матрасов, отнывали в растворе Хэнкса и растворяли в

уфере, содержащем 60 иМ Трнс-HCI, рН=б,8; 22 DS-Na, 52

еркаптоэтанол;' 5% сахарозу. Образцы, содержащие одинаковое

оличество белка, прогревали .2 мин при. 100°С и проводили

ель-электрофорез в присутствии г DS-Na по Лэмили, используя 12ч 5%

олиакрилапидлий гель .Гель фиксировали в 7Я уксусной кислоте,

крапивали Кумасси, высуиивали и радиоавтографировали. Относительное 32

ключенио Р в белки определяли при денситометрическом сканировании адиоавтографов на лазерной денситометре Ultroscan XL, LKB.

Для определения активности протеинкиназм С клетки гепатомы 22 нкубировали в присутствии или отсутствии дексаиетазона в течение 30 :ин при 37°С. Клетки снимали с матрасов, отмывали в растворе Хэнкса ; гомогенизировали в буфере Л С20 иМ Трис-ЙС1, рН=7,5; 2 нИ ЭДТА; 10 :М неркаптоэтанол; 0,25 М сахароза). Гокогенат центрифугировали 10 urn . 1500 г. осадок отбрасывали и проводили повторное 1ентрифугирование 90 яия 100000 g. > Полученный супернатант [спользовали в качестве источника цитозольноп фракции. Осадок »есуспендировали в буфере Л ♦ 0,1£ Тритон Х-100 и встряхивали l' час |ри 4°С. Центрифугировали 1 час 100000 г и супернатант использовали I качество мембранной фракции.. ' ."

м 32

Активность протоинкиназы С определяли по переносу Р с Р-ЛТФ

ia гистон HI S в отсутствии или присутствии Са**, фосфатидилсерина

| ТРА. Для этого по 5 мкл образцов инкубировали 5 нин при 30°С в 20

• 32

нсл реакционной сиеси, содержащей 0,5 ккКи Р-АТФ; 20 иМ Трис-HCI,

рН=7,5; ЮмМ MgCI2; 5 мкг гмстона IIIS; 10 иЫ ЭГТА. В параллельные пробы добавляли 1 мМ СаС12, 5 мкг фосфатидидсерина и 10 иг ТРА. Реакцию останавливали добавлением 10Х-ноИ ТХУ, осадки собирали к пропивали на фильтрах CF/C. Активность протеинкыназы С определяли по разнице включения Р в гнстон в отсутствии и присутствии Ca ,

фосфатидидсерина и ТРА и вирахали в пмолях фосфата, перенесеного с

32

Р-АТФ на гистон за 1 нин в расчете на 1 мг белка.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССГ.ЕДОВАНИЛ И ИХ 05СУ2ШЕНИ2

Влияние однократного а длительного ооедешя гидрокортизона на синтез мРНК. TAT, Ha-ras и скорость пролмферешм клеток печена

Действие гидрохортиэоиа на слнтеэ TAT.

Известно, что ежедневные ин'екими гидрокортизона хивотш в дозе 5 иг/ил уже через 5-7 дней приводят к выраженному ториохеник гормонозавнсимой индукции TAT 13 1. В навих экспериментах крыса! линии Вистар ежедневно вводили по 5 мг гидрокортизона на 100 г вес. в течение 10 дней. Через 5 час после последней ин'екции • клетка; печени определяли активность TAT и уровень нРНК TAT. Било показано, что введение хивотник гидрокортизона в течение 10 дней приводит i значительному снижению способности клеток индуцировать TAT в отве на введение гормона (табл.1).

Анализ числа специфических мест связывания горвона в цитозол клеток печени не обнаружил сукественных различий в количеств специфических рецепторов в печени контрольных xubotuux u животных длительное время получаввих - гормон. Кроме того, был проанализиропна способность .клеток печени накапливать горнон 1 vivo. Для этого контрольным животным и животным после "ЧИТеЛЬНО! введения гормона вводили по 40 мкКи 3Н-дексаюетазона или 40 vKi 3Н-дексаметазона вместе с 0,5 мг немеченого дексаяетазона на 45 ш и оценивали количество специфически связанного с ядра! ЭН-дексаметазона. Оказалось, что специфическое связывание гормона ядрами клеток печени не снижается у животных, длительное вре получавюих гормон (Табл. 1). Полученные данные возводи

' я

Накопление [ Н]дексаметазона в клетках пвченж крыс я индукция активности TAT на фоне длительного введения гидрокортизона

Связывание ГН] дексаметазона Активность Количест-

Условия опыта TAT во тРНК

щггозолеи ядрами усл.ед. TAT,

фмоль/иг белка фиюль/иг ДНК усл.ед.

Контроль - - "1,0 5,8

После однократного

введения гормона 4.6 ± 0,3 0,15 ± о;,02 6,9 ± 0.5 17.2

После введения

гормона в течение.

10 дней 5,4 i 0,4 0,14 1,0,03 ! 3,8 ± 0,3 13,7

Таблица 2

Индукция TAT D клетках печени под действием триптофана

Условия опыта Активность TAT в цитозоле, .усл.ед.-

Контроль . „ 1,0

Поело однократного введения триптофана 6,0 т 0,3

После введения триптофана в течение !

10 дней, последняя тгьекция - V

триптофан 4.1 т 0,1

Ьосле введения -триптофана в течепкэ

10 дней, последняя шгьекция -

гидрокортизон 3,4 * 0,1

- п -

предположить существование механизма, который регулирует уровень гормональной индукции TAT в клетках печени. не затрагивая рецепторний аппарат кЛеток. Одним из возможных путей подобной регуляции может являться образование в клетках - избытка индуцированного белка (в данном случае - TAT), который по принципу обратной связи подавляет синтез TAT de novo. Действительно, оказалось, что длительная индукция TAT в присутствии триптофана -известного негормонального индуктор ТА - также приводит к ослаблению горионозависимоя индукции TAT (Табл.2). Таким образом, совокупность приведенных данных свидетельствует о существовании в клетках печени своеобразного механизма ауторегуляции гормональной индукции, благодаря которому уровень индукции тех или иных белков не выходит за рамки физиологически допустимых значений. Однако, дальнейшее исследование влияния однократного и длительного введения гормона на пролиферативный статус клеток печени показало, что в этом случае мы сталкиваемся с дополнительными путями (..гуляции гормональной чувствительности клеток.

5

Действие гидрокортизона па включение Н-тииидияа в ДНК регенерирующей печени.

В работах ряда исследователей отмечается, что пролиферация клеток печени после частичной гепатэктомии тормозится после, однократного введения животным глкжокортикоида (161. В навих экспериментах было обнарухено, что вызванное однократным введением гидрйкортизона торможение пролиферации клеток регенерирующей печени сопровождается уменьвением количества мРНК протоонкогена Ha-ras,которое сохраняется в течение не менее 23 час с момента введения гормона - существенно дольне, чем гормональная индукция TAI (рис.1).Введение животным гидрокортизона ежедневно в течение 10 дней не приводит .. ослаблению гормонозависимого торможения пролиферации клеток ' регенерирующей печени. Наоборот, длительное введение гидрокортизона вызывает резкое ослабление способности клеток печеш пролиферировать в ответ на частичную гепатэктомию (табл.3). Анали: синтеза мРНК Ha-ras показал, что после длительного введения гормон, в клетках печени не наблюдается выраженного увеличения количеств; мРНК Ha-ras в ответ на частичную гепатэктомию (рис.2 1.

Если сравнить скорость включения 3Н-тимидина в ДНК различны

| Таблица 3

Включение ^Н-ти\щдияа а ДНК печени поело частичной гепатектомии на- фоне длительного введения гидрокортизона (имп/мин на 1 мкг фПС)

Условия опыта

Контроль

I

После 10 инъекций гидрокортизона

До гепатектомии После гепатектомии

14,2 т 0,3 512,6 т :44

20,6 * 2 86,4 т 3

После гепатэктошш.+ гидрокортизон за 5 ч до забоя

57,6 т 3

84,5 * 8,3

Рис.1 Дот-гибридизация РНК печени крыс с фрагментами гена ТАТ(А) и На-гаМБ), РНК печени выделяли через 26 чао после проведения частичной гепатектомии в условиях без введения гормона (1), введение гидрокортизона на 5 чао (2), введение гидрокортизона на 25 чао (3).Гибридизацию проводили как описано в Методах. Представлены результаты денег ометрического сканирования радиоавтографа.

Рис.2 Дот-гибридизация РНК печени крыс о фрагментом гена На-газ, РНК печени выделяли из контрольных не-опарированных животных (1), через 26 чао после проведения гепатектомии (2) и через 26 час после гепатектомии, проведенной на фоне длительного введения гидрокортизона (3). Представлены результат» денситометрического сканирования радиоавтогрпфа.

8

4

Включение ^Н-тимвдина в ДНК рвгенврярупцеВ печени, селезенка я тимуса .через 6 сут посте прекращения длительного в веда ния гидрокортизоаа (вдпЛ-ин аа 1 мкг ДНК) ■

Ткань

Контроль

Опыт

Печень

Селезенка

Тимус

203 7 4 . 93 18 7 т 0,4'

28,4 * 0,5

74 * 5 53,8 * 4

400

гя

■л м

ГЛ

СО'

о ш

я 200 и л ф я

Я » а <ц гч

5

Бреия по еде отмены,, йух

Рис.3 Восстановление скорости пролиферации клеток печени поел отмены введения гидрокортизона.

1 - после длительного введения гидрокортизона, 2 г поел однократного введения гидрокортизоаа. Представлены средние значен! трех независимых определений.

тканей, то, как видно из табл.4, длительное введение гидрокортизона ]риводит к продолжительному подавлению пролиферативной активности 1ечени, довольно незначительному - в селезенке. В тимусе наблюдается обратный эффект - повышение скорости пролиферации, которое следует за отменой ин'екций гормона. Как известно, высокие дозы глюкокортикоида приводят к быстрой инволюции тимуса, что наблюдалось я в напих экспериментах. Вероятно, стимуляцию пролиферативной активности тимуса после отмены введения гормона следует рассматривать как конпепсаториу» реакцию, направленную на юсстановление массы тииуса. На этом примере хорово видно, что юдавление клеточной пролиферации после длительного введения •люкокортикоида является, в основном, гепатотропным эффектом.

Восстановление способности клеток печени к нормальной 1ролиферацин происходит довольно медленно, в течение 7 суток после 1рекравення длительного введения гормона. При этом налицо выраженный сумулятнвный эффект в действии гормона, поскольку эффект от однократной нн'екцни горнона исчезает значительно быстрее (рис.3). В го же время гидрокортизон метаболизируется и выводится из организма 5а несколько часов и, следовательно, никакого накопления горнона в организме в результате ежедневных ин'екций не происходит.

Коаплекс приведенных данных удается об'яснить, если 1редположить, ч^о длительное введение горкона вызывает прекраиение :интеза и последующе кстовение пула ростовых факторов, необходимых 1ла нормальной пролиферации клеток печени. В свою очередь, подобные изменения приводят к усилению прямого цитостатического эффекта глюкокортикоидов на клетки-мишени и поддерживают индуцированное глюкокортикоидами торножение клеточной пролиферации в условиях 1лителыюго введения горнона.

Такии образом, на этой стадии экспериментов было установлено, что эффективность пряиого цитостатического действия глюкокортикоидов :1а клетки-мипени иозязт существенно нзкеняться в зависимости от тродолястелыгости действия горкома и, вероятно, от активности экзо-:( эндогенных рост-регулируювшх факторов. Представляло интерес дсследовать знч .¿ние подобного неханизна в регуляции гормональной чувствительности клеток злокачественных опухолей.

- 16 -

Действие гидрокортизона на клетки гелатош 22 ln vivo: прямой и опосредованный эффекты гормона

Влияние гмдрокортяэоаа на рост геоатомы 22 ln vivo.

Эксперименты проводились на нивах линии СЭНД. Двум группа* мымея (контрольным и после 10 ин'екцмя гидрокортизона) перевивали асиитние клетки гепатоми 22. Йеревмвку проводили через 24 час после эаверааюяея мн'екцмм гидрокортизона, следовательно, к моменту перевивки содержание гормона в организме животных снижалось te нормального уровня. Через определенные ицтервЬлы времени животны; эаОивалм и определяли оОщэе количество аецмтных клеток. Обнаружено, что при перевивке клеток гепатоми животным, получавшим 10 мн'екшк гидрокортизона,' наблюдается резкое торможанмв роста опухолевы: клеток. Однократная ми'екцмя:гормона вызывает лимь незначительно! снижение пролнферативноя активности 'клеток гепатоми (рис.4) Обусловлен ли этот эффект действительные торможением ¿корост пролиферации опухолевых клеток млм снижением выживаемости клеток ца фоне длительного введения гормона? Животным перевивали аецмтны клетки, содержцмме меченную 3Н-тимидйномДНК- Оказалось, что Через сут роста гепатоми количество ДНК, содержа мой 3Н-тиммдин..одинаков у животных в контроле и опыте, несмотря на значительное снижены обкэго количества асцитных клеток, наОлюдающеес;« у животных поел длительного введения глюхокортихоида (тар*.5). Следователь» торможение роста асиитноя гепатомы у животных после длительно! введения гормона вызвано снижением скорости пролиферации асцитш клеток. Полученные результаты позволяют предположить, ч* рост-ингибируюмий эффект глюкокортикоидов». наблюдаемый ln vlvo qoc. продолжительного введения гормона, вызван не только непосредствен^ взаимодействием гормона с клеткой, но - ' м мобилизацией ' ря дополнительных путей, опосредую»« м усиливающих, цмто„татическ эффект глюкокортикоидов в организме. , .

Влияние гидрокортизона на ' цитотоксическую актявяоет аеритопеаяьвых макрофагов.

Один из возможных путей усиления. цитостатического зффе» глюкокортикоидов может быть связан с действием гормона на клет миолоидной и лимфоидной тканей. Действительно, с одной сторс

Foot клеток асцитной гвпатомы 22,содержащих меченную

о

[Н]тимиданом ДНК, па фоне предварительного введения животным гидрокортизона (5-е сут роста гепатомы 22) •

Условия опыта

Количество клеток п х 107 '

Радиоактивность ДНК всцитных клеток, имп/миа

Контроль Опыт

9,4 т 0,68 •

5,9 т 0,6

38400 * 5322 39680 * 8600

Примечание..Расчет приведен па одно животное.

"о

и и

я

и I о я

о

FJ

И

о

и

н

о аз в-

3 ' •• 3

Время pooia гепаюиц, оуг

Рис,4 Развитие асцитной гепатомы 22 у мышей С311А после введения гидрокортизона. 1- контроль,

2 - после с 'юкратного введения гидрокортизона,

3 - после длительного введения гидрокортизона Представлены средние, значения трех независимы* "пр-лолепяй.

вироко известна способность глюкокортикоидов регулировать рост, дмфферениировку и метаболизм этих клеток [141.С другой стороны, в< многих работах продемонстрирована возможность регуляции ииелоидным! и лимфоидными клетками пролиферативной активности опухолевых клеток Такая регуляция осуществляется как за счет'известной цитотоксическо) активности макрофагов, так и благодаря продукции миежоидны^и : лимфоидными клетками ростовых факторов вирокого спектра действия, которым чувствительны и опухолевые клс гки 191.

В представленных ниже экспериментах, исследовали возможност

усиления цитостатического эффекта глюкокортмкоидо

опосредованно:через воздействие гормона на перитонеальные макрофагм

в частности на их цитотоксическую активность. Цитотоксическу

активность макрофагов определяли по способности иакрофагов тормозит

рост клеток гепатомы 22 при их совместном культивировании ln vitre

В экспериментах использовали резидентные ; макрофаги, выделенные t

контрольных животных и из животных, предварительно получи! их од|

или ; восемь ин'ехций гидрокортизона. Активированные вакрофш

выделяли из мывей, предварительно стимулированных ин'екцией 3*-noi

раствора пептона. Скорость деления клеток гепатомы определяли i

« з

включению Н-трмидина о ДНК клеток гепатояы (доля Н- нимднн

включившегося , в макрофаги, составляла не более 3S от общ;

включения 3Н~тияидина в культивируемые клетки).

Результаты , экспериментов, . представленные на рис. 3 свидетельствуют о резких изменениях цнтотоксическоя çyiucu иакрофагов после введения гормона. Оказалось, что однократи введение гидрокортизона приводит к с ни то ни ю цнтотоксическоя функи макрофагов, проявляюазыуся в ослаблении ингнбируюцаго ¡зффек макрофагов на пролиферацию клеток гепатоиы. Наоборот, длптолы: введение г. дрокортизона сопровождается ; значительной актиоаш цитотокснческой функции макрофагов, дахо превываювеп гктиваш вызванную введением пе'птона. . ¡:

Как уже отмечалось, торможение роста гепатояы 22 наблюдав" только сри продолжительном введении глюкокортикоида. Представлен! результаты позволяют предположить. что одним из фактор! определяющих эффективность действия глюкокортикоида в этом случ является способность гормона при продолжительном курсе ин'ек

•л

о

El

33 аз сг

а

п м eq

ад

Рис.5 Вгелвчвш» Н-ттаядгиа в ДНК клэток гепатомы 22 при совместном кудьтпзяровапЕЛ (20 чао) о сэрзтопэ альнтга макрофагами: без макрофагов 11 ), с иакрофзгаьи, сыдолепными из интактных мышей (2), и о макрофагами. падало шгдп из мышей, получавших пептон (3), одну (4) пли восемь инъекций гидрокортизона (5). "Н-тимядан вводили на 16 час и определяли удвльнуо радиоактивность ДНК.

г»--11

«X ■

fjiEUI« CI

i г з

X - ковг^ои (-)

2 - одликрииб» иадвиш гвдрокоргмова (---)

3 - длитеыкоа ладейка гадрокоргизонв (•'• • ■•)

фрвкцхя ФИ

т

Рис.б Влияние гидрокортизона па обмен фосфолипидов в пвритонеалышх макрофагах мышей; Перитонеальные макрофаги выделяли из* животных: контрольных (1), после однократного введения гидрокортизона (2) и nor те длительного ввег'шия гидрокортизона (3). Клетки инкубировали 20 мин в присутствии "Р-ортофосфата и фосфолиппды анализировали методом' ТСХ. Справа дставлены результаты денситометрического сска1шрования радиоавтографа (всего 3 независимых еекперимента).

резко активировать цитотоксическую функцию перитонеальных макрофагов. Вероятные причини противоположного эффекта глюкокортикоидов на макрофаги при однократном и длительном введении гормона могут заключаться, с одной стороны, б появлении клона гормонореэистентных макрофагов в результате длительного введения гидрокортизона^ с другой ^тороны - в компенсаторном увеличении -активности такого рода клеток.

Более подробно исследовать этот процесс можно было, изучая -действие глюкокортикоидов 1 на метаболические пути активации макрофагов. Одним из таких путей, как известно, является распад фосфолипидов. Образование в результате обиена фосфолипидов диацилглицеролов, активация протеинкиназы С и фосфорилмрование ряда белков относятся к числу основных факторов, определяют» активность макрофагов (161.

Влияние гидрокортизона на овыев .фосфолипидов в перитонеалышх макрофагах.

Макрофаги выделяли из контрольных животных и животных после однократного и длительного введения гидрокортизона. Изолированные

макрофаги инкубировали 20 мин в среде Игла в присутствии

32

Р-ортофосфорной кислоте. Клетки отмывали в физиологическом

растворе, липиды экстрагировали и фракционировали методом

тонкослойной хроматографии с последующей радиоавтографиея.

Было обнаружено (риг*.б), что макрофаги, выделенные из животных

после однократного введения гидрокортизона, отличаются заметно

32

неныв^м уровней включения Р в основные фракции фосфолипидов:

фосфатидилхолин и фосфоинозитиды. Иная картина изменений синтеза

фосфолипидов наблюдается после длительного введения гидрокортизона.

Оказалось, что в результате длительного введения гормона включение 32

Р в фосфолипим восстанавливается практически до контрольного уровня. На наш взгляд, эти данные позволяют предположить, что о процессе длительного введения гормона происходит формирование клона глкжокортикоид-резистентных макрофагов.

Вероятно, . продолжительное введение гормона приводит к образованию популяции иакрофагов, не чувствительной к ингибируюавну действию глюкокортикоидов и, как было отмечено выве, отличающейся повывенной (Ытотоксическоя активностью. ¡Возможно, появление тахих

активированных, иакрофагов и является одной из причин усиления иитостатического эффекта гидрокортизона на опухолевые, клетки -три длительном введении гормона- ,

Совокупность приведенных данных свидетельствует о том, что эффективность прямого иитостатического действия.глюкокортикоидов на опухолевые клетки может существенно изменяться в зависимости от активности рост-регулируюцих факторов организма-опухоленосителя. Целью следующего этапа экспериментов явилось изучение механизма прямого иитостатического действия стероидных гормонов на клетки-мииени и анализ возможных путей изменения гормональной чувствительности клеток.

Регуляция скорости обращения фосфолипидов и активности протеиккипазы С как необходимый этап d реализации

I

рост-ингибирукнцего действия глюкокортикоидов на клетки гепатомм 22

Цикл обращения фосфолипидов и протеинкиназа С - зависимое ■фосфорнлированне белков имеют ключевое значение на стадии инициации клеточного деления и во многой определяют эффективность реакции клеток па митогенный стимул. Известно, что способностью изменять скорость обращения фосфолипидов и активность протеинкиназы С обладают не только белково-пептидные , ростспне факторы, но и стероидные гормоны - стимуляторы пролиферации (эстрогены) |131.Однако, вопрос о возможности регуляции этих процессов стероширгаи гормонами - ингибиторами пролиферации остается открытым.

Влияние дексамегазопа на включение, 3//—пошлина п актпвлость протелнкллаз» с в клетках гепатоми 22..

Исследования проводились на культивируемых In vitro клетках Гепатомы 22. Анализ влияния дексаметазона на включение 3Н-тимидина в ДНК клеток гепатомы показал, что клетки в экспоненциальной фазе роста нечувствительны■ к гормону. В то же время добавление дексаметазона к медленно пролиферируюкиа клеткам гепатоми (5-е сутки после пересева) , вызывает значительное ториожение пключения-3Н-тимидина о ДНК (табл.бЬ

Влияние дексаметазона на шишчешя» [^Н]твмидянп в > клвтки геоатош 22.

Клетка геоатош 22 в ексгопонциальвой П относительно

стационарной фазах роста проинкубировали о отсутствии шш

—7

присутствии 10 и даксаиатазопя в течение 20 чао, затеи 2 часа после добавления' 13Штимидина. Вюа-хвниэ 1^Н]тездядяна о ДНК определяли как описано в Методах (р < 0,01).

Условия | опыта

Вклхпешш

"Рн!

ткмцдана (со/|Ш на 1 ш«г ДНК)

экспоненциальная фаза роота i

относительно стационарная фазе роота

Шягрольные клетки ■ Клотки, обработанные дексаметазоном •

818,7 * 49,4 1048,1 * 135,3 .

168.7 * 7,2 29.6 » 5,5

' ТайЕЗДО 7

Активнооть проте&нкшхази С о кхэтках гооакжа 22

Клетки геоатош 22 проинкубировали 301 иш в присутствии tust отсутствии дексаметазона и определяли скткзаость протевшашазы С как описано в Мет дах (р < 0,005). -1

Условия опыта, Активность протеинкиназы С (тюл/ииы па 1 иг белка)

цатозольная Фракция иембранная фракция

Контрольные клетки 49 * 13' 44 т 15 -

Клетки, обработанные t (

дексаметазоном 72 * 22 18 т 1 »

Для определения действия дексаметазона на активность протеинкинази С выделяли иембраннув и цитозольную фракции клоток гепатош ' и определяли активность протеинкинази С как описано в Методах. Обпар>;~вно (табл-7), что через 30 яин после добавления к яодленно оролиферируюснв (горяоночувствителыши) клеткам гепатоии дексавотаэон вызывает сусественное снижение акт»вности протеинкинази С. в иеибранной фракции клеток и накопление фермента в составе цятрзольиоп (неактивной) фракции. Такии образом, иэиенение активности протеинкинази С полю отнести к однин из начальных события, вызванных, действием горкопа на клеткк-аисени. Однако, оставался неясный веханизи вовлечения про1еинкинази С в сферу горяональноя рзгуляцин: является ли протеинкиназа С непосредственной яагеньа для действия глвкокортикоидов, млн изменение ее активности связано с дог.ствиен горпона на петаболические пуги, контролируюяие протеинкиназу С? Как известно, однин из таких иетаболических путей является цикл обраезния фосфолипидоз. Следует отметить, что механизм активации протеинкинази С продуктами гидролиза фосфолмпидов (диацилглнцаролц, инозитолфосфатц) изучен; достаточно подробно 130). В существенно пеньсеп степени исследован иеханизи обратной регуляции: влияние протеинкинази С на скорость обрапения фосфолнпидов.

32

Скорость включения Р-ортофос<?ата в отдельные фракции $осфодпппяов л актпвпвсть протеппкняаэы С в клетках гепатоии 22.

Для изучения роли протеинкинази С в регуляции скорости обрасения фосфолипндоп бил проведен сравнительный анализ включения 32Р-ортофосфата а различные фосфолипиды клеток гепатоии в условиях кратковревепиоЯ стимуляции или подавления активности протеинкинази

Оказалось, 'что доблчление к клеткам на 10 иин ингибитора / —^ • отеинкннаэы С хлорпроназина (2x10 МI < вызывает резкое снижение 32

включения Р в фосфатидилглицорин и фосфатидилхолин на ооно

активного включения изотопа в фосфоинозитиды. Добавление к клеткам

на 10 иин активатора протеинкиназы С

12-0-тетрадеканоил-форбол-13-ацетата 1ТРЛ) в концентрации 2x10 7М

32

приводит к обратному эффекту: выраженной стимуляции включэния Р в фосфатидилглицерин п фосфатидилхолин (риС'Л).

«рмом «г

р

1|1Пи и

«ракли Ф4

12 3

1 - коагрои ( ; )

2 - ---

клеток гепатомы 22. Клетки инкубировали 10 мин без добавок (1), в присутствии 2 х 10"5 М хлорпромазина (2) и 2 х 10"'М ТРА (3). затем 20 мин в присутствии 32Р-ортофосфата. ФоСфолипиды разделяли методом ТСХ. Справа представлены результаты денситометрического сканирования ч радиоавтографа (всего 3 независимых експеримента).

Клетки гепатомы 22 в акспоненциалыюй и относительно стационарной фазе роста инкубировали 10 мин в присутствии или отсутствии ТРА и 20 млн , после добавления 32 р ортофосфата, Электрофорез белков и обработку геля проводили, как описано в Методах. Относительное количество 32 Р, включившегося в белки с М.в. 20 КД, определяли при денситометрическом сканировании радиоавтографа геля.

Таблица 8

Влияние ТРА на фосфорилирование ецдогенвых клеточных белков с М.в. 20 КД

фключенйё ЛАР в белки с

Условия опыта

М.в. 20 КД

Плетки в експоненциальной фазе роста

Контроль ТРА

4,7 12,3

Плетки в относительно •туционарной фазе роста

Контроль ТРА

0,95 1,2

^я того, чтобы установить, действительно ли скорость синтеза

фосфатидилглицерина и фосфатидилхолина коррелирует с активностью

протеинкиназы С, был проведен одновреиеНный анализ включения Р в

фосфолипиды и; ТРА-зависимого фосформлирования. эндогенных белков в

клетках ге'патоиы 22 на разных фаза!х роста. Клетки гепатоми

преинкубировали в присутствии или отсутствии 2хЮ~7М ТРА в течение

32

10 мин и затеи инкубировали 20 мин в присутствии Р-ортофосфата. Проводили электрофорез белков и тонкослойную хроматографию (ТСХ) фосфолипидов как описано в Методах.

В табл. 8 представлены результаты денситометрического

сканирования фрагмента радиоавтографа 'геля, содержащего один на ТРА-зависммих !белков с М.в. 20 КД. Можно заметить, что переход Клеток из экспоненциальной в относительно стационарную фазу роста сопровождается, практически полным прекращением ТРА-зависимого фосфорилирования белка, что, очевидно, свидетельствует о существенном снижении активности протеинкиназы С в клетках на этой фазе роста.

32

Анализ результатов ТСХ Р-фосфолийидов, полученных из тех же (слеток, показывает, что переход клеток.в относительно стационарную фазу роста и снижение активности протеинкиназы С сопровождается уменьшением синтеза фосфатидилглицерина и фосфатидилхолина и существенным ослаблением ТРА-зависнаой стимуляции синтеза этих фосфолипидов. В то же время, на всех стадиях роста клеток синтез фосфоинозитидов практически не изменяется после добавления ТРА. а ври снижении скорости роста клеток падает не столь розко, как синтез фосфатидилглицерина или фосфатидилхолина (Рис.в).

Таким образом, результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о том, что синтез отдельных фосфолипидов клеток гепатоми 22 находится в различной степени зависимости от протеинкиназы С. Если синтез фосфоинозитидов практически не регулируется протеинкиназой С. то синтез фосфотидиглицерина м фосфатидилхолина находится в прямой зависимости от активности этого фермента.

Влияние лексамотаэипа на скорость, обращения фогфолишиов п клетках гепатокы 22.

Клетки генатомы 22 на сутки после пересеял прпич1-:»г1ирм- <

•юно*« ни* 1*ъ«а етаоага&део £воха омиаоьармаа

(дм

* т

(ЦШ1 «Г «(акта

■л

«ракши «Й

А /«

- повтуояь

■), к,к - т (—.■■■■)

3? '

Рис.Ь Влияние ТРЛ на включение Р в фосфолшшда клеток геватс "ч 22

на разных фазах роста. Клетки, находящиеся в експоноЕщиалыюй И,2)

и относительно стационарной (3,4) фазах роста проинкубировали 10 мин

в отсутствии (1,3) или присутствии (2,4),2 х 10"'и ТРА а 20 мин _

поело добавления Р-ортофосфата. Фосфолиютда разделяли методом ТСХ^'

Справа представлены результаты денситометрического сканирования

радиоавтографа (всего 4 независимых аксперимента).

11вмм|циик*1 свосиаим

£Л4в РОСМ

»Г— о О

е© о о

А А

\

\

1|»ш |Г

в

^жива и

12 1» - имг^йи <- ,.....), - А>К01Н,>1,01 Ъ---.-----1

1

лр

Рис.9 В^.-.яние дексаметазона на включение Р в фосфолипида клеток гепатомы 22. Клетки, находящиеся в экспоненциальной (1,2) и относительно стационарной (3,4) фазах роста преинкубировали 10 мин в отсутствии (1,3) тыл присутствии (2,4) 10"'М дексаметазона и 20 мин после добавления 32Р-ортофосфата. Фосфолшшда разделяли методом ТСХ. Справа прг-дставло1ш результаты денситометрического сканирования рпдиоалтог; (всего 3 независимых эксперимента).

10 шш в присутствии или отсутствии дексаметазона. затеи 20 нин в присутствии 32Р-ортофосфата. Обнаружено, что дексажетазон вызывает снижение включения в фосфолипмды. которое равномерно

распространяется на все фракции: на фосфатидилхолин. синтез которого зависит от про>еинкинази С, н на фосфоинозитнды, синтез которых не регулируется протеннкипаэой С (рис. 9). Эти результаты свидетельствуют о тоя, что вмвеиьв для дейст ля гормона в клетках гепатомы являются, скорее всего, ферменты цикла обращения фзсфолшшдоз. Вероятно, подавление обра сепия фосфолииидов под депствнеи дексаметазона в свою очоредь вызывает каскад дальнейших изменения клеточного иетаболиэиа, включая и отмеченное снижение активности протоинкиназы С.

Подученные результаты позволяют также оценить возможные причини

выхода клеток из-под гормонального контроля. Как оказалось, активно

пролифарнрувсме клетки гепатомы 22, нечувствительные к

цятостатмчвскому действию гормона, отличаются высоким базалышм

урозйея обращения фосфолнпидов, а добавление дексаметазона к таким

' 32

хдоткак па вызывает заметных изменения в скоросуи включения Р о

фосфолипяди С рис.01. Известно, что повышение скорости обращения

фос^олкзядов« в активно пролиферируквдих клетках обусловлено

стняул.чциоП фосфолявазн С под действиея ростовых факторов 1121.

Празодйшша дашше позволяют предположить, что цикл обраеения

^осфолипадоо а клетках гепатоги находится под противоположным

контролен со сторони глвкокортикоидов - ингибиторов пролиферации и

ростових факторов - стимуляторов пролиферации. Вероятно, соотноиение

яеаду этяпа соодиненнаям во пногоя определяет степень гормональной

заэнсняостя фврнептов цикла обрасення фосфолипидов и, в конечной

итого, чувствительность клеток к рост-ннгибируювдму действию

горяонов. В пользу такого предположения свидетельствуют результаты

проводспнах эксперияеь.ов, показавпмх, что клетки гепатомы

практически полностью теряют чувствительность к цитостатическому

действия дексаяетазона в условиях стимуляции пролиферации и

прекрасэпяа горяон-завмсииого торнржения цикла обракения

с^сфолипидов.

Влиянмо полевых горияжюо и антшэстрогеноо на обмен фосфолипидов в клетках опухолей матки м исмочной железы

I

Результаты описанных внес экспериментов свидетельствуют о О исключительно важной роли. котор> . играют изменения цикла обращения фосфолмпмдоо в реализации цнтостатмческого действия глюкокортикоидных горионов. В дальнейших экспериментах исследовалось влияние на цикл обращения внутриклеточных фосфолипидов представителей других групп стероидных гормонов, обладающих различным действием на пролиферацию клеток-мишеней.

Лляяяие прогестерона и 178-эстрадмола на обжен фосфолипидов в клетках адевокарципоми маткп:

Хорошо известно, что. 170-эстрадиол и прогестерон обладают антагонистически» действием на пролиферативную активность тканей половой сферы: ,170-эстрадмол стимулирует, а прогестерон подавляет деление клеток. Для изучения роли шпела обращения фосфолипидсл в реализации действия этих гормонов было проанализировано влияние 17В-эстрадиола и прогестерона на скорость вклвч$нмя 32Р о фосфолипиды клеток аденокарциномы шатки женщин.

Клетки получали из фрагментов удаленных опухолей матки как описано в Методах. Оказалось, что 170-эстраднол вызывает

32«

существенное увеличение включения • Р в фосфолипиды клеток. Прогестерон обладает противоположных эффектов и приводит к снижению скорости обращения фосфолипидов (рис.10).

Как известно, инициация клеточного' деления под действием белково-пептидных ростовых факторов, в частности ЭФР, сопровождается бистро» активацией цикла обращения фосфолипидов (121. Было об- 'ружено (рис. 10), что добавление ^ФР вместе с прогестеронов ослабляет ингибируюшее действие, стероида на обмен фосфолипидов. .В спою очередь в присутствии прогестерона'уменьшается и стимулирующий эффект ЭФР или 170-эстрадиола на обмен фосфолипидов. Исследование влияния прогестерона на скорость обращения фосфолипи."ов в 19 лпонокарцимомах матки женщин (операционный материал) показало, что прогестерон вызывает подавление включения Р в фосфолипиды в 60 * опухолей.

На наш .1згляд, полученные данные свидетельствуют о том, что цикл

*у1ЫЯ«я «X

«X-«4 -

■а #

I

1 - комроп (-)

2 - 801Р1Л»01'(---)

Д - 8»Р (••••)'

I & у

* - прогвоирсв (

5 - t щюгвоЬрс*

6 - ввтрЦяоа1- дромоЬрс* (-»-*■}

♦¡¡«кии«

Ряс. 10 Влияние прогестерона, 9®Р и естрадиола на обмен фосфолипидов

в клетках аданокарциош матки. Клетки преинкубировали 10 мин без

добавок (1,4), в присутствии Ю-8*! ^ЭФР (3,5) и Ю-8« 17

Р-астрадиола (2,6). Затем продолжали инкубацию в течение 10 мин в

присутствии (4,5,6) или отсутствии (1,2,3) 10 М прогестерона и 20 32

■да* после добавления Р-ортофосфата. восфолилиды разделяли методом ТСХ. Справа представлены результаты денситометрического сканиронапия тадиоавтографа (всего 6 независимых экспериментов).

обращения фосфолипидов п клетках натки находится под»противоположные контролен гормонов - ингибиторов пролиферации (прогестерона) и стимуляторов пролиферации (стероидных гормонов из группы эстрогенов и ростовых фактрров). Вероятно, соотноменне мехду этими соединениями во многом, определяет эффектии ость- торможения цикла обращения

фосфолипидов и, в конечном итоге,1 чувствительность клеток к действии

• I

гормонов-цитостатиков-

Влняиие 17&-эстоадиола н а;> --иэстрогева тамоксифеоа па обиеа

фосфолипидов в клетках опухолей молочное железы.

Кле си получали иа фрагментов удаленных опухолей молочной хелезц

женщин. Обнаружено, что в 10 из 29 исследованных опухолей

молочной железы 170-эстрадиол вызывает 1,5-2-кратное увеличение

скорости обрааекия основных клеточных оосфолипидов: фосфатидилхолина

и фосфоинозитидов. ' ,

Анализ действия на клетки опухолей молочной железы айтиэстрогсна

тамоксифена выявил неоднозначную картину изменения о обмене

фосфолипидов. Прежде всего оказалось, что, в отлично . от

прогестерона, добавление тамоксифена к клеткан, стимулированная ЗСР

или 17Б-эсТрадиолом не снимает действия этих соединения па обкан

фосфолипидов. Так, таиоксифен ослабляет индуцированное ЭФР иди

176-эстрадиолок увеличение включения 32Р в фосфатидылхолин, в то

32 1

время как включение Р в фосфоинозктиди не только не снижается, но,

наоборот, существенно возрастает относительно контрольного уровня.

Сходные изменения в обмене фосфолипидов наблюдаются и при действия

тамоксифена иа нестииулированние клетки опухолей (puc.ll):

таиоксифен стимулирует обмен фосфоинозитидов, тогда как обпей

фосфатидилхолина существенно не изменяется. Такой эффект такоксифена

обнаружен в 16 из 22 исследованных опухолей молочной хелозы.

Можно било предположить, что изменения в обкене фосфолипидов,

отнеЧаеиыо после' обработки клеток таноксифенои, связаны с ого

способностью непосредственно воздействовать на пути переноса

иитогенного сигнала в клетках и, в частности - с известным свойством

тамоксифена , подавлять активность протеинкиназы С (241.

Депствительно, было обнаружено, что активатор протеинкиназы С ТРЛ

вызывает изменения в обращении фспфолипидов, обратные тем, что

наблюдаю ;я при действии тамоксифена. На рис.12 видно, что обработка

1 - М^И (-> * - I")

г - —> ' - ♦ «•»««»«•» (■')

» - ИГ I.....) 4 - ><1>им1 • и»01&>4а1 1 . а )

Рас.11 Влияния тамоксифена, ЭФР и аотрадиола на обмен фосфолипидов а клетках опухолей молочной железы. Клетки проинкубировали 10 мин без добавок (1,4). в присутствии Ю^М &ВР (3,6) и 1О"0М еотрадаола (2,5). Затеи продолжали инкубации в течение 10 мин в присутствии (4,5,6) или отсутствии (1,2,3) 10 И таызксифена, и 20 мин после добавления -33 Р-ортофосфатя. Фосфолапида разделяли методом ТСХ. Справа представлены результаты "денсатометричезкого сканирования радиоавтографа (всего 6 независимых експариментоп).

1 - 1 -> 5 - пммв^я» (-4

г - и>» « - нмшфа » од (••—)

Рис.12 Влияние тамоксифена а ТРА на обмен фосфодшшдов в клетках пухолвй молочной аелезы. Клетки првинкубировали 10 мин без добавок (1), в присутствия 2 х 10"'М ТРА (2), 10'6М тамоксифена (3) и 10"вМ тамоксифена +.2 1 10"'М ТРА (4), затем 20 мин после добавления ЗяР-ортофосфата. Фосфолипиды разделяли методом ТСХ. Представлены результаты денситометрического сканирования радиоавтографа (всего 4 независимых эксперимента).

- 32 -

-7

клеток ТРА в концентрации 2x10 М приводит к активации обмена фосфатидилхолина и некоторому снижение синтеза фосфоинозитидов. Добавление к клеткам ТРА вместе с тамоксифсном практически полностью блокирует действие последнего на обмен фосфолипидов. :

Такии образом, из приведены, данных следует, что действие на клетки-кипени антиэстрогена тамоксифена, в отличие от действия стероидных гормонов - цитостатиков (глюкокортикоидов, прогестмнов), но связано' с тормохениен цикла обращения .фосфолипидов, а реализуется, ¿корее всего, через изменение протеинкиназа С -зависимых путей переноса имтогенного сигнала.

Принцип мультифуккииональноп регуляшиа гормональной чувствительности клеток

Результаты проведенных исследований позволяет сфориулиро :ать основные закономерности регуляции гормональной чувствительности клеток. Как следует из полученных данных, изменения гормональной чувствительности клеток не обязательно связаны с нарушениями рецевторного аппарата клеток и могут носить обратимый характер, приводя лг.иь к временному ослаблению, I но не полному прекращению ответа клеток на стероид. На нац взгляд, эти результаты свидетельствуют о существовании в клетках нескольких путей регуляции гормональной чувствительности.

Наиболее известный путь регуляции основан на изменении содержания внутриклеточных гормон-связываюших рецепторов. Несмотря на большое число экспериментальных исследования, посвященных этой ср Олене, механизм, ответственный эа подобного рода регуляцию, до конца не изучен. Прежде всего остаются неизвестными причины, приводящие к снижению концентрации и активности рецепторов в клетках г-локачествешшх-опухолей. В качестве возможных причин исследователи рассматривают нарушение структуры и экспрессии генов, кодирующих рецепторы, появление в клетках мутантных рецепторных белков, изменение концентрации гормонов и ростовых факторов, контролирующих синтез рецепторов сте; оидных гормонов (291. Следует отметить, что определенные вариации 1 в содержании стероидных

рецепторов отмечаются и в нормальных тканях, но в этих случаях они оказываются легкообратимыми и не достигают столь низких значений, как для опухолевых клеток. ,

Второй путь регуляции гормональной чувствительности также связан с функционир,таниеи горяон-рецепторного комплекса и основан на изменении сродства' комплекса к специфическим участкам ДНК. Так, рядом исследователей было обнаружено, что ;нихение в опухолевых клетках гормональной индукции ферментов часто коррелирует с нарушение«! структуры соответствующих , генов. Важную роль в чувствительности клеток к горионая играет и степень метилирования ДНК 18!. Следует отметить. что гормон-рецепторный комплекс является лишь одним- из большого числа регуляторних белков, контролирующих экспрессию гормон-зависимого гена; Связывание со специфическими последовательностями ДНК регуляторных белков, действующих как независимо от гораона, так и непосредственно участвующих во взаияодеяствии гормон-рецепторного комплекса с ДНК. возет во яногоа определять эффективность гормонального контроля транскрипции О).

Однако, представленные в настояиея работе результаты свидетельствуют о том', что наряду с описашшим принципами регуляции гораопальноя чувствительности клеток существенное значение имеет и другой способ регуляции. В отличие от первых двух, этот путь регуляции не затрагивает структур, необходимых для реализации действия' гормона (рецепторы, сайты связывания ДНК). Речь идет о регуляции активности рментативных систем, которые принимают участие во < внутриклеточных процессах, ; контролируемых гормонами. Одним из наиболее характерных примеров подобного рода регуляции является изменение чувствительности клеток-мишеней к ростовым ^фектам стероидных гормонов.

Хорошо известно, чтс инициация клеточного деления под действием , ->стовых факторов ножет развиваться по разным путяи: через активацию протеинкиназы С, цАМФ-зависимых протеинкиназ, Бб-киназы, с участием специфических тирозинкиназ - рецепторов ростовых факторов 1311. Для г-йствия многих ростовых факторов большое значение имеет стимуляция фосфолипазы С и никла обращения фосфолипидов, в результате которой в клетках накапливаются диацилглицеролы, активирующие протеинкиназу

130]. Даже стимуляция клеточного деления под действие* одного ростового фактора, например ЭФР, сопряжена с активацией нескольких путей переноса митогенного си'чала. Об этом свидетельствуют извсстние даннне о сохранении некоторых ЭФР-вависимых эффектов (индукции синтеза рецептора ЭФР, активации Бб-кинази) о условиях ингибирования протеинкинаэы С - одного из ключевых ферментов клеточного цикла, активируемых ЭФР ПО].

Судя по имеющимся данный литературы , далеко не все пути переноса иитогенного сигнала находятся под контролен стероидных гормонов. Вероятно, развитие в клетках гормональной резистентности ножет происходить в результате переключения путей инициации клеточного деления с одних, .. контролируемых ■ стерондави, . на другие,гормон-независииые пути. При этой изменения гормональной чувствительности клеток могут быть основаны на ковпенсаторнов увеличении концентрации соединений, активность которых заблокирована ! гормонами. Так, в наших экспериментах было обнаружено, что действие на клетки-мишени глюкокортикоидных гормонов и прогестииов сопряжено с торможением процессов, инициируемых ростовыми факторами, таких кап гидролиз фосфолипидов и активация протемнкиназы С. ДлсР прекращения действия гормонов достаточно добавления к клеткам избытка ростовых факторов,. Сходная картина развития гормональной резистентности отмечается и , в клинических исследованиях: опухоли с высоких содержание)! , рецепторов ростовых факторов (ЭФР) отличаются« как правило, низкой чувствительностью к рост-регулируюцэку действие) стероидных гормонов 123). Очевидно, что оодобвия путь развития гормональной резистентности никак не связан с нарушением рец„пторного механизма передачи гормонального сигнала, а реализуется через изменение активности соединения, которые, наряду с горконаки, контролируют определенные функции клеток, в частности клеточную пролиферацию. ,

Следует отметить, что описанный принцип регуляции гогиональнол чувствительности иохет распространяться и на другие функции клеток, контролируемые; гормонами. Оказалось, что временное повышение активности гормон-зависимых ферментов, ' вызванное действиеи негориональних мндуктгров, . сопровождается снижвнмеи уровня гормональной индукции ферментов,; несмотря на сохранение рецепторного

■" i.

аппарата клеток. Об этой свидетельствуют представленные выие результаты ' исследования гормональной индукции

тмрозинаяанотрансферазы в клетках печени в условиях длительного введения • индукторов ' TAT. Такие образом, регуляция гормональной чувствнтелыюсч,л клеток может осувяствляться и без изменения рецапторного аппарата клеток, ограничиваясь верестроякоп Оарионтатаагшх систеп, контролирующих гормон- тнсиные функции.

И, наконец, нельзя' не ответить' ene один путь регуляции горионадькоп 'чувствительности клеток, реализуемый на уровне Езгтханзвых взаимодействия. При действии гориоиов In vivo некоторые их эффзкты развивается не в результате прямого контакта стероида с клеткася, но опосредованно, через изменение активности функционально сопрягзнних с кнви других клеточных систек. Так, выг.е отмечалось, что цатостатнческий эффект глкхокортикомдов на клетки гепатояц 22 1п vivo значительно усиливается после длительного введения гориона гявоткия. Ояпа из причин этого явления ьохет закличаться вг снижении чувствительности к горпону перитонаальных макрофагов и сувдственнои поэнгэнни их цитотоясаческоп активности. Авторы других работ отйзчаот, что nasiya роль s регуляции гориональноя чувствительности опухолей играет уровень продукции ростовых факторов тканяпи организм - озухолспоситсля 1221.

Тот факт,, что кетаболизи как опухолевых клеток, так м порзальних тканая, регулируекнх гораонаш», находится в постоянной функциональной свази с другкнм клеточными системами, позволяет с узерзкксстьо говорить значительном вкладе этих систем в

форнирование окончательной картины гормональной чувствительности клеток. Причен влияние окружения опухолевых клеток на, их чувствительность к горионая ногет реализовнваться в соответствии с ■ еви приниипави регуляции, которые были рассяотрены выше: через пзнэнсияе роцепторного г парата клеток и через изаенение активности LjexmismiH. которые принимают участие во внутриклеточных процессах, гсомтролпруекых горнонамн.

Такии образоа, чувствительность клеток к рост-регулируюаему j"^ncTBua стероидных гормонов следует рассматривать не как постоянную величину, а как динамичную, изиекапзуюся .функции, окончательные значения которой зависят от активности целого ряда внутри-

внеклеточных факторов. Подобный подход в сочетании с приведенными выше результатами экспериментальных исследований позволяет разработать новые пути определения чувствительности опухолевых клеток к гормонам, основанные на установлении степени гормональной зависимости ключевых реакций клёточного цикла: гидролиза фосфолипидов и Дктивацни протеинкиназы С.

Выводы

1. Показано, что в результате длительного введения глюкокортикоида животным подавляется гормональная индукция тирозинаминотрансферазы, в то время как гормоноэависииое ^торможение пролиферативных реакции клеток печени (синтез мРНК Ha-ras, включение 3Н-тимидина в ДНК) не меняется.

2. Обнаружено, что перевивка клеток гепатоиы животным, получавшим 10 ин'екиий гидрокортизона, сопровождается' значительным ториохециен роста опухолевых клеток, тогда как однократная ии'екция гормона не вызывает существенных изменений пролиферативной активности клеток гепатомы. Показано, что длительное введение гормона приводит к формированию популяции гормонореэистентных макрофагов, отличающихся повышенной цитостатической активностью, что может являться одни»! из Факторов, поддерживающих и усиливающих индуцированное глюкокортикоидамн торможение клеточной пролиферации.

3. Изучение прямого цмтостатического действия глюкокортикоидных гормонов на клетки гепатомы 22 In vitro показало, что через 30 мин после добавления гормона к клеткан наблюдается 1,5-2-кратное снижение скорости обращения фосфолипидов'и активности протеинкиназы С - ферментативных процессов, игравших ключевую роль в инициации клеточного деления.

4. Обнаружено,- что эффективность действия глюхако.ртикоидных гормонов на фбмен фосфолипидов может существенно варьировать о зависимости от степени ' гормональной чувствительности .клеток. Показано, что клетки гепатомы 22, находящиеся в экспоненциальной фазе роста, не чувствительны к цитостатическожу действию глкжокортикоидов и добавление гормона к клеткам не вызывает изменений в скорости обращения фосфолипидов- В то же время медленно

продиферируюиие клетки гепатоии чувствительны к цитостатическому действию глюкокортикоидов и добавление горяоиа к таким " клеткам приводит к подавлению обращения фосфолипидов и активности протеинкинази С.

5. При исследовании действия стероидного гормона - цитостатика прогестерона на клетки Ьденокарциномы матки жениин установлено, что прогестерон подавляет обмен фосфолипидов в 60* исследованных опухолей. Обнаружено, что эффективность действия прогестерона снижается в присутствии ростовых факторов (ЭФР).

6. Установлено, что стимулятор пролиферации 17£~эстраднол вызывает увеличение скорости обращения фосфолипидов в 35Х исследованных оггухолеЯ Молочной зоелезы женщин. Действие на клетки опухоли молочной гелезы антиэстрогена тамоксифена сопровождается неравномерными йзяеНени'яяИ обмена отдельных фосфолипидов (активацией обращения фосфойнозйТидов ■ и подавлением обрасення фосфатидилхолина) и реализуется, скорее всего, через изменение протеинкиназа С-зависииых йутей переноса ¿мтогенного сигнала. '

7. Полученные данные позволили сформулировать принцип йульткфункционалмюя регуляции гормональной чувствительности клеток. Предполагается, что чувствительность клеток к гормонам регулируется как через изменение рецепторного. механизма передачи гормонального сигнала, так и независимо от рецепторного аппарата клеток - через изменение ферментативных систем (в частности, цикла обращения фосфолипидов ]ы ■протеинкиназы С), участвуюких в реализации гормонозавмеимых функций клеток. Подобный подход в сочетании с Полученными экспериментальными результатами позволяет разработать Новые пути к определению гормональной чувствительности опухолей, основанные на установлении степени гормональной зависимости ключевых реакций клеточного цикла - гидролиза. фосфолипидов и активации Протеинкиназы с. ;.(

Список научных работ, опубликованных по теме диссертация

1. Красилышков U.A., Адлер В.В., Бочкарев Г.Ю. Связывание глюкокортикоид-рецепторных комплексов с акцепторными зонами ядер и .влияние глококортмкондов на синтез * РНК в. чувствительных ы гормонорезистентных клеточных популяциях // Биохимия, 1982, Т.47, ВЫП.2, с.206-215.

2. Адлер В.В., Красмльннков H.A., Бочкарев Г.Ю. Ранние изменения структуры ДНК-натрниы после введения глвкокортикоыдов. // Биохимия, 1982, т.47, вып*б, с.915-920.

3. Красильников H.A., Полоцкая- A.B.. Дмитриева Л.В.; Адлер В.В., Сапот B.C. Этапы взаимодействия стероидных гормонов с внутриядерными акцепторными' зонами клеток гепатокы Коррнса // Биохимия, 1983, Т.48, вып.10, с.1733-1738.

4. Полоцкая A.B., Адлер В.В., Красилышков U.A., Дмитриева Л.В., Папот B.C. Биохимические критерии чувствительности клеток млекопитаюнах к глюкокортикондам // Биохимия, 1983, т*48, вып.11, с.1849-1854

5. Красильников М.А., Полоцкая! A.B., Тедиков В.П., \длер В.В. Взаимодействие триамсиколон' ацетонида с клеткаии гепатомы Морриса в присутствии антибиотиков - ингибиторов синтеза РНК // Биохимия, 1984, Т.49;. вып. \ С.1496-1501.

6. Красильников М.А., Полоцкая A.B., Адлер В.В, Гормональная индукция тирозинаминотрансферазы м синтез РНК в клетках гепатомы Морриса линии 7777 // Биохимия, 1985, т.50, вып.4,

с.686' э91.

7. Красильнихов Я.А., Полоцкая A.B.. Динтриева Л.В., Адлер В.В. Синтез тирозинаямнотрансфераэи нормальными и опухолевыми клеткаям печени вря длительной гормональной стимуляции // Тезисы докладов IY Всесоюзной конференции по биологии клетки. Тбилиси, 1903. с.341 - 343.

0. Красильнмков H.A.. Полоцкая A.B., Адлер В.В., Вапот B.C. Регуляция уровня гормональной индукции иРНК. тироэинаминотрансфераэи в культуре клеток гепатоны Иорриса // Тезиси докладов Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток в культуре. Звенигород, 1986. с.67.

9. Красилышков H.A.. Богданова H.H., Адлер В. В. Действие глвхокортикоидных гормонов на синтез ДНК и экспрессию протоошсогена Ha-ras в клетках пролифериругаей печени крыс. // Биохииия, 1907. т.32, ВЫП.7, с.1226-1229.

10.Красильнмков Я.А., Полоцкая A.B.. Дмитриева Л.В., Адлер В.В., Папот B.C. Аутогенная регуляция чувствительности клеток печени к глвкокортикомдап в условиях длительной гормональной стииуляции // Биохимия, 1987. т.32, вып.11, с.1838 - 1647.

11.Krnsll'nlkov М.А., Adler V.Y., Polotskaya A.V. Regulation of tyrosine aalnotransferase <TAT) gene sensitivity to glucocorticoids. // proc. Intern .Syaph. "Physlco-chealstry of DNA and Bolecular mechanises of geno»e functioning" Tbilisi,1967 . p. Ill - 112.

12.Адлер В.В.. Красильнмков H.A., Полоцкая A.B. Регуляция транскрипции гена тирозинаиинотрансферазы глюкокортикоидавм в клетках гепатосы f.toppwca 7777 и 8994 // Молекулярная биология, 1966, т.22, вып.2. с. 423-29.

13.Красильников H.A., Богданова H.H.. Адлер В.В. Тормогение пролиферации нормальных и опухолевых клеток печени в условиях длительной гормональной стииуляции// Биохииия,1989 т. 54. вып.4. с. 656-62 .

14.Красильников М.А.. Адлер В.В. Молекулярные механизмы деяствмя глюкокортикоидов на пролиферативные реакции клеток млекопитаюких (оОзор) // Успехи современной биологии, 1969, т. 108, вып.1 (4), с.66 - 79.

15.Красильников М.А., Сухова Т.И. Регуляция скорости клеточной пролиферации глюкокортикоиднымм гормонами: влияние глюкокортикоидов на распад фосфатидилиноэитолдифосфата к синтез мРНК с-вус в клетках гепатомы Морриса линии 7777 // Тезисы докладов Всесоюзной конференции по генетике соиатических клеток в культуре, Звенигород, 1989, с.65.

16.Красильников И.А. О возможной роли глюкокортикоидных гормонов в старении организма (обзор). // Вестник АМН СССР, 1990, т.З, с.55 - 59

17.Краенльников М.А., Храмцова С.Н. Механизм торможения пролиферации клеток гепатом под действие» глюкокортикоидных гормонов // Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Биохимия опухолевой клетки". Минск, 1990, с.54.

10.Натекая В. А., Красильников Н.А., Бассалык Л.С. Влияние 17 р-эстрадиола и эмбриональной сыворотки на синтез фосфолипидов в клетках карциноиы натки // Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Биохимия опухолевой клетки" Минск, 1900, с. 157.

lQ.Krasll'nikov М.А., Shatskaya V.A. Effect of steroid horoones on the rate of phospholipid synthesis and protein kinase С activity In tumor cells // Metastatic spreadlne of sallgnant tumors. New approaches, Kiev, 1991, p.205.

20.Красильников M.A., Ватская В. А. Рост-ингибируюнее действие глюкокортикоидов и прогестинов на опухолевые клетки In vitro: влияние на скорость обращения фосфолипидов // Биохимия, 1991, т.56, вып.7, с.1272-60.

21.Красильников И. Д.. Храмцова С.Н., Басюк Е.И. Роль пермтонеальних макрофагов в реализации рост-ингибирувщего действия глвкокортикоидов на клетки перевиваемой мывиной гепатомы 22: влияние гидрокортизона на цитотоксическую активность и обмен фосфолипидов накрофагов //Биохимия, 1991, т.56, вып.7, С.1201-1287.

22.Красилышков П.А., Безруков В.Я., Еатская В.А. Регуляция скорости обравения фосфолипндов и активности протеинкинази С как необходиаия этап в реализации рост-ингибируюкего действия дексаиетазона на клетки гепатомы 22 // Биохимия. 1992. т.57. вып.4. с. 637-46.

23.KrasU'nlkov М.А.. Bezrukov V.M.. Shatskaya V.A. Glucocorticoid regulation of phospholipid turnover and protein kinase С activity in ею usо hepatoma 22 cells // Blochlntca ot Biophysics Acta. 1992. 1135, 91-96.

24.Красильннков M.A. Биохимические пути регуляции горяональнон чувствительности клеток (обзор) // Биохимия, 1993, т.38, вып.4, С.499-511.

25.Shatskaya V.A.. Krasil'nlkov И.A EfTect of 17 0-estraillol and taeoxlfen on phospholipid turnover in breast cancer cells // Proc. Second. Europ. Seminar on Surfflcal Oncology, Lvov, 1992. In: Acta Chlrurela Austrica, Suppl.. 1992.

26.Красильнихов И.А.. Храмцова С.И., Шатская В.А. Участие перитонеалышх макрофагов в реализации рост-ингмбирувиего действия стероидных гормонов на опухолевые клетки: влияние гормонов на цитотоксическую активность и обмен фосфолипидов макрофагов // Тезисы докладов I съезда иммунологов России, Новосибирск. 1992. с.250.

27.Красильников М.А., Патская В.А.. Кузьмина З.В., Баринов В.В., Летягин В.П., Бассалык Л. С. Влияние стероидных гормонов м таиоксмфена на скорость обращения фосфолипидов в клетках опухолей иатки и молочной хелезы // Вестник РАМН, 1993. т.З, с.43-46.

20.Krasll'nlkov M.A., Shatskaya V.A.,Kuzalna Z.V.. B&rlnov V.V., Letуagin V.P., Bassalyk L.S. Regulation of phospholipid turnover by steroid hormones In endoaetrlal carclnoaa and breast cancer cells // Acta Endocrlnologtca, 1A93, 120, 274.

29.Красмльников М-А.. Яатск&я В.А., Бассалык Л.С. Влияние прогестерона и тамокснфена на ЭФР-а&вмсммув аггиваимо обращения фосфолипидов в клетках опухолей натки н полочной железы // Биохимия, 1993, т.58. вып.6.

Список дотированных работ

1. Конопля Е.Ф., Луква Г.Л. Стероидные гормоны и геном клетки. Минск, Наука и техника, 1987, 143 с.

2. Рецепторы стероидных гормонов в опухолях человека. Под ред. Л.С.Бассалык. Москва, Медицина, 1987.

3. Салганик Р.И., Грязнова H.H., Наркель А.Л. ДАН СССР, 1979, 245, 473-476.

4. Храмцова С.П., Райнхольд Д., Сухова Т.Н. и др. Биохимия, 1989, 54, 1673-1680.

5. Beato М.// Oncogenes and Growth Control. Eds: Kahn P., Graf Т. Sprlneer-Verlas Berlin Heidelberg. 1986. 219-225.

6. BUgh E.C., Dyer V.J.// Can.J.Blochen.and Physlol.,1959. 37. 911-917.

7. Cook P.H., Kelntraub W.H., Swanson K.T., e.a.// J.Blol.CheB.. 1988, 263, 19296-19301.

8. Darbre P.D.. King R.J.B.// Cell. 1987, 51. 521-528.

9. Diamonds tone T.I. //Anal.Blochen., 1966, 16, 395.

10. Earp U.S., Hoipar J.R.. Potch L.A.// J.Slol.Chen.. 1988,263, 13868-13874.

11. Ellis R.ff.', do Foo D.. Shin T.Y.. e.a.// Nature. 1981,292. 506-311.

12. Fain J.N. // Blochen. ot Blophys. Acta. 1990. 1053. 81-88.

13. Fretor C.F.. Llppnan H.E., Chevlllo A., o.a.// Hoi.Endocrinol., 1988, 2. 159-166.

14. Hocan M. // J. Icaunol., 1988. 140, 513-519.

15. Howoll A.. Barness B.M.. Harland R., e.a. // Lancet. 1984,1,388.

16. Iluanff 3.J.. ItonU P.N., Domes C.P.. o.a. // Blochen. J., 1988. 249, 839-843.

17. Kalbuchl K., Takal Y., 5a\ra=ura !4.. o.a. // J. Biol. Chen.. 1933. 230. 6701.

13. Loob J.II., Boroc C.. Young L.L.// Proc.Nat.Acad.Scl.USA, 1974, 70, 3832- 3836.

19. Kadtos D.K., Raines E.W., Sakarlassen K.S., o.a.// Cell, 1988, 33, 285-293.

"0. KlM U.S.. Hoohn J.S. // Arch.Surff., 1989, 124, 377.

21. Eianlatls T., Frltsh E.E.. Sasbroolc J. // Molecular Cloning. A laboratory canual. H.Y.: Cold Sprlne Harbor, 1982, 191-195.

•22. Murphy L.C., Dotzlan II. // Cancer Res., 1989. 49, 599.

23. Nicholson 3., Halerow R.. Salnsburff J.R.. e.a. // Br.J.Cancer., 1988, 58, 810-814.

24. 0'Erla.n С.A., Llsk'acp R.. Solocon D.H.. o.a. // Cancer Ros.» 1885. 45. 2462-2465.

25. Ottestad L., Tvelt K.M., hollodt H.K., e.a. // Br.J.Cancer, 1908, 50. 8.

26. Roberts M.M., Rubens R.D., Klne R.J.B. // Br.J.Cancar, 1876, 36, 431.

27. Shlnonlya Т., Schorer G., Schald W.,e.a.// Proc.Hat.Acad.Sel. USA, 1984, 61, 1346-1350.

26. Vlnteriayr O.K.. Doskoland S.O. // J.Coll Physiology, 1CCÖ. 138, 29.

20. Wastphal U.M., Mugóle K.. Beato M., o.a. // EK30 J.. 1564. 3, 1493-1498.

30. Whitman M., Cantley L., // Blochin. et Blophys. Acta, 1ÍCS, 948, 327-377. . '

31. Wllllans L.T. // Sclenco. 1969, 243, 1564-1570.

УЧАСТОК МНОЖИТЕПЪНОЙ ТЕХНИКИ ОН Ц P АМН • ПОДЛ- К ПЕЧАТ^ЗЙ/ЗзАКв^&ТИРАкЮОзКЗ.