Автореферат и диссертация по медицине (14.01.25) на тему:Ассоциация полиморфизма генов NR3C1 и MDR1 с терапевтической резистентностью и глюкокортикоидной терапией у больных бронхиальной астмой

СИМАКОВА Мария Александровна

АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ N1*30 И МБШ С ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ И ГЛЮКОКОРТИКОИДНОЙ ТЕРАПИЕЙ У БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ

14.01.25 - пульмонология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург - 2011

7 ДПР 2011

4842338

Работа выполнена на кафедре госпитальной терапии имени академика М.В. Черноруцкого Санкт-Петербургского Государственного Медицинского университета имени академика И.П.Павлова

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Трофимов Василий Иванович

Гембицкая Татьяна Евгеньевна

Коровина Оксана Всеволодовна

Ведущая организация: Российская военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Защита диссертации состоится 19 апреля 2011 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.090.02 при Санкт-Петербургском Государственном Медицинском университете имени академика И.П.Павлова в Научно-исследовательском институте пульмонологии (197022, Санкт-Петербург, ул. Рентгена, дом 12).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского Государственного Медицинского университета имени академика ИЛЛавлова (197022, Санкт-Петербург, ул. Л.Толстого, дом 6-8).

Автореферат разослан « » й^у_2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

А.Л. Александров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность проблемы. Бронхиальная астма (БА) относится к группе мультифакториальных заболеваний. В её патогенез вовлечены различные функционально взаимосвязанные гены, включающие наряду с главными генами, ответственными за начало болезни, гены-модификаторы, эффекты которых во многом определяются внешними факторами (Баранов B.C., 2005).

Благодаря многочисленным противовоспалительным эффектам глюкокортикостероидных гормонов, использование их в качестве базисной терапии БА в настоящее время считается общепризнанным (Global Initiative for Asthma, 2008). Предпочтение отдается ингаляционным глюкокортикоидам (ИГКС). Однако при обострении и тяжелой астме по показаниям применяются также системные глюкокортикостероиды (СГКС) в разных режимах. Противовоспалительный эффект этих препаратов реализуется путем взаимодействия их с глюкокортикоидными рецепторами (ГР), что приводит к изменению экспрессии генов, вовлеченных в воспаление.

Несмотря на достигнутые успехи, ситуация в отношении контроля данного заболевания остается напряженной (Чучалин А.Г., 2005). Об этом свидетельствуют результаты международных эпидемиологических исследований (AIRE, AIRCEE), в которых контроль над болезнью был зарегистрирован только у 5-30% пациентов. Данные эпидемиологических исследований, проведенных в России, выявили отсутствие контроля над симптомами БА у 86,1% пациентов (Ленская JI. Г., 2004).

За рубежом и в России в течение последних 10 лет активно разрабатывается тема тяжелой, трудно курабельной астмы. Эксперты сходятся во мнении, что необходимо выработать единые критерии постановки данного диагноза. Это трудная задача, учитывая очевидное существование нескольких фенотипов тяжелой астмы. В англоязычной медицинской литературе для обозначения разных вариантов течения БА авторами используются следующие термины «brittle asthma», «fatal asthma», «chronic difficult asthma», «difficult-to-treat asthma», при чем в клиническом описании одного и того же пациента может быть использовано несколько формулировок (Roberts N.J, 2006). Широко обсуждаемым является понятие терапевтически резистентной бронхиальной астмы (ТРБА), при которой, в частности, противовоспалительный эффект гормонов недостаточно выражен. Критерии постановки этого диагноза были выработаны на основание мета-анализа многочисленных исследований в 2000 году Американским Торакальным Обществом (ATS), однако они пока не применяются повсеместно.

Одним из патогенетических механизмов терапевтической резистентности является гормонозависимость, характеризующаяся необходимостью приема СГКС для достижения контроля над заболеванием.

Крайним проявлением гормонозависимости является

стероидорезистентность. Приобретенная стероидорезистентность имеет относительный характер и отражает сдвиг кривой доза-эффект таким образом, что необходима в несколько раз большая доза стероидов для реализации противовоспалительного эффекта. Первичная, или генерализованная, стероидорезистентность затрагивает все ткани и ассоциирована с мутациями в гене ГР или в генах, модулирующих его функцию. Ген ГР NR3C1 расположен на пятой хромосоме. Полиморфизм Ile559Asn в пятом экзоне уже в случае гетерозиготности ассоциирован со стероидорезистентностью (Kino Т. et al., 2001), полиморфизмы в девятом экзоне Val729Ile, Ile747Met ассоциированы со снижением аффинности и транскрипционной активности рецептора (Vottero A. et al., 2002). Большое внимание уделяется двум полиморфизмам во втором экзоне: N363S и R23K. Ряд зарубежных работ показывает связь этих мутаций с нарушением чувствительности к кортикостероидам (Huizenga N. et al., 1998; Henk R. et al., 2005). В связи с этим можно предположить, что полиморфизм гена ГР оказывает существенное влияние на выраженность терапевтического действия глюкокортикостероидов при БА.

Одним из важных аспектов фармакогенетики является изучение генов детоксикации. Известно, что транспорт стероидов в клетку является пассивным процессом за счёт их гидрофильности. Однако существует активный процесс выведения таких лигандов из клетки, опосредуемый, в том числе, АТФ-зависимым транспортным белком Р-гликопротеином 170 (Pgpl70), кодируемым MDR1 геном (multidrug-resistance gene). Полиморфизм С3435Т в двадцать шестом экзоне, по данным литературы, наиболее коррелирует с уровнем экспрессии и функционирования Pgpl70.

Таким образом, представляется актуальным определение генетических маркеров прогноза формирования терапевтической резистентности и изменения чувствительности к ГКС терапии у пациентов с бронхиальной астмой.

Цель исследования: выявить маркерные профили для диагностики терапевтической резистентности и подбора дозы ГКС у больных тяжелой бронхиальной астмой с учетом полиморфных вариантов гена глюкокортикоидного рецептора NR3C1 и гена MDR1.

Задачи исследования:

1. Проанализировать критерии гормонозависимости и терапевтической резистентности у больных БА среднетяжелого и тяжелого течения, выделить наиболее значимые из них для формирования группы труднокурабельной БА.

2. Оценить частоту встречаемости полиморфных вариантов гена NR3C1 (Ile559Asn, Val729Ile, Ue747Met, N363S и R23K), гена MDR1 (С3435Т) в группе Б А и контрольной группе, сравнить их с частотой встречаемости в других популяциях.

3. Оценить ассоциацию полиморфных вариантов генов NR3C1 и MDR1 со степенью тяжести Б А, показателями спирометрии, частотой побочных эффектов терапии и дозой глюкокортикоидов, необходимой для достижения контроля над заболеванием.

4. Оценить независимое и совместное влияние полиморфных вариантов генов NR3C1 и MDR1 на относительный риск развития БА и формирование терапевтической резистентности.

5. Сформулировать рекомендации для выбора стартовых доз ГКС терапии у пациентов с БА с учетом генетических факторов.

Научная новизна исследования. Впервые проанализированы критерии терапевтической резистентности, разработанные ATS, на российской популяции больных БА. Впервые охарактеризована частота полиморфных вариантов гена MDR1 (С3435Т) и гена NR3C1 (Ile559Asn, Val729Ile, Ile747Met, N363S, R23K) в славянской популяции жителей Санкт-Петербурга у больных БА и людей без хронических заболеваний органов дыхания и аллергической патологии. Показано потенцирующее влияние аллеля 3435С и генотипа 343 5СС гена MDR1 на относительный риск развития БА и формирования терапевтической резистентности. У пациентов с Б А выявлена ассоциация генотипа 3435СС с потребностью в больших дозах СГКС.

Практическая значимость исследования. Показана целесообразность применения критериев терапевтически резистентной бронхиальной астмы для формирования группы труднокурабельной тяжелой БА. Пять наиболее значимых критериев объединены в диагностические формулы, удобные для применения. Показано, что при формировании групп риска развития БА следует учитывать не только общепризнанные факторы риска, но и наследственную предрасположенность к заболеванию, в том числе носительство генотипа 3435СС гена MDR1. При этом у больных с БА, носителей 3435СС гена MDR1, возрастает риск развития терапевтической резистентности, поэтому терапию СГКС следует начинать, как правило, с больших доз.

Положения, выносимые на защиту:

1. Для индивидуализации терапии тяжелой БА целесообразно выделение категории терапевтически резистентных больных, при этом достаточно пяти критериев ATS от 2000 года, объединенных в разработанные диагностические формулы (см. формулы 1,2).

2. Аллель 3435С и генотип 3435СС гена MDR1 ассоциированы с БА и повышают относительный риск формирования терапевтической резистентности у пациентов.

3. У пациентов с БА, носителей генотипа 3435СС гена MDR1, отмечается потребность в больших дозах таблетированных СГКС, чем у носителей других генотипов С3435Т гена MDR1.

4. Частота гетерозиготного носительства полиморфных вариантов R23K, N363S гена глюкокортикоидного рецептора NR3C1

составила 1% и 4,95% соответственно и не отличалась от таковой в контрольной группе и других популяциях.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на 16, 17 Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2006; Казань, 2007), на конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2007), на II Международном молодежном медицинском конгрессе (Санкт-Петербург, 2007), на ежегодной конференции Европейского Общества Генетики Человека (Ницца, Франция, 2007), на 16, 18 и 20 конгрессах Европейского Респираторного Общества (Мюнхен, Германия, 2006; Берлин, Германия, 2008; Барселона, Испания, 2010).

Результаты исследования используются в учебном процессе к афедры госпитальной терапии имени акад. М.В. Черноруцкого и кафедры общей врачебной практики (семейной медицины) факультета последипломного образования СПбГМУ имени акад. И.П.Павлова.

По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 40 отечественных и 99 зарубежных библиографических источников. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, иллюстрирована 25 рисунками, 44 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследования

Клинико-лабораторное обследование больных. Отбор и клинико-лабораторное обследование больных осуществлялись на базе клиники госпитальной терапии имени акад. М.В.Черноруцкого СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова. Диагноз БА ставился согласно международной классификации болезней 10 пересмотра с учетом рекомендаций Европейского Респираторного Общества (GINA, 2008) и Российского руководства по диагностике, лечению и профилактике БА (Трофимов В.И., 2005). Клинико-патогенетические варианты БА определялись согласно классификации А.Д. Адо и П.К. Булатова (1969) с дополнениями Г.Б. Федосеева (1982). Критериями включения в группу терапевтически резистентных больных служили диагностические критерии, разработанные в 2000 году рабочей группой по изучению «refractory asthma» (трудноизлечимой астмы) при участии Американского Торакального Общества (табл.1):

Таблица 1

Диагностические критерии терапевтически резистентной астмы

Большие критерии:_

1. Потребность в применение СГКС > 50% времени_

2. Необходимость использования высоких доз ИГКС

(>1,260 мг/сутки беклометазона или эквивалентные дозы других ИГКС)

Малые критерии:_

1. Ежедневная потребность в длительно действующих

(3; - агонистах, теофиллине, антилейкотриеновых препаратах______

2. Ежедневные симптомы астмы, требующие применения

короткодействующих (32 - агонистов_

3. Сохраняющаяся бронхообструкция (ОФВ1< 80%,

дневная вариабельность ПСВ > 20%)__

4. > 1 вызова скорой помощи за последний год_

5. > 3 курсов СГКС за последний год_

6. Быстрое обострение астмы при уменьшении

на < 25% дозы ИГКС или СГКС_

7. Жизнеугрожающие события, связанные с астмой в прошлом_

Для постановки диагноза терапевтически резистентной бронхиальной астмы достаточно одного большого критерия в сочетании с двумя малыми.

Критерии отбора в контрольную группу были следующие: 1) возраст от 20 до 60 лет; 2) отсутствие курения в анамнезе; 3) отсутствие хронической бронхо-легочной патологии, аутоиммунной и онкопатологии; 4) отсутствие аллергических заболеваний в анамнезе; 5) неотягощенная наследственность в отношении аллергической патологии.

Для постановки (исключения) диагноза применялись общеклинические и лабораторные методы обследования, включая цитологическое исследование мокроты и спирометрию с определением жизненной емкости легких (ЖЕЛ), объема форсированного выдоха за первую секунду выдоха (ОФВ1), максимальной и пиковой скоростей выдоха, удельной проводимости бронхов (Б§аш). При наличии показаний выполнялись рентгенологическое исследование легких, фибробронхоскопия, эхокардиография, денситометрия, фиброгастродуоденоскопия, сцинтиграфия легких; производились осмотры оториноларинголога, психотерапевта, аллерголога. При оценке анамнеза курения использовался показатель количества «пачка/лет».

Общая характеристика обследованных больных. В исследование был включен 101 больной бронхиальной астмой, из них 56 пациентов с тяжелым течением заболевания (ТБА) и 45 - с БА средней степени тяжести (СБА). Группу контроля составили 103 человека, из них 63 (61%) практически здоровых человека и 40 (39%) пациентов с гипертонической болезнью и/или ишемической болезнью сердца с I или II функциональным

классом стенокардии напряжения. Группы достоверно не отличались по полу и возрасту (табл. 2). В группу терапевтически резистентной БА (ТРБА) вошло 36 пациентов. Все обследованные не состояли в родстве друг с другом. Национальный состав был представлен русскими, жителями Санкт-Петербурга и Ленинградской области.

Характеристика больных БА и группы контроля

Таблица 2

Больные БА Возраст, М±ш Контроль Возраст, М±ш

всего (п=101) 52,2±1,3 всего (п=103) 39,0±1,6

жен. (п=74) 52,7±1,4 жен. (п=66) 42,7±1,4

муж. (п=27) 50,1±3,0 муж. (п=37) 38,4±3,0

Молекулярно-генетические методы исследования. Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Маниатис Т. и соавт., 1984).

Для идентификации аллельных вариантов гена NR3C1 и MDR1 использовали амплификацию соответствующих фрагментов ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим рестрикционным анализом. Амплификацию фрагментов ДНК, включающих анализируемые полиморфизмы осуществляли методом ПЦР на автоматическом термоциклере «Терцик» («ДНК-технология», Москва) с использованием термостабильной рекомбинантной Taq-полимеразы фирмы «Fermentas» (Литва). Структура праймеров для амплификации фрагментов ДНК гена NR3C1 была разработана на основании последовательности NT_029289, для амплификации фрагментов ДНК гена MDR1 - на основании последовательности АС_005068. Список аллельных вариантов гена и последовательности олигопраймеров представлены в табл. 3.

Для проведения рестрикции к 5 мкл амплификационной смеси добавляли 8,5 мкл дистиллированной воды, 0,1 мкл рестриктазы (Mbol для С3435Т гена MDR1 и Ile559Asn гена NR3C1; Mnl I для R23K, TasI для N363S, BseLI для Val729Ile, Rsel для Ile747Met гена NR3C1), 1,5 мкл десятикратного буфера и инкубировали 12 часов при температуре 37°С. Продукты рестрикции разделяли в 8% неденатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ), приготовленном на трис-боратном буфере (TBE) в аппарате для вертикального электрофореза с длиной стекла 10 см. Электрофорез проводили в 1- кратном TBE при напряжении электрического поля 120 В. Гель окрашивали водным раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл), Просматривали в ультрафиалетовом свете на трансиллюминаторе «BIORAD» (Германия) и фотографировали на системе видео-гель-документации «GelDoc».

Таблица 3

Последовательности олигопраймеров_

ген мутация структура олигопраймеров

ген NR3C1 5 экзон Т1808А Ue559Asn F: 5'-CAGGCCACNACAGGAGTCTCACAA-3' R: 5'-TGCCGCCCTCCTAACATGTT-3'

ген NR3C1 9 экзон G2317A Val729Ile F: 5'-CATTACCATATCTTCTCCTG-3' R: 5'-TTCTTATTAAGGCAGTCACT-3'

ген NR3C1 9 экзон T2373G Ile747Met

ген NR3C1 2 экзон A200G R23K F: 5'-AGGATTGATATTCACTGATG-3' R: 5'-TTAGGGTTTTATAGAAGT-3'

ген NR3C1 2 экзон А1220Т N363S F: 5'-TTCTCAACAGCAGGATCAGAAGC-3' R: 5 '-TGTTCGACCAGGGAAGTTCAGAG-3'

ген MDR1 26 экзон С3435Т* F: 5'-TGTATGTTGGCCTCCTTTGCTG-3' R: 5'-AGCATTGCTGAGAACATTGCCTA-3'

* синонимичный однонуклеотидный полиморфизм

Статистическая обработка данных. Статистический анализ полученных данных выполняли с использованием пакета статистической программы Statistica 7.0.

Средние величины представлены как М±т, где М - среднее, т -стандартная ошибка среднего. Сравнение частот аллелей и генотипов оценивалось при помощи критерия уь2 и точного метода Фишера (Fisher exact test). Для оценки достоверности различий между средними, использовался непараметрический тест Манн-Уитни (Mann-Whitney U test). При p менее 0,05 различия между сравниваемыми показателями считались достоверными, при р менее 0,1 различия расценивались как тенденция.

Приводятся достоверные значения риска развития заболевания (относительный риск - OR) для носителей определенных аллелей и генотипов (PearceN., 1993).

Для выделения критериев формирования группы терапевтически резистентной БА с уровнем значимости не ниже 95% (р<0.05), которые обеспечивали бы классификацию больных выборки с классификационной способностью 97%, применялся пошаговый дискриминантный анализ.

Результаты исследования

Анализ критериев гормонозависимости и терапевтической резистентности у пациентов с БА

Из 64 пациентов, имеющих анамнестические указания на прием СГКС на момент включения в исследование, только 40 пациентов удовлетворяли критериям ГЗБА. Большинство в группе гормонозависимых пациентов составляли женщины - 76%. Преобладал смешанный патогенетический вариант БА 78% (п=32), при этом при сравнении с больными тяжелой астмой без системной гормональной терапии (БСГТ) у ГЗБА достоверно чаще встречались инфекционно-зависимый и нервно-психический варианты: 95% (п=39) против 75% (п=12) (х2=4,78, р=0,048) и 66% (п=27) против 56% (п=9) (х2=6,87, р=0,008) соответственно.

При сравнении группы ГЗБА и пациентов с тяжелым течением без системной гормональной терапии отличий в длительности заболевания, наличии факторов риска, частоте обострений, количестве вызовов скорой медицинской помощи и госпитализаций за последний год не было. Анализируя лабораторно - инструментальные данные, следует отметить, что в клиническом анализе крови при поступлении в стационар у гормонозависимых больных чаще обнаруживался лейкоцитоз при сравнении с группой БСГТ: 60% против 56% (%2=3,55, р=0,051), при этом в лейкоцитарной формуле достоверных отличий не было. Показатели спирометрии между сравниваемыми группами отличались только степенью прироста ОФВ1 и индекса Тиффно при пробе с бронхолитиком - в группе ГЗБА отмечалась меньшая обратимость обструкции: 20,91%±3,7% против 25,16%±4,4% (р=0,052) и 5,05%±2,2% против 11,01±1,9% (р=0,008) соответственно. У девяти пациентов из группы ГЗБА доза таблетированных СГКС была > 20 мг/сут. При сравнении анамнестических данных и параметров спирометрии этих больных с остальными гормонозависимыми пациентами отличий так же не было.

Следует подчеркнуть, что в группе БСГТ больные в анамнезе получали таблетированные ГКС общей длительностью от 5 до 15 лет. Однако, несмотря на очевидно большие дозы СГКС у ГЗБА отличий в количестве и распределении осложнений не было (табл.4).

Таким образом, в группе больных ГЗБА, выделенной на основании присутствия системных ГКС в терапии на момент включения в исследование, не было отличий в показателях спирометрии, количестве обострений, госпитализаций и вызовов скорой помощи за последний год при сравнении с пациентами с тяжелой астмой БСГТ. Принимая во внимание анамнестические указания на раннее подключение преднизолона к терапии из-за отсутствия альтернативных препаратов, социально-экономический фактор, влияющий в ряде случаев на приверженность пациентов к таблетированным глюкокортикостероидам, на наш взгляд, требуются

дополнительные критерии для выделения трудно курабельных больных БА с целью дальнейшей индивидуализации терапии. Привлекательным в связи с этим выглядит понятие терапевтической резистентности.

Таблица 4

Распределение осложнений ГКС терапии у пациентов тяжелой БА

Осложнения п (%)

БА тяжелого течения с-м Иценко-Кушинга остеопороз стероидный диабет поражение кожи миопатия

ГЗБА (п=40) 18(41%) 27 (68%) 7(18%) 18(45%) 1 (3%)

БСГТ (п=16) 11 (69%) 7 (44%) 3 (19%) 4 (25%) 2(13%)

36 пациентов из включенных в исследование удовлетворяли критериям терапевтически резистентной БА (ТРБА). У больных с ТРБА при сравнении с ТЧБА чаще встречался такой часто обсуждаемый в литературе фактор неконтролируемого течения как гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь: 28% против 11% (Г=4,63, р=0,031).

Оценить значимость отличий показателей спирометрии между группами сложно, учитывая, что одним из малых критериев терапевтической резистентности является ОФВ1<80% после бронхолитика, что привело к попаданию в группу ТРБА больных с более выраженным бронхообструктивным синдромом. Однако обращают на себя внимания признаки меньшей обратимости бронхиальной обструкции и достоверное снижение индекса Тиффно в случае ТРБА: 65,22±3,0 против 75,78±1,8 в случае ТЧБА (р=0,010), которые могут быть связаны с ремоделирование бронхов и вовлечением в патогенетический процесс периферических отделов бронхиального дерева, что характерно для тяжелого течения БА.

Говоря об объеме глюкокортикоидной терапии, следует отметить, что в группе ТРБА за счет первого большого критерия включения (использование высоких доз ИГКС (>1,260 мкг/сутки беклометазона или эквивалентные дозы других ИГКС) дозы ингаляционных глюкокортикостероидов были выше, чем у больных с ТЧБА. При этом были выше максимальные и настоящие дозы таблетированых стероидов, а также дозы вводимых парентерально ГКС в фазу обострения (табл. 5). Большими дозами и длительностью приема СГКС объясняется и большее число осложнений такого лечения: 69% против 31% в случае ТЧБА (%2=14,03, р<0,001).

Таким образом, терапевтически резистентные больные БА достоверно отличались от остальных пациентов более выраженным бронхообструктивным синдромом с меньшей обратимостью, потребностью в

больших дозах таблетированных ГКС и соответственно большим количеством осложнений такой терапии.

Сравнивая между собой группы ТРБА и ГЗБА, мы ожидали большого числа совпадений по составу пациентов, т.к. гормонозависимость является одной из причин терапевтической резистентности. Однако только 19 пациентов попадали в обе группы. Таким образом, коэффициент перекрывания (КП) групп составил 50,25% т.е. анализируемые группы были разными по составу. Гормонозависимых пациентов было достоверно больше среди терапевтически резистентных больных в сравнении с терапевтически чувствительными, однако, при этом уровень статистической значимости имел пограничное значение: 53% против 32%, ^=4,06, р=0,044. Следует отметить, что у 6 пациентов из группы ГЗБА нам удалось отменить СГКС, при этом четверо из них исходно удовлетворяли критериям ТЧБА, что составило 8,7% от группы ГЗБА. Еще у 6 больных из категории ГЗБА в ходе лечения удалось снизить дозу таблетированных ГКС практически в 2 раза, все эти 6 пациентов также относились изначально к группе ТЧБА. Эти данные подтверждают возможность изменения чувствительности к ГКС. А выделение категорий терапевтически резистентных и чувствительных больных позволяет персонализировать подход к пациенту, выделить среди исходно получающих СГКС группу для применения алгоритма «difficult asthma» с целью отмены в дальнейшем этой терапии.

Полученные результаты требуют подтверждения в более масштабных мультицентровых исследованиях.

Таблица 5

Параметры ГКС терапии у больных с разной чувствительностью к терапии

Параметры терапии ТРБА ТЧБА Р

М±т, %

максимальная доза СГКС, таблетки 4,57±0,51 2,0±0,31 <0,001

настоящая доза СГКС, таблетки 1,44±0,29 0,41±0,26 0,006

длительность терапии ГКС,года 11,36±1,1 7,74±0,89 <0,001

длительность терапии таблетированными ГКС, года 7,97±1,35 4,0±0,96 <0,001

длительность инфузионной терапии ГКС, дни 10,58±0,65 9,46±0,46 0,192

доза ГКС, вводимых внутривенно, мг/сут (пересчет на преднизолон) 51,04±2,98 40,1±1,85 0,001

максимальная доза Рг-агонистов короткого действия, ингал./сут 7,34±0,52 7,61±0,58 0,913

Мы проанализировали девять критериев терапевтически резистентной БА, предложенных в 2000 году ATS, на нашей группе пациентов для выделения наиболее значимых и определения их диагностической силы. С

помощью пошагового дискриминантного анализа были отобраны пять критериев с уровнем значимости не ниже 95% (р<0.05), которые обеспечивают классификацию больных выборки с классификационной способностью 97% (табл. 6).

Таблица 6

Результаты расчета коэффициентов и констант линейного дискриминантного _уравнения для ТРБА и ТЧБА ___

Критерии ТРБА аббревиатура критерия коэффициент дискриминантного уравнения для ТЧБА коэффициент дискриминантного уравнения для ТРБА уровень статистической значимости, р

ежедневные симптомы астмы, требующие применения короткодействующих р2-агонистов XI 2,17171 11,1212 <0,001

использование высоких доз ИГКС (> 1,260 мкг/сутки беклометазона или эквивалентные дозы других ИГКС) Х2 1,55430 7,0371 <0,001

>1 вызова скорой помощи за последний год ХЗ 1,63047 6,4396 <0,001

применение системных ГКС > 50% времени болезни Х4 2,02674 8,3284 <0,001

ежедневная потребность в длительно действующих р2-агонистах, теофиллине, антилейкотриеновых препаратах Х5 2,24577 4,8909 0,016

Константа дискриминантного уравнения -1,38756 -13,1561

Для групп терапевтически резистентных и терапевтически чувствительных больных, обобщая все пять диагностических критериев, были определены линейные классификационные функции (ЛКФ), представляющие собой уравнения:

ЛКФ(ТЧБА) = -1,4 + 2,2 • XI +1,6 • Х2 +1,6 • ХЗ + 2,0 • Х4 + 2,2 *Х5 (1) ЛКФ(ТРБА) = -13,2 +11,1 • XI + 7,0 • Х2 + 6,4 • ХЗ +- 8,3 • Х4 + 4,9 • Х5 (2)

Для решения диагностической задачи по наличию критериев ТРБА у больного (1-удовлетворяет критерию; 0-не удовлетворяет критерию) производится расчет ЛКФ. Пациента относят к той группе, для которой ЛКФ примет максимальное значение.

Таким образом, описанные диагностические формулы достаточно удобны для выделения терапевтически резистентных больных из группы пациентов с тяжелой БА.

Полиморфизм С3435Т гена 1УПШ1

Ген мультилекарственной резистентности (МЕШ ген) кодирует Р-гликопротеин 170 - транспортный белок, осуществляющий выведение ряда ксенобиотиков, в том числе ГКС, из клетки. В литературе имеются противоречивые данные в отношении связи синонимичного полиморфизма С3435Т гена М1Ж1 с активностью помпы. Ряд авторов склоняются к мнению о влиянии полиморфизма С3435Т на конформационную структуру субстрат-связывающего сайта в белке в ходе его процессинга, что изменяет специфичность транспортера к разным субстратам и чувствительность к ингибиторам (КтсЫ-8аг£а1у С. et а1., 2007; \Veii й а!., 2008). Так, М. Жг1 с коллегами, изучая активность транспортера в С056+ лимфоцитах по уровню внутриклеточного свечения родамина, показали, что у носителей 343 5СС генотипа она выше (Нкг1 М. е1 а1., 2001). Важной особенностью этого полиморфизма является существенное различие в частоте встречаемости полиморфных вариантов С3435Т гена МЕЖ1 в разных популяциях.

Больные БА и группа контроля были прогенотипированы на носительство полиморфизма гена МЕЖ1 С3435Т. Распределение генотипов не зависило от пола и возраста пациентов, и при сравнении распределения генотипов в группе контроля с данными литературы наиболее похожее распределение было получено в португальской популяции и в русской популяции Новосибирской области (Горева О.Б., 2007; РесЬапс1оуа Н. е1 а1. 2006).

Генотип 3435СС достоверно чаще встречался среди пациентов с БА по сравнению с контрольной группой: 29% против 9% (£=13,9, р<0,001). При этом носительство генотипа 3435СС повышало риск развития БА в 4 раза ((Ж=4,2; С195% 2,3-7,5). Гетерозиготное носительство практически не отличалось в сравниваемых группах и составляло в контрольной группе 47%, среди больных Б А 44%. Гомозиготы по аллелю 343 5Т достоверно чаще встречались в группе контроля: 47% против 24%, х2=12,8, р<0,001 (рис. 1). Отличия в распределении генотипов С3435Т сохранялись и при разделении пациентов с БА по тяжести течения заболевания и сравнении со здоровыми в отношении бронхо-легочной патологии субъектами группы контроля. Как среди больных ТБА, так и у пациентов со СБА достоверно чаще при сравнении с контрольной группой встречался генотип 3435СС: 32% против 9% (х2=14,1, р<0,001) и 29% против 9% (х2=Ю,5, р=0,015) соответственно (рис. 2). При этом в группе ТБА достоверно реже присутствовали гомозиготы по аллелю 343 5Т: 16% против 47% (зс2=15,5, р<0,001). Таким образом, риск развития тяжелой БА при наличии генотипа 3435ТТ снижался в 4.7 раз (011=4,74; С195% 2,6-8,5). Кроме того, генотип 3435ТТ чаще

встречался среди пациентов со СБА в сравнении с ТБА: 33% против 16% (Х2=4,1,р=0,037).

Х2=13.9, р=0.001 х2=12.8, р=0.001

Рис. 1. Распределение генотипов С3435Т гена М1Ж1 в группе БА и контрольной группе

60 50 40 3020 10 о -

% у =14.1. р<0.001

32

29

5.2. р<0 001

СС

СТ

ТТ

а ТБАа СБА» Контроль

Рис. 2. Распределение генотипов С3435Т гена МГШ в группах БА разной степени тяжести и контрольной группе: * х2=Ю,5, р=0,015

Говоря о частотах аллелей полиморфного варианта гена МЕШ С3435Т, следует отметить преобладание аллеля 3435С среди больных БА в сравнении с контрольной группой: 0,52 против 0,31 (р=0,001). Эта зависимость сохранялась и при сравнении ТБА и СБА с контролем: 0,58 и 0,47 против 0,31 соответственно (р=0,009) (рис. 3).

0.48 ; 0.42 : | 0.53 | 0.691]

| ии «|Ч

БА ТБА СБА Контроль

аллель С □ аллель Т

Рис. 3. Распределение аллелей С3435Т гена КЮШ в группах БА разной степени тяжести и контрольной группе

В группе ТРБА наблюдалась тенденция в виде преобладания среди пациентов с ТРБА носителей генотипа 3435СС при сравнении с больными ТЧБА: 39% против 23% (х2=3,05, р=0,065). Эти отличия были более

значимыми при сравнении больных с ТРБА с группой контроля, где генотип 3435СС был наиболее редким: 39% (п=14) против 8% (п=9) (/2= 17,56, р<0,001). Риск развития терапевтически резистентной астмы, т.е. более тяжелого варианта БА, возрастал в 6 раз у гомозигот по аллелю 3435С гена МБЮ (СЖ=6,6; С195% 3,2-9,6). При этом носители генотипа 3435ТТ преобладали в контрольной группе по сравнению с ТРБА: 48% (п=49) против 25% (п=9) (х2=5,59, р=0,014), что вероятно, указывает на протективный в отношении развития БА эффект этого генотипа.

Таким образом, можно сделать вывод об ассоциации аллеля 3435С и генотипа 3435СС с БА и об их предрасполагающей роли к развитию более тяжелого течения заболевания. При расчете коэффициента отношения шансов риск развития БА у носителей 3435СС увеличивался в 4 раза. При этом носительство 3435ТТ достоверно снижало вероятность развития астмы. Возможно, этот факт обусловлен влиянием функционально измененного Р -гликопротеина 170 на регуляцию апоптоза и иммунологических процессов. В одном из исследований показано, что высвобождение цитокинов (ИЛ2, ИЛ4, ЮТа) из мононуклеаров периферической крови достоверно меньше у гомозигот по аллелю 3435Т и связано с низкой активностью Рцр-170 по сравнению с носителями генотипа 3435СС (РашПК А. й а1., 2005).

При анализе объема глюкокортикоидной терапии у пациентов с БА было обнаружено, что среди 64 пациентов с анамнестическими указаниями на прием таблетированных ГКС, длительность приема таблеток была достоверно больше у гомозигот по аллелю 3435С в сравнении с носителями 3435ТТ. В группе пациентов с таблетированными ГКС в терапии на момент включения у носителей генотипа 3435СС дозы были в 2 раза выше, чем у гетерозигот и у гомозигот по аллелю 3435Т (табл. 7).

Интересно, что у девяти пациентов, получавших верапамил по поводу сопутствующей патологии, отмечалось снижение средних доз таблетированных ГКС, вероятно, за счет ингибирующего действия верапамила на Р-гликопротеин. При этом доза СГКС была также достоверно выше у гомозигот по аллелю 3435С при сравнении с носителями остальных вариантов генотипов С3435Т гена МОШ.

При анализе объема и длительности глюкокортикоидной терапии у пациентов с ГЗБА отличия были получены только для значения доз таблетированных ГКС на момент включения, которые были выше у носителей генотипа 3435СС в сравнении с геторозиготами: 2,86±0,2 против 1,86±0,1 (р=0,047). У девяти пациентов из группы ГЗБА доза таблетированных ГКС была более > 20 мг/сут. Несмотря на небольшое число наблюдений, как видно на рис. 4, носители генотипа 3435СС достоверно чаще встречались среди этих больных.

Таблица 7

Параметры терапии ГКС у пациентов с БА в зависимости от генотипа

С3435Т гена МБЯ1

Параметры ГКС терапии М±т Р

сс СТ тт

длительность терапии ГКС, года 9,9*1,1 9,1±1,1 7,9±1,1 0,619

длительность терапии таблетированными ГКС, года 7,7±1,4 5,2±1,1 3,0±1,2 0,037

максимальная доза СГКС, табл. 3,4±0,2 3,1 ±0,3 2,0±0,4 0,507

настоящая доза СГКС, табл. 2,5±0,2 1,3±0,2 1,2±0,2 СС/СТ 0,011 СС/ТТ 0,037

настоящая доза ИГКС, мкг 1364±74 1406±71 1238±65 0,397

длительность инфузионной терапии ГКС, дни 8,5±0,7 10,5±0,6 9,9±0,4 0,031

доза ГКС, вводимых внутривенно, мг/сутки (пересчет на преднизолон) 40,4±2,8 45,0±2,5 56,6±3,9 0,254

80 60 4020-П ё Х2=4.48, р=0.043 ч .] Ч 1 : 47 25

> 20 мг/сут < 20 мг/сут

пССаСТаТТ

Рис. 4. Распределение генотипов С3435Т МГЖЛ гена среди пациентов с разной дозой СГКС в терапии

В группе ТРБА доза системных глюкокортикоидов так же была более, чем в 2 раза выше у гомозигот по аллели 3435С гена МОЮ при сравнении с носителями других вариантов генотипа (табл. 8).

Таблица 8

Показатели терапии ГКС у пациентов с ТРБА в зависимости от генотипа

С3435Т гена МЖ1

Параметры терапии М±т Р

СС СТ ТТ

настоящая доза СГКС, табл. 2,28±0,2 0,92±0Д 0,88±0,1 СС/СТ: 0,038 СС/ТТ: 0,054

Таким образом, у пациентов с БА носителей генотипа 3435СС гена MDR1 отмечается потребность в больших дозах таблетированных ГКС, чем у носителей других генотипов С3435Т гена MDR1, что может быть связано с повышенной активностью Р-гликопротеина 170.

Отличий средних значений показателей спирометрии после купирования обострения БА между пациентами с разными генотипами С3435Т гена MDR1 не было. При делении больных в зависимости от тяжести течения и анализе потоковых показателей внутри этих групп было показано, что у больных с ТБА показатели имели наибольшее значение у носителей 3435СТ, что свидетельствует о меньшей степени бронхообструкции у этих пациентов (табл. 9). Эта же связь скоростных показателей спиромеирии с гетерозиготным носительством С3435Т гена MDR1 получена в группе СБА, у 16 пациентов с сочетанием ТБА и ХОБЛ (рис. 5), в группе ГЗБА у больных с дозой таблетированных ГКС > 20мг/сут и свидетельствует о влиянии полиморфизма С3435Т гена MDR1 на эффективность терапии БА.

Таблица 9

Показатели спирометрии у больных с ТБА в зависимости от генотипа С3435Т гена MDR1

Показатели спирометрии M±m Р

cc CT TT

ОВФ1,% 53,1±4,6 62,7±4,5 49,3±6,6 0,039

ПОСвыд,% 57,2±3,6 69,9±4,5 51,7±6,1 СТ/СС: 0,033 СТ/ТТ: 0,049

МОС 50,% 22,3±3,2 35,9±4,7 17,4±3,4 0,027

Sqaw 0,04±0,01 0,07±0,01 0,03±0,01 0,017

прирост Sgaw% 58,8±15,9 19,0±4,1 106,3^38.3 ТТ/СС: 0,018 ТТ/СТ: 0,013

90 705030-,

100-

р=0.032

55.7

р=СШ17

МОС50У.

■ оССиСТоТТ

р=0 026 1 [я?

115]

Рис. 5. Показатели спирометрии у больных с сочетанием ТБА и ХОБЛ в зависимости от генотипа С3435Т гена МЕЖ1

Полиморфизм G200A (R23K), А1220Т (N363S), Т1808А (IIe559Asn), G2317A (Val729Ile), T2373G (Ile747Met) гена NR3C1

В результате нашего исследования как среди пациентов с БА, так и в группе контроля не удалось обнаружить носительство полиморфных вариантов в пятом (Т1808А) и девятом (G2317A, T2373G) экзонах гена NR3C1. Эти мутации гена NR3C1, нарушающие афинность ГР и его транскрипционную активность, чаще в литературе описываются у пациентов с редкой семейной кортикостероидной резистентностью. Отсутствие этих полиморфных вариантов у наших пациентов говорит в пользу отсутствия в выборке больных с первичной стероидорезистентностью.

Частота гетерозиготного носительства G200A гена NR3C1 в контрольной группе составила 2,9% и достоверно не отличалась от частот в других популяциях, приведенных в литературе. Выявлен один случай гомозиготного носительства 200АА гена NR3C1 в контрольной группе, что не описано в доступной нам литературе (Köper J.W. et al., 1997; Rossum E.F. et al., 2002). Среди пациентов с БА обнаружен один больной с генотипом G200A. Несмотря на то, что частота гетерозиготного носительства G200A гена NR3C1 в группе Б А достоверно ниже приведенных в литературе данных, комментировать данный результат крайне сложно ввиду наличия лишь одного наблюдения. Требуются дальнейшие исследования с воспроизводимыми результатами на большом контингенте больных.

Частота гетерозиготного носительства А1220Т гена NR3C1 в контрольной группе и среди больных с БА составили 10% и 4,95% соответственно и достоверно не отличались от приводимых в литературе. Следует отметить, что все пациенты были женщинами среднего возраста с БА смешанного генеза, дебютировавшей во второй половине жизни. Частота гетерозиготного носительства в ГЗБА составила 2,5% и была меньше при сравнении с таковой у пациентов без системной гормонотерапии (отличия недостоверные). У трех пациенток из пяти имелись критерии терапевтической резистентности. У обеих терапевтически чувствительных пациенток имелось сочетание генотипов А1220Т reHaNR3Cl и С3435Т гена MDR1. При этом каких-либо достоверных отличий в объективных данных, включая параметры спирометрии, между пациентами с разными сочетаниями генотипов генов NR3C1 и MDR1 обнаружено не было.

Таким образом, не было выявлено ассоциации полиморфных вариантов G200A (R23K), А1220Т (N363S), Т1808А (Ile559Asn), G2317A (Val729Ile), T2373G (Ile747Met) гена глюкокортикоидного рецептора (NR3C1) с БА и их влияния на чувствительность пациентов к глюкокортикоидной терапии.

ВЫВОДЫ

1. Для индивидуализации комбинированной терапии БА целесообразно выделение категории терапевтически резистентных больных. В качестве критериев ТРБА достаточно использование пяти критериев ATS от 2000 года, заключенных в разработанные нами диагностические формулы (см. формулы 1,2).

2. Аллель 3435С и генотип 3435СС гена MDR1 ассоциированы с БА и повышают риск развития заболевания в 4 раза.

3. Генотип 3435СС ассоциирован с ТРБА и повышает риск ее развития в 6 раз. Возможно, эти факты обусловлены влиянием функционально измененного Р-гликопротеина 170 на регуляцию апоптоза и иммунологических процессов.

4. У пациентов с БА, носителей генотипа 3435СС гена MDR1, отмечается потребность в больших дозах таблетированных ГКС, чем у носителей других генотипов С3435Т гена MDR1, что может быть связано с повышенной активностью Р-гликопротеина 170.

5. У пациентов с БА при гетерозиготном носительстве С3435Т гена MDR1 после купирования обострения заболевания по данным спирометрии регистрируется наименее выраженный бронхообструктивный синдром и бронхоспазм.

6. Частота гетерозиготного носительства полиморфных вариантов R23K, N363S гена глюкокортикоидного рецептора NR3C1 составила 1% и 4,95% соответственно и не отличалась от таковой в контрольной группе и других популяциях.

7. Не выявлено ассоциации полиморфных вариантов G200A (R23K), А1220Т (N363S), Т1808А (Ile559Asn), G2317A (Val729Ile), T2373G (Ile747Met) гена NR3C1 с БА и их влияния на чувствительность пациентов к глюкокортикоидной терапии, что говорит в пользу отсутствия у обследованных больных первичной стероидорезистентности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для индивидуализации комбинированной терапии тяжелой БА целесообразно выделение категории терапевтически резистентных больных на основании пяти критериев заключенных в следующие диагностические формулы:

ЛКФ{ТЧБА) = -\Л + 2.2»Х\ + \.в»Х2 + \.6»ХЪ + 2Л»ХЛ + 2.2»Х5 ЛКФ(ТРБА) = -13.2 +11.1 • XI + 7.0 • Х2 + 6.4 • ХЗ + 8.3 • Х4 + 4.9 • Х5

Для решения диагностической задачи по наличию критериев ТРБА у больного (1-удовлетворяет критерию; 0-не удовлетворяет критерию) производится расчет ЖФ. Пациента относят к той группе, для которой ЛКФ примет максимальное значение.

При формировании групп риска развития БА следует учитывать не только общепризнанные факторы риска, но и наследственную предрасположенность к заболеванию, в том числе носительство генотипа 3435СС гена MDR1.

У пациентов с генотипом 3435СС гена MDR1 при необходимости использования СГКС стартовые дозы должны быть выше, целесообразно использование комбинированной противовоспалительной терапии, раннее подключение малых доз теофиллина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фармакогенетические аспекты стероидорезистентности у больных тяжелой астмой / Ж.А. Миронова, В.И. Трофимов, М.А.Симакова // 16 Национального конгресса по болезням органов дыхания: Тезисы докладов. - СПб., 2006. - С. 23.

2. The pharmacogenetic aspects of corticosteroid metabolism in patients with severe asthma / Z.A. Mironova, V.l. Trofimov, M.V. Dubina, N.L.Shaporova, E.D Ianchina, M.A. Simakova // Europ. Respir. J. - 2006. -Vol.28(50). -P.678.

3. The MDR1 polymorphism C3435T in bronchial asthma (BA) and steroid-resistant idiopathic fibrosing alveolitis (IFA) patients / M.A. Simakova, Z.A. Mironova, V.l. Trofimov, E.D. Ianchyna, M.V. Dubina, U.M.Ilkovich // Europ. J. of Human Genetics. - 2007. - Vol.l5(l). -P.41.

4. Генетические аспекты гормонозависимости у больных бронхиальной астмой / М.А. Симакова, Ж.А. Миронова, В.И. Трофимов, Е.Д.Янчина // Конференция актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: Тезисы докладов. - СПб., 2007. - С. 96.

5. Фармакогенетические аспекты у больных бронхиальной астмой / М.А. Симакова, Е.Д. Янчина // II Международный молодежный медицинский конгресса: Тезисы докладов. - СПб., 2007. - С. 53.

6. Генетический контроль транспорта глюкокортикоидов и регуляции интерлейкина 4 у больных тяжелой астмой / Ж.А. Миронова, В.И. Трофимов, М.А. Симакова, Е.Д. Янчина, М.В. Дубина // 17 Национальный конгресс по болезням органов дыхания: Тезисы докладов. -Казань, 2007.-С. 18.

7. Polymorphism of multidrug resistance gene (MDR1), interleukin 4 (IL4), IL13 genes in asthmatic patients and patients with idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) / Z.A. Mironova, V.I. Trofimov, E.D Ianchina, U.M. Ilkovich, M.V. Dubina, E. Surkova, M.A. Simakova // Europ. Respir. J. - 2008. -Vol.32(52). -P.621.

8. The associations of polymorphism C3435T multidrug resistance gene (MDR1) and regimen of inhaled glucocorticosteroid therapy in bronchial asthma (BA) patients / Z.A. Mironova, V.I. Trofimov, E.D Ianchina, M.A.Simakova, M.V. Dubina // Europ. Respir. J. - 2008. - Vol.32(52). -P.633.

9. Ген множественной лекарственной устойчивости (MDR1) -маркер терапевтической резистентности и степени тяжести заболевания / Ж.А. Миронова, В.И. Трофимов, М.А. Симакова, Е.Д. Янтчина, М.В. Дубина // Российский Аллергологический журнал. - 2010. - №3. - С. 9-13.

10. "Терапевтическая резистентность" у больных тяжелой бронхиальной астмой / М.А. Симакова, Ж.А. Миронова, В.И. Трофимов, Е.Д. Янчина, М.В. Дубина // Пульмонология. - 2010. - №2. - С. 108-113.

11. Ассоциация полиморфизма С3435Т гена MDR1 со степенью тяжести бронхиальной астмы / М.А. Симакова, В.И. Трофимов, Ж.А. Миронова, Е.Д. Янчина, М.В. Дубина // Ученые записки Петрозаводского Государственного Университета. -2010. - №6(111). - С. 27-31.

12. Allele variants of С3435Т multidrug resistance gene (MDR1), R130Q interleukin 13 (IL13) gene, -590C>T interleukin 4 (IL4) gene - markers of steroid dependent bronchial asthma (BA) risk / Z.A. Mironova, V.I.Trofimov, M.A. Simakova, E.D Ianchina, M.V. Dubina // Europ. Respir. J. - 2010. -Vol.36. —P.291-292.

13. Pharmacogenetic markers of steroid dependent bronchial asthma (BA) control / Z.A. Mironova, V.I. Trofimov, M.A. Simakova, E.D Ianchina, M.V. Dubina // Europ. Respir. J. - 2010. - Vol.36. -P.1003.

14. Association of C3435T polymorphism of MDR1 gene and T1808A polymorphism of NR3C1 gene with bronchial obstruction in severe asthmatics and COPD patients / M.A. Simakova, Z.A. Mironova, V.I. Trofimov, E.D Ianchina, M.V. Dubina // Europ. Respir. J. - 2010. - Vol.36. -P.779.

Формат бумаги 60*90 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Отпечатано в ПК «Объединение Вента» с оригинал-макета заказчика. 197198, Санкт-Петербург, Большой пр. П. С., д. 29а, тел.718-46-36.

Актуальность проблемы

Бронхиальная астма (БА) относится к группе мультифакториальных заболеваний. В её патогенез вовлечены различные функционально взаимосвязанные гены, включающие наряду с главными генами, ответственными за начало болезни, гены-модификаторы, эффекты которых во многом определяются внешними факторами (Баранов B.C., 2009).

Благодаря многочисленным противовоспалительным эффектам глюкокортикостероидных гормонов, использование их в качестве базисной терапии БА в настоящее время считается общепризнанным (Global Initiative for Asthma, 2008). Предпочтение отдается ингаляционным глюкокортикоидам (ИГКС). Однако при обострении и тяжелой астме по показаниям применяются также системные глюкокортикостероиды (СГКС) в разных режимах. Противовоспалительный эффект этих препаратов реализуется путем взаимодействия их с глюкокортикоидными рецепторами (ГР), что приводит к изменению экспрессии генов, вовлеченных в воспаление.

Несмотря на достигнутые успехи, ситуация в отношении контроля данного заболевания остается напряженной (Чучалин А.Г. и соавт., 2005). Об этом свидетельствуют результаты международных эпидемиологических исследований (AIRE, AIRCEE), в которых контроль над болезнью был зарегистрирован только у 5-30% пациентов. Данные эпидемиологических исследований, проведенных в России, выявили отсутствие контроля над симптомами БА у 86,1% пациентов (Ленская JI. Г. и соавт., 2004).

За рубежом и в России в течение последних 10 лет активно разрабатывается тема тяжелой, трудно курабельной астмы. Эксперты сходятся во мнении, что необходимо выработать единые критерии постановки данного диагноза. Это трудная задача, учитывая очевидное существование нескольких фенотипов тяжелой астмы. В англоязычной медицинской литературе для обозначения разных вариантов течения БА авторами используются следующие термины «brittle asthma», «fatal asthma», «chronic difficult asthma», «difficult-to-treat asthma», при чем в клиническом описании одного и того же пациента может быть использовано несколько формулировок (Roberts N.J. et al., 2006). Широко обсуждаемым является понятие терапевтически резистентной бронхиальной астмы (ТРБА), при которой, в частности, противовоспалительный эффект гормонов недостаточно выражен. Критерии постановки этого диагноза были выработаны на основание мета-анализа многочисленных исследований в 2000 году Американским Торакальным Обществом (ATS), однако они пока не применяются повсеместно.

Одним из патогенетических механизмов терапевтической резистентности является гормонозависимость, характеризующаяся необходимостью приема СГКС для достижения контроля над заболеванием. Крайним проявлением гормонозависимости является стероидорезистентность. Приобретенная стероидорезистентность имеет относительный характер и отражает сдвиг кривой доза-эффект таким образом, что необходима в несколько раз большая доза стероидов для реализации противовоспалительного эффекта. Первичная, или генерализованная, стероидорезистентность затрагивает все ткани и ассоциирована с мутациями в гене ГР или в генах, модулирующих его функцию. Ген ГР NR3C1 расположен на пятой хромосоме. Полиморфизм Ile559Asn в пятом экзоне уже в случае гетерозиготности ассоциирован со стероидорезистентностью (Kino Т. et al., 2001), полиморфизмы в девятом экзоне Val729Ile, Ile747Met ассоциированы со снижением аффинности и транскрипционной активности рецептора (Vottero А. et al., 2002). Большое внимание уделяется двум полиморфизмам во втором экзоне: N363S и R23K. Ряд зарубежных работ показывает связь этих мутаций с нарушением чувствительности к кортикостероидам (Huizenga N. et al., 1998; Henk R. et al., 2005). В связи с этим можно предположить, что полиморфизм гена ГР оказывает существенное влияние на выраженность терапевтического действия глюкокортикостероидов при БА.

Одним из важных аспектов фармакогенетики является изучение генов детоксикации. Известно, что транспорт стероидов в клетку является пассивным процессом за счёт их гидрофильности. Однако существует активный процесс выведения таких лигандов из клетки, опосредуемый, в том числе, АТФ-зависимым транспортным белком Р-гликопротеином 170 (Pgpl70), кодируемым MDR1 геном (multidrug-resistance gene). Полиморфизм С3435Т в двадцать шестом экзоне, по данным литературы, наиболее коррелирует с уровнем экспрессии и функционирования Pgpl70.

Таким образом, представляется актуальным определение генетических, маркеров прогноза формирования терапевтической резистентности и изменения чувствительности к ГКС терапии у пациентов с бронхиальной астмой.

Цель исследования

Выявить маркерные профили для диагностики терапевтической резистентности и подбора дозы ГКС у больных тяжелой бронхиальной астмой с учетом полиморфных вариантов гена глюкокортикоидного рецептора NR3C1 и гена MDR1.

Задачи исследования

1. Проанализировать критерии гормонозависимости и терапевтической резистентности у больных БА среднетяжелого и тяжелого течения, выделить наиболее значимые из них для формирования группы труднокурабельной БА.

2. Оценить частоту встречаемости полиморфных вариантов гена NR3C1 (Ile559Asn, Val729Ile, Ile747Met, N363S и R23K), гена MDR1

С3435Т) в группе БА и контрольной группе, сравнить их с частотой встречаемости в других популяциях.

3. Оценить ассоциацию полиморфных вариантов генов NR3C1 и MDR1 со степенью тяжести БА, показателями спирометрии, частотой побочных эффектов терапии и дозой глюкокортикоидов, необходимой для достижения контроля над заболеванием.

4. Оценить независимое и совместное влияние полиморфных вариантов генов NR3C1 и MDR1 на относительный риск развития Б А и формирование терапевтической резистентности.

5. Сформулировать рекомендации для выбора стартовых доз ГКС терапии у пациентов с БА с учетом генетических факторов.

Научная новизна

Впервые проанализированы критерии терапевтической резистентности, разработанные ATS, на российской популяции больных БА. Впервые охарактеризована частота полиморфных вариантов гена MDR1 (С3435Т) и гена NR3C1 (Ile559Asn, Val729Ile, Ile747Met, N363S, R23K) в славянской популяции жителей Санкт-Петербурга у больных БА и людей без хронических заболеваний органов дыхания и аллергической патологии. Показано потенцирующее влияние аллеля 3435С и генотипа 3435СС гена MDR1 на относительный риск развития Б А и формирования терапевтической резистентности. У пациентов с БА выявлена ассоциация генотипа 3435СС с потребностью в больших дозах СГКС.

Практическая значимость работы

Показана целесообразность применения критериев терапевтически резистентной бронхиальной астмы для формирования группы труднокурабельной тяжелой БА. Пять наиболее значимых критериев объединены в диагностические формулы, удобные для применения. Показано, что при формировании групп риска развития БА следует учитывать не только общепризнанные факторы риска, но и наследственную предрасположенность к заболеванию, в том числе носительство генотипа 3435СС гена ШЖ1. При этом у больных с БА, носителей 3435СС гена МОЮ, возрастает риск развития терапевтической резистентности, поэтому терапию СГКС следует начинать, как правило, с больших доз.

Апробация работы Результаты работы были доложены на 16, 17 Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2006; Казань, 2007), на конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2007), на II Международном молодежном медицинском конгрессе (Санкт-Петербург, 2007), на ежегодной конференции Европейского Общества Генетики Человека (Ницца, Франция, 2007), на 16, 18 и 20 конгрессах Европейского Респираторного Общества (Мюнхен, Германия, 2006; Берлин, Германия, 2008; Барселона, Испания, 2010).

Результаты исследования используются в учебном процессе кафедры госпитальной терапии имени акад. М.В. Черноруцкого и кафедры общей врачебной практики (семейной медицины) факультета последипломного образования СПбГМУ имени акад. И.П.Павлова.

По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 40 отечественных и 95 зарубежных библиографических источников. Работа изложена на 135 страницах машинописного текста, иллюстрирована 25 рисунками, 46 таблицами.

ВЫВОДЫ

1. Для индивидуализации комбинированной терапии БА целесообразно выделение категории терапевтически резистентных больных. В качестве критериев ТРБА достаточно использование пяти критериев ATS от 2000 года, заключенных в разработанные нами диагностические формулы (см. формулы 6, 7).

2. Аллель 3435С и генотип 3435СС гена MDR1 ассоциированы с Б А и повышают риск развития заболевания в 4 раза.

3. Генотип 3435СС ассоциирован с ТРБА и повышает риск ее развития в б раз, что, возможно, обусловлено влиянием функционально измененного Р-гликопротеина 170 на регуляцию апоптоза и иммунологических процессов.

4. У пациентов с БА, носителей генотипа 3435СС гена MDR1, отмечается потребность в больших дозах таблетированных СГКС, чем у носителей других генотипов С3435Т гена MDR1, что может быть связано с повышенной активностью Р-гликопротеина 170.

5. У пациентов с Б А при гетерозиготном носительстве С3435Т гена MDR1 после купирования обострения заболевания по данным спирометрии регистрируется наименее выраженный бронхообструктивный синдром и бронхоспазм.

6. Частота гетерозиготного носительства полиморфных вариантов R23K, N363S гена глюкокортикоидного рецептора NR3C1 составила 1% и 4,95% соответственно и не отличалась от таковой в контрольной группе и других популяциях.

7. Не выявлено ассоциации полиморфных вариантов G200A (R23K), А1220Т (N363S), Т1808А (Ile559Asn), G2317A (Val729Ile), T2373G (Ile747Met) гена NR3C1 с Б А и их влияния на чувствительность пациентов к глюкокортикоидной терапии, что говорит в пользу отсутствия у обследованных больных первичной стероидорезистентности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для индивидуализации комбинированной терапии тяжелой Б А целесообразно выделение категории терапевтически резистентных больных на основании пяти критериев заключенных в следующие диагностические формулы

ЛКФ(ТЧБА) = -1,4 + 2,2 • XI +1,6 • Х2 +1,6 • ХЗ + 2,0 • Х4 + 2,2 • Х5; ЛКФ(ТРБА) = -13,2 +11,1 • XI + 7,0 • Х2 + 6,4 • ХЗ + 8,3 • Х4 + 4,9 • Х5, где XI - ежедневная потребность в короткодействующих р2-агонистах; Х2 -использование высоких доз ИГКС (>1,260 мкг/сутки беклометазона); ХЗ - > 1 вызова скорой помощи за последний год; Х4 - применение СГКС >50% времени заболевания; Х5 - ежедневная потребность в теофиллине, антилейкотриеновых препаратах, ДДБА.

Для решения диагностической задачи по наличию диагностических критериев у больного (1-удовлетворяет критерию; 0-не удовлетворяет критерию) производится расчет ЛКФ. Пациента относят к той группе, для которой ЛКФ примет максимальное значение.

2. При формировании групп риска развития БА следует учитывать не только общепризнанные факторы риска, но и наследственную предрасположенность к заболеванию, в том числе носительство генотипа 3435СС гена М1Ж1.

3. У пациентов с генотипом 3435СС гена М1Ж1 при необходимости использования СГКС стартовые дозы должны быть выше, целесообразно использование комбинированной противовоспалительной терапии и раннее подключение малых доз теофиллина.