Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Конверсия андростендиона в опухолевой и экстрагонадных тканях и ее связь с гормонально-метаболическими факторами у больных раком молочной железы

Р Г Б ОД

г

на прквах рукописи:

Ларионов

Алексей Анатольевич

Конверсия андростендиона в опухолевой и экстрагонадных тканях и её связь с гормонально-метаболическими факторами у больных раком молочной железы

Специальность - 14.00.14 - онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 1997

Работа выполнена

в НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова Министерства здравоохранения РФ (Санкт-Петербург)

Научный руководитель

доктор медицинских наук Л.М.Берштейн

Научный консультант

доктор медицинских наук, профессор В.Ф.Семиглазов

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук В.М.Моисеенко доктор медицинских наук А.Ф.Урманчеева

Ведущее учреждение

Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологический институт Министерства здравоохранения РФ (Санкт-Петербург)

Защита состоит ся "__"_1997 г.ув-1-' часов.

на заседании Специал1шфовршого Совета К 074138.01

НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова Министерства здравоохранения РФ

189646, Санкт-Петербург, Песочный 2, Ленинградская ул., 68

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института

Автореферат разослаи "_" __1997 г.

Учёный секретарь

Специализированного Совета доктор медицинских наук ...

Е.В.Демин

-1В ВЕДЕНИЕ Актуальность работы

Рак молочной железы (РМЖ) является одной из самых частых злокачественных опухолей человека (Напалков НП 1989, Семиглазов ВФ с соавт 1992). В развитых странах он выявляется более, чем у 10% женщин (1л РР е1 а11993), причем, не менее, чем в 1/3 клинически выявленных случаев РМЖ опухоль является гормонально-зависимой (Дильман ВМ 1983, БаШеп Ю е! а11990).

Основой гормонального лечения при РМЖ в настоящее время является противодействие эсгрогенной стимуляцией опухоли. Для этого используются два основных подхода: во-первых - блокада эстрогенного эффекта на уровне клеточных рецепторов, и, во-вторых, - различные способы ограничения синтеза эстрогенов в организме больных: о вар из кто мия, аналоги гонадотропин-рилизинг-гормонов и ингибиторы ароматазы (Дильман ВМ 1983, Семиглазов ВФ с соавт 1992, ВгоШе АМН е1 а1 1987). В последние годы разрабатывается и внедряется в клинику третье поколение ингибиторов ароматазы (ключевого фермента в биосинтезе эстрогенов), что привлекает к этой группе лекарств особое внимание (МШег WR1996).

Основной точкой приложения терапевтического воздействия ингибиторов ароматазы является экстрагонадный синтез эстрогенов, а его активность в опухолевой ткани может служить маркером чувствительности к ингибиторам ароматазы. Внегонадный синтез эстрогенов у женщин, как правило, реализуется путем конверсии циркулирующего в крови надпочечникового андросген-диона в эстрон. При этом происходит ароматизация кольца А молекулы авдро-стендиона, в связи с чем данная реакция в литературе, посвященной биосинтезу эстрогенов, и получила тривиальное название «ароматизация».

Ароматаза обнаружена в разных тканях, но основными внегонадными источниками циркулирующих в крови эстрогенов, прежде всего, за счет своей массы, являются жировая и мышечная ткань. При этом синтез эстрогенов в мышечной ткани, в отличие от жировой, изучен крайне слабо.

Особос внимание при РМЖ привлекает синтез эстрогенов в самой опухолевой ткани. Этому вопросу посвящено уже много работ, но их результаты часто противоречивы. В частности, противоречивы данные о связи локальной ароматизации с различными характеристиками опухоли и о значимости этого процесса для патогенеза РМЖ. Недостаточно изучен вопрос о связях локальной ароматизации в опухолевой ткани с гормонально-метаболическим окружением опухоли.

Остается актуальным вопрос о том, какие клетки в ткани РМЖ отвечают за локальный синтез эстрогенов, что стало изучаться сравнительно недавно. К началу выполнения данной работы нам была известна только одна публикация по этому вопросу: Esteban JM et al (1992). В дальнейшем, кроме работ нашей лаборатории, еще три группы исследователей опубликовали свои данные. При этом, одни авторы находят ароматазу преимущественно в злокачественных клетках (Esteban JM et al 1992, Lu Q et al 19%), а другие - в веретенообразных стромальных клетках (Santen RJ et al 1994, Sasano N et al 1994).

Практически не изучалась возможность синтеза эстрогенов клетками лим-фоидного ряда. Нам известно только несколько отдельных наблюдений по этому вопросу, и дальнейшие исследования в этой области тоже представляются актуальными.

Таким образом, несмотря на то, что эстрогенозависимость РМЖ уже давно является предметом пристального внимания онкологов, в этой области остается еще много вопросов, требующих дальнейшего изучения. Среди них вопрос о том, каковы экстрагонадные источники эстрогенов при РМЖ, и чем определяются особенности их регуляции. Одним из шагов в изучении этого вопроса является данная диссертация.

Целью работы

явилось сравнительное исследование активности ароматазы в опухолевой и мышечной тканях, а также конверсии андростендиона в лимфоцитах крови, и сопоставление интенсивности этих биохимических реакций с гормонально-

метаболическими и клинико-морфологическими показателями у больных РМЖ.

Для достижения данной цели были сформулированы следующие задачи:

1) Оценить активность и клеточную локализацию ароматазы в ткани опухоли у больных РМЖ.

2) Оценить уровень конверсии андростендиона в циркулирующих лимфоцитах и ароматизацию в мышечной ткани у группы больных РМЖ и в группах сравнения.

3) Сопоставить активность ароматазы в опухолевой, мышечной ткани и конверсию андростендиона в лимфоцитах между собой.

4) Сопоставить полученные данные с рядом гормонально-метаболических показателей: состоянием репродуктивной системы (менопаузальвый статус, уровень эсградиола и тестостерона в крови ) и состоянием жиро-углеводного обмена (глюкоза, холестерин, а-холестерин, триглицернды, Р-липопротеиды, антропометрические данные).

5) Сопоставить полученные данные с клинико-морфологическими показателями по материалам истории болезни и по данным подробного гистологического заключения, включающего количественную оценку клеточности опухоли.

Научная новизна

В процессе выполнения данной работы были получены новые данные по ряду спорных вопросов, касающихся локального синтеза эстрогенов в ткани РМЖ:

- была подтверждена связь локальной ароматизации с клиническим течением РМЖ, в частности - с размерами опухоли;

- было установлено, что локальная ароматизация в ткани РМЖ происходит преимущественно в злокачественных клетках;

- впервые была обнаружена зависимость локального синтеза эстрогенов в ткани РМЖ от уровня тестостерона в крови;

- впервые была изучена активность ароматазы в мышечной ткани и интенсивность конверсии андростендиона в лимфоцитах крови у больных РМЖ. Была

выявлена зависимость этих процессов от состояния репродуктивной системы и связь конверсии андростендиона в лимфоцитах с некоторыми показателями иммунитета.

Практическая ценность

Полученные данные о локальном синтезе эстрогенов в ткани РМЖ и о различных путях экстрагонадной конверсии андростендиона при РМЖ в дальнейшем могут использоваться при разработке новых подходов к гормонотерапии, оценке течения и прогноза у больных РМЖ.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались автором на II Национальном Конгрессе молодых ученых-медиков Украины (Киев 1994) и на научных конференциях лаборатории эндокринологии НИИ онкологии им проф. Н.Н. Петрова в 1994-1997 годах, а также представлены в 10 публикациях в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объём диссертации.

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов, результатов исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 20 рисунками и 4 фотографиями. Библиографический указатель включает 146 публикаций на русском и английском языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Характеристика обследованных групп

В данной работе было обследовано 145 женщин: 89 больных РМЖ и 56 - в группах сравнения. Локальная ароматизация в опухолевой ткани была изучена у 77 больных РМЖ (в 50 случаях - биохимическим и в 27 случаях - иммуноги-стохимическим методом). Конверсия андростендиона в циркулирующих лимфоцитах определялась у 38 больных РМЖ и у 45 здоровых доноров. Ароматизация в мышечной ткани - у 16 больных РМЖ, и для сравнения - у 11 больных с иной патологией ( 2 больных опухолями других локализаций и 9 травматоло-

гических больных). У часта больных РМЖ активность ароматазы (конверсия андростендиона) определялась сразу в нескольких тканях.

Больные РМЖ обследовались и лечились в НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова в 1989-97 годах. Женщины, вошедшие в группы сравнения, обследовались в лаборатории эндокринологии в те же годы. Образцы мышечной ткани от больных опухолями других локализаций также были получены в НИИ онкологии. Мышечная ткань от травматологических больных собиралась в 1996 году в НИИ травматологии им. Вредена. Дня обследования отбирались лица без декомпенсированной сопутствующей патологии.

Оценка ароматизация в опухолевой и мышечной тканях и конверсии андростендиона в циркулирующих лимфоцитах

Биохимический метод

Принцип метода

В данной работе для биохимической оценки ароматизации в опухолевой и мышечной тканях использовался метод, основанный на регистрации тяжелой воды, образующейся при ароматизации андростендиона, меченного тритием в 1 Р-положении. Достоинство данного метода состоит в том, что отделил, не-прореагировавший меченный андростендион от образовавшейся тяжелой воды гораздо легче, чем от образующихся эстрогенов. Недостаток метода заключается в том, что он косвенный: в принципе можно предположить образование тяжелой воды из 1 Р-Н3-андросгендиона и в результате каких-либо других реакций, помимо ароматизации (Berstein LM et al 1993). Однако для многих тканей, способных к ароматизации, показано хорошее соответствие между образованием тяжелой воды и эстрогенов, в частности - этот метод широко используется для изучения ароматизации в опухолевой ткани (Tilson-Mallett N et al 1983) и уже использовался для оценки ароматизации в мышечной ткани (Doody KJ and Carr BR 1989, Sholl SA et al 1989). В этих тканях присутствие ароматазы подтверждено и другими методами (Miller WR et al 1974, Longcope Cetal 1978, Matsumine H et al 1986). В отличие от мышечной и опухолевой

i канем присутствие ароматазы в циркулирующих лимфоцитах еще не доказано прямыми методами, поэтом)' конверсия андростендиона позволяет пока говорить только о боыожности присутствия ароматазы в них.

Методика

Ароматизация в опухолевой п мышечной тканях

Нами использовалась модификация методики, предложенной Tilson-Mallett N et al (1983). Образцы опухолевой и мышечной ткани массой 200-400 мг получали во время операции с согласия хирургов и морфологов и без ущерба для лечебно-диагностического процесса. Ткань замораживалась в жидком азоте и хранилась там до определения активности ароматазы. В день определения замороженная ткань перетиралась до порошкообразного состояния, гомогенизировалась в 1 мл 12.5 шМ калий-фосфатного буфера с 1 шМ ЭДТА, рН 7.5 в течении 10-20 секунд на гомогенизаторе РТ2. Гомогенат центрифугировали 15 мин при 1000g при +4°С, 200 мкл надосадочной жидкости брали на инкубацию с 1р-Н3-андростендионом, ещё 50 мкл надосадочной жидкости использовали для определения белка по Лоури (Lowry ОН et al 1951). В состав инкубационной смеси (500 мкл) входили: 12.5 пзМ калий-фосфатный буфер с 1 тМ ЭДТА, рН 7.5; 5тМ глюкозо-6-фосфат (Reanal, Венгрия), 0.5 шМ НАДФ (Reanal, Венгрия), 10 шМ 1,4-дитиотрейтол (Sigma, ФРГ). 10 U на 1 пробу глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Serva, ФРГ) и 1.6 мкл на 1 пробу 1Р-Н3-андростендиона (New England Nuclear 0.041 ^mol/ml, 24.1Ci/mmol). Смесь инкубировалась 2 часа при 37°С. Реакция останавливалась добавлением 5 объемов холодного хлороформа, смесь энергично встряхивалась -30 секунд, центрифугировалась 10 мин при 1000g при +4°С. Водная фаза смешивалась с равным объемом 5% суспензии активированного угля Norit A (Serva, ФРГ), энергично встряхивалась -30 секунд, после осаждения угля центрифугированием надосадочная жидкость поровну разливалась в две виалы со сцинтиллятором: по 0,5мл в 10мл диоксанового сцинтиллягора ( ЮОг нафталина, 7г ППО /2,5-дифенил-

оксазол/, О.Зг ПОПОП /п-бис[2-(5-фенилоксазоил)]бензол/. диоксан до 1 л). Счет велся на 1ритиепом канале счетчика Delta 300 фирмы Searle. Результат рассчитывался, исходя го среднего счета в двух виалах, выражался в фмоль/мг белка/час и округлялся до целых.

Конверсия андростендиона в лимфоцитах

Для определении конверсии андростендиона в лимфоцитах у больных кровь бралась за несколько дней до операции. Утром натощак в пробирку с гепарином (25 Ед/мл) бралось 15 мл крови. Лимфоциты выделяли методом Boyum (Хейфиц ЛБ и Абалакин ВА 1973), лизпровали в гипотоническом 5 гоМ растворе ТРИС-НС1, центрифугировали 15 мин при 0,25g при +4°С, брали на-досадочную жидкость, микросомальную фракцию осаждали ультрацентрифу-гнрованием при 30000g в течении 1 часа (ультрацентрифуга фирмы Beckman). Осадок ресуспендировали в 250 мкл 12.5 тМ калий-фосфатного буфера с 1 тМ ЭДТА, рН 7.5, брали 50 мкл на определение белка по Лоури (Lowry ОН et al 1951), затем проводили инкубацию с меченным апдростендионом и оценивали результат, как описано выше для опухолевой и мышечной тканей.

Иммуногистохимический метод

Поликлональные кроличьи антитела к человеческой плацентарной арома-тазе были получены от проф. Е. R. Simpson (USA, Southwestern University, Texas). Образцы ткани РМЖ брались из фиксированного формалином и заключенного в парафин архивного материала 2-3 летней давности. Окрашивание производилась РАР-методом с использованием реактивов DACO-corporation согласно рекомендациям фирмы (Bourne J А. 1983). На срезах плацента специфическая иммунореакция выявлялась в синцитиотрофобласте, где, как известно, ароматаза присутствует в значительном количестве. В контроле, где первичные антитела были опущены, окрашивание в синцитиотрофобласте отсутствовало.

В опухолевой ткани доля окрасившихся клеток и интенсивность окраски

виз\ально оценивалась по балльной шкале: or 0 до 4 баллов. Окраска оценивалась раздельно в различных типах клегок. Типы клеток (злокачественные клетки, неозлокачествленнын эпителий, фнбробласты, адипоциты. 1шфильтри-рукицие опухоль л1гмфоциты и макрофаги) идентифицировались по морфологическим критериям.

Оценка параметров, характеризующих опухоль и организм Клинико-морфологические данные Данные о диагнозе, стадии и TNM-классификации брались из историй болезни и амбулаторных поликлинических карт.

В группах, где оценивалась ароматизация в опухолевой ткани, пересматривались архивные стекла и давалось подробное гистологическое заключение. В части случаев производилась количественная оценка клеточности опухоли по модифицированной методике Simpson JF et al (1992).

В группе больных РМЖ, у которых активность ароматазы оценивалась биохимически, уголь-декстрановым методом определялось содержание эстро-генных и прогесгероновых рецепторов в опухолевой ткани.

Гормонально-метаболический статус Оценка гормонально-метаболического статуса включала характеристику репродуктивной системы и жиро-углеводного обмена. Репродуктивная система оценивалась по состоянию менструальной функции и - в части случаев - по уровням эстрадиола и тестостерона в крови. Жиро-углеводный обмен оценивался по уровням триглицеридов, р-липопротеидов, а-холестерина, общего холестерина и глюкозы в крови и по антропометрическим показателям (рост, вес, в части случаев - измерение окружности талии и бедер). По формулам Брока и Кегле оценивался избыток или дефицит веса тела.

Все гуморальные показатели определялись в сыворотке крови, взятой утром натощак. Уровень тестостерона и эстрадиола в крови оценивался радиоиммунным методом с использованием наборов фирм Белорис (Белоруссия) и

Farmos Diagnostics (Финляндия). Уровень метаболитов оценивался энзимо-колориметрическн с использованием наборов фирм Randox (Англия), Согтау (Польша), Копе (Финляндия).

Функциональное состояние лимфоцитов

При изучении конверсии андростенднона в лимфоцитах в части случаев она была сопоставлена со спонтанной и стимулированной ФГА реакцией бла-сттрансформации лимфоцитов.

В группе больных РМЖ при изучении конверсии андростенднона в лимфоцитах функциональное состояние иммунного ответа оценивалось также по характеру лимфоидной инфильтрации опухоли: визуально оценивалась е2 выраженность и локализация (по периферии или по всему объему опухоли).

Статистическая обработка результатов

При оценке ассоциаций между изучавшимися показателями статистическая обработка производилась на основе алгоритмов, описанных в монографии Е.В.Сидоренко (1996): сочетание критерия Колмогорова-Смирнова с угловым преобразованием Фишера. Этот подход является одним из наиболее чувствительных при использовании непараметрических критериев для поиска ассоциаций между переменными. Вычисления проводились с использованием программ Visual FoxPro 3.0а (Microsoft Corp., 1995) и Statistica for Windows (Release 4.3, StatSoft Inc., 1993).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Данная работа представляет собой попытку комплексного изучения экстрагонадной продукции эстрогенов в опухолевой, мышечной тканях и в лимфоцитах и сопоставления их с особешюстями гормонально-метаболического статуса организма у больных РМЖ. Основное внимание было уделено изучению опухолевой ткани. Оценка ароматизации в лимфоцитах и в мышечной ткани носила только предварительный характер: при изучении лимфоцитов - из-за ограничешш в трактовке результатов использованного метода, при изучении

мышечной ткани - из-за относительно малого числа наблюдений (подробно см. Материалы и Методы)

Ароматаза в опухолевой ткана Активность ароматазы в опухолевой ткани варьировала от 0 до 50 фмоль/мг белка/ч, её распределение было далеко от нормального, среднее и медиана равнялись, соответственно, 11 и 7 фмоль/мг белка/ч.

Принимая во внимание противоречивость литературных данных, а также возможную роль в этом методических причин и различного состава обследуемых групп, в данной работе ароматизация в опухолевой ткани изучалась двумя различными методами (биохимическим и иммуногистохимическим) на двух существенно отличавшихся выборках больных РМЖ.

Было продемонстрировано, что наблюдающиеся в литературе противоречия действительно могут быть обусловлены методическими причинами и отличиями в выборках больных РМЖ. Так, в частности, в рамках данной работы на двух разных выборках больных, в которых ароматизация в опухолевой ткани оценивалась двумя различными методами, выявились статистически значимые, но противоположные ассоциации с возрастом. В группе, в которой преобладали больные 1 и 2 стадий заболевания, и в которой ароматаза в опухолевой ткани оценивалась биохимическим методом, наблюдалось снижение активности ароматазы с возрастом. В группе же, в которой преобладали больные с более поздними стадиями заболевания и ароматаза в опухолевой ткани оценивалась иммуногистохимически, наоборот - наблюдалось усиление специфической окраски в опухолевых клетках у более пожилых больных.

Наблюдающееся расхождение может быть связано с тем, что интенсивность иммуногистохимического окрашивания оценивает количество ароматазы на клетку, а биохимический метод - её активность на мг белка тканевого гомогената. С другой стороны, не исключено, что существуют различные тенденции в динамике эстрогенообразования в опухолевой ткани, которые по разному проявляются в разных по клинико-морфологическим параметрам груп-

пах больных (обследованные нами двумя методами группы больных, как отмечалось, существенно различались по клиническим показателям).

Учитывая, что активность ароматазы в опухолевой ткани при РМЖ может служить маркером чувствительности к ингибиторам ароматазы (Bezwoda WR et al 1987, Miller WR and O'Neill JS 1987), полученные результаты, а также данные литературы, указывают на необходимость разработки более надежных критериев оценки локальной ароматизации при РМЖ. На сегодняшнем уровне развития проблемы для более надежной оценки ароматизации в ткани РМЖ можно рекомендовать сочетание нескольких методов, в частности, биохимического и иммуногистохимического.

Других противоречащих друг другу статистически значимых результатов в обследованных группах не выявлялось, и, соответственно, в дальнейшем обсуждаются преимущественно те закономерности, которые обнаруживались независимо от выбранного метода и группы.

Локальная ароматизация и клиническая характеристика опухоли При сопоставлении с клиническими показателями (стадия, размеры опухоли и наличие регионарных метастазов) по нашим данным в обеих изученных выборках выявлялась положительная ассоциация только между локальной ароматизацией и размерами опухоли (Рис.1).

В литературе уже имелось сообщение о положительной связи между локальной ароматизацией и размерами опухоли (Bolufer Р et al 1992). Учитывая, что в настоящей работе положительная связь выявлялась двумя различными методами, и что работа Bolufer P. et al 1992 выполнена на весьма большом числе наблюдений (225 случаев), мы считаем, что обсуждаемая связь не артефакт и не случайность, а отражает важную роль локальной ароматизации в развитии опухоли у части больных РМЖ. В литературе есть сообщения о повышении пролиферации в опухолях с повышенной активностью ароматазы (Reed MJ 1991, Lu Q et al 1996). Это позволяет предположить, что связь между

локальной ароматизацией и размерами огплоли объясняется эстроген-опосредоиамнон стимуляцией роста в опухолях с высокой активностью арома-тазы.

А Размеры опухоли и активность ароматазы Биохимический метод (0.01<р<0.05)

й £

(VI <0

У- т

2? го

2 ^

2 с

о. а»

га ю

■о Ь

Й -I

* I

со о

£ в-

< ^

>7 (п=24)

■7 (п=26)

0% 20% 40% 60% 80% 100% % случаев

Б, Размеры опухоли и интенсивность специфической окраски злокачественных клеток на ароматазу. Иммуногистохимический метод (0.01<р<0.05)

а* >2.5 (п=11) Б 5

0 с

1 П!

ш ю

г: '—■ о <:

х ьг :

<¡3 о го

^ о <=2.5 (п=12)

■ВМЯВ' - ВИв а „ ..С .

-- □ опухоль Iопухоль>5 см

ПН!

--1-1-1-1-1

0%

20%

40% 60% % случаев

80%

100%

Рис.1 Ароматаза в опухолевой ткани РМЖ и размеры опухоли

Локальная ароматизация и гормонально-метаболическое окружение Одним го основных результатов данной работы является подтверждение зависимости локальной ароматизации в ткани РМЖ от гормонально-метаболического окружения опухоли. В известной нам литературе изучение данного вопроса ограничивалось сопоставлением локальной ароматизации с сохранностью менструальной функции. В данной работе локальная ароматизация впервые сопоставлялась с уровнем половых гормонов в крови и с показателями жиро-углеводного обмена.

Локальная ароматизация и репродуктивная система В данной работе впервые была обнаружена положительная ассоциация между ароматизацией в ткани РМЖ и уровнем тестостерона в крови. По нашим данным, эта связь прослеживалась в двух отличающихся группах, исследованных различными методами, что привлекает к данному результату серьезное внимание.

В литературе уже отмечалось, что андрогены могут стимулировать пролиферацию клеток рака молочной железы, и что этот эффект опосредуется локальной ароматизацией (Dowsett et al 1996). Андрогены при этом обычно рассматривались только в качестве субстрата для ароматазы. Наши данные позволяют предполагать, что тестостерон способен, кроме того, индуцировать усиление синтеза ароматазы в ткани РМЖ: иммуногистохимический метод показал увеличение количества ароматазы у больных с более высоким уровнем тестостерона крови, это подтверждалось и увеличением ароматазной активности, определенной биохимическим методом. Предположение об усилении синтеза ароматазы в опухолевой ткани под влиянием тестостерона согласуется с литературными данными об аналогичном влиянии тестостерона на синтез ароматазы в яичниках (Fitzpatrick SL and Richards JS 1991) и о стимуляции ароматазной активности андрогенами в клетках мозга (Roselli СЕ 1991). Схема, обобщающая возможные связи андрогенов с ароматизацией в ткани РМЖ, представлена на Рис.2.

Андроген

Стимулятор синтеза

5и-редуктазная реакция \

Субстрат Ингибитор ___1_активности

Ароматаза

Цитоплазма

Эстроген

Рис. 2 Андрогены и локальная ароматизация в ткани РМЖ

Необходимо особо отметить, что возможная индукция синтеза ароматазы тестостероном не противореча литературным данным о нпгибировашш различными производными андрогенов её активности в клетках РМЖ (Perel Е et al 1988, Coombes RC and Dowsett M /eds/ 1991). Речь идет о разных процессах; с одной стороны некоторые андрогены могут угнетать активность ароматазы, а с другой - андрогены, возможно, способны индуцировать её синтез. Подобная ситуация описана, например, в отношении амнноглютетимида, который одновременно является и ингибитором ароматазы и индуктором её синтеза (Miller WR 1996).

Локальная ароматизация и показатели жиро-угже,одного обмена При сопоставлении ароматизации в ткани РМЖ с показателями жиро-углеводного обмена единственной ассоциацией, выявлявшейся в обеих исследованных группах была отрицательная связь с уровнем общего холестерина крепи. Одновременно была выявлена обратно пропорциональная связь активности ароматазы. определявшейся биохимическим методом, с уровнем Р-липопротендов крови, весом тела и индексом Кетле. Однако, в связи с тем, что по данным иммуногнстохимического метода накопление ароматазы в опухоли

позитивно коррел1гровапо с концентрацией триглицеридов в крови, вероятно можно предположить, что синтез ароматазы в ткани РМЖ более липидо- и инсулинозавискм. чем регуляция её активности.

Клеточная локализация продукции эстрогенов в опухолевой ткани Как уже упоминалось во вступлении, этот вопрос стал изучаться только в последние годы. По результатам, представленным в настоящей работе и в работах Esteban JM et al (1992) и Lu Q et al (1996), ароматаза обнаруживалась преимущественно в злокачественных клетках. В тоже время, другие авторы находили, что, несмотря на присутствие ароматазы в хтокачественных клетках, ведущая роль в локальной ароматизации принадлежит стромальным клеткам (Santen RJ et al 1994, Sasano H et al 1994).

Мы видим несколько возможных объяснений этому противоречию. Во-первых, можно отметить, что специфическое окрашивание было более выражено в стромальных клетках и менее выражено в злокачественных клетках в тех работах, где антитела были получены от д-ра Н.Харада с соавт. (Santen RJ et al 1994, Sasano H et al 1994). В работах же, где антитела были получены от д-ра Е.Симпсона с соавт. (Lu Q et al 1996 и наше исследование) или от д-ра П.Холла с соавт. (Esteban JM et al 1992), преимущественное окрашивание наблюдалось в опухолевых клетках. Таким образом, различия в результатах могут объясняться разными использованными антителами.

Во-вторых, необходимо отметить что, несмотря на различия в выводах, первичные данные в некоторых работах различались не столь существенно. Авторы, обнаружившие ароматазу преимущественно в веретенообразных фиб-робластах, не отрицают ее присутствия и в опухолевых клетках. Например, в работе Santen RJ et al (1994) вывод о преимущественной локализации ароматазы в фибробластах в основном базировался на преобладании чиста окрасившихся фибробластов по сравнению со злокачественными клетками, в то же время интенсивность окрашивания злокачественных клеток не уступала

стромапьным клеткам. Так как в опухолях молочной железы площадь цитоплазмы фибробластов значительно меньше, чем у злокачественных клеток, то при таком подходе относительная роль фибробластов могла оказаться завышена. Необходимо подчеркнуть, что и наши данные не отрицают присутствия ароматазы в других типах клеток, а только говорят о преимущественной локализации ароматазы в злокачественных клетках.

Локализация ароматазы в злокачественных клетках, по нашим данным, косвенно подтверждается и в группе, где результаты были получены биохимическим методом. В этой группе наблюдались: позитивная ассоциация между ароматизацией и клеточностью опухолей, большая активность ароматазы в опухолях с преобладанием паренхимы над стромой и её большая активность в опухолях с более выраженным внутрипротоковым компонентом. Положительная корреляция активности ароматазы, определенной биохимически в гомоге-нате опухоли, с клеточностью опухоли уже была описана в литературе группой Miller WRet al (1991).

Кроме иммуногистохимичских исследований и корреляций с клеточностью опухоли, имеется работа, в которой присутствие ароматазы в опухолевых клетках подтверждается методом гибридизации in situ (Lu Q et al 1996). Помимо этого, есть немало работ на клеточных линиях РМЖ, подтверждающих присутствие ароматазы в опухолевых клетках (Kitawaki J et al 1992, Calaf G et al 1992).

Таким образом, несмотря на существование и иного мнения (Santen RJ et al 1994, Sasano H et al 1994), опираясь на собственные данные и на наблюдения других групп исследователей (Esteban JM et al 1992, Lu Q et al 1996), мы склоняемся к тому, что ароматаза в опухолевой ткани РМЖ локализуется в разных типах клеток, но преимущественно - в злокачественных клетках.

Завершая обсуждение собственных результатов, касающихся локальной ароматизации в ткани РМЖ, можно подытожить, что при оценке ароматизации

-17в ткани РМЖ для получения более надежного результата сегодня необходимо сочетание нескольких методов оценки этого процесса. Обнаружившаяся в данной работе связь ароматизации с размерами опухоли подтверждает важность локального синтеза эстрогенов для роста РМЖ. Впервые обнаруженная ассоциация с уровнем тестостерона в крови подтверждает, что синтез эстрогенов в ткани РМЖ не полностью автономен, а, по крайней мере частично, зависит от гормонально-метаболического окружения. Как прямо (иммуногистохимически), так и косвенно (при помощи сопоставления активности ароматазы с клеточностью опухоли) наши данные подтверждают, что ароматаза в ткани РМЖ локализуется преимущественно в злокачественных клетках.

Ароматизация в мышечной ткани н конверсия андростендиона в лимфоцитах

В данной работе ароматизация в мышечной ткани и конверсия андростендиона в лимфоцитах изучались, по ряду причин, менее подробно, чем в опухолевой ткани. При изучении мышечной ткани и лимфоцитов, в отличие от опухолевой ткани, использовался только биохимический метод.

По данным литературы, нам известны только две работы, посвященные синтезу эстрогенов в мышечной ткани (не у онкологических больных), в которых была убедительно продемонстрирована ароматизация в данной ткани, но не проводилось дальнейшего изучения этого процесса. Нам известны, также, лишь отдельные сообщения о возможности синтеза эстрогенов в лимфоидных клетках.

Ароматизация в мышечной ткани

При оценке ароматизации в мышечной ткани на данном этапе работа мы ограничились сравнительно небольшим числом наблюдений (16 больных РМЖ и И человек в группе сравнения), и сопоставляли её только с состоянием менструальной функщш и с уровнем эстрогенов крови. Нами не наблюдалось достоверных отличий активности ароматазы в мышцах у больных РМЖ и у

Гюльных. оперированных по др\тм поводам (преимущественно - травмаюло-шческнх больных). Лк11шнос1ь аромагсиы и мышечной ткани варьировала 01 О до 13 фмодь/мг белка в час. её распределение и 1,1 л о дхчеко ог нормального, среднее и медиана равнялись, соответственно 2 и 1 ф.молы'мг белка в час. Активность ароматазы в мышечной ткани, что было показано впервые, оказалась существенно ниже, чем в опухолевой ткани РМЖ (Рис. 3).

Также впервые было обнаружено усиление ароматизации в мышечной ткани с наступлением менопаузы, которое подтверждалось соответствующей отрицательной ассоциацией с эстрадиолом и положительной ассоциацией с возрастом (в объединенной группе, куда входили и женщины с сохраненной менструальной функцией, и женщины, находившиеся в менопаузе). Этот результат хорошо согласуется с известными данными об усилении с возрастом суммарной экстрагонадной ароматизации.

Таким образом, полученные результаты подтверждают способность мышечной ткани к синтезу эстрогенов, впервые демонстрируют усиление этого процесса в менопаузе и требуют дальнейшего набора материала и продолжения работ в данном направлении.

Е

3 +1

I ?

8.®

га £ л аз

СО X

Е с

£ о < 5

-е-

14 12 10 8 6 4 2 0

р<0.01

□ Мышца □ Опухоль

Рис. 3. Активность ароматазы в мышечной ткани и ткани РМЖ

Конверсия андростендиона в лимфоцитах

Активность конверсии андростендиона в лимфоцитах варьировала от 2 до 38 фмоль/мг белка в час (у больных РМЖ: от 2 до 38, у здоровых: от 3 до 38), её распределение было далеко от нормального, среднее и медиана равнялись, соответственно 13 и 10 фмоль/мг белка в час (у больных: 13 и 10, у здоровых: 12 и 11 фмоль/мг белка в час). Наблюдавшаяся в данной работе интенсивность конверсии андростендиона в лимфоцитах превосходила активность ароматазы в опухолевой или мышечной тканях. Однако, такое сопоставление не совсем корректно в силу методических причин: лимфоциты представляют собой взвесь клеток в жидкой среде, и при работе с ними методика выделения фракции, содержащей микросомы, отличалась от методики, применявшейся для опухолевой и мышечной тканей (см Материалы и методы). Так как результаты выражались в пересчете на количество белка этой фракции, то прямое сравнение полученных величин может отражать не различия в конверсии андро генов, а различия в доле мгасросомалыюго белка во фракциях, полученных по разной методике.

Наиболее важным фактом, выявившимся в данной работе при изучении конверсии андростендиона в лимфоцитах, мы считаем усиление этого процесса у больных РМЖ в менопаузе по сравнению со здоровыми женщинами (рис.4), а также усиление этого процесса у больных РМЖ на более поздних стадиях заболевания по сравнению с более ранними стадиями. Это позволяет предполагать, что в определенных условиях (например - в менопаузе) наличие опухоли в организме и её прогрессирование способно стимулировать конверсию андростендиона в лимфоцитах. Необходимо отметить, что нами исследовались лимфоциты периферической крови. Возможно, что опухоль оказывает ещё большее влияние на лимфоциты, непосредственно инфильтрирующие её ткань.

_ 18 16

о

г- га

1 5

О го г-

<и с т ал х Ю

О 1_ •О

с: о 5 ■8-

14 -12 10

4 -2 --

РМЖ Здоровые

Репродуктивный период

РМЖ Здоровые Менопауза

6

Рис. 4 Конверсия андростендиона в лимфоцитах и репродуктивный статус у больных РМЖ и здоровых женщин

Важной представляется отрицательная связь, выявившаяся между конверсией андростендиона и показателями иммунного ответа. Эта связь выражалась в отрицательной ассоциации со спонтанной реакцией бластгрансформащш лимфоцитов (1'БТ) и с индексом РБТ(ФГА)/РБТ(спонт.), а также в специфической ассоциации с локализацией лнмфоидной инфильтрации опухоли: при высоких значениях конверсии андростендиона в лимфоцитах лимфоидная инфильтрация чаще распределялась по всему объему опухоли, а при шпик -локализовалась по её периферии. Имеются работы, в которых показано, что формирование лимфоидного вата по периферии опухоли служит признаком полноценного иммунного ответа и ассоциируется с более благоприятным прогнозом при РМЖ (Семиглазов ВФ 1970). Возможная отрицательная связь

между конверсией андростенднона в лимфоцитах и иммунной функцией лимфоцитов привлекает интерес к этой реакции и вне прямой связи с изучением рака молочной железы.

При сопоставлетш с гормонально-метаболическим фоном как в группе больных РМЖ, так и у здоровых доноров наблюдалось выраженная зависимость конверсии андростенднона в лимфоцитах от состояния репродуктивной системы. Выявлялось снижение конверсии андростенднона в менопаузе (рис.4). Это снижение было значительно менее выражено у больных РМЖ, что приводило к уже упомянутым статистически значимым отличиям в уровне конверсии между здоровыми и больными РМЖ. Снижение конверсии в менопаузе подтверждалось отрицательной ассоциацией с возрастом и положительной ассоциацией с эстрогенами крови. Выявлялась также отрицательная связь с уровнем тестостерона в крови. Ассоциации с показателями жиро-углеводного обмена были выражены в меньшей степени.

Таким образом, при изучении конверсии андростенднона в циркулирующих лимфоцитах, нами была косвенно подтверждена возможность присутствия ароматазы в этих клетках, было показано, что в менопаузе конверсия андростенднона выше у больных РМЖ по сравнению со здоровыми женщинами, что она зависит от состояния репродуктивного гомеостата и ассоциируется со снижением иммунной функции лимфоцитов. Для окончательного подтверждения или отрицания присутствия ароматазы в лимфоцитах периферической крови человека требуются дальнейшие исследования с использованием других биохимических и молекулярно-генетических методов.

Завершая обсуждение полученных результатов, можно заключить, что данная работа была посвящена изучению экстрагонадных источников эстрогенов у больных РМЖ. Изучался синтез эстрогенов в самой опухолевой ткани и в тканях, недостаточно изученных в литературе : в мышечной и лимфоидной. Была подтверждена важная роль локальной ароматтоащш в ткшш РМЖ для

развития опухоли. Получены новые данные, касающиеся синтеза эстрогенов в ткани РМЖ, их продукции в мышечной ткани и конверсии андростендиона в лимфоцитах у больных РМЖ. Полученные данные могут иметь отношение как к исследованию этиопатогенеза, так и к подбору рациональной гормонотерапии у части больных с опухолями данной локализации.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При оценке ароматизации в ткани рака молочной железы (РМЖ) для получения более надежного и клинически значимого результата необходимо сочетание нескольких методов оценки этого процесса.

2. Полученные данные о локальном синтезе эстрогенов в ткани РМЖ и о различных путях экстрагонадной конверсии андростендиона при РМЖ в дальнейшем могут использоваться при разработке новых подходов к гормонотерапии, оценке течения и прогноза у больных РМЖ.

ВЫВОДЫ

1. Ароматаза в ткани РМЖ локализуется преимущественно в злокачественных клетках.

2. Синтез эстрогенов в ткани РМЖ не автономен, а зависит от гормонально-метаболического окружения, в частности - усиливается при повышении уровня тестостерона в крови.

3. Локальный синтез эстрогенов в опухолевой ткани РМЖ позитивно коррелирует с размерами опухоли, что подтверждает значимость данного процесса для клинического течения РМЖ

4. Ароматаза присутствует в мышечной ткани больных РМЖ, но её активность в этой ткани значительно ниже активности в опухоли. Активность ароматизации в мышечной ткани усиливается с возрастом и в менопаузе.

-235. В лимфоцитах больных РМЖ и здоровых лиц происходит конверсия андростендиона. сопровождающаяся отщеплением водорода в lß положении, что косвенно подтверждает возможность присутствия ароматазы в этих клетках.

6. Активность конверсии андростендиона в лимфоцитах тесно связана с состоянием репродуктивной системы: она снижается в менопаузе, причем у больных РМЖ это снижение выражено в меньшей степени, чем у здоровых женщин. Наблюдается положительная ассоциация конверсии андростендиона в лимфоцитах с уровнем эстрадиола и отрицательная - с уровнем тестостерона в крови.

7. Усиление конверсии андростендиона в лимфоцитах ассоциировано со снижением показателей иммунного ответа у больных РМЖ.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМУ- ТТИГГКРТЛТПт

Статьи

1. Берштейн JIM., Ларионов АА., Крюкова ОХ. - Конверсия андростендиона в лимфоцитах периферической крови людей - Бюлл.эксп.биол.мед., 1994, №5, сгр.517-519

2. Берштейн Л.М., Ларионов A.A., Кыштообаева А.Ш., Пожарисский K.M., Семиглазов В.Ф. - Активность ароматазы в ткани рака молочной железы: роль клеточного субстрата - Бюлл.эксп.биол.мед., 1995, №10, стр.410-413

3. Берштейн Л.М., Ларионов A.A., Крюкова О.Г., Кочнев В А., Семиглазов В.Ф. - Исследование ароматазной активности в мышечной ткани человека -Вопр.мед.химии, 1996, т42, №1, стр.76-82

4. Berstein L.M., Larionov A.A., Kyshtoobaeva A.Sh., Pozharisski K.M., Semiglazov V.F., Ivanova O.A. - Aromatase in breast cancer tissue - localization and relationship with reproductive status of patients - J Cancer Res Clin Oncol, 1996, vl22,№8, pp495-498

Тезисы

1. Берштенн JI.M., Ларионов А.А., Крюкова О.Г., Порошина Т.Е., Семигла-зов В.Ф. - Конверсия андростендиона в циркулирующих лимфоцитах у больных раком молочной железы - Актуальные проблемы профилактики и лечения рака молочной железы (9-10 июня 1993), Орел, Тез. симп., 1993, стр.13-15

2. Ларионов А.А., Иванова О.А., Кыштообаева А.Ш., Берштейн Л.М. - Чувствительность ароматазы к влиянию её ингибиторов в ткани опухолей молочных желез - Актуальные проблемы профилактики и лечения рака молочной железы (9-10 июня 1993), Орел, Тезлимп., 1993, слр.64-65

3. Berstein L.M., Larionov АЛ^ Krjukova O.G., Semiglazov V.F. - Conversion of androstendione in blood lymphocytes of breast carcinoma patients - 184th Meeting of the Society for Endocrinology (24-26 Nov 1993), London, J. of Endocrinology, 1993, v 139, Suppl, P.17

4. Ларионов A.A., Кыштообаева AJIL - Усиление синтеза эстрогенов в ткани рака молочной железы в менопаузе - П Нацюнальний конгрес молодих вчених-медшав YKpaimi (18-19 мая 1994), Кшв, Тези доповщей, 1994, стр.37-38

5. Berstein L., Larionov Au, Kyshtoobaeva A., Pozharisski К., Semiglazov V. -The role of cellular substrate in aromatase activity of breast cancer tissue -1st Baltic Congress of Oncology and Radiology (12-15 Oct 1994), Tallinn, 1994, Abstract book: A 54

6. Berstein L.M., Larionov A.A., Kijukova O.G.,Tsyrlina E.V., Gamajunova V.B., Rekhocheva I.P., Rykov JUA - Aromatase activity in muscle tissue of women: role of age, menopausal status and body composition - Ageing in a Changing Europe, the 111 European Congress of Gerontology (30 Aug -1 Sept 1995), Amsterdam, 1995, Abstract 087.0079

Приношу свою искретпою благодарность научному руководителю д.м.н. Л.М.Керштейну за постоянное внимание при выполнении данной работы, научному консультанту проф. В.Ф.Семиглазову за ценные советы и помощь в организации набора материала, проф. К.М.Пожарисскому, к.м.н. Л.Ш.Кыштообаевой и д-ру А.В.Упорову за помощь в морфологическом анализе материала, всем коллегам по лаборатории эндокринологии за дружескую поддержку и помощь в оценке гормонально-метаболических показателей.

Помимо государственного финансирования в 1996-97 годах выполнение дашюй работы было поддержано стипендией Фонда Сороса (программа "Соросовские аспиранты", фанты а96-1129 и а97-1535).