Автореферат и диссертация по медицине (14.01.10) на тему:ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СТРУКТУР ВРОЖДЕННОГО И АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА В ПОРАЖЕННОЙ КОЖЕ БОЛЬНЫХ ТЯЖЕЛЫМИ ФОРМАМИ ПСОРИАЗА НА ФОНЕ СИСТЕМНОЙ АНТИЦИТОКИНОВОЙ ТЕРАПИИ (ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

На правах рукописи

КАТУНИНА Оксана Рахимовна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СТРУКТУР ВРОЖДЕННОГО И АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА В ПОРАЖЕННОЙ КОЖЕ БОЛЬНЫХ ТЯЖЕЛЫМИ ФОРМАМИ ПСОРИАЗА НА ФОНЕ СИСТЕМНОЙ АНТИЦИТОКИНОВОЙ ТЕРАПИИ (ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.01.10 - кожные и венерические болезни 14.03.02 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

005005802

Работа выполнена в отделах дерматологии и лабораторной диагностики инфекций, передаваемых половым путем, и заболеваний кожи Федерального государственного бюджетного учреждения «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные консультанты:

академик РАМН

доктор медицинских наук,

профессор

Анна Алексеевна Кубанова

доктор медицинских наук, профессор

[Александр Михайлович Вавилов|

доктор медицинских наук, профессор

Валентина Павловна Быкова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Елена Владиславовна Матушевская

доктор медицинских наук, профессор

Вероника Владимировна Мордовцева

доктор медицинских наук, профессор

Елена Леонидовна Туманова

Ведущая организация: Российский университет дружбы народов, г. Москва

Защита диссертации состоится « сР» СОС-А'р^-^С 2012 г. на заседании Диссертационного совета Д 208.115.01 йри ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцраз-вития России по адресу: 107076, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦДК» Мин-здравсоцразвития России

Автореферат разослан «_ Оъи&ЛгЪ? 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Наталия Константиновна Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Псориаз - один из тяжелых дерматозов мультифак-ториальной природы, имеющий наследственную предрасположенность. Заболевание характеризуется рецидивирующим течением с частыми обострениями (Griffiths С.Е., 2007; Lowes М.А., 2007; Скрипкин Ю.К., Бутов Ю.С., 2009; Nestle F.O., 2009; Navarini A.A., 2010). Нередко сочетается с патологией органов желудочно-кишечного тракта, сердечно-сосудистой системы, вовлечением в патологический процесс суставов (Neimann A.L., 2006; Katsambas А., 2008; Navarini A.A., 2010).

Кожные высыпания при псориазе формируются за счет гиперпролиферации и нарушения дифференцировки кератиноцитов, развития воспалительной инфильтрации в дерме, опосредованной активированными Т лимфоцитами (Liu Y.,Krueger J.G. et.al., 2007; Griffiths C.E., Barker J.N., 2007; Скрипкин Ю.К., Бутов Ю.С., 2009 и др.). Существуют данные, что появление основных патомор-фологических феноменов в очагах пораженной кожи больных псориазом (акан-тоза эпидермиса, паракератоза, микроабсцессов Мунро, воспалительной инфильтрации дермы) опосредовано биологическим эффектом продукта активированных клеток кожи - провоспалительного цитокина - фактора некроза опухоли альфа (ФНО-а) (Nickoloff B.J., 1991; Griffiths С.Е., 2007; Lin J., 2008). Относительно клеток-продуцентов ФНО-а, его рецепторов, клеток-мишеней и биологических эффектов этого цитокина, имеются многочисленные публикации в научной литературе, однако они касаются процессов, происходящих только в органах иммунной системы. Данные о степени экспрессии ФНО-а, как показателя активированного состояния клеток непосредственно в очагах пораженной кожи, в отечественной литературе отсутствуют.

Клетки кожи с разнообразными распознающими рецепторами - кератино-циты эпидермиса, антигенпрезентирующие клетки кожи (клетки Лангерганса), нейтрофильные лейкоциты, антибактериальные пептиды - относятся к структурам врожденного иммунитета и участвуют, прежде всего, в осуществлении барьерных функций. Если при внедрении патогена эти структуры не могут обес-

печить его элиминации, то врожденные механизмы защиты обеспечивают обработку патогена для взаимодействия с Т лимфоцитами с последующим развитием адаптивного иммунного ответа. (Barrai D.C., Brenner М.В., 2007; Ярилин A.A., 2010, и др.). Данные литературы о количестве клеток Лангерганса при псориазе весьма противоречивы (Deguchi M., Alba S. et. al., 2002; Lowes M.A., Chamian F. et.al., 2005). Исследования по изучению роли толл-подобных рецепторов в патогенезе псориаза в Российской Федерации не проводились.

Интерлейкин 1 (ИЛ-1) экспрессируется в коже человека для выполнения ряда физиологических функций (регуляция синтеза и деградации коллагеновых волокон и гиалуроновой кислоты в дерме и др.) (Помыткин И., 2010). В то же время известно, что ИЛ-1, обладая плейотропным характером биологической активности, регулирует все стороны воспалительной реакции. Изучение роли и функции ИЛ-1 при псориазе привело к противоречивым результатам (Cooper К, Hammerberg С. et al.,1990; Debets R., Hegmans J.P. et al., 1995; Громова А.Ю., Чаплыгин A.B. и др., 2005). Поэтому интерес к изучению экспрессии ИЛ-1 непосредственно в пораженной коже больных псориазом возникает как с позиции получения нового иммуноморфологического параметра для оценки активированного состояния клеток кожи, так и для определения эффективности лечения.

Повышенное количество Т лимфоцитов, являющихся составляющей адаптивного иммунитета, обнаруживается в дермальных воспалительных инфильтратах (Охлопков В.А., 2004; Пинсон И.Я., 2006). Циркуляция лимфоцитов между структурами кожи и регионарными лимфатическими узлами строго регулируется молекулами межклеточной адгезии (Ярилин A.A., 2009). Поэтому характеристика таких адгезивных молекул, как ICAM-1 и Е-селектин, в коже больных псориазом, несомненно, имеет большое значение для понимания механизма формирования воспалительного инфильтрата.

Существующие методы системной терапии псориаза недостаточно эффективны, так как они направлены лишь на удлинение периодов ремиссии, снижение степени тяжести заболевания и не приводят к полному излечению больных

(Nijsten Т., 2005). Повышение эффективности лечения псориаза остается одной из важных проблем дерматологии, решение которой зависит от результатов исследований, направленных на углубление знаний о механизмах патогенеза этого заболевания.

Достижения в сфере молекулярных и клеточных биотехнологий позволили разработать новый класс лекарственных препаратов, являющихся рецепторны-ми или химическими антагонистами различных медиаторов воспаления. Один из механизмов действия биологических препаратов заключается в нарушении связывания эндогенного лиганда с соответствующим рецептором, приводящем к модификации биологических реакций из-за блокирования системы внутриклеточной передачи сигнала (Jackson J.M., 2007; Козлов И.Г., 2009).

В последние годы в терапии псориаза стали использовать генно-инженерные биологические препараты (Sterry W., 2004; Purcell R.T., 2008; Nestle F.О., 2009; Navarini A.A., 2010). В России зарегистрированным и разрешенным к применению для лечения псориаза и псориатического артрита является препарат инфликсимаб (Ремикейд). По наблюдениям отечественных и зарубежных исследователей, терапия инфликсимабом у большинства больных более эффективна, чем при лечении другими системными методами терапии (Boehncke W.H., 2007; Menter А., 2007; Кубанов A.A., Матушевская Ю.И., 2008; Castelo-Soccio L., 2009; Курдина М.И., 2010). Однако инфликсимаб в терапии больных псориазом применятся сравнительно недавно, поэтому механизм реализации его терапевтической эффективности нельзя считать полностью изученным. Работы, посвященные изучению изменений морфологической картины в коже больных псориазом под влиянием терапии биологическими модификаторами иммунных реакций немногочисленны. Данные об иммуноморфологиче-ских показателях врожденного и адаптивного иммунитета в процессе биологической терапии приводятся в единичных работах.

Комплексный клинико-иммуноморфологический анализ структурной характеристики и особенностей функционирования врожденного и адаптивного иммунитета необходим для получения новых данных о механизмах развития

воспалительного процесса при псориазе и достижения эффекта терапии биологическими модификаторами иммунного ответа, что определяет актуальность, своевременность и целесообразность проведения настоящего исследования.

Цель работы: изучить роль и особенности функционирования компонентов врожденного и адаптивного иммунитета в патогенезе псориаза и оценить динамику показателей иммунного воспаления в коже больных псориазом в процессе терапии биологическим модификатором иммунного ответа - инфликсимабом. Задачи:

1. Провести оценку содержания компонентов врожденного иммунитета мор-фометрическим методом по показателям экспрессии и распределения в эпидермисе и дерме пораженной кожи больных псориазом: толл-подобных рецепторов 2, 4 и 9 типов, провоспалительных цитокинов ИЛ-1а и ФНО-а, количества клеток Лангерганса.

2. Исследовать морфометрические параметры экспрессии молекул межклеточной адгезии 1САМ-1 и Е-селектина, а также содержания компонентов адаптивного иммунитета с учетом показателей распределения в эпидермисе и дерме пораженной кожи больных псориазом субпопуляций Т-лимфоцитов (С04+, СЭ8+, С045Я0+).

3. Изучить динамику клинической картины заболевания у больных псориазом, получающих терапию инфликсимабом, по результатам ближайших и отдаленных наблюдений (по истечении 2-х месяцев и 1-го года).

4. Провести анализ динамики показателей врожденного и адаптивного иммунитета в коже больных псориазом в процессе терапии инфликсимабом.

5. Определить взаимосвязь между клиническими проявлениями на коже больных псориазом, патоморфологической картиной и показателями врожденного и адаптивного иммунитета в процессе отдаленных наблюдений.

6. Оценить прогностическую значимость показателей врожденного и адаптивного иммунитета у больных псориазом, получающих терапию инфликсимабом.

Научная новизна:

Впервые у больных псориазом проведено иммуноморфологическое исследование, включающее одновременное комплексное определение состояния структур врожденного и адаптивного иммунитета, что является новым перспективным направлением, позволяющим более эффективно изучать закономерности развития воспаления в коже больных и реализации эффективности терапии.

Результаты исследования, основанные на анализе распределения толл-подобных рецепторов разных типов, клеток Лангерганса, относящихся к структурам врожденного иммунитета, субпопуляций Т лимфоцитов, относящихся к структурами адаптивного иммунитета, молекул, обеспечивающих рекруитмент клеток адаптивного иммунитета в очаг поражения (адгезивные молекулы) и определяющих активацию клеток кожи (провоспалительные цитокины), позволили расширить представления о роли врожденного иммунитета и показать, что такие его структуры, как толл-подобные рецепторы 2 и 4 типов и клетки Лангерганса не только участвуют в запуске иммунного воспаления, но и способны регулировать интенсивность иммунной реакции в коже больных, доказательством чего является наличие корреляционной связи между этими показателями. Изучение параметров содержания компонентов врожденного и адаптивного иммунитета позволило установить, что кератиноциты эпидермиса и эндотелио-циты сосудов непосредственно участвуют в иммунных реакциях при развитии воспалительного процесса в пораженной коже больных псориазом.

Установлено, что воспалительный процесс в коже развивается при значительном увеличении молекул межклеточной адгезии 1САМ-1 (на кератиноцитах эпидермиса, эндотелиоцитах сосудов, клетках воспалительного инфильтрата) и Е-селектина (на эндотелиоцитах сосудов), необходимых для обеспечения межклеточных взаимодействий. Показано, что в коже здоровых лиц не возникает необходимости в экспрессии молекулы 1САМ-1.

Выявлены особенности экспрессии провоспалительных цитокипов в структурах пораженной кожи больных псориазом: при наличии клинических признаков воспаления установлено увеличение экспрессии ИЛ-1а на кератино-

цитах эпидермиса, эндотелиоцитах сосудов и клетках воспалительного инфильтрата, в то время как, иммуногистохимическим методом признаков экспрессии ФНО-а обнаружено не было.

Вскрыты неизвестные ранее механизмы действия инфликсимаба, заключающиеся в уменьшении экспрессии распознающих рецепторов ТЬЯ2 и ТЫ14, провоспалительного цитокина ИЛ-1а, молекул межклеточной адгезии 1САМ-1 и Е-селектина в процессе терапии. Практическая значимость работы:

Изучение показателей врожденного и адаптивного иммунитета, непосредственно в пораженном органе, в процессе антицитокиновой терапии, позволило установить, что этот метод лечения обладает стабильно нормализующим влиянием на патогенетические компоненты хронического воспаления, сопровождающимся разрешением высыпаний на коже больных. Данные, полученные в ходе исследования, позволили, в соответствии с правилами доказательной медицины, объективно оценить и обосновать эффективность терапии инфликсимабом.

Результаты исследования по определению в коже больных количества толл-подобных рецепторов 2 и 4 типов, клеток Лангерганса, молекул межклеточной адгезии, провоспалительного цитокина ИЛ-1а, основных субпопуляций Т лимфоцитов, в перспективе могут быть использованы для научно-обоснованной оптимизации существующих методов системной терапии и являются основой для разработки новых методов лечения псориаза, а также в исследованиях, ориентированных на поиск антигенов, вызывающих развитие иммунного воспаления у больных псориазом. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Защитные функции кожи, находящейся в непрерывном взаимодействии с внешней средой, и развитие иммунного воспаления при псориазе осуществляются одними и теми же структурами врожденного иммунитета: толл - подобными рецепторами 2 и 4 типов и клетками Лангерганса. Разница между этими процессами заключается в количестве, различном рас-

пределении в компартментах кожи и степени активации структур. Патофизиологическая стадия при развитии воспалительного процесса у больных псориазом сопровождается увеличением числа активированных структур врожденного иммунитета, о чем свидетельствует повышение экспрессии распознающих рецепторов TLR2 и TLR4 и количества анти-генпрезентирующих клеток Лангерганса (CD 1а) в эпидермисе и дерме пораженной кожи.

2. Формирование воспалительных инфильтратов в пораженной коже больных псориазом происходит на фоне увеличения экспрессии адгезивных молекул ICAM-1 и Е-селектина, которые в коже у здоровых лиц продуцируются в незначительном количестве.

3. Связывание провоспалительного цитокина ФНО-а при введении инфлик-симаба приводит к существенному уменьшению числа толл-подобных рецепторов, количества активированных клеток адаптивного иммунитета, адгезивных молекул в коже. В то же время, в разрешающихся высыпаниях количество активированных клеток Лангерганса остается повышенным, что является предрасполагающим фактором, способствующим обострению патологического процесса.

4. Появление в отдаленном периоде папулезных элементов у больных псориазом, получающих инфликсимаб сопровождается увеличением числа CD4+ и CD8+ лимфоцитов.

5. Биологическая терапия является перспективным методом терапии псориаза. Предложенный алгоритм исследования является основой для разработки новых таргентных препаратов.

Апробация работы.

Основные положения работы представлены и обсуждены в ходе проведения: -II Всероссийского конгресса дерматовенерологов (г. Санкт-Петербург, 25-28 сентября 2007 г.);

-III Всероссийского конгресса дерматовенерологов (г. Казань, 5-9 ноября 2009

г.);

-научно-практических конференциях ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России (г. Москва, 25 сентября 2009 г. и 28 мая 2010 г.);

-пленарном заседании Московского общества дерматовенерологов им. А.И. Поспелова (г. Москва, 18 февраля 2010 г.);

-XI Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов (г. Екатеринбург, 9-12 ноября 2010 г.);

-VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (г. Москва, 11-12 ноября 2010 г.);

-22-м Мировом Конгрессе дерматологов (Корея, г. Сеул, 24-29 мая 2011 г.); -II Континентальном конгрессе дерматологов международного дерматологического общества/ IV Всероссийском конгрессе дерматологов (г. Санкт-Петербург, 5-9 июля 2011 г.).

Внедрение результатов исследования. Иммуноморфологические методы исследования внедрены в работу отдела лабораторной диагностики инфекций, передаваемых половым путем и болезней кожи ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России. Полученные в ходе выполнения исследования результаты, используются в обучающих программах сертификационных курсов для дерматовенерологов, на занятиях с клиническими ординаторами и аспирантами, на циклах общего и тематического усовершенствования ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития, включены в учебный процесс кафедры клинической микологии и дерматовенерологии ФПКМР РУДН и кафедры дерматовенерологии ГБОУ ВПО Тверской Государственной Медицинской академии.

Результаты исследования, касающиеся характеристики иммунопатологических реакций в коже при псориазе были использованы при составлении глав в руководствах для врачей: Клиническая дерматовенерология: 2 т./под редакцией Ю.К. Скрипкина, Ю.С. Бутова, 2009г. и Дерматовенерология. Национальное руководство/под редакцией Ю.К. Скрипкина, Ю.С. Бутова, O.JI. Иванова, 2011г.

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 26 научных работах, из которых 17 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Личный вклад автора в проведенное исследование. Автором подготовлен обзор данных отечественных и зарубежных литературных источников по теме исследования, разработан дизайн исследования. Проведена гистологическая обработка биопсийного материала, изготовлены срезы биоптатов, на которых в последующем осуществлена постановка иммуногистохимической реакции. С помощью светового микроскопа проведен анализ полученных гистологических и иммуногистохимических препаратов, проведено фотодокументирование па-томорфологической картины. С применением компьютерной программы анализа изображения ImageJ проведен морфометрический анализ исследуемых показателей. С помощью прикладной программы осуществлена статистическая обработка полученных материалов. Проведена интерпретация данных, сформулированы выводы и практические рекомендации.

Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 185 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 21 таблицей и 47 рисунками (80 фотографий). Состоит из введения, 6 глав с описанием данных литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, содержащего 55 источников на русском и 191 источник на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Материалы и методы исследования. Работа выполнялась на базе ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России в период с марта 2007 по август 2011 года.

В исследование было включено 80 больных псориазом (34 - женского пола, 46 - мужского пола) в возрасте от 19 до 75 лет. Критериями включения больных в исследование являлись возраст старше 18 лет, наличие типичной картины заболевания, среднетяжелая и тяжелая степень кожных проявлений. В соответствии с «Основами законодательства Российской Федерации об охране здоровья

граждан» до начала проведения диагностических манипуляций и лечения все пациенты были ознакомлены и подписывали информированное добровольное согласие на медицинское вмешательство. Клиническое обследование больных проводилось в условиях отделения клинической дерматологии ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России и включало изучение жалоб, анамнеза жизни и заболевания, данных о полученном ранее лечении и сопутствующих заболеваниях, оценку общего и локального статуса. У каждого больного для оценки тяжести и распространенности кожных проявлений использовали индекс PASI (Psoriasis area and severity index).

До начала лечения и в течение курса терапии всем больным проводили обследование с применением лабораторных методов исследования (общий анализ крови и мочи, биохимическое исследование крови, проведение исследования для выявления сифилиса, гепатитов В и С, ВИЧ).

Для исключения сопутствующих заболеваний и противопоказаний к лечению больные были консультированы терапевтом, офтальмологом, эндокринологом, гинекологом, по показаниям - другими специалистами.

Оценку клинической эффективности лечения проводили через 2 месяца от начала лечения, используя динамику индекса PASI (табл. 1).

Таблица 1. Клинические показатели результатов лечения

Результаты лечения Снижение индекса PASI

Клиническое выздоровление 90% и более

Значительное улучшение 75-89%

Улучшение 50-74%:

Незначительное улучшение 25-49%

Без эффекта Менее 25%

Клинически значимым показателем высокой эффективности лечения считали снижение индекса РА81 на 75% и более. Отдаленные клинические результаты изучали на протяжении периода от 1 до 3 лет, оценивая на момент осмотра жалобы больного, отсутствие прогрессирования заболевания либо распространенность, локализацию и характер кожных высыпаний.

Методы лечения. Основную группу составили 38 больных, у которых наблюдался псориаз среднетяжелой и тяжелой степени (индекс РА81 >10) с короткими периодами ремиссии, отмечались неудовлетворительные результаты лечения при назначении ретиноидов, метотрексата, циклоспорина, фотохимиотерапии.

Больные основной группы получали препарат инфликсимаб (химерное соединение на основе гибридных и человеческих ^01 моноклональных антител), являющийся селективным иммунодепрессантом, связывающим как растворимую, так и трансмембранную формы ФНО-а человека. До начала лечения больных основной группы тщательно обследовали для исключения новообразований, туберкулеза, тяжелых хронических инфекций, сердечно-сосудистой недостаточности. Женщины детородного возраста включались в исследование после получения отрицательного результата теста на беременность, при условии использования высокоэффективных методов контрацепции. Инфликсимаб вводили в дозе 5 мг/кг массы тела внутривенно капельно. Повторные введения препарата осуществляли через 2 и 6 недель после первого введения и далее каждые 8 недель. Непосредственно перед каждым введением препарата всем больным проводили общие анализы крови и мочи, биохимический анализ крови (исследование уровня трансаминаз, общего и связанного билирубина, продуктов азотистого обмена). После расчета дозы препарата содержимое каждого флакона растворяли в 10 миллилитрах воды для инъекций, после чего общий объем приготовленной дозы доводили 0,9% раствором натрия хлорида для инъекций до 250 миллилитров. Сразу после приготовления раствор вводили внутривенно капельно в течение не менее 2-х часов, со скоростью не более 2 мл/в минуту. Во время проведения инфузии каждые 30 минут больным измеряли ча-

стоту сердечных сокращений, частоту дыхательных движений, артериальное давление. По окончании проведения инфузии эти показатели измеряли каждые 30 минут в течение 2-х часов, затем больной оставался под наблюдением дежурного врача.

Группу сравнения составили 42 человека, которые получали фотохимиотерапию, ретиноиды, метотрексат, в различных комбинациях, в соответствии с клиническими рекомендациями Российского общества дерматовенерологов (РОДВ). Выбор метода терапии был обусловлен тяжестью кожного процесса, предыдущим использованием различных методов лечения и их эффективностью, наличием сопутствующей патологии. С учетом выбранного метода лечения всех больных группы сравнения до начала терапии тщательно обследовали для исключения противопоказаний к лечению: назначали общие анализы крови и мочи, биохимическое исследование крови, консультации специалистов. Патоморфологические исследования. У всех больных (80 человек) проведено рутинное гистологическое исследование кожи (окраска гематоксилин-эозином). У 30 больных (15 человек из основной группы, 15 человек из группы сравнения), из них 12 женщин и 18 мужчин в возрасте от 19 до 68 лет, проведены им-муноморфологические исследования кожи.

Контрольную группу составили 10 здоровых добровольцев, не имевших клинических признаков кожных заболеваний, у которых биоптаты кожи были получены во время проведения хирургических операций.

До начала лечения биоптаты брали из центра очагов поражения под местной анестезией 2% раствором лидокаина. Через 2 месяца биоптаты брали из участков, расположенных в непосредственной близости от места первой биопсии. У 6 человек из 15 больных основной группы забор 3-й биопсии проводился через 1 год от начала терапии. В этом случае биопсийный материал брали из имеющихся на момент осмотра очагов поражения.

Биоптаты подвергали стандартной гистологической обработке. Фиксацию биопсийного материала осуществляли в 10% растворе забуференного формалина в течение 12-24 часов при комнатной температуре. После отмывания фикса-

тора в проточной воде проводилась стандартная гистологическая проводка би-оптатов в автоматизированной вакуумной системе обработки тканей Leica ASP300 (Германия) путем обезвоживания в 96% этиловом спирте. Далее кусочки ткани пропитывали парафином, заливали в парафиновые блоки, из которых на ротационном микротоме Leica RM2125RT (Германия) изготавливали срезы толщиной 5 мкм, растягивали их на предметных стеклах. Для иммуноморфоло-гических исследований использовали предметные стекла с полилизиновым покрытием Vision biosystems plus slides (Великобритания). Окраску гематоксилин-эозином проводили в автоматическом устройстве для окрашивания срезов тканей Leica Autostainer XL ST5010 (Германия).

Изучение количества и распределения в структурах кожи основных субпопуляций Т-клеток - CD4+ (Т хелперов/индукторов), CD8+ (цитотоксических Т лимфоцитов) и CD45RO+ (Т-клеток памяти), антигенпрезентирующих клеток (CDla+ клеток Лангерганса), толл-подобных рецепторов 2, 4 и 9 классов (TLR2, TLR4 и TLR9), молекул межклеточной адгезии ICAM-1 и Е-селектина, провос-палительных цитокинов ИЛ-1а и ФНО-а проводили непрямым иммуноперок-сидазным иммуногистохимическим методом. Для иммунофенотипирования использовали мышиные моноклональные антитела против CD4 (клон 1F6), CD8 (клон 1А5), CD45RO (клон UCHL1), CDla (клон МТВ1), CD54 (клон 23G12) и CD62-E (клон 16G4) человека производства фирмы Vision biosystems novocastra (Великобритания), кроличьи поликлональные антитела против TLR2 (регистрационный № 060603), TLR4 (регистрационный № 000206), TLR9 (регистрационный № аЬ53396), ИЛ-1а (регистрационный № Р01583) и ФНО-а (регистрационный № Р01375) человека производства фирмы Abbiotec (США), а также пе-роксидазную детекционную систему Novocastra Peroxidase Detection System, производства «Leica Microsystems» (Великобритания), включающую вторичные универсальные биотинилированные антитела и стрептавидин-пероксидазный комплекс. Визуализация реакции осуществлялась DAB-хромогеном. Постановку иммуногистохимической реакции осуществляли согласно протоколам, прилагаемым к используемым антителам.

Высокотемпературная антигенная демаскировка проводилась путем кипячения в цитратном буфере (pH - 6,0) в СВЧ - печи при максимальной мощности 900 Вт тремя циклами по 5 минут с 1-минутными перерывами. Остывшие препараты промывали в растворе ТРИС - буфера (pH 7,54-7,58), обрабатывали 0,3% раствором перекиси водорода на метаноле (1:1) для предотвращения эндогенной пероксидазной активности. Инкубацию с первичными антителами проводили в течение 60 минут при комнатной температуре (23°С), с вторичными антителами - в течение 30 минут в термостате при температуре 37°С. Для завершения окрашивания осуществляли фоновое контрастирование срезов гематоксилином Майера. Полученные гистологические и иммуногистохимиче-ские препараты заключали под покровное стекло и изучали с помощью светового микроскопа Leica DM4000B (Германия). Всего было изучено 940 препаратов (170 - гистологических и 770 - иммуногистохимических). Морфометрическнй анализ проводили с применением компьютерной программы анализа изображения ImageJ. Для этого в каждом срезе цифровой фотокамерой с высоким разрешением Leica DFC320 (Германия) фотографировали по 5 полей зрения в эпидермисе на отрезке длиной 0,5 мм, в дерме площадью 0,15 мм2, в которых проводили подсчет клеток с положительной реакцией (рис. 1 А, Б), затем рассчитывали среднее значение показателя. Экспрессию толл-подобных рецепторов, молекул адгезии, провоспалительных цитокинов определяли измерением площади эпидермиса и сосудов дермы с положительной реакцией клеток в квадратных микрометрах (мкм2). Содержание толл-подобных рецепторов, молекул адгезии, провоспалительных цитокинов на стенках сосудов выражали в процентах по отношению к общей площади поля зрения (рис. 2 А, Б).

Статистическая обработка данных. Статистический анализ проводили с применением пакета прикладных программ STATISTICA 8. Проверка на нормальность распределения осуществлялась с помощью критерия Шапиро-Уилкса. Описательная статистика количественных признаков представлена в виде медиан, в скобках приведены границы интерквартильных отрезков (в формате Ме

Ю,-К2,1). При сравнении показателей до и после лечения внутри групп (анализ признаков в динамике) использовали тест Вилкоксона. При сравнении групп друг с другом по количественным признакам использовали ЧГ-тест Манна-Уитни. Оценка корреляционных связей осуществлялась с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Различия считали статистически значимыми при значении уровня достоверности ниже 0,05 (Р < 0,05).

Рисунок 1. Подсчет содержания субпопуляций клеток в эпидермисе (А) и дерме (Б)

Рисунок 2. Измерение площади эпидермиса (А) и сосудов дермы (Б) с положительной экспрессией маркеров

Клиническая характеристика наблюдавшихся пациентов представлена в таблице 2. При анализе данных анамнеза было установлено, что дебют заболевания приходился на возраст от 4 до 65 лет (медиана 22). У 29 человек выявлен отягощенный наследственный анамнез. Начало заболевания у 31 больного было связано со стрессовой ситуацией, у 2 - со злоупотреблением алкоголем, у 1 больной - с наступлением беременности, у 5 - с переохлаждением и перенесенной вирусной респираторной инфекцией. 1 больной отметил, что заболевание у него возникло после пребывания на Чернобыльской АЭС, где он работал в ка-

честве ликвидатора аварии. У 40 больных возможную причину заболевания выявить не удалось.

У 16 больных отмечалась сезонная зависимость: у 12 - обострение заболевания наблюдалось в осенне-зимний период, у 4 - в весенне-летний. У 64 человек наблюдалось внесезонное течение заболевания. Среди сопутствующей патологии следует отметить заболевания сердечно-сосудистой системы (22 человека), желудочно-кишечного тракта (34 человека), мочеполовой системы (4 человека), эндокринной системы (9 человек). У 11 больных наблюдалась желе-зодефицитная анемия.

Вульгарный псориаз диагностирован у 56 (70%) больных, на коже которых имелись распространенные мономорфные папулезные высыпания розового или красного цвета, покрытые рыхлыми серебристо-белыми чешуйками четко отграниченные от здоровой кожи. В результате периферического роста папулы местами сливались в бляшки различных очертаний, диаметром от 5 до 20 см. У 24 (30%) больных была отмечена эритродермия. При этом патологический процесс локализовался практически на всей поверхности кожного покрова. Кожные покровы были от розовато-красного до ярко-красного цвета, инфильтрированы, с умеренным крупно - и мелкопластинчатым шелушением. У части больных отмечалось увеличение периферических лимфатических узлов.

Величина индекса РА81 колебалась от 10 до 65,4 баллов (медиана 35,1 балла). У 46 (57,5%) больных помимо кожного процесса диагностирован псори-атический полиартрит с вовлечением в процесс лучезапястных, локтевых, коленных, голеностопных, плюсневых, плюснефаланговых и межфаланговых суставов. У 35 (43,7%) больных были патологические изменения ногтевых пластин в виде их утолщения и деформации, изменения цвета, появления подног-тевого гиперкератоза, симптома «наперстка».

Большая часть пациентов ранее неоднократно получала лечение различными методами системной терапии, включая ретиноиды (неотигазон, тигазон), цитостатические препараты (метотрексат, циклоспорин, циклофосфан), фототерапию (общая фотохимиотерапия с пероральным приемом фотосенсибилизато-

ра, локальная фотохимиотерапия, ПУВА-ванны, узкополосная фотохимиотерапия), глюкокортикостероидные препараты для парентерального введения и для наружного применения (дипроспан, преднизолон, кремы и мази, содержащие кортикостероиды).

При сравнении исходных значений клинических показателей в группах больных статистических различий по полу, возрасту, длительности заболевания, а также распространенности высыпаний обнаружено не было (Р>0,05) (табл. 2).

Таблица 2. Клиническая характеристика больных основной группы и группы сравнения

Клинические Основная группа Группа сравнения Р

показатели (п=38) (п=42)

Возраст (лет) 39,5 [33,0-47,0] 45,0 [37,0-^52,0] 0,184

Пол (муж/жен) 25/13 22/20 0,303

Длительность болезни (лет) 18,0 [11,0-24,0] 18,0[12,0-28,0] 0,862

Индекс РАБ! 35,6 [27,6-47,6] 35,0 [27,2-42,6] 0,410

Примечание: пол и возраст указаны в абсолютных частотах, остальные показатели в виде медиан и ингерквар-тильных отрезков. Уровень статистической значимости при сравнении групп по клиническим показателям Р>0,05 (Ц-тест Манна-Уитни).

Результаты исследования

Результаты гистологического исследования показали характерные для заболевания патологические признаки: акантоз эпидермиса, нарушение диффе-ренцировки кератиноцитов в виде паракератоза, наличие микроабсцессов Мун-ро внутри паракератотических чешуек, густая периваскулярная инфильтрация в дерме преимущественно из лимфоцитов и гистиоцитов, в биоптатах полученных из очагов пораженной кожи до начала лечения.

Изучение распределения и содержания толл - подобных рецепторов 2, 4 и 9 (ТЫ12, ТЬЯ4 и ТЬЯ9), антигенпрезентирующих клеток Лангерганса (СБ 1а),

распределения провоспалительных цитокинов ИЛ-1а и ФНО-а, молекул межклеточной адгезии 1САМ-1 и Е-селектина, субпопуляций Т-лимфоцитов проводилось до начала лечения у 30 больных псориазом (12 женщин и 18 мужчин) и у 10 здоровых добровольцев. Возраст больных варьировал от 19 до 68 лет, длительность заболевания от 3 до 35 лет. Величина индекса РАЙ1 колебалась от 10 до 65,4 баллов. Группы больных и здоровых не отличались по полу и возрасту (соответственно Р = 0,172 и Р = 0,249).

Результаты иммуноморфологического исследования выявили экспрессию толл-подобных рецепторов ТЫ12 и ТЬЯ4 в базалыюм и шиповатом слоях эпидермиса в очагах поражения у больных псориазом до начала лечения. В роговом слое и в зонах паракератоза экспрессия толл-подобных рецепторов ТЫ12 и ТЬ114 отсутствовала. В верхних рядах шиповатого слоя эпидермиса было отмечено усиление интенсивности иммуногистохимической окраски. Площадь экспрессии ТЫ12 и ТЫ1 4 в эпидермисе на отрезке длиной 0,5 мм была достоверно повышена до 990,2 мкм2 [817,7-1099,2] и 968,5 мкм2 [750,5-1093,6] соответственно. В дерме экспрессия ТЫ12 и ТЫ14 наблюдалась на эндотелии кровеносных сосудов, клетках макрофагального и гистиоцитарного ряда воспалительных инфильтратов, на эпителиоцитах потовых желез и наружного корневого влагалища волосяных фолликулов. Площадь сосудов с положительной экспрессией ТЫ12 и ТЫМ была повышена до 7,1% [5,3-9,1] и 8,2% [5,7-10,4] соответственно.

В биоптатах кожи, полученных от здоровых лиц, экспрессия ТЫ12 и ТЫ14 обнаруживалась в базальном, шиповатом и зернистом слоях эпидермиса, в роговом слое - отсутствовала. Окраска была выражена равномерно, без тенденции к усилению интенсивности в каком-либо слое эпидермиса. Площадь экспрессии ТЫ12 в эпидермисе у здоровых лиц на отрезке 0,5 мм составляла 213,2 мкм2 [191,3-223,0], ТЬЯ4-217,3 мкм2 [191,5-222,9]. В дерме у здоровых лиц экспрессия ТЬ112 и ТЫ14 отмечалась на эндотелии кровеносных сосудов, клетках макрофагального и гистиоцитарного ряда, располагающихся вокруг сосудов сосочкового слоя дермы, на эпителиоцитах потовых желез и наружного

корневого влагалища волосяных фолликулов. Площадь сосудов с положительной экспрессией Т1Л12 и Т1Л14 у здоровых лиц составила 2,5% [1,9-^3,3] и 2,3% [1,9^-2,4] соответственно.

Реакция с моноклональными антителами к ТЬЯ9 была отрицательной в эпидермисе и дерме, как у больных псориазом, так и у здоровых лиц. Для подтверждения полученных результатов была проведена постановка иммуногисто-химической реакции с поликлональными антителами к ТЫ19 в ткани небной миндалины, где положительная экспрессия изучаемого маркера наблюдалась на криптальном эпителии, на эндотелии кровеносных сосудов, клетках макро-фагального и гистиоцитарного ряда, инфильтрирующих ткань миндалины.

Другой компонент врожденного иммунитета - клетки Лангерганса (СП1а+) в очагах пораженной кожи больных псориазом обнаруживались в базальтом и шиповатом слоях эпидермиса, имели тело и несколько четко выраженных отростков, контактирующих с прилегающими кератиноцитами. В дерме клетки Лангерганса присутствовали в составе периваскулярных инфильтратов и не имели четко выраженной отросчатой формы. Количество клеток Лангерганса у больных псориазом было статистически достоверно выше по сравнению с показателями здоровых лиц, как в эпидермисе, так и в дерме, и составляло 30,2 [25,6-К37,0]/0,5 мм и 40,3[27,2-47,б]/0,15 мм: соответственно. У здоровых лиц клетки Лангерганса локализовались в эпидермисе на уровне базаль-ного слоя, имели отросчатую форму. В дерме обнаруживались единичные клетки Лангерганса, располагающиеся вокруг сосудов сосочкового слоя, не имеющие отростков. Их количество в эпидермисе здоровых лиц составило 12,5 [11,4-14,0]/0,5 мм, в дерме 6,2 [4,6-8,0]/0,15 мм2.

Таким образом, в коже больных псориазом происходит повышение экспрессии толл-подобных рецепторов ТЫ12 и ТЫ14 (табл. 3) и увеличение числа антигенпрезентирующих клеток - клеток Лангерганса, относящихся к структурам врожденного иммунитета.

Статистически значимое повышение содержания клеток Лангерганса (С01а+) в эпидермисе и дерме больных псориазом наряду с повышенным ко-

личеством толл-подобных рецепторов 2 и 4 свидетельствует об их активации для процессинга и готовности к миграции в регионарные лимфатические узлы для презентации Т-лимфоцитам пока еще неустановленного антигена. В дальнейшем это приводит к развитию иммунного воспаления.

Полученные результаты позволяют полагать, что отсутствие экспрессии толл-подобного рецептора 9 (ТЬЯ9), ответственного за распознавание вирусных частиц, у здоровых лиц и больных псориазом свидетельствует о том, что данный рецептор, вероятно, имеет меньшую значимость для инициации иммунных реакций в коже, в отличие от других тканей.

Таблица 3. Содержание толл-подобных рецепторов и клеток Лангерганса в пораженной коже больных псориазом и у здоровых добровольцев

показатель больные псориазом (п=30) здоровые добровольцы (п=10) Р1

ТЬЯ2 Э 3 (мкм2) 990,2 [817,7-1099,2]2 213,2[191,3-223,01 <0,001

ТЫ12 Д 4 (%) 7,1 [5,3-9,11 2,5 [1,9-3,31 < 0,001

ТЬЯ4 Э (мкм2) 968,5 [750,5-1093,61 217,3 [191,5-222,91 <0,001

ТЫ14 Д (%) 8,2 [5,7-10,41 2,3 П,9+2,41 <0,001

С01а+Э (абс. к-во/0,5мм) 30,2 [25,6-37,0] 12,5 [11,4-14,0] < 0,001

СЭ1а+Д (абс. к-во/0,15мм2) 40,3 [27,2-47,6] 6,2 [4,6-8,0] <0,001

Примечание:

1Р - уровень статистической значимости при сравнении показателей больных псориазом и здоровых добровольцев

2 медиана значений, в скобках приведены границы интерквартильных отрезков ]Э - эпидермис, 4Д - дерма.

Экспрессия провоспалительного цитокина ИЛ-1а в пораженной коже больных псориазом выявлялась в базальном и шиповатом слоях эпидермиса, в шиповатом слое была выражена наиболее интенсивно, отсутствовала в параке-ратотическом и роговом слоях. Площадь экспрессии ИЛ-1а в эпидермисе на отрезке длиной 0,5 мм была достоверно повышена до 957,5 мкм2 [821,6-1084,5] (Р<0,001).

В дерме экспрессия ИЛ-1а наблюдалась на эндотелии кровеносных сосудов, клетках воспалительных инфильтратов. Для оценки содержания ИЛ-1а в дерме осуществлялся подсчет площади сосудов, на эндотелии которых обнаруживалась экспрессия исследуемого маркера, которая затем выражалась в процентах по отношению к площади поля зрения. Изучение этого показателя выявило достоверное повышение площади сосудов с положительной экспрессией ИЛ-1а до 8,5% [6,1-10,7] (Р<0,001) (табл. 4).

В биоптатах кожи, полученных от здоровых лиц, экспрессия ИЛ-1а в эпидермисе была выражена очень слабо, на эндотелии сосудов дермы отсутствовала, выявлялись единичные позитивно окрашенные клетки, локализованные вокруг сосудов поверхностного сплетения.

Таблица 4. Содержание провоспалительных цитокинов ИЛ-1а и ФНО-а в пораженной коже больных псориазом и у здоровых лиц

показатель больные псориазом (п=30) здоровые добровольцы (п=10) Р1

ИЛ-1а Э3 (мкм2) 957,5 [821,6-1084,5]2 0 <0,001

ИЛ-1а Д4 (%) 8,5 [6,1-10,7] 0 <0,001

ФНО-а Э (мкм2) 0 0 -

ФНО-а Д (%) 0 0 -

Примечание:

'Р - уровень статистической значимости при сравнении показателей больных псориазом и здоровых добровольцев

1 медиана значений, в скобках приведены границы ингерквартильных отрезков 3Э - эпидермис, 4Д - дерма

При проведении корреляционного анализа установлена прямая связь между увеличением площади экспрессии провоспалительного цитокина ИЛ-1а и повышением площади экспрессии толл-подобных рецепторов 2 и 4 (ТЫ12 и Т1Л4) в эпидермисе и дерме (табл. 5).

Реакция с моноклональными антителами к ФНО-а была расценена нами как отрицательная в эпидермисе и дерме как у больных псориазом, так и у здоровых лиц. Для подтверждения полученных результатов была проведена постановка иммуногистохимической реакции с поликлональными антителами к

ФНО-а в образцах ткани низкодифференцированного рака толстой кишки (аутопсийный материал), где положительная очаговая экспрессия исследуемого маркера наблюдалась в опухолевых клетках, а также в клетках инфильтрата соединительнотканной стромы.

Таблица 5. Уровни коэффициента ранговой корреляции Спнрмена при проведении корреляционного анализа

показатели ИЛ-1а Э ИЛ-1а Д

ТЬЮЭ' г = 0,86 г = 0,66

ТЬЯ2 Дг г =0,59 г = 0,78

ТЫ14Э г = 0,92 г = 0,62

ТЫМД г =0,64 г = 0,78

Примечание: во всех случаях уровень статистической значимости Р<0,05, 'Э - эпидермис, !Д - дерма

Полученные результаты выявили следующие особенности экспрессии про-воспалительных цитокинов ИЛ-1<х и ФНО-а в структурах пораженной кожи больных псориазом: при наличии клинических признаков воспаления в очагах пораженной кожи установлено увеличение экспрессии ИЛ-1а, в то время как признаков экспрессии ФНО-а не было обнаружено. Полученные результаты можно объяснить возможностью депонирования ИЛ-1а в коже и локальным функционированием ФНО-а в низких концентрациях, не определяющихся им-муногистохимическим методом.

Таким образом, кератиноциты и клетки воспалительного инфильтрата, эн-дотелиоциты кровеносных сосудов дермы у больных псориазом находятся в активированном состоянии, доказательством чего является значительное увеличение экспрессии провоспалительного цитокина ИЛ-1а на этих участках.

Экспрессия молекулы межклеточной адгезии 1САМ-1 в биоптатах, полученных из очагов поражения больных псориазом, наблюдалась в базаль-ном и шиповатом слоях эпидермиса, отсутствовала в паракератотическом и роговом слоях. Площадь экспрессии молекулы межклеточной адгезии 1САМ-1 в

эпидермисе на отрезке длиной 0,5 мм была достоверно повышена до 968,9 мкм2 [853,1-1073,1] (Р<0,001).

В дерме экспрессия 1САМ-1 была обнаружена на эндотелии кровеносных сосудов, клетках воспалительных инфильтратов. Для оценки содержания 1САМ-1 в дерме осуществлялся подсчет площади сосудов, на эндотелии которых выявлялась экспрессия исследуемого маркера, которая затем выражалась в процентах по отношению к площади поля зрения. Изучение этого показателя выявило достоверное повышение площади сосудов с положительной экспрессией 1САМ-1 до 8,1% [6,1-10,6] (Р<0,001) (табл. 6).

В биоптатах кожи, полученных от здоровых лиц, экспрессия 1САМ-1 в эпидермисе и на эндотелии сосудов дермы отсутствовала, выявлялись лишь единичные позитивно окрашенные клетки, локализованные вокруг сосудов поверхностного сплетения.

Экспрессия молекулы Е-селектина в эпидермисе у больных псориазом до начала лечения отсутствовала. В дерме экспрессия молекулы Е-селектин наблюдалась на эндотелии кровеносных сосудов. Для оценки содержания молекулы Е-селектин в дерме осуществлялся подсчет площади сосудов, на эндотелии которых наблюдалась экспрессия исследуемого маркера, которая затем выражалась в процентах по отношению к площади поля зрения. Изучение этого показателя выявило достоверное повышение площади сосудов с положительной экспрессией Е-селектина до 8,5 % [6,5-10,2] (Р<0,001).

В биоптатах кожи, полученных от здоровых лиц, экспрессия Е-селектина в эпидермисе отсутствовала. В дерме у здоровых лиц экспрессия Е-селектина наблюдалась на эндотелии кровеносных сосудов. Содержание сосудов с положительной экспрессией Е-селектина у здоровых лиц составило в среднем 2,4 % [1,9-3,2] (табл. 6).

При проведении корреляционного анализа установлена прямая связь между увеличением площади экспрессии молекулы межклеточной адгезии 1САМ-1 в эпидермисе и дерме больных псориазом (г = 0,66; Р< 0,05). Повышение площади экспрессии Е-селектина в дерме коррелировало с увеличением

площади экспрессии 1САМ-1 в эпидермисе (г = 0,65; Р< 0,05) и в дерме (г = 0,93; Р< 0,05). Кроме того, повышение экспрессии молекул межклеточной адгезии 1САМ-1 и Е-селектина было связано с повышением площади экспрессии толл-подобных рецепторов 2 и 4 (ТЫ12 и Т1ЛМ) и провоспалительного цитоки-на ИЛ-1а в эпидермисе и дерме (табл. 7). Это свидетельствует о взаимосвязанности процессов, направленных на подготовку клеток кожи к приему лимфоцитов из циркуляции.

Таблица 6. Содержание молекул межклеточной адгезии 1САМ-1 и Е-селектина в пораженной коже больных псориазом и у здоровых лиц

показатель больные псориазом (п=30) здоровые добровольцы (п=10) Р1

1САМ-1 Э (мкм2) 968,9 [853,1-1073,II2 0 <0,001

1САМ-1 Д4 (%) 8,1 [6,1-10,61 0 <0,001

Е-селектин Э(мкм2) 0 0 -

Е-селектин Д (%) 8,5 [6,5-10,21 2,4 [1,9- 3,21 <0,001

Примечание:

'Р - уровень статистической значимости при сравнении показателей больных псориазом и здоровых добровольцев

2 медиана значений, в скобках приведены границы интерквартильных отрезков 3Э - эпидермис, 4Д - дерма

Таблица 7. Уровни коэффициента ранговой корреляции Спирмена при проведении корреляционного анализа

показатели 1САМ-1Э1 1САМ-1Д2 Е-селектин Д

ТЬМЭ г = 0,88 г = 0,68 г = 0,69

ТЬИ2 Д г = 0,55 г = 0,75 г = 0,74

ТЫ14Э г = 0,92 г = 0,63 г = 0,64

Т1Л4Д г = 0,72 г = 0,82 г = 0,82

ИЛ-1а Э г = 0,93 г =0,55 г = 0,58

ИЛ-1аД г = 0,61 г = 0,94 г = 0,88

Примечание: во всех случаях уровень статистической значимости Р<0,05, 'Э - эпидермис, 3Д - дерма

Участие молекул межклеточной адгезии 1САМ-1 и Е-селектина в миграции Т-лимфоцитов в очаг воспаления является известным фактом. Результаты иммуноморфологических исследований показали увеличение экспрессии адгезивных молекул 1САМ-1 и Е-селектина в коже больных псориазом, что необходимо для осуществления контакта клеток иммунной системы, дермы и эпидер-

миса в условиях развития воспаления. Отсутствие молекулы 1САМ-1 в коже у здоровых лиц свидетельствует о том, что необходимость её экспрессии возникает лишь при формировании воспалительного процесса. Наличие экспрессии Е-селектина на эндотелии у здоровых лиц показывает участие данной молекулы в физиологических функциях кожи.

Иммуноморфологическое исследование клеток адаптивного иммунитета

показало значимое повышение количества Т лимфоцитов, как в эпидермальном, так и в дермальном слоях кожи больных псориазом (табл. 8).

В эпидермисе у больных псориазом С04+ хелперные и С08+ цитотокси-ческие Т лимфоциты обнаруживались между кератиноцитами на разных уровнях эпителиального пласта. Количество их составляло 1,6 [1,2-2,0]/0,5 мм и 22,8 [18,0-К30,6]/0,5 мм соответственно. В дерме С04+ и СБ8+ лимфоциты обнаруживались преимущественно в составе периваскулярных инфильтратов. Их количество составляло 52,2 [35,4-61,0]/0,5 мм2 и 42,9 [33,6-57,2]/0,15 мм2 соответственно. Количество Т-клеток памяти (С0451Ш+) в очагах пораженной кожи больных псориазом было повышено и составило в среднем 16,4 [12,0-23,2]/0,5 мм в эпидермисе, 106,7 [91,6^135,4] /0,15 мм2 в дерме.

В биоптатах кожи, полученных от здоровых лиц, СБ4+ и С08+ лимфоциты отсутствовали в эпидермисе, и в небольшом количестве обнаруживались вокруг сосудов сосочкового слоя дермы, где их количество составило 11,0 [10,4-11,4]/0,15 мм2 и 8,9 [7,2-9,4]/0,15 мм2 соответственно.

СЭ45ЯО+ лимфоциты в эпидермисе у здоровых лиц отсутствовали, и в небольшом количестве обнаруживались вокруг сосудов сосочкового слоя дермы, где их количество составило 30,9 [29,2-К?2,4]/0,15 мм2.

При проведении корреляционного анализа была установлена прямая связь между повышением уровня содержания С04+ и С08+ Т лимфоцитов в эпидермисе (г= 0,46; Р<0,05), а также между повышением уровня содержания СЭ4+ и СВ45ЯО+ Т лимфоцитов в эпидермисе (г = 0,43; Р< 0,05). Повышение уровня содержания С04+ Т лимфоцитов в дерме было связано с повышением СО 8+ Т лимфоцитов (г = 0,72; Р< 0,05) и С045ГЮ+ Т-клеток памяти (г = 0,67; Р< 0,05) в

дерме, и С01 а+ клеток Лангерганса в эпидермисе (г = 0,43; Р< 0,05) и дерме (г = 0,51; Р< 0,05).

Таблица8. Содержание субпопуляций Т-лимфоцитов в пораженной коже больных псориазом и у здоровых добровольцев

показатель больные псориазом (п=30) здоровые добровольцы (п=10) Р1

СБ4 Э 3 (абс. к-во/0,5мм) 1,6 Г1,2^2,012 0 <0,001

СЭ4 Д4(абс. к-во/0,15мм2) 52,2 [35,4- "61,01 11,0 [10,4-11,4] <0,001

СЭ4 Д (%) 26,2 [24,3- -29,21 27,2 [24,9-28,9] 0,563

СЭ8 Э (абс. к-во/0,5мм) 22,8 [18,0- -30,6] 0 <0,001

С08 Д (абс. к-во/0,15мм2) 42,9 [33,6- -57,21 8,9 [7,2-9,4] <0,001

СЭ8 Д (%) 24,6 [18,7- -28,3] 21,6[19,4-23,2] 0,174

С045Я0 Э (абс. к-во/0,5мм) 16,4 [12,0- -23,21 0 <0,001

СБ45ЯО Д (абс. к-во/0,15мм2) 106,7 [91,6- -135,4] 30,9 [29,2-32,4] <0,001

С045110 Д (%) 58,9 [55,3- -66,2] 67,8 [67,0-69,2] 0,003

Примечание:

'Р - уровень статистической значимости при сравнении показателей больных псориазом и здоровых добровольцев

2 медиана значений, в скобках приведены границы интерквартильных отрезков 3Э - эпидермис, 4Д - дерма

Повышение уровня содержания СБ8+ Т лимфоцитов в эпидермисе коррелировало с повышением уровня содержания СЭ8+ Т лимфоцитов в дерме (г = 0,48; Р< 0,05) и С045Я0+ Т-клеток памяти в эпидермисе (г = 0,56; Р< 0,05), а повышение уровня содержания СЭ8+ Т лимфоцитов в дерме было связано с увеличением числа С045Я0+ Т-клеток памяти (г = 0,63; Р< 0,05) и СЭ1а+ клеток Лангерганса (г = 0,56; Р< 0,05) в дерме. Также была установлена прямая связь между повышением уровня содержания С045Я0+ Т-клеток памяти в эпидермисе и увеличением площади экспрессии ТЫ12 (г = 0,45; Р< 0,05) и ТЬЯ4 (г = 0,43; Р< 0,05) в эпидермисе.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено статистически значимое повышение числа СЭ4+ , С08+ лимфоцитов и Т-клеток памяти (С045Я0+) в эпидермисе и в дерме у больных псориазом. При изучении их распределения в эпидермальном и дермальном слоях кожи выявлено, что лимфоциты, локализованные в эпидермисе, были представлены преимуще-

ственно цитотоксическими (С08+) клетками и Т-клетками памяти (С045К0+), а лимфоциты, локализованные в дерме, представлены С04+, С08+ лимфоцитами и клетками памяти (С0451Ю+).

Прямая корреляционная связь между количеством С045Я0+ Т-клеток памяти в эпидермисе и увеличением экспрессии ТЬК2 и ТЫ14 свидетельствует о наличии связи между клетками иммунной системы, относящимися к адаптивному иммунитету, и клетками кожи, относящимися к структурам врожденного иммунитета. То есть, чем более выражена была экспрессия ТЬЯ2 и ТЬЯ 4, и чем больше в коже присутствовало клеток Лангерганса, тем выше был приток лимфоцитов в очагах поражения.

Эффективность проводимой терапии. В основной группе на фоне лечения инфликсимабом у большинства больных наблюдалась положительная динамика кожных проявлений в виде уменьшения эритемы, инфильтрации и шелушения очагов поражения. Наиболее выраженная динамика отмечалась после 2-й инфузии препарата. Положительная динамика сохранялась в течение 2-х месяцев наблюдения и сопровождалась разрешением высыпаний.

Переносимость лечения инфликсимабом была хорошей. Во время терапии не было выявлено случаев развития туберкулеза, сердечно-сосудистой недостаточности, аутоиммунных и инфекционных заболеваний. Значение индекса РАБ1 через 2 месяца лечения снизилось в среднем с 35,6 до 5,4 баллов, что свидетельствует о выраженном уменьшении активности заболевания под действием проводимого лечения.

Через 2 месяца лечения (после 3-й инфузии) биологическим препаратом инфликсимаб клиническое выздоровление наблюдалось у 12 (32%) больных, значительное улучшение у 19 (50%) больных, улучшение у 5 (13%) больных.

Разрешение высыпаний спустя 2 месяца лечения инфликсимабом сопровождалось выраженной положительной динамикой патоморфологической картины: наблюдалось уменьшение толщины эпидермиса, восстановление диффе-ренцировки кератиноцитов, снижение интенсивности воспалительной инфильтрации в дерме.

У 1 больной отмечалось значительное улучшение со стороны суставного процесса с некоторым ухудшением кожных проявлений. У 1 больного лечение оказалось неэффективным. Состояние этого больного оставалось тяжелым, сохранялась эритродермия, наблюдались выраженная инфильтрация и шелушение кожного покрова. Индекс РА81 не претерпевал значительных изменений (до лечения - 51 балл, через 2 месяца терапии - 48 баллов).

При гистологическом исследовании биоптата кожи этого больного через 2 месяца терапии было установлено усиление патоморфологических признаков воспаления с формированием типичной картины, наблюдаемой в период про-грессирования псориаза.

Во время наблюдения за больными в течение 1 года у части пациентов за 1-2 недели до ожидаемой инфузии инфликсимаба появлялись немногочисленные папулезные элементы бледно-розовой окраски, с незначительной инфильтрацией и шелушением. Высыпания были локализованы преимущественно на коже конечностей, местами сливались в бляшки до 2-х см в диаметре.

При патоморфологическом исследовании биоптатов кожи больных, полученных через 1 год после начала терапии, не наблюдалось развития полной па-томорфологической картины, характерной для псориаза: отмечалось незначительное утолщение эпидермиса, слои которого были дифференцированы, вокруг сосудов сосочкового слоя дермы наблюдалась умеренная инфильтрация лимфогистиоцитарного характера.

В группе сравнения выбор методов лечения и/или их комбинаций был обусловлен тяжестью общего состояния и распространенностью кожных высыпаний, наличием противопоказаний. Учитывались данные анамнеза о лечении, применяемом при предыдущих обострениях. Кроме методов системной терапии, у пациентов группы сравнения использовались средства для наружного применения, содержащие салициловую кислоту, нафталанскую нефть, ихтиол, синтетические аналоги витамина и активированный цинк пиритионат.

На фоне терапии у всех больных группы сравнения наблюдалась положительная динамика. Однако регресс высыпаний происходил несколько медлен-

ней, чем у больных основной группы, и наблюдался, как правило, с третьей недели лечения.

В результате сравнительного анализа установлено, что эффективность терапии через 2 месяца лечения в исследуемых группах статистически значимо не различалась. Среднее значение индекса РА81 через 2 месяца лечения в основной группе снизилось с 35,6 [27,6-47,6] до 5,3 [3,0-9,5] баллов (Д РА81=85,1%), в группе сравнения с 35,0 [27,2-42,6] до 6,7 [3,6-8,4] баллов (Д РА81=80,9%) (и-тест Манна-Уитни, Р = 0,484). Вместе с тем, в группе сравнения через 2 месяца число больных, достигших клинического выздоровления, составило 8 человек (19%) (что было в 1,5 раза ниже, чем в основной группе), значительное улучшение наблюдалось у 23 (55%) больных, улучшение - у 11 (26%), что было в 2 раза выше, чем в основной группе.

Среди побочных явлений, наиболее часто наблюдавшихся у больных группы сравнения, необходимо отметить повышение артериального давления, уровня печеночных ферментов, развитие диспепсических явлений и фототоксических реакций в виде эритемы и сухости кожи, нарушение функции почек и костного мозга. В зависимости от степени выраженности побочных явлений, в ряде случаев требовалась отмена проведения системной терапии до нормализации соответствующих показателей.

Во время наблюдения за больными группы сравнения было установлено, что период ремиссии составлял в среднем от 3,5 до 5,7 месяцев, после чего наступало обострение кожного процесса.

Таким образом, проведенный анализ показал, что терапия инфликсима-бом по эффективности не уступает другим методам системной терапии. При положительной динамике кожного процесса, наблюдается восстановление нормальной гистологической структуры кожи. В течение длительного времени сохраняется стойкий положительный эффект. Даже в случае появления у больных высыпаний незадолго до очередной инфузии инфликсимаба не происходит формирования полной патоморфологической картины, характерной для периода обострения псориаза.

При отсутствии эффекта от лечения инфиликсимабом, патоморфологиче-ские признаки псориаза не только не претерпевают изменений, но и происходит их усиление, что свидетельствует о сохранении высокой активности патологического процесса.

Динамика иммуноморфологических показателей в процессе лечения больных псориазом. Изучение распределения и содержания толл - подобных рецепторов 2, 4 и 9 (ТЬЯ2, ТЫ14 и ТЬК9) и антигенпрезентирующих клеток Лангерганса (СО 1а), провоспалительных цитокинов ИЛ-1а и ФНО-а, молекул межклеточной адгезии 1САМ-1 и Е-селектина, субпопуляций Т-лимфоцитов в процессе терапии препаратом инфликсимаб проводилось у 15 больных псориазом (6 женщин и 9 мужчин). Возраст больных варьировал от 19 до 57 лет, длительность заболевания от 5 до 35 лет. Величина индекса РА81 составляла в среднем 39 баллов.

Через 2 месяца лечения препаратом инфликсимаб в коже больных отмечалось статистически значимое снижение экспрессии толл-подобных рецепторов 2 и 4. Площадь экспрессии ТЬЯ2 в эпидермисе снижалась до 438,0 мкм2 [322,3-810,4] (Р<0,004), в дерме до 2,9% [2,5-5,1] (Р<0,007). Площадь экспрессии ТЬЯ4 уменьшалась в эпидермисе до 466,6 мкм2 [338,3-747,0] (Р<0,006), в дерме до 5,8% [2,4-6,4] (Р<0,007). Количество С01а+ клеток Лангерганса достоверно уменьшалось в дерме, а в эпидермисе наблюдалась тенденция к уменьшению их количества (табл. 9).

При анализе биоптатов кожи больных, полученных через 1 год от начала терапии, абсолютные показатели содержания толл-подобных рецепторов в эпидермисе и дерме были ниже, чем до начала лечения. Содержание С01а+ клеток Лангерганса в эпидермисе через 1 год оставалось достаточно высоким.

При сравнении исследуемых показателей, полученных через 2 месяца и через 1 год от начала лечения различий обнаружено не было (табл. 10).

Анализ исследуемых показателей врожденного иммунитета у больного с отсутствием эффекта от лечения, выявил увеличение площади экспрессии толл-

подобных рецепторов ТЬК2 и ТЬЯ4, а также содержания клеток Лангерганса в эпидермисе и в дерме по сравнению с таковыми до начала лечения.

Таблица 9. Содержание толл-подобных рецепторов и клеток Лангерганса в пораженной коже больных псориазом до начала лечения и через 2 месяца терапии инфликсимабом

показатель до лечения (п=15) через 2 месяца терапии (п=15) Р'

Т1Л12 Э3 (мкм2) 975,6 [694,8-1023,3]2 438,0 [322,3-810,4] 0,004

ТЫ12 Д4 (%) 5,4 [4,8-9,0] 2,9 [2,5-5,1] 0,004

ТЬЯ4 Э (мкм2) 961,9 [676,6-1055,4] 466,6 [338,3-747,0] 0,005

ТЫ14 Д (%) 8,1 [4,9-9,4] 5,8 [2,4-6,4] 0,006

СЭ1а+Э (абс. к-во/0,5мм) 29,6 [19,4-43,6] 20,4 [14,2-27,8] 0,03

СЭ1а+Д (абс. к-во/0,15мм2) 42 [21,2-43,8] 19,4 [17,6-22,4] 0,009

Примечание:

'Р - уровень статистической значимости при сравнении показателей до начала лечения и через 2 месяца терапии 2 медиана значений, в скобках приведены границы интерквартильных отрезков 3Э - эпидермис, 4Д - дерма.

Реакция с поликлональными антителами к ТЬК9 через 2 месяца и через 1 год от начала терапии препаратом инфликсимаб была отрицательной, как в эпидермисе, так и в дерме.

Таким образом, разрешение высыпаний у больных псориазом в процессе терапии препаратом инфликсимаб сопровождалось уменьшением в коже экспрессии толл-подобных рецепторов 2 и 4 (ТЬЯ2 и ТЫ14) и достоверным снижением количества антигенпрезентирующих клеток Лангерганса в дерме. Через 1 год от начала терапии, содержание исследуемых показателей оставалось ниже, чем до начала лечения. При отсутствии эффекта от проводимой терапии в пораженной коже не только сохранялся высокий уровень экспрессии толл-подобных рецепторов и клеток Лангерганса, но и наблюдалось увеличение их количества при прогрессировании симптомов.

Таблица 10. Содержание толл-подобных рецепторов и клеток Лангерганса в пораженной коже больных псориазом в процессе лечения ннфлнксима-бом

показатель до лечения (п=6) через 2 месяца терапии (п=6) через1 год от начала лечения (п=6) Р. Р2 Рз

ТЬМ э (мкм') 894,8 [694,8+975,6] 532,9 [346,9+906,1] 420,9 [293,4+545,7] 0,046 0,028 0,172

Т1Л*2Д(%) 5,4 [5,0+6,2] 2,7 [2,2+4,8] 2,5 [2,3+2,7] 0,028 0,028 0,116

ТИЫ Э (мкм1) 856,2 [676,6+975,1] 573,8 [354,6+737,2] 353,7 [293,4+513,0] 0,028 0,028 0,172

Т1Ж4 Д (%) 5,9 [4,0+9,0] 2,8 [2,2+5,9] 2,6 [2,4+2,7] 0,046 0,046 0,465

СБ1а+Э (абс. к-во/0,5мм) 29,7 [26,4+43,6] 24,0 [18,4+27,8] 17,9 [13,8+19,2] 0,116 0,046 0,249

СШа+Д (абс. к-во/0,15мм2) 31,5 [21,2+42,0] 18,5 [14,2+20,3] 11,7 [10,4+12,6] 0,028 0,028 0,028

Примечание:

Рг уровень статистической значимости при сравнении показателей до начала лечения и через 2 месяца терапии

Р:- уровень статистической значимости при сравнении показателей до начала лечения и через 1 год от начала лечения

Р3. уровень статистической значимости при сравнении показателей через 2 месяца и через 1 год от начала лечения

Разрешение высыпаний спустя 2 месяца лечения инфликсимабом сопровождалось статистически значимым уменьшением площади экспрессии про-воспалительного цитокина ИЛ-1а в эпидермисе и дерме (табл. 11). Площадь экспрессии провоспалительного цитокина ИЛ-1а в эпидермисе снижалась до 449,8 мкм2 [359,8-679,7], в дерме до 4,0% [2,9-6,5].

При анализе биоптатов кожи, полученных через 1 год от начала терапии, абсолютное содержание провоспалительного цитокина ИЛ-1а было ниже, чем до начала лечения. При сравнении уровней экспрессии провоспалительного цитокина ИЛ-1а в биоптатах, полученных через 2 месяца и через 1 год от начала лечения, статистически значимых различий обнаружено не было (табл. 12).

При анализе уровня содержания провоспалительных цитокинов у больного с отсутствием эффекта от лечения, отмечалось увеличение площади экспрессии провоспалительного цитокина ИЛ-1а в эпидермисе и дерме по сравнению с таковыми до начала лечения.

Реакция с моноклональными антителами к ФНО-а через 2 месяца и через 1 год от начала терапии препаратом инфликсимаб, была расценена как отрицательная.

Таблица 11. Содержание провоспалительного цитокина ИЛ-1а и молекул межклеточной адгезии и в пораженной коже больных псориазом до начала лечения и через 2 месяца терапии инфликсимабом

показатель до лечения (п=15) через 2 месяца терапии (п=15) Р1

ИЛ-1 Э (мкм2) 925,6 [727,0-1044,21 449,8 [359,8-679,71 0,004

ИЛ-1 Д (%) 7,9 [5,9-9,8] 4,0 [2,9-6,5] 0,002

1САМ-1 Э3 (мкм3) 956,0 Г1853,1-1017,512 453,4 [366,6-671,11 0,002

1САМ-1 Д4 (%) 7,8 [6,1-9,1] 4,0 [2,8-7,01 0,003

Е-селектин Д (%) 8,5Г5,7-10,0] 3,8 [3,4-6,4] 0,006

Примечание:

'Р - уровень статистической значимости при сравнении показателей до начала лечения и через 2 месяца терапии 2 медиана значений, в скобках приведены границы интерквартильных отрезков 3Э - эпидермис, 4Д - дерма.

Таблица 12. Содержание провоспалительного цитокина ИЛ-1а и молекул межклеточной адгезии в пораженной коже больных псориазом в процессе лечения инфликсимабом

показатель до лечения (п=6) через 2 месяца терапии (п=6) через1 год от начала лечения (п=6) Р. Р1 Рз

ИЛ-1 Э (мкм2) 920,1 [727,0+1024,3] 564,7 [390,0+765,6] 337,4 [305,5+542,4] 0,046 0,028 0,173

ИЛ-1 Д(%) 7,1 [5,0 +8,5] 4,0 [2,9+4,7] 2.5 [2,3+2,8] 0,028 0,028 0,028

1САМ-1 Э <мим;) 893,2 [853.1+1018,7] 562,3 [391,6+787,0] 346,5 [296,8+541,7] 0,028 0,028 0,043

1САМ-1 Д(%) 6,9 [4,7+8,3] 3,9 [2,8+4,8] 2,7 [2,3+2,8] 0,028 0,028 0,043

Е-селектин Д(%) 7,6 [5,1+8,8] 3,9 [3,4+4,5] 2,6 [2,4+2,8] 0,028 0,028 0,464

Примечание:

Рг уровень статистической значимости при сравнении показателей до начала лечения и через 2 месяца терапии Р: .уровень статистической значимости при сравнении показателей до начала лечения и через 1 год от начала лечения

Рз .уровень статистической значимости при сравнении показателей через 2 месяца и через 1 год от начала лечения

Разрешение высыпаний спустя 2 месяца лечения инфликсимабом сопровождалось статистически значимым уменьшением площади экспрессии молекул межклеточной адгезии в эпидермисе и дерме. Площадь экспрессии молекулы межклеточной адгезии 1САМ-1 в эпидермисе снижалась до 453,4 мкм2 [366,6-671,1], в дерме до 4,0% [2,8-7,0]. Площадь экспрессии Е-селектина в дерме уменьшалась до 3,8 % [3,4-6,4] (табл. 11).

При анализе биоптатов кожи, полученных через 1 год от начала терапии, абсолютное содержание молекул адгезии было ниже, чем до начала лечения. При сравнении уровней экспрессии молекул межклеточной адгезии 1САМ-1 и

Е-селектина в биоптатах, полученных через 2 месяца и через 1 год от начала лечения, статистически значимых различий обнаружено не было (табл. 12).

При анализе содержания молекул адгезии у больного с отсутствием эффекта от лечения, отмечалось увеличение площади экспрессии молекул 1САМ-1 в эпидермисе и дерме и Е-селектина в дерме по сравнению с таковыми до начала лечения.

Таким образом, разрешение высыпаний у больных псориазом в процессе терапии препаратом инфликсимаб сопровождалось уменьшением площади экспрессии провоспалительного цитокина ИЛ-1а, а также молекулы межклеточной адгезии 1САМ-1 в эпидермисе и дерме и Е-селектина в дерме. Через 1 год от начала терапии, уровень содержания исследуемых показателей остается ниже, чем до начала лечения. При отсутствии эффекта от проводимой терапии в пораженной коже не только сохраняется высокий уровень экспрессии молекул межклеточной адгезии и провоспалительного цитокина ИЛ-1а, но и наблюдается увеличение их количества при прогрессировании симптомов.

Спустя 2 месяца лечения препаратом инфликсимаб разрешение высыпаний сопровождалось статистически значимым уменьшением количества субпопуляций Т-лимфоцитов. Количество СБ4+ хелперных лимфоцитов статистически достоверно снижалось до 0,4 [0-0,6]/0,5 мм в эпидермисе, и до 19,2 [13,824,8]/ 0,15 мм2 в дерме. Количество СБ8+ цитотоксических лимфоцитов через 2 месяца терапии инфликсимабом статистически достоверно снижалось до 6,6 [4,0-13,8]/0,5 мм в эпидермисе, и до 18,4 [7,8-39,6]/0,15 мм2 в дерме. Количество С045110+ Т-клеток памяти через 2 месяца лечения препаратом инфликсимаб статистически достоверно снижалось до 1,6 [1,0-4,0]/0,5 мм в эпидермисе, и до 40,6[28,4-67,8]/ 0,15 мм2 в дерме (табл. 13).

При анализе биоптатов кожи, полученных через 1 год от начала терапии, абсолютное содержания всех исследуемых субпопуляций Т лимфоцитов было ниже, чем до начала лечения. При сравнении исследуемых показателей в биоптатах, полученных через 2 месяца и через 1 год от начала лечения, было установлено повышение количества СЭ4+ лимфоцитов и С08+ лимфоцитов в дер-

ме, которое, тем не менее, было достоверно ниже по сравнению с показателями до начала лечения. По остальным параметрам статистически значимых различий обнаружено не было (табл. 14).

Таблица 13. Содержание субпопуляций Т лимфоцитов в пораженной коже больных псориазом до начала лечения и через 2 месяца терапии инфлик-симабом

показатель до лечения (п=15) через 2 месяца терапии (п=15) Р1

С04+ Э3 (абс. к-во/0,5мм) 1,6 [1,2-2,0]2 0,4 [0-0,6] 0,007

СЭ4+Д4 (абс. к-во/0,15мм2) 50,2 [34,2-61,0] 19,2 [13,8-24,8] 0,004

СП8+Э (абс. к-во/0,5мм) 23,0 [11,6-31,4] 6,6 [4,0-13,8] 0,006

С08+Д (абс. к-во/0,15мм2) 41,4 [33,6-53,4] 18,4 [7,8-39,6] 0,02

С0451Ю+ Э (абс. к-во/0,5мм) 16,4 [11,2-23,2] 1,6 [1,0-4,0] 0,0008

СЭ45ЯО+Д (абс. к-во/0,15мм2) 104,4 [56,6-139,2] 40,6 [28,4-67,8] 0,0008

Примечание:

'Р - уровень статистической значимости при сравнении показателей до начала лечения через 2 месяца терапии 2 медиана значений, в скобках приведены границы интерквартильных отрезков' 3Э - эпидермис, 4Д - дерма.

Анализ показателей адаптивного иммунитета у больного с отсутствием эффекта от лечения выявил увеличение содержания всех субпопуляций Т-лимфоцитов по сравнению с таковыми до начала лечения.

Таким образом, через 2 месяца лечения инфликсимабом разрешение высыпаний сопровождалось уменьшением количества С04+ лимфоцитов, С08+ лимфоцитов и С0451Ю+ лимфоцитов в пораженной коже больных псориазом, что свидетельствует о снижении миграции этих клеток в очаг воспаления под влиянием лечения. Через 1 год от начала терапии, появление у больных высыпаний незадолго до очередной инфузии инфликсимаба сопровождалось увеличением количества СЭ4+ лимфоцитов и С08+ лимфоцитов в дерме. Несмотря на это, уровень содержания СЭ4+ лимфоцитов, СЭ8+ лимфоцитов и С045ГШ+ лимфоцитов в пораженной коже оставался ниже, чем до начала лечения ин-

фликсимабом. При отсутствии эффекта от лечения в очагах пораженной кожи наблюдалось увеличение уровня содержания исследуемых субпопуляций Т-лимфоцитов, что является доказательством постоянного притока их в очаг воспаления.

Таблица 14. Содержание субпопуляций Т лимфоцитов в пораженной коже больных псориазом в процессе лечения инфликсимабом

показатель до лечения (п=6) через 2 месяца терапии (п=6) через! год от начала лечения (п=б) Р. Р2 Рэ

С04+Э (абс. к-во/0,5мм) 1,3 [0,8-4,6] 0,3 [0,2+0,4] 0,1 [0+0,4] 0,028 0,028 0,345

СП4+Д (абс. к-во/0,15мм2) 47,4 [43,6+59,4] 17,2(14,0+21,6] 28,5 [23,8+31,4] 0,046 0,028 0,345

С08+Э (абс. к-во/0,5мм) 27,2 [20,8+31,4] 7,6 [6,6+14,8] 1,6 [0,8+10,6] 0,028 0,028 0,116

СЭ8+Д (абс. к-во/0,15мм2) 42,9 [39,4+50,8] 21,1[15,4+25,4] 29,8 [25,8+44,2] 0,028 0,116 0,173

С045Я0+Э (абс. к-во/0,5мм) 19,9 [16,4+25,6] 1,8 [1,2+4,0] 1,9 [0,6+8,2] 0,028 0,028 0,892

С045Я0+ Д (абс. к-во/0,15мм2) 124,1[98,2+162,0] 53,6 [38,0+71,6] 40,2 [36,7+48,9] 0,028 0,028 0,173

Примечание:

IV уровень статистической значимости при сравнении показателей до начала лечения и через 2 месяца терапии Р2. уровень статистической значимости при сравнении показателей до начала лечения и через 1 год от начала лечения

Рэ. уровень статистической значимости при сравнении показателей через 2 месяца и через 1 год от начала лечения

Динамика изучаемых показателей у больных группы сравнения. У 15

больных (6 женщин и 9 мужчин) в возрасте от 23 до 68 лет (медиана 45 лет), получавших лечение различными методами системной терапии, было изучено распределение и содержание компонентов врожденного иммунитета (ТЫ12, ТЫ14, клеток Лангерганса), провоспалительного цитокина ИЛ-1а, молекул межклеточной адгезии (1САМ-1 и Е-селектина), субпопуляций Т лимфоцитов (С04+, СЭ8+, С045К0+). Продолжительность заболевания у этих больных составляла от 3 до 34 лет (медиана 16 лет), величина индекса РАвГ колебалась от 14,4 до 56,4 балла (медиана 35,4).

В результате проведенных исследований было установлено, что через 2 месяца лечения в группе сравнения наблюдалось статистически значимое снижение всех исследуемых показателей (табл. 15).

При сравнительном анализе исследуемых показателей, полученных через 2 месяца лечения, обнаружено, что содержание клеток Лангерганса и СЭ8+ Т лимфоцитов в эпидермисе у больных группы сравнения было статистически значимо ниже по сравнению с основной группой (соответственно 20,4 [14,2-27,8] и 13,8 [11,2-17,8]; Р = 0,027 и 6,6 [4,0-13,8] и 0,6 [0,4-1,0]; Р = 0,00007) (табл. 16). По остальным показателям достоверной разницы обнаружено не было.

Таким образом, результаты лечения больных псориазом, оцениваемые через 2 недели терапии по показателям динамики индекса РА81, как при лечении инфликсимабом, так и при лечении системными методами существенно не отличались.

Между тем, механизм реализации эффективности терапии при разных методах лечения больных несколько иной. Инфликсимаб, как препарат, представляющий собой смесь моноклональных антител мышей и человека против ФНО-а, связывает этот провоспалительный цитокин, вероятнее всего, в периферических органах иммунной системы с последующим «отключением» его биологических эффектов на системном уровне.

Эффективность лечения системными методами может быть обусловлена их местным воздействием, обеспечивающим значительное уменьшение активности кератиноцитов, снижением количества структур врожденного иммунитета, в том числе и притока в кожу клеток Лангерганса и цитотоксических Т лимфоцитов.

Таблица 15. Содержание исследуемых показателей в пораженной коже больных, получавших лечение методами системной терапии до начала лечения и через 2 месяца терапии

показатель до лечения (п=15) через 2 месяца терапии (п=15) Р1

TLR2 3J (мкм-) 1096 [817,7-1122,4]2 426,0 [322,6+475,2] 0,0006

TLR2 Д4 (%) 8,1 [6,1+9,6] 4,6 [2,8+6,7] 0,001

TLR4 Э (мкм2) 997,7 [773,9+1176,0] 380,6 [318,1+451,7] 0,0006

TLR4 Д (%) 8,9 [6,5+10,4] 6,4 [3,4+7,6] 0,002

CDla+Э (абс. к-во/0,5мм) 30,8 [26,6+37,0] 13,8 [11,2+17,8] 0,0006

CDla+ Д (абс. к-во/0,15мм2) 38,6 [29,2+51,6] 24,8 [19,2+27,0] 0,0006

CD4+ Э (абс. к-во/0,5мм) 1,8 [1,0+2,4] 0,2 [0+0,2] 0,0006

CD4+ Д (абс. к-во/0,15мм2) 54,2 [35,8+63,2] 22,8 [19,6+35,8] 0,0008

CD8+ Э (абс. к-во/0,5мм) 22,6 [18,2+30,6] 0,6 [0,4+1,0] 0,0006

CD8+ Д (абс. к-во/0,15мм2) 54,6 [29,8+63,0] 20,6 [11,6+36,4] 0,0006

CD45RO+3 (абс. к-во/0,5мм) 16,4 [12,4+23,4]2 1,4 [0,8+2.2] 0,0006

CD45RO+ Д (абс. к-во/0,15мм3) 107,4 [93,6+129,2] 62,6 [37,2+71,2] 0,001

ICAM-1 Э(мкм') 981,7 [784,3+1136,2] 395,2 [294,4+493,4] 0,0006

ICAM-1 Д (%) 8,6 [6,0+11,0] 6,6 [3,8+7,8] 0,001

Е-селект. Д(%) 8,8 [6,5+10,7] 5,6 [4,2+6,4] 0,0008

ИЛ-1 Э (мкм2) 975,3 [1821,6+21191,1] 390,1 [325,2+473,3] 0,0006

ИЛ-1 Д (%) 10,2 [6,1+12,1] 5,6 [4,3+7,6] 0,0006

Примечание:

!Р - уровень статистической значимости при сравнении показателей до начала лечения и через 2 месяца терапии 2 медиана значений, в скобках приведены границы интерквартальных отрезков 3Э - эпидермис, 4Д - дерма.

Таблица 16. Содержание исследуемых показателей в пораженной коже больных исследуемых групп через 2 месяца терапии

показатель больные основной группы (п=15) больные группы сравнения (п=15) Р'

■ШиЭ'(мкм2) 438,0 [322,3-810,4]2 426,0[322,6-475,2] 0,547

ТЬИ2 Д4 (%) 2,9 [2,5-5,1] 4,6 [2,8-6,7] 0,059

ТЬК4 Э (мкм2) 466,6 [338,3-747,0] 466,6 [338,3-747,0] 0,119

ТЬЯ4 Д (%) 5,8 [2,4-6,4] 6,4 [3,4-7,6] 0,237

СШа+Э (абс. к-во/0,5мм) 20,4 [14,2-27,8] 13,8 [11,2-17,8] 0,027

СШа+Д (абс. к-во/0,15мм2) 19,4 [17,6-22,4] 24,8 [19,2-27,0] 0,0563

С04+Э (абс. к-во/0,5мм) 0,4 [0-0,6] 0,2 [0-0,2] 0,078

С04+Д (абс. к-во/0,15мм2) 19,2 [13,8-24,8] 22,8 [19,6-35,8] 0,093

С08+Э (абс. к-во/0,5мм) 6,6 [4,0-13,8] 0,6 [0,4-1,0] 0,00007

С08+Д (абс. к-во/0,15мм2) 18,4 [7,8-39,6] 20,6 [11,6-36,4] 0,819

С045Я0+ Э (абс. к-во/0,5мм) 1,6 [1,0-4,0] 1,4 [0,8-2.2] 0,350

С045Я0+Д (абс. к-во/0,15мм2) 40,6 [28,4-67,8] 62,6 [37,2-71,2] 0,254

1САМ1Э(мкм2) 453,4 [366,6-671,1] 395,2 [294,4-493,4] 0,177

1САМ-1 Д(%) 4,0 [2,8-7,0] 6,6 [3,8-7,8] 0,290

Е-селект. Д (%) 3,8 [3,4-6,4] 5,6 [4,2-6,4] 0,309

ИЛ-1 Э (мкм2) 449,8[359,8-679,7] 390,1 [325,2-473,3] 0,329

ИЛ-1 Д(%) 4,0 [2,9-6,5] 5,6 [4,3-7,6] 0,158

Примечание:

'Р - уровень статистической значимости при сравнении показателей основной группы и группы сравнения 2 медиана значении, в скобках приведены границы интерквартальных отрезков 3Э - эпидермис, 4Д - дерма.

Выводы:

1. При проведении морфометрической оценки содержания компонентов врожденного иммунитета в пораженной коже больных псориазом установлено повышение экспрессии толл-подобных рецепторов 2 и 4 типов, провоспалительного цитокина ИЛ-1а, а также увеличение количества клеток Лангерганса в эпидермисе и дерме по сравнению с кожей здоровых лиц, что свидетельствует об их участии в развитии воспалительного процесса. Экспрессия толл-подобного рецептора 9 типа и ФНО-а как в коже больных псориазом, так и у здоровых лиц не определяется.

2. Исследование морфометрических параметров содержания компонентов адаптивного иммунитета выявило увеличение экспрессии молекул межклеточной адгезии 1САМ-1 (в эпидермисе и дерме, на эндотелии сосудов), Е-селектина (на эндотелии сосудов), что является необходимым условием для миграции в эпидермис и дерму пораженной кожи хелперных (С04+), цитотоксических (С08+) лимфоцитов и Т-клеток памяти (С0451Ю+).

3. При наблюдении за больными в течение 2-х месяцев установлено, что терапия инфликсимабом позволила достичь клинического выздоровления (ДРА81 >90%) у 12 (32%) больных, значительного улучшения (ДРА81 >75-89%) у 19 (50%) больных, улучшения (ДРА81 >50-74%) у 5 (13%) больных. У одного больного терапия инфликсимабом была неэффективна, индекс РАЭ1 не претерпевал изменений. При наблюдении за больными в течение 1 года наблюдалась экзацербация кожного процесса, характеризующаяся появлением мелких, слабо инфильтрированных папул, локализованных на коже конечностей.

4. В процессе терапии инфликсимабом установлено, что через 2 месяца наблюдения достижение клинической эффективности сопровождалось следующими изменениями содержания показателей врожденного и адаптивного иммунитета в очагах поражения:

-снижением экспрессии толл-подобных рецепторов 2 (с 975,6 мкм2 до 438,0 мкм2, Р = 0,004 в эпидермисе; с 5,4% до 2,9% в дерме, Р = 0,004) и 4

типов (с 961,9 мкм2 до 466,6 мкм2, Р = 0,005 в эпидермисе; с 8,1% до 5,8% в дерме, Р = 0,006);

-снижением экспрессии провоспалительного цитокина ИЛ-1а (с 925,6 мкм2 до 449,8 мкм2, Р = 0,004 в эпидермисе; с 7,9% до 4,0% в дерме, Р = 0,002);

-снижением экспрессии молекул межклеточной адгезии ICAM-1 (с 956,0 мкм2 до 453,4 мкм2, Р = 0,002 в эпидермисе; с 7,8% до 4,0% в дерме, Р = 0,003) и Е-селектина (с 8,5% до 3,8% в дерме, Р = 0,006); -уменьшением количества субпопуляций Т-клеток - хелперных CD4+ лимфоцитов (с 1,6/0,5 мм до 0,4/0,5 мм в эпидермисе, Р = 0,007; с 50,2/0,15 мм2 до 19,2/0,15 мм2 в дерме, Р = 0,004), цитотоксических С08+лимфоцитов (с 23,0/0,5 мм до 6,6/0,5 мм в эпидермисе, Р = 0,006; с 41,4/0,15 мм2 до 18,4/0,15 мм2 в дерме, Р = 0,02), CD45RO+ Т клеток памяти (с 16,4/0,5 мм до 1,6/0,5 мм в эпидермисе, Р = 0,0008; с 104,4/0,15 мм2 до 40,6/0,15 мм2 в дерме, Р = 0,0008);

-уменьшением количества клеток Лангерганса в дерме (с 42/0,15 мм2 до 19,4/0,15 мм2, Р = 0,009) и тенденцией к уменьшению их количества в эпидермисе (с 29,6/0,5 мм до 20,4/0,5 мм, Р = 0,03).

5. При патоморфологическом исследовании в папулезных элементах, появляющихся у больных, получающих инфликсимаб, через 1 год отсутствует картина, характерная для прогрессирующей стадии псориаза. При имму-номорфологическом исследовании имеет место увеличение числа CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов при отсутствии увеличения экспрессии компонентов врожденного иммунитета.

6. Изучение показателей врожденного и адаптивного иммунитета у больных, получающих терапию инфликсимабом, позволило установить, что в разрешающихся высыпаниях сохраняется повышенное содержание активированных клеток Лангерганса, наличие которых является прогностическим признаком, свидетельствующим об отсутствии полного подавления патологического процесса, а также о высокой вероятности развития

обострения. Данный факт должен учитываться при проведении исследований, направленных на поиск патогенов, вызывающих развитие псориаза, а также при разработке новых таргентных препаратов для лечения данного заболевания.

Практические рекомендации:

Рекомендуется использовать иммуноморфологический метод определения количества толл-подобных рецепторов, клеток Лангерганса, адгезивных молекул (ICAM 1 и Е селектин), ИЛ-1а, CD4, CD8 позитивных Т лимфоцитов и Т-клеток памяти для разработки новых методов системной терапии и индивидуального подбора существующих системных методов лечения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Волнухин В.А. Гистологические и иммуногистохимические изменения кожи больных псориазом при лечении ПУВА-ваннами /В.А.Волнухин, A.M. Вавилов, И.В. Кравцова, O.P. Катунина // Вестн. дерматол. и вене-рол. -2007.-№2.-С.З-7.

2. Катунина O.P. Иммунопатологические процессы в коже / O.P. Катунина, A.B. Резайкина, A.M. Вавилов, Н.В. Баконина // II Всеросс. конгр. дерматовенерологов: Тез. науч. раб. - 25-28 сентября 2007г. - С.Пб.,2007. - С.62.

3. Резайкина A.B. Характеристика иммунопатологических реакций в коже при дерматозах / A.B. Резайкина, A.M. Вавилов, O.P. Катунина // Клиническая дерматовенерология: в 2т. / под ред. Ю.К. Скрипкина, Ю.С. Бутова. - М.:ГЭОТАР-Медиа, 2009. - С.48-55.

4. Катунина O.P. Современные представления об участии кожи в иммунных процессах / O.P. Катунина, A.B. Резайкина // Вестн. дерматол. и ве-нерол. - 2009. - №2. - С.39-46.

5. Катунина O.P. Роль врожденного и адаптивного иммунитета в патогенезе псориаза / O.P. Катунина // Вестн. дерматол. и венерол. - 2009. - №5. -С.43-48.

6. Катунина O.P. Изменение показателей адаптивного иммунитета в коже больных псориазом на фоне иммуносупрессивной терапии / O.P. Катунина// Современные проблемы общей и частной патологической анатомии: Мат-лы Всеросс. науч. конф., посвящ. 150-летию кафедры патологической анатомии BMA им. С.М. Кирова. - 24 апр. 2009 г.- СПб., 2009. -С.62-63.

7. Катунина O.P. Экспрессия молекулы главного комплекса гистосовме-стимости II класса в коже у здоровых лиц и у больных псориазом / O.P. Катунина // Мат-лы III съезда Рос. общества патологоанатомов. - 26-30 мая 2009 г. - Самара.,2009. - С. 233-234.

8. Катунина O.P. Клетки Лангерганса в коже больных распространенным псориазом в процессе лечения биологическим препаратом инфликсимаб / O.P. Катунина, А.Д. Попов // 1-ая Всеросс. конф. по дерматовенерологии ФМБА России «Актуальные вопросы дерматологии и урогенитальной патологии»: Тез. докл. - 5-6 ноября 2009 г. - М.,2009. - С. 25-28.

9. Кубанова A.A. Иммунные механизмы псориаза. Новые стратегии биологической терапии / A.A. Кубанова, A.A. Кубанов, Дж. Николас, Л. Пьюиг, Дж. Принц, O.P. Катунина, Л.Ф. Знаменская // Вестн. дерматол. и вене-рол. - 2010. - №1. - С.35-47.

10. Кубанова A.A. Иммуноморфология и морфогенез очагов пораженной кожи при псориазе / A.A. Кубанова, O.P. Катунина // Вестн. дерматол. и венерол. - 2010. -№1. - С.70-79.

11. Катунина O.P. Роль распознающих рецепторов в инициации иммунного воспаления в коже больных псориазом / O.P. Катунина, A.B. Резайкина, О.И. Колыхалова // Вестн. дерматол. и венерол. - 2010. - №5. - С.84-91.

12. Катунина O.P. Участие распознающих рецепторов в инициации иммунного воспаления у больных псориазом / O.P. Катунина, A.A. Кубанова, A.B. Резайкина // Сб. науч. тр. VIII Всеросс. конф. по патологии клетки. -11-12 ноября 2010 г. -М.: МДВ,2010.-С. 114-116.

13. Катунина О.Р. Роль Толл-подобных рецепторов в развитии иммунного воспаления у больных псориазом / О.Р. Катунина // Сб. науч. раб. XI Все-росс. съезда дерматовенерологов и косметологов. - 9-12 ноября. 2010г. -Екатеринбург,2010. - С. 51-52.

14. Катунина О.Р. Функции Toll - подобных рецепторов как компонента врожденного иммунитета и их участие в патогенезе дерматозов различной этологии / О.Р. Катунина // Вестн. дерматол. и венерол. - 2011. - №2. -С. 18-25.

15. Резайкина А.В. Современные методы иммунобиологической терапии больных псориазом / А.В. Резайкина, Л.Ф. Знаменская, О.Р. Катунина // Аллергол. и иммунол. - 2011. - Т.12, №1. - С.32. Тезисы докладов XVI Международного конгресса по реабилитации в медицине и иммунореа-билитации (Париж, Франция, 30 апреля-3 мая, 2011).

16. Kubanova A. Role of Toll-like receptors in the development of immune inflammation in patients with psoriasis / A. Kubanova, O. Katunina, O.Kolykhalova, I.Lesnaya // Abstract of 22nd World Congress of Dermatology.

- 24-29 May 2011. - Seoul, 2011. - P. 1376.

17. Катунина О.Р. Исследование пораженной кожи больных псориазом в процессе лечения инфликсимабом (морфологический анализ) /О.Р. Катунина, Л.Ф. Знаменская, Ю.И Матушевская // Вестн. дерматол. и венерол. -2011.-№3.-С. 58-62.

18. Катунина О.Р. Содержание субпопуляций Т-лимфоцитов и молекул межклеточной адгезии в пораженной коже больных псориазом на фоне лечения инфликсимабом / О.Р. Катунина, Ю.И. Матушевская // Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии. - 2011. - №3. - С. 12-17.

19. Катунина О.Р. Врожденный иммунитет в коже больных псориазом на фоне лечения инфликсимабом / О.Р. Катунина // Тез. II континент, конгр. дерматологов / IV Всеросс. конгр. дерматовенерологов. - 6-9 июля 2011г.

- СПб.,2011. — С.246-247.

20. Катунина O.P. Провоспалительные цитокины ИЛ-1 и ФНО-а в очагах пораженной кожи больных псориазом /O.P. Катунина, A.B. Резайкина // Вестн. дерматол. и венерол. - 2011. - №4. - С. 25-30.

21. Катунина O.P. Особенности противовоспалительного эффекта инфлик-симаба у пациентов с псориазом / O.P. Катунина // Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии. -2011. -№4.-С.12-17.

22. Катунина O.P. Морфофункциональная организация лимфоидной ткани, ассоциированной с кожей и её роль в иммунных реакциях / O.P. Катунина //Арх. патол. - 2011. - №5. - С. 40-43.

23. Катунина O.P. Участие компонентов врожденного иммунитета в патогенезе псориаза / O.P. Катунина // Арх. патол. - 2011. - №5. - С. 62-65.

24. Катунина O.P. Патоген-распознающие рецепторы и их роль во взаимодействии врожденного и адаптивного иммунитета в коже больных псориазом / O.P. Катунина // Иммунология. - 2011. - №5. - С.261-64.

25. Катунина O.P. Иммуногистохимический анализ молекулярно-клеточных компонентов врожденного и адаптивного иммунитета у больных псориазом в процессе биологической терапии / O.P. Катунина // Вестн. дерматол. и венерол. - 2011. - №5. — С.70-77.

26. Катунина O.P. Экспрессия молекул межклеточной адгезии ICAM-1 и Е-селектина в очагах пораженной кожи больных псориазом / O.P. Катунина //Иммунология,- 2011. - №6,- С.328-331

Автор выражает глубокую благодарность своему учителю и наставнику, профессору |Александру Михайловичу Вавилову.]

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ИЛ-1а-интерлейкин 1 - альфа ФНО-а - фактор некроза опухоли-а

CD - маркеры кластерной дифференцировки клеток костномозгового происхождения

ICAM -1 (intercellular adhesion molecule-1) - молекула межклеточной адгезии-1

PASI - Psoriasis area and severity index

TLRs (toll-like receptors) - толл-подобные рецепторы

Подписано в печать:

08.12.2011

Заказ № 6385 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 wwvv.autoreferat.ru

Актуальность проблемы

Псориаз - один из тяжелых дерматозов мультифакториальной природы, имеющий наследственную предрасположенность. Заболевание характеризуется рецидивирующим течением с частыми обострениями (Griffiths С.Е., 2007; Lowes М.А., 2007; Скрипкин Ю.К., Бутов Ю.С., 2009; Nestle F.O., 2009, Navarini A.A., 2010). Нередко сочетается с патологией органов желудочно-кишечного тракта, сердечнососудистой системы, вовлечением в патологический процесс суставов (Neimann A.L., 2006; Katsambas А., 2008; Navarini A.A., 2010).

Кожные высыпания при псориазе формируются за счет гиперпролиферации и нарушения дифференцировки кератиноцитов, развития воспалительной инфильтрации в дерме, опосредованной активированными Т лимфоцитами (Liu Y., Krueger J.G. et.al., 2007; Griffiths C.E., Barker J.N., 2007; Скрипкин Ю.К., Бутов Ю.С., 2009 и др.). Существуют данные, что появление основных патоморфологических феноменов в очагах пораженной кожи больных псориазом (акантоза эпидермиса, паракератоза, микроабсцессов Мунро, воспалительной инфильтрации дермы) опосредовано биологическим эффектом продукта активированных клеток кожи - провоспалительного цитокина - фактора некроза опухоли альфа (ФНО-а) (Nickoloff B.J., 1991; Griffiths С.Е., 2007; Lin J., 2008). Относительно клеток продуцентов ФНО-а, его рецепторов, клеток-мишеней и биологических эффектов этого цитокина, имеются многочисленные публикации в научной литературе, однако они касаются процессов, происходящих только в органах иммунной системы. Данные о степени его экспрессии, как показателя активированного состояния клеток непосредственно в очагах пораженной кожи в отечественной литературе отсутствуют.

Клетки кожи с разнообразными распознающими рецепторами -кератиноциты эпидермиса, антигенпрезентирующие клетки кожи (клетки Лангерганса), нейтрофильные лейкоциты, антибактериальные пептиды относятся к структурам врожденного иммунитета и участвуют, прежде всего, в осуществлении барьерных функций. Если при внедрении патогена эти структуры не могут обеспечить его элиминации, то врожденные механизмы защиты обеспечивают обработку патогена для взаимодействия с Т лимфоцитами с последующим развитием адаптивного иммунного ответа. (Barrai D.C., Brenner М.В., 2007; Ярилин A.A., 2010, и др.). Данные литературы о количестве клеток Лангерганса при псориазе весьма противоречивы (Deguchi M., Alba S. et.al., 2002; Lowes M.A., Chamian F. et.al., 2005). Исследования по изучению роли толл-подобных рецепторов в патогенезе псориаза в Российской Федерации не проводились.

Интерлейкин 1 (ИЛ-1) экспрессируется в коже человека для выполнения ряда физиологических функций (регуляция синтеза и деградации коллагеновых волокон и гиалуроновой кислоты в дерме и др.) (Schoch Р., Помыткин И. 2010). В то же время известно, что ИЛ-1, обладая плейотропным характером биологической активности, регулирует все стороны воспалительной реакции. Изучение роли и функции ИЛ-1 при псориазе привело к противоречивым результатам (Cooper К, Hammerberg С. et al., 1990; Debets R., Hegmans J.P. et al., 1995; Громова А.Ю., Чаплыгин A.B. и др., 2005). Поэтому интерес к изучению экспрессии ИЛ-1 непосредственно в пораженной коже больных псориазом возникает как с позиции получения нового иммуноморфологического параметра для оценки активированного состояния клеток кожи, так и для определения эффективности лечения.

Повышенное количество Т лимфоцитов, являющихся составляющей адаптивного иммунитета, обнаруживается в дермальных воспалительных инфильтратах (Охлопков В.А., 2004; Пинсон И.Я., 2006). Циркуляция лимфоцитов между структурами кожи и регионарными лимфатическими узлами строго регулируется молекулами межклеточной адгезии (Ярилин A.A., 2009). Поэтому характеристика таких адгезивных молекул, как ICAM-1 и Еселектин, в коже больных псориазом, несомненно, имеет большое значение для понимания механизма формирования воспалительного инфильтрата.

Существующие методы системной терапии псориаза недостаточно эффективны, так как они направлены лишь на удлинение периодов ремиссии, снижение степени тяжести заболевания и не приводят к полному излечению больных (Nijsten Т., 2005). Повышение эффективности лечения псориаза остается одной из важных проблем дерматологии, решение которой зависит от результатов исследований, направленных на углубление знаний о механизмах патогенеза этого заболевания.

Достижения в сфере молекулярных и клеточных биотехнологий позволили разработать новый класс лекарственных препаратов, являющихся рецепторными или химическими антагонистами различных медиаторов воспаления. Один из механизмов действия биологических препаратов заключается в нарушении связывания эндогенного лиганда с соответствующим рецептором, приводящем к модификации биологических реакций из-за блокирования системы внутриклеточной передачи сигнала (Jackson J.M., 2007; Козлов И.Г., 2009).

В последние годы в терапии псориаза стали использовать генно-инженерные биологические препараты (Sterry W., 2004; Purcell R.T., 2008; Nestle F.O., 2009; Navarini A.A., 2010). В России зарегистрированным и разрешенным к применению для лечения псориаза и псориатического артрита является препарат инфликсимаб (Ремикейд). По наблюдениям отечественных и зарубежных исследователей, терапия инфликсимабом у большинства больных более эффективна, чем при лечении другими системными методами терапии (Boehncke W.H., 2007; Menter А., 2007; Кубанов A.A., Матушевская Ю.И., 2008; Castelo-Soccio L., 2009; Курдина М.И., 2010). Однако инфликсимаб в терапии больных псориазом применятся сравнительно недавно, поэтому механизм реализации его терапевтической эффективности нельзя считать полностью изученным. Работы, посвященные изучению изменений морфологической картины в коже больных псориазом под влиянием терапии биологическими модификаторами иммунных реакций немногочисленны. Данные об иммуноморфологических показателях врожденного и адаптивного иммунитета в процессе биологической терапии приводятся в единичных работах. Комплексный клинико-иммуноморфологический анализ структурной характеристики и особенностей функционирования врожденного и адаптивного иммунитета необходим для получения новых данных о механизмах развития воспалительного процесса при псориазе и достижения эффекта терапии биологическими модификаторами иммунного ответа, что определяет актуальность, своевременность и целесообразность проведения настоящего исследования

Цель работы: изучить роль и особенности функционирования компонентов врожденного и адаптивного иммунитета в патогенезе псориаза и оценить динамику показателей иммунного воспаления в коже больных псориазом в процессе терапии биологическим модификатором иммунного ответа -инфликсимабом. Задачи:

1. Провести оценку содержания компонентов врожденного иммунитета морфометрическим методом по показателям экспрессии и распределения в эпидермисе и дерме пораженной кожи больных псориазом: толл-подобных рецепторов 2, 4 и 9 типов, провоспалительных цитокинов ИЛ-1а и ФНО-а, количества клеток Лангерганса.

2. Исследовать морфометрические параметры экспрессии молекул межклеточной адгезии 1САМ-1 и Е-селектина, а также содержания компонентов адаптивного иммунитета с учетом показателей распределения в эпидермисе и дерме пораженной кожи больных псориазом субпопуляций Т лимфоцитов (С04+, СБ8+, СБ451Ш+).

3. Изучить динамику клинической картины заболевания у больных псориазом, получающих терапию инфликсимабом, по результатам ближайших и отдаленных наблюдений (по истечении 2-х месяцев и 1-го года).

4. Провести анализ динамики показателей врожденного и адаптивного иммунитета в коже больных псориазом в процессе терапии инфликсимабом.

5. Определить взаимосвязь между клиническими проявлениями на коже больных псориазом, патоморфологической картиной и показателями врожденного и адаптивного иммунитета в процессе отдаленных наблюдений.

6. Оценить прогностическую значимость показателей врожденного и адаптивного иммунитета у больных псориазом, получающих терапию инфликсимабом.

Научная новизна:

Впервые у больных псориазом проведено иммуноморфологическое исследование, включающее одновременное комплексное определение состояния структур врожденного и адаптивного иммунитета, что является новым перспективным направлением, позволяющим более эффективно изучать закономерности развития воспаления в коже больных и реализации эффективности терапии.

Результаты исследования, основанные на анализе распределения толл-подобных рецепторов разных типов, клеток Лангерганса, относящихся к структурам врожденного иммунитета, субпопуляций Т лимфоцитов, относящихся к структурам адаптивного иммунитета, молекул, обеспечивающих рекруитмент клеток адаптивного иммунитета в очаг поражения (адгезивные молекулы) и определяющих активацию клеток кожи (провоспалительные цитокины), позволили расширить представления о роли врожденного иммунитета и показать, что такие его структуры, как толл-подобные рецепторы 2 и 4 типов и клетки Лангерганса не только участвуют в запуске иммунного воспаления, но и способны регулировать интенсивность иммунной реакции в коже больных, доказательством чего является наличие корреляционной связи между этими показателями. Изучение параметров содержания компонентов врожденного и адаптивного иммунитета позволило установить, что кератиноциты эпидермиса и эндотелиоциты сосудов непосредственно участвуют в иммунных реакциях при развитии воспалительного процесса в пораженной коже больных псориазом.

Установлено, что воспалительный процесс в коже развивается при значительном увеличении молекул межклеточной адгезии 1САМ-1 (на кератиноцитах эпидермиса, эндотелиоцитах сосудов, клетках воспалительного инфильтрата) и Е-селектина (на эндотелиоцитах сосудов), необходимых для обеспечения межклеточных взаимодействий. Показано, что в коже здоровых лиц не возникает необходимости в экспрессии молекулы 1САМ-1.

Выявлены особенности экспрессии провоспалительных цитокинов в структурах пораженной кожи больных псориазом: при наличии клинических признаков воспаления установлено увеличение экспрессии ИЛ-1а на кератиноцитах эпидермиса, эндотелиоцитах сосудов и клетках воспалительного инфильтрата, в то время как, иммуногистохимическим методом признаков экспрессии ФНО-а обнаружено не было.

Вскрыты неизвестные ранее механизмы действия инфликсимаба, заключающиеся в уменьшении экспрессии распознающих рецепторов ТЪЫ2 и Т1Л14, провоспалительного цитокина ИЛ-1а, молекул межклеточной адгезии 1САМ-1 и Е-селектина в процессе терапии.

Практическая значимость работы:

Изучение показателей врожденного и адаптивного иммунитета, непосредственно в пораженном органе, в процессе антицитокиновой терапии, позволило установить, что этот метод лечения обладает стабильно нормализующим влиянием на патогенетические компоненты хронического воспаления, сопровождающимся разрешением высыпаний на коже больных. Данные, полученные в ходе исследования, позволили, в соответствии с правилами доказательной медицины, объективно оценить и обосновать эффективность терапии инфликсимабом.

Результаты исследования по определению в коже больных количества толл-подобных рецепторов 2 и 4 типов, клеток Лангерганса, молекул межклеточной адгезии, провоспалительного цитокина ИЛ-1а, основных субпопуляций Т лимфоцитов, в перспективе могут быть использованы для научно-обоснованной оптимизации существующих методов системной терапии и являются основой для разработки новых методов лечения псориаза, а также в исследованиях, ориентированных на поиск антигенов, вызывающих развитие иммунного воспаления у больных псориазом. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Защитные функции кожи, находящейся в непрерывном взаимодействии с внешней средой, и развитие иммунного воспаления при псориазе осуществляются одними и теми же структурами врожденного иммунитета: толл-подобными рецепторами 2 и 4 типов и клетками Лангерганса. Разница между этими процессами заключается в количестве, различном распределении в компартментах кожи и степени активации структур. Патофизиологическая стадия при развитии воспалительного процесса у больных псориазом сопровождается увеличением числа активированных структур врожденного иммунитета, о чем свидетельствует повышение экспрессии распознающих рецепторов ТЪЯ2 и ТЬЯ4 и количества антигенпрезентирующих клеток Лангерганса (СБ 1а) в эпидермисе и дерме пораженной кожи.

2. Формирование воспалительных инфильтратов в пораженной коже больных псориазом происходит на фоне увеличения экспрессии адгезивных молекул 1САМ-1 и Е-селектина, которые в коже у здоровых лиц продуцируются в незначительном количестве.

3. Связывание провоспалительного цитокина ФНО-а при введении инфликсимаба приводит к существенному уменьшению числа толл-подобных рецепторов, количества активированных клеток адаптивного иммунитета, адгезивных молекул в коже. В то же время, в разрешающихся высыпаниях количество активированных клеток Лангерганса остается повышенным, что является предрасполагающим фактором, способствующим обострению патологического процесса.

4. Появление в отдаленном периоде папулезных элементов у больных псориазом, получающих инфликсимаб сопровождается увеличением числа CD4+ и CD8+ лимфоцитов.

5. Биологическая терапия является перспективным методом терапии псориаза. Предложенный алгоритм исследования является основой для разработки новых таргентных препаратов.

Апробация работы.

Основные положения работы представлены и обсуждены в ходе проведения:

-II Всероссийского конгресса дерматовенерологов (г. Санкт-Петербург, 25-28 сентября 2007 г.);

-III Всероссийского конгресса дерматовенерологов (г. Казань, 5-9 ноября 2009 г.);

-научно-практических конференциях ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития

России (г. Москва, 25 сентября 2009 г. и 28 мая 2010 г.);

-пленарном заседании Московского общества дерматовенерологов им. А.И.

Поспелова (г. Москва, 18 февраля 2010 г.);

-XI Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов (г.

Екатеринбург, 9-12 ноября 2010 г.);

-VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (г. Москва, 11-12 ноября 2010 г.);

-22-м Мировом Конгрессе дерматологов (Корея, г. Сеул, 24-29 мая 2011 г.);

-II Континентальном конгрессе дерматологов международного дерматологического общества/ IV Всероссийском конгрессе дерматологов (г. Санкт-Петербург, 5-9 июля 2011 г.).

Внедрение результатов исследования.

Иммуноморфологические методы исследования внедрены в работу отдела лабораторной диагностики инфекций, передаваемых половым путем и болезней кожи ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России.

Полученные в ходе выполнения исследования результаты, используются в обучающих программах сертификационных курсов для дерматовенерологов, на занятиях с клиническими ординаторами и аспирантами, на циклах общего и тематического усовершенствования ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития, включены в учебный процесс кафедры клинической микологии и дерматовенерологии ФПКМР РУДН и кафедры дерматовенерологии ГБОУ ВПО Тверской Государственной Медицинской академии.

Результаты исследования, касающиеся характеристики иммунопатологических реакций в коже при псориазе были использованы при составлении глав в руководствах для врачей: Клиническая дерматовенерология: 2 т./под редакцией Ю.К. Скрипкина, Ю.С. Бутова, 2009г. и Дерматовенерология. Национальное руководство/под редакцией Ю.К. Скрипкина, Ю.С. Бутова, О.Л. Иванова, 2011г.

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 26 научных работах, из которых 17 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Личный вклад автора в проведенное исследование.

Автором подготовлен обзор данных отечественных и зарубежных литературных источников по теме исследования, разработан дизайн исследования. Проведена гистологическая обработка биопсийного материала, изготовлены срезы биоптатов, на которых в последующем осуществлена постановка иммуногистохимической реакции. С помощью светового микроскопа проведен анализ полученных гистологических и иммуногистохимических препаратов, проведено фотодокументирование патоморфологической картины. С применением компьютерной программы анализа изображения 1ша§е1 проведен морфометрический анализ исследуемых показателей. С помощью прикладной программы осуществлена статистическая обработка полученных материалов. Проведена интерпретация данных, сформулированы выводы и практические рекомендации.

Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 185 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 21 таблицей и 47 рисунками (80 фотографий). Состоит из введения, 6 глав с описанием данных литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, содержащего 55 источников на русском и 191 источник на иностранных языках.

Выводы:

1. При проведении морфометрической оценки содержания компонентов врожденного иммунитета в пораженной коже больных псориазом установлено повышение экспрессии толл-подобных рецепторов 2 и 4 типов, провоспалительного цитокина ИЛ-la, a также увеличение числа клеток Лангерганса в эпидермисе и дерме по сравнению с кожей здоровых лиц, что свидетельствует об их участии в развитии воспалительного процесса. Экспрессия толл-подобного рецептора 9 типа и ФНО-а как в коже больных псориазом, так и у здоровых лиц не определяется.

2. Исследование морфометрических параметров содержания компонентов адаптивного иммунитета выявило увеличение экспрессии молекул межклеточной адгезии ICAM-1 (в эпидермисе и дерме, на эндотелии сосудов), Е-селектина (на эндотелии сосудов), что является необходимым условием для миграции в эпидермис и дерму пораженной кожи хелперных (CD4+), цитотоксических (CD8+) лимфоцитов и Т-клеток памяти (CD45RO+).

3. При наблюдении за больными в течение 2-х месяцев установлено, что терапия инфликсимабом позволила достичь клинического выздоровления (АРASI >90%) у 12 (32%) больных, значительного улучшения (АРASI >75-89%) у 19 (50%) больных, улучшения (APASI >50-74%) у 5 больных. У одного больного терапия инфликсимабом была неэффективна, индекс PASI не претерпевал изменений. При наблюдении за больными в течение 1 года наблюдалась экзацербация кожного процесса, характеризующаяся появлением мелких, слабо инфильтрированных папул, локализованных на коже конечностей.

4. В процессе терапии инфликсимабом установлено, что через 2 месяца наблюдения достижение клинической эффективности сопровождалось следующими изменениями содержания показателей врожденного и адаптивного иммунитета в очагах поражения:

-снижением экспрессии толл-подобных рецепторов 2 (с 975,6 мкм2 до 438,0 мкм2, Р = 0,004 в эпидермисе; с 5,4% до 2,9% в дерме, Р = 0,004) и 4 типов (с 961,9 мкм2 до 466,6 мкм2, Р = 0,005 в эпидермисе; с 8,1% до 5,8% в дерме, Р = 0,006);

-снижением экспрессии провоспалительного цитокина ИЛ-1а (с 925,6 мкм2 до 449,8 мкм2, Р = 0,004 в эпидермисе; с 7,9% до 4,0% в дерме, Р = 0,002);

-снижением экспрессии молекул межклеточной адгезии ICAM-1 (с 956,0 мкм2 до 453,4 мкм2, Р = 0,002 в эпидермисе; с 7,8% до 4,0% в дерме, Р = 0,003) и Е-селектина (с 8,5% до 3,8% в дерме, Р = 0,006); -уменьшением количества субпопуляций Т клеток - хелперных CD4+ лимфоцитов (с 1,6/0,5 мм до 0,4/0,5 мм в эпидермисе, Р = 0,007; с 50,2/0,15 мм2 до 19,2/0,15 мм2 в дерме, Р = 0,004), цитотоксических С08+лимфоцитов (с 23,0/0,5 мм до 6,6/0,5 мм в эпидермисе, Р = 0,006; с 41,4/0,15 мм2 до 18,4/0,15 мм2 в дерме, Р = 0,02), CD45RO+ Т клеток памяти (с 16,4/0,5 мм до 1,6/0,5 мм в эпидермисе, Р = 0,0008; с 104,4/0,15 мм2 до 40,6/0,15 мм2 в дерме, Р = 0,0008); -уменьшением количества клеток Лангерганса в дерме (с 42/0,15 мм2 до 19,4/0,15 мм2, Р = 0,009) и тенденцией к уменьшению их количества в эпидермисе (с 29,6/0,5 мм до 20,4/0,5 мм, Р = 0,03).

5. При патоморфологическом исследовании в папулезных элементах, появляющихся у больных, получающих инфликсимаб, через 1 год отсутствует картина, характерная для прогрессирующей стадии псориаза. При иммуноморфологическом исследовании имеет место увеличение числа CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов при отсутствии увеличения экспрессии компонентов врожденного иммунитета.

6. Изучение показателей врожденного и адаптивного иммунитета у больных, получающих терапию инфликсимабом, позволило установить,

157 что в разрешающихся высыпаниях сохраняется повышенное содержание активированных клеток Лангерганса, наличие которых является прогностическим признаком, свидетельствующим об отсутствии полного подавления патологического процесса, а также о высокой вероятности развития обострения. Данный факт должен учитываться при проведении исследований, направленных на поиск патогенов, вызывающих развитие псориаза, а также при разработке новых таргентных препаратов для лечения данного заболевания.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

Рекомендуется использовать иммуноморфологический метод определения количества толл-подобных рецепторов, клеток Лангерганса, адгезивных молекул (ICAM 1 и Е селектин), ИЛ-la, CD4, CD8 позитивных Т лимфоцитов и Т-клеток памяти для разработки новых методов системной терапии и индивидуального подбора существующих системных методов лечения.

Автор выражает глубокую благодарность своему безвременно ушедшему учителю и наставнику, профессору \4лександру Михайловичу Вавилову.