Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Антитела к нейромедиаторам при болевых и психоэмоциональных стресс-синдромах

/

На правах ткппигц ООЗДЭиьаю

ЗАХАРОВА ИРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

АНТИТЕЛА К НЕЙРОМЕДИАТОРАМ ПРИ БОЛЕВЫХ И ПСИХОЭМОЦИОНАЛЬНЫХ СТРЕСС - СИНДРОМАХ

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 в ЯНВ 20Т0

Москва - 2009

003490696

Работа выполнена в лаборатории нейроиммунопатологии У РАМН НИИ общей патологии и патофизиологии Российской АМН.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Евсеев Владимир Анатольевич Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Малышев Игорь Юрьевич доктор биологических наук, профессор Архипенко Юрий Владимирович

Ведущее учревдение:

ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова

Автореферат разослан

20$Фгода

Защита диссертации состоится д » 2010 года в / / часов

на заседании Диссертационного совета Д 001.Й03.01 при У РАМН НИИ общей патологии и патофизиологии Российской АМН по адресу: 125315, Москва, улица Балтийская, дом 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Лариса Николаевна Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Всестороннее детальное изучение влияния эмоционального стресса на психическое и физическое здоровье человека и поиск новых путей повышения устойчивости организма к стрессорным нагрузкам имеет на сегодняшний день важное медико-социальное значение. Исследования механизмов стрессорных реакций не теряют актуальности на протяжении многих десятилетий и по-прежнему имеют фундаментальную биологическую и клиническую значимость. На современном этапе детально исследовано участие гормональной и нервной системы в развитии стресса (Селье Г., 1936,1950,1960; Мясников А.Л., 1954; Анохин П.К., 1965; Ланг Г.Ф. 1975; Горизонтов П.Д., 1973, 1976; Меерсон Ф. 3., 1981; Меерсон Ф. 3., Пшенникова М. Г., 1988; Судаков К.В., 1984 - 2005).

В последнее время отмечается возрастающий интерес к изучению нейроиммунных процессов при эмоциональном стрессе. Стресс может послужить причиной нарушения взаимодействия и взаиморегуляции нервной и иммунной систем, приводя к развитию дизрегуляционной патологии (Крыжановский Г.Н., 2002, 2003). До настоящего времени стресс не рассматривался как нейроиммунопатологический процесс. Особый интерес представляет механизм регуляции нервной системы иммунной системой в виде продукции аутоантител (аугоАТ) и антител (АТ) к нейромедиаторам (НМ). АТ к НМ оказываются важным механизмом во взаимодействии ЦНС и иммунной системы в условиях нейроиммунопатологии. Дизрегуляция этих взаимодействий - одна из основных причин развития нейроиммунопатологических процессов. Нейроиммунопатология в отличие от иммунопатологии висцеральных органов и систем, обусловленной цитотоксическими и аутоаллергическими реакциями, представляет собой цикл противоположно направленных механизмов, особое место среди которых занимают НМ и аутоантитела к ним.

Впервые положение о том, что в определенных физиологических условиях возможно образование аутоАТ к НМ было обосновано в работах И.Е. Ковалева и О.Ю. Полевой (1985 г.). Многолетними исследованиями лаборатории нейроиммунопатологии, обобщенными в монографии В.А. Евсеева «Антитела к нейромедиаторам в механизмах нейроиммунопатологии» (2007), установлены особенности действия антител к серотонину (5-ОТ), дофамину (ДА), глутамату (ГЛУ) и гамма-аминомасляной кислоте (ГАМК) на экспериментальных моделях алкоголизма, наркомании, эпилепсии, нейропатического болевого синдрома и экспериментально обоснована возможность применения АТ к НМ в иммунотерапии. Особый интерес представляет реципроктность эффектов АТ к 5-ОТ и ДА, а также АТ к ГЛУ и ГАМК.

Известно, что первичной реакцией на стрессорные нагрузки являются изменения в ЦНС, особенно в лимбических структурах мозга и стресс-реакция сопровождается значительным изменением обмена нейромедиаторов в ЦНС (Судаков К.В., 1998, 2005). Данные процессы могут сопровождаться

образованием аутоАТ к НМ, которые, как и индуцированные иммунизацией АТ к НМ, могут препятствовать прогрессированию нарушений ЦНС, связывая избыточное количество нейротрансмиттеров и их метаболитов в головном мозге и в циркуляции, либо усугублять эти нарушения при стойком изменении баланса нейромедиаторных функций мозга при стресс-синдромах. Однако, до настоящего времени продукция и роль АТ к нейромедиаторам при стресс-синдромах оставалась не изученой. Особый интерес представляют АТ к глутамату и ГАМК, относящиеся к основным медиаторам стресс-реализующей и стресс-лимитирующей систем (Меерсон Ф.З., 1986; Пшенникова М.Г., 2002), не исследовано их участие в механизмах стресс-синдромов и вызванных ими нарушений функций ЦНС.

Вышеприведенные факты указывают на актуальность изучения роли антител к нейромедиаторам, в частности к глутамату и ГАМК в патогенезе стресс-синдромов и поиска современных подходов к иммунокоррекции стрессорных нарушений.

Цель исследования заключалась в определении возможной патогенетической роли антител к нейромедиаторам, в особенности к глутамату (ГЛУ) и ГАМК, в механизмах развития стрессорных синдромов в эксперименте и клинике, и изучении эффектов действия антител к ГЛУ и ГАМК при психоэмоциональном стрессе.

Задачи исследования.

1. Исследовать возможность образования аутоантител к нейромедиаторам (серотонину, дофамину, адреналину, норадреналину (НА), ГЛУ и ГАМК) и определить их роль при стрессорных болевых синдромах (нейропатический болевой синдром, болевой синдром при поясничном остеохондрозе) и психоэмоциональном стрессорном процессе.

2. Установить нейроиммунологические эффекты действия антител к ГЛУ и ГАМК при экспериментальном воспроизведении психоэмоционального стресс-синдрома.

3. Изучить возможность иммунопрофилактики стрессорных реакций посредством активной иммунизации конъюгированными с белком нейромедиаторами.

4. Изучить возможные протективные эффекты пассивной иммунизации антителами к нейромедиаторам при системном и интраназальном введении на проявление психоэмоционального стресс-синдрома.

Научная новизна. Впервые получены прямые свидетельства участия АТ к НМ в механизмах развития болевых и психоэмоциональных стресс-синдромов. Впервые установлен феномен образования аутоантител к серотонину, дофамину, адреналину, норадреналину, ГЛУ и ГАМК при экспериментальном нейропатическом болевом синдроме и остеохондрозе позвоночника человека, а также - при экспериментальном психоэмоциональном стресс-синдроме. Установлена защитная роль антител к ГЛУ при психоэмоциональном стресс-

синдроме в условиях предварительной активной и пассивной иммунизации животных, а также иммунотерапевтический эффект действия АТ к ГЛУ при постстрессорном интраназальном введении.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные расширяют представления о нейроиммунопатологических механизмах развития стресс-синдромов. Усиленное образование аутоантптеп к ГЛУ и ГАМК при недолговременных приступах боли и менее выраженная продукция их при затяжных болевых приступах у больных остеохондрозом может иметь прогностическое значение. Полученные результаты защитного действия АТ к ГЛУ могут послужить основой для разработки методов иммунокоррекции нарушений, вызванных стрессом и повышения индивидуальной устойчивости к стрессорным воздействиям иммунизацией антителами к глутамату. Можно полагать, что интраназальное введение антител к ГЛУ больным в межприступный период может предупредить рецидив болевой реакции и очевидно может препятствовать развитию стрессорных психоэмоциональных расстройств у людей.

Положения, выносимые на защиту.

1. Аутоантитела к глутамату, ГАМК, норадреналину, а также антитела к глутамату и ГАМК участвуют в механизмах развития болевых и психоэмоциональных стресс-синдромов.

2. Активная иммунизация животных конъюгатом глутамат-БСА препятствует развитию проявлений стресс-синдрома.

3. Пассивная иммунизация животных антителами к глутамату предупреждает и подавляет проявления психоэмоционального стресса по показателям поведенческой активности.

Апробация работы. Основные результаты исследования были доложены на: V Конференции молодых ученых России с международным участием (Москва, 19-22 мая, 2008), V Российской конференции «Нейроиммунопатология» (Москва, 29-30 мая, 2008), XVII Всероссийской конференции «Нейроиммунология, Рассеянный склероз» (Санкт-Петербург, 2730 апреля, 2009), V Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Крым, Украина, 3-13 июня, 2009).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3-х глав с описанием результатов собственных исследований, заключения, выводов. Работа включает 27 рисунков и 9 таблиц. Список литературы содержит 195 источников.

По теме диссертации опубликовано 9 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 441 мышах-самцах линии С57В1/6, весом 22-24 г., и на 86 крысах-самцах популяции Вистар, весом 220-300 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария при свободном доступе к пище и воде. В постановке экспериментов руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных в ГУ НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН и ГУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, которые соответствуют требованиям Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных.

Для синтеза конъюгированных антигенов в качестве белка-носителя использовали бычий сывороточный альбумин (БСА). Антигены глутамат-БСА и ГАМК-БСА синтезировали с помощью бифункционального реагента глутарового альдегида по стандартному методу (Seguela P., et al., 1984; Storm-Mathisen J., etal., 1983).

Конъюгаты серотонин-БСА, дофамин-БСА синтезировали реакцией ковалентного связывания с диазотированным белком по методике (Peskar В., Spector S., 1973), конъюгат норадреналин-БСА синтезировали с помощью глутарового альдегида (Melmon K.L., 1976).

Антитела к нейромедиаторам получали путем гипериммунизации кроликов соответствующим конъюгированным антигеном. Гамма-глобулиновые фракции антител выделяли из сыворотки крови методом переосаждения сульфатом аммония, очищали путем диализа, лиофилизировали и хранили при 4°С. Аналогичным образом выделяли и гамма-глобулиновую фракцию у неиммунизированных кроликов. Очистку AT к НМ от антител к белку-носителю (БСА) проводили методом аффинной хроматографии с использованием активированной бромцианом сефарозы 4В (5г), растворенной в дистиллированной воде.

Антитела к нейромедиаторам в сыворотках крови людей и экспериментальных животных (крысы и мыши) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием плоскодонных полистероловых 96-луночных планшетов (DYNATECH). В качестве тест-антигенов (тест-АГ) использовали конъюгаты нейромедиаторов на гетерологичном белковом носителе - гамма-глобулине лошади. Оптическую плотность в каждой лунке определяли при длине волны 492 нм с использованием считывающего устройства Mini-reader (DYNATECH). В качестве контроля использовали сыворотку крови доноров и неиммунизированных животных соответственно.

Сыворотку крови больных остеохондрозом позвоночника с хроническим болевым синдромом получали в отделении патологии позвоночника (заведующий - д.м.н., профессор С.Т. Ветрилэ) Центрального научно-исследовательского института травматологии и ортопедии (ЦИТО) им. Н.Н. Приорова. Пациенты поступили в стационар для хирургического лечения с целью устранения болевых приступов. Для контроля использовали сыворотку

крови доноров, полученную из отделения заготовки и переливания крови (заведующий - к.м.н. А.И. Бернакевич) ЦИТО им. H.H. Приорова.

Сыворотку крови экспериментальных животных для ИФА получали путем взятия крови из хвостовой вены (у крыс) либо при декапитации животных (крыс и мышей).

Активная иммунизация животных конъюгированными антигенами ГЛУ-БСА и ГАМК-БСА проводилась 3-х кратно с интервалом в 2 недели по схеме: 1-я иммунизация - 2 мг/кг конъюгата в 0,1 мл 0,9% NaCl с добавлением 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда подкожно в область спины; 2-я - 5 мг/кг в 0,1 мл 0,9% NaCl с добавлением 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда подкожно в область спины; 3-я - 10 мг/кг в 0,2 мл 0,9% NaCl без адъюванта Фрейнда внутрибрюшинно. Животным контрольных групп вводили 0,2 мл 0,9% NaCl по схеме иммунизации.

Пассивная иммунизация проводилась путем введения AT к ГЛУ. Очищенные от примесей AT к белку-носителю (БСА) методом аффинной храматографии AT к глутамату в дозе 25 мг/кг вводили однократно внутрибрюшинно или внутримышечно (в мышцу бедра) в 0,2 мл физиологического раствора за 1 час до стрессорного воздействия. Контрольной группе мышей аналогично вводили гамма-глобулин интактного кролика в той же дозе, что и AT. Другая контрольная группа получала инъекции 0,2 мл физиологического раствора.

Интраназальное введение AT к ГЛУ проводили по методу Sveinbjörn G., et al., 2006. AT к ГЛУ вводили по 5 мкл в каждую ноздрю в дозе 30 мкг/кг.

Моделирование нейропатического болевого синдрома проводили посредством перерезки седалищного нерва. Показателем развития патологического болевого синдрома служила аутотомия - реакция самоповреждения пальцев оперированной конечности. Для оценки выраженности болевого синдрома использовали 11-ти балльную шкалу степени аутотомий (Осипов A.B., Кукушкин М.Л, 1993). Контролем служила группа ложнооперированных крыс, которым производили разрез кожного покрова и мягких тканей, обнажение нерва с последующим послойным зашиванием раны. Динамику процесса учитывали ежедневно на протяжении 28 дней после операции. АутоАТ к нейромедиаторам в сыворотке крови опытной группы и группы ложнооперированных животных исследовали на 14-е и 28-е сутки после операции. Опыты проводили совместно с лабораторией патофизиологии боли (заведующий - д.м.н., профессор М.Л. Кукушкин)

Моделирование психоэмоционального стресса. У крыс стресс моделировали путем иммобилизации на платформе с фиксацией конечностей в течение 1 часа с одновременным умеренным электрокожным раздражением по порогу вокализации переменным электрическим током силой 0,6-0,8 А, частотой 50 Гц с длительностью импульсов 1 мс (Судаков К.В., 1998). Иммобилизационную стрессорную нагрузку проводили два раза с интервалом в 24 часа. Опыты проведены совместно с лабораторией эмоционального стресса НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН под руководством академика К.В. Судакова.

У мышей в качестве модели стресса использовали водно-иммерсионную стрессорную нагрузку, комбинированную с иммобилизацией (Семенова М.Г. и соавт., 2007). Животных помещали в тесные полые пластиковые цилиндры с отверстиями в стенках и в них погружали в прохладную воду (+20 - +21°С) до уровня шеи на 1 час.

Поведенческая активность животных для оценки тревожно-эмоциональных реакций на стресс изучалась с использованием теста «открытое поле» (Судаков К.В., 1998; Калуев A.B., 1998) в котором регистрировали латентный период (ЛП) первого движения, ЛП первого захода в центр поля, количество пересеченных квадратов, стоек и обследованных объектов, Рассчитывали суммарный показатель активности (СПА), представляющий собой общее число пересеченных квадратов, стоек и обследованных объектов. Также использовали тест «темно-светлая» камера: фиксировали ЛП первого выхода, количество выходов в освещенный отсек и общее время, проведенное в светлом отсеке (Калуев A.B., 1998). Для обучения и проверки запоминания использовали классическую методику выработки условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ), которая основана на обучении животного избегать вредных факторов (удар электрического тока) путем подавления определенного врожденного поведения (предпочтение темного пространства) (Буреш Я. с соавт., 1991).

Порог болевой чувствительности определяли на горячей пластине (+5б°С) с использованием установки "Ugo Basile" (Италия). В основе метода лежит регистрация латентного периода защитной реакции животного (облизывание задней лапы) в ответ на ноцицептивное раздражение. Максимальное время тестирования составляло 60 сек.

После завершения опытов животных декапитировали и измеряли массу (в мг) огранов-маркеров (селезенка, тимус, надпочечники). Вес органов-маркеров выражали в % от общей массы тела. Слизистую желудка на наличие язв исследовали при 40-кратном увеличении с использованием лупы. Тяжесть поражения слизистой желудка оценивали в баллах (Перцов С.С., 2003).

Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы «Statistica 6,0» с использованием непараметрического U-t-критерия по Mann-Whitney, t-критерия Стьюдента и критерия Фишера. Числовые данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка. Достоверными считали различия между группами при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Аутоантитела к нейромедиаторам при болевых и психоэмоциональных стресс-синдромах.

Экспериментальный нейропатическокий болевой синдром воспроизводили путем перерезки седалищного нерва. В результате на 14-е сутки наблюдения аутотомии были зарегистрированы у 22 из 30 (73,3%)

оперированных животных. При этом интенсивность болевого синдрома в среднем составляла 5,86±0,79 балла.

К концу опыта на 28-е сутки аутотомии интенсивностью в 7,87±0,94 балла наблюдались у 23 из 30 крыс (76,6%). В группе ложнооперированных животных аутотомии отсутствовали.

АутоАТ к нейромедиаторам (ГЛУ, ГАМК и норадреналину (НА) на 14-е сутки были выявлены у 60-73,3% оперированных животных, включая группу «ложнооперированных» крыс (табл. 1).

Таблица 1

Выявление аутоантител к нейромедиаторам при экспериментальном нейропатическом болевом синдроме (% животных с аутоАТ)

аутоАТ к ГЛУ аутоАТ к ГАМК аутоАТ к НА

Группа 14-е сутки 28-е сутки 14-е сутки 28-е сутки 14-е сутки 28-е сутки

Контрольная

п, % 30% 33,3% 30% 26,7 % 20% 10%

«К», усл. ед. 0,99±0,06 1,01±0,12 1,01±0,05 0,01±0,18 0,90±0,11 0,98±0,03

Опытная (НБС) п,% * 64,5% • 41,9% * 66,7% 17,2% ** 73,3% ** 60%

«К», усл. ед. 1,46±0,06 1,45±0,09 1,45±0,06 1,55±0,2 1,56±0,09 1,57±0,1

Ложно- оперированные **

п, % 60% 30% 60% 30% 50% 50%

«К», усл. ед. 1,41±0,06 1,5±0,2 1,78±0,27 1,58±0,19 1,5±0,2 1,54±0,12

*р<0,05, **р<0,01 по сравнению с контролем; ^<0,05, •••р<0,001 по сравнению с предыдущим тестированием, п - количество животных.

На 28-е сутки после операции у опытных и «ложнооперированных» животных наблюдали существенное снижение антителообразования к ГЛУ и ГАМК. Частота выявления аутоАТ к НА оставалась той же. Как видно из таблицы 1, наиболее значительным оказалось снижение антителогенеза к ГАМК у опытной группы животных.

Зависимость частоты выявления аутоАТ у животных с различной степенью проявления нейропатического болевого синдрома представлена в таблице 2.

Таблица 2

Выявление аутоантител к нейромедиаторам при экспериментальном нейропатическом болевом синдроме (% животных с аутоАТ) в зависимости от выраженности болевого синдрома (тяжесть аутотомий).

Аутоантитела Интенсивность болевого синдрома

0 баллов 1-5 баллов 6-11 баллов

п п, % п п, % п п, %

Через 14 суток после операции

к ГЛУ 9 55,5 12 91,7 9 33,3 +

к ГАМК 9 44,4 12 91,7 9 55,5 +

к НА 9 55,5 12 91,7 9 77,8

Через 28 суток после операции

к ГЛУ 7 28,6 9 55,5* 14 42,8

к ГАМК 7 р ** 9 33,3 ** 14 14,2*

к НА 7 85,7 9 66,6 14 57,1

п - количество животных; *р < 0,05 , ** р < 0,001 по сравнению с предыдущим сроком тестирования (в динамике); + р< 0,001 по сравнению с тяжестью болевого синдрома в 1-5 баллов.

Наиболее интенсивная продукция аутоАТ выявлена у животных с наименее выраженным уровнем патологического процесса. Так, при интенсивности болевого синдрома в 1-5 балла, аутоАТ ко всем нейромедиаторам обнаружены у абсолютного большинства животных (91,7%). Напротив, у крыс, характеризующихся наиболее высокими показателями аутотомий с болевым синдромом в 6-11 баллов, на 14-е сутки после операции частота регистрации аутоАТ к ГЛУ и ГАМК оказывалась значительно меньшей. К концу опыта через 28 дней после оперативного вмешательства наблюдали значительное снижение частоты обнаружения аутоАТ к ГЛУ (в 1,9 раза) и полное исчезновение аутоАТ к ГАМК у животных с неразвившимися аутотомиями. Достоверное снижение вьтявляемости аутоАТ к ГАМК наблюдалось и у животных с аутотомиями. Вместе с тем, интенсивность продукции аутоАТ к НА у крыс основной группы не изменялась, что, очевидно, связано со стрессорным компонентом болевого синдрома.

Таким образом, в приведенном разделе исследования были получены следующие результаты: 1) феномен образование аутоАТ к нейромедиаторам вследствие повреждения нерва; 2) наличие аутоАТ к нейромедиаторам у крыс с

неразвившимся нейропатическим болевым синдромом; 3) усиленный синтез аутоАТ к ГЛУ, ГАМК и НА у ложнооперированных животных.

Установленная в наших опытах обратная зависимость между интенсивностью аутоантителообразования и выраженностью нейропатического болевого синдрома, очевидно, свидетельствует о протективном эффекте действия аутоАТ к ГЛУ и НА на фоне существенного снижения синтеза аутоАТ к ГАМК, которые по ранее установленным данным (Кукушкин М.Л. и соавт., 2007) усиливают проявления нейрогенного болевого синдрома. Таким образом, можно предположить, что аутоАТ к нейромедиаторам, вероятно, выступают в роли пока единственного свидетеля сходства исследованных нами различных нейроиммунопатологических процессов.

Аутоантитела к нейромедиаторам при экспериментальном психоэмоциональном стрессе.

Подопытные крысы были разделены на две подгруппы по результатам стрессорного воздействия. У животных 1-подгруппы через 1 час после стресса СПА снизился в среднем на 40%, у 2-й - на 73%. Через 2 недели после стрессорного воздействия поведенческая активность крыс 1-й подгруппы осталась практически на том же уровне, в то время как крысы 2-й подгруппы значительно (в 2,5 раза) увеличивали СПА в ОП (рис.1).

с

и

120

100

80

60

40

20

1-я подгруппа

| | - исходный СПА

Рас. 1. Динамика изменения двигательной активности крыс в открытом поле при иммобилизационной стрессорной нагрузке. *р <0,001 по сравнению с исходным СПА, #р<0,002 по сравнению с предыдущим тестированием.

2-я подгруппа

Н| - СПА через 1 час после стресса

3 - СПА через 2 недели после стресса

АутоАТ к 5-ОТ, ДА, НА, ГЛУ и ГАМК в сыворотке крови животных определяли через 2 недели после стрессорной нагрузки. Сравнительный анализ интенсивности антителообразования показал, что во 2-й подгруппе крыс, значительно снизивших СПА в результате стрессорного воздействия, процент обнаружения аутоАТ к исследуемым НМ, за исключением аутоАТ к ГАМК, было достоверно выше, чем в 1-й подгруппе (рис. 2), то есть, крысы, менее устойчивые к стрессу, отвечали на стрессорное воздействие более усиленной продукцией аутоАТ к 5-ОТ, ДА, НА и ГЛУ.

аутоАТ к 5-ОТ 80

аутоАТ к ГАМК

аутоАТ к ГЛУ I I 1-я подгруппа

/ аутоАТ ■ к ДА

60/ *

аутоАТ к НА

2-я подгруппа

Рис. 2. Выявление аутоАТ в сыворотке крови крыс в зависимости от степени снижения СПА в открытом поле (% животных с аутоАТ). 1-я подгруппа - снижение СПА в открытом поле в среднем на 40%, 2-я подгруппа - на 73%. *р<0,05 по сравнению с другой подгруппой крыс.

АутоАТ к НМ выявлялись преимущественно у крыс с высокой эмоциональной реакцией на стресс (рис. 3).

14

12

10

40 35 30 25 20 15 10 5

б

□ -

крысы, не отвечающие на стрессорную реакцию продукцией аутоАТ к НМ

крысы, у которых обнаруживали аутоАТ к НМ в сыворотке крови в постстрессорный период

Рис. 3. Выявление аутоАТ к нейромедиаторам в зависимости от эмоционального компонента общей поведенческой активности крыс в открытом поле; а - суммарное количество актов груминга и фекальных болюсов; б - общая продолжительность актов груминга (сек.). *р<0,05 по сравнению с другой подгруппой крыс.

Таким образом, максимальная продукция аутоАТ к большинству НМ выявлялась у животных с более высокой эмоциональной реакцей, у которых значительно снизились в результате стресса показатели поведенческой активности в ОП, то есть наиболее предрасположенных, согласно данным литературы (Исмайлова Х.Ю. и соавт., 1992; Кулагин Д.А., Болондинский В.К., 1986), к стрессорным воздействиям. Повышение показателей двигательной активности через 2 недели в группе стресснеустойчивых крыс свидетельствует о возможной протективной роли выявляемых аутоАТ к НМ.

Этот этап работы выполнен при поддержке РФФИ (грант № 07-04-01477).

Аутоантитела к нейромедиаторам у больных с хроническим болевым синдромом при остеохондрозе поясничного отдела позвоночника.

В сыворотке крови доноров аутоАТ к нейромедиаторам выявлялись в незначительном проценте случаев. Оказалось, что частота их обнаружения зависит от возраста (рис. 4). Так у людей до 30 лет аутоАТ к серотонину, глутамату, ГАМК, норадреналину и адреналину практически отсутствовали. У лиц старше 30 лет (от 31 до 57) чаще всего были выявлены аутоАТ к серотонину и ГАМК - в 33,3% случаев в количестве 1,53±0,05 и 1,44±0,08 усл.ед. соответственно. АутоАТ к глутамату, и норадреналину обнаружены соответственно у 13,3% и 23,3% людей, при среднем уровне их равном 1,51±0,12 и 1,46±0,07 усл.ед.

аутоАТ к 5-ОТ *

аутоАТ к А

23,3

аутоАТ к НА I I - доноры 18-28 лет

выявлены у 55,8°/с норадреналину -

13,3

аутоАТ к ГЛУ

Рис.4. Выявление аутоАТ к нейромедиаторам у доноров в зависимости от возраста (% обследованных с аутоАТ), *р<0,05-достоверностъ между возрастными группами.

АутоАТ к адреналину обнаружены у 16,3% доноров старшей возрастной группы. У больных остеохондрозом позвоночника оказалась большей частота выявления аутоАТ к исследуемым нейромедиаторам (рис. 5-а). АутоАТ к серотонину были больных, к глутамату - у 51,1%, к ГАМК - у 63,8% и к у 55,3%, хотя уровень их возрастал незначительно по

33,3

аутоАТ к ГАМК | - доноры 31-57 лет

сравнению с контролем (рис. 5-6).

70'

4

50 40' 30 20 10; 0"

**

а

**

б

**

Г

х 1,5' Ь

V

¿0,5

к 5-ОТ к ГЛУ к ГАМК к НА к А | | - доноры | ^у -больные

к 5-ОТ кГЛУ к ГАМК к НА

Рис. 5. Частота выявления и уровень аутоАТ к нейромедиаторам в сыворотке крови больных остеохондрозом поясничного отдела позвоночника и здоровых доноров; а - выявление аутоАТ к нейромедиаторам (% обследованных с аутоАТ); б - уровень аутоАТ к нейромедиаторам (показатель «К», усл. ед.). *р<0,01; **р<0,001 по сравнению с группой доноров.

В целях определения возможной патогенетической роли аутоАТ определяли зависимость частоты выявления аутоАТ от интенсивности болевого синдрома. АутоАТ к глутамату, ГАМК и норадреналину выявлялись значительно чаще у больных с длительностью периода последнего обострения болевого синдрома до 1 месяца, по сравнению с больными, у которых болевой синдром длился несколько месяцев (рис. 6-а).

аутоАТ к 5-ОТ Я

**

аутоАТ к А

*

аутоАТ кГЛУ

*

аутоАТ к НА

*** аутоАТ к ГАМК

я 62,9

аутоАТ к НА аутоАТ к ГАМК

□

- интенсивность болевого синдрома 1 -4 балла щ - интенсивность болевого синдрома 5-10 баллов

аутоАТ к 5-ОТ

#

аутоАТ к А

аутоАТ кГЛУ

Ш-3 - длительность периода обострения до 1 мес.

- от 1 мес. до 1 года

Рис. 6. Выявление аутоАТ к нейромедиаторам в сыворотке крови больных остеохондрозом поясничного отдела позвоночника в зависимости: а - от длительности периода последнего обострения болевого синдрома (% обследованных с аутоАТ); б - от интенсивности болевого синдрома (% обследованных с аутоАТ). *р<0,05; ** р<0,01;*** р<0,001 по сравнению с периодом обострения от 1 мес. до 1 года; # р<0,05 по сравнению с интенсивностью болевого синдрома 1-4 балла.

Этот факт можно связать с очевидной стрессорной реакцией на боль, с которой сочетается усиленная продукция аутоАТ к адреналину. Частота выявления аутоАТ к катехоламинам коррелирует с интенсивностью проявления болевого синдрома (рис. 6-6). Так у больных с выраженным болевым синдромом (5-10 баллов) частота обнаружения АТ к катехоламинам была значительно выше, чем при меньшей интенсивности (1-4 балла) болевого синдрома.

Влияние антител к глутамату и гамма-аминомасляной кислоте на развитие стрессорных реакций у мышей С57В1/6 при иммунизации конъюгатами нейромедиатор-белок.

В данном разделе работы для оценки тревожно-эмоциональных поведенческих реакций животных применялись тесты: «открытое поле» (ОП), «темно-светлая камера» и УРПИ. Исследовали также изменение болевой чувствительности.

Основным экспериментам предшествовало исследование возможного защитного адаптационного эффекта субпороговых стрессорных влияний.

Установлено, что инъекции физиологического раствора сами по себе не влияют на поведение в открытом поле и болевую чувствительность мышей.

В 1-й серии опытов с исследованием поведения в ОП животные были поделены на четыре группы: 1 - интактные мыши (контроль); 2 -стрессированные мыши (стрессированный контроль); 3 - иммунизация коньюгатом ГЛУ-БСА и стрессирование; 4 - иммунизация коньюгатом ГАМК-БСА и стрессирование. Мышей 3-й и 4-й групп иммунизировали соответствующими конъюгированными антигенами 3-х - кратно. На восьмой день после последней иммунизации мышей подвергали неизбегаемому стрессорному воздействию.

Иммунизация мышей антигенами ГЛУ-БСА и ГАМК-БСА привела к выработке АТ к ГЛУ в титре 1:256 и к ГАМК в титре 1:32 - 1:64.

Фоновая поведенческая активность мышей всех групп в ОП практически не различалась. Комбинированный иммобилизационный стресс вызвал у мышей трех стрессированных групп (2-я, 3-я, 4-я) снижение СПА в ОП (рис. 7), наиболее выраженное в группе стрессированного контроля (на 53,1%) и иммунизированных коньюгатом ГАМК-БСА (56,9%). В группе мышей, иммунизированных коньюгатом ГЛУ-БСА, снижение СПА после стрессорного воздействия составило 39,1% и было менее выраженным по сравнению со стрессированным контролем и с группой мышей, иммунизированных ГАМК-БСА.

120

60 40 20

0

контроль

стрессированным контроль иммунизированные ГЛУ-БСА иммунизированные ГАМК-БСА

I* * * № -»'/. II

160 140 120 100 80 60

20

пересеченные стойки ооследованные квадраты объекты

1-я 2-я 3-я 4-я группы животных

Рис. 7. Влияние активной иммунизации коньюгатами ГЛУ-БСА и ГАМК-БСА на поведенческую активность в ОП при комбинированном иммобилизационном стрессе мышей С.57ВЬ/б. *р<0,001 по сравнению с 1-й группой (контроль); #р<0,05 по сравнению с 3-й группой.

Во 2-й серии опытов исследовали влияние иммунизации на стрессорное воздействие по поведению в «темно-светлой» камере. Иммунизация мышей коньюгатами ГЛУ-БСА и ГАМК-БСА вызвала разнонаправленные изменения их поведения в «темно-светлой» камере после стрессорной нагрузки (табл. 3). В контрольной группе мышей латентный период первого выхода из темного

отсека составил 12,5±2,6 сек. Суммарное время нахождения в светлом отсеке мышей этой группы составило 156,4±7,9 сек. После стрессорной нагрузки у мышей 2-й группы наблюдали: достоверное увеличение латентного периода первого выхода из темного отсека камеры до 23,1±3,9 сек. и снижение суммарного времени нахождения в светлом отсеке до 126,2 ±10 сек. У мышей 3-й группы, иммунизированных коньюгатом ГЛУ-БСА и стрессированных, латентный период первого выхода из темного отсека был существенно ниже, чем в группе стрессированного контроля (2-я) и практически не отличался от латентного периода 1-й контрольной группы. Общее время нахождения в светлом отсеке у этой группы мышей было достоверно выше, чем во 2-й группе стрессированных мышей и также не отличалось от данных в контрольной группе. В группе мышей, иммунизированных ГАМК-БСА и стрессированных, латентный период первого выхода из темного отсека и общее время нахождения в светлом отсеке существенно не отличались от этих показателей группы стрессированного контроля.

Таблица 3

Влияние активной иммунизации коньюгатами ГЛУ-БСА и ГАМК-БСА на поведение мышей C57BL/6 в «темно-светлой» камере при комбинированном иммобилизационном стрессе

Группа животных Время первого выхода, сек. Число выглядываний Число выходов Суммарное время в светлом отсеке, сек.

1-я 12,5±2,6 7,8±0,7 7,3±0,5 156,4±7,9

2-я 23,1±3,9 ** 4,8±0,5 * 6,8±0,5 126,5±10 **

3-я 12,8±3,5 # 3,75±0,6 * 5,1±1,2 156,3±27#

4-я 32,5±7,9 * 2,7±0,4 *# 5,3±0,6 ** 129,4±19,5

*р<0,01; ** р<0,05 - по сравнению с 1-й группой #р<0,01 - по сравнению со 2-й группой

Стрессорная нагрузка в двух сериях экспериментов вызвала достоверное снижение порога болевой чувствительности мышей 2-й группы по сравнению с контролем (стрессорная гипералгезия) (рис. 8). В группе мышей, иммунизированных ГЛУ-БСА латентный период облизывания задней лапы (ЛП) после стрессорного воздействия практически не отличался от ЛП контрольных мышей, т. е. АТ к ГЛУ оказывали антиноцицептивное действие. Иммунизация ГАМК-БСА не повлияла на болевую чувствительность стрессированных мышей.

При изучении веса органов-маркеров стресса (тимус, селезенка, надпочечники) в различных экспериментах изменения носили неоднородный характер, однако, в группе мышей, иммунизированных ГЛУ-БСА данные веса органов-маркеров были близки к таковым в контрольной группе, а значения в группе животных, иммунизированных ГАМК-БСА достоверно не отличались от значений в группе стрессированных мышей. Язвы слизистой желудка обнаруживались во всех группах стрессированных животных (иммунизированных и не иммунизированных), частота их обнаружения достоверно не различалась между группами. В контрольной группе животных язвы не обнаружены.

1-я 2-я 3-я 4-я

Группы животных '"я

Группы животных

Рис. 8. Влияние активной иммунизации коньюгатами ГЛУ-БСА и ГАМК-БСА на латентный период облизывания задней лапы в тесте «горячая пластина» при комбинированном иммобилизационном стрессе мышей С57ВЬ/6. *р < 0,05-по сравнению с 1-й группой (контроль); # р < 0,05 - по сравнению со 2-й группой (стрессированный контроль).

Таким образом, результаты двух серий экспериментов с применением различных поведенческих тестов устанавливают, что предварительная иммунизация мышей конъюгатом ГЛУ-БСА вызывает снижение большинства проявлений стресс-синдрома, а также предотвращает постстрессорную гипералгезию и изменение веса органов-маркеров.

В 3-й серии опытов с целью изучить возможное влияние АТ к ГЛУ и ГАМК при активной иммунизации на процессы обучения и памяти в условиях комбинированного иммобилизационного стресса была использована методика УРПИ. Однако в данных условиях опыта эта методика оказалась не информативной, т.к. из-за резкого снижения двигательной активности после стрессорного воздействия животные оставались в светлом отсеке установки и у них не удавалось выработать УРПИ.

Экспериментальные подходы к иммунокоррекции стресс-индуцированных нарушений с помощью антител к глутамату.

Иммунопрофилактика постстрессорных нарушений.

Испытывали три способа (внутрибрюшинной, внутримышечной и интраназальной) предварительной (за 1 час до стресса) пассивной иммунизации мышей АТ к ГЛУ, афинноочищенными от примеси АТ к БСА.

Животные были разделены на 3 группы: 1 - интактный контроль; 2 -стрессированные мыши (стрессированный контроль); 3 - внутрибрюшинное (либо внутримышечное) введение АТ к ГЛУ и стрессирование. Через 1 час после стрессорной нагрузки проводили исследование поведенческой активности животных в тесте "открытое поле" (ОП). Определяли также болевую чувствительность в тесте «горячая пластина». На рисунке 10 видно, что при внутрибрюшинном (в/б) и внутримышечном (в/м) введении АТ к ГЛУ в равной мере предотвращали изменение всех тестируемых показателей двигательной активности мышей в ОП после стрессорного воздействия. СПА в группе стрессированных мышей, получавших предварительно АТ к ГЛУ, практически не отличался от значения показателя в контрольной (интактной) группе. В то же время при данных способах введения АТ к ГЛУ не оказывали влияния на выраженность постстрессорной гипералгезии (рис. 9 а, б). Вместе с тем АТ к ГЛУ не предотвращали язвообразование в слизистой желудка и не влияли на постстрессорное изменение органов-маркеров.

Рис. 9. Влияние АТ к ГЛУ при а- в/6 и б- в/м введении на латентный период облизывания задней лапы в тесте «горячая пластина» при комбинированном иммобилизационном стрессе мышей С57ВЬ/б. *р< 0,05; **р< 0,01 - по сравнению с контролем

20

3 ,. с! 15 Ж

* 10

и

о

5 0

ЛП первого движения

30 25

3 20

X & 15

<и ^ 10

5

0

ЛП первого движения

**

Внутрибрюшинное введение АТ к ГЛУ

Двигательная активность

80 70 60 50 40 30 20 10 0

1 1

1

1 1

1

контроль -стрессированный контроль -в/б введение АТ к ГЛУ -

пересеченные квадраты

шмш

стойки

#

Ей

120 100 80 60 40 20 0

обследованные объекты

Внутримышечное введение АТ к ГЛУ

Двигательная активность

контроль - В.,-

80 70 60 50 40 30 20 10 0

стрессированныи - £ контроль в/м введение АТ к ГЛУ -Я

120 100 80 60 40 20 0

пересеменные стойки обследованные квадраты объекты

Суммарный показатель активности

■ **

■

Суммарный показатель активности

Рис. 10. Влияние АТ к ГЛУ при внутрибрюшинном и внутримышечном введении на поведение в ОП при комбинированном иммобилизационном стрессе. *р< 0,05; **р<0,001 - по сравнению с контролем; #р<0,05; ##р<0,001 - по сравнению со стрессированным контролем.

В целях повышения иммунокоррегирующего эффекта АТ к ГЛУ использовали интраназальный способ введения, который позволяет АТ проникать в головной мозг через ижиц оИайогшБ, минуя гемато-энцефалический барьер. Животных разделили на 4 группы: 1 - интактный контроль; 2 - стрессированные мыши (стрессированный контроль); 3 -интраназальное введение АТ к ГЛУ и стрессирование; 4 - интраназальное введение гамма-глобулина интактного кролика и стрессирование.

У опытной группы мышей, получавшей интраназально АТ к ГЛУ за 1 час до стресса, наблюдали тенденцию к уменьшению ЛП захода в центр поля, что свидетельствует об анксиолитическом действии антител (Буреш Я. с соавт., 1991). СП А в этой группе, достоверно не отличался от регистрируемого в контрольной группе мышей, не подвергавшихся стрессорному воздействию и был равен 101,9±5,8, и соответственно, был достоверно выше, чем в группе мышей, получивших такую же стрессорную нагрузку без введения АТ. Гамма-глобулин кролика не влиял на выраженность стресс-реакции: поведенческая активность мышей, получавших интраназально гамма-глобулин за 1 час до стресса, достоверно не отличалась от активности стрессированных животных (табл. 4).

Таблица 4

Влияние АТ к ГЛУ на поведение мышей С57В1/6 в ОП при интраназальном введении за 1 час до стрессорной нагрузки.

ЛП ЛП захода Кол-во Кол-во Кол-во

начального в центр пересечн- стоек обследован- СПА

Группа движения, поля, сек. ных ных

животных п сек. квадратов объектов

1 гр. контроль 11 8,7±1,4 68,7±15,2 85,2±4,2 15,5±0,7 16,5±2,2 117,3±5

(интактные)

2 гр. контроль (стресс) 13 9,5±5,5 59,4±12,8 ** 60,8±5,8 ** 7,9±1,9 ** 9,5±1,2 ** 78,3±7,8

3 гр. введение АТ ♦ ♦ * ♦♦ * # ♦♦

к ГЛУ, 8 6,1±1,8 40,6±8,8 82,12±5,0 11,6±1,7 8,12±2,1 101,9±5,8

стресс

4 гр. введение у- *## ** # ** ** **

глобулина, 8 6,1±2,8 133,5±21 35,5±11,8 4,1±1,9 6,87±2,4 46,5±15,6

стресс

*р<0,05 ; ** р<0,01 - по сравнению с интактным контролем (1 гр.)

# р<0,05 ; ## р<0,01 - по сравнению со стрессированным контролем (2-я гр.)

♦ р<0,05 ; ♦ ♦ р<0,01 - по сравнению с введением гамма-глобулина интактного кролика (4-я гр.)

Интраназально введенные АТ к ГЛУ в данном случае предупреждали развитие постстрессорной гипералгезии. ЛП облизывания задней лапы в группе стрессированных животных составил 12,8±1,2 сек. а в контрольной группе он был в среднем равен 17,9±1,1 сек. В группе мышей, получавших интраназально

АТ к ГЛУ, ЛП облизывания задней лапы после стрессорного воздействия практически не отличался от ЛП контрольных мышей и составлял 18,0±1,3 сек. ЛП у мышей, получавших интраназально гамма-глобулин, достоверно не отличался от интактного контроля.

В данной серии экспериментов также не наблюдали достоверных различий массы органов-маркеров стресса (селезенка, тимус, надпочечники) между контрольной группой и группами стрессированных животных. АТ к ГЛУ не влияли на язвообразование у стрессированных мышей.

Таким образом, АТ к ГЛУ при трех различных способах введения препятствовали постстрессорному изменению поведения и оказывали антиноцицептивный эффект. Наиболее действенным оказался интраназальный способ введения АТ.

Иммунотерапия постстрессорных нарушений

В связи с высокой эффективностью защитного действия незначительных количеств АТ к ГЛУ при интраназальной аппликации их при иммунопрофилактике для иммунотерапии была выбрана начальная доза, равная 30 мкг/кг. АТ вводили сразу после стресса. Вопреки ожиданию защитного эффекта АТ к ГЛУ в дозе 30 мкг/кг после стресса вызвали усиление стресс-реакции, что проявлялось в виде достоверного снижения СПА по сравнению с интактным и стрессированным контролем (табл. 5). АТ к ГЛУ также не предотвращали развитие постстрессорной гипералгезии.

Таблица 5

Влияние АТ к ГЛУ на поведение мышей С57В1/6 в ОП при их интраназальном введении в дозе 30 мкг/кг сразу после стрессорной нагрузки.

Группа животных п ЛП начального движения, сек. ЛП захода в центр поля, сек. Кол-во пересечн- ных квадратов Кол-во стоек Кол-во обследованных объектов СПА

I гр. контроль (интактные) 8 11,6±2,7 32,0±5,1 76,4±4,1 11,8±0,9 13,9±0,6 100,5±4,2

2 гр. контроль (стресс) 10 10,1 ±4,6 53,6±17 73,2±9,2 8,9±1,4 10,4±2,1 92,5±11,2

3 гр. стресс, введение АТ к ГЛУ 8 7,1±3,2 63,9±18,9 **## 36,7±7,1 **## ♦♦ 2,3±0,7 **# 5,1±1,1 **##♦ 45,5±9,1

4 гр. стресс, введение у-глобулина 7 * 3,1±2,6 47,3±14,9 65,4±10,5 7,2±1,0 ** 7,1±1,6 79,6±13,1

*р<0,05 ; ** р<0,01 - по сравнению с интактным контролем (1 гр.)

# р<0,05 ; ## р<0,01 - по сравнению со стрессированным контролем (2-я гр.)

♦ р<0,05 ; ♦♦ р<0,01 - по сравнению с введением нормального гамма-глобулина (4-я гр.)

Для более детального анализа парадоксального эффекта было исследовано дозозависимое действие АТ к ГЛУ при интраназальном введении их на развитие стресс-реакций. Интраназальное введение АТ к глутамату в дозах 150 и 250 мкг/кг сразу после стресса предотвращало снижение показателей двигательной активности мышей в ОП. В группе мышей, получавших АТ в дозе 150 мкг/кг, отметили лишь тенденцию к снижению количества пересеченных квадратов (р=0,09, ГНевО. Число пересеченных квадратов в этой группе составляло 66,5±6,6, а в группе стрессированного контроля - 52,1±8,4. Количество пересеченных квадратов в группе мышей, получавших АТ к ГЛУ в дозе 250 мкг/кг, составляло 82,6 ±6,8 и практически не отличалось от значения в группе интактного контроля (86,6±3,7). СПА в этой группе мышей был достоверно выше, чем в группе стрессированного контроля (99,8± 8,1 и 64,5± 11,3; р=0,03 ГМеБ^ и также не отличался достоверно от СПА в контрольной группе интактных животных (109,3±5,2). Кроме того АТ к ГЛУ в дозе 250 мкг/кг существенно подавляли язвообразование на слизистой желудка (табл. 6). В группе стрессированного контроля эрозивно-язвенное поражение слизистой желудка наблюдали у 66,7% животных, их тяжесть составляла 2,5±0,2 балла. В группе мышей, получавших АТ к ГЛУ в дозе 250 мкг/кг сразу после стресса, процент животных с дефектами слизистой желудка снизился практически в 2 раза и составил 34,6%, а их тяжесть оценена в 1,3±0,2 балла

(р=0,002, и^).

Таблица 6

Влияние АТ к ГЛУ в дозе 250 мкг/кг при интраназальном введении сразу после стресса на развитие дефектов слизистой желудка при комбинированном иммобилизационном стрессе у мышей С57В1/6.

Группа Число мышеи Наличие дефектов слизистой желудка

% встречаемости тяжесть, баллы

Контроль интактный 10 0 0

Стресс + введение физ.р-ра 30 66,7 2,5±0,2

Стресс + введение АТ к ГЛУ, 26 34,6 ~ 1,3±0,2 ++

++ р<0,005 по сравнению с группой стрессированных мышей.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что АТ к ГЛУ в дозах 150 мкг/кг и 250 мкг/кг при интраназальном введении сразу после стресса снижали выраженность стрессорных реакций, проявляли защитный эффект. При этом он был наиболее выражен при введении АТ к ГЛУ в дозе 250 мкг/кг.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основным итогом проведенного исследования следует считать установленный впервые факт участия антител к нейротрансмитгерам возбуждающего и тормозного действия в механизмах развития болевого и психоэмоционального стресс-синдромов.

Были получены однотипные свидетельства продукции аутоАТ к НМ при болевом и иммобилизационном стрессе. В ходе эксперимента аутоАТ к НМ выявлялись не только у крыс с типичными симптомами болевой патологии в виде аутотомий, но и у животных с неразвившимся синдромом, а также у ложнооперированных крыс. Наибольшая частота обнаружения аутоантител зафиксирована у крыс с наименьшей выраженностью проявления нейропатического болевого синдрома. Эти данные позволяют связать феномен обнаружения аутоАТ у всех групп животных (с развившимся, неразвившимся синдромом и ложнооперированных) со стрессорным компонентом боли. Следующий подход по изучению возможности образования стресс-индуцированных аутоантител к нейромедиаторам проведен на модели психоэмоционального стресса. Выявлена определенная зависимость характера стрессорных нарушений от исходной индивидуальной чувствительности крыс к стрессорным воздействиям и положительное влияние на проявления стресса усиленной продукции аутоАТ к ГЛУ. Клинико-иммунологические исследования, проведенные у больных остеохондрозом поясничного отдела позвоночника, сопровождающегося болевыми приступами, выявили положительную взаимосвязь между частотой обнаружения аутоантител к ГЛУ и НА и более благоприятной симптоматикой, выразившейся в меньшем числе рецидивов и интенсивности приступов боли. У данных больных выявлена наиболее интенсивная продукция аутоАТ к ГЛУ и НА, что указывает на сопутствующий боли стресс-синдром. Низкий титр аутоантител, выявленных в ИФА, объясняется слабой иммуногенностью нейромедиаторов, конъюгированных с собственным сывороточным белком.

Вторым этапом диссертационной работы стало исследование влияния антител (аналогов аутоАТ) к ГЛУ и ГАМК, индуцируемых иммунизацией животных соответствующими конъюгатами. В результате иммунизации, предшествующей воспроизведению психоэмоционального водно-иммерсионного стресс-синдрома у мышей обнаружен защитный эффект действия АТ к возбуждающему нейромедиатору глутамату. В данном случае наблюдали предотвращение изменений основных показателей стрессорной реакции по поведению в открытом поле, темно-светлой камере, болевой чувствительности, изменению со стороны органов-маркеров стресса. Стресс-синдром оставался столь же выраженным при иммунизации ГАМК-БСА. Таким образом, тенденция, выявленная при оценке роли аутоантител к ГЛУ и ГАМК при стрессе, обрела форму твердо установленного факта разнонаправленности или противоположного конкурентного эффекта действий активированных иммунизацией антител к ГЛУ и ГАМК. Эти данные являются прямым свидетельством существенной роли в механизмах психоэмоционального стресса дисбаланса функций глутаматергических и ГАМК-ергических нейротрансмиттерных систем.

В результате внутрибрюшинного, внутримышечного и интраназального однократного введения АТ к ГЛУ, очищенных от примеси АТ к БСА-носителю, выявлено одинаковое их защитное действие в качестве профилактики стрессорных нарушений. Одновременно с этим был также зафиксирован защитный иммунокоррекционный дозозависимый эффект АТ, вводимых интраназально после стрессорного воздействия. Однако неожиданным оказалось потенцирующее стрессорные нарушения действие малой дозы АТ к ГЛУ (30 мкг/кг). Очевидно, данная доза АТ, введенная вслед за стрессом, снижая уровень ГЛУ в ЦНС, усиливает по принципу обратной связи выброс нейротрансмиттера на фоне активированной стрессом глутаматергической системы. Однако этот механизм может быть изменен при интраназальном введении большей дозы АТ к ГЛУ. Было установлено, что постстрессорное интраназальное введение АТ к ГЛУ в дозе 250 мкг/кг подавляет проявления психоэмоционального стресс-синдрома по поведенческим показателям и уменьшает тяжесть язвообразования в слизистой желудка.

ВЫВОДЫ

1. Экспериментальный нейропатический болевой стресс-синдром, сопровождается продукцией аутоантител к глутамату, ГАМК и норадреналину у крыс с полностью развившемся синдромом (наличие аутотомий), у крыс с неразвившемся синдромом (без аутотомий) и у ложнооперированных животных.

2. Аутоантитела к глутамату, ГАМК, серотонину, дофамину и норадреналину вырабатываются у крыс, подвергнутых острому иммобилизационному стрессорному воздействию. Наиболее выражена продукция аутоантител к глутамату, серотонину, дофамину и норадреналину у неустойчивых к стрессу особей.

3. Остеохондроз поясничного отдела позвоночника с хроническим болевым синдромом сопровождается выработкой аутоантител к глутамату, ГАМК, серотонину, адреналину и норадреналину. Усиленная продукция аутоантител к нейромедиаторам обнаружена преимущественно у пациентов с выраженными непродолжительными болевыми приступами.

4. Психоэмоциональный водно-иммерсионный стресс-синдром подавляется предварительной иммунизацией мышей С57В1/6 конъюгатом глутамат-БСА и остается столь же выраженным при иммунизации ГАМК-БСА.

5. Антитела к глутамату при интраназальном введении эффективно предотвращают вызванные стрессом изменения поведения и болевой чувствительности у мышей С57В1/6. Менее выраженное защитное действие антитела к глутамату оказывают при внутрибрюшинном и внутримышечном предварительном введении.

6. Установлен дозозависимый эффект действия антител к глутамату на проявления психоэмоционального стресс-синдрома при интраназальном введении их вслед за стрессорным воздействием. Антитела к глутамату в дозе 30 мкг/кг усиливают, а в дозе 250 мкг/кг уменьшают выраженность стресс-синдрома по поведенческим показателям и язвообразованию в слизистой желудка.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Евсеев В.А., Ветрилэ С.Т., Швец В.В., Ветрилэ Л.А., Крупаткин А.И., Соколова Т.В., Захарова И.А. Аутоантитела к нейромедиаторам у больных с хроническим болевым синдромом при остеохондрозе поясничного отдела позвоночника.// Вестник травматологии и ортопедии им. H.H. Приорова. -2007.-№4.-С. 15-18.

2. Евсеев В.А., Ветрилэ Л.А., Смирнова B.C., Графова В.Н., Захарова И.А., Трекова H.A., Кукушкин М.Л. Аутоантитела к глутамату, ГАМК, норадреналину в механизмах нейропатического болевого синдрома.// Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2008. - Т. 145. - №5. - С. 521-524.

3. Ветрилэ Л.А., Евсеев В.А., Умрюхин А.Е., Кравцов А.Н., Сотников C.B., Захарова И.А. Аутоантитела к нейромедиаторам в механизмах развития стрессорных реакций у крыс.// Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2008. - Т. 146. -№12.-С. 623-626.

4. Захарова И.А. Аутоантитела к возбуждающему и тормозному нейромедиаторам в механизмах болевых синдромов.// Тез. докл. V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» 19-22 мая 2008 г. - М., электронное приложение к журналу «Вестник Российской Академии медицинских наук». - 2008. - №6. - С. 155.

5. Ветрилэ Л.А., Умрюхин А.Е., Кравцов А.Н., Сотников C.B., Захарова И.А. Аутоантитела к нейромедиаторам при психоэмоциональном стресс-синдроме.// Тез. докл. V Российской конференции «Нейроиммунопатология» 29-30 мая 2008 г. - М., Патогенез. - 2008. - Т. 6. - № 2. - С. 38.

6. Захарова И.А., Ветрилэ Л.А., Евсеев В.А. Влияние антител к глутамату и гамма-аминомасляной кислоте на развитие стрессорных реакций у мышей С57В1/6.// Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2009. - Т. 147. - №3. - С. 272-275.

7. Евсеев В.А., Захарова И.А., Ветрилэ Л.А. Стресспротективное и стресспотенцирующее действие антител к глутамату и -аминомасляной кислоте при интраназальном введении мышам С57В1/6.// Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2009. - Т. 148. - №7. - С. 18-22.

8. Захарова И.А., Ветрилэ Л.А. Влияние антител к глутамату и ГАМК при интраназальном введении на проявления психоэмоционального стресс-синдрома у мышей С57В1/6.// Тез. докл. XVII Всероссийской конференции «Нейроиммунология. Рассеянный склероз» 27-30 апреля 2009 г. - Санкт-Петербург, 2009.-С. 41.

9. Захарова И.А., Ветрилэ Л.А., Умрюхин А.Е., Кравцов А.Н., Сотников C.B. Нейроиммунные взаимодействия при психоэмоциональном стресс-синдроме. Антитела к глутамату и гамма-аминомасляной кислоте.// Тез. докл. V Международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии» 3-13 июня 2009 г. - Судак, Крым, Украина, 2009. -С. 108-109.

Zakharova Irina Aleksandrovna ANTIBODIES TO NEUROTRANSMITTERS IN PAIN AND PSYCHOEMOTIONAL STRESS-SYNDROMES

In the first part of work the production of autoantibodies to neurotransmitters -glutamate (GLU), gamma-aminobutyric acid (GABA), serotonin, dopamine and norepinephrine in the blood serum of the rats Wistar with the exsperimental neuropathic pain syndrome, with combined stress and in the blood serum of the humans with lumbar osteochondrosis pain syndrome was established.

In the second part of work was studied the effect of antibodies to GLU and GABA on the development of stress-syndrome in the mice C57BL/6 after immunization with conjugates GLU- and GABA-BSA in water-immersion model of stress combined with immobilisation. It was shown that preventive immunization with GLU - BSA conjugate reduce most manifestation of stress-syndrome, so was demonstrated the stress-protective effects. Antibodies to GABA did not influence on the development of stress.

In the third part of work the effect of antibodies to GLU on the development of stress-syndrome in the mice C57BL/6 by means immunization with the GLU antibodies cleared from the antibodies to BSA was investigated. After three ways of administration of GLU antibodies in dose 30 mkg/kg (intraperitoneal, intramuscular and intranasal) was obtained the stress-protective result. The intranasal administration GLU antibodies demonstrated higher effect.

Заказ № 57-а/12/09 Подписано в печать 16.12.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 1 ^^-У \vw\v. cfr.ru; е-таП:т/о@с/г. ги

Всестороннее детальное изучение влияния эмоционального стресса на психическое и физическое здоровье человека и поиск новых путей повышения устойчивости организма к стрессорным нагрузкам имеет на сегодняшний день важное медико-социальное значение. Исследования механизмов стрессорных реакций не теряют актуальности на протяжении многих десятилетий и по-прежнему имеют фундаментальную биологическую и клиническую значимость. На современном этапе детально исследовано участие гормональной и нервной системы в развитии стресса (Селье Г., 1936, 1950, 1960; Мясников А.Л., 1954; Анохин ПК., 1965; Ланг Г.Ф. 1975; Горизонтов П.Д., 1973, 1976; Меерсон Ф. 3., 1981; Меерсон Ф. 3., Пшенникова М. Г., 1988; Судаков К.В., 1984 - 2005).

В последнее время отмечается возрастающий интерес к изучению нейроиммунных процессов при эмоциональном стрессе. Стресс может послужить причиной нарушения взаимодействия и взаиморегуляции нервной и иммунной систем, приводя к развитию дизрегуляционной патологии (Крыжановский Г.Н., 2002, 2003). До настоящего времени стресс не рассматривался как нейроиммунопатологический процесс. Особый интерес представляет механизм регуляции нервной системы иммунной системой в виде продукции аутоантител (аутоАТ) и антител (АТ) к нейромедиаторам (НМ). АТ к НМ оказываются важным механизмом во взаимодействии ЦНС и иммунной системы в условиях нейроиммунопатологии. Дизрегуляция этих взаимодействий - .одна из основных причин развития нейроиммунопатологических процессов. Нейроиммунопатология в отличие от иммунопатологии висцеральных органов и систем, обусловленной цитотоксическими и аутоаллергическими реакциями, представляет собой цикл противоположно направленных механизмов, особое место среди которых занимают НМ и аутоантитела к ним.

Согласно современным представлениям процесс антителообразования к НМ подчиняется общим принципам формирования аутоантител к низкомолекулярным химическим соединениям. Молекулярную основу для них создали классические исследования К. Ландштейнера (Landsteiner К., 1946), впервые установившие особенности ответной реакции на конъюгированные антигенные комплексы. Подобные конъюгаты могут образовываться в организме естественным путем, ярким свидетельством чего является образование реагиновых Ig Е — антител к низкомолекулярным химическим соединениям вследствие комплексирования с сывороточными белками при аллергических реакциях немедленного типа. Впервые положение о том, что в определенных физиологических условиях возможно образование аутоантител к НМ было обосновано в работах И.Е. Ковалева и О.Ю. Полевой (1985). В процессе биотрансформации нейромедиаторов образуются реакционно способные метаболиты (хиноны, семихиноны, эпоксиды), которые при ковалентном связывании с белками сыворотки крови образуют естественные конъюгированные антигены, индуцирующие продукцию аутоантител, реагирующих с нейротрансмиттерными эпитопами конъюгата. Другой возможный путь формирования естественных антител к НМ связан с механизмом сетевой идиотип-антиидиотип регуляцией иммунного ответа в соответствии с концепцией К. Ерне (Jeme N.K., 1974). Посредством последовательных каскадных процессов аутоантитело к рецептору превращается в антиидиотипическое антитело 2-го порядка, способное связываться с лигандом-нейромедиатором.

Многолетними исследованиями нашей лаборатории, обобщенными в монографии В.А. Евсеева «Антитела к нейромедиаторам в механизмах нейроиммунопатологии» (2007), установлены особенности действия антител к серотонину (5-ОТ), дофамину (ДА), глутамату (ГЛУ) и гамма-аминомасляной кислоте (ГАМК) на экспериментальных моделях алкоголизма, наркомании, эпилепсии, нейропатического болевого синдрома и экспериментально обоснована возможность применения АТ к НМ в иммунотерапии. Особый интерес представляет реципроктность эффектов АТ к 5-ОТ и ДА, а также АТ к

ГЛУ и ГАМК. Была установлена двойственная функция AT к 5-ОТ. Они подавляют проявления абстинентного синдрома при экспериментально воспроизводимой алкогольной и морфиновой зависимости, однако способствуют при активной иммунизации животных серотониновым конъюгатом более тяжелому развитию нейропатического болевого синдрома.

Впервые в совместных исследованиях с лабораторией эпилептогенеза (заведующий - д.б .н. Карпова М.Н.) и патофизиологии боли (заведующий — д.м.н., профессор Кукушкин М.Л.) был установлен феномен иммунобиологической специфичности перекрестно реагирующих в ELISA антител к ГЛУ и ГАМК: защитный эффект действия первых и патогенный — вторых.

Новым этапом изучения иммунобиологических свойств AT к НМ в последние годы (с 2005 по 2009) стало выяснение их функций при воспроизведении психо-эмоциональных стрессорных реакций, исследуемых нами совместно с НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН в рамках программы, поддержанной грантами РФФИ (№ 04-04-49047а, № 07-0401477).

Известно, что первичной реакцией на стрессорные нагрузки являются изменения в ЦНС, особенно в лимбических структурах мозга и стресс-реакция сопровождается значительным изменением обмена нейромедиаторов в ЦНС (Судаков К.В., 1998, 2005). Данные процессы могут сопровождаться образованием аутоАТ к НМ, которые, как и индуцированные иммунизацией AT к НМ, могут препятствовать прогрессированию нарушений ЦНС, связывая избыточное количество нейротрансмиттеров и их метаболитов в головном мозге и в циркуляции, либо усугублять эти нарушения при стойком изменении баланса нейромедиаторных функций мозга при стресс-синдромах. Однако до настоящего времени продукция и роль AT к нейромедиаторам при стресс-синдромах оставалась не изученной. Особый интерес представляют AT к глутамату и ГАМК, относящиеся к основным медиаторам стресс-реализующей и стресс-лимитирующей систем (Меерсон Ф.З., 1986; Пшенникова М.Г., 2002), однако не исследовано их участие в механизмах стресс-синдромов и вызванных ими нарушений функций ЦНС.

Вышеприведенные факты указывают на актуальность изучения роли антител к нейромедиаторам, в частности к глутамату и ГАМК в патогенезе стресс-синдромов и поиска современных подходов к иммунокоррекции стрессорных нарушений. Решению этой проблемы посвящается настоящая диссертационная работа, базирующаяся на двух основных предпосылках: существенной роли нейромедиаторов в механизмах стресса и возможности купирования нейроиммунопатологических синдромов антителами к НМ.

Цель исследования заключалась в определении возможной патогенетической роли антител к нейромедиаторам, в особенности к глутамату (ГЛУ) и ГАМК, в механизмах развития стрессорных синдромов в эксперименте и клинике, и изучении эффектов действия антител к ГЛУ и ГАМК при психоэмоциональном стрессе.

Задачи исследования

1. Исследовать возможность образования аутоантител к нейромедиаторам (серотонину, дофамину, адреналину (А), норадреналину (НА), ГЛУ и ГАМК) и определить их роль при стрессорных болевых синдромах (нейропатический болевой синдром, болевой синдром при поясничном остеохондрозе) и психоэмоциональном стрессорном процессе.

2. Установить нейроиммунологические эффекты действия антител к ГЛУ и ГАМК при экспериментальном воспроизведении психоэмоционального стресс-синдрома.

3. Изучить возможность иммунопрофилактики стрессорных реакций посредством активной иммунизации конъюгированными с белком нейромедиаторами.

4. Изучить возможные протективные эффекты пассивной иммунизации антителами к нейромедиаторам при системном и интраназальном введении на проявление психоэмоционального стресс-синдрома.

Научная новизна

Впервые получены прямые свидетельства участия АТ к НМ в механизмах развития болевых и психоэмоциональных стресс-синдромов. Впервые установлен феномен образования аутоантител к серотонину, дофамину, адреналину, норадреналину, ГЛУ и ГАМК при экспериментальном нейропатическом болевом синдроме и остеохондрозе позвоночника человека, а также — при экспериментальном психоэмоциональном стресс-синдроме. Установлена защитная роль антител к ГЛУ при психоэмоциональном стресс-синдроме в условиях предварительной активной и пассивной иммунизации животных, а также иммунотерапевтический эффект действия АТ к ГЛУ при постстрессорном интраназальном введении.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные данные расширяют представления о нейроиммунопатологических механизмах развития стресс-синдромов. Усиленное образование аутоантител к ГЛУ и ГАМК при недолговременных приступах боли и менее выраженная продукция их при затяжных болевых приступах у больных остеохондрозом может иметь прогностическое значение. Полученные результаты защитного действия АТ к ГЛУ могут послужить основой для разработки методов иммунокоррекции нарушений, вызванных стрессом и повышения индивидуальной устойчивости к стрессорным воздействиям иммунизацией антителами к глутамату. Можно полагать, что интраназальное введение антител к ГЛУ больным в межприступный период может предупредить рецидив болевой реакции и очевидно может препятствовать развитию стрессорных психоэмоциональных расстройств у людей.

Положения, выносимые на защиту

1. Аутоантитела к глутамату, ГАМК, норадреналину, а также антитела к глутамату и ГАМК участвуют в механизмах развития болевых и психоэмоциональных стресс-синдромов.

2. Активная иммунизация животных конъюгатом глутамат-БСА препятствует развитию проявлений стресс-синдрома.

3. Пассивная иммунизация животных антителами к глутамату предупреждает и подавляет проявления психоэмоционального стресса по показателям поведенческой активности.

Апробация работы

Основные результаты исследования были доложены на: V Конференции молодых ученых России с международным участием (Москва, 19-22 мая, 2008), V Российской конференции «Нейроиммунопатология» (Москва, 29-30 мая, 2008), XVII Всероссийской конференции «Нейроиммунология. Рассеянный склероз» (Санкт-Петербург, 27-30 апреля, 2009), V Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Крым, Украина, 3-13 июня, 2009).

выводы

1. Экспериментальный нейропатический болевой стресс-синдром, сопровождается продукцией аутоантител к глутамату, ГАМК и норадреналину у крыс с полностью развившемся синдромом (наличие аутотомий), у крыс с неразвившемся синдромом (без аутотомий) и у ложнооперированных животных.

2. Аутоантитела к глутамату, ГАМК, серотонину, дофамину и норадреналину вырабатываются у животных, подвергнутых острому иммобилизационному стрессорному воздействию. Наиболее выражена продукция аутоантител к глутамату, серотонину, дофамину и норадреналину у неустойчивых к стрессу особей.

3. Остеохондроз поясничного отдела позвоночника с хроническим болевым синдромом сопровождается выработкой аутоантител к глутамату, ГАМК, серотонину, адреналину и норадреналину. Усиленная продукция аутоантител к нейромедиаторам обнаружена преимущественно у пациентов с выраженными непродолжительными болевыми приступами.

4. Психоэмоциональный водно-иммерсионный стресс-синдром подавляется предварительной иммунизацией мышей С57В1/6 конъюгатом глутамат-БСА и остается столь же выраженным при иммунизации ГАМК-БСА.

5. Антитела к глутамату эффективно предотвращают вызванные стрессом изменения поведения и болевой чувствительности при интраназальном введении. Менее выраженное защитное действие антитела к глутамату оказывают при внутрибрюшинном и внутримышечном предварительном введении.

6. Установлен дозозависимый эффект действия антител к глутамату на проявления психоэмоционального стресс-синдрома при интраназальном введении их вслед за стрессорным воздействием. Антитела к глутамату в дозе 30 мкг/кг усиливают, а в дозе 250 мкг/кг уменьшают выраженность стресс-синдрома по поведенческим показателям и язвообразованию в слизистой желудка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основным итогом проведенного исследования следует считать факт участия антител к нейротрансмиттерам возбуждающего и тормозного действия в механизмах развития болевого и психоэмоционального стресс-синдромов.

В наших клинико-иммунологических поисках впервые обнаружена оппозитная функция антител к ГЛУ и ГАМК при болевых стресс синдромах у больных поясничным остеохондрозом, при нейропатическом болевом синдроме, при психоэмоциональном стрессорном воздействии, исследованном в аспектах концепции физиологической системы, разработанной П.К. Анохиным (1968) и К.В. Судаковым (1984, 1988).

Диссертационная работа представляет собой три последовательных этапа: аутоиммунный, нейроиммунопатологический и нейроиммунокоррегирущий. Первым из них было изучение возможности образования аутоантител к нейромедиаторам (глутамату, ГАМК, адреналину, норадреналину, серотонину, дофамину) при болевом и иммобилизационном стрессе. Исследовали три качественно различных формы стрессорного состояния. В результате были получены однотипные свидетельства продукции аутоантител к нейромедиаторам.

Большой интерес представляют особенности образования аутоантител к ГЛУ и ГАМК и их патологическая роль в механизмах нейропатического болевого синдрома, воспроизводимого у крыс, который, по мнению специалистов-альгологов (Кукушкин М.Л., Хитров Н.К., 2004) имеет свойства стресса с усиленным выбросом адреналина. В ходе эксперимента были получены три на первый взгляд парадоксальных факта, заключающихся в том, что аутоантитела к нейромедиаторам выявлялись не только у крыс с типичными симптомами болевой патологии в виде аутотомий, но и у животных с неразвившимся синдромом (без аутотомий), а также у ложнооперированных крыс. Наибольшая частота обнаружения аутоантител зафиксирована у крыс с наименьшей выраженностью проявления нейропатического болевого синдрома.

Эти данные позволяют, связать феномен обнаружения аутоантител у всех групп животных (с развившимся, неразвившимся синдромом и ложнооперированных) со стрессорным компонентом боли.

Какой же механизм образования аутоантител к нейромедиаторам при болевых стресс-индуцированных реакциях? Наиболее естественным объяснением может служить, как и при других формах нейроиммунопатологии, образование эндогенных конъюгатов НМ-белок вследствие нарушения функций ЦНС, вызванного в данной ситуации усиленной болевой афферентацией. В результате возникают аутоантитела, реагирующие с нейромедиаторными эпитопами конъюгата.

Следующий подход по изучению возможности образования стресс-индуцированных аутоантител к нейромедиаторам проведен на модели психоэмоционального стресс-синдрома, разработанной школой К.В. Судакова (Судаков К.В., 1998) и увенчался новыми фактами, укладывающимися полностью в концепцию физиологических систем организма П.К. Анохина (Анохин П.К., 1965). Как и при предыдущих двух вариантах исследования выявлена определенная зависимость характера стрессорных нарушений от исходной индивидуальной чувствительности животных к стрессорным воздействиям и положительное влияние на проявления стресса усиленной продукции аутоантител к ГЛУ.

Клинико-иммунологические исследования, проведенные у больных пояснично-крестцовым остеохондрозом, выявили положительную взаимосвязь между частотой обнаружения аутоантител к ГЛУ и НА и более благоприятной симптоматикой, выразившейся в меньшем числе рецидивов и интенсивности приступов боли. У данных больных выявлена наиболее интенсивная продукция аутоантител к ГЛУ и НА, что указывает на сопутствующий боли стресс-синдром.

Низкие титры аутоантител к нейромедиаторам, сопутствующие стрессорным процессам, вероятно, объясняются слабой иммуногенностью эндогенных конъюгатов НМ-белок, хотя в сходных условиях при мощном стрессорном воздействии, каковым является коразоловый эпилептический стресс-синдром, регистрировали высокие титры аутоантител к ГЛУ и ГАМК (Ветрилэ Л.А., 2007) в динамике эпилептогенеза.

Вторым этапом диссертационной работы стало исследование влияния антител (аналогов аутоантител) к ГЛУ и ГАМК, индуцируемых иммунизацией животных соответствующими конъюгатами. В результате иммунизации, предшествующей воспроизведению психоэмоционального водно-иммерсионного стресс-синдрома у мышей обнаружен защитный эффект действия AT к глутамату. В данном случае наблюдали предотвращение изменений основных показателей стрессорной реакции по поведению в открытом поле, темно-светлой камере, болевой чувствительности, изменению со стороны органов-маркеров стресса. Стресс-синдром оставался столь же выраженным при иммунизации ГАМК-БСА. Таким образом, тенденция, выявленная при оценке роли аутоантител к ГЛУ и ГАМК при стрессе, обрела форму твердо установленного факта разнонаправленности или противоположного конкурентного эффекта действий активированных иммунизацией антител к ГЛУ и ГАМК. Эти данные являются прямым свидетельством существенной роли в механизмах психоэмоционального стресса дисбаланса функций глутаматергических и ГАМК-ергических нейротрансмиттерных систем. Очевидно, наряду с AT к ГЛУ и ГАМК важную роль в стрессорных процессах могут играть и AT к NMDA-рецепторам, вызывающих в культуре дегенерацию гиппокампальных нейронов (Sun D.A., 2001). Однако этот аспект проблемы остается пока никем не исследованным.

Продолжением установленных в двух предыдущих разделах работы фактов стало изучение возможных методов иммунокоррекции стресс вызванных нарушений посредством пассивной иммунизации животных AT к ГЛУ при трех способах аппликации очищенных от примеси AT к БСА-носителю специфических антител. В результате внутрибрюшинного, внутримышечного и интраназального однократного введения антител выявлено одинаковое их защитное действие, в качестве профилактики стрессорных нарушений. Одновременно с этим был таюке зафиксирован защитный иммунокоррекционный дозозависимый эффект АТ, вводимых интраназально после стрессорного воздействия. Однако неожиданным оказалось потенцирующее стрессорные нарушения действие начальной незначительной, малой дозы АТ к ГЛУ. Последнее представляется труднообъяснимым феноменом. Очевидно, данная доза АТ, введенная вслед за стрессом, снижая уровень ГЛУ в ЦНС, усиливает по принципу обратной связи выброс нейротрансмиттера на фоне активированной стрессом глутаматергической системы. Однако этот механизм может быть изменен при интраназальном введении большей дозы АТ к ГЛУ. Было установлено, что постстрессорное интраназальное введение АТ к ГЛУ в оптимальной дозе 250 мкг/кг подавляет проявления психоэмоционального стресс-синдрома по поведенческим показателям и уменьшает тяжесть язвообразования в слизистой желудка. В настоящее время обоснована эффективность интраназального чрезбарьерного введения различных соединений, в том числе протеинов (Кобб Т.М. е1 а1., 2004, 2008; 012игаг80п Б. е1 а1., 2006). Особый интерес представляет использование РаЬ-фрагментов АТ. Однако этот вопрос требует официального исследования. Таким образом, полученные в ходе исследования данные могут служить научно-практическим итогом диссертационной работы.

Полученные данные расширяют представления о нейроиммунопатологических механизмах развития стресс-синдромов. Усиленное образование аутоантител к ГЛУ и ГАМК при недолговременных приступах боли и менее выраженная продукция их при затяжных болевых приступах у больных остеохондрозом может иметь прогностическое значение. Полученные результаты защитного действия АТ к ГЛУ могут послужить основой для разработки методов иммунокоррекции нарушений, вызванных стрессом и повышения индивидуальной устойчивости к стрессорным воздействиям иммунизацией антителами к глутамату. Можно полагать, что интраназальное введение антител к ГЛУ больным в межприступный период может предупредить рецидив болевой реакции и очевидно может препятствовать развитию стрессорных психоэмоциональных расстройств у людей.

106