Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Ассоциация вирусов папилломы человека и стафилококков в формировании нарушений микрофлоры кожи при псориазе

Фомина Екатерина Сергеевна

Ассоциация вирусов папилломы человека и стафилококков в формировании нарушений микрофлоры кожи при псориазе

14.00.11. - кожные и венерические болезни 03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2009

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова

Научные руководители: заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Молочков Владимир Алексеевич

доктор медицинских наук, профессор Быков Анатолий Сергеевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Уджуху Владислав Юсуфович

доктор медицинских наук, профессор Митрохин Сергей Дмитриевич

Ведущая организация: ГОУВПО Московский государственный медико-стоматологический университет.

Защита диссертации состоится «» ¿^■¿/^^бс^г^ 200^г. в /~^часов на заседании диссертационного Совета Д.208.040.10 при Московской медицинской академии имени И.М.Сеченова по адресу: 119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр.2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО ММА имени И.М. Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан « /¿¿^¿^ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Эрдес Светлана Ильинична

доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Состояние нормальной микрофлоры (нормофлоры) человека является одним из важных показателей здоровья организма. Количественные и видовые изменения в составе нормофлоры могут сопровождаться как развитием угрожающих жизни заболеваний, так и манифестацией болезней, исходно протекавших субклинически [Шендеров Б.А., 1998; Митрохин С.Д.,1998; Finegold S.M. et al., 1983].

В настоящее время псориаз является одним из наиболее распространенных хронических заболеваний кожи, заболеваемость им продолжает непрерывно возрастать [Молочков В.А. и соавт., 2007; Топорова Н.П. и соавт., 1997; Чистяков И.А., 1997; Henseler Т., 1997; Schafer T. et al., 1996]. Имеются данные о том, что некоторые микробные агенты, в том числе S. aureus, S. pyogenes, Е. coli, могут играть триггерную роль в отношении псориаза [Abeck С., 1992; Aly R. et al., 1976; Leung D.Y. et al., 1993; Tefer N.R. et al., 1992], при этом большее значение придают не столько очагам фокальной инфекции, сколько массивной микробной контаминации кожи микробными агентами. Так, продемонстрировано, что у больных псориазом численность стафилококков в очагах в 20 раз превосходит таковую на участках непораженной кожи [Noble W.C., 1998].

Высказывается предположение о том, что наряду с бактериями, развитие псориаза может быть связано также с вирусом папилломы человека (ВПЧ) [Pfister H., 2003]. Среди почти 200 типов ВПЧ выделяют не только слизистые, но и кожные типы, которые также как и ВПЧ слизистого типа, подразделяют на группы низкого и высокого онкогенного риска. Непосредственное участие ВПЧ в кожном канцерогенезе было впервые установлено на примере ВПЧ-5 и ВПЧ-8, ассоциирующихся с верруциформной эпидермодисплазией Левандовского-Лютца с развивающимся в последующем на фоне этого заболевания плоскоклеточным раком кожи, формирование которого обусловливала интеграция в геном

клетки ВПЧ 9, 12, 15, 17, а также 19 - 25 типов [zur Hausen Н„ 1996]. ДНК ВПЧ может быть обнаружена и в образцах здоровой кожи, но частота ее выявления достоверно возрастает у лиц с иммуносупрессией [Boxman I.L. et al., 1999; Harwood С.А. et al., 2000; Stockfleth E. et al., 2004; Weissenborn S.J. et al., 1999].

Взаимосвязи репликации кожных ВПЧ с течением псориаза мало изучены. Тем не менее, установлено, что частота обнаружения ВПЧ-5 на коже псориатических бляшек более чем двукратно превосходит таковую в образцах видимо здоровой кожи [Prignano G. et al., 2003]. Показано, что ВПЧ 5, 36, 38 типов может выявляться почти в 90% псориатических очагов. Кроме того, отмеченное Н. Pfister et al. (2003) более чем пятикратное повышение сывороточного титра антител к ВПЧ-5 и ВПЧ-8 у больных псориазом в сопоставлении со здоровыми людьми косвенно свидетельствует в пользу участия ВПЧ в патогенезе местных иммунологических кожных нарушений при псориазе. Частота обнаружения ВПЧ-5 и ВПЧ-8 достигает максимума также после высокодозовой PUVA-терапии, сопровождающейся локальной иммуносупрессией [Wolf Р. et al., 2003].

Таким образом, повышенная репликация определенных типов кожных ВПЧ, отражая присущие псориазу нарушения локального кожного иммунитета, может также служить маркером интенсивности патологической пролиферации кератиноцитов в псориатических очагах. В связи с этим особую актуальность приобретает изучение взаимосвязи оцененной с помощью высокочувствительных методов кожной вирусной нагрузки кожными ВПЧ с другими показателями, отражающими расстройства кожного локального иммунитета, в частности, нарушениями аутомикрофлоры кожи, регистрируемыми исходя из количества персистирующих стафилококков. Результатом изучения кожных бактериально-вирусных ассоциаций при псориазе может стать углубление представлений о формировании и прогрессировании псориаза с возможным в

дальнейшем расширением возможностей его патогенетически обоснованного лечения.

Цель исследования: изучить связь кожных вирусов папилломы человека с нарушениями аутомикрофлоры кожи при псориазе.

Задачи исследования:

1. Оценить частоту обнаружения ДНК ВПЧ в псориатических очагах.

2. Определить вирусную нагрузку ВПЧ в очагах псориаза и на участках видимо здоровой кожи и изучить ее динамику в зависимости от клинического течения и формы псориаза.

3. Изучить обсемененность стафилококками пораженных и здоровых участков кожи больных псориазом с оценкой ее динамики в зависимости от клинического течения и формы псориаза, а также состояния врожденного иммунитета, оцениваемого с помощью реакции иммуноприлипания.

4. Сопоставить динамику микробной обсемененности и вирусной нагрузки ВПЧ в зависимости от клинического течения псориаза.

Научная новизна

Впервые проведено определение кожных типов ВПЧ рода Betapapillomavirus с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени у больных псориазом. На основе количественного анализа впервые детально изучена ассоциация клинического течения псориаза с ВПЧ рода Betapapillomavirus. Также подробно описано изменение вирусной нагрузки ВПЧ в зависимости от динамики клинического течения псориаза.

Для оценки врожденного иммунитета организма у больных псориазом в сопоставлении со здоровыми лицами применен тест для определения уровня аутомикрофлоры кожи (АМФК) в отношении Staphylococcus aureus с помощью контактных слайдов Envirocheck® Contact YM (R). Впервые проанализирована взаимосвязь динамики величины вирусной нагрузки ВПЧ

рода Betapapillomavirus и степени микробной обсемененности в зависимости от морфофункционального состояния кожи больных псориазом, динамики клинического течения псориаза и клинической формы. Также впервые проведена оценка врожденного иммунитета больных псориазом с применением реакции иммуноприлипания в титрационном варианте.

Положения, выносимые на защиту:

1. У больных псориазом часто удается обнаружить наличие ВПЧ рода Betapapillomavirus в псориатических очагах, при этом концентрация ДНК ВПЧ рода Betapapillomavirus при псориазе достоверно превосходит таковую у бессимптомных носителей ВПЧ.

2. Существует взаимосвязь между динамикой вирусной нагрузки ВПЧ и стадией клинического течения псориаза.

3. Изменения показателей, характеризирующих состояние аутомикрофлоры кожи, коррелируют с динамикой вирусной нагрузки ВПЧ у больных псориазом.

4. Диагностическая значимость теста с применением контактных слайдов Envirocheck® Contact YM (R), описывающего аутомикрофлору кожи (АМФК), и диагностическая значимость теста «Бактотест» сопоставимы.

Внедрение в практику

Результаты работы используются в лечебном и учебном процессе на кафедре кожных и венерических болезней ФППОВ ММА им. И.М. Сеченова и кафедре дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, а также на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ММА им. И.М. Сеченова.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании Московского областного общества дерматовенерологов, Москва, 2007г., 2008г.; на 14-ой международной специализированной выставке «Аптека» 23 -26 октября 2007г., Москва, СК «ОЛИМПИЙСКИЙ»; 23rd INTERNATIONAL

PAPILLOMAVIRUS CONFERENCE & CLINICAL WORKSHOP 2006 Prague, September 1-7 2006r.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ. Структура диссертации

Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, выводов и библиографического указателя. Указатель литературы включает 28 отечественных и 118 зарубежных работ. Работа иллюстрирована 9 рисунками и 15 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В настоящее исследование включены 69 пациентов с установленным диагнозом псориаза, находившихся на стационарном лечении в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского. Возраст обследованных составлял от 17 до 76 лет.

Таблица 1. Исходная характеристика больных (п=69)

Особенности распределения Число больных (п (%))

Распределение по полу:

мужчины 40 (58%)

женщины 29 (42%)

Клинические формы псориаза:

Вульгарный псориаз 51 (74%)

Псориатическая эритродермия 18(36%)

Больные псориазом получали десенсибилизирующую, дезинтоксикационную терапию, а также антигистаминные препараты, поливитамины, нестероидные противовоспалительные средства. Также применяли экстракорпоральные методы лечения (плазмаферез) и наружную терапию. Всем пациентам проводили комплексное обследование, включавшее общий анализ крови, мочи, биохимические анализы крови, ЭКГ, при необходимости — УЗИ внутренних органов. Критерием исключения из исследования были состояния, сопровождающиеся выраженной

иммуносупрессией: онкологические заболевания внутренних органов и крови, тяжелые системные заболевания, гепатиты В и С, ВИЧ-инфекция, состояния после трансплантации внутренних органов.

Контрольную группу составили 46 человек, из них 19 мужчин и 27 женщин в возрасте от 29 до 78 лет, у которых кожные заболевания, в том числе ассоциированные с кожными типами ВПЧ, отсутствовали. Пациентам и лицам контрольной группы предлагалось не принимать водных процедур за 24 часа до обследования, а также не использовать мази, кремы и прочие средства наружного применения. Непосредственно перед получением отпечатков кожу обследуемых лиц не подвергали обработке дезинфицирующими средствами.

Молекулярно-биологическое исследование. Материалом для исследования служили биоптаты кожи размером 0,2x0,2 см, полученные с помощью малоинвазивной модификации взятия биопсии бритвенным способом, или суспензия клеток, полученная методом соскоба. Соскоб использовался только для взятия материала из зон псориатических высыпаний, где имелись нарушения сцепления между клетками, и скарификация обеспечивала получение достаточного количества клеточной массы. Исследуемый материал помещали в отдельные пробирки, содержащие 1 мл транспортной среды (PBS буфер, ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва). Для максимального сохранения количества клеточной и вирусной ДНК пробирки замораживали сразу после взятия материала и хранили до проведения ПЦР-анализа при -70 °С.

Выявление и количественное определение ВПЧ рода р проводили методом ПЦР в режиме реального времени (А.Ю. Кладова и соавт., 2006) с использованием рекомбинантных плазмидных положительных контролен, содержащих последовательность полных геномов ВПЧ кожных типов рода alpha, gamma, mu, nu и beta-1,3,4,5,7,8,15,20,24,27,37,38,49,50,65 (M. Favre Instituí Pasteur, Unite Postulante Genetique, Papillomavirus et Cáncer Human, France; E.M. de Villers, Abteilung tumorvirus- Charakterisierung

Referenzzenturum für Humanpathogene Papillomviren, Germany), а также контрольные плазмиды фрагмента ß-глобинового гена человека (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора).

Для выявления ДНК ВПЧ рода ß были использованы 4 независимые системы олигонуклеотидов (группоспецифических праймеров и зондов): первая - для выявления генотипов вида beta 1 (5,8,12,14,20,21,19,25,47,36); вторая - для выявления вида beta 2 (9,15,17,22,23,38,37,80); третья - для выявления вида beta 3 (49,75,76); четвертая - для выявления вида beta 4 (92), beta 5 (96), beta 1 (20,24 и 93 типы). Последовательности всех олигонуклеотидов ВПЧ рода beta были выбраны при анализе известных последовательностей ВПЧ, взятых из Интернет ресурса «NCBI Genebank» (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и обработаны при помощи программы AlignX пакета Vector NTI 6 (InforMax Inc., 2000). ПЦР проводили в мультиплексном формате. Аналитическая чувствительность методики позволяла выявлять генотипы вида beta 1-1250 копий ДНК ВПЧ/мл; вида beta 2-1000 копий ДНК ВПЧ/мл; вида beta 3-450 копий ДНК ВПЧ/мл; вида beta 4,5-300 копий ДНК ВПЧ/мл.

Метод ПЦР в «режиме реального времени», положенный в основу методики количественного выявления ВПЧ рода beta, позволял определять абсолютное количество геномов ВПЧ и ДНК человека в пробе. С учетом того, что при взятии клинического материала из очагов псориаза и нормальной кожи количество эпителиальных клеток (а соответственно и копий вируса), попадающих в образец, существенно варьировало, была использована методика нормирования количества вируса на количество клеток человека. Это позволяло получать надежные и достоверные данные о вирусной нагрузке ВПЧ в клетках кожи.

Расчет нормализованной вирусной нагрузки (ВН) производился по формуле: BH=lg ((кол-во ДНК ВПЧ/кол-во ДНК чел.)* 105). Изучение микробиоценоза кожи проводили методом агаровых отпечатков с использованием «Бактотестов» — стерильных пластиковых одноразовых

микрочашек площадью 10 см2. «Бактотесты» для работы были предоставлены Федеральным медицинским биофизическим центром (А.А. Иванов и др.).

В группах отобранных больных отпечатки брали с очагов псориаза на сгибательной поверхности предплечья. Также снимали отпечатки с участков видимо здоровой кожи. В контрольной группе отпечатки брали с того же биотопа. Посев отпечатков проводили на 10% кровяной агар и на среду Columbia фирмы BioMerieux. Время аппликации составляло 40 секунд. Посевы инкубировали в термостате при 37 °С в течение 48 часов. Выросшие колонии подсчитывали и окрашивали по Граму. Для идентификации чистой культуры стафилококков использовали тест на выявление плазмокоагулазы с учетом лецитовителазы, продуцируемой на желточно-солевом агаре.

По числу выросших колоний (степени обсемененности кожи) определяли уровень аутомикрофлоры кожи (АМФК) больных и доноров. Было выделено 4 группы: с нормальным уровнем (<20 КОЕ/отпечаток); с повышенным уровнем (21-100 КОЕ/отпечаток); с высоким (100 КОЕ/отпечаток) и с очень высоким уровнем АМФК (сплошной рост).

Микробную обсемененность кожи изучали также при помощи контактных слайдов Envirocheck® Contact YM (R), которые предназначены для обнаружения дрожжей и плесеней, а также допускающие рост некоторых бактерий — Escherichia coli, Staphylococcus aureus, S. cerevisiae и Pseudomonas aeruginosa. Отпечатки у больных брали с поверхности очагов псориаза и с видимо здоровой кожи, а также у лиц контрольной группы. В качестве биотопа было выбрано правое предплечье. С каждого биотопа отпечатки брали как на среду с агаром с хлорамфениколом, так и с бенгальским розовым. Время аппликации составляло 40 секунд. Посевы инкубировали в течении 48 часов при температуре 37 °С (условия, при которых культивируются только бактерии). По количеству выросших на слайде колоний было выделено 4 группы: менее 60 КОЕ/отпечаток — нормальный уровень(104); 60-100 КОЕ/отпечаток — повышенный

уровень(105); более 100 КОЕ/ отпечаток— высокий уровень(106); сплошной рост — очень высокий уровень(107) АМФК.

Оценку врожденного иммунитета больных псориазом проводили с применением реакции иммуноприлипания (Смирнова A.M., 1975; Пустовалова H.A., 1975; Быков A.C. 1986). Реакция основана на активации системы комплемента корпускулярными антигенами (бактериями, вирусами), обработанными сывороткой крови. В результате активированный компонент комплемента (СЗЬ) присоединяется к корпускулярному антигену в составе иммунного комплекса.

Обследовано 58 больных псориазом в возрасте от 20 до 63 лет, из них 11 — с эритродермической формой псориаза, 47 — с вульгарным псориазом, у 20 из которых имелся псориатический артрит, 27 — без псориатического артрита. У всех больных с эритродермической формой псориаза отмечался псориатический артрит. Контрольную группу составили 20 практически здоровых доноров. Исходная характеристика обследованных больных представлена в таблице 2.

Таблица 2. Исходная характеристика больных (п=58)

Особенности распределения Число больных - п (%)

Распределение по полу: мужчины женщины 34 (59%) 24 (41%)

Клинические формы псориаза: вульгарный псориаз: -наличие псориатического артрита -отсутствие псориатического артрита псориатическая эритродермия 47 (81%) 20 (43%) 27 (57%) 11 (19%)

Материалом для исследования были образцы цельной крови больных псориазом и лиц контрольной группы. РИП ставили в новой модификации с разведениями сыворотки крови больных (титрационный вариант), которая давала сходные результаты при использовании как стафилококков, так и эшерихий, что свидетельствовало о неспецифичности реакции. Постановка РИП заключалась в 10 мин. инкубации (при 37°С) золотистого стафилококка (Wood 46) с разведениями сыворотки крови больного и последующим

добавлением отмытых эритроцитов этого же больного. Учёт реакции проводили через 30-50 минут после добавления эритроцитов. К этому сроку в положительных пробах наблюдали склеивание эритроцитов в виде фестончатых зонтиков, как и в реакции пассивной гемагглютинации. Постановку реакции сопровождали контролем: 1) контроль из смеси эритроцитов и взвеси суточной культуры золотистого стафилококка; 2) контроль из смеси изотонического раствора хлорида натрия и взвеси эритроцитов; 3) контроль из смеси разведенной сыворотки крови и эритроцитов.

Электронномикроскопическое исследование. В работе использовали продукт реакции иммуноприлипания с использованием Staphylococcus aureus штамм Wood-46, полученного из ГИСК им. JI.A. Тарасевича. Для получения ультратонких срезов применяли глютаральдегид-осьмиевую фиксацию с использованием фосфатного или Na-кокадилатного буфера с учетом соответствующих рекомендаций (Быков А.С. и соавт., 1981), что позволило выявить как структуры бактерий, так и структуры тканей. Фиксированные и обезвоженные объекты заключали в эпоксидные смолы, или другие полимеры, с последующей полимеризацией. Полученные на ультрамикротоме LKB ультратонкие срезы объекта контрастировали и снимали в электронном микроскопе JEM-100В.

Статистическая обработка результатов исследования. Достоверность различия частот определяли при помощи критерия «хи-квадрат». Доверительные границы к частотам рассчитывали на основании биномиального распределения. Для анализа вирусных нагрузок рассчитывали десятичный логарифм количества вирусов, анализ его связи с другими переменными проводили с использованием метода параметрической статистики: достоверность различий средних по группам вычисляли с помощью дисперсионного анализа, а доверительные границы к среднему - на основе распределения Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ Выявление ДНК ВПЧ рода beta у больных псориазом

В исследование были включены 69 образцов псориаза (соскобы). В качестве контроля использовали 46 биоптатов нормальной кожи здоровых добровольцев, у которых кожные заболевания, в том числе, ассоциированные с кожными типами ВПЧ, отсутствовали. Обследование проводили в два этапа. Первоначально все образцы кожи больных псориазом и контрольной группы были протестированы на присутствие ДНК ВПЧ рода beta. В дальнейшем проводили количественный анализ ВПЧ-положительных образцов псориаза и нормальной кожи, заключавшийся в определении вирусной нагрузки ВПЧ и нормировании количества геномов ВПЧ на ДНК человека. В таблице 3 представлены результаты обследования больных псориазом и лиц контрольной группы (нормальная кожа) на наличие ДНК ВПЧ рода beta.

Таблица 3. Частота обнаружения ДНК ВПЧ рода beta в псориатических бляшках и нормальной коже

Кол-во Количество Количество

Объект исследования образцов ВПЧ- ВПЧ +

образцов образцов

Абс. % Абс. %

Псориатические бляшки 69 9 13,0 60 87,0*

Нормальная кожа 46 26 56,3 20 43,7

Всего 115 35 27,0 80 73,0

*р<0,001 по сравнению с образцами здоровой кожи

Как видно из таблицы 4, ДНК ВПЧ обнаруживалась в 2 раза чаще у больных псориазом по сравнению с контрольной группой (р<0,001). ДНК ВПЧ удавалось выявить независимо от возраста, пола больных, а также от длительности заболевания. Оценка частоты обнаружения ДНК ВПЧ рода beta в зависимости от клинической формы псориаза выявила, что ее наличие несколько чаще удавалось зарегистрировать у больных эритродермией по

сравнению с страдавшими вульгарным псориазом (94,7% и 84,0%, соответственно).

28 больным вульгарным псориазом проводили исследование, направленное на выявление ДНК ВПЧ рода beta как в псориатических бляшках, так и на участках видимо здоровой кожи. Более чем в половине исследованных образцов (54%) ДНК ВПЧ рода beta удавалось выявить как в псориатической бляшке, так и на видимо здоровой коже. Почти в 40% образцов наличие ДНК ВПЧ рода beta регистрировалось в псориатических бляшках, но отсутствовало в здоровой коже. Лишь в 2 (7%) образцах ДНК ВПЧ рода отсутствовала как в псориатических бляшках, так и в видимо здоровой коже.

С учетом того, что группоспецифический формат методики ПЦР позволял дифференцированно выявлять beta 1, beta 2, beta 3, beta 4-5 виды ВПЧ, мы проанализировали данные о частоте их обнаружения и ассоциации в образцах псориаза и нормальной кожи. Результаты приведены в таблице 4. Таблица 4. Сравнительная частота обнаружения различных видов ВПЧ рода beta при псориазе и нормальной коже

Диагноз Кол-во ВПЧ+ образцов Виды ВПЧ

beta-Г (%) beta-2* (%) beta-3* (%) beta-4,5* (%)

Псориаз (п=69) 60 34 (49,3) 39 (56,5) 31 (44,9) 31 (44,9)

Нормальная кожа (п=46) 20 5(10,9) 10 (47,0) 15(32,6) 11 (23,9)

*в том числе в ассоциации с другими видами ВПЧ

В результате проведенного анализа было установлено, что как в псориатических бляшках, так и нормальной коже выявлялся широкий спектр ВПЧ рода beta, представленный beta 1, beta 2, beta 3, beta 4-5 видами. В образцах псориаза папилломавирусы beta 1 и beta 2 видов встречались более чем в 4 раза чаще, (р<0,05), а представители beta 4, 5 видов- почти в 2 раза чаще, чем в нормальной коже. При анализе частоты выявления ассоциации

видов ВПЧ рода beta при псориазе и нормальной коже было установлено, что 85% образцов кожи больных псориазом демонстрировали сочетание 2-х и более видов ВПЧ рода beta. Один вид ВПЧ выявлялся лишь в 15% образцов. В здоровой коже представителей контрольной группы, напротив, 4/5 исследованных образцов показали присутствие ДНК только одного представителя ВПЧ рода beta; различие с частотой обнаружения ассоциации ДНК 2-х и более видов ВПЧ рода beta оказалось статистически достоверным

Око,01).

Вместе с тем, с учетом широкой распространенности ВПЧ как при псориазе, так и в нормальной коже, сам факт обнаружения ДНК отдельных представителей этого семейства, очевидно, не может быть интерпретирован однозначно. Помимо собственно выявления ДНК ВПЧ, необходимо учитывать количество вирусных частиц, приходящихся на одну эпителиальную клетку, описываемое показателем вирусной нагрузки. Определение количества ДНК ВПЧ в исследуемом материале (вирусной нагрузки в коже), очевидно, позволит в большей степени дифференцировать патогенетически обоснованные ассоциации от бессимптомной персистенции В связи с этим следующим этапом нашего исследования стал количественный анализ, включающий определение вирусной нагрузки вирусной нагрузки в ВПЧ-положительных образцах кожи больных псоризом в сопоставлении с образцами нормальной кожи и нормирование количества ДНК ВПЧ на количество клеток, позволяющее косвенно доказать связь динамики вирусной нагрузки с клеточной пролиферацией. Определение вирусной нагрузки ВПЧ рода beta при псориазе В данной части работы использовались 60 ВПЧ-положительных образцов кожи 69 больных псориазом. Контрольная группа была представлена 20 ВПЧ-положительными образцами кожи, взятыми от здоровых добровольцев. Данные, полученные в ходе определения вирусной нагрузки ВПЧ в очагах псориаза и нормальной коже представлены в табл. 5 в десятичных логарифмах. В отличие от группы больных псориазом, у здоровых

преобладали сравнительно низкие значения вирусной нагрузки, констатированные более чем в 80% образцов. Средние значения вирусной нагрузки (2-3 log ДНК ВПЧ на 105 клеток) были зарегистрированы лишь в 17,4% образцов кожи здоровых людей и в 44,7% образцах кожи пациентов, страдавших псориазом. Высокие (>3 log ДНК ВПЧ на 105 клеток) значения вирусной нагрузки в образцах здоровой кожи не определялись вообще, в то время как частота их обнаружения в образцах кожи больных псориазом достигала почти 15%.

Таблица 5. Результаты определения вирусной нагрузки (десятичный логарифм ДНК ВПЧ на 105 клеток человека) в образцах псориаза и нормальной кожи.

Материал Кол-во исследованных образцов Кол-во ВПЧ + образцов Вирусная нагрузка (log ДНК ВПЧ на 105 клеток)

<2 2-3 >3

Псориаз 69 60 (87%) 40,4 % 44,7% 14,9%

Нормальная кожа 46 20 (43%) 82,6 % 17,4% 0,0

Вирусная нагрузка в образцах кожи больных псориазом более чем в 2 раза превышала таковую в образцах здоровой кожи и это различие оказалось статистически достоверным. Кроме того, была проведена оценка динамики вирусной нагрузки в зависимости от стадии клинического течения псориаза. В прогрессирующую стадию псориаза не было зарегистрировано случаев, когда ДНК ВПЧ не определялось вообще, в то время как в период регресса высыпаний ее не удавалось обнаружить у % обследованных пациентов. Вирусная нагрузка, составлявшая > 2 log ДНК ВПЧ на 105 клеток, в прогрессирующую стадию псориаза отмечалась в 4,5 раза чаще, чем в ремиссию заболевания (р<0,01).

На рисунке 1 представлена динамика вирусной нагрузки ДНК ВПЧ в периоды прогрессирующей и регрессирущей стадий псориаза индивидуально у каждого из 16 обследованных больных. Ни у одного из них в период

регресса высыпаний вирусная нагрузка ДНК ВПЧ не возрастала по сравнению с прогрессирующей стадией псориаза. Более того, у 4 из 16 больных в стадии регресса высыпаний вирусная нагрузка ДНК ВПЧ снижалась до значений, находившихся ниже порогового уровня. Рис. 1. Динамика вирусной нагрузки ВПЧ у больных псориазом в прогрессирующую и регрессирующую стадии псориаза

вирусная нагрузка 3

2,5

щШшшШ

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

число наблюдений

Прогрес.

С Регресс.

Таким образом, в результате количественный анализа вирусной нагрузки ДНК ВПЧ можно констатировать, что этот показатель у больных псориазом оказывается достоверно выше, чем у здоровых из группы контроля. Кроме того, вирусная нагрузка ДНК ВПЧ достоверно снижается в стадию регресса высыпаний по сравнению с показателем, оцененным в прогрессирующей стадии псориаза.

Показатели теста оценки аутомикрофлоры кожи (АМФК)

Результаты оценки АМФК у больных псориазом в сопоставлении со здоровыми лицами из группы контроля представлены в таблице 6. Сплошной рост коагуланозонегативных стафилококков был отмечен только в очагах и видимо здоровой коже больных псориазом, но не у здоровых представителей контрольной группы. Повышенный и высокий рост коагуланозонегативных стафилококков регистрировался преимущественно в псориатических очагах. Более чем у 70% здоровых людей показатель АМФК оставался в пределах

нормальных значений. В очагах псориаза частота регистрации нормальной АМФК не достигала 25%.

Таблица 6. Показатель АМФК (число коагулазонегативных стафилококков) в группе больных псориазом (п= 69) и лиц контрольной группы (п= 46)

Показатель АМФК Очаги псориаза Видимо здоровая кожа больных псориазом Контроль

Абс. % Абс. % Абс. %

Нормальный (до 20 КОЕ/отпечаток) 16 23 39 57 33 71,5

Повышенный (21-100 КОЕ/отпечаток) 41 60 20 30 10 22,5

Высокий (более 100 КОЕ/отпечаток) 7 10 7 10 3 6

Очень высокий (сплошной рост) 5 7 2 3 - -

Частота обнаружения повышенного уровня обсемененности Staphylococcus aureus в псориатических очагах более чем в 4,5 раза превосходила видимо здоровую кожу больных псориазом, высокого роста -более чем в 6 раз. Повышенный и высокий рост Staphylococcus aureus у здоровых из группы контроля не регистрировался вообще. Повышенный и высокий рост стафилококков преобладал как при вульгарном псориазе (58,7% и 7,8% соответственно), так и при псориатической эритродермии (61,1% и 22,2% соответственно). Сплошной рост стафилококков при вульгарном псориазе и при псориатической эритродермии обнаруживался в псориатических очагах и в 5,5% случаев на участках видимо здоровой кожи больных псориатической эритродермией.

У 16 больных псориазом была оценена динамика уровня Staphylococcus aureus в прогрессирующую и регрессирующую стадию псориаза. У 1/4 больных в прогрессирующую стадию уровень обсемененности Staphylococcus aureus оказался повышенным, у I больного - высоким. Частота обнаружения повышенного уровня обсемененности Staphylococcus aureus в псориатических очагах в период регресса высыпаний снижалась на

6,5%. Высокий уровень обсемененности Staphylococcus aureus в регрессирующую стадию в псориатических бляшках зарегистрировать не удавалось. Повышенный и высокий уровень микробной обсемененности Staphylococcus aureus в образцах видимо здоровой кожи больных псориазом не были отмечены ни в прогрессирующую, ни в регрессирующую стадии псориаза. По сравнению с прогрессирующей стадией псориаза, в период регресса высыпаний частота выявления нормального уровня АМФК, оцененного по росту Staphylococcus aureus, в видимо здоровой коже возрастала на 6,5%, в псориатическом очаге - увеличивалась в 2 раза (таблица 7).

Таблица 7. Уровень Staphylococcus aureus в прогрессирующую и регрессирующую стадии псориаза (п=16)*

Показатель АМФК прогрессирующая стадия регрессирующая стадия

очаг здоровая кожа очаг здоровая кожа

Нормальный 2 (12,5%) 4 (25%) 4 (25%) 5(31,5%)

Повышенный 4 (25%) - 3(18,5%) -

Высокий 1 (6,2%) - - -

* сплошного роста не выявляли

Вирусно-бактериальные ассоциации при псориазе

Для оценки вирусно-бактериальных ассоциаций было проведено сопоставление вирусной нагрузки ДНК ВПЧ в зависимости от величины показателя АМФК у больных псориазом в сравнении со здоровыми людьми из группы контроля (таблица 8). Оказалось, что при высоком и очень высоком показателе АМФК вирусная нагрузка в образцах кожи, полученных из псориатических бляшек, составляла 2-3 log ДНК ВПЧ на 105 клеток, в то время как при нормальном и повышенном - не превышала 2 log ДНК ВПЧ на 105 клеток.

В контрольной группе здоровых людей величины вирусной нагрузки, составлявшие более 2 log ДНК ВПЧ на 105 клеток, не регистрировались

вообще. Более чем у 85% представителей контрольной группы величина вирусной нагрузки не достигала 1 log ДНК ВПЧ на 105 клеток. Диапазон величин вирусной нагрузки от 1 до 2 log ДНК ВПЧ на 105 клеток был отмечен только у 6 из 46 здоровых лиц контрольной группы. Динамика АМФК и вирусной нагрузки в прогрессирующую и регрессирующую стадии псориаза носила, в целом, однонаправленный характер (таблица 9). Высокие вирусная нагрузка ДНК ВПЧ и показатель АМФК были в большей степени свойственны прогрессирующей стадии псориаза.

Таблица 8. Взаимосвязь вирусной нагрузки и уровня АМФК при псориазе

Вирусная нагрузка (log ДНК ВПЧ на 105 клеток)

Показатель АМФК Псориаз Контрольная группа

(п=69) (п=46)

нормальный 1-2 (п=34) < 1 (п=40)

повышенный 1-2 (п=10) 1-2 (п=6)

высокий 2-3 (п=19) -

очень высокий 2-3 (п=6) -

Таблица 9. Взаимосвязь динамики вирусной нагрузки ДНК ВПЧ и АМФК в прогрессирующую и регрессирующую стадии псориаза

Стадия псориаза Вирусная нагрузка (log ДНК ВПЧ на 105 клеток) Показатель АМФК*

не определяется 1-2 >2 нормальный повышенный высокий

Прогресс. - 7(43,7) 9 (56,3) 5(31,5%) 8 (50%) 3 (18,5%)

Регрересс. 4(25) 10 (62,5) 2 (12,5) 6 (37,5%) 8 (50%) 2 (12,5%)

* сплошного роста не выявляли

Оценка врожденного иммунитета больного с применением реакции иммуноприлипания

Реакция иммуноприлипания была выполнена у 58 больных с псориазом в первый день после поступления и на фоне лечения спустя 14 дней с момента поступления (рис.2).

Рис. 2. Реакция иммуноприлипания у больных псориазом (исходно, п=58) в сопоставлении со здоровым контролем (п=20)

50 45

I

40

!35 £ зо

л

5 25

□ контроль ■ псориаз

о 20 с

10 20 4 0 80 160 320 640 1280

РИП (тигры)

При постановке реакции в первый день после поступления у больных псориатической эритродермией гемагглютинация наблюдалась в пределах титров сывороток 1:10-1:20, а у больных вульгарным псориазом- 1:40 -1:320, из которых лиц с суставным синдромом гемагглютинация наблюдалась в пределах титров сывороток 1:40-1:80, у больных без суставного синдрома - 1:160 - 1:320. При повторной постановке реакции иммуноприлипания на фоне лечения через 14 дней у больных псориатической эритродермией гемагглютинация наблюдалась при прежнем титре сывороток. У больных вульгарным псориазом в целом отмечалось повышение показателей реакции иммуноприлипания. При вульгарном псориазе с псориатическим артритом данные показатели увеличивались до уровня 1:160 против значений, отмеченных у представителей контрольной группы, и у больных без псориартрического артрита. У здоровых людей гемагглютинация наблюдалась в пределах титров - 1:640-1:1280 (рис 2).

22

ВЫВОДЫ

1. ДНК вирусов папилломы человека кожных типов обнаруживается в 87,0% образцах кожи больных псориазом (в 94,7% — при псориатической эритродермии, в 84,0% — при вульгарном псориазе) и в 43,7% образцов кожи здоровых людей (р<0,001). В 85,0% образцов кожи больных псориазом выявляется ассоциация нескольких видов кожных вирусов папилломы человека; частота обнаружения вируса папилломы человека вида beta 1 достоверно превосходит таковую в нормальной коже (49,3% и 10,9%, соответственно, р<0,05).

2. Вирусная нагрузка кожными вирусами папилломы человека в псориатических бляшках достоверно выше, чем в образцах кожи здоровых людей (2,0±1,2 log ДНК на 105 клеток и 0,9±0,7 log ДНК на 105 клеток, соответственно, р<0,001). В прогрессирующую стадию псориаза вирусная нагрузка кожными вирусами папилломы человека возрастает, в регрессирующую — снижается (у 25% больных менее нижней границы определяемых значений).

3. Нарушения аутомикрофлоры кожи наиболее выражены в псориатических очагах по сравнению с видимо здоровой кожей больных псориазом и образцами кожи здоровых лиц. В прогрессирующую стадию псориаза наблюдается повышение числа колониеобразующих единиц Staphylococcus aureus, свидетельствующее об усугублении нарушений аутомикрофлоры. Регресс псориатических высыпаний сопровождается увеличением частоты обнаружения нормального количества колониеобразующих единиц Staphylococcus aureus, отражающего коррекцию кожной аутомикрофлоры, в псориатических очагах в 2 раза, в видимо здоровой коже больных псориазом — в 2,5 раза.

4. Увеличение вирусной нагрузки кожными вирусами папилломы человека в псориатических бляшках сопряжено с нарастанием нарушений аутомикрофлоры кожи, регистрируемым по увеличению числа колониеобразующих единиц стафилококков.

5. Титры сывороток, в которых отмечается гемагглютинация в реакции иммуноприлипания, различаются в зависимости от клинической формы псориаза, составляя при псориатической эритродермии 1:10 -1:20, при вульгарном псориазе - 1:40 - 1:320, в том числе при псориатическом артрите 1:40-1:80 и у больных без псориатического артрита- 1:160 - 1:320. У здоровых представителей контрольной группы гемагглютинация наблюдается в пределах титров 1:640 - 1:1280.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определение вирусной нагрузки кожными вирусами папилломы человека у больных псориазом целесообразно проводить с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с исследованием как образцов кожи, полученных из псориатических очагов, так и из образцов видимо здоровой кожи.

2. Выявление нарушений аутомикрофлоры кожи при псориазе следует осуществлять, исходя из выявленного числа колониеобразующих единиц коагулазонегативных стафилококков и Staphylococcus aureus.

3. При резистентном к стандартным схемам лечения псориазе обосновано повторное определение степени обсемененности стафилококкоми пораженных и здоровых участков кожи.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кладова А.Ю., Куевда Д.А., Молочков В.А., Шипулина О.Ю., Козлова (Фомина) Е.С., Прокофьев А.А. Количественное определение вируса папилломы человека (ВПЧ) в эпителиальных образованиях и других пролиферативных заболеваниях кожи. II VI научно-практическая конференция «Социально значимые заболевания в дерматовенерологии. Диагностика, терапия, профилактика». — М.- 2006.- С. 74-75;

2. Кладова А.Ю., Куевда Д.А., Молочков В.А., Шипулина О.Ю., Киселев В.И., Хлебникова А.Н., Козлова (Фомина) Е.С. Встречаемость кожных типов вируса папиллом человека в патологиях кожи. // Альманах клинической медицины. - 2006. - Том IX. - С. 44-50;

3. Kladova A., Kuevda D., Molochkov V., Pokrovskii V., Shipulina O., Kozlova (Fomina) E. Human papillomavirus -DNA loads in skin pathologies and normal skin. // Abstract in 23-d international papillomavirus conference and clinical workshop. - Prague, 2006. - P. 185;

4. Козлова (Фомина) E.C., Быков A.C., Кладова А.Ю., Куевда Д.А. Изучение некоторых вирусо-бактериальных ассоциаций при псориазе. // Альманах клинической медицины. - 2007. - Том XV. - С. 191-194;

5. Кладова А.Ю., Куевда Д.А., Молочков В.А., Шипулина О.Ю., Козлова (Фомина) Е.С., Прокофьев A.A. Определение вирусов папилломы человека (ВПЧ) рода beta в патологиях и нормальной коже. // Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М. - 2007. - С.47;

6. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии.// Под ред. A.C. Быкова, А. А. Воробьева, В.В. Зверева. -М.: МИА, 2008. - 122123 с.

7. Козлова (Фомина) Е.С., Быков A.C., Молочков В.А., Кладова А.Ю., Николаева С.А. Изучение некоторых вирусо-бактериальных ассоциаций при псориазе. // Материалы научно-практической конференции «Актуальные проблемы дерматологии», посвященной 75-летию кафедры дерматовенерологии Самарского университета и 115-летию со дня рождения A.C. Зенина. -Самара.-2008,- С. 61-62;

8. Быков A.C., Козлова (Фомина) Е.С., Кладова А.Ю., Молочков В.А. Нарушение местного иммунитета и бактериально-вирусных ассоциаций при псориазе. // Материалы конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии». - 2008. - М. - С. 79-83;

9. Быков A.C., Козлова (Фомина) Е.С., Кладова А.Ю., Молочков В.А. Бактериально-вирусные ассоциации при местных нарушениях иммунитета при псориазе. // Российский журнал кожных и венерических болезней. -2008. - № 6. - С. 24-28.

Подписано в печать 26.02.2009 г. Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: (495) 7В5-00-38 www.autoref.webstolica.ru

Актуальность проблемы

Состояние нормальной микрофлоры человека является одним из важных показателей здоровья организма. Количественные и видовые изменения в составе нормофлоры могут сопровождаться как развитием угрожающих жизни заболеваний, так и манифестацией болезней, исходно протекавших субклинически [Митрохин С.Д.,1998; Шендеров Б.А., 1998; Finegold S.M. et al., 1983].

В настоящее время псориаз является одним из наиболее распространенных хронических заболеваний кожи; заболеваемость им продолжает непрерывно возрастать [Молочков В.А. и соавт., 2007; Топорова Н.П. и соавт., 1997; Чистяков И.А., 1997; Henseler Т., 1997; Schafer Т. et al., 1996). Имеются данные о том, что некоторые микробные агенты, в том числе S. aureus, S. pyogenes, Е. coli, могут играть триггерную роль в отношении псориаза [Abeck С., 1992; Aly R. et al., 1976; Leung D.Y. et al., 1993; Tefer N.R. et al., 1992]; при этом большее значение придают не столько очагам фокальной инфекции, сколько массивной микробной контаминации кожи микробными агентами. Так, продемонстрировано, что у больных псориазом численность стафилококков в очагах в 20 раз превосходит таковую на участках непораженной кожи [Noble W.C., 1998].

Высказывается предположение о том, что наряду с бактериями, развитие псориаза может быть связано также с вирусом папилломы человека (ВПЧ) [Pfister Н., 2003]. Среди почти 200 типов ВПЧ выделяют не только слизистые, но и кожные типы, которые также как и ВПЧ слизистого типа, подразделяют на группы низкого и высокого онкогенного риска. Непосредственное участие ВПЧ в кожном канцерогенезе было впервые установлено на примере ВПЧ-5 и ВПЧ-8, ассоциирующихся с верруциформной эпидермодисплазией Левандовского-Лютца с развивающимся в последующем на фоне этого заболевания плоскоклеточным раком кожи, формирование которого обусловливала интеграция в геном клетки ВПЧ 9, 12, 15, 17, а также 19 — 25 типов [zur Hausen Н., 1996]. ДНК ВПЧ может быть обнаружена и в образцах здоровой кожи, но частота ее выявления достоверно возрастает у лиц с иммуносупрессией [Boxman I.L. et al., 1999; Harwood С.A. et al., 2000; Stockfleth E. et al., 2004; Weissenborn S.J. et al., 1999].

Взаимосвязи репликации кожных ВПЧ с течением псориаза изучены менее подробно. Тем не менее, установлено, что частота обнаружения ВПЧ-5 на коже псориатических бляшек более чем двукратно превосходит таковую в образцах видимо здоровой кожи [Prignano G. et al., 2003]. Показано, что частота обнаружения ВПЧ 5, 36, 38 типов в псориатических очагах может достигать 90%. Кроме того, отмеченное Н. Pfister et al. (2003) более чем пятикратное повышение сывороточного титра антител к ВПЧ-5 и ВПЧ-8 у больных псориазом в сопоставлении со здоровыми людьми косвенно свидетельствует в пользу участия ВПЧ в патогенезе местных иммунологических кожных нарушений при псориазе. Частота обнаружения ВПЧ-5 и ВПЧ-8 достигает максимума также после высокодозовой PUVA-терапии, сопровождающейся локальной иммуносупрессией [Wolf P. et al., 2003].

Таким образом, повышенная репликация определенных типов кожных ВПЧ, отражая присущие псориазу нарушения локального кожного иммунитета, может также служить маркером интенсивности патологической пролиферации кератиноцитов в псориатических очагах. В связи с этим особую актуальность приобретает изучение взаимосвязи оцененной с помощью высокочувствительных методов кожной вирусной нагрузки кожными ВПЧ с другими показателями, отражающими расстройства кожного локального иммунитета, в частности, нарушениями аутомикрофлоры кожи, регистрируемыми исходя из количества персистирующих стафилококков. Результатом изучения кожных бактериально-вирусных ассоциаций при псориазе может стать углубление представлений о формировании и прогрессировании псориаза с возможным в дальнейшем расширением возможностей его патогенетически обоснованного лечения.

Цель исследования: изучить связь кожных вирусов папилломы человека с нарушениями аутомикрофлоры кожи при псориазе. Задачи исследования:

1. Оценить частоту обнаружения ДНК ВПЧ в псориатических очагах.

2. Определить вирусную нагрузку ВПЧ в очагах псориаза и на участках видимо здоровой кожи и изучить ее динамику в зависимости от клинического течения и формы псориаза.

3. Изучить обсемененность стафилококками пораженных и здоровых участков кожи больных псориазом с оценкой ее динамики в зависимости от клинического течения и формы псориаза, а также состояния врожденного иммунитета, оцениваемого с помощью реакции иммуноприлипания.

4. Сопоставить динамику микробной обсеменениости и вирусной нагрузки ВПЧ в зависимости от клинического течения псориаза.

Научная новизна

Впервые проведено определение кожных типов ВПЧ рода Betapapillomavirns с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени у больных псориазом. На основе количественного анализа впервые детально изучена ассоциация клинического течения псориаза с ВПЧ рода Betapapillomavirus. Также подробно описано изменение вирусной нагрузки ВПЧ в зависимости от динамики клинического течения псориаза.

Для оценки врожденного иммунитета организма у больных псориазом в сопоставлении со здоровыми лицами применен тест для определения уровня аутомикрофлоры кожи (АМФК) в отношении Staphylococcus aureus с помощью контактных слайдов Envirocheck® Contact YM (R). Впервые проанализирована взаимосвязь динамики величины вирусной нагрузки ВПЧ рода

Betapapillomavirus и степени микробной обсемененности в зависимости от морфофункционального состояния кожи больных псориазом, динамики клинического течения псориаза и клинической формы. Также впервые проведена оценка врожденного иммунитета больных псориазом с применением реакции иммуноприлипания в титрационном варианте.

Практическая значимость

Результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что расстройства локального кожного иммунитета, наблюдающиеся при псориазе и достигающие максимальной выраженности в период его обострения, могут быть диагностированы по увеличению вирусной нагрузки ВПЧ в псориатических очагах и усугублению нарушений аутомикрофлоры кожи, регистрируемому по нарастанию обсемененности кожи стафилококками. Данные показатели могут быть использованы для выявления нарушений локального кожного иммунитета у пациентов, страдающих псориазом, а также мониторирования течения этого заболевания, в том числе в качестве доклинических маркеров его обострений. Определение их обосновано, в первую очередь, у больных псориазом, резистентным к стандартным терапевтическим схемам, а также при решении вопроса о включении в программу ведения антибактериальных и противовирусных препаратов. Детекция нарушений аутомикрофлоры кожи как неинвазивный метод выявления расстройств локального кожного иммунитета может применяться при динамическом наблюдении больных псориазом.

Положения, выносимые на защиту

1. У больных псориазом часто удается обнаружить наличие ВПЧ рода Betapapillomavirus в псориатических очагах, при этом концентрация ДНК ВПЧ рода Betapapillomavirus при псориазе достоверно превосходит таковую у бессимптомных носителей ВПЧ.

2. Существует взаимосвязь между динамикой вирусной нагрузки ВПЧ и стадией клинического течения псориаза.

3. Изменения показателей, характеризирующих состояние аутомикрофлоры кожи, коррелируют с динамикой вирусной нагрузки ВПЧ у больных псориазом.

4. Диагностическая значимость теста с применением контактных слайдов Envirocheck® Contact YM (R), описывающего аутомикрофлору кожи (АМФК), и диагностическая значимость теста «Бактотест» сопоставимы.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании Московского областного общества дерматовенерологов, Москва, 2007г., 2008г.; на 14-ой международной специализированной выставке «Аптека» 23 - 26 октября 2007г., Москва, СК «ОЛИМПИЙСКИЙ»; 23rd INTERNATIONAL PAPILLOMAVIRUS CONFERENCE & CLINICAL WORKSHOP 2006 Prague, September 1-7 2006r.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, выводов и библиографического указателя. Указатель литературы включает 37 отечественных и 123 зарубежных работ. Работа иллюстрирована 13 рисунками и 18 таблицами.

выводы

1. ДНК вирусов папилломы человека кожных типов обнаруживается в 87,0% образцах кожи больных псориазом (в 94,7% — при псориатической эритродермии, в 84,0% — при вульгарном псориазе) и в 43,7% образцов кожи здоровых людей (р<0,001). В 85,0% образцов кожи больных псориазом выявляется ассоциация нескольких видов кожных вирусов папилломы человека; частота обнаружения вируса папилломы человека вида beta 1 достоверно превосходит таковую в нормальной коже (49,3% и 10,9%, соответственно, р<0,05).

2. Вирусная нагрузка кожными вирусами папилломы человека в псориатических бляшках достоверно выше, чем в образцах кожи здоровых людей (2,0±1,2 log ДНК на 105 клеток и 0,9±0,7 log ДНК на 105 клеток, соответственно, р<0,001). В прогрессирующую стадию псориаза вирусная нагрузка кожными вирусами папилломы человека возрастает, в регрессирующую — снижается (у 25% больных менее нижней границы определяемых значений).

3. Нарушения аутомикрофлоры кожи наиболее выражены в псориатических очагах по сравнению с видимо здоровой кожей больных псориазом и образцами кожи здоровых лиц. В прогрессирующую стадию псориаза наблюдается повышение числа колониеобразующих единиц Staphylococcus aureus, свидетельствующее об усугублении нарушений аутомикрофлоры. Регресс псориатических высыпаний сопровождается увеличением частоты обнаружения нормального количества колониеобразующих единиц Staphylococcus aureus, отражающего коррекцию кожной аутомикрофлоры, в псориатических очагах в 2 раза, в видимо здоровой коже больных псориазом — в 2,5 раза.

4. Увеличение вирусной нагрузки кожными вирусами папилломы человека в псориатических бляшках сопряжено с нарастанием нарушений аутомикрофлоры кожи, регистрируемым по возрастанию числа колониеобразующих единиц стафилококков.

5. Титры сывороток, в которых отмечается гемагглютинация в реакции иммуноприлипания, различаются в зависимости от клинической формы псориаза, составляя при псориатической эритродермии при вульгарном псориазе - 1:40 - 1:320, в том числе при псориатическом артрите 1:40-1:80 и у больных без псориатического артрита — 1:160 - 1:320. У здоровых представителей контрольной группы гемагглютинация наблюдается в пределах титров 1:640- 1:1280.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определение вирусной нагрузки кожными вирусами папилломы человека у больных псориазом целесообразно проводить с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с исследованием как образцов кожи, полученных из псориатических очагов, так и из образцов видимо здоровой кожи.

2. Выявление нарушений аутомикрофлоры кожи при псориазе следует осуществлять, исходя из выявленного числа колониеобразующих единиц коагулазонегативных стафилококков и Staphylococcus aureus.

3. При резистентном к стандартным схемам лечения псориазе обосновано повторное определение степени обсемененности стафилококкоми пораженных и здоровых участков кожи.