Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Оценка качества и стандартизация композиций на базе диквертина

На правах рукописи

□□30Б9343

САВВАТЕЕВ АЛЕКСЕЙ МИХАЙЛОВИЧ

ОЦЕНКА КАЧЕСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ КОМПОЗИЦИЙ НА БАЗЕ ДИКВЕРТИНА

15 00,02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание >ченой степени кандидата фармацевтических наук

МОСКВА - 2007

003069343

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московская медицинская академия имени Й М Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук Белобородое Владимир Леонидович

Официальные оппоненты-

профессор, доктор химических наук Харитонов Юрий Яковлевич

профессор, доктор фармацевтических наук Берлянд Александр Семенович

Ведущая организация:

Институт стандартизации и контроля лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применениям Росздравнадзора

Защита состоится « _2007 г а '^часов на заседании диссертаци-

онного совета Д 208 040 09 при Московской медицинской академии имени И М Сеченова г:о адресу 121019, г Москва, Никитский бульвар 13

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии имени ИМ Сеченова по адресу 117998, г Москва, Нахимовский проспект, 49

Автореферат разослан ^^ 2007 г

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208 040 09 доктор фармацевтических наук профессор

Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Для России с ее богатейшими растительными рес} рсами характерен широкий масштаб производства фитопрепаратов В гостаг» многих из них в ;одят фтавоноидные соединения

Относительно недавно этот список пополнился препаратом Диквертин®, обладающим антиексидантными и капилляропротекторньши свойствами Растительным источником диквертина служит древесина лиственницы Состав его представлен тремя фла-воноидными соединениями при подавляющем количестве (90% и выше) одного из них -дигидрокверцетина

Банк присущих диквертину фундаментальных фармакологических свойств обеспечивает ему базисный статус для создания на его основе препаратов, комбинированных с другими лекарственными средствами с целью оптимизации отдельных видов фармакологического действия В последние годы проведены совместные исследования сотрудниками НИИ фармакологии ТНЦ СО РА.МН и кафедры органической химии ММА им И М Сеченова по разработке принципиально новой группы гемореологичесьих лекарственных препаратов Известно, что течорео топические нарушения осложняют -еченче таких заболеганий, как ишсмическая болезнь сердца, артериальная гипертензчя л др

Препарат, сочетающий диквертин и аскорбиновую кислоту, зарегистрирован как ангиочротекторное лекарственное средство Асковертин® Препарат, сочетающий диквер-1ин и ацетилсалициловую кислоту (год рабочим названием СаливертинЧ, прошел стадию доклинического изучения с выявлением антигромбоцитарлсго и геморео логического действия Сочетание диквертина с двумя компонентам и - аскорбиновой кислотой и В-каротином - используется как биологически актизная добавка к пище «Каровертин»

Появление новых комбинированных препаратов в силу усложнения состава действующих веществ, существенно различающихся но свойствам, ставит задачу поиска оптимальных путей их фармацевтического анализа

Актуальность настоящей работы определяется необходимостью совершенствования на современном физико-химическом уровне стандартизации базового фитопрепарата диквертина, а также создания системы стандартизации новых комбинированных препаратов

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлась разработка методологического подхода к оптимизации хроматографического анализа в качестве сквозного унифицированного метода стандартизации как базовою препарата диквертина, так и комбинированных препаратов на его оснозе

Для достижения поставленной цели решались следующие задали

* модификация я унификация методик анализа диквер тина - ст растительного сырья, субстанции, стандартного образна до лекарственной формы,

* совершенствование методик спектрального (УФ, ИК, ЯМР) анализа стандартного образца дигидрокьерцетича,

* разработка методик \роматогрэшииеского анализа с учетом специфичности состава комбинированных препаратов - аскозертипа, саливертина и ЬАД - карочертина, ,

\ \ \

• валидация предлагаемых методик на основе изучения соответствующих валидаци-онных характеристик,

• включение разработанных методик в фармакопейную документацию

Научная новизна. Предложен единый методический подход к стандартизации комбинированных препаратор на базе диквертина путем сквозного использования метода ВЭЖХ в сочетании со специфичностью пробоподготовки

Определены оптимальные хроматографические условия эффективного разделения флавоноидных компонентов диквертина и аскорбиновой кислоты, компонентов дикверш-на и ацетилсалициловой и салициловой кислот в составе комбинированных препаратов -асковертина и саливертина соответственно Разработаны селективные и воспроизводимые методики качественного и количественного анализа действующих веществ комбинированных препаратов

Предложены спектральные (УФ-, ИК-, ЯМР 'Н, ЯМР 13С) и хромаЮ1рафические критерии подлинности и оценки качества стандартного образца дигидрокверцетина

Разработан оригинальный комбинированный способ использования в определенной последовательности методов твердофашой экстракции, ВЭЖХ и спектрофотометрни для анализа разнополярных компонентов каровертина

Впервые разработана система стандартизации лекарственного растительного сырья -древесины лиственницы цельной и измельченной

Практическая значимость. Методихи анализа действующих веществ препаратов диквертина, асковертина и саливертина вггидкрсваны и унифицированы с целью определения таких фармакопейных показателей, как подлинность, родственные соединения, посторонние примеси, растворение, однородность дозирования, количественное определение Разработанные аналитические методики включены в зарршстрированнне фармакопейные статьи Лиственницы древесина цельная, измельченная «ангро4^ Дигиярокверцетин-стандрртньш образец, Дихвертин субстанция, Диквертин таблетки, Асковергин таблетки, в проект фармакопейной статьи Саливертин таблетки, в Технические условия на Б АД <чКаровершн»

Предложенные методики апробированы на производственных сериях табчеток диквертина, асковертина и саливертина

Основные положения, выносимые на защиту.

• Результаты изучения хроматографических характеристик флавонсидных компонентов диквертина Усовершенствованная методика стандартизации и оценки качества диквертина методом ВЭЖХ

• Спектральная (УФ-, ИК-, ЯМР 'Н и ЯМР '"С) и хроматографическая характеристика дигидрокверцетина как стандартного образца и оценка его индивидуальности и степени чистоты

• Оптимальные хроматографические параметры ВЭЖХ для одновременного качественного и количественного анализа аскорбиновой кисчоты и флавоноидов диквертина Валидированная и >нифицррованная для определения ряда фармакопейных показателей методика стандартизация препарата асковертина методом ВЭЖХ

• Оптимальные хроматографические параметры ВЭЖХ для одновременного качественного и количественного анализа ацетилсалициловой кислоты, примеси салициловой кислоты и флавоноидов диквертина Валидированная и унифицированная для определения фармакопейных показателей методика стандартизации желудоч-но-резистентных таблеток саливертина методом ВЭЖХ

• Комплексный аналитический подход (твердофазная экстракция, ВЭЖХ, спектро-фотометрия) к анализу компонентов каровертина (аскорбиновая кислота, диквер-тин, р-каротин)

• Стандартизация лекарственного растительного сырья - древесины лиственницы цельной, измельченной «ангро»

• Результаты изучения возможности использования разработанных методик в анализе опытно-промышленных серий асковертина и лабораторных серий саливертина Апробация работы Основные положения работы доложены на IV, VI, IX и X международных съездах «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Великий Новгород 2001, С-Пб 2002, 2005 и 2006), на VI Симпозиуме по фенольным соединениям (Москва 2004) на XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2005)

Публикации По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры органической химии ММА им И М Сеченова «Физико-химические основы стандартизации и биотрансформации лекарственных средств и биологически активных добавок к пище» Номер госрегистрации 01200110547

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, двух глав, отражающих собственные экспериментальные исследования, выводов, списка литературы и приложения Работа иллюстрирована 22 таблицами 37 рисунками и 17 схемами Библиографический список включает 124 отечественных и 64 зарубежных источников

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Характеристика основных объектов п методов исследования

Объектами настоящего исследования являлись образцы древесины лиственницы сибирской и л даурской, дигидрокверцегин - стандартный образец, биофлавоноидный комплекс диквертии и одноименный препарат «Диквертин», композиции на базе диквертина, лежащие в основе создаваемых оригинальных комбинированных препаратов Доминирующий компонент диквертина (90% и более) - дипшрокверцетин В состав диквертина входят также родственные флавоноиды дигидрокемпферол и нарингенин

Препарат «Асковертин» является комбинацией диквертина и аскорбиновой кислоты (таблетки, содержащие 0,02 г диквертина в пересчете на 100% содержание дигидрокверце-тина н 0,05 г аскорбиновой кислоты) Композиция диквертина и ацетилсалициловой кисло-

ты лежит в основе разрабатываемого препарата «Саливертин» (таблетки покрытые желу-дочно-резистентной оболочкой, содержащие 0,01 гдиквертинав пересчете на 100% содержание дигидрокверцетина и 0,05 г ацетилсалициловой кислоты) Композиция диквертина, аскорбиновой кислоты и Р-каротина является основой БАД «Каровертин» (таблетки, содержащие 0,01 г диквертина в пересчете на 100% содержание дигидрокверцетина, 0,05 г аскорбиновой кислоты и 0,001 г р-каротина) В исследование включались модельные смеси, субстанции и таблетки одноименных препаратов

Основным аналитическим методом, используемым в работе, являлся метод ВЭЖХ Для идентификации и анализа объектов исследования привлекались методы УФ-, ИК-, ЯМР Н и ЯМР ПС спектроскопии Для фракционирования многокомпонентных смесей на стадии пробоподготовки применялась твердофазная экстракция в ее современном техническом исполнении

2. Методический подход к анализу многокомпонентных смесей на базе диквертина

В состав биофлавоноидного комплекса и вышеуказанных композиций входят разнохарактерные с химической точки зрения соединения от наиболее полярной и гидрофильной аскорбиновой кислоты, полярных и менее гидрофильных флавоноидов до неполярного и гидрофобного р-каротина Эффективное разделение компонентов смеси является основой для их аналитическою определения

Многокомпонентность состава комбинированных препаратов обусловила поиск оптимальных способов анализа и стандартизации их действующих веществ Методические пути анализа многокомпонентных смесей, использованные в настоящей работе, представлены на схеме 1

Схема 1 Алгоритм разработки методик анализа смесей на базе диквертина

Унификация методик качественного и количественного анализа композиций осуществилась таким образом, чтобы они служили единой аналитической основой для определения фармакопейных показателей качества препарата год чинность, посторонние примеси, растворение, однородность дотирования^ котчесггеенное определение Большое значение уделено вадидации методик, даюшей высокую степень уверенности в том, что разработанная методика приводит к результатам, отвечающим устаковлеаным критериям приемлемости

3. Физико-химическая характеристика дигидрокверцетина как стандартного образца

В фармацевтическом анализе для получения точных (правильных) и воспроизводимых результатов анализа ЛС решающее значение имеет применение высокоочищенных и хорошо охарактеризованных стандаотных образцов

Стандартный образец дигидрокверцетина (СО ДГК), получаемый из древесины лиственницы сибирской (Lwix sibirica Ledeb) и л гмелииэ, или л даурской (larix gmehrt.i (Rupr ) Rupr, синоним Lawс dahvrica Turcz ), бьп разработан в 1996 г совместчо кафедрой органической химии MIMA им ИМ Сеченова и ООО «Флавир» г Иркутск За прошедший период проведена работа по совершенствованию способа выделения ДГК из экстракта древесины с использованием ВЭЖХ в полупрепаративном варианте Эксчерименталтная работа по потученгао СО ДГК проведена в ООО <'Фчавкр/>, г Иркутск

Одна из целей настоящей работы заключалась во всесторонней характеристике фк-зико-химических свойств СО ДГК, доказательстве его строения и степени чистоты

Индивидуальность и ст'реохимическое строение ДГК докэзычалось с пемошью хроматеграфических (ВЭЖХ) и спеггральных (УФ-, ИК-, ЯМР *Н кЯМР ,jO методов

Хроматографический анализ проводили с использованием дв}^ ти"ов сорбентов -октадецилги чановых и цмкопропилситановкх - как в кзократическом, так и в градиет-ном режимах элгоирезания Подвижной фазой (ПФ) служили смеси ацетонитрила или метанола с водными растворами кислоты (фосфорной, трифтороуьсусной или уксусной) с рН 3,0 - 3.5 Создалие такой кислотности среды необходимо для подавления диссоциации фенольных гидроксичьяых групп Детектирование осуществляли на аналитических длинах волн при 230 им для обнаружения соединений с короткой хромофорной системой, при 290 нм - ДГК и флаванонов с близкой структурой и при 370 нм - возможных примесей флавонов Широкое варьирование условий производили с целью выявления возможных примесей В качестве оптимальных нами предложены следующие условия ВЭЖХ анализа ДГК колонка LiChrosper RP-18 5 мкм (250 х 4,6 мм), ПФ А - ацетокитрил, Б-2% уксусная кисло га Градиентное люирование А Б 0-4 мин 35 65 об %, 4,1-10 мин 70 30 об % Скорость потока - 1 мл/мин аналитическая длина волны 290 нм В данных условиях эффективность голокки по пику ДГК сост^вл^ет 5450 т т коэффициент емкости к'-1,6, фактор симметрии пика А5-0,9-1,05, относительное стандартное отклонение площади пика S 0,98% На всех хроматограммах образцов ДГК содержался единственный пик практически со 100% степенью чистоты

Степень чистоты ДГК подтверждалась также методом ЯМР Спектры ЯМР 'Н и ЯМР 13С регистрировали в дейтерированных растворителях - метаноле и диметитс^ль-фоксиде Отнесение сигналов, их мультиплетность и константы спин-спинового взаимодействия спектра ЯМР 'Н ДГК в ДМСО-В6 в области от 0,5 до 12 мд представлены в табл 1 Суммарная интенсивность всех указанных сигналов соответствует 12 протонам молекулы ДГК С15Н12О7

Наряду с сигналами протонов, представленных в табл 1, наблюдаются сигналы растворителя ДМСО-Об (квинтет ооаточных протонов дейтерированных метальных групп при 2,50 м д) и уширенный сигнал воды при 3,34 м д , а также незначительные примесные сигналы - уширенный синглет при 1,25 м д (0,03 массовых%) и сннглет при 2,07 м д (0,007 массовых%), который можно отнести к ацегону, используемому в технологическом цикле В целом, на основании анализа методами ВЭЖХ и ЯМР можно оценить степень чистоты образцов ДГК не ниже 99,96%

ОН Также проведено отнесение всех сигналов в спектре

ЯМР |3С Химические сдвиги ядер 13С ДГК в ДМСО-Об (8, мд) 71,62 (С-3), 83,10 (С-2), 95,02 (С-8), 96, 03 (С-6), 100,53 (С-4а), 115,17 (С-5), 115,40 (С-2') 119 41 (С-6'), 128,08 (С-1'), ¡44,98 (С-З7), 145,81 (С-4'), 162,6 (С-8а) 163,37 (С-5), 166,83 (С-7), 197,78 (С-4)

НО ^^О

ТА ГС ГН 6

•ОН

Таблица 1 Химические сдвиги (8) и константы ешш-спивозого взаимодействия (Л) в ЯМР 'Н спектре СО ДГК в ДМСО-П6'

(дл - дублет дублетов, д - дублет, с - синггет, АВ - АВ-система)

Данные спектра Кольно С Кольцо А Р^озьцоВ I Протоны ОН групп п ри

Н-2 Н-3 Н-6 Н-8 Н-2' ¡Н-5' и Н-6' С-5 С-3 С-7 С-3' С-4'

8, м д 4,973 4,483 5,898 5,8481 6 868 ¡6,72-6,76 11,87 5,712 10,78 8,98 8,93

Гц 11,1 6,1 и 11,1 2,0 2,0 - 8,2 - 6,1 - - -

Сигнал д д д д д с АВ с д с ¡' с с

* Спекхры ЯМР получены и обс>ждены старшим научным сотрудником химического фак>льтета МГУ им М В Ломоносова, д \им и Чертковым В А

Индивидуальность структуры ДГК наиболее полно подтверждена методом ЯМР Для отнесения сигналов в спектрах ЯМР 'Н и ЯМР ПС наряду с мучьтиплетностью, интегральной интенсивностью и положением сигналов использовалась информация двумерных экспериментов Н8С>С и НМВС Особенно важную информацию дают кросс-пики двумерного эксперимента НМВС, которые позволяют устанавливать корреляцию сигналов 'Н и 13С, находящихся друг от друга через две-три связи Использование современного подхода позволило впервые разделить и сделать надежное отнесение сигналов протонов всех гидрохсильных групп Ранее не удавалось идентифицировать сигналы протонов гидроксичьных 1рупп при С-7, С-3 и С-4' сигналы коютэых перекрывались и наблюдались в виде уширенного пика В наиболее слабом поле расположен неуширенный сигнал гид-роксильной группы 5-ОН (11,87 и дчто свидетельствует об образовании внутсимолеку-

лярной водородной связи между 5-ОН к карбонильной группой Проюн 5-ОН группы дает отчепивые кросс-пики, соответствующие константам 13С-Н через две, три и четыре связи с атомами углерода С-5 С-4а, С-6, и С-7 Относительно 1/оло уширен также сигнал протона группы 4'-ОН, который имеет кросс пики с С-3', С-4', С-5' (рис 1)

5 ОН

не

Н2'

7 ОН

з'он/он

[Н 5'

ho

ril

,нз

л:

сз_

С2_ С—=

се_

С4з С 5'

С 2_

С 6'

СГ"

СЗ_

С4

-— ------ - ----- —------- -—» —

* - & * - т

« -*

шт

- = _--X * _ - -

♦------ • ---

♦ » Ч

г 60

■100

г-120

КО

-1S0

-130

Юг

PPm 10 8 6

Рис. 1. Двумерный спектр ЯМР дивдрокверцетина - по оси абсцисс сигналы протонов я нх отнесение,- по оси ординат снгналы ядер 13С и ил отнесение

Молекулярной специфичностью (за исключением отнесения стероизомеров) обладает и метод ИК-спектроскспии Для подтверждения индивидуальности исследованного СО ДГК нами предложен ИК-спектр в виде суспензии в вазелиновом масле (рис 2)

В высокочастотной области хорошо разреатаются полосы поглощения, обусловленные валентными колебаниями ОН-связей свободных (3550 см1), связанных внутримолекулярной (3406 см"') и межмолекулярной (широкая полоса с максимумом при 3250 см"1) водородными связями

Валентные колебания связей С-Н в ароматическом кольце проявляются при 3080 см"1, залентные колебания ароматического кольца - при 1615, 1588 см'1 Положение интенсивной полосы валентного колебания карбонильной группы (1644 см"') свидетельствует об ее участии в водородном связывании Высокое разрешение полос поглощения в области «отпечатксв пальцев» (1300-600 см') позволяет использовать ИК-спектр в суспензии в вазелиновом масле для ьадежной идентификации ДГК (рис 2)

УФ-спектр СО ДГК в подкисленном этаноле в области длин во ш от 230 нм до 380 нм характеризуется наличием полосы поглощения с минимумом при 2Л7±2 нм и максимумом при 290±2 ям, имеющей плечо при 320-327 нм Концентрации испытуемых рас-

творов (0,001%) отвечапа оптическая плотность от 0,590 до 0,640 Для количественной характеристики СО предложен удельный показатель поглощения Е1С„'% при длине волны ¿90 0 нм Проведено 9 независимых определений удельного показателя трех образцов ДГК Величина удельного погтогцения для этих растворов составила з среднем 623 х 19

Рис. 2, ИК-слектр дигидрокверистпна в вазелиновом масле

Молекула ДГК содержит двг центра хиральности и является оптически активным веществом Для решения вопроса об относитечьной конфигурации стереоцентров в моче-куле исследуемого дигидрокверцегина ключезую роль играет величина константы спич-спинового взаимодействия (3) протонов Н-2 и К-3 По данным ЯМР 'Н спектра эта константа равна 11,1 Гц, что свидетельств) ет об их т/7й«с-расположении Такую отпсси-течъную конфигурацию имеют два стереоизомера дигидрокверцетина - 2Я,ЗД-изомгр и его энантиомер - ¿^ЗЗ-изомер Учитывая сумму установленных в настоящее время физико-химических характеристик для всех четырех стереоизомерных форм ДГК, можно воспользоваться сравнением со специфическим сочетанием дня каждого стереоизомера двух характеристик величины константы I и направления угла оптического вращения

Исследуемый в нашей работе ДГК имеет положительное значение удельного вращения, что в сочетании со значением константы I 11,1 Гц позволяет считать его изомером с 2Я,ЗЛ-конфигурацЕей

С помощью комплекса физико-химических методов установлено, что СО ДГК представляет собой индивидуальное соединение высокой степени чистоты, отвечающее структуре (2Л,ЗД)-2,3-дигадро-3,5,7-тр1Ш1дрокси-2-(3,4-дагидроксифег1ит)-4Я-1-бензогиран-4-она.

На базе высокоразрешэюхцей аппаратуры усовершенствованы спектральные и хро-матографические методики анализа, обеспечивающее достоверность проверки подлинно-

сти и чистоты ДГК, которые легли в основу соответствующей ФС для регистрации ДГК в качестве государственного стандартного образца

ГСО ДГК использовался в чашей работе для количественною определения модельных смесей, субстанций и лекарстврнных форм исслед) емых объектов (схема 2)

Схема 2 Использование ГСО ДГК для количественного определения препаратов на базе диквертина

4. Анализ и стандартизация диквертина в субстанции, таблетках и растительном сырье

В состав субстанции диквертина (ДКВ) входят ДГК (Э0% и более), родственьые соединения флаванонового ряда - дигидрокемпферол и нарингенин, допускается наличие флавонота кверцетина Суммарное содержание дигидрокемпферола, нарингеника и квер-цетина в субстанции должно быть не более 10% В древесине листвииницы в незначительных количествах присутствуют пиностробин, пиноцембрин и пинобаксин

Учитывая многокомпонентный состав ДКВ, оптимальным для его анализа является метод ВЭЖХ Общим а структуре флаЕоноидных компонентов ДКВ является наличие ма-лополярнсй ароматической углеродной и тероуглеродной основы, несущей более полярные гидроксильные заместители Такой тип структуры предопределяет использование обращенно-фазно»-о варианта ВЭЖХ

Пробоподготовка субстанции и таблеток ДКВ заклкналась в непосредственном растворении образцов в ацетонитриле, фильтрации и дальнейшем разбавлении смесью растворителей, используемой в качестве ПФ Нерастворимые в ацетоннтриле вспомогательные вещества удалялись фильтрованием Установлено, что вспомогательные вещества, растворимые в ацетонитриле, не мешают определению компонентов ДКВ

При выборе аналитической длины волны изучены УФ-спектры ДКВ в ацетонитриле с добавлением водного раствора кислоты или щелочи в интервале рН от 2 до 8 В интервале рН от 2 до 4 спектр ДКВ, как и спектр ДГК, характеризуется максимумом полосы поглощения при 290±2 нм, имеющий плечо при 320-327 пм При увеличении рН от 4 до 8 наблюдается уменьшение интенсивности поглощения при 290 нм к увеличение при 325 нм, что обусловлено ионизацией фенольных гадроксильчых групп Наилучшая воспроизводимость спектров достигается в интервале рН 2-3, когда ДГК находится в купонизированном состоянии Это обстоятельство учитывалось при выборе состава ПФ Диггд-рокемпферот и нарингенин имеют сходную с ДГК хромофорную систему и соответственно, подобный УФ-спектр КБерце1ин (флайонол) имеет максимум поглощения при

370 нм Современные детекторы позволяют проводить обсчет результатов сразу для нескольких длин вочн В то лее Еремя чувствительность УФ детекторов такова, что, даже используя в качестве аналитической только дайну волны 290 чм, можно обнаружить кверце-тан (.если он имеется) в образце ДКВ вплоть до его содержания 0,01% по массе

Выбор обращенно-фазного сорбента осуществлен на основе анализа эффективности разделения компонентов ДКВ на этил-, октил- и октадецилсилановых сорбентах с использованием модельных смесей, содержащих ванилин в качестве внутреннего стандарта В составе ПФ использовали метанол или ацетонитрил и 2% уксусную кислоту Расчет хроматографических параметров показывает преимущество октадецилсиланового сорбента по эффективности, симметрии пика и воспроизводимости площади пика (табч 2)

Таблица 2 Сравнение некоторых хроматографических параметров анализа ДКВ (при

5 повторных определениях)

Определяемый показа- 1 тель LiClirosoiblOORP-2 , 250 мм х 4,6 мм, | 5 мкм Колонки LiChrosorb 100RP-8 250 мм х 4,6 мм, 5 мкм LiChrosorb 100 RP-18 250 мм х 4 6 мм, 5 мкм

N по пику ДГК, т т | 815,860,900 840, ! 810 3900,3853,3800, 3600, 3700 4300, 4400, 4500,4800,4900

Rs пиков ДГК к ванилин? 2,1 2 0,2,1,2,0,2,1 2,0,2,2, 2,0, 2,1,2,1 2,7, 2,6 2 5, 2,5, 2,5

S площади пик? ДГК, % ! 1 8 ± 0,2 1,5+0,2 U +0,1

AS пика ДГК 10,9 1,5, 2 0, 0,7, 1,2 0,8, 1 2, 1,5, 1,2 1,1 1,0, I,1, 0,8, 0,9, 1,0

Июкратическич режим элюирования не позволяет оптимизировать хроматографи-ческий процесс для каждэю кочлонента ДКВ В ПФ ацетонитрил - 2% уксусная кислота (30 70 об %) оптимизированы условия для ДГК к дигидрокемпферола, но на хроматз-граммах наблюдается асимметрия пиков нарингенина и кверцетина, имеющих большую величину коэффициетна емкости к' При резком увеличении органического модификатора ПФ (ацетонитрил - 2% уксусная кисло га 70 30 об %1, ДГК элюируется практически с мертвым временем колонки, но для прков нарингенина и кверцетина это соотношение оптимально Поэтому, для оптимизации хроматографического процесса подобран градиентный режим элюирования колонка 250 мм х 4,6 мм, сорбент ЬСИгоБрИег 100, ЛР-18, 5 мкм, аналитическая дчина волны 290 нм ПФ- ацетонитрил (А), кислота уксусная 2,0% (Б), условия градиента (время/отношение А к Б (об %)) 0-4,0 мин/35 65, 4,110,0 мин / 70 30, скорость потока ПФ 1 мл/мин, температура колонки 20 СС

Предлагаемые условия оптимизированы по хроматографическим параметрам (табл. 3) Значения коэффициента емкости к' находятся в диапазоне от 0,532 для ДГК до 2,902 для кверцетина Оптимальными являются значения параметров селективности а и разрешающей способности служащие мерой качества разделения

Эффективность хроматографической колонки (Н), рассчитанная дчя пика ДГК, составила от 4325 до 5100 теоретических тарелок, коэффициент ассиметрии гика (Ас) от 0,94 до 1,05 Относите 1ьное стандартное еггклонеьье площади пика ДГК (5) составило 1,0% Хроматочзафические параметры свидетельствуют о пригодности хроматографиче-

ской системы Методика ваяидирована по соответствующим параметрам, подтверждающим ее специфичность, точность и воспроизводимость, линейную зависимость в аналитической области, что позволяет исгользовать ее дчя достоверной оценки качества субстанции и препарата диквертин

Таблица 3 Параметры хромат ографнческого разделения компонентов диквертина _(среднее из 5 определений)_

Соединение Эффективность 14, т т Коэффициент емкости, к' Селективность, а Разрешающая способность, Из

Дигидрокверцетин 5050 0,532

1,859 1,86

Диглдрокемферол 3210 0,989

2,612 15,4

Наришенин 4420 2,585

1,124 1,89

Кверцетин 5320 2,902

При разработке методики анализа большое внимание уделялось унификации условий анализа с целью возможности скеозной стандартизации диквертина от растительного сырья ло лекарственной формы по фармакопейным тестам (схема 3) Схема 3 Унификация ВЗЖХ методики анализа диквертина

Анализ ДКВ методом ВЭЖХ —

Стардчртизуемь'е показатели

Л

ж

¿к.

ПОДЛИННОСТЬ растительное сырье субстанция таблетки ПОСТОРОННИЕ ПРИМЕСИ субстанция таблетки РОДСТВЕННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ субстаьдия табпетки ОДНОРОДНОСТЬ ДОЗИРОВАНИЯ субстаьция табле~кр КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ растительное еь.рье субстанция таблетки

Подтверждение подлинности ДКВ производится путем сопоставления хромато-грамм образцов субстанции или таблеток с хромагограммой СО ДГК Наряду с пиком ДГК в образцах ДКВ содержатся пики соответствующие дигидрокемпферол> и нрринге-нину с временами удерживания относительно СО ДГК 1,3 ± 0,1 и 2,4 + 0,1 соответственно Возможно наличие пика, соответствующего квераегпну с относительным временем удерживания 2,7 ±0,1

Содержание родственных соединений и ДГК в образцах ДКВ в процентах рассчитывается на основании площадей соответствующих пиков и пика ГСО ДГК Суммарное содержание дигидрокемпферола, нарингенина и кверцетина в образце должно быть не более 10 0%, содержание ДГК - не менее 90,0%

Стандартизаоня растительного сырья, содержащего ДКВ В иелях сквозной стандартизации ДКВ от растительною сырья до препарата разработанная методика адаптирована для анализа содержания ДГК в цельном и измельченном ЛРС - древесине лиственницы

С этой келью разработана специальная процедура пробояодготовки, направленная

на освобождение исследуемой пробы от ряда примесей, способных не только помешать анализу, но и опасных с позиции сохранности сорбента колонки и хромата графического оборудования В методику пробоподготовки к анализу была введена стадия твердофазной экстракции (ТФЭ) Выявлено Ч10 оптимальным сорбентом для проведения ТФЭ явились патроны Кехиэ 60 п^ (Уапап) Путем последовательного промывания патрона с нанесенной пробой растворителями различной полярности производилось удаление примесей -неполярных (элюированием хлороформом и бензолом) и полярных (элюированием 2% водным раствором уксусной кислоты) Подбор экспериментальных условий элюирования пргмесей без десорбции ДГК проводили под контролем чувствительной цианидиновоя пробы и с помощью ВЭЖХ

Для элюирования ДГК с патрона достаточно 1 мл ацетонитрила Анализ содержания ДГК в древесине лиственницы проводили по вышеописанной методике

Установлено, что содержание ДГК в древесине лиственницы варьирует н широком интервале от 0,5% до 3 0 - 3,5% (редко до 4,0 - 4,5%) Это связано с разными географическими зонами произрастания Важно отметить, "то по количественному содержанию ДГК в древесине нет принципиального различия между двумя ботаническими видами лиственницы - сибирской и даурской

5. Анализ и стандартизация комбинированных препаратов на базе диквертина

5.1. Способы анализа многокомпонентных препаратов на основе диквертина с использованием метода твердофазной экстракции

Для стандартизации асковертина, саливертчна л каровертина необходимо было решить задачи прсбоподготовки и анализа действующих веществ - ДГК и аскорбиновой кислоты (АК), ДГК и ацетилсалициловой кислоты (^СК), ДГК и АК и р-каротинл соответственно

Непосредственное одновременное спектрофотометрчческое определение всех компонентов комбинированных препаратов в одной пробе затруднено тем, что получаемая при их совместном присутствии кривая УФ-спектра представляет собой спектр наложения, в котором невозможно выдели 1Ь области индивидуального поглощения каждого из компонентов Кроме того, спектры действующих веществ в неионизированном и ионизированном состоянии значительно различаются и необходимо было выбрать интервал рН, в котором воспроизводимость спектра наибольшая Так, анализ водных и водно-метанольных растворов АК методом УФ-спехтроскопии показал, что в течение короткого промежутка времени происходит изменение интенсивности оптического поглощения В водных растворах кислот - 0,1% НэРОа или 0,03% СРзСООН - с рН 2,5-2,7 (степень ионизации, вычисленная по данным рКа АК = 4,04 и рН составляет ье более 2%), а также при добавлении к растворам кислог до 30% метанола по объему оптическая плотность АК не изменяется в течение 2 ч, что достаточно для анализа Стабильность действующих веществ в той или иной среде учитывалась при выбор? экстрагентов и элюентов

Для каждого из перечисленных препаратов предложены варианты анализа, основанные на предварительном разделении компонентов методом ТФЭ (рис. 3) Анализируемые

смеси пропускали через колонку, затепленную соответствующим адсорбентом, на которой сорбировались отдельные компоненты В наибольшей степени данной цели отвечали универсальные патроны для ТФЭ Isexus (Vanan) и патроны с полиамидным сорбентом DPA-6S (Supelco) Разделение компонентов достигалось элюирозанием подходящим растворителем Извлеченные из таблеток флавоноидяые соединения сорбировались на патроне АК или АСК не сорбировались и находилась в водном элюате, прошедшем через патрон Элюат, содержащий АК, анализировали спектрофотометрически на длине волны 244 нм Параллельно в этих же условиях измеряли оптическую плотность РСО АК, обработанную аналогичным образом с использованием процедуры ТФЭ Для расчета содержачие АК в таблетке использовали значение EiCm разное 523 Аналогично в случае саливертина анализировали АСК на длине волны 271 нм Флавоноидные компоненты ДКВ извлекали из таблеток метанолом и анализировали спектрофото метрически или методом ВЭЖХ Величину оптической птотносга при длине вечны 290 им использовали для количественной оценки содержания ДГК

Достоинством способа анализа, основанного на разделении компонентов методом ТФЭ и их спектрофэтометрическом опредеченпи, является экспресность и применение доступного, недорогого оборудования Вместе с тем, очевидны и недостатки метода Не учитывается вклад в поглощение ДГК родственных соединений - дигидрокемпферота и наринге-нкна, имеющих аналогичные спектральные характеристики Таким образом, можно проводить анализ только совокупности флавочоидных компонентов ДКВ, а не ДГК При анализе АСК не учитывается и не анализируется примесь СК, а ее содержание в препаратах АСК регламентируется В случае асксвертина оценка эффективности ТФЭ показала, что не происходит полного разделения АК и фпаЕо^оидов, до 3-4% флавоноидов от их общего содержания в таблетке не сорбируется на патроне ТФЭ и находится в водном растворе Поэтому данный подход не является оптимальным для стандартизации асковертина и сализер-тина и для этих препаратов безусловный интерес представляла разработка ууиверегльной методики одновременного определения действующих веществ, родственных соединений и примесей с использованием метода ВЭЖХ

В то же время для стандартизации каровертина данный вариант анализа является оптимальным, так как в альтернативном случае пришлось бы разрабатывать два способа ВЭЖХ анализа - один для АК и флавоноидов и другой для (5-каротина учитывая,что их анализ треб>ет различного сочетания подвижных и неподвижных фаз Использование ТФЭ (рис Зв) позволяет отделить АК и проанализировать ее спектрофотометрически, выделить и проанализировать методом ВЭЖХ компоненты ДКВ p-Каротин экстрагируется из исследуемого образца гексаном и аназизируется спектрофотометрически при длине волны 465±4 нм с использованием удельного показателя поглощения равного 2335 Пред-тагаемый вариант акализа с использованием ТФЭ характеризуется высокой селективностью чувствительностью и воспроизводимостью

АСКОВЕРТИН

Экстракция 0,1% НгР04 и СНрН, фильтрация, доведение объема е колбе бо метки

(Т) Элюцип Н,0

@ Эпюция СН3ОН

Сорбция

на патроне Nexus или DPA6S

Анализ АК, спектро-фотометрия

Анализ ДКВ,

спектро-фотометрия, ВЭЖХ

сирн Раствор

1 l.'ll ТФУЭмл

1САЛИВЕРТИН

КАРОВЕРТИН

Извлечение АСК, CK, флавоноидов, ДКВ, фильтрация, довздение объема в колбе до mcwu

(Т) Эмоция СеН-о

фЭлюция Нр

®ЭлюцияСН,ОН

Сорбция

на патроне Nexus или DPA6S

лГ

Ф,

Анализ АСК,

спектоо-фотометрия

©

Анализ ДКВ,

спектро-фотометрия, ВЭЖХ

5 мл

фЭлюция Нр

5 мл

Точно отвешенная навеска растертых таблеток

Сухая навеска

на патроне Nexus или DPA 6S

тг

(D Сушка воздухом 5 мин

@ Эпюция СНрН А-.

Доведение объема в колбе Зо метки Анализ ß-каротина,

спектро-фотометрия

v©

Доведение объема в колбе до метки Анализ АК и ДКВ, ВЭЖХ

Рта. 3. Способы анализа многокомпонентных препаратов с исчолыоьанием метода ТФЭ а)

асковертин, б) саливертин, ё) каровертин

5 2. Разработка унифицированной методики одновременного определения компонентов препарата Асковертин методом ВЭЖХ

В результате исследования различных вариантов пробог.одгоговки к анализу методом ВЭЖХ выбран гростой, эффектиьныи способ жидкостной экстракции Компоненты ДКВ полностью извлекаются метанолом, при последующем добавлении к пробе 0,03% раствора ТФУ происходит потное растворение АК Определяемые компоненты АК и ДГК устойчивы в растворах ТФУ и ПФ в течение 2 ч и более

Поиск тучшего варианта хроматографических условий показал, что оптимальное разделение высокополярной АК и менее полярных и гидрофильных флавоноидов ДКВ достигается на сорбентах с привитой циано-фазой в режиме обращенно-фазього элюиро-вания (сорбент ХогЪах СМ, 5 мкм, ПФ метанол - 0,03% тр«иртороукс>сная кислота 21 79

06 %) При данной кислотности ПФ (рН среды 2,7) все компоненты аскозертика находятся в неионизированной форме и наряду с неспецифическими взаимодействиями «сорбат-сорбент» появляются специфические - водородные связи между сорбатом и ннтрильной группой сорбента Таким образом, селективное« дачной хроматографической системы отличается от селективности традиционных обращенно-фазных алкильных сорбентов, при разгонке на которых аК элюируетсь практически с мертвым объемом

Методика одновременного анализа АК и <$лавоноидов ДКВ оптимизирована по хроматографическим параметрам Пики родственных ДГК соединении, входящю в состав субстанции ДКВ, чегко различаются от пиков действующих веществ и имеют следующие показатели времени удерживания относительно СО ДГК дигидрокемпферол 1 3 ± 0,1 и наричгеник 1,9 г 0,1 Эффективность хроматографической колонки (К) варьирует по пику АК от 1554 до 1577 и по пику ДГК от 1354 до 1370 т т Разрешающая способность Я для пары АК-ДГК составляет 1,3, для пары ДГК-дигидрокемпферол 1,1, для пары дигиро-кемпферол-нарчнгения 2,5 Коэффициент асимметрии пика варьирует от 0,8 до 0,9 для пика АК и от 0,85 до 1,08 для пика ДГК Отнссительное стандартное отклонение площади пика (8) составило 2,49% ± (п - 5) для площадл пика АК и 1,32% ± (п = 5) для площади пика ДГК Все приведенные параметры характеризуют пригодность хроматографической системы для анализа асковертина Для проведения количественного анализа компонентов аековертина АК и ДГК методика валидирована по линейности, воспроизводимости, правильности

Унификация методики ВЭЖХ анализа осуществлена таким образом, чтобы она служи ча единой аналитической базой для испытаний на подлинность, родственные соединения, растворение, однородность дозирования и для количественного определения АК и ДГК в таблетках Подлинность на хроматограмме полученной методом ВЭЖХ в предложенных условиях, должны содер каться пики ДГК и А К, совпадающие по времени удер-я иьания с пиками ГСО ДГК и РСО АК, а также должны обнаруживаться родственные соединения - дигидрокемпферол и нарингенин

На рисуте 4 приведены результаты теста «растворениел, который введен только длл ДГК ках наименее растворимого кз двух действующих веществ Определение прсво-

дили в соответствии с требованиями ОФС л2-0003-00. По данным анализа 5 серий препарата через 20 мин количество ДГК в растворе достигало максимума и составляло не менее 80% от его ¡финального содержания в таблетке 0 018

S 0 016s

р | 0 014

I | 0012

X В

I I 0.01 | 0,008 0 006

Рис. 4. Профиль высвобождения ДГК из таблеток асковертина

По результатам теста «однородность дозированиям отклонение содержания ДГК в одной таблетке составило от J- 7 до - 6,5% от среднего содержания, отклонение содержания АК одной таблетке составило от + 7,2 до - 6,0% от среднего содержания, что удовлетворяет требованиям ГФ XI

Результаты количественного определения АК и ДГК 5 опытно-промышленных партий таблеток «Асковертик», выработанных ОАО «Диод», приведены в табл 4

Таблица 4 Результаты анализов образцов таблеток Асковертина, изготовленных ОАО «Диод»

Серия Количественное определение в дягидрокверцетина, ог 0,0185 г до 0,0215 г -аблетке (ВЭЖХ) аскорбиновой кислоты от 0,0462 г до 0,0537 г

010503 0,019^ 0,0485

02С603 0,0196 0,0510

030703 0.U/00 0,0492

040803 0,0201 0,0515

050903 0,0187 0,0490

Таким образом разработанная методика анализа действующих веществ асковертина методом ВЭЖХ является универсальной « может быть использована для определения фармакопейных показателей, лежащих з основе оценхи качества препарата

5 3. Разработка унифицированной методики анализа компонентов саливертина методом ВЭЖХ

Основная цель в создании такой методики заключалась в разработке оптимальных условий одновременного определения действующих веществ саливертина - ДГК и АСК, родственных соединений биофлавоноидного комплекса ДКВ и посторонней примеси СК

Хорошее разделение всех компонентов композиции ДКВ и АСК удалось реализовать в обращенно-фазном варианте в ПФ метанол-водный раствор кислоты в условиях градиентного элюирования В качестве аналитической выбрана длина волны 280 нм, при которой АСК, СК и компоненты ДКВ имеют интенсивное поглощение

Разработка состава ПФ включхла впбор органического компонента и водного раствора клелоты Для данной многокомпонентной смеси преимущество, по сравнению с ацетонигрилом, имеет метанол, как более «мя~кий» чпюент, имеющий более низкую

элюирующую способность ДирЕЫбора лучших параметров удерживания изучено влияние величины ПФ и типа кислоты на эффективность, разрешающую способность и размывание хроматографической зоны

В таблице 5 представлены параметры пиков ДГК и АСК, полученные при использовании ПФ метанол-водный раствор кислоты в изократическом режиме 45 55 об % Оптимальное значение коэффициента емкости к' реализуется только для ПФ с 1% уксусной кислотой или 0,01% фосфорной кислотой Наиболее высокая симметрия пиков ДГК и АСК достигается при использовании ПФ с ортофосфорной кислотой или трифтороуксус-ной кислотои (коэффициент ассимстрии пиков ДГК и АСК составляет в ПФ с н3ро4 0,930,94 и 0,91-1,05, соответственно, тогда как при использовании 1% СНзСООН 0,89 и 0,84) Критерий разделения пиков Из дгк/аск и селективность ацгк/лск при использовании ортофосфорной кислоты находится в оптимальном диапазоне значений, что предопределило включение данной кислоты в состав ПФ

Таблица 5 Выбор оптимального кислотно! о модификатора ПФ

"\Состав пф СН3ОН СН3ОН сн3он СНзОН СНзОН

5% СНзСООН 12% СНзСООН 1% СНзСООН 0,01% н3ро4 о,оз%ср3соон!

ГН3 51 рН 3,68 рН 3,68 рН 3,25 рН 2,88

к'л-к 0,682 0,902 0,964 1,020 0,890

к'АСК 1,07 1,27 1,27 1,32 1,21

адгк/АСк 1,57 1,39 1,30 1,29 1,39

эддгк 5202 4842 5305 5202 4389

Кдск 76°8 7025 7844 7516 6505

Кэ ДГК/АСК 3,73 3,10 2,71 2,9

дгк 0,77 1.13 0,89 0,95 0,9!

AsACK 0,94 0,95 0,84 0,94 1,05

Для оптимизации хроматографического процесса по каждому компоненту саливер-тиьа предпочтительным является ¡радиентный режим разгонки фаза А - сн3он, фаза Б -0,01% н3ро4, в начальный момент соотношение А Б - 45 55 об %, к седьмой мичуте разюнки 48 52об%, к 15 минуте 80 20 об % Хроматограчма образца таблетки сали-вертина представлена на рис 5, а параметры разделения компонентов в табл б Как видно из представленных данных все параметры находятся в оптимальном диапазоне

Лекарственной формой саливертина являются таблетки покрытые кишечно-растворимой оболочкой Наряду со вспомогательными вещестзами ядра (мелкокристаллическая целлюлоза, лактоза, картофельный крахмал и стеарат кальция) они содержат вспомогательные вещества оболочки (колликут МАЕ-100Р, полиэтиленоксид 400, диоксид титана) Процесс пробоподготовки оптимизирован таким образом, чтобы вспомогательные вещества ядра л оболочки не извлекались в анализируемый раствор Поиск подходящего экстрагента привел к выбору в качестве такового ацетонитрила Установлено, что в нем плохо растворимы компоненты оболочки таблетки, которые удаляют фильтрованием, но хорошо растьоримы действующие вещества Полученный расгзор разбавляют ПФ А до удобного для анализа уровня концентраций действующих веществ

1 1 1 1 ! | 1 20 !| 1 Л

' 1 J 11 --r>v- в L ... . __ _ б

..-Au -J V.

Рис 5. Хроматограмыы, иллюстрирующие селективность определения дигидрокверцети-на, ацетилсалициловой кислоты л салициловои кислоты в таблетках саливертина а - ГСО ДГК, б - PCO АСК, в - таблетки саливертина, порядок выхода веществ ДГК f5,3), АСК (6,1), дигидрокемтЬерол (7,31, CK (8,5), наритешгн (12 8), г-ГСО CK

Таблица 6 Хроматографические параметры разделения компонентов смеси АСК и ДКВ (среднее из п=9)

Соединение N k' I а Rs

ДГК 5000 1 020 j

! J.29 2,9

АСК 7000 1,32 |

1,49 2,52

Дипздрокег.юферол 4800 2,12

1,11 1,32

Салициловая кислота 7900 : 2,53

1 1,82 11,24

Карингенин 6510 j 4,27

Разработанная методика позволяет проводить качественный и количественный анализ саливертина с использованием внешних стандартов образцов - ГСО ДГК, PCO АСК и CK Относительное стандартное отклонение площади пика ДГК составляет 2,37%, АСК 1,22% Универсальность методики ВЭЖХ анализа саливерина позволяет использовать ее в фармакопейных тестах «подлинность», «количественное определение», «растворение», «однородность дозирования», «посторонние примеси»

Поскольку саливергин относится ко 2-й группе ГЛФ - желудочно-резистентные таблетки, то в соответствии с фармакопейными требованиями тест «растворение» проводится в две стадии - в кислой, а затем нейтральной среде Тест «растворение» может быть введен только для ДГК, как наименее растворимого из дзух дейстзующчх веществ Количество перешедшего в раствор ДГК определяли методом ВЭЖХ ро представленной методике, в сравнении с раствором ГСО ДГК в подвижкой фазе Таким образом, для тестов

«растворение» и «количественное определение» предложена единая методика ВЭЖХ, а в качестве стандарта один и тот же раствор ГСО ДГК По данным анализа 5 серий препарата на 1-й стадии (кислотной) в растЕор 1,ерез 60 мин переходило не более 10% ДГК, на 2-й стадии (буферной) в растворе через 45 мин определялось не менее 70% ДГК, что соответствует требованиям ГФ XI

Количественный анализ ДГК и АСК с использованием стандартных образцов по данной единой методике ВЭЖХ лежит и в основе теста «однородность дозирования»

В препаратах, содержащих АСК в качестве посторонней примеси может присутствовать СК Она образуется в резутьтате гидролиза АСК на технологических стадиях производства и при нарушении условий хранения 3 различных фармакопеях допустимые уровни нормирования примеси СК в лекарственных формах АСК несколько различаются По Европейской Фармакопее содержание СК в таблетках АСК должно быть не более 0,15%, а по Фармакопее США - не более 0,3% В таблетках аспирина покрытых оболочкой в Фармакопее США нормируется допустимая примесь СК не более 3%

Обнаружение примеси СК в препарате осуществляется на основании совпадения на хроматограммах времен удерживания гика в образцах с таковым для РСО СК Методика позволяет анализировать СК в таблетках без оболочки и в таблетках покрытых оболочкой Дтя таблеток покрытых оболочкой анализ СК рекомендуется проводить, используя разбавленный раствор, одновременно с анализом действующих компонентов препарата а не покрытых желудочно-резистенгкой ейоточкой более концентрированный раствор

По результатам анализа таОеток 5 серий препарата саливертина установлено, что содержание СК изменялось в интервале 0,0009 - 0,0014 г Ни в одной из анализируемых серий содержание примеси СК не поевышалс допустимое значение (не более 3%)

Разработанная методика оценки качества саливертина с использованием ВЭЖХ испытана в анализе модельных смесей и табчеток двух лабораторных партий Методика нашла отражение в подготавливаемой фармакопейной документации для регистрации препарата саливертина «подлинность», «однородность дозирования*/, «растворение», «посторонние примеси», «количественное определение»

6. Валидация методик анализа диквертина, асковертина и саливертина

Важнейшим критерием оценки аналитической методики служит доказательство ее валидности, включающей взаимосвязанную систем) характеристик - специфичность, пригодность хроматографической системы, линейность, правильность и воспроизводимость

С этой целью выполнено экспериментальное исследование по изучению комплекса валидационных характеристик разработанных методик определения действующих веществ указанных препаратов методом ВЭЖХ Пригодность хрома-тографической системы дтя анализа каждого препарата подтверждена оптимальными значениями хроматографических параметров, представленными выше

Специфичность методики основана на возможности достоверно определять количественное содержание дейетв}эощих веществ в таблетке г присутствии вспомогательных

веществ и родственных соединений Процесс цробопаяпмдаки оптимизирован таким образом, что вспомогательные вещества «дра и оболочки не извлекаются в анализируемый раствор На хроматограммах модельной смеси, содержащей вспомогательные вещества без дейстьующих веществ (птацебо), отсутствуют пики, мешающие определению действующих веществ Тождественность действующих веществ препаратов ДГК, АК, АСК и СК подтверждалась совпадением времен удерживания анализируемых компонентов таблетки и стандартных образцов Пики родственных соединений, входящих в состав субстанции диквертин, хорошо разделяются с пикрми действующих веществ

Линейная зависимость методики отражает пропорциональность возрастания площади пика на хроматограмме при возрастании количества анализируемых веществ в испытуемых образцах Данная валидациончая характеристика исследовалась на модельных смесях в интервале 70-130% от заявленного содержания действующих компонентов в таблетках Зависимость аналитического сигнала (условных единиц площади пика) от содержания анализируемых веществ (в г) описаны уравнением регрессии у - Ьх ь а (габл 7) Сопасно полученным результатам все линейные зависимости характеризуются высоким коэффициентом корреляции в ичтервалг 70-130% декларируемой величины Этот интервал можно определить как аналитическую обчастъ методики

Правильность (.точность■) методики показывает систематические погрешности метода и выражается как процент регенерации точно взвешенного количества анализируемого образца Правильность разработанных методик установлена по результатам анализа модельных смесей с использованием СО длл трех повторностей определений се? ж аналитических концентраций В таблице 8 иродсмсро~рировьны результаты данной характеристик! валидпости на примере салквертина Как видно из представленных данных, методика обладает удовлечворчгелгней точностью Полученные аналогичным образом результаты для препарата аековертина показали, что средний процент регенерации составляет для АК 99,1%, для ДГК - 99,2% Результаты оценки правильности, полученные для всех методик, находятся в интервале 97-103%

Таблица 7 Параметры линейной регрессии зависимостей площадей пиков от содержания анализируемых веществ в модельных смесях

Действующее вещество Отрезок а Наклон Ъ Коэффициент корреляции

ДИКВЕРТИН

ДГК 127000 8,647 0,9993

АСКОВЕРТИН

ДГК 7257,3571 7,0212 0 4984

АК 6554,3571 3,8295 0,9998

САЛИВЕРТИН

ДГК 11310 6,16 0,9989

АСК 340660 8 88 0 9993

СК 1050 9 63 0,9886

Таблица 8 Оценка правильности методики определения действующих компонентов саливертина

Действующих веществ от заявленного в таблетке, % Состав в модельной смесн, г Найдено*,г Регенерация*,%

ДГК АСК дгк АСК ДГК АСК

70 0,0072 0,0358 0,0071 0,0357 98,6 99,7

80 0,0080 0,0407 0,0082 0,0405 102,5 99,5

90 0,0091 0,0455 0,0090 0,0454 98,9 99,7

100 0,0101 0,0506 0,0100 0,0507 99,0 100,2

110 00112 0,0555 0,0112 0,0558 101,8 100,5

120 0,0121 0,0602 0,0121 0,0600 100,0 99,7

130 0,0134 0,0653 0,0133 0,0652 99,3 99,8

* - среднее из 3 опредепений

Воспроизводимость аначитической методики характеризовалась степенью совпадения результатов индивидуальных определений при многократном использовании По представленным в таблице 9 параметрам (величины стандартного отклонения, доверительный интервал) можно сделать заключение о хорошей воспроизводимости методик анализа асковертина и саливертина Относительная ошибка среднего результата определения ДГК составляет 2,73 и 1,97% соответственно, АК 1,70%, АСК - 1,74% и СК 2,9%

Таблица 9 Оценка воспроизводимости методик анализа асковертина и саливертина

\„ мг 11 \ср±Д\ср 8 Р, Г х„ мг П хСр±Д\Ср 8 ЕСП

АСКОВЕРТИН

по ДГК 1 по АК

18 90 19 27 19 5-1 1954 19 44 20 20 20 45 20 8-> 21 04 9 19,96±0 5452 0,724 2,73 2,26 48 50 49 20 48 83 48 93 50 К) 50 75 51 47 49 00 51 23 9 49,78+0,85 1,3 1,70

САЛИВЕРТИН

по ДГК 1 по АСК

10 1 10 2 9 8 9 7 10 3 9 5 9 9 9 8 10 1 9 9,93+0,1959 0,260 1,97 2,26 48 51 50 10 48 96 5133 50 83 49 01 >1 47 48 80 49 23 9 49 8±0,87 1,15| 1,74

По валидационным характеристикам разработанные методики являются специфичными для определения содержания действующих веществ, характеризуются корректной точностью и воспроизводимостью, линейной зависимостью в аналитической области ± 30% по отношению к заявленному содержанию действующих веществ в табпетках, что позволяет испочьзовать их для достоверной оценки качества препаратов

ВЫВОДЫ

1 Разработан единый аналитический подход к стандартизации и оценке качества в цепи объектов древесина лиственницы - биофлавоноидный комплекс диквертин - комбинированные препараты на ба!е диквертина асковертин (с аскорбиновой кислотой), са-ливертин (с ацетилсалициловой кислотой), БАД каровертин (с аскорбиновой кислотой и (З-каротином) Аначитнческий подход, включающий этапы соответствующей пробо-подготовки и анализа методом ВЭЖХ, применим для определения фармакопейных показателей как субстанций, так и лекарственных форм

2 С помощью комплекса физико-химических методов установлено, что стандартный об-

разец дигидрокверцетина (производства ООО «Флавир», г Иркутск) представляет собой индивидуальное соединение высокой степени чистоты, отвечающее структуре (2Л,ЗЛ)-2,3-дипщро-3,5,7-тригидрокси-2-(3,4-дигидроксифенил)-4Я-1-бензопиран-4-она Предложены спектральные и хроматографические методики анализа, обеспечивающие достоверность подлинности (ИК-, ЯМР 'Н и ЯМР ,3С спектры) и чистоты (ВЭЖХ, ЯМР 'н и УФ-спектроскопия) дигидрокверцетина Исследованные образцы дигидрокверцетина соответствуют фармакопейным требованиям, предъявляемым к государственным стандартным образцам, и могут быть использованы для анализа лекарственных средств и лекарственного растительного сырья

3 Определены оптимальные условия разделения и анализа флавоноидных компонентов диквертина с использованием обращенно-фазного варианта ВЭЖХ на октадецилсила-новых сорбентах в градиентном режиме элюирования Предложена усовершенствованная методика стандартизации субстанции и табтеток диквертина с применением стандартного образца дигидрокверцетина и обосновано ее применение для анализа основного компонента дигидрокверцетина и родственных соединений - дигидрокемпфе-рола и нарингенииа

4 Установлено, что оптимальное разделение полярной и гидрофильной аскорбиновой кислоты и менее полярных и более гидрофобных флавоноидных компонентов диквертина достигается на сорбентах с привитой циано-фазой в режиме обращенно-фазного элюирования На основе щученных хроматографических характеристик композиции диквертина и аскорбиновой кислоты предложена унифицированная методика стандартизации субстанции и таблеток препарата асковертина

5 Разработаны эффективные способы пробоподготовки и одновременного анализа методом ВЭЖХ ацетилсалициловой кислоты, флавоноидных компонентов диквертина и салициловой кислоты (как возможной примеси) в таблетках саливертина, покрытых желу-дочно-резистентной оболочкой В предлагаемых хроматографических условиях эффективность колонки по пику дигидрокверцетина составила не менее 5000 т т, по пику ацетилсалициловой кислоты не менее 7000 т т, степень разделения всех пиков не ниже 2,5, фактор симметрии бчизок к единице Относительное стандартное отклонение площади пика дигидрокверцетина 2,4%, ацетилсалициловой кислоты 1,2% Все хроматографические параметры соответствуют современным фармакопейным требованиям

6 Предложен селективный и воспроизводимый способ анализа композиции диквертина, аскорбиновой кислоты и (3-каротина, как основы БАД каровертин и одноименного разрабатываемого препарата Способ основан на предварительном фракционировании компонентов смеси методом твердофазной экстракции и последующем анализе фракций методом ВЭЖХ (аскорбиновая кислота и компоненты диквертина) и УФ-спектрофотометрии (Р-каротин)

7 Изучен комплекс валидационных характеристик предложенных методов анализа и стандартизации препаратов диквертин, асковертин и саливертин в субстанции и лекарственных формах По результатам валидации установлено, что все разработанные методики яв-

ляются специфичными для определения содеру<ания действующих веществ, характеризуются корректной точностью (правильностью) и воспроизводимостью, линейкой зависимостью в аналитической области ± 30% по отношению к заявленному содержанию действующих Ееществ в препарате, что позволяет использовать их для достоверной оценки качества препаратов 8 Показано, что унифицированные методики анализа препаратов диквертин, асковертин и сализертик можно использовать для сквозной стандартизации препаратов по фармакопейным показателям подлинность, родственные соединения, посторонние примеси, растворение, однородность дозирования, количественное определение Методики включены в нормативную документацию по стандартизации и контролю качества вышеперечисленных прегаратов

Список работ опубликованных по теме диссертации

1 Савватеев А М , Тюкавкина Н А , Колесник Ю А и др Разработка новой биотога-чески активной добавки к пище << ¿.чтоксид» // Материалы IV международного съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных прспарагов природного происхождения» Великий Новгород -2001 -С 210-216

2 Савватеев А М , Тюкавкина Н А , Белобородов В Л и др Разработка методов анализа смеси диквертина и ацетилсалициловой кислоты - действующей основы нового комплексного препарата // Материалы VI международного съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождение» Санкт-Петербург -2002 - С 184-186

3 Савватеев А М , Белобсродов В Л , Тюкавкина Н А Хромалографический анализ гомпозкции диквертина и аскорбиновой кислоты // Материалы VI Симпозиума по фено^ьным соединениям М , 2004 - С 106

4 Савватеев А М , Белобородов В Л , Тюкавкина НА и др Валидация методики анализа препарата «Асковертин»//Фармация -2004 -№3 -С 11-14

5 Савватеев А М , Белобородов В Л , Тюкаркина Н А и др Вхлидность методики определения компонентов препараш «Саливертчп» // Фармация - 2005 - Л'? 3 - С ' 1-14

6 Савватеев А М , Тюкавкина Н А, Белобородов В Л и др Стандартизация композиции аскорбиновой кислоты, диквертина и |3-кактина // Материалы XII Российского нац контр «Человек и лекарство» М , 2005 - С 702

7 Савватеев А М, Белобородов В Л, Тюкавкина Н Л и др Разработка фармакопейного хромахографического метода анализа нового отечественного препарата сали-вертин // Материалы IX междунар съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» Санкт-Петербург, 2005 -С 556-559

8 Савватеев А М , Белобородов В Л , Тюкавкина Н А Определение примеси салициловой кислоты в новом препарате «Салявертин» методом ВЭЖХ // Микроэлементы в медицине - 2005 - Т 6 Вып 3 - С 90-93

9 Савватеев А М , Тюкавкина Н А , Белобородов В Л и др Физико-химическая характеристика дигидрокверцетина как стандартного образца // Материалы X мелзду-нар съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождениям Санкт-Петербург, 2006 -С 338-342

Подписано в печать/2007г. Объем/, пл Тираж {оО экз, Заказ № /с?

Для России с ее богатейшими растительными ресурсами, где к медицинскому применению разрешено около 200 видов растительного сырья [9,49], наиболее характерен широкий масштаб производства фитопрепаратов. Фитопрепараты составляют около 40% номенклатуры лекарственных средств, выпускаемых в нашей стране [2]. В состав большинства из них входят в том или ином количестве флавоноидные соединения.

Относительно недавно этот список пополнился препаратом Диквертин®, состав которого представлен тремя флавоноидными соединениями при подавляющем количестве (90% и выше) одного из них - дигидрокверцетина [104].

Диквертин выделен из древесины лиственницы и обладает антиоксидантными и капилляропротекторными свойствами [35]. Банк присущих диквертину фундаментальных фармакологических свойств обеспечивает ему базисный статус для создания на его основе препаратов, комбинированных с другими лекарственными средствами с целью оптимизации отдельных видов фармакологического действия (усиления некоторых эффектов, расширения спектра показаний, снижения уровня нежелательных побочных эффектов и т. п.).

В последние годы проведены совместные исследования по разработке таких комбинированных препаратов сотрудниками НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН и кафедры органической химии ММА им. И.М. Сеченова. Наиболее продвинутыми являются работы по созданию сочетанных с диквертином препаратов, в составе которых в роли «второго партнера» выступают известные и хорошо зарекомендовавшие себя лекарственные вещества - аскорбиновая кислота, ацетисалициловая кислота, [3-каротин.

Препарат, сочетающий диквертин и аскорбиновую кислоту, зарегистрирован как ангиопротекторное лекарственное средство Асковертин® [109]. Препарат, сочетающий диквертин и ацетилсалициловую кислоту (под рабочим названием Саливертин), прошел стадию доклинического изучения с выявлением антитромбоцитарного и гемореологического действия [66]. Сочетание диквертина с двумя компонентами - аскорбиновой кислотой и [3-каротином - используется как биологически активная добавка к пище «Каровертин», служащая источником антиоксидантов [76].

Диквертин [4], асковертин [61] и саливертин [66] составляют принципиально новую группу гемореологических лекарственных препаратов [70]. Актуальность создания препаратов этого класса диктуется острой необходимостью применения их в лечении заболеваний, связанных с гемореологическими расстройствами, выражающимися прежде всего в формировании синдрома повышенной вязкости крови (синдром гипервязкости крови). Гемореологические расстройства осложняют течение таких заболеваний, как нарушение мозгового кровообращения, ишемическая болезнь сердца, артериальная гипертензия и др. [114, 182].

В то же время известны сведения о возможности предотвращения негативного влияния синдрома гипервязкости крови с помощью антиоксидантов [71, 139, 162]. Отсюда становится понятной идея создания группы гемореологических препаратов на базе антиоксидантного препарата диквертина путем «обогащения» его другими известными и применяемыми в медицине веществами, обладающими также антиоксидантными (аскорбиновая кислота, Р-каротин) или антиагрегационными (ацетилсалициловая кислота) свойствами.

Появление новых комбинированных препаратов в силу усложнения состава действующих веществ, существенно различающихся по свойствам, ставит задачу поиска оптимальных путей их фармацевтического анализа.

Актуальность настоящей работы определяется необходимостью совершенствования на современном физико-химическом уровне стандартизации базового фитопрепарата диквертина, а также создания системы стандартизации новых комбинированных препаратов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлась разработка методического подхода к оптимизации хроматографического анализа в качестве сквозного метода стандартизации как базового препарата диквертина, так и комбинированных препаратов на его основе.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: • модификация и унификация методик анализа диквертина - от растительного сырья, субстанции, стандартного образца до лекарственной формы;

• совершенствование методик спектрального (УФ-, ИК-, ЯМР-) анализа стандартного образца дигидрокверцетина;

• разработка методик хроматографического анализа с учетом специфичности состава комбинированных препаратов - асковертина, саливертина и БАД каровертина;

• валидация предлагаемых методик на основе изучения соответствующих валидационных характеристик;

• включение разработанных методик в соответствующую фармакопейную документацию.

Научная новизна. Предложен единый методический подход к стандартизации комбинированных препаратов на базе диквертина путем сквозного использования метода ВЭЖХ в сочетании со специфичностью пробоподготовки.

Определены оптимальные хроматографические условия эффективного разделения сочетаний флавоноидных компонентов диквертина и аскорбиновой кислоты, компонентов диквертина и ацетилсалициловой и салициловой кислот в составе комбинированных препаратов - асковертина и саливертина соответственно. Разработаны селективные и воспроизводимые методики качественного и количественного анализа действующих веществ комбинированных препаратов.

Предложены спектральные (УФ-, ИК-, ЯМР1Н, ЯМР13С) и хроматографические критерии подлинности и оценки качества стандартного образца дигидрокверцетина.

Разработан оригинальный комбинированный способ сочетания методов твердофазной экстракции, ВЭЖХ и спектрофотометрии для анализа разнополярных компонентов каровертина.

Впервые разработана система стандартизации лекарственного растительного сырья - древесины лиственницы цельной и измельченной.

Практическая значимость. Методики анализа действующих веществ препаратов диквертина, асковертина и саливертина валидированы и унифицированы с целью определения таких фармакопейных показателей, как подлинность, родственные соединения, посторонние примеси, растворение, однородность дозирования, количественное определение. Разработанные аналитические методики включены в зарегистрированные фармакопейные статьи: ФСП 42-0083-7320-06

Лиственницы древесина Larix lignum цельная, измельченная «ангро»;

ФС 42-0162-06 «Дигидрокверцетин-стандартный образец»; ФСП 42-0083-0185-06

Диквертин®»; ФСП 42-0083-0186-06 «Диквертин® таблетки 20 мг»;

ФСП 42-0542-5494-04 «Асковертин® таблетки»; в проект фармакопейной статьи

Саливертин таблетки; в Технические условия ТУ 9352-001-1242812-04

Биологически активная добавка к пище «Каровертин».

Предложенные методики апробированы на производственных сериях таблеток диквертина и опытных сериях асковертина и саливертина.

Основные положения, выносимые на защиту.

• Результаты изучения хроматографических характеристик флавоноидных компонентов диквертина. Усовершенствованная методика стандартизации и оценки качества диквертина методом ВЭЖХ.

• Спектральная (УФ-, ИК-, ЯМР *Н и ЯМР13С) и хроматографическая характеристика дигидрокверцетина как стандартного образца и оценка его индивидуальности и степени чистоты.

• Оптимальные хроматографические параметры ВЭЖХ для одновременного качественного и количественного анализа аскорбиновой кислоты и флавоноидов диквертина. Валидированная и унифицированная для определения суммы фармакопейных показателей методика стандартизации препарата асковертина методом ВЭЖХ.

• Оптимальные хроматографические параметры ВЭЖХ для одновременного качественного и количественного анализа ацетилсалициловой кислоты, примеси салициловой кислоты и флавоноидов диквертина. Валидированная и унифицированная для определения фармакопейных показателей методика стандартизации желудочно-резистентных таблеток препарата саливертина методом ВЭЖХ.

• Комплексный аналитический подход (твердофазная экстракция, ВЭЖХ, спектрофотометрия) к анализу компонентов каровертина.

• Стандартизация лекарственного растительного сырья - древесины лиственницы цельной, измельченной «ангро».

• Результаты изучения возможности использования разработанных методик в анализе опытно-промышленных серий асковертина и лабораторных серий саливертина.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры органической химии ММА им. И.М. Сеченова: «Физико-химические основы стандартизации и биотрансформации лекарственных средств и биологически активных добавок к пище». Номер госрегистрации 01200110547.

ВЫВОДЫ

1. Разработан единый аналитический подход к стандартизации и оценке качества в цепи объектов: древесина лиственницы - биофлавоноидный комплекс диквертин комбинированные препараты на базе диквертина: асковертин (с аскорбиновой кислотой), саливертин (с ацетилсалициловой кислотой), Б АД каровертин (с аскорбиновой кислотой и Р-каротином). Аналитический подход, включающий этапы соответствующей пробоподготовки и анализа методом ВЭЖХ, применим для определения фармакопейных показателей как субстанций, так и лекарственных форм.

2. С помощью комплекса физико-химических методов установлено, что стандартный образец дигидрокверцетина (производства ООО «Флавир», г. Иркутск) представляет собой индивидуальное соединение высокой степени чистоты, отвечающее структуре

2/?3^)-23-ДигидрсьЗ,5,7-тригидрокси-2-(3,4-дигидроксифенил)-4Я-1-бензогафан-4она. Предложены спектральные и хроматографические методики анализа,

1 < 1 обеспечивающие достоверность подлинности (ИК-, ЯМР Н и ЯМР С спектры) и чистоты (ВЭЖХ, ЯМР 'Н и УФ-спекгроскопия) дигидрокверцетина. Исследованные образцы дигидрокверцетина соответствуют фармакопейным требованиям, предъявляемым к государственным стандартным образцам, и могут быть использованы для анализа лекарственных средств и лекарственного растительного сырья.

3. Определены оптимальные условия разделения и анализа флавоноидных компонентов диквертина с использованием обращенно-фазного варианта ВЭЖХ на октадецилсилановых сорбентах в градиентном режиме элюирования. Предложена усовершенствованная методика стандартизации субстанции и таблеток диквертина с применением стандартного образца дигидрокверцетина и обосновано ее применение для анализа основного компонента дигидрокверцетина и родственных соединений -дигидрокемпферола и нарингенина.

4. Установлено, что оптимальное разделение полярной и гидрофильной аскорбиновой кислоты и менее полярных и более гидрофобных флавоноидных компонентов диквертина достигается на сорбентах с привитой циано-фазой в режиме обращенно-фазного элюирования. На основе изученных хроматографических характеристик композиции диквертина и аскорбиновой кислоты предложена унифицированная методика стандартизации субстанции и таблеток препарата асковертина.

5. Разработаны эффективные способы пробоподготовки и одновременного анализа методом ВЭЖХ ацетилсалициловой кислоты, флавоноидных компонентов диквертина и салициловой кислоты (как возможной примеси) в таблетках саливертина, покрытых желудочно-резистентной оболочкой. В предлагаемых хроматографических условиях эффективность колонки по пику дигидрокверцетина составила не менее 5000 т. т., по пику ацетилсалициловой кислоты не менее 7000 т. т., степень разделения всех пиков не ниже 2,5, фактор симметрии близок к единице. Относительное стандартное отклонение площади пика дигидрокверцетина 2,4%, ацетилсалициловой кислоты 1,2%. Все хроматографические параметры соответствуют современным фармакопейным требованиям.

6. Предложен селективный и воспроизводимый способ анализа композиции диквертина, аскорбиновой кислоты и р-каротина, как основы Б АД каровертин и одноименного разрабатываемого препарата. Способ основан на предварительном фракционировании компонентов смеси методом твердофазной экстракции и последующем анализе фракций методом ВЭЖХ (аскорбиновая кислота и компоненты диквертина) и УФ-спектрофотометрии ф-каротин).

7. Изучен комплекс валидационных характеристик предложенных методов анализа и стандартизации препаратов диквертин, асковертин и саливертин в субстанции и лек. формах. По результатам валидации установлено, что все разработанные методики являются специфичными для определения содержания действующих веществ, характеризуются корректной точностью (правильностью) и воспроизводимостью, линейной зависимостью в аналитической области ± 30% по отношению к заявленному содержанию действующих веществ в препарате, что позволяет использовать их для достоверной оценки качества препаратов.

8. Показано, что унифицированные методики анализа препаратов диквертин, асковертин и саливертин можно использовать для сквозной стандартизации препаратов по фармакопейным показателям подлинность, родственные соединения, посторонние примеси, растворение, однородность дозирования, количественное определение. Методики включены в нормативную документацию по стандартизации и контролю качества вышеперечисленных препаратов.