Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Белки семейства NF-kB в опухолях больных раком молочной железы

На правах рукописи

ПЛАТОВА АЛЕВТИНА МИХАЙЛОВНА

БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА ОТ-кВ В ОПУХОЛЯХ БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ: КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ КОРРЕЛЯЦИИ

14.01.12- онкология Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2012

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Министерства здравоохранения и социального развития России

Ректор: Заслуженный врач, доктор медицинских наук, профессор

О.О. Янушевич

Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук

Директор: академик РАН и РАМН, профессор

Научные руководители

доктор медицинских наук, профессор

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Петерсон Сергей Борисович

М.И. Давыдов

Летягин Виктор Павлович Кушлинский Николай Евгеньевич

Кадагидзе Заира Григорьевна

Ведущее учреждение:

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедры онкологии ГБОУ ВПО Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России

доктор медицинских наук, профессор, руководитель централизованного клинико-лабораторного отдела ФГБУ«РОНЦ имени Н.Н. Блохина» РАМН

ФГБУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Минздравсоцразвития России.

Защита диссертации состоится НО^^Ъ^- 2012

диссертационного совета (Д001.017.02) при ФГБУ «РОНИ

года в ,

часов на заседании

диссертационного совета (Д001. Москва, Каширское шоссе, 23)

«РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН (115478,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук.(115478, Москва, Каширское шоссе, 24)

Автореферат разослан « О ок^^л _2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор І і ^ Барсуков Юрий Андреевич

I " БИБЛИОТЕКА I

I 2012_| 3

Актуальность темы

Заболеваемость раком молочной железы (РМЖ) в последнее время неуклонно растет: за период с 2004 по 2009 гг. прирост стандартизованных показателей по России составил 10,3% (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2009). Наряду с этим повышается осведомленность женского населения о необходимости самообследования и диспансеризации, происходит усовершенствование диагностического оборудования, разрабатываются оптимальные алгоритмы диагностики и лечения (Давыдов М.И., Летягин В.П., 2007; Чиссов В.И., Давыдов М.И., 2008; Aebi S. et al., 2010).

Благодаря появлению новых препаратов направленного действия, в последнее время усиливается роль исследования молекулярно-биологических маркеров для определения тактики лекарственной терапии и прогноза течения РМЖ (Тупицын Н.Н. и соавт., 2001; Георгиев Г.П., 2004; Герштейн Е.С. и соавт., 2008; Имянитов Е.Н., 2008; Мирошниченко И.И. и соавт., 2009; Sleifer S. Et al., 2008; O'Shaughness J. et al., 2009; Tutt A. et al., 2009).

В последние годы пристальное внимание исследователей привлекает ядерный транскрипционный фактор NF-каппа В (NF-кВ), который играет важную роль в клеточной пролиферации, апоптозе, воспалительной и аутоиммунной реакциях, поскольку он регулирует экспрессию генов, вовлеченных в эти процессы (Герштейн Е.С. и соавт., 2009; Biswas D.K., Iglehart J.D., 2006). Идентифицировано пять белков семейства NF-кВ, содержащих общий ДНК-связывающий домен: NF-kB1 (р50/р105), NF-kB2 (р52/р100), RelA (р65), RelB и c-Rel (Haffiier М.С. et al., 2006; Kim H.J. et al., 2006). Основной формой существования этих белков в большинстве типов клеток является гетеродимер p50/RelA(p65). Активность NF-кВ регулируется посредством их взаимодействия с ингибиторными белками 1кВ (Kim H.J. et al., 2006]. В большинстве покоящихся клеток NF-кВ неактивен и находится в цитоплазме в комплексе с одним из ингибиторов. При поступлении в клетку регуляторного стимула сигнальный каскад NF-кВ активируется, происходит

фосфорилирование, а затем полная деградация ингибиторного белка, и свободный активный NF-кВ поступает в ядро.

Регуляция NF-кВ сигнального каскада нарушена во многих опухолях человека, в том числе и при РМЖ. В большинстве опухолевых клеток NF-kB постоянно активирован и находится в ядре. Эта активация не только защищает клетки от апоптоза, но также увеличивает их пролиферативную активность. Установлено, что NF-кВ играет важную роль в этиологии, патогенезе и прогрессии РМЖ (Cao Y. et al., 2003; Huber М.А. et al., 2004; Biswas D.K. et al., 2004). Особенно велико значение этого фактора в опухолях, отрицательных по рецепторам эстрогенов, но имеющих рецепторы эпидермапьного фактора роста или Her-2/neu (Biswas D.K. et al., 2006; Van Laere S.J. et al., 200).

В последние годы показано, что гиперактивация NF-kB является одной из причин резистентности РМЖ к антиэстрогенам (Ю.С.Лобанова и соавт., 2007; Pratt М.А. et al., 2003; DeGraffenried L.A. et al., 2004; Zhou Y. et al., 2007), химиопрепаратам (Weldon C.B. et al., 2001; Hernandez-Vargas H. et al., 2007), лучевой терапии (Ahmed К.M. et al., 2007).

Предполагается, что создание противоопухолевых агентов, блокирующих NF-кВ сигнальный путь, позволит повысить чувствительность клеток к существующим видам терапии, а также может иметь самостоятельное терапевтическое значение (Wu J.T. et al., 2005; Ahmed K.M. et al., 2007).

В то же время, большинство доказательств определяющего значения NF-кВ сигнального каскада при РМЖ получено в экспериментальных системах, а данные об экспрессии этого фактора в опухолях человека, полученные на клиническом материале, лишь единичны (Liu С. et al., 2007; Van Laere S.J. et al., 2007) и требуют дальнейшего подтверждения.

Цель исследования

Изучить особенности и соотношение экспрессии и ДНК-связывающей активности р65 и р50 субъединиц ядерного транскрипционного фактора NF-кВ в различных клинико-морфологических подгруппах больных раком молочной железы.

Задачи исследования

1. Иммуноферментными методами определить концентрацию ЫР-кВр65, а также ДНК-связывающую активность ОТ-кВр65 и ОТ-кВр50 в опухолях и прилежащих гистологически неизмененных тканях больных раком молочной железы.

2. Сопоставить уровни и соотношение исследуемых показателей в опухолях и прилежащих гистологически неизмененных тканях молочной железы.

3. Проанализировать взаимосвязь содержания и ДНК-связывающей активности субъединиц ОТ-кВ с клиническими (стадия заболевания, размер опухоли, статус лимфатических узлов, возраст и менопаузный статус больных) и морфологическими характеристиками больных раком молочной железы.

4. Сопоставить содержание и ДНК-связывающую активность субъединиц ОТ-кВ в опухолях с их рецепторным статусом и экспрессией НЕЯ2/пеи.

Научная новизна исследования Впервые на клиническом материале исследовано количественными иммуноферментными методами содержание и ДНК связывающая активность ключевых субъединиц ядерного транскрипционного фактора ОТ-кВ, а также соотношение их уровней в опухолях и гистологически неизмененной ткани больных раком молочной железы различных стадий и изучена взаимосвязь этих показателей с основными клинико-морфологическими особенностями опухолей, их рецепторным и Нег-2/пеи статусом. Обнаружено, что более чем в 90% опухолей больных РМЖ происходит координированное увеличение ДНК-связывающей активности р65 и р50 субъединиц ядерного транскрипционного фактора ЫБ-кВ по сравнению с окружающей гистологически неизмененной тканью молочной железы, а также содержания белка ЫР-кВр65, при этом изменения более выражены у больных с неблагоприятными клинико-морфологическими показателями.

Впервые показано, что уровни белка №-кВр65 достоверно выше в опухолях, отрицательных порецепторам эстрогенов (РЭ) по сравнению с РЭ-положительными опухолями молочной железы и не зависели от экспрессии РП. При этом показатели ДНК-связывающей активности №-кВр65 в РМЖ не зависели от рецепторного статуса опухоли. Достоверно более высокие показатели ЫР-кВр65 обнаружены в опухолях, экспрессирующих Нег-2/пеи, тогда как ДНК-связывающая активность р65 не зависела от наличия этого рецептора в РМЖ.

Практическая значимость исследования

Значительное и практически универсальное увеличение ДНК - связывающей активности и содержания ключевых субъединиц ядерного транскрипционного фактора №-кВ в ткани РМЖ по сравнению с окружающей неизмененной молочной железой, свидетельствует о том, что при дальнейшем наблюдении за обследованными больными, данные биомаркеры могут приобрести значение в качестве независимых прогностических факторов, определяющих как течение заболевания в целом, так и его чувствительность к отдельным видам лечения. В частности, удельная ДНК-связывающая активность №-кВр65 оказалась наиболее высокой в опухолях с прогностически неблагоприятным «тройным отрицательным» рецепторным фенотипом, в связи с чем именно подгруппа больных РМЖ с такими опухолями может получить преимущество от использования селективных ингибиторов ОТ-кВ.

Апробация диссертации

Материалы диссертации доложены на совместной научной конференции с участием кафедр онкологии: Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Первого Московского государственного медицинского университета имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации,

Московского государственного медико-стоматологического университета, клинической биохимии и лабораторной диагностики ФПДО Московского государственного медико-стоматологического университета, хирургических отделений: опухолей молочных желез, диагностики опухолей, опухолей женской репродуктивной системы, реконструктивной и сосудистой хирургиий, отделения патологической анатомии опухолей человека ФГБУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, лабораторий: клинико-диагностической, клинической биохимии, клинической иммунологии опухолей централизованного клинико-лабораторного отдела 15 декабря 2011 года.

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 7 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, включает введение, обзор данных литературы, главы «Материалы и методы исследования» и «Результаты собственных наблюдений», обсуждение полученных данных, выводы, список цитируемой литературы, который состоит из 66 работ отечественных и 121 работы зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 30 таблицами, 25 рисунками.

Материалы и методы исследования

В исследование включено 120 больных РМЖ в различных стадиях опухолевого процесса, проходивших обследование и лечение в хирургическом отделении опухолей молочных желез ФГБУ НИИ клинической онкологии Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН в период с ноября 2008 г. по март 2010 г.

Стандартный объем предоперационного обследования у больных раком молочной железы включал маммографию обеих молочных желез в двух проекциях, рентгенографию легких, ультразвуковое исследование органов малого таза и печени, подмышечных, надключичных и подключичных лимфатических(регионарных) узлов, радиоизотопное исследование костей скелета.

Обследованные больные раком молочной железы были в возрасте от 23 по 77 лет, средний возраст обследованных пациенток составил 53,2+1,0 лет, медиана равнялась 54 годам (рис. 1).

50 45 40 35

1 зо

2 25

0

1 *

у

15 10 5 О

Рис. 1. Распределение больных РМЖ по возрасту.

При этом, у 37 (30,8%) больных РМЖ менструальная функция была сохранена, 18 (15,0%) пациенток находились в пременопаузе и 65 (54,2%) - в постменопаузе (табл. 1).

Больные РМЖ

K-S d=,06290, р> .20; Lilliefors р> .20 -Expected Normal

...........................................".....................7

ШР

ш ' т

10 20 30 40 50 60 70 80

возраст, лет

Таблица 1

Распределение больных РМЖ по стадиям заболевания и состоянию репродуктивной функции

Стад ия Частота Абс./(Отн.) Возраст, годы (М±ш) Менструальная функция

Сохранена Премено пауза Постмено пауза

I 20 (16,7%) 53,0±2,5 8 (40,0%) 1 (5,0%) 11 (55,0%)

НА 37 (30,8%) 53,8±1,9 10 (27,0%) 5 (13,5%) 22 (59,5%)

ПВ 29 (23,3%) 52,1±2,3 10(34,5%) 3 (10,3%) 16 (55,2%)

ША 20(16,7%) 54,5±2,1 6 (30,0%) 5 (25,0%) 9 (45,0%)

ШВ 8 (6,6%) 58,9±3,6 1 (14,3%) - 6 (85,7%)

ШС 6 (5,0%) 44,7±4,6 2 (33,3%) 3 (50,0%) 1 (16,7%)

Больные распределялись по стадиям заболевания следующим образом: ПА - 37, ПВ - 28, по 20 больных I и IIIА стадии, и у 14 больных был распространенный процесс ШВ - ШС стадии.

Основным гистологическим вариантом рака молочной железы был ин-фильтративный протоковый рак - 95 наблюдений, в 14 случаях - дольковый инфильтративный рак, прочие формы рака молочной железы фиксировались значительно реже - 11 случаев (табл. 2).

Преобладали пациентки со 2 степенью злокачественности РМЖ 70,8%, (85 из 120), 1 степень злокачественности опухоли выявлена в 23,3% (28 из 120), только у 5,8% (7 из 120) пациенток обнаружена 3 степень злокачественности РМЖ (табл. 2).

Таблица 2

Распределение больных РМЖ по степени злокачественности опухоли

Степень злокачественности РМЖ Частота выявления Абс./Отн. Гистологический вариант (частота)

ИДР* ИПР** Прочие

1 степень злокачественности 7/5,8% 1/14,3% 4/57,1% 2/28,6%

2 степень злокачественности 85/70,8% 13/15,3% 66/77,7% 6/7,1%

3 степень злокачественности 28/23,3% 1/3,6% 25/89,3% 2/7,1%

Примечание: ИДР* - инфильтративно-дольковый РМЖ; ИПР** -инфильтративно-протоковый РМЖ.

В процессе исследования удалось определить суммарное содержание и ДНК-связывающую активность р65 субъединицы NF-кВ в тканях 119 и 99 больных, соответственно. У 43 больных была измерена также ДНК-связывающая активность р50 субъединицы. Таким образом, размер и состав обследованной группы позволяли провести достаточно детальный и статистически значимый анализ.

Особый интерес представляло определение NF-KBp65 или NF-KBp50 с помощью оригинальных иммуноферментных систем серии «TransAM™» (Active Motif, США), в которых на плашки для первоначальной экстракции определяемого белка из клеточного лизата нанесены не специфические антитела, а олигонуклеотид, содержащий консесусную последовательность 5'-GGGACTTTCC-3', специфичную для ядерного связывания всех субъединиц NF-кВ. После этого проводили стандартное прямое иммуноферментное определение количества связавшегося белка с использованием специфических антител к р65 или р50, соответственно. Результаты этих определений, рассчитанные в условных единицах в пересчете на 1 мг клеточного белка, мы обозначили как «ДНК-связывающую активность» NF-кВ, в отличие от суммарного содержания NF-icBp65, оцененного классическим ELISA тестом.

Результаты и обсуждение

На первом этапе анализа оценили соотношение уровня исследованных маркеров в опухолях и гистологически неизмененных тканях молочной железы (табл. 1) и их возможные взаимосвязи между собой. Измеримые количества общего белка №-кВр65 были обнаружены в 118 образцах опухолей (99%) и в 96 образцах (81%) гистологически неизмененной ткани молочной железы.

Содержание ОТ-кВр65 в опухоли было достоверно выше, чем в окружающей ткани у 86% больных РМЖ (р<0,0001). У 99% больных выявлена измеримая ДНК-связывающая активность №-кВр65 в опухоли и у 81% - в окружающей опухоль ткани, причем этот показатель был достоверно повышен в опухоли по сравнению с окружающей тканью в 97% случаев (р<0,0001) (табл.3).

Таблица 3.

Содержание и активность некоторых компонентов №-кВ сигнального пути в ядерно-цитоплазматических экстрактах опухолей и окружающих

гистологически неизмененных тканей больных РМЖ*

Кол-во Рак Неизмененная

Показатель больных молочной железы ткань молочной

железы

диапазон медиана диапазон медиана

№-кВр65 (нг/мг белка) 119 0 - 67,2 11,1' 0-42,5 2,9

ДНК-связывающая активность ОТ-кВр65 99 0-711 193' 0-143 28,7

ДНК-связывающая активность №-кВр50 39 0-1110 479' 2,5-278 72,9

р<0,0001 по отношению к показателям неизмененной молочной железы (тест Вилкоксона); *представлены медианы и диапазоны значений. Все показатели, кроме содержания и удельной ДНК-связывающнй активности №-кВр65 выражены в относительных единицах на 1 мг общего белка ядерно-цитоплазматического экстракта (см. раздел «Методика исследования»).

Содержание и ДНК-связывающая активность №-кВр65 в опухоли не коррелировали с соответствующими показателями в образцах неизмененной ткани молочной железы. В то же время, как в опухоли, так и в нормальной ткани отмечена слабая, но достоверная положительная корреляционная взаимосвязь между общим уровнем белка №-кВр65 и его ДНК-связывающей активностью (11=0,31, р<0,01 и 11=0,26, р<0,05 соответственно) (рис. 2).

Содержание и ДНК-связывающая активность №кВр66 в лиэатах РМЖ

800,-:-—

™ 700 С 5

| 1§ 600

2 » 500

д ^ эш

» о 300

* £ I 5 200

4 I

а «0 о

я-р,31;р<0;01

• •• ;

г7«? •. •.....

10 20 30 40 50 60 70 №кВр65, нг/м- белка

Рис. 2. Содержание и ДНК - связывающая активность ОТ-кВр65

в лиэатах РМЖ.

ДНК-свяэывающие активность МРкВр65 и МРкВрбО (Ед/мг белка) в лиэатах РМЖ

12000

10000 8000

О ■л а

ш вооо и. 2

4000 2000 0

0 100 200 300 400 »0

ЫРкВр65

Рис.3. ДНК - связывающая активность NF-кBp65 и №кВр50 (Ед/мг белка) в лиэатах РМЖ.

•

• • • • • •

• 1 •• 1 • • • •

1 л • Р

• ЫРкВ 050« 16' ЫРкВр65 ■ 1535

Таким образом, практически во всех случаях РМЖ наблюдали увеличение ДНК-связывающей активности NF-icBp65, в большинстве случаев сопровождавшееся также увеличением количества общего белка этой субъединицы. Однако увеличение активности NF-KBp65 носило более выраженный характер, чем увеличение количества общего белка: ДНК-связывающая активность превышала верхнюю 95% границу нормальных значений (118 Ед/мг белка) в 81% случаев, а содержание общего белка - только в 18% (95% граница нормы - 26,7 нг/мг белка). Это наблюдение соответствует представлению об относительной независимости активации транскрипционного фактора NF-кВ в опухолях от синтеза этого белка de novo.

В 97% опухолей и во всех образцах неизмененной молочной железы выявлена также ДНК-связывающая активность NF-KBp50. Активность этой субъединицы также была повышена в опухолях 97% больных РМЖ (р<0,0001). Так же, как и для NF-icBp65, ДНК-связывающая активность NF-KBp50 в опухоли не коррелировала с соответствующими показателями в неизмененной ткани молочной железы. Отмечена высоко достоверная (р<0,0001) положительная корреляционная взаимосвязь ДНК-связывающих активностей двух субъединиц NF-кВ как в опухоли (R=0,80), так и в окружающей ткани (R=0,88) молочной железы (рис. 3). При этом активность р50 в обеих тканях была достоверно выше (р<0,0001), чем активность р65. В опухоли превышение составило от 10 до 574 раз (медиана - 77 раз). Это наблюдение согласуется с данными Y.Zhou et al. (2005) - единственного исследования, выполненного тем же количественным методом определения ДНК-связывающей активности NF-кВ, который был использован в настоящей работе. Таким образом, повышенный уровень ДНК-связывающей активности NF-кВ является потенциальным маркером гормонорезистентности РЭ-положительного РМЖ.

В целом, первый этап статистического анализа продемонстрировал координированное увеличение ДНК-связывающей активности р65 и р50 субъединиц ядерного транскрипционного фактора NF-кВ по сравнению с

окружающей гистологически неизмененной тканью молочной железы в опухолях более 90% больных РМЖ. В случае №-кВр65 это изменение было в определенной степени связано с увеличением экспрессии суммарного белка этой субъединицы.

Далее была проанализирована взаимосвязь исследованных показателей с клинико-морфологическими особенностями РМЖ. На этой стадии помимо основных параметров, проведен анализ еще 3 расчетных показателей: увеличение содержания белка р65 и увеличение его активности в опухоли по сравнению с окружающей тканью, а также соотношение активности и общего содержания (удельную активность) ЫР-кВр65 в опухоли. Достоверной взаимосвязи с такими клинико-морфологическими факторами как стадия заболевания, размер (индекс Т) и гистологическое строение опухоли, степень поражения лимфатических узлов (индекс Ы) ни для одного из показателей не обнаружено. Однако выявлены тенденции к увеличению содержания и/или активности №-кВр65 при большей местной распространенности процесса, увеличении количества пораженных регионарных лимфатических узлов, локализации опухоли в нижне-внутреннем квадранте молочной железы, а также у больных старшей возрастной группы, находящихся в постменопаузе. Важно, что содержание общего белка ЫР-кВр65 в опухолях III степени злокачественности было достоверно выше, чем в опухолях II степени злокачественности (р<0,05). Для №-кВр50 значимой взаимосвязи с классическими клиническими и морфологическими факторами прогноза РМЖ не выявлено.

Отсутствие четкой взаимосвязи экспрессии и активности ключевых субъединиц ОТ-кВ с большинством клинически значимых прогностических факторов, наряду со значительным и практически универсальным увеличением всех исследованных показателей в ткани РМЖ по сравнению с окружающей неизмененной молочной железой, свидетельствует о том, что при дальнейшем наблюдении за обследованными больными, данные биомаркеры смогут

приобрести значение в качестве независимых прогностических факторов, определяющих как течение заболевания в целом, так и его чувствительность к отдельным видам лечения.

Таблица 4.

Содержание и ДНК-связывающая активность субъединиц №-кВ в ядерно-цитоплазматических экстрактах РМЖ в зависимости от рецепторного статуса опухоли*

Рецепторный статус Чис ло обр азцо в NF-KBp65 нг/мг белка ДНК-связывающая активность ЫР-кВр65 ДНК-связывающая активность Ед/нг NF-KBp65 ДНК-связывающая активность NF-icBp50

РЭ+ 81 8,95 0-67,2 187 0-640 15,7 0-182 502 0-1110

РЭ- 34 13,7 2,1 -46,5 223 63,5 -497 15,8 3,42-77,8 476 268-757

HER2+ 65 9,47 0-58,3 193 0,98 - 640 9,29 3,42-45,3 476 340-737

HER2- 31 13,3 2,08-46,5 212 63,5 - 497 16,7^ 0-182 501 0-1110

P3+Pn+HER2- 18 18,4 4,25 - 67,2 166 63,5-497 19,3 0,34-182 502 0-1110

РЭ+РП+НЕЯ2 + 97 9,73' 0-58,3 191 0-640 20,3 3,90-36,7 503 340-666

P3-PI1-HER2+ 62 9,38 0-58,3 193 0,98 - 640 9,29J 3,42-37,2 357-737 476

P3-Pn-HER2- 3 21,8 7,41-33,7 202 131-272 27,5 8,35-77,8 268-757 470

р<0,01 по сравнению с НЕЯ2+ опухолями; 2р<0,05 по сравнению с НЕЯ2+ опухолями; Зр<0,01 по сравнению с РЭ-РП-НЕЯ2- опухолями; "р<0,05 по сравнению с РЭ+РП+НЕЯ2-опухолями.

Учитывая роль активации №-кВ-сигнального пути в регуляции гормональной и лекарственной чувствительности РМЖ, особый интерес

представляла оценка взаимосвязи экспрессии и активности №-кВ с рецепторным статусом опухоли (табл. 4). Наиболее детальный анализ был проведен для показателей содержания и ДНК-связывающей активности №-кВр65, поскольку они были измерены у достаточно большого числа больных, позволившего сформировать подгруппы с различными сочетаниями трех рецепторов (РЭ, РП и НЕЯ2/пеи). Выраженных различий в зависимости от статуса рецепторов половых стероидных гормонов ни для одного из показателей не обнаружено. Однако можно отметить значимую тенденцию к увеличению содержания и ДНК-связывающей активности №-кВр65 в РЭ-отрицательных опухолях молочной железы по сравнению с РЭ-положительными (рис.4). В то же время достоверное увеличение содержания общего белка №-кВр65 (р<0,01) и его изменения по отношению к норме (р<0,01), а также снижение удельной активности ОТ-кВр65 (р<0,05) наблюдали в НЕ112-положительных опухолях по сравнению с НЕ112-атрицательными.

При анализе сочетаний из трех видов рецепторов выявлены следующие закономерности: 1) значительное снижение удельной активности ЫР-кВр65 в РЭ-РГГНЕК2+ опухолях, высоко достоверное по сравнению с РЭ~РГГНЕ112~ (р<0,01); 2) наибольшее увеличение ДНК-связывающей активности №-кВр65 по сравнению с окружающей тканью в опухолях, отрицательных по трем видам рецепторов (р<0,05 по отношению к РЭ+РП+НЕЯ2~ опухолям); 3) наконец, при сравнении опухолей с двумя классическими сочетаниями рецепторов -РЭ"РГГНЕК2+ и РЭ+РПГНЕЯ2~ - обнаружено достоверное увеличение суммарного содержания и прироста общего белка ОТ-кВр65 в первой подгруппе по сравнению со второй (р<0,05).

Значимых взаимосвязей с рецепторным статусом РМЖ для ДНК-связывающей активности №-кВр50 не обнаружено, однако это может быть связано с меньшим числом больных, обследованных по данному показателю.

Таким образом, по данным представленного исследования, в НЕ112-положительных опухолях молочной железы происходит увеличение общей

экспрессии белка №-кВр65, не зависящее от статуса рецепторов половых стероидных гормонов и не сопровождается увеличением ДНК-связывающей активности. В то же время, удельная ДНК-связывающая активность №-кВр65 наиболее высока в опухолях с так называемым «тройным отрицательным» рецепторным статусом, не поддающихся ни эндокринной, ни молекулярно-направленной терапии, поэтому возможно, что именно эта подгруппа больных РМЖ получит преимущество от использования селективных ингибиторов ЫР-кВ.

Исходя из проведенного анализа, можно констатировать, что настоящее исследование дает в руки врача-онколога еще один шанс для оценки эффективности лечения и прогноза у каждого конкретного пациента.

Выводы

1. Обнаружено достоверно более высокое содержание р65 субъединицы ядерного транскрипционного фактора №-кВ в опухоли по сравнению с окружающей гистологически неизмененной тканью у больных РМЖ (медианы соответственно 10,9 и 2,5 нг/мг белка, р<0,0001).

2. Наиболее высокие показатели содержания ОТ-кВр65 в опухоли больных РМЖ связаны с неблагоприятными морфологическими факторами прогноза: критерием местной распространенности процесса (Т), высокой степенью злокачественности опухоли. Обнаружена взаимосвязь высоких показателей содержания ЫР-кВр65 в опухоли с локализацией ее в нижневнутреннем квадранте молочной железы.

3. У преобладающего числа больных РМЖ (97%) ДНК-связывающая активность №-кВр65 в первичной опухоли выше, чем в неизмененной ткани (медианы соответственно 192,0 и 21,6 Ед, р<0,0001), а ее достоверно более высокие уровни связаны со степенью злокачественности и размером опухоли, с увеличением возраста пациенток, числом пораженных метастазами регионарных лимфатических узлов и постменопаузой.

4. Выявлена положительная корреляционная взаимосвязь между

содержанием белка №-кВр65 в ткани рака молочной железы и его ДНК-связывающей активностью (11=0,31; р<0,01).

Уровни белка №-кВр65 достоверно выше в РЭ (13,7 нг/мг белка) по сравнению с РЭ+ (9,0 нг/мг белка) опухолями молочной железы (р=0,04) и не зависят от экспрессии РП, при этом показатели ДНК-связывающей активности ЫР-кВр65 в РМЖ не зависят от рецепторного статуса опухоли. Многофакторный анализ выявил достоверную связь между уровнями кВр65 и экспрессией белка Нег-2/пеи в РМЖ: достоверно более высокие показатели №-кВр65 обнаружены в опухолях, экспрессирующих Нег-2/пеи, тогда как ДНК-связывающая активность р65 не зависела от содержания этого рецептора в первичной опухоли.

У преобладающего числа больных (97%) РМЖ уровни ДНК-связывающей активности р50 субъединицы ЫР-кВ достоверно выше в опухоли, чем в неизмененной ткани молочной железы, не зависят от репродуктивного статуса пациенток, критерия Т, количества пораженных метастазами регионарных лимфатических узлов и рецепторного статуса опухоли. При этом выявлена высоко достоверная прямая корреляционная взаимосвязь между ДНК-связывающими активностями ОТкВр50 и ОТ-кВр65 как в ткани РМЖ (11=0,80; р<0,0001), так и в неизмененной ткани (11=0,88; р<0,0001).

Более чем в 90% опухолей больных РМЖ происходит координированное увеличение ДНК-связывающей активности р65 и р50 субъединиц ядерного транскрипционного фактора №-кВ по сравнению с окружающей гистологически неизмененной тканью молочной железы, а также содержания белка №-кВр65, при этом изменения более выражены у больных с неблагоприятными клинико-морфологическими показателями.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Герштейн, Е.С. Клинические перспективы исследования ядерного транскриппционного фактора NF-кВ при раке молочной железы. / Е.С. Герштейн, A.M. Платова, В.П. Летягин, Н.Е. Кушлинский // Опухоли женской репродуктивной системы.- 2009 г.- №3-4-с. 39-42.

2. Герштейн, Е.С. Экспрессия и ДНК-связывающая активность ядерного транскрипционного фактора NF-кВ в опухолях больных раком молочной железы / Е.С. Герштейн, A.M. Платова, A.M. Щербаков, Г.Ю. Чемерис, В.П. Летягин, Н.Е. Кушлинский // Бюлл. эксп. биол. мед. -2010 г. т. 150, № 7, с.80-84.

3. Кушлинский, Н.Е. Сравнительный иммуноферментный анализ экспрессии и активности ядерного транскрипционного фактора NF-кВ, его ингибитора 1кВа и вышележащей эффекторной протеинкиназы AKtl в опухолях больных раком молочной железы. / Н.Е. Кушлинский, Е.С. Герштейн, A.M. Щербаков, А.М. Платова, Г.Ю. Чемерис, Е.В. Ошкина, А.А. Тулеуова, В.П. Летягин // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2010 г.- №8-с. 56-60.

4. Gershtein, E.S. Comparative ELISA study of NF-карраВ p65 and p50, its inhibitor 1карраВ, and upstream effector protein kinase AKtl expression and activity in the tumors of breast cancer patients. / E.S. Gershtein, A.M. Platova, A.M. Scherbakov, G.Yu. Tchemeris, N.E. Kushlinsky, // Tumor Biology. 2010, v. 31, Suppl. l,p. 39-40.

5. Герштейн, Е.С. Содержание и ДНК-связывающая активность ядерного транскрипционного фактора NF-кВ в опухолях больных раком молочной железы. / Е.С. Герштейн, A.M. Щербаков, A.M. Платова, Г.Ю. Чемерис, А.А. Тулеуова, З.К. Карабекова, И.В. Терешкина, Л.К. Овчинникова, М.В. Грицкевич, В.П. Летягин, Н.Е. Кушлинский // Российский биотерапевтический журнал, 2010, т. 4, №9, с. 85- 88.

6. Герштейн, Е.С. Экспрессия и активность ядерного транскрипционного фактора NF-кВ, его ингибитора 1кВа и протеинкиназы Aictl в опухолях больных раком молочной железы. / Е.С. Герштейн, A.M. Щербаков, A.M. Платова, Г.Ю. Чемерис, Е.В. Ошкина, В.П. Летягин, Н.Е. Кушлинский. // Альманах клинической медицины, 2010, №22, с. 55-61.

7. Gershtein, E.S. The expression and DNA-binding activity of NF-кВ nuclear transcription factor in the tumors of patients with breast cancer. / E.S Gershtein, A.M. Scherbakov, A.M. Platova, G.Yu. Tchemeris, V.P.Letyagin V.P. Kushlinsky N.E. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2010, Vol. 150, N1, p. 71-74.

8. Герштейн, Е.С. Ядерный транскрипционный фактор NF-кВ в опухолях больных раком молочной железы с различным рецепторным статусом. / Е.С. Герштейн, A.M. Платова, A.M. Щербаков, Г.Ю. Чемерис, В.П. Летягин, Н.Е. Кушлинский // Материалы XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство» Москва 2009г.- с. 69.

9. Кушлинский, Н.Е. Суммарный и активированный ядерный транскрипционный фактор NF-кВ в опухолях больных раком молочной железы с различным рецепторным статусом. / Н.Е. Кушлинский, Е.С. Герштейн, A.M. Платова, A.M. Щербаков, З.К. Карабекова, Г.Ю. Чемерис, В.П. Летягин // Труды научно-практической конференции «Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года» Москва 2009 г.- с. 38-39.

10. Герштейн, Е.С. Экспрессия и ДНК-связывающая активность ядерного транскрипционного фактора NF-кВ в опухолях больных раком молочной железы с различным рецепторным статусом. / Ё.С. Герштейн, A.M. Платова, A.M. Щербаков, Л.К. Овчинникова, Г.Ю. Чемерис, В.П. Летягин, Н.Е. Кушлинский // Материалы XIII Российского онкологического конгресса Москва 2009г.- Издательская группа РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.-М.-с. 284-285.

11. Gershtein, E.S. Nuclear transcription factor NF-кВ and PI3K/Akt signaling pathway components in human breast cancer: clinico-pathologic associations. / E.S. Gershtein, A.M. Platova, A.M. Scherbakov, L.K. Ovtchinnikova, G.Yu. Tchemeris, N.E. Kushlinsky // International Society of Oncology and Biomarkers 37th Meeting. Biomarkers and new treatment strategies in oncology. ISOBM2009 Amsterdam, 2009.- Meervart Conference Centre. Program. Abstracts.- p.82.

12. Герштейн, E.C. Иммуноферментный анализ содержания и активности р65 и р50 субьединиц ядерного транскрипционного фактора NF-кВ, его ингибитора 1кВа и эффекгорной протеинкиназы Aictl в опухолях больных раком молочной железы / Е.С. Герштейн, A.M. Щербаков, A.M. Платова, Е.В. Ошкина, Н.Е. Кушлинский // VII Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность». Сборник материалов. 28-29 октября 2010 г. Москва, с. 55-56.

Подписано в печать 12.05.12. Формат 60x84/16.

_Бумага офисная «SvetoCopy». Тираж 100 эю. Заказ № 850.____

Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24

12-20966

¡b5fr

2012340459

2012340459