Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Белки NF-kB в опухолях больных раком молочной железы: клинико-морфологические корреляции

Заболеваемость раком молочной железы (РМЖ) в последнее время неуклонно растет: за период с 2004 по 2009 гг. прирост стандартизованных показателей по России составил 16% [Давыдов М.И. и Аксель Е.М., 2009]. Наряду с этим повышается осведомленность женского населения о необходимости самообследования и диспансеризации, происходит усовершенствование диагностического оборудования, разрабатываются оптимальные алгоритмы диагностики и лечения [Давыдов М.И. и Летягин В.П., 2007; Чиссов В.И. и Давыдов М.И., 2008; Aebi S. et al, 2010].

Следует отметить, что этиология РМЖ, как и большинства опухолей не известна, патогенез и факторы риска изучены не до конца [Пальцев М.А., 2004; Ашрафян JI.A. и соавт., 2007; Лихтенштейн A.B., 2009; Linos S. et al., 2008; Saarinen N.M. et al., 2009; Maillard V. et al., 2010], а программы скрининга, диагностики, мониторинга и лечения совершенствуются [Корман Д.Б., 2006, 2010; Медведев Ф.В. и соавт., 2009; Фомин Д.К. и соавт., 2009], при этом, большинство исследователей, полагают, что в основе этого процесса лежат генетические нарушения [Копнин Б.П., 2000; Попов Л.С. и совт., 2004; Абелев Г.И. и соавт., 2008; Abel G.-G., 2009].

Несмотря на существующий прогресс в лечении РМЖ, особенно его ранних стадий, сохраняются существенные проблемы: определенные формы РМЖ лечить сложно, например местнораспространенные формы или тройной негативный рак молочной железы; некоторые женщины не переносят побочных эффектов стандартной терапии, а успехи в лечении метастатического РМЖ, к сожалению невелики [Корман Д.Б., 2006; Petrel Ii N.J. et al., 2010].

Стандартными прогностическими факторами, позволяющими планировать лечение, а также прогнозировать клиническое течение РМЖ по настоящее время остаются такие параметры как: размер опухоли, поражение периферических лимфатических коллекторов, гистологическая форма, степень злокачественности, наличие рецепторов эстрогенов и прогестерона, а с недавнего времени - также экспрессия белка Her-2/neu [Божок A.A. и соавт., 2005; Кушлинский Н.Е. и Герштейн Е.С., 2008; Aebi S. et al., 2010; Pet-relli N.J. et al., 2010].

Проведение как неоадьювантной, так и адьювантной системной и местной терапии не безразлично для больной, и ее применение должно быть четко определено [Muss H.B. et al., 2009; Aebi S. et al., 2010]. В этой связи, а также благодаря появлению новых препаратов направленного действия, в последнее время усиливается роль исследования молекулярно-биологических маркеров для определения тактики лекарственной терапии и прогноза течения РМЖ [Тупицын H.H. и соавт., 2001; Георгиев Г.П., 2004; Герштейн Е.С. и соавт., 2005; Имянитов E.H., 2008; Мирошниченко И.И. и соавт., 2009; Sleifer S. Et al., 2008; O'Shaughness J. et al., 2009; Tutt A. et al., 2009].

Среди таких маркеров при РМЖ особо следует выделить рецепторы половых стероидных гормонов [Бассалык Л.С. и соавт., 1987; Chu R. et al., 2009] и наличие экспрессии Her-2/neu в опухоли [Кушлинский и соавт., 2007; Саво-стикова М.В., 2010; Ozols R.F. et al., 2007; Fischgrabe J. et al., 2009], матрикс-ные металлопротеиназы и их ингибиторы [Давыдов М.И. и соавт., 2009; Woessner J.F. et al., 2000; McGowan P.M. et al., 2008; Bornstein P. et al., 2009; Chiodoni C. et al., 2010], активатор плазминогена урокиназного типа (uPA) и его ингибитор (PAI-1) [Герштейн Е.С. и соавт., 1999; 2007; Duffy M.J., 2004; Duffy M.J. et al., 2004; Harbeck N. et al., 2009; Li Ch. et al., 2010] в опухоли; наличие экспрессии рецептора эпидермального фактора роста в опухоли [Berns P.M.J.J. et al., 2008]; растворимый Fas [Аббасова С.Г. и соавт., 2009] и Нег-2/neu в сыворотке крови [Кушлинский Н.Е. и соавт., 2008]; фактор роста эндотелия сосудов, его рецепторы, а также ряд активаторов и ингибиторов нео-ангиогенеза в опухоли и сыворотке крови [Луценко С.В. и соавт., 2004; Ким Е.А. и соавт., 2008; Березов Т.Т. и соавт., 2010; Deprimo S.E. е al., 2006; Michael А. et al., 2010]; интерлейкин 6 [Вищипанова Н.Л. и соавт., 2004]; ИФР и их транспортные белки [Mccarthy К. et al., 2009; Verheus М. et al., 2009]; p53

Dookeran К.A. et al., 2010]; PI3K [Markman В. et al., 2010]; II тип рецептора TGF-p [Paiva C.E. et al., 2010]; циклин B1 [Nimeus-Malmstrom E. et al., 2009]; ген CCND1 [Roy P.G. et al., 2010]; RACK1 [Cao Xi-Xi et al., 2009]; топоизоме-раза 2a [Glynn R.W. et al., 2010]; экспрессия HLA-G [Не X. et al., 2010].

В последние годы пристальное внимание исследователей привлекает ядерный транскрипционный фактор NF-карра В (NF-кВ), который играет важную роль в клеточной пролиферации, апоптозе, воспалительной и аутоиммунной реакциях, поскольку он регулирует экспрессию генов, вовлеченных в эти процессы [Герштейн Е.С. и соавт., 2009; Biswas D.K., Iglehart J.D., 2006]. Идентифицировано пять белков семейства NF-kB, содержащих общий Д1Ж-связывающий домен: NF-kB 1 (р50/р105), NF-kB2 (р52/р100), RelA (р65), RelB и c-Rel [Haffner М.С. et al., 2006; Kim H.J. et al., 2006]. Основной формой существования этих белков в большинстве типов клеток является гетеродимер p50/RelA(p65). Активность NF-kB регулируется посредством их взаимодействия с ингибиторными белками 1кВ [Kim H.J. et al., 2006]. В большинстве покоящихся клеток NF-kB неактивен и находится в цитоплазме в комплексе с одним из ингибиторов. При поступлении в клетку регуляторного стимула сигнальный каскад NF-kB активируется, происходит фосфорилирование, а затем полная деградация ингибиторного белка, и свободный активный NF-kB поступает в ядро.

Регуляция NF-kB сигнального каскада нарушена во многих опухолях человека, в том числе и при РМЖ. В большинстве опухолевых клеток NF-kB постоянно активирован и находится в ядре. Эта активация не только защищает клетки от апоптоза, но также увеличивает их пролиферативную активность. Установлено, NF-kB играет важную роль в этиологии, патогенезе и прогрессии РМЖ [Cao Y. et al., 2003; Huber М.А. et al., 2004; Biswas D.K. et al., 2004]. Особенно велико значение этого фактора в опухолях, отрицательных по рецепторам эстрогенов, но имеющих рецепторы эпидермального фактора роста или Her-2/neu [Biswas D.K. et al., 2006; Van Laere S.J. et al., 2007].

В последние годы показано, что гиперактивация NF-kB является одной из причин резистентности РМЖ к антиэстрогенам [Ю.С.Лобанова и соавт., 2007; Pratt М.А. et al., 2003; DeGraffenried L.A. et al., 2004; Zhou Y. et al., 2007], химиопрепаратам [Weldon C.B. et al., 2001; Hernandez-Vargas H. et al., 2007], лучевой терапии [Ahmed К.M. et al., 2007].

Предполагается, что создание противоопухолевых агентов, блокирующих NF-кВ сигнальный путь, позволит повысить чувствительность клеток к существующим видам терапии, а также может иметь самостоятельное терапевтическое значение [Wu J.T. et al., 2005; Ahmed K.M. et al., 2007].

В то же время, большинство доказательств определяющего значения NF-кВ сигнального каскада при РМЖ получено в экспериментальных системах, а данные об экспрессии этого фактора в опухолях человека, полученные на клиническом материале, лишь единичны [Liu С. et al., 2007; Van Laere S.J. et al., 2007] и требуют дальнейшего подтверждения.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить особенности и соотношение экспрессии и активности ключевых субъединиц транскрипционного фактора NF-кВ и его ингибитора 1кВ в различных клинико-морфологических подгруппах больных раком молочной железы и выявить их связь с рецепторным статусом опухоли и основными клинико-морфологическими характеристиками заболевания.

Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи исследования:

1. Иммуноферментными методами определить суммарную концентрацию р65 субъединицы NF-кВ и ингибиторного белка 1кВ в лизатах опухолей и прилежащих гистологически неизмененных тканей больных раком молочной железы и сопоставить уровни и соотношение концентраций NF-кВ и IkB в опухолях и неизмененных тканях молочной железы.

2. Специфическим иммуноферментным методом оценить ДНК-свя-зывающую активность р65 и р50 субъединиц NF-кB в лизатах опухолей и прилежащих гистологически неизмененных тканей больных раком молочной железы и проанализировать их соотношение.

3. Проанализировать взаимосвязь исследованных показателей с клиническими и морфологическими (стадия заболевания, размер опухоли, статус лимфатических узлов, возраст и менопаузный статус больных) характеристиками больных раком молочной железы.

4. Сопоставить содержание и активность ЫР-кВр65, КР-кВр50 и 1кВ в опухолях со статусом рецепторов стероидных гормонов (рецепторы эстрогенов, рецепторы прогестерона).

5. Исследовать содержание 1\ПР-кВр65 и №-кВр50 в опухолях молочной железы, а также их ДНК-связывающую активность с учетом экспрессии рецепторов Нег-2/пеи в РМЖ.

6. Сравнить исследуемые показатели у больных раком молочной железы с ранним прогрессированием и больных соответствующих стадий с безрецидивным течением заболевания.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Впервые на клиническом материале исследовано количественными им-муноферментными методами содержание общего NF-кB и ингибиторного белка ПсВ, а также соотношение их концентраций в опухолях и гистологически неизмененной ткани молочной железы больных РМЖ различных стадий и изучена взаимосвязь этих показателей с основными клинико-морфологиче-скими особенностями опухолей, их рецепторным и Нег-2/пеи статусом.

Обнаружено достоверно высокое содержание р65 субъединицы ядерного транскрипционного фактора №-кВ в опухоли, по сравнению с окружающей гистологически неизмененной тканью у больных РМЖ. При этом, высокие уровни ЫР-кВр65 в опухоли больных РМЖ связаны с такими неблагоприятными морфологическими факторами прогноза как критерий местной распространенности процесса (Т), низкая степень дифференцировки опухоли и ее локализация в нижне-внутреннем квадранте молочной железы.

У преобладающего числа больных РМЖ ДНК-связывающая активность ]\ГР-кВр65 в первичной опухоли была выше, чем в неизмененной ткани, а ее достоверно более высокие уровни связаны со степенью дифференцировки и размером опухоли, с увеличением возраста пациенток, числом пораженных метастазами регионарных лимфатических узлов и постменопаузой. Кроме того, выявлена положительная корреляционная взаимосвязь между содержанием белка МР-кВр65 в опухоли молочной железы и его ДНК-связывающей активностью.

Впервые показано, что уровни белка ЫР-кВр65 достоверно выше в РЭ~ по сравнению с РЭ+ опухолями молочной железы и не зависели от экспрессии РП. При этом показатели ДНК-связывающей активности МР-кВр65 в РМЖ не зависели от рецепторного статуса опухоли.

Показано, что достоверно более высокие показатели ЫР-кВр65 обнаружены в опухолях, экспрессирующих Нег-2/пеи, тогда как ДНК-связывающая активность р65 не зависела от содержания этого рецептора в РМЖ.

Доказано, что у больных РМЖ уровни ДНК-связывающей активности р50 субъединицы ЫБ-кВ достоверно выше в опухоли, чем в неизмененной ткани молочной железы и не зависели от репродуктивного статуса пациенток, критерия Т, количества пораженных метастазами регионарных лимфатических узлов и рецепторного статуса опухоли. При этом, выявлена высоко достоверная прямая корреляционная взаимосвязь между ДНК-связывающими активностями МРкВр50 и №-кВр65 в ткани РМЖ и в неизмененной ткани молочной железы.

Обнаружено, что более чем в 90% опухолей больных РМЖ происходит координированное увеличение ДНК-связывающей активности р65 и р50 субъединиц ядерного транскрипционного фактора ЫР-кВ по сравнению с окружающей гистологически неизмененной тканью молочной железы, а также содержания белка КР-кВр65, при этом изменения более выражены у больных с неблагоприятными клинико-морфологическими показателями.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

В результате проведенного исследования обнаружено, что более чем в 90% опухолей больных РМЖ происходит координированное увеличение ДНК-связывающей активности р65 и р50 субъединиц ядерного транскрипционного фактора МБ-кВ по сравнению с окружающей гистологически неизмененной тканью молочной железы, а также содержания белка МР-кВр65, при этом изменения более выражены у больных с неблагоприятными клинико-морфологическими показателями, характеризующими заболевание.

выводы

1. Обнаружено достоверно более высокое содержание р65 субъединицы ядерного транскрипционного фактора М^-кВ в опухоли по сравнению с окружающей гистологически неизмененной тканью у больных РМЖ (медианы соответственно 10,9 и 2,5 нг/мг белка, р<0,0001).

2. Наиболее высокие показатели содержания №-кВр65 в опухоли больных РМЖ связаны с неблагоприятными морфологическими факторами прогноза: критерием местной распространенности процесса (Т), низкой степенью злокачественности опухоли. Обнаружена взаимосвязь высоких показателей содержания №"-кВр65 в опухоли с локализацией ее в нижневнутреннем квадранте молочной железы.

3. У преобладающего числа больных РМЖ (97%) ДНК-связывающая активность ЫР-кВр65 в первичной опухоли выше, чем в неизмененной ткани (медианы соответственно 192,0 и 21,6 Ед, р<0,0001), а ее достоверно более высокие уровни связаны со степенью злокачественности и размером опухоли, с увеличением возраста пациенток, числом пораженных метастазами регионарных лимфатических узлов и постменопаузой.

4. Выявлена положительная корреляционная взаимосвязь между содержанием белка №-кВр65 в ткани рака молочной железы и его ДНК-связывающей активностью (11=0,3 1; р<0,01).

5. Уровни белка №-кВр65 достоверно выше в РЭ (13,7 нг/мг белка) по сравнению с РЭ+ (9,0 нг/мг белка) опухолями молочной железы (р=0,04) и не зависят от экспрессии РП, при этом показатели ДНК-связывающей активности ЫР-кВр65 в РМЖ не зависят от рецепторного статуса опухоли.

6. Многофакторный анализ выявил достоверную связь между уровнями №7-кВр65 и экспрессией белка Нег-2/пеи в РМЖ: достоверно более высокие показатели МБ-кВр65 обнаружены в опухолях, экспрессирующих

Нег-2/пеи, тогда как ДНК-связывающая активность р65 не зависела от содержания этого рецептора в первичной опухоли.

7. У преобладающего числа больных (97%) РМЖ уровни ДНК-связывающей активности р50 субъединицы ИР-кВ достоверно выше в опухоли, чем в неизмененной ткани молочной железы, не зависят от репродуктивного статуса пациенток, критерия Т, количества пораженных метастазами регионарных лимфатических узлов и рецепторного статуса опухоли. При этом выявлена высоко достоверная прямая корреляционная взаимосвязь между ДНК-связывающими активностями №кВр50 и №"-кВр65 как в ткани РМЖ (11=0,80; р<0,0001), так и в неизмененной ткани (11=0,88; р<0,0001).

8. Более чем в 90% опухолей больных РМЖ происходит координированное увеличение ДНК-связывающей активности р65 и р50 субъединиц ядерного транскрипционного фактора ЫР-кВ по сравнению с окружающей гистологически неизмененной тканью молочной железы, а также содержания белка ЫР-кВр65, при этом изменения более выражены у больных с неблагоприятными клинико-морфологическими показателями.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы частота заболевания раком молочной железы неуклонно возрастает, и по темпам роста заболеваемости эта опухоль в России занимает первое место среди злокачественных новообразований различных локализаций у женщин [Давыдов М.И. и соавт., 2004]. Ежегодно в мире РМЖ заболевают около 1 млн. женщин [Мерабишвили В.М., 2004; Гарин A.M. и соавт., 2006]. Однако уровень заболеваемости колеблется в достаточно широких пределах. Так, по данным МАИР в издании «Рак на 5 континентах» (т.7) число случаев РМЖ увеличивается в каждой стране, прибавляя ежегодно 12%. Наибольший прирост заболеваемости РМЖ отмечен за последние годы в Канаде, США, Швеции, Испании, Финляндии (3-6%), а наименьший - в Дании, Норвегии (1,8%). Наиболее высокие показатели смертности отмечены в Бельгии, Франции, Германии, Италии, Португалии.

При этом, несмотря на успехи, достигнутые в диагностике, совершенствовании хирургических и лекарственных методов лечения, смертность от РМЖ остается довольно высокой [Давыдов М.И. и соавт., 2008; Chen W.Y. et al., 2009; Cardoso F. et al., 2010]. Многие исследователи дальнейший прогресс в повышении эффективности лечения этого тяжелого заболевания связывают не только с рациональным использованием комбинированных и комплексных методов лечения (Загрекова Е.И. и соавт., 2002; Корман Д.Б., 2010; Ciruelos Е.М. et al., 2010; Kozloff М. et al., 2010), но и с разработкой принципиально новых патогенетических методов терапии, основанных на современных достижениях в изучении биохимии и молекулярной биологии этих опухолей [Георгиев Г.П., 2004; Имянитов Е.Н., 2008; Liu S. et al., 2010].

Улучшение ранней диагностики и совершенствование методов терапии РМЖ, в том числе создание и успешное применение специфических молеку-лярно-направленных («таргетных») препаратов, существенно повысили эффективность лечения этого тяжелого и социально значимого заболевания [Жуков Н.В. и соавт., 2008; Имянитов E.H., 2008]. Однако проведение как неоадьювантной, так и адьювантной системной терапии не безразлично для больных, и ее применение должно быть четко определено.

Современный уровень знаний о молекулярных механизмах возникновения и развития опухолей, их чувствительности или резистентности к различным препаратам и воздействиям уже позволяет осуществить переход от усредненных стандартных схем терапии к так называемой «персонализированной медицине», т.е. назначению лечения в соответствии с индивидуальными особенностями больного и биологическими характеристиками опухоли [Имянитов E.H., 2008; Lee-Hoeflich S.T. et al., 2008; Mancl E.E. et al., 2009].

Стандартными прогностическими факторами, позволяющими планировать течение РМЖ, до сих пор остаются такие параметры как размер опухоли, поражение периферических лимфатических коллекторов, гистологическая форма и степень злокачественности РМЖ [Божок A.A. и соавт., 2005; Давыдов М.И. и соавт., 2007; Герштейн Е.С. и соавт., 2010; Cardozo F. et al., 2010].

Важнейшими этапами на пути к персонализированному лечению РМЖ стало внедрение в клиническую практику исследования статуса рецепторов половых стероидных гормонов (РЭ и РП) для определения показаний к назначению эндокринной терапии в 70-х г.г. [Бассалык JI.C. и соавт., 1987; Давыдов М.И. и соавт., 2009; Корман Д.Б., 2010] и обязательная оценка экспрессии мембранного рецептора Her-2/neu или амплификации его гена при решении вопроса о применении Герцептина, вошедшая в практику вместе с внедрением этого первого таргетного препарата для лечения РМЖ в конце 20 века [Герштейн Е.С. и соавт., 2010; Luftner D. et al., 2003; Goldhirsch A. et al., 2005; Plosker G.L. et al., 2006; Engel R.H. et al., 2007].

Тем не менее, остается еще очень много нерешенных вопросов в этой области науки и практики, в связи с чем в последнее время возрастает роль поиска и исследования новых биологических маркеров для определения тактики лекарственной терапии и прогноза течения РМЖ [Кушлинский Н.Е. и соавт., 2009; Chen W.Y. et al., 2009].

Одним из перспективных молекулярных маркеров РМЖ, по данным экспериментальных исследований, является полифункциональный ядерный транскрипционный фактор NF-кВ, играющий важную роль в клеточной пролиферации, апоптозе, воспалительной и аутоиммунной реакциях, регулируя экспрессию генов, вовлеченных в эти процессы [Гущин И.С., 2010; Biswas D.K. et al., 2000; Baldwin A.S. et al., 2001]. NF-кВ представляет собой гетеродимерный комплекс белков, которые в большинстве покоящихся клеток неактивны и находятся в цитоплазме в комплексе со специфическими ингибиторами - 1кВ [Haffner М.С. et al., 2006; Kim H.J. et al., 2006]. В большинстве нормальных клеток NF-kB/IkB комплексы находятся в цитоплазме в транскрипционно неактивном состоянии и активируются только при поступлении в клетку соответствующего регуляторного стимула. ДНК-связы-вающая активность NF-кВ стимулируется в ответ на целый ряд экзогенных стимулов, причем этот процесс не зависит от синтеза белка de novo.

Показано, что гиперактивация NF-кВ является одной из причин резистентности РМЖ к антиэстрогенам [Лобанова Ю.С. и соавт., 2007; Zhou Y. et al., 2007], химиопрепаратам [Hernandez-Vargas H. et al., 2007] и лучевой терапии [Baldwin A.S. et al., 2001; Haffner M.C. et al., 2006]. Эта активация не только защищает клетки от апоптоза, но также увеличивает их пролифератив-ную активность, инвазивный, метастатический и ангиогенный потенциал [Bhat-Nakshatri P. et al., 2002; Sliva D. et al., 2002; Helbig G. et al., 2003; Zhou Y. et al., 2005].

Предполагается, что создание противоопухолевых агентов, блокирующих NF-кВ сигнальный путь, позволит повысить чувствительность клеток к существующим видам терапии, а также может иметь самостоятельное терапевтическое значение. В настоящее время известно несколько десятков экзогенных и эндогенных агентов, способных подавить активность NF-кВ, большинство из которых пока отличаются низкой специфичностью. В любом случае, для успешного использования подобных препаратов потребуется индивидуальная оценка статуса NF-кВ и степени его активации в опухоли в сочетании с другими молекулярными маркерами [Plosker G.L. et al., 2006].

В связи с этим, нами была поставлена задача апробировать возможность использования при изучении клинического материала недавно разработанные количественные тест-системы для определения содержания и ДНК-связывающей активности NF-кВ и изучить особенности и соотношение этих показателей в различных клинико-морфологических подгруппах больных РМЖ.

Идентифицировано пять различных белков семейства NF-кВ, содержащих общий ДРПС-связывающий домен, однако основной формой существования NF-кВ в большинстве клеток млекопитающих является гетеродимер p50/RelA(p65) [Гущин И.С., 2010]. Именно эти две ключевые субъединицы и были исследованы нами в ядерно-цитоплазматических экстрактах опухолевой и гистологически неизмененной ткани больных РМЖ, проходивших обследование и лечение в хирургическом отделении опухолей молочных желез РШИ клинической онкологии Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН в период с ноября 2008 г. по март 2010 г.

В процессе исследования удалось определить суммарное содержание и ДЬЖ-связывающую активность р65 субъединицы NF-кВ в тканях 119 и 99 больных, соответственно. У 43 больных была измерена также ДНК-связыва-ющая активность р50 субъединицы.

Особый интерес представляло определение NF-KBp65 или NF-KBp50 с помощью оригинальных иммуноферментных систем серии «TransAM™» (Active Motif, США), в которых на плашки для первоначальной экстракции определяемого белка из клеточного лизата нанесены не специфические антитела, а оли гону клеотид, содержащий консесусную последовательность 5'-GGGACTTTCC-3', специфичную для ядерного связывания всех субъединиц NF-кВ. После этого проводили стандартное прямое иммуноферментное определение количества связавшегося белка с использованием специфических антител к р65 или р50, соответственно. Результаты этих определений, рассчитанные в условных единицах в пересчете на 1 мг клеточного белка, мы обозначили как «ДНК-связывающую активность» NF-кВ, в отличие от суммарного содержания NF-icBp65, оцененного классическим ELISA тестом.

На первом этапе анализа оценили соотношение уровня исследованных маркеров в опухолях и гистологически неизмененных тканях молочной железы и их возможные взаимосвязи между собой. Измеримые количества общего белка NF-KBp65 были обнаружены в 118 образцах опухолей (99%) и в 96 образцах (81%о) гистологически неизмененной ткани молочной железы. Содержание NF-KBp65 в опухоли было достоверно выше, чем в окружающей ткани у 86%о больных РМЖ (р<0,0001). У 99% больных выявлена измеримая ДНК-связывающая активность NF-KBp65 в опухоли и у 81%о - в окружающей опухоль ткани, причем этот показатель был достоверно повышен в опухоли по сравнению с окружающей тканью в 97% случаев (р<0,0001). Содержание и ДНК-связывающая активность NF-KBp65 в опухоли не коррелировали с соответствующими показателями в образцах неизмененной ткани молочной железы. В то же время, как в опухоли, так и в нормальной ткани отмечена слабая, но достоверная положительная корреляционная взаимосвязь между общим уровнем белка NF-KBp65 и его ДНК-связывающей активностью (R=0,31, р<0,01 и R=0,26, р<0,05 соответственно).

Таким образом, практически во всех РМЖ наблюдали усиление ДНК-связывающей активности NF-KBp65, в большинстве случаев сопровождавшееся также увеличением количества общего белка этой субъединицы. Однако увеличение активности NF-KBp65 носило более выраженный характер, чем увеличение количества общего белка: ДНК-связывающая активность превышала верхнюю 95%> границу нормальных значений (118 Ед/мг белка) в 81% случаев, а содержание общего белка - только в 18%о (95% граница нормы

26,7 нг/мг белка). Это наблюдение соответствует представлению об относительной независимости активации транскрипционного фактора NF-кВ в опухолях от синтеза этого белка de novo.

В 97% опухолей и во всех образцах неизмененной молочной железы выявлена также ДНК-связывающая активность NF-KBp50. Активность этой субъединицы также была повышена в опухолях 91% больных РМЖ (р<0,0001). Так же, как и для NP-KBp65, ДНК-связывающая активность NF-кВр50 в опухоли не коррелировала с соответствующими показателями в неизмененной ткани молочной железы. Отмечена высоко достоверная (р<0,0001) положительная корреляционная взаимосвязь ДНК-связывающих активностей двух субъединиц NF-кВ как в опухоли (R=0,80), так и в окружающей ткани (R=0,88) молочной железы. При этом активность р50 в обеих тканях была достоверно выше (р<0,0001), чем активность р65. В опухоли превышение составило от 10 до 574 раз (медиана - 77 раз). Это наблюдение согласуется с данными Y.Zhou et al. (2005) - единственного исследования, выполненного тем же количественным методом определения ДНК-связывающей активности NF-кВ, который был использован в настоящей работе.

Следует отметить, что по данным Y.Zhou et al. (2005), высокий уровень ДНК-связывающей активности NF-кВ, в первую очередь, его р50 субъединицы, у больных РМЖ с относительно низким (21-87 фмоль/мг белка) содержанием РЭ в опухоли, получавших адъювантно тамоксифен, приводит к более раннему прогрессированию заболевания. Таким образом, повышенный уровень ДНК-связывающей активности NF-кВ является потенциальным маркером гормонорезистентности РЭ-положительного РМЖ.

В целом, первый этап статистического анализа продемонстрировал координированное увеличение ДНК-связывающей активности р65 и р50 субъединиц ядерного транскрипционного фактора NF-кВ по сравнению с окружающей гистологически неизмененной тканью молочной железы в опухолях более 90% больных РМЖ. В случае NF-icBp65 это изменение было в определенной степени связано с увеличением экспрессии суммарного белка этой субъединицы.

Далее была проанализирована взаимосвязь исследованных показателей с клинико-морфологическими особенностями РМЖ. На этой стадии помимо основных параметров, проведен анализ еще 3 расчетных показателей: увеличение содержания белка р65 и увеличение его активности в опухоли по сравнению с окружающей тканью, а также соотношение активности и общего содержания (удельную активность) NF-icBp65 в опухоли.

Обследованная группа из 119 больных РМЖ имела достаточно вариабельный возрастной состав (от 23 до 77 лет; медиана составила 54 года). Репродуктивная функция была сохранена у 37 больных, 18 находились в состоянии пременопаузы, и 64 женщины были в постменопаузе различной длительности. Больные распределялись по стадиям заболевания следующим образом: 1ГА - 37, IIB - 28, по 20 больных I и 111А стадии, и у 14 больных был распространенный процесс ШВ - II1C стадии.

По гистологическому строению 95 опухолей молочной железы представляли собой протоковый инфильтративный рак, 14 - дольковый ин-фильтративный рак. Большинство опухолей имели II, 28 - 1Г1, и 7 -1 степень злокачественности. Таким образом, размер и состав обследованной группы позволяли провести достаточно детальный и статистически значимый анализ, по крайней мере, для двух показателей - содержания и ДНК-связывающей активности р65 субъединицы NF-kB.

Достоверной взаимосвязи с такими клинико-морфологическими факторами как стадия заболевания, размер (индекс Т) и гистологическое строение опухоли, степень поражения лимфатических узлов (индекс N) ни для одного из показателей не обнаружено. Однако выявлены тенденции к увеличению содержания и/или активности NF-KBp65 при большей местной распространенности процесса, увеличении количества пораженных лимфатических узлов, локализации опухоли в нижне-грудном квадранте молочной железы, а также у больных старшей возрастной группы, находящихся в постменопаузе. Важно, что содержание общего белка NF-KBp65 в низкодифференцированных опухолях III степени злокачественности было достоверно выше, чем в уме-реннодифференцированных опухолях II степени злокачественности (р<0,05). Для NF-KBp50 значимой взаимосвязи с классическими клиническими и морфологическими факторами прогноза РМЖ не выявлено.

Отсутствие четкой взаимосвязи экспрессии и активности ключевых субъединиц NF-кВ с большинством клинически значимых прогностических факторов, наряду со значительным и практически универсальным увеличением всех исследованных показателей в ткани РМЖ по сравнению с окружающей неизмененной молочной железой, свидетельствует о том, что при дальнейшем наблюдении за обследованными больными, данные биомаркеры смогут приобрести значение в качестве независимых прогностических факторов, определяющих как течение заболевания в целом, так и его чувствительность к отдельным видам лечения.

Учитывая роль активации NF-кВ-сигнального пути в регуляции гормональной и лекарственной чувствительности РМЖ, особый интерес представляла оценка взаимосвязи экспрессии и активности NF-кВ с рецепторным статусом опухоли. Наиболее детальный анализ был проведен для показателей содержания и ДНК-связывающей активности NF-кВрбЗ, поскольку они были измерены у достаточно большого числа больных, позволившего сформировать подгруппы с различными сочетаниями трех рецепторов (РЭ, РП и H£R2/neu). Выраженных различий в зависимости от статуса рецепторов половых стероидных гормонов ни для одного из показателей не обнаружено. Однако можно отметить значимую тенденцию к увеличению содержания и ДНК-связывающей активности NF-кВрбЗ в РЭ-отрицательных опухолях молочной железы по сравнению с РЭ-положительными. В то же время достоверное увеличение содержания общего белка NF-KBp65 (р<0,01) и его изменения по отношению к норме (р<0,01), а также снижение удельной активности МР-кВр65 (р<0,05) наблюдали в НЕ112-положительных опухолях по сравнению с НЕК2-отрицательными.

При анализе сочетаний из трех видов рецепторов выявлены следующие закономерности: 1) значительное снижение удельной активности №-кВр65 в РЭ~РП"НЕ112+ опухолях, высоко достоверное по сравнению с РЭ~РП"НЕК2" (р<0,01); 2) наибольшее увеличение ДНК-связывающей активности кВр65 по сравнению с окружающей тканью в опухолях, отрицательных по трем видам рецепторов (р<0,05 по отношению к РЭ+РП+НЕК2~ опухолям); 3) наконец, при сравнении опухолей с двумя классическими сочетаниями рецепторов - РЭ~РП~НЕК2+ и РЭ+РП+НЕ]Я2~ - обнаружено достоверное увеличение суммарного содержания и прироста общего белка ЫР-кВр65 в первой подгруппе по сравнению со второй (р<0,05). Значимых взаимосвязей с рецептор-ным статусом РМЖ для ДНК-связывающей активности ЫР-кВр50 не обнаружено, однако это может быть связано с меньшим числом больных, обследованных по данному показателю.

Таким образом, по данным представленного исследования, в НЕ112-по-ложительных опухолях молочной железы происходит увеличение общей экспрессии белка ЫР-кВр65, не зависящее от статуса рецепторов половых стероидных гормонов и не сопровождается увеличением ДНК-связывающей активности. В то же время, удельная ДНК-связывающая активность МР-кВр65 наиболее высока в опухолях с так называемым «тройным отрицательным» рецепторным статусом, не поддающихся ни эндокринной, ни молекулярно-направленной терапии, поэтому возможно, что именно эта подгруппа больных РМЖ получит преимущество от использования селективных ингибиторов №-кВ.

Исходя из проведенного анализа, можно констатировать, что настоящее исследование дает в руки врача-онколога еще один шанс для оценки эффективности лечения и прогноза у каждого конкретного пациента.