Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Влияние многофункционального белка YB-1 на лекарственную устойчивость и метастатическую активность клеток рака молочной железы

На правах рукописи

мл

Моисеева Наталья Ивановна

ВЛИЯНИЕ МНОГОФУНКЦИОНАЛЬНОГО БЕЛКА УВ-1 НА ЛЕКАРСТВЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ И МЕТАСТАТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 7 НАР 2014

Москва - 2013

005546537

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук

Директор

академик РАН и РАМН, профессор

Давыдов Михаил Иванович

Научный руководитель

доктор медицинских наук профессор

Официальные оппоненты

Белицкий Геннадий Алексеевич

Надеждина Елена Сергеевна

Ставровская Алла Александровна

доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина», РАМН, НИИ Канцерогенеза, в.н.с. лаборатории механизмов химического канцерогенеза

доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник, руководитель группы клеточной биологии Института белка РАН

Ведущая организация

ФГБУ "ГНЦ Институт Иммунологии" ФМБА России

Защита диссертации состоится «¿3 » 12. 2013 г. в « Ц » часов на заседании диссертационного совета Д 001.017.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24. Автореферат разослан «(Я» II 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

д.м.н., профессор

Шишкин Юрий Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Возможность прогнозировать прогрессию злокачественных новообразований остается крайне важной задачей практической онкологии. Несмотря на широкие исследования, данное положение остается верным и для рака молочной железы (РМЖ), являющимся самым распространенным онкологическим заболеванием у женщин.

Одним из потенциальных маркеров агрессивного течения онкологических заболеваний является белок YB-1 (Y-box binding protein). Белок YB-1 входит в семейство ДНК/РНК-связывающих белков с эволюционно консервативным доменом холодового шока [Елисеева, И.А. и др., 2011]. Белок YB-1 участвует в регуляции как трансляции, так и транскрипции широкого спектра белков. На уровне трансляции YB-1, мажорный белок рибонуклеопротеидных частиц (РНП) цитоплазмы, может влиять на уровень общей синтетической активности в клетке [Ovchinnikov, L.P., 2001]. В ядре в качестве фактора транскрипции YB-1 регулирует экспрессию генов, содержащих Y-бокс в промоторе. В эту группу входят некоторые гены, кодирующие белки-транспортеры лекарственных препаратов, участвующие в возникновении множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток (МЛУ). МЛУ - это невосприимчивость популяции клеток к целому ряду лекарственных препаратов с различным химическим строением. Данный феномен часто препятствует успешной терапии злокачественных опухолей.

Возникновение МЛУ связывают как с повышенным содержанием YB-1 в клетках опухоли, так и с его локализацией в ядрах клеток [Гене, Г.П., 2010]. В некоторых работах было предложено рассматривать ядерную локализацию. YB-1 как ранний маркер МЛУ [Kuwano, M., 2004]. Однако вопрос о том, экспрессия и/или локализация белка YB-1 являются более значимыми показателями лекарственной устойчивости и прогноза заболевания, остается открытым.

Недавно был обнаружен ещё один потенциальный механизм влияния белка YB-1 на опухолевую прогрессию. Было показано, что данный белок может секретироваться мезангиопролиферативными клетками почки и макрофагами, играя роль экстраклеточного митогена, влияя также на

подвижность клеток [Frye, B.C., 2009]. Воздействие на опухолевые клетки экстраклеточного белка YB-1 ещё не изучено. Между тем, внеклеточный YB-1 может быть одним из факторов опухолевой прогрессии.

Основные цели и задачи исследования

Целью данной работы является изучение возможных механизмов влияния белка YB-1 на свойства опухолевых клеток, а также исследование связи экспрессии мРНК гена YB-1 и внутриклеточной локализации белка YB-1 со степенью агрессивности течения рака молочной железы человека (РМЖ)

Задачи работы:

1. Исследовать влияние химиотерапевтических препаратов на локализацию белка и экспрессию мРНК гена YB-1 в различных культурах малигнизированных клеток молочной железы;

2. Исследовать влияние химиотерапевтических препаратов на экспрессию мРНК генов МЛУ в культурах малигнизированных клеток молочной железы;

3. Исследовать влияние химиотерапевтических препаратов на экспрессию большого количества генов с помощью биочипа НТ-12 в культурах малигнизированных клеток молочной железы;

4. Исследовать влияние внеклеточного белка YB-1 на пролиферацию, миграцию и чувствительность к химиопрепаратам малигнизированных клеток молочной железы;

5. Исследовать экспрессию мРНК гена YB-1 в образцах опухолей больных РМЖ и ее корреляцию с клинико-морфологическими характеристиками опухолей и прогнозом заболевания;

6. Исследовать внутриклеточную локализацию белка YB-1 в образцах опухолей больных РМЖ и ее корреляцию с клинико-морфологическими характеристиками опухолей и прогнозом заболевания.

Научная новизна и практическая значимость исследования

При выполнении данного исследования был получен ряд приоритетных ■ данных. Впервые исследовано воздействие химиопрепаратов различных механизмов действия, используемых при лечении РМЖ, на локализацию и

экспрессию УВ-1 в нескольких культурах малигнизированных клеток молочной железы. Впервые исследовано, как влияют химиотерапевтические препараты доксорубицин и цисплатин на экспрессию широкого круга генов в малигнизированных клетках молочной железы. Впервые обнаружено, что внеклеточный белок УВ-1 усиливает пролиферацию и подвижность различных малигнизированных клеток молочной железы. Впервые показано, что внеклеточный белок УВ-1 не влияет на чувствительность к химиопрепаратам малигнизированных клеток молочной железы.

Важным результатом данной работы является выявленная положительная корреляция между неоадъювантной (предоперационной) химиотерапией и ядерной локализацией белка УВ-1 в опухолях молочной железы. Продемонстрировано, что количество мРНК УВ-1 и его локализация в ядрах могут служить независимыми факторами прогноза. Впервые показано, что количество мРНК гена УВ-1 является более достоверным маркером течения заболевания, нежели ядерная локализация белка УВ-1. Особое значение определение экспрессии мРНК гена УВ-1 приобретает у больных на ранних стадиях РМЖ (1-П стадия), позволяя выделить группу повышенного риска.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Перемещение белка УВ-1 в ядра малигнизированных культивируемых клеток молочной железы зависит от химиопрепарата. Агенты, повреждающие ДНК (доксорубицин, цисплатин) приводят к транслокации УВ-1 в ядра опухолевых клеток. Транслокация УВ-1 зависит также от особенностей клеток (клеточного контекста).

2. Использование экспрессионных микрочипов, позволяющих исследовать активность 35 ООО генов, показало, что воздействие доксорубицина и цисплатина на экспрессию генов в клетках культур РМЖ разнонаправленно. Оно может приводить не только к повышению, но и к снижению экспрессии генов АВС-транспортеров.

3. Внеклеточный белок УВ-1 усиливает пролиферацию и миграцию малигнизированных клеток молочной железы, но не влияет на устойчивость клеток к химиопрепаратам.

4. Внутриклеточная локализация белка УВ-1 и степень экспрессии мРНК гена УВ-1, обнаруживаемые в опухолевых образцах после мастэктомии, являются независимыми прогностическими признаками для больных РМЖ. Повышенная экспрессия мРНК гена УВ-1 в опухолевом материале достоверно коррелирует с увеличением частоты появления отдаленных метастазов (р=0.04).

5. В группе больных, которые получали неоадъювантную терапию, ядерная локализация белка УВ-1 обнаруживается достоверно чаще (р=0.05), что свидетельствует о том, что неоадъювантная химиотерапия приводит к перемещению УВ-1 в ядра опухолевых клеток.

Апробация работы

Диссертация апробирована и рекомендована к защите 16 октября 2012 года на совместной научной конференции лаборатории генетики опухолевых клеток, лаборатории механизмов химического канцерогенеза, лаборатории молекулярной эндокринологии НИИ Канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 1 статья в иностранном издании, 4 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, содержит 31 рисунок, 13 таблиц, состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы», «Список литературы». Список литературы включает 105 источника, в том числе 4 публикации в отечественных рецензируемых изданиях.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы включает данные о структуре гена и белка YB-1, о его многообразных функциях в различных компартментах клетки. Рассказывается об участии YB-1 в регуляции на уровне транскрипции и трансляции экспрессии белков, связанных с опухолевой прогрессией. Отдельный раздел посвящен секреции белка YB-1 во внеклеточную среду и его опосредованному воздействию через рецепторы Notch3 на опухолевые клетки. Во второй части обзора говорится о механизмах множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) опухолей, основных белках-транспортёрах семейства ABC, участвующих в формировании МЛУ, и роли YB-1 в регуляции их экспрессии. Третья часть обзора посвящена описанию исследований экспрессии и локализации белка YB-1 в опухолях различного гистогенеза и связи YB-1 с клиническими показателями и выживаемостью больных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали клетки рака молочной железы человека линий MCF-7 и ВТ-474, а также туморогенные клетки линии HBL-100, которые являются трансформированными in vitro клетками. Были получены клетки MCF-7, трансфецированные геном N-RAS™912, геном GFP, геном YB-1-GFP. Также в работе использовали рекомбинантные белки YB-1 и РАВР.

В работе исследовали опухолевый материал, полученный от 91 больного с диагнозом «инфильтрирующий протоковый рак молочной железы I-III стадии», оценивали экспрессию мРНК и локализацию белка YB-1.

Методы исследования: анализ динамики пролиферации клеток, метод оценки чувствительности клеток к химиопрепаратам - колориметрический метод (МТТ), анализ подвижности клеток (тест на «зарастание раны» in vitro). Исследование уровня экспрессии мРНК генов проводилось с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР, ПЦР в реальном времени, экспрессионных биочипы (RNA microarray). Для исследования уровня экспрессии и локализации белков использовались иммуноцитохимический метод, иммуногистохимический метод, иммуноблотгинг. Полученные экспериментальные и клинические данные обрабатывались различными статистическими методами.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Характеристики используемых в работе клеточных культур

В нашей работе мы использовали три культуры малигнизированных клеток молочной железы: MCF-7, ВТ-474, HBL-100. Они различающихся по молекулярному подтипу опухолей (люминальный А и В, базальный, соответственно), который является предиктивным комплексным маркером, от которого зависит схема лечения РМЖ.

1.1. Сравнение пролиферации трех клеточных культур

В нашей работе было показано, что популяции исследуемых линий клеток различаются по скорости пролиферации. После засева на 24-луночное плато на 4-ые сутки количество клеток MCF-7 было в 1,65 раз больше, чем клеток линии HBL-100 (р=0.018) и в 3,3 раза больше, чем клеток линии ВТ-474 (р=0.0001). Клетки линии HBL-100 пролиферировали в два раза быстрее, чем клетки ВТ-474 (р=0.025).

1.2. Чувствительность культур клеток к различным химиотерапевтическим препаратам

Одной из задач данной работы являлось исследование связи локализации и экспрессии белка YB-1 в клетке с экспрессией генов семейства МЛУ, которые активируются при воздействии на клетку различных химиотерапевтических препаратов. Использовались доксорубицин, цисплатин, паклитаксел. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Значение LD50 для трех культур клеток

MCF-7 ВТ-474 HBL-100

Доксорубицин 0.05 мкМ 0.3 мкМ 0.15 мкМ

Цисплатин 50 мкМ 50 мкМ 6.0 мкМ

Паклитаксел 6 мкМ 6 мкМ 1 мкМ

По результатам этой серии опытов можно сделать вывод, что культура клеток НВЬ-100 более чувствительна к химиотерапевтическим препаратам различных классов, по сравнению с культурами МСР-7 и ВТ-474. Клетки МСР-7 устойчивее других линий к паклитакселу и цисплатину и значительно чувствительнее к доксорубицину.

1.3. Уровень экспрессии генов МЛУ и УВ-1 в клетках культур МСР-7,

ВТ-474 и НВЬ-100

МЛУ к химиотерапевтическим препаратам во многом, определяет экспрессия набора генов, кодирующих белки семейства АВС-транспортеров: МОК1 (АВСВ1), MR.P1 (АВСС1), ВСЯР(АВСв2,), а также ЬЯР/МУР. Культуры клеток ВТ-474 и НВЬ-100 ранее не были охарактеризованы по всей панели этих генов. Также мы оценивали количество мРНК гена УВ-1 (рисунок 1). Суммируя результаты, можно сказать, что в клетках ВТ-474 наиболее сильно выражена экспрессия генов круга МЛУ, что коррелирует с их более высокой устойчивостью к исследованным нами цитостатическим препаратам. В клетках НВЬ-ЮО менее выражена экспрессия генов МБЯ1, МКР1, ВСЯР, чем в двух других линиях, с этим может быть связана более высокая чувствительность этих клеток. Четкой корреляции между количеством

мРНК УВ-1 и генов МЛУ не прослеживается.

^ ^

/ ^

С,АРЪН 23 цикла

УВ-1 28 циклов

МОЯ1 33 цикла

МЯР1 30 циклов

ЬИР 30 циклов

ВСЯР 30 циклов

Рисунок 1. Экспрессия генов МЛУ (МОЮ, МЯР1, ЬЯР, И С ИР) и гена УВ-1 в клетках культур МСР-7, ВТ-474, НВЬ-100. Результаты полуколичественного метода ОТ-ПЦР.

1.4. Локализация белка УВ-1 в клетках культур МСР-7, ВТ-474 и

НВЬ-100

Белок УВ-1 выполняет разные функции в цитоплазме и ядре клетки. Поэтому мы определили изначальную локализацию белка УВ-1 в исследуемых нами трех линиях клеток РМЖ (МСР-7, ВТ-474 и НВЬ-100). Анализ локализации проводился с помощью метода иммуноцитохимии с использованием специфических антител к белку УВ-1. Во всех трех культурах белок УВ-1 в 100% клеток локализован в цитоплазме (рисунок 2).

Рисунок 2. Локализация белка YB-1 в клетках MCF-7 (А, Г), ВТ-474 (Б, Д), HBL-100 (В, Е). Верхняя панель: окраска антителами к белку YB-1 (AlexaFluor 488), нижняя панель: ядра клеток (Hoechst 33258)

В этой части работы показано, что выбранные клеточные модели отличаются друг от друга по пролиферативному потенциалу и чувствительности и химиотерапевтическим препаратам. Однако связи этих показателей с изначальной экспрессией и локализацией белка YB-1 не обнаружено.

2. Влияние химиотерапевтических препаратов на локализацию белка YB-1 и его экспрессию в культурах клеток MCF-7, ВТ-474 и HBL-100

Исследуемые клетки линий MCF-7, ВТ-474 и HBL-100 не отличаются по базовому уровню экспрессии гена YB-1 или по локализации этого белка. Но при оценке роли YB-1 в ответе опухолевых клеток на стресс важно также динамическое изменение его экспрессии и, главное, перемещение белка YB-1 в ядра клеток, где он может активировать гены МЛУ.

2.1. Транслокация белка YB-1 в клетках культур MCF-7, ВТ-474 и HBL-100 при инкубации с различными химиотерапевтическими

препаратами

Белок YB-1 может перемещаться в ядра при воздействии ряда стрессовых факторов, в том числе некоторых химиотерапевтических веществ. Также известно, что он играет роль фактора транскрипции, связывающегося с промоторами некоторых генов МЛУ. Однако вопрос о том, для всех ли препаратов и линий клеток эта закономерность справедлива,

остается открытым. В связи с этим нами был проведен ряд экспериментов, в которых клетки инкубировали с тремя цитостатическими агентами и с помощью иммуноцитохимии изучали локализацию белка YB-1 в клетках.

Воздействие цисплатина (100 мкМ) на клетки MCF-7 в течение 24 часов привело к транслокации белка YB-1 в ядра 93% клеток (рисунок 3 Б, Д). В случае доксорубицина (5 мкМ) через 24 часа перемещение белка YB-1 произошло в 100% клеток MCF-7 (рисунок 3 В, Е). Стоит заметить, что при воздействии доксорубицина белок YB-1 не обнаруживается в цитоплазме даже в небольших количествах, и ядра клеток заметно интенсивней окрашиваются по сравнению с клетками, которые инкубировали с цисплатином.

Инкубация клеток HBL-100 с цисплатином и доксорубицином привела к тем же результатам, что и для клеток MCF-7. Однако в клетках линии ВТ-474 ни один из используемых препаратов не привел к транслокации белка YB-1 в ядра.

Исследования воздействия паклитаксела на клетки показали следующее: через 3 часа инкубации наблюдается появление округлых ярко окрашенных клеток, локализацию белка YB-1 в которых можно интерпретировать как ядерную (указаны на рисунке 4Б белыми стрелками). Однако при оценке состояния хроматина в данных клетках (Hoechst 33258, рисунок 4Г) обращает на себя внимание тот факт, что эти клетки находятся в состоянии митоза.

На более поздних сроках инкубации клеток MCF-7 с паклитакселом (6 и 24 часа) происходит дальнейшее увеличение количества клеток, находящихся в состоянии митоза, транслокации белка YB-1 в интерфазные ядра клеток не наблюдается.

Через 24 часа после добавления паклитаксела (10 мкМ) в 100% клеток HBL-100 происходит транслокация белка YB-1 из цитоплазмы в ядра клеток. Количество митозов в этих клетках с течением времени не увеличивается. Клетки, так же как и в случае с цисплатином, изменяют свою форму и становятся полигональными. В популяции ВТ-474 не происходит ни увеличения количества митозов, ни транслокации белка YB-1 в ядра клеток.

Рисунок 3. Транслокация белка YB-1 в ядра клеток линии MCF-7 (цисплатин (100 мкМ) и доксорубицин (5 мкм), 24 часа). Верхняя панель: окраска антителами к белку YB-1 (AlexaFluor 488), нижняя панель: ядра клеток (Hoechst 33258). А, Г - контроль; Б, Д - цисплатин (100 мкМ), 24 часа; В, Е - доксорубицин (5 мкМ), 24 часа. Иммуноцитохимия.

Рисунок 4. Локализация белка YB-1 в линии клеток MCF-7 (паклитаксел, 10 мкМ, 3 часа). Верхняя панель: окраска антителами к белку YB-1. Нижняя панель: окраска тех же клеток Hoechst 332S8. А, В — контроль; Б, Г - паклитаксел 10 мкМ, 3 часов. Белые стрелки указывают на клетки, находящиеся в митозе. Иммуноцитохимия.

Таким образом, агенты, приводящие к повреждению ДНК, стимулируют быструю и практически стопроцентную транслокацию белка YB-1 в ядра клеток. Это позволяет думать, что он выполняет не только роль активатора транскрипции, но и участвует в репарации ДНК. Также можно предположить, что белок YB-1 упаковывает ДНК в митозе, что показано в опытах с паклитакселом на клетках MCF-7. Отсутствие перемещения YB-1 в ядра клеток линии ВТ-474 может быть связано с наличием мутации белка р53, который (по литературным данным) необходим для транслокации YB-1.

2.2. Исследование профиля экспрессии гена YB-1 и генов МЛУ в культурах малигнизированных клеток молочной железы при добавлении доксорубицина и цисплатина

На следующем этапе мы изучали, изменяется ли экспрессия мРНК гена YB-1 при воздействии препаратов на клетки культур MCF-7 и ВТ-474. Также мы исследовали, коррелируют ли эти изменения с экспрессией мРНК генов МЛУ (MRP1, BCRP) и перемещением белка YB-1 в ядра клеток.

Клетки линий MCF-7 и ВТ-474 инкубировали с цисплатином (100 мкМ) и доксорубицином (1 мкМ) в течение 24 и 48 часов. Цисплатин не влиял на экспрессию мРНК гена YB-1 ни в клетках линии MCF-7, ни в клетках линии ВТ-474 (Рисунок 5). Доксорубицин приводил к увеличению экспрессии мРНК гена YB-1 через 48 часов воздействия в клетках MCF-7, и, в ещё большей мере, в клетках ВТ-474, где его количество увеличилось в 2.5-3 раза по сравнению с контролем.

Экспрессия мРНК гена MRP1 под влиянием цисплатина снижалась с течением времени в клетках MCF-7 (Рисунок 5, дорожки 2 и 3), в клетках ВТ-474 этой динамики выявлено не было. Доксорубицин через 48 часов приводил к увеличению экспрессии мРНК гена MRP1 в клетках обеих культур. Стоит отметить, что в клетках линии MCF-7 возрастанию экспрессия гена MRP1 предшествовало его незначительное снижение после 24 часов инкубации с доксорубицином. Экспрессия мРНК гена BCRP лишь незначительно увеличивалась в клетках линии ВТ-474 через 48 часов инкубации с доксорубицином, в остальных группах опытов экспрессия этого гена не изменялась.

В сумме с предыдущими опытами, данные результаты показывают, что активация экспрессии генов МЛУ больше коррелирует с повышением экспрессии гена YB-1, а не с перемещением белка в ядра клеток.

MCF-7

GAPDH

YB-1

MRP1 BCRP

BT-474

Рисунок 5. Экспрессия мРНК гена YB-1 и генов МЛУ (BCRP, MRP1) в клетках линии MCF-7 и ВТ-474 при воздействии цитостатических препаратов. Метод: ОТ-ПЦР. 1 -контроль; 2 - цисплатин 100 мкМ, 24 часа; 3 - цисплатин 100 мкМ, 48 часов; 4 -доксорубицин 0.1 мкМ, 24 часа; 5 - доксорубицин 0.1 мкМ, 48 часов.

2.3. Исследования профиля экспрессии генов с помощью биочипа НТ-12 (RNA microarray) в культурах малигнизированных клеток молочной железы при воздействии доксорубицина и цисплатина

При воздействии на клетку лекарственные препараты могут приводить к изменению широкого спектра генов, отвечающих за самые различные функции. Мы оценивали изменения профиля экспрессии генов в клетках MCF-7, ВТ-474, HBL-100 с помощью экспрессионного микрочипа. Для изучения нами были выбраны следующие препараты: цисплатин, приводящий к перемещению белка YB-1 в ядра клеток, но не влияющий на экспрессию мРНК гена YB-1, и доксорубицин, влияющий как на перемещение белка, так и на экспрессию мРНК гена YB-1 в клетке.

Анализ общих закономерностей показал, что количество изменивших свою экспрессию генов значительно больше при воздействии доксорубицина, чем при влиянии цисплатина. Экспрессия генов могла как возрастать, так и снижаться, и степень изменения значительно варьировала (от 1,5 до 200 раз). В целом, на клетки линии HBL-100 оба препарата оказали наиболее сильное воздействие по сравнению с другими культурами. В клетках линии ВТ-474 при воздействии цисплатина экспрессия генов практически не изменилась ни через 24 часа, ни через 48 часов.

В случае клеток линии MCF-7 показано, что цисплатин и доксорубицин не только имеют разную степень влияния на профиль экспрессии генов (количество изменившихся генов), но и для большинства генов действуют

14

разнонаправлено. Общая группа генов, увеличивших свою экспрессию, как под воздействием цисплатина, так и под воздействием доксорубицина, включает 79 мРНК. Это количество составляет от всего пула изменившихся генов 12% в случае воздействия цисплатина, и 14% - доксорубицина. Общая группа генов, снизивших свою экспрессию, составляла 244 мРНК (25.2% и 18.8%, соответственно).

Мы провели анализ функциональных групп генов (кластеры, объединенные по «биологическим процессам») (Рисунок 6). При этом также выявилось разнонаправленное действие доксорубицина и цисплатина. Так, в группе «биологическая регуляция» цисплатин увеличивал экспрессию генов, а доксорубицин - подавлял. Цисплатин активировал экспрессию генов из групп «ответ на стимул», «мульти-органные процессы», «локомоция», на которые доксорубицин не оказывал какого-либо воздействия. Обратная картина была для группы генов «локализация».

MCF7_24h

Рисунок 6. Изменение экспрессии генов при воздействии цисплатина и доксорубицина через 24 часа на клетки MCF-7, исследованное с помощью биочипа НТ-12 (Illumina) на 35500 генов. Представлены различные функциональные группы (кластеры «биологические процессы») достоверно экспрессируемых генов, количество мРНК которых изменилось не менее чем в 1.5 раза (р<0.01).

Экспрессия мРНК гена YB-1 при добавлении цисплатина изменялась только в клетках HBL-100 (в 2.1 раза). При 24-часовой инкубации с доксорубицином увеличение количества мРНК гена YB-1 в клетках MCF-7 и HBL-100 происходит в 3.7 и 15.4 раза, соответственно. В клетках ВТ-474 изменений экспрессии этого гена не наблюдалось. Таким образом, возрастание экспрессии гена YB-1 при воздействии обоих препаратов в наибольшей степени наблюдалось в клетках HBL-100. Экспрессия генов, вовлеченных в МЛУ, принадлежащих к семейству АВС-транспортеров при данных сроках воздействия препаратов не изменилась ни в одной из исследованных клеточных популяций.

3. Влияние внеклеточного белка YB-1 на клетки культур MCF-7, ВТ-474

и HBL-100

3.1. Перемещение белка Notch3 в клетках MCF-7 под действием rYB-1

На первом этапе мы исследовали возможность активации белка Notch3, потенциального рецептора для внеклеточного белка YB-1, в клетках MCF-7 при инкубации их с рекомбинантым белком YB-1 (rYB-1). Клетки MCF-7 инкубировались с rYB-1 (500 нг/мл) в питательной среде, содержащей 1% fes, в течение 3, 6 и 24 часов.

В контроле белок Notch3 определяется в зоне контакта клеток, образуя ярко окрашенную «сетчатую» структуру. Через 24 часа у всех клеток образуется яркий контур вокруг ядра. Таким образом, наши данные свидетельствуют в пользу того, что белок Notch3 перемещается в клетках MCF-7 под влиянием внеклеточного rYB-1.

3.2. Исследование влияния рекомбинантного YB-1 (rYB-1) на пролиферацию малигннзнрованных клеток молочной железы Прежде всего, мы исследовали влияние рекомбинантного белка YB-1 (rYB-1) на пролиферацию клеток. Оценку проводили с помощью подсчета клеток в течение нескольких дней. При воздействии rYB-1 в концентрации 500 нг/мл на культуру MCF-7 прирост числа клеток в популяции увеличивался на 40% (/>=0.003) по сравнению с контролем (1% fes) (рисунок 7). В популяции клеток HBL-100 скорость пролиферации возрастала на 25% по сравнению с контролем (2% fes) (р=0.001), а клеток ВТ-474 - на 7,8%

(р=0.02), но на более поздних сроках по сравнению с двумя другими линиями клеток (6 сутки после посева).

Таким образом, в двух из трех исследуемых линий клеток гУВ-1 в дозе 500 нг/мл значительно увеличивал прирост клеток в популяции. Степень увеличения и сроки, в которые наблюдалось влияние гУВ-1 на пролиферацию, были различными для изученных культур.

MCF-7

5

X

У

г л

:

О D дне й

□ 1 день О2 дня

□ 3 дня

1%fc« + BSA 1VJ-CI+ rYB-1 1ЭДС1* rYB-1 50D н т í м л 50 нг1мл 500 нг!мл

Рисунок 7. Влияние rYB-1 в концентрациях 50 и 500 нг/мл на пролиферацию клеток MCF-7 (*р<0.05; **р<0.01).

3.3. Исследование влияния rYB-1 на скорость закрытия раны, нанесенной на монослой

С целью выяснить, как влияет rYB-1 на движение клеток, мы исследовали скорость закрытия раны клетками MCF-7 и HBL-100. На клетки MCF-7 воздействия rYB-1 не обнаружено. Тогда мы грансфецировали клетки MCF-7 онкогеном N-iMS"51312 (показано, что одновременное присутствие гиперэкспрессии гена YB-1 и мутаций в гене Ras приводят к эпителиально-мезенхимальному переходу). Скорость закрытия раны (рисунок 8) под воздействием rYB-1 в клетках MCF-7/ras (клоны 4 и 5) оказалась примерно в 1.5 раза выше по сравнению как с исходной линией, так и с контрольными Ras-клонами, к которым rYB-1 не добавляли (р=0.02 для клона 4 и ¿>=0.01 для клона 5). Стоит отметить, что rYB-1 не увеличивал пролиферацию трансфецированных N-RASF^'2 клеток MCF-7.

На клетках HBL-100 нами показано, что через 3 дня после нанесения раны на монослой, отмечается некоторая тенденция к более быстрому закрытию просвета между краями раны при действии rYB-1 в концентрации

17

500 нг/мл по сравнению с контролем. В контроле рана закрылась на 35.3 ± 7.6%, а при добавлении гУВ-1 - на 47.3 ± 3.1% 0=0.1).

----------------~л Г

/Л t----

/ / / /

/ /

/ / // -------

-о- -MCF-7 -V- -MCF-7+rYB-1

_П-r.i cU

-Я-гшs cl4+rYB-1

—О— ras с! Б

— г«* с! Б *rYB-1

Рисунок 8. Влияние rYB-1 в концентрации 500 нг/мл на закрытие раны, нанесенной на монослой. А - клетки HBL-100 при воздействии rYB-1. Б - клетки MCF-7, MCF-7/ras клоны 4 и 5 при воздействии rYB-1.

3.4. Исследование влияния rYB-1 на устойчивость опухолевых клеток

к химиопрепаратам

На следующем этапе изучался вопрос участия внеклеточного rYB-1 в развитии устойчивости к химиопрепаратам. Выживаемость клеток трех исследуемых линий (MCF-7, ВТ-474 и HBL-100) оценивали при воздействии следующих препаратов: доксорубицин, цисплатин, винбластин, паклитаксел. Рекомбинантый YB-1 добавляли в концентрациях 50 и 500 нг/мл, в качестве контроля использовали BS А или РАВР в эквимолярных концентрациях. Мы показали, что rYB-1 не повышает устойчивость клеток к какому-либо из вышеперечисленных препаратов.

3.5. Исследование влияния внеклеточного rYB-1 на экспрессию генов в

клетках опухолей молочной железы (RNA microarray)

Для данного эксперимента мы выбрали клетки MCF-7, т.к. на них воздействие rYB-1 было самым значительным. Для выяснения сходства и различий в действии внутриклеточного и внеклеточного белка YB-1, клетки MCF-7 обработали rYB-1 500 нг/мл или трансфецировали плазмидой, содержащей кДНК гена YB-1-GFP. Изменения в профиле экспрессии генов оценивали с использованием биочипа Human НТ-12 (таблица 2).

Таблица 2. Влияние внеклеточного гУВ-1 и внутриклеточного белка УВ-!-(ИР на экспрессию генов в клетках МСР-7. Всего исследовано более 35500 генов.

Проба Степень изменения экспрессии генов (количества мРНК)

Изменение в 1,5 раза* Изменение в 2 раза* Изменение в 3 раза*

Г J. Î 1 Î 1

rYB-1 75 548 2 143 0 22

YB-1-GFP 841 567 177 34 53 0

* Изменение по сравнению с контролем; контроль - МСР-7 в среде с 1% сыворотки (для гУВ-1) и МСР-7, трансфецированные контрольной плазмидой ОРР.

Опыты с применением экспрессионных чипов продемонстрировали, что влияние внеклеточного УВ-1 и внутриклеточного УВ-1 на экспрессию генов разнонаправлено (рисунок 9). В то время как гУВ-1 в основном тормозил активность различных генов в клетках МСР-7, в результате трансфекции кДНК гена УВ-1 в эти клетки активность разных групп генов возрастала.

^/'Ж ^У Ж

у / Г yv

/ ~ * '

¿г

Рисунок 9. Изменение экспрессии генов при воздействии rYB-1 500 нг/мл через 24 часа на клетки MCF-7 (А) или трансфекцией геном YB-1-GFP (Б), биочипа НТ-12 (Illumina)

19

Таким образом, экстраклеточный белок YB-1 больше связан с пролиферацией и миграцией клеток, причем эти влияния сильно зависят от клеточного контекста. Какого-либо влияния на устойчивость клеток к химиопрепаратам не обнаружено ни на уровне выживаемости клеток, ни на уровне изменения экспрессии генов АВС-транспортеров.

4. Исследование количества мРНК гена YB-1 и его внутриклеточной локализации в опухолях молочной железы

Помимо изучения функционирования белка YB-1 на клеточных моделях, мы исследовали локализацию YB-1 и количество мРНК YB-1 в опухолевом материале, полученном при мастэктомии у больных РМЖ. Содержание мРНК YB-1 определяли методом ПЦР в реальном времени (Real-time PCR), локализацию белка выявляли иммуногистохимическим методом. Полученные данные сопоставляли с известными клинико-морфологическими характеристиками опухолей, маркером пролиферации Ki67, частотой появления отдаленных метастазов, влиянием на локализацию и экспрессию белка YB-1 неоадъювантной терапии.

4.1. Содержание мРНК YB-1 и внутриклеточная локализация белка YB-1 в опухолях молочной железы

Нами была принята следующая градация количества мРНК YB-1 в опухоли: высокое количество, если ACt (цикл (YB-1) - цикл (GAPDH)) от 4 до 10; среднее количество мРНК YB-1, если ACt от -1 до 3; низкое количество мРНК YB-1, если ACt от -1 до -2. Из исследованных 49 больных высокое содержание мРНК YB-1 выявлено у 10 пациенток (20.4%), среднее - у 18 (36.8%), низкое - у 11 (22.4%), у 10 больных мРНК YB-1 не определялась (20.4%). Таким образом, по количеству мРНК гена YB-1 пациенток можно разделить на группу с высоким содержанием мРНК (57%) и группу с низким ее содержанием (43%).

По результатам определения локализации белка YB-1 в клетке больных разделили на группы с цитоплазматической и ядерной локализацией. За ядерную локализацию принимались образцы, где более чем в 10% клеток белок YB-1 обнаруживается в ядре. При изучении локализации белка YB-1 в 41 случаях он был обнаружен в цитоплазме (63%), в 14 случаев (21.6%) — в ядрах, в 10 (15.4%) YB-1 не детектировался.

Прежде чем анализировать различия между этими группами по клиническим и иммуногистохимическим критериям, мы исследовали

20

наличие корреляции между содержанием мРНК гена УВ-1 и локализацией белка УВ-1 в ядрах клеток в опухолевом материале. Мы не выявили корреляций между этими показателями на выборке из 22 пациенток, у которых были определены оба фактора (р=0.2). Это позволяет рассматривать локализацию УВ-1 в ядре и количество мРНК этого гена как два независимых показателя.

4.2. Сопоставление локализации и экспрессии УВ-1 с известными

клиническими и молекулярными характеристиками опухолей

Был проведено сопоставление групп с различным содержанием мРНК гена УВ-1 и локализацией белка УВ-1 с общепризнанными клиническими и молекулярными параметрами: размер опухоли (группы пациентов с опухолью меньше 5 см (Т1-Т2) и опухолью больше 5 см (ТЗ-Т4)), поражение регионарных лимфатических узлов (группа N0 и N1-2), гормональный статус опухоли (наличие или отсутствие рецепторов эстрогенов (РЭ) и прогестерона (РП)). Ни по одному из перечисленных критериев статистически значимой разницы между группами не обнаружено. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4. Сопоставление экспрессии и локализации УВ-1 с размером опухоли, поражением регионарных лимфатических узлов, наличием эстрогеновых и прогестеронового рецепторов у больных РМЖ.

Показатель Экспрессия мРНК УВ-1 Р Локализация УВ-1 Р

0/+ ++/ +++ Цитоплазма-тическая Ядерная

Т1-2 ТЗ-4 54% 42% 46% 58% р=0А 73% 86% 28% 14% р=0А

N0 N1-3 60% 55% 40% 45% р=0.4 73% 76% 27% 24% р=0.8

РЭО РЭ + 38% 52% 62% 48% ¿>=0.2 31% 69% 38% 62% />=0.6

РПО РП + 41% 50% 59% 50% р= 0.5 55% 45% 36% 64% р=0.2

Анализ группы больных, которые получали неоадъювантную химиотерапию, позволяет оценить влияние цитостатических препаратов на локализацию белка УВ-1 в опухолевых клетках на клиническом материале.

В группе больных с опухолями ТЗ-Т4 у 5 из 8 пациенток, получавших неоадъювантную терапию (62.5%), УВ-1 обнаруживался в ядре. Это достоверно чаще (р=0.05) по сравнению с больными, которые не получали неоадъювантную терапию (1 из 7).

Также нами была проанализирована корреляция между уровнем мРНК гена УВ-1 и его локализацией в клетках с маркером пролиферации клеток -Кл67, широко используемым в онкологической практике. При исследовании корреляции ядерной локализации УВ-1 с экспрессией Кл67 статистически значимой разницы не было получено (г=0.18; р= 0.3). Однако при анализе количества мРНК гена УВ-1 и экспрессией Кл67 была выявлена четкая положительная достоверная корреляция этих показателей (г=0.78; р=0.05). Результаты представлены на рисунке 10.

90%

80%

й 70% 1Й к

| 60% £

50%

X

о

о 40% О. С

| 30% ^

о 20% Б 5

о 10% 0% -10%

-4 -2 0 2 4 6 8 10 12

дельта СI

Рисунок 10. Корреляция экспрессии Ю67 (% клеток, экспрессирующих этот белок в образце) и Д С/, полученной при измерении экспрессии мРНК гена УВ-1 методом ПЦР в реальном времени (г=0.78; Р=0.05). Критерий Спирмена.

4.3. Сопоставление экспрессии гена УВ-1 и локализации белка УВ-1 в опухолевых клетках с метастазированием РМЖ

Последний показатель, который был проанализирован, - наличие отдаленных метастазов у больных за период наблюдения (средний период наблюдения 25.5 месяца). Всего за прошедшее время исследования у 10 пациенток (20.4%) в сроки от 8 до 42 месяцев были обнаружены отдаленные

метастазы в различные органы. У 10 из них наблюдалось повышенное содержание мРНК гена УВ-1, и у 3 — низкий уровень этого показателя. Важно отметить, что ни у одной пациентки с отсутствием мРНК гена УВ-1 метастазов выявлено не было. Таким образом (рисунок 11), в группе пациенток, в опухолях у которых было обнаружено высокое содержание мРНК гена УВ-1, метастазы обнаруживались достоверно чаще, чем в группе больных, в опухолях которых содержание мРНК гена УВ-1 было низким (р=0.04).

При анализе групп больных с ядерной и цитоплазматической локализацией белка УВ-1, достоверных различий по метастазированию мы не обнаружили (р=0.07). Однако можно говорить о тенденции более частого появления отдаленных метастазов в группе пациенток с ядерной локализацией УВ-1 (28% ув 9%). Необходим анализ большей выборки больных, чтобы проверить выявленную тенденцию. Стоит отметить, что появление отдаленных метастазов в группе больных с ядерной локализацией УВ-1 (более чем в 10% клеток белок УВ-1 детектируется в ядре) не зависело от дальнейшего увеличения количества клеток с УВ-1 в ядре.

Мотастазирован)

Рисунок 11. Группы больных с отдаленными метастазами и без них в зависимости от А Си Группы статистически значимо различаются (р=0.04). Критерий Манн-Уитни.

Основным результатом нашей работы было выявление корреляции повышенного количества мРНК гена УВ-1 в опухолевых образцах с увеличением частоты появления отдаленных метастазов. Наша работа является одной из немногих, где определяли экспрессию именно гена УВ-1, а не интенсивность окраски опухолевых образцов. В свете различных

трудностей с антителами к белку УВ-1, определение количества его мРНК методом ПЦР в реальном времени является более надежным прогностическим фактором. Важно отметить, что прогностическое значение повышенной экспрессии мРНК гена УВ-1 наблюдается и для малых опухолей (Т1-Т2), что позволяет выделить группу риска среди таких больных.

Заключение

В представленном исследовании проведено изучение роли многофункционального белка УВ-1 в прогрессии опухолей молочной железы. Работа проводилась как на клеточных культурах (МСР-7, ВТ-474, НВЬ-ЮО), так и на опухолевом материале, полученном от больных РМЖ.

В данном исследовании были получены некоторые принципиально новые результаты, детализирующие и углубляющие знания об участии белка УВ-1 в опухолевой прогрессии. Мы показали, что перемещение белка УВ-1 в ядра опухолевых клеток зависит не только от препарата, но и от клеточной культуры, т.е., очевидно, от клеточного контекста. Также нами показано, что транслокация белка УВ-1 может приводить не только к увеличению экспрессии мРНК генов АВС-транспортеров, но и к уменьшению (мРНК гена МЯР1).

Впервые обнаружено, что внеклеточный белок УВ-1 влияет на пролиферацию и подвижность различных малигнизированных клеток молочной железы, усиливая их. Также показано, что внеклеточный белок УВ-1 не влияет на чувствительность к химиопрепаратам малигнизированных клеток молочной железы.

В нашей работе подтверждены данные, что экспрессия мРНК УВ-1 и локализация белка УВ-1 в опухолевых клетках не коррелируют с известными прогностическими маркерами РМЖ (размер опухоли, поражение регионарных лимфатических узлов, рецепторный статус). Таким образом, белок УВ-1 при РМЖ может являться самостоятельным маркером. Нами впервые показано, что высокая экспрессия мРНК УВ-1 коррелирует с худшим прогнозом для больных РМЖ и является более надежным показателем, чем ядреная локализация белка УВ-1 в клетке.

Выводы

1. Доксорубицин и цисплатин, в отличие от паклитаксела, способны индуцировать переход белка УВ-1 из цитоплазмы в ядра малигнизированных клеток молочной железы

2. Инкубация клеток МСР-7 с цисплатином приводит к перемещению УВ-1 в ядра клеток и снижению экспрессии мРНК гена МЯР1. В ответ на воздействие доксорубицина увеличивается степень экспрессии мРНК гена УВ-1, что коррелирует с увеличением экспрессии мРНК генов МЛУ (МКР1 и ВСЩ

3. Профиль экспрессии генов при воздействии цисплатина и доксорубицина в малигнизированных клетках молочной железы изменяется в широких пределах, разнонаправлено и в значительной мере зависят от клеточного контекста (результаты микрочипирования)

4. Рекомбинантный (экзогенный) белок УВ-1 (гУВ-1) увеличивает пролиферацию малигнизированных клеток молочной железы, а также миграцию некоторых из них (НВЬ-ЮО, МСР-7/газ). гУВ-1 не влияет на устойчивость клеток к химиопрепаратам. Добавление гУВ-1 к клеткам МСР-7 в основном приводит к подавлению экспрессии ряда генов, большая часть которых связана с клеточным метаболизмом (результаты микрочипирования)

5. Экспрессия мРНК гена УВ-1 и локализация белка УВ-1 в опухолях больных РМЖ не коррелирует с основными клинико-морфологическими характеристиками заболевания. Корреляции между количеством мРНК гена УВ-1 и его локализацией в клетках не обнаружено (р=0.5)

6. В группе больных, которые получали неоадъювантную терапию, ядерная локализация белка УВ-1 обнаруживается достоверно чаще (р=0.05)

7. Выявлена статистически достоверная положительная корреляция между экспрессией мРНК гена УВ-1 и маркером пролиферации клеток К167 (г=0.78;/>=0.05), тогда как для ядерной локализации УВ-1 такой зависимости не обнаружено

8. В группе больных РМЖ с высокой экспрессией мРНК гена УВ-1 отдаленные метастазы за период наблюдения возникают достоверно чаще, чем в группе больных с низкой экспрессией (р= 0.04). Статистически достоверных различий в группах с ядерной и цитоплазматической локализацией УВ-1 по наличию отдаленных метастазов не выявлено (р=0.07)

Список работ, опубликованных по теме диссертации в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Гене, Г.П. Исследование белка YB-1 в опухолях молочной железы. / Г.П. Гене, Т.П. Стромская, О.В. Калита, А.В. Вайман, Е.Ю. Рыбалкина, Л.П. Овчинников, А.А. Сорокин, Л.И. Коробкова, А.Ф. Астраханцев, С.Ф. Муха, Н.И. Моисеева, А.А. Ставровская. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2009. - № 4. - С. 21 - 24.

2. Гене, Г.П. Определение количества мРНК гена YB-1 в тканях опухолей молочной железы с целью прогнозирования течения заболевания. Клиническая лабораторная диагностика. / Г.П. Гене, Н.И.Моисеева, Т.П. Стромская, Е.Ю.Рыбалкина, А.В. Вайман, А.А. Ставровская. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - №2. - С. 28-32.

3. Гене, Г.П. Внутриклеточная локализация белка YB-1 и химиотерапия опухолей молочной железы. / Г.П. Гене, Н.И. Моисеева, Т.П. Стромская, Е.Ю. Рыбалкина, А.В. Вайман, Л.П. Овчинников, А.А. Ставровская. // «Российский биотерапевтический журнал». - 2010. - №4. — С. 17 -24.

4. Моисеева, Н.И. Влияние внеклеточного белка YB-1 на культивируемые клетки опухолей молочной железы. / Н.И. Моисеева, Т.П. Стромская, Е.Ю. Рыбалкина, А.В. Вайман, М.А. Малышкина, Е.Р. Ким, И.А. Елисеева, И. В. Кулаковский, Л.П. Овчинников, А.А. Ставровская. // Биологические мембраны. -2012.-Т. 29.-№5.-С. 1-9.

Другие работы, опубликовапные по теме диссертации:

5. Stavrovskaya, А.А. YB-1 protein and multidrug resistance of tumor cells. A.A. Stavrovskaya, T.P. Stromskaya, E.Yu. Rybalkina, N.I. Moiseeva, A.V. Vaiman, S.G. Guijanov, L.P. Ovchinnikov, G.P Guens. // Current signal transduction therapy. - 2012. -V. 07.-№03.-P. 237-246.

6. Guens, G.P. Correlation between level of mRNA of YB-1 maltifunctional protein in tumor and breast cancer metastasis. G.P. Guens, N.I. Moiseeva, T.P. Stromskaya, E.Y. Rybalkina Alia A. Stavrovskaya. // XX International Congress on Anti-Cancer Treatment, Paris, France. - 2009. - P. 418.

7. Guens, G.P. Impact of YB-1 mRNA and it's intracellular localization on the progression of breast cancer. / G.P. Guens, N.I. Moiseeva, T.P. Stromskaya, E.Yu. Rybalkina, L. P. Ovchinnikov, A.A. Stavrovskaya. И XXI Innernational Congress on Anti-Cancer Treatment. Paris, France. - 2010. - P. 207 - 208.

8. Guens, G.P. Prognostic significance of YB-1 nuclear localization in mammary tumors. / G.P. Guens, N.I. Moiseeva, T.P. Stromskaya, E.Yu. Rybalkina, A.V. Vaiman, A.A. Stavrovskaya. // XXII Innernational Congress on Anti-Cancer Treatment. Paris, France.-2011.-P. 164.

9. Guens, G.P. YB-1 protein and the sensivity of breast tumor to chemotherapy. / G.P. Gelena, N.I. Moiseeva, T.P. Stromskaya, E.Yu. Rybalkina, L. P. Ovchinnikov, A.A. Stavrovskaya. // XXIII International Congress on Anti-Cancer Treatment, Paris, France. -2012.-P. 187.

10. Моисеева, Н.И. Влияние внеклеточного белка YB-1 на размножение и подвижность клеток линий рака молочной железы. / Н.И. Моисеева, Т.П. Стромская, Е.Ю. Рыбалкина, Л.П. Овчинников, А.А. Ставровская. // VIII Международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток», Звенигород, Россия. - 2012. - С. 52.

Подписано в печать 2 9.1 о. 13 Формат 60x84/16. Бумага офисная «8уе1оСору». Тираж 100 экз. Заказ № 705 Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24