Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Антикоагулянтная активность сульфатированной целлюлозы и аптамера RA36

00

На правах рукописи

Л/

ш

Савчик Елена Юрьевна

АНТИКОАГУЛЯНТНАЯ АКТИВНОСТЬ СУЛЬФАТИРОВАННОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ И АПТАМЕРА ИАЗб

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 4 МАР 2013

Москва-2013

005050691

Работа выполнена в Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении «Гематологический научный центр» Министерства Здравоохранения России

(ФГБУ ГНЦ Минздрава России)

Научный руководитель:

доктор биологических наук Дрозд Наталья Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории фармакологии цереброваскулярных расстройств ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова» РАМН

доктор биологических наук, заведующая клинико-диагностическим отделом ФГБУ "Институт хирургии им. A.B. Вишневского" Минздрава России

Ганьшина Тамара Сергеевна

Демидова Валентина Семеновна

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова Минздрава России

Защита состоится «_»_ 2013 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д.001.024.01, созданного на базе ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова» РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д. 8.

Автореферат разослан « » _ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Вальдман Елена Артуровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Сульфатированные полисахариды (СП) представляют собой большую и сложную группу макромолекул, которые обладают широким спектром важных биологических свойств. У них обнаружены антигипоксические, противовоспалительные, иммунотропные, противоопухолевые, противовирусные, противомикробные, сорбционные, антикоагулянтные (АК) свойства (Алексеенко и соавт. 2007, Chen et al 2009, Hayashi et al 2008, Kiphuth et al 2009, Li et al 2005, Medeoris 2008). В настоящее время интерес к полисахаридам растительного происхождения, как к соединениям, обладающим низкой токсичностью (Mauray et al 1995), значительно возрос. Если ранее полисахариды, в основном, применялись в качестве вспомогательных компонентов в производстве различных лекарственных форм, то в последние годы их в большей степени рассматривают как биологически активные вещества.

Сульфатированный полисахарид (гликозаминогликан) нефракционированный гепарин (НФГ) - один из широко используемых в клинической практике антикоагулянтов прямого действ™, который выделяют из тканей млекопитающих (легкие крупного рогатого скота или слизистая оболочка кишечника свиней) (Hirsch et al 2001, Linhardt et al 2003). АК активность (способность подавлять образование фибрина) НФГ связана с увеличением скорости ингибирования активированных факторов свертывающей системы крови — фактора Па (тромбин), активированных факторов X (фактор X), IX, XI, в основном, посредством активации плазменного ингибитора серпновых протеаз (серпина) - антитромбина (AT) (Guermazi et al 2009, Izaguirre et al 2009). При активации еще одного серпина - кофактора гепарина П (КГ II), происходит ингибирование только тромбина. НФГ катализирует подавление активности фактора Ха и тромбина в одинаковой степени, то есть соотношение активностей анти-фактор Ха (аХа) к анти-фактор lia (alla) составляет 1 к 1 (Alban et al 2002).

В качестве антнтромбопгческих (АТБ) средств, кроме НФГ, в настоящее время применяют ряд полусинтетических низкомолекулярных гепаринов (НМГ) с подобным НФГ механизмом действия, но средним распределением молекулярной массы (ММ) от 4 до 7 кД и отношением aXa/alla от 1,5 до 3,8 (Weitz et al 2004), а также синтетические пентасахариды только с аХа активностью - фондапаринукс и идрапаринукс. Интенсивно используют в разработках по поиску АТБ средств и другие СП природного происхождения: фукоиданы, галактаны и сульфаты хитозана, маннанов,

галактоманнанов, пектинов (Витязев и соавт. 2010, Дрозд и соавт. 2008, Henry et al 2010, Pittler et al 2005). Известно, что существует корреляция между структурой и АК/АТБ активностями НФГ, НМГ и гепариноподобных соединений (сульфаты дерматана, гепарана, хондроитина, кератана и гиалуроновой кислоты) из тканей млекопитающих (Neha et al 2008). Эту информацию используют для направленного получения соединений с необходимой активностью. Для придания необходимой активности в настоящее время применяют как химическое модифицирование макромолекул нативных соединений, так и технологии синтеза (Brihton 2004, Chaidedgumjom et al 2002, Dace et 1 1997, Franz et al 1995, Gustafsson et al 2004, Nimje 2005).

К синтетическим ингибиторам тромбина и фактора Ха относят такие соединения, как апиксабан, дабигатран, бивалирудин, аргатробан, мелагатран/ксимелагатран, аптамеры (Schulman et al 2007, Scott et al 2011, Weitz et al 2004). В настоящее время научный мир все больше проявляет интерес к аптамерам - олигонуклеотидам (молекулы одноцепочечной ДНК {оцДНК} или РНК), которые специфически связываются с целевой молекулой в наномолярных концентрациях (Bock et al 1992, Buddai et al 2010, Long et al 2008, Wu et al 1992). Неоспоримым преимуществом аптамеров является вероятность подбора высокоспецифичного антидота - аптамера (Dyke et al 2006, Kim et al 2008, Nimjee et al 2006). Так, Rusconi С.Р. и соавт. (2004) разработали и РНК аптамер (RB006; pegnivaco) с ингибиторной активностью по отношению к фактору 1Ха, и его комплементарный антидот - аптамер (RB007; anivamersen) для нейтрализации антикоагулянтной активности.

Таким образом, актуален поиск новых АК средств с разным механизмом действия. Экспериментальные исследования и анализ новых соединений с разным механизмом АК действия является актуальным для поиска и создания потенциальных фармакологических препаратов. Исследование связи структура - активность сульфатов целлюлозы позволит направленно получить наиболее активные полисахариды. Оценка in vitro АК потенциала ДНК аптамера RA36 позволит определить направления и дозовый диапазон для дальнейшего углубленного доклинического изучения на моделях in vivo.

Цель работы

Исследование влияния ДНК аптамера RA36 (in vitro) и сульфатированной целлюлозы, выделенной из древесины Pápulas trémula, Abies sibirica Ledeb хлопка Gossypium, {in vitro и ex vivo) на фибриногенсвертывающую и амидолитическую активность тромбина, активированного фактора X и агрегацию тромбоцитов человека.

Задачи исследования

1. Исследовать влияние сульфатов целлюлозы, выделенной из древесины осины (Pópulus trémula), с диапазоном молекулярных масс 12,7 - 18,9 кД и степенью замещения по сере 0,54 - 0,61 на амидолитическую активность тромбина и активированного фактора X в присутствии и без антитромбина, на время свертывания плазмы человека in vitro в тестах активированное частичное тромбопластиновое время, РеаКлот-гепарин, тромбиновое время, протромбиновое время, эхитоксовое время и анцистроновое время.

2. Оценить возможность образования комплексов между полианионами сульфатов целлюлозы, выделенной из древесины осины (Pópulus trémula), с диапазоном молекулярных масс 12,7 - 18,9 кД и степенью замещения по сере 0,54 - 0,61 и поликатионом антидотом - сульфатом протамина с помощью биоспецифичного электрофореза, и провести нейтрализацию антитромбиновой активности образцов сульфатов целлюлозы сульфатом протамина в тесте тромбиновое время.

3. Оценить фармакодинамические параметры сульфата целлюлозы, выделенной из хлопка (Gossypium), с молекулярной массой 30-60 кД и степенью сульфатирования 0,8-2,5, при внутривенном введении кроликам в дозах 0.3, 1.0 и 5.0 мг/кг и сульфата целлюлозы, выделенной из древесины пихты (Abies sibirica Ledeh), при подкожном введении в дозах 5, 20, 40 мг/кг; исследовать антитромботическую и геморрагичекую активности сульфатированной целлюлозы из древесины пихты.

4. Исследовать влияние аптамера RA36 на амидолитическую активность тромбина в присутствии и без антитромбина, на время свертывание плазмы/крови человека, кроликов, крыс in vitro в тестах РеаКлот-гепарин, тромбиновое время, эхитоксовое время, время рекальцификации, время свертывания крови в сравнении с нефракционированным гепарином и рекомбинантным гирудином.

5. Оценить влияние сульфатов целлюлозы, выделенной из древесины осины {Pópulus trémula) и древесины пихты (Ahie ssibirica Ledeb), аптамера RA36 на скорость и агрегационную способность тромбоцитов человека, индуцированную аденозиндифосфорной кислотой.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

Впервые была исследована АК активность шести образцов сульфатов целлюлозы, выделенной из древесины осины (Pópulus trémula), с ММ 12,7 - 18,9 кД и C3s 0,54 - 0,61; причем антитромбнновая активность данных СЦ преобладала над анти-фактор Ха

активностью. Показана способность протамнна сульфата образовывать комплексы с образцами исследуемых сульфатов целлюлозы, а также нейтрализовать их антитромбиновую активность in vitro в тесте ТВ. Впервые проанализировано влияние СЦ из древесины осины на плазму человека in vitro при активации свертывания коагулазами из ядов змей и определены эффективные дозы СЦ, выделенной из хлопка (Gossypium, ММ 30-60 кД, СС 0,8-2,5) и древесины пихты (Abies sibirica Ledeb, MM 3,6 кД, CC 1,65), при введениях экспериментальным животным. Впервые исследовано АТБ действие сульфата целлюлозы, выделенной из древесины пихты (Abies sibirica Ledeb), с молекулярной массой 3,6 кД и степенью сульфатирования 1,65 при моделировании венозного тромбоза у крыс, а также геморрагическая активность при внутривенном введении крысам.

Впервые частично определен механизм действия синтезированного аптамера RA36 с молекулярной массой 10000, который является антикоагулянтом прямого действия, и оценена АК активность RA36 in vitro в плазмах человека, крыс и кроликов в сравнен™ с НФГ и рекомбинантным гирудином.

Практическая значимость работы

Экспериментально обоснована возможность конструирования новых АК на основе сульфатов целлюлозы, выделенной из травянистых и древовидных растений для профилактики и лечения тромбозов. Рассчитаны дозы для оценки фармакологической активности аптамера RA36 при введении экспериментальным животным.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Показано, что сульфаты целлюлозы, выделенной из древеснны осины (Pópulus trémula), с диапазоном молекулярных масс 12,7 - 18,9 кД и степенью замещения по сере 0,54 - 0,61 катализируют ингибирование антитромбином скорости гвдролиза тромбином и активированным фактором X хромогенных субстратов, увеличивают время образования фибринового сгустка в плазме человека in vitro в коагулолошческих тестах: активированное частичное тромбопластиновое время, РеаКлот-гепарин, тромбиновое время, протромбиновое время, эхитоксовое время и анцистроновое время.

2. Показано комплексообразование между полианионами сульфатов целлюлозы, выделенной из древесины осины (Pópulus trémula), с диапазоном молекулярных масс 12,7 - 18,9 кД и степенью замещения по сере 0,54 - 0,61, и используемым в клинической практике антидотом сульфатом протамина, а также исследована in vitro нейтрализация сульфатом протамина антитромбиновой активности сульфатов целлюлозы.

3. Определены зависимость от дозы и время действия сульфата целлюлозы, выделенной из хлопка (Gossypium, ММ 30-60 кД, СС 0,8-2,5), вводимом внутривенно кроликам в дозах 0,3-5 мг/кг, в сравнении с дозой НФГ 5 мг/кг. Выяснено, что сульфат целлюлозы, выделенной из древесины пихты (Abies sibirica Ledeb, MM 3,6 кД, СС 1,65) как in vitro, так и ex vivo при подкожном введении кроликам, эффективно удлиняет время свертывания плазмы, проявляет антитромботическую активность на модели венозного стаза у крыс и геморрагическую активность.

4. Показано, что аптамер RA36, в отличие от рекомбинантного гирудина, не оказывает влияния на ингибирование скорости гидролиза тромбином хромогенного субстрата как в буфере, так и в плазмах человека, крыс, кроликов; кроме того, исследованный аптамер увеличивает фибриногенолитическую активность плазмы/крови человека, крыс in vitro в тестах РеаКлот-гепарин, тромбиновое время, эхитоксовое время, время рекальцификации, время свертывания крови, тогда как время свертывания плазмы кроликов при добавлении RA36 возрастает только в тестах время рекальцификации и тромбиновое время.

5. Обнаружено, что сульфаты целлюлозы из древесины осины (Pápulas trémula) и древесины пихты (Abies sibirica Ledeb), а также аптамер RA36 не влияют как на способность тромбоцитов человека агрегировать при индуцировании аденозиндифосфорной кислоты, так и на скорость агрегации.

Апробация работы

Основные результаты и положения диссертации были представлены на Всесоюзных и Международных конференциях, конгрессах, симпозиумах: XVII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов - 2010, секция «Биология», Москва 2010; 5-я Международная конференция «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Москва 2010; III Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» - Нижний Новгород 2010; Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению», Москва 2010; Пятая всероссийская конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием), Москва, 2011; Russian-Indian Symposium on Glycosciences, Moscow, Russia, 2011; 10"' International conference of the European Chitin Society, St.-Petersburg, Russia, 2011; XXIII Congress of the international

Society on Thrombosis and Haemostasis, Kyoto, Japan, 2011; 36th FEBS Congress, Torino, Italy, 2011; Конгресс гематологов России, Москва, 2012.

Публикации.

Основные положения и результаты работы отражены в 15 научных работах, в том числе: 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов кандидатских диссертаций, 11 статей и тезисов, опубликованных в материалах российских и международных конференций и симпозиумов.

Личный вклад соискателя. Автор самостоятельно выполняла анализ литературы по теме исследования, проводила экспериментальные исследования, получала и анализировала результаты ко всем главам диссертации, интерпретировала, проводила статистическую обработку полученных данных и формулировала выводы. По результатам работы при непосредственном участии автора подготовлены публикации.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста и состоит из введения, главы материалы и методы, главы результатов собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка использованной литературы, включающего 364 источника, из них 22 отечественных, 342 зарубежных. Работа иллюстрирована 24 таблицами и 32 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Выделение, изучение химического состава, структуры и химическое модифицирование образцов для определения АК активности проводились в следующих организациях: сульфаты целлюлозы, выделенной из древесины осины (Pópulus trémula, 6 образцов с диапазоном молекулярных масс 12700 — 18900 Д, степенью замещения по сере 0,54 - 0,61) и древесины пихты (Abies sibirica Ledeb, динамическая вязкость 1,65 сПа, степень замещения по сере 1,65) - в лаборатории каталитической химии угля и биомассы Института химии и химической технологии СО РАН, Красноярск (Левданский и соавт. 2009); сульфаты целлюлозы, выделенной из хлопка рода Gossypium (ММ 30000-60000 Д, степень замещения по сере 0,8-2,5) - в Институте химии Коми научного центра УрО РАН, Сыктывкар (Торлопов и др. 2007); синтез аптамера RA36 и определение молекулярной массы проводили в ООО АПТО-ФАРМ на колонках на основе CPG {BioAutomation, 5'-DMT-dG(dmf) Мег Made columns, MM1-1200F-1, 1 цшо1, Lot.No: 025295-10}.

Влияние исследуемых образцов in vitro на свертывание крови/плазмы человека, кроликов, крыс оценено с применением общепринятых тестов с использованием

программируемых оптико-механических коагулометров Минилаб 701М: время свертывания крови, время рекальцификации, РеаКлот-гепарин (аналог Heptest), тромбииовое время (ТВ), эхитоксовый тест (ЭХВ, аналог экаринового времени), анцистроновый тест (АВ, аналог рептилазного или батроксобинового времени).

Специфические АК активности образцов in vitro определены по ингибированию фибриногенсвертывающей и амидолитической активностей тромбина (антитромбиновая, анти-фактор lia, alla активность) и фактора Ха (активность против фактора Ха, антифактор Ха, аХа активность) в некоторых случаях с применением плазмы человека или экспериментальных животных с использованием Международных стандартов нефракционированного гепарина, основываясь на рекомендациях Российской Фармакопейной статьи и Европейской Фармакопейной статьи (Государственная Фармакопея СССР 1978, European Pharmacopoeia, 6th edition 2009). Измерения проведены на спектрофотометре прн длине волны 405 нм и оптико-механическом коагулометре Минилаб 701-М. Для оценки АК потенциала полученных соединений графически определяли эффективные концентрации 2ВСК, 2ВР, 2ТВ, 2РеаКлот, 2ЭХВ, 2АВ. Эти концентрации являются абсциссами точек, расположенных на кривых зависимости концентрация-эффект (время свертывания); ординаты точек - 2 х (время свертывания в контроле, то есть без добавления антикоагулянтов).

Анализ областей преципитации сульфатов целлюлозы, выделенной из древесины осины, с поликатионом сульфатом протамина выполняли с помощью ракетного биоспецифичного электрофореза в слое 1% агарозы (Drozd N. N. Et al. 2001). Нейтрализацию антикоагулянтной активности in vitro исследуемых образцов сульфатированных полисахаридов с помощью сульфата протамина (СПТ) исследовали в тесте тромбинового времени (Teien et al 1975).

Исследование агрегации тромбоцитов in vitro проводено по методу Борна (Вот

1962).

Экспериментальные исследования АК активности образцов in vivo выполнены на 80 кроликах Шиншилла обоего пола массой 2,3-5,5 кг и на 42 крысах-самцах Wistar массой 240-370 г, полученных из питомника РАМН "Столбовая". Фармакологическая активность исследуемых образцов определена при внутривенном или подкожном введении кроликам. Исследование антитромботической (АТБ) активности проведено на модели венозного стаза у крыс по методу S. Wessler н соавт. (1959). Геморрагическая активность образцов СЦ пихты определена на 55 крысах-самках линии Wistar весом 160210 г (Чевари С. И. 1985).

Результаты исследования представлены как средние арифметические ± ошибки средних арифметических. Статистическая обработка данных выполнена с использованием непараметрического критерия Колмогорова-Смирнова, корреляционного анализа и программ Вюз1аг, 51а^арЬ1сзР1и5.

Результаты диссертациоиного исследования.

Ингибирование амндолитической активности тромбина и фактора Xa in vitro еульфатированной целлюлозой, выделенной из древесины осины (Pópulus trémula)

Исследованные соединения ингибировали амидолитическую активность тромбина в диапазоне конечных концентраций 0,45-36,4 мкг/мл, как в присутствии, так и в отсутствие АТ, но в концентрациях меньше в 1,5-2 раза. В отсутствие АТ для достижения концентрации АК, при которой скорость гидролиза хромогенного субстрата снижалась в 2 раза ([1/2 AWmhh]), исследованных СЦ требовалось в сотни раз меньше, чем НФГ, у которого данная концентрация была больше 100 мкг/мл, тогда как в присутствии АТ - в 4 - 5 раз больше. Исследованные СЦ и НФГ в диапазоне конечных концентраций 3,32-33,2 мкг/мл не снижали амидолитическую активность фХа в отсутствие АТ. При добавлении АТ исследованные СЦ снижали амидолитическую активность фХа, но в 5-7 раз хуже, чем НФГ, для которого концентрация [1/2 А405/МИН] составила 0,06±0,0] мкг/мл. Во всех тестах наименее активным был СЦ 61 с ММ=14 кД и содержанием серы 8,1%, его требовалось в 85-200 раз больше, чем других АК для достижения того же эффекта. Наибольшие антитромбиновые активности СЦ составили 42,7±4,2 — 53,2±4,9 ЕД/мг, для образца 61 - всего 10,25±0,05 ЕД/мг, аХа активность достигла 8,8±0,6 - 11,8±0,3 ЕД/мг (рис. 1).

ra S

15

160 140 120 100 80 60 40 20 о

о alia

■ аХа

Г"

-Í1 гЗг -г- dn i

Л ■ .171_____ ■................ iL ■

59

60

61

62 63

шифр соединения СЦ

64

СЦ-469

ПХ

Рис. 1. Антикоагулянтная активность сульфатов целлюлозы, выделенной из древесины осины, пихты или хлопка.

Влияние сульфатов целлюлозы, выделенной из древесины осины Pópuhis trémula, на время свертывания плазмы человека в тестах ЛЧТВ, РеаКлот-гепарин, тромбиновое время, протромбиновое время, эхитоксовое время (ЭХВ), анцистронове время (АВ)

Исследованные образцы СЦ, выделенной из древесины осины Pápulas trémula, с различной молекулярной массой ММ=12-19 кД и степенью замещения серой C3s=0,55 — 0,61 удлиняли время свертывания плазмы человека in vitro в стандартных коагулошческих тестах АЧТВ, РеаКлот-гепарин, ПВ, ТВ, ЭХВ, АВ, причем с увеличением концентрации АК время появления фибринового сгустка тоже возрастало. По данным тестов, СЦ из древесины осины не существенно различались по своим антикоагулянтным свойствам, при этом образец 61, как и прежде, оказался наименее активным. В тестах ПВ и ТВ для достижения одинакового эффекта наиболее активных СЦ требовалось в 4,5 — 6,5 раз больше, чем НФГ, что можно объяснить невысокой степенью сульфатирования данных соединений. Кроме этого, эффективные концентрации наиболее активных СЦ выше в 4-5 раз, чем в тесте ТВ. В тесте АЧТВ наиболее активные соединения показали антитромбиновую активность в 3,8 - 4,5 раз меньше, чем у НФГ, а образца 61 требовалось в 17 раз больше для достижения эффекта, сравнимого с таковым НФГ. Ингибиторная активность по отношению к фактору Ха наилучших СЦ в 20-25 раз меньше, чем у НФГ; а у образца 61 меньше, чем у НФГ в 100 раз. Принимая во внимание тот факт, что активность против фХа в 4,6-6,0 раз ниже, чем alla, тогда как для НФГ величина активности аХа равна alla, можно предположить, что механизм ингибирования факторов свертывания плазмы исследованными СЦ отличался от АК механизма действия НФГ. Достоверной связи антитромбиновой или анти-фактор Ха активностей с ММ или количеством серы не обнаружено. Результаты определений АК потенциала НФГ при оценке alla/aXa активностей с использованием теста АЧТВ / РеаЮют-гепарин коррелировали с определениями активностей по непрямому ингибнрованию гидролиза тромбином или фХа хромогенных субстратов.

НФГ (международный стандарт) в диапазоне конечных концентраций 0,052 - 104,4 мкг/мл практически не влиял на свертывание плазмы человека в тестах ЭХВ и АВ. В отличие от НФГ, в диапазоне конечных концентраций СЦ из древесины осины 3,64 -363,64 мкг/мл время свертывания плазмы человека в тестах АВ с активацией коагулазой из яда щитомордника обыкновенного и ЭХВ в присутсвии коагулазы яда эфы увеличивалось. В данных тестах для достижения одинакового эффекта наименее активного образца 61 (содержание серы 8,1%, ММ 14000 Д) требовалось в 13-15 раз

больше, чем других СЦ; эффективные концентрации, при которых время свертывания плазмы удлинялось в два раза, образцов 62, 63, 64 в тесте АВ достоверно не различались. Кроме этого, 2АВ концентрации наиболее активных СЦ выше в 2,5-4 раза, чем 2ЭХВ концентрации, а для образца 61 - в 12 раз. Удлинение свертывания плазмы исследуемыми образцами в тесте АВ может свидетельствовать о влиянии либо на активность протеазы яда щитомордника обыкновенного, либо на полимеризацию фибриногена. Возможно, изучаемые СЦ увеличивали время свертывания плазмы в тесте ЭХВ за счет связывания с субстрат связывающим экзосайтом I, как и в случае с гирудином, или из-за влияния самих соединений на коагулазу эхитокс.

Электрофорез сульфатов целлюлозы в геле агарозы с сульфатом протамина Посредством биоспецифичного электрофореза в слое агарозы была исследована возможность образования комплексов между сульфатами целлюлозы из древесины осины (Pópuhts trémula) с поликатионом протамина сульфатом (СПТ). В результате электрофореза наблюдали пики преципитации комплексов полианион-поликатион в виде «ракеток» (рис. 2). При анализе подвижности в электрическом поле подобных комплексов между СЦ и СПТ отмечали увеличение размеров пиков преципитации с увеличением антитромбиновой, анти-фактор Ха активностей и концентрации СЦ, при этом высота пиков преципитации образца 6! с СПТ достоверно наименьшая, как и его антикоагулянтная активность. Площади пиков преципитации при 5 мкг СЦ в лунке геля составили 1553±84 - 1825+221 пкс, а при 10 мкг - 3320±160 - 4248±466 пкс.

я Г • ■ ■ '. . !!. ■ /;' i 1 А .:ч- \ К ■ д 'V- су^огунут Й|§|| л

Рис. 2. Пики преципитации сульфатов целлюлозы с сульфатом протамина. Количество сульфата целлюлозы в лунке: с - 5 мкг; Ь -10 мкг.

Коэффициенты корреляции между высотой и площадью пиков преципитации, с одной стороны, и alla активностью с другой, составили 0,88 - 0,90 (р=0-0,02). Достоверность коэффициентов корреляции возрастала при увеличении количества СЦ до 10 мкг.

Нейтрализация антитромбиновой активности сульфатов целлюлозы из Pópiilus trémula сульфатом протамина в тесте тромбннового времени.

Нейтрализацию сульфатом протамина антитромбиновой активности наиболее и наименее активных СЦ в сравнении с НФГ оценивали с помощью теста ТВ. Среднее гравиметрическое соотношение антидот/антикоагулянт для нейтрализации НФГ составило 1,4, что согласуется с литературными данными (Cumming et al. 1986). СПТ нейтрализовал антитромбиновую активность СЦ, выделенной из древесины Pápulas trémula, с разными структурными параметрами в концентрациях, превышающих в 2-20 раз концентрацию самого сульфатированного полисахарида. Так, для полной нейтрализации АК активности образца 59 СПТ требовалось в 10 раз больше, самого СЦ. Возможно, это связано с низким содержанием серы в образце (8,1%), из-за чего молекула СЦ со сниженным зарядом плохо связывается с СПТ. Такой эффект отмечали для НМГ (Byun et al 1999).

Фармакодинамические параметры сульфатированной целлюлозы, выделенной из растения рода Gossypium, при внутривенном введении кроликам

Для оценки фармакодинамических параметров СЦ, выделенной из хлопка рода Gossypium (СЦ-469; ММ 30-60 кД , C3s=0,8-2,5, alla= 130±12 ЕД/мг, аХа= 45±3,3 ЕД/мг; рис. 1) вводили внутривенно экспериментальным животным, кроликам, в дозах 0,3; 1 и 5 мг/кг. В качестве сравнения использовали введение препарата НФГ с alla=160 Ед/мг в дозе 5 мг/кг. С возрастанием дозы от 0,3 до 5 мг/кг увеличивались время свертывания плазмы в тестах АЧТВ, РеаКлот и антитромбиновая, анти-фактор Ха активности плазмы (рис. 3). Отмечено, что антитромбиновая активность соединения СЦ больше анти-фактор Ха активности в 3 раза, но при введении кроликам наблюдали практически одинаковые антикоагулянтные активности плазмы (2,61±0,57 - 2,85±0,12 alla ЕД/мл и 2,31±0,39 -2,56±0,37 аХа ЕД/мл) через 5-30 мин после введения. Это может свидетельствовать о том, что такое производное целлюлозы способствовало увеличению активности ингибитора пути тканевого фактора, за счет чего аХа активность возрастала, что отмечено у некоторых НМГ (Demîrkan et al 2002, Hoist et al 1997, Ma et al 2007).

Рис. 3. А. Изменение антитромбиновой активности плазмы кроликов в тесте АЧТВ после внутривенного введения СЦ-469 в дозах 0,3, 1и 5 мг/кг; Б. Изменение анти-фактор Ха активности плазмы кроликов в тесте РеаКлот-гепарин после внутривенного введения СЦ-469 в дозах 0,3, 1и5 мг/кг.

100 200 300 400 время после введения, мин

О___ _ _ _

О 100 200 300

время после введения, мин

—О ......А.......СЦ 0,3

СЦ 1

Пик антитромбиновой активности плазмы после введения СЦ в дозе 5 мг/кг продолжался 2 часа после введения, а максимальная величина аХа активности - до 1 часа. И даже через 5 час антитромбиновая активность достигала терапевтической величины. При внутривенном введении нефракционированного гепарина в дозе 5 мг/кг (для сравнения) по влиянию на время свертывания в тесте АЧТВ эффект заканчивался через 3 час, а по РеаКлот- гепарин - через 2 часа, несмотря на то, что сила АК эффекта в первый час после введения была в несколько раз больше, чем при введении СЦ. Таким образом, для СЦ картина выведения антикоагулянта, отличалась от таковой для НФГ, что может свидетельствовать о некоторых различиях в механизме действия этих соединений. С увеличением дозы возрастали период полувыведения и время действия исследуемого соединения.

Аитиагрегациоиная активность сульфатов целлюлозы, выделенной из древесины осины и хлопка

Оценивали влияние наиболее активного (59, ММ=Т8,9 кД и C3s=0,54; alla = 51,21±1,22 ЕД/мг; рис 1) и наименее активного (61, ММ=14,0 кД и C3s=0,55;aIIa = 12,46±1,52 ЕД/мг) образцов СЦ из древесины осины, а таюке СЦ из хлопка (СЦ-469, ММ=30-60 кД и C3s=0,8-2,5, alla= 130±12 ЕД/мг, аХа= 45±3,3 ЕД/мг; рис.1) на скорость и агрегационную активность тромбоцитов человека, индуцированную добавлением АДФ. Образцы полисахаридов в конечных концентрациях 0-0,3 мг/мл (что соответствует концентрации антикоагулянтов в плазме при внутривенном введении экспериментальным животным в дозах 5-10 мг/кг), как и НФГ, при добавлении к богатой тромбоцитами

плазме человека не влияли на агрегацию тромбоцитов человека, вызванную добавлением АДФ, и не индуцировали саму агрегацию пластинок.

Антикоагулянтная активность сульфатированного полисахарида, выделенного из древесины пихты (Abies sibirica Leileb)

Исследована специфическая антикоагулянтная активность образца СЦ, выделенной из древесины пихты Abies sibirica Ledeb, со степенью сульфатирования 1,65 (ПХ). С увеличением концентрации исследованного СЦ увеличивалось время появления сгустка фибрина в тестах АЧТВ и РеаКлот-гепарин. Данное соединение показало антитромбиновую активность 87,37 ЕД/мг, что в 2 раза меньше, чем у НФГ, ингибиторная активность по отношению к фактору Ха была 18,33 ЕД/мг, что в 8 раз меньше, чем у НФГ (рис. 1). Отношение активностей aXa/alla составило 0,2.

Для оценки фармакодннамических параметров СЦ из древесины пихты подкожно вводили кроликам в дозах 5, 20 и 40 мг/кг. В качестве сравнения также был подкожно введен НФГ (alla=160 ЕД/мг) в дозе 5 мг/кг. Исследуемое соединение в дозе 5 мг/кг практическн не влияло ни на время свертывания плазмы, ни на антитромбиновую или анти-фактор Ха активности (рис. 4). При введении 20 мг/кг СЦ время свертывания плазмы кроликов и антитромбиновая активность в тесте АЧТВ увеличивались через сутки (на 1440 минуте) после введения с 29,76±1,75 сек до 76,97 ± 9,26 сек (рис. 4А). Введение 20 мг/кг СП также не оказало влияния на время свертывания плазмы кроликов и анти-фактор Ха активность (рис. 4Б). Через 2 часа после введения СЦ в дозе 40 мг/кг время свертывания достоверно удлинилось с 18,97±1,30 с до 36,61 ±6,44 с. При дозе 40 мг/кг отмечали достоверное увеличение антикоагулянтного эффекта в 2-2,5 раза, в сравнении с контролем, а анти-фактор Ха активность достигала максимального значения 0,552±0,178 сек через 240 минут после введения. Таким образом, при подкожном введении кроликам сульфата целлюлозы, выделенной из пихты, с антитромбиновой активностью 87,37±0,71 ЕД/мг, анти-фактор Ха активностью 18,33±0,24 ЕД/мг с возрастанием дозы от 20 до 40 мг/кг увеличивались время свертывания плазмы в тесте АЧТВ, антитромбиновая активности, и только при дозе 40 мг/кг возрастали время свертывания плазмы в тесте РеаКлот и анти-фактор Ха активность плазмы.

г

ад—I- _ —Щг

Рис. 4. А. Изменение антитромбиновой активности плазмы кроликов в тесте АЧТВ после подкожного введения ПХ в дозах 5, 20 и 40 мг/кг; Б. Изменение анти-фактор Ха активности плазмы кроликов в тесте РеаКлот-гепарин после подкожного введения ПХ в дозах 5, 20 и 40 мг/кг.

Антитромботическая и геморрагическая активности сульфата целлюлозы, выделенной из древесины пихты (Abies sihirica Ledeh)

Исследовали АТБ активность при внутривенном введении крысам в дозах 1-5 да/кг на модели венозного стаза. С увеличением вводимой дозы СЦ АТБ активность образца возрастала, что отражено в уменьшении формы, веса, размеров тромбов и концентрации белка в гомогенатах тромбов. С возрастанием дозы СЦ удлинялось время свертывания плазмы крыс в тестах АЧТВ и РеаКлот-гепарин. Антитромбиновая активность плазмы достоверно увеличивалась с 0,25±0,02 ЕД/мл при введении I мг/кг сульфата целлюлозы до 2,67±0,34 ЕД/мл, что сопоставимо с alla активностью при введении 2 мг/кг НФГ (3,11± 0,67 ЕД/мл). Анти-фактор Ха активность плазмы также возрастала с 0,153±0,04 до 1,89±0,22 ЕД/мл, при этом равное значение с 2 мг/кг НФГ было достигнуто при введении 4 мг/кг СЦ (0,448±0,073 ЕД/мл).

С увеличением дозы сульфата целлюлозы из древесины пихты от 50 до 200 ЕД/кг и НФГ отмечали увеличение геморрагической активности. Однако, при вводимых дозах антикоагулянта наблюдали достоверно меньшие значения геморрагической активности СЦ в 3,5-4 раза в сравнении с НФГ.

Ингибирование амидолитической активиости тромбина in vitro ДНК-аптамером и рекомбинантным гирудином

Исследовано ингибирование амидолитической активности тромбина при добавлении аптамера в плазму человека, крыс и кроликов в сравнении с

рекомбинантным-гирудином (р-гирудин) и нефракционированным гепарином. Влияние аптамера ПАЗ6 и р-гирудина, добавленных в Трис-буфер (рН 7,4) или в плазму (человека, кроликов, крыс), определяли, анализируя изменение оптической плотности раствора инкубационной смеси при длине волны 405 нм за минуту (Аздз/мин). Р-гирудин снижал А405/МИН как в постановке с буфером, так и при постановке реакции с плазмой человека, кроликов или крыс. При добавлении аптамера ЯАЗб к буферу или плазме человека, кроликов, крыс в диапазоне концентраций 0,5 - 500 мкг/мл амидолитическая активность тромбина по отношению к специфическому хромогенному субстрату не менялась, то есть ДНК-аптамер не влиял на амидолитическую активность тромбина.

Влияние на время свертывания крови/ плазмы человека, кроликов, крыс ДНК-аптамера в коагулологических тестах

Увеличение концентрации в крови кроликов аптамера ЯА36, р-гирудина, НФГ приводило к удлинению времени появления фибринового сгустка в тесте ВСК. Для одинакового эффекта ЛАЗ 6 требовалось достоверно в 20 и 67 раз больше, чем р-гирудина и НФГ (рис. 5Б). При добавлении аптамера ЛАЗ6 и препаратов сравнения возрастало время свертывания плазмы человека, кроликов, крыс в тестах ВР с увеличением концентрации соединения (рис. 5). При активации свертывания хлоридом кальция, для достижения одинакового эффекта (время свертывания увеличивается в два раза) аптамера требовалось в 1,7 раз больше в определениях с плазмой человека, чем в определениях с плазмой крыс и в 3 раза меньше, чем в определениях с плазмой кроликов, в 55-72 раза больше, чем р-гирудина, и в 4-32 раза больше, чем НФГ.

ДНК-аптамер ЯА36 удлинял время свертывания в тесте РеаКлот-гепарин в плазме человека и крыс, но для достижения эффективной концентрации его требовалось в 25 и 8 раз больше, чем р-гирудина и НФГ, соответственно, тогда как в плазме крыс необходимо было 23,92±2,90 мкг/мл ЯА36, 0,32±0,07 мкг/мл - р-гирудина и 1,20±0,45 мкг/мл НФГ. Различия между концентрацией 2РеаКлотядзб с 2РеаКлот,,-г и 2РеаКлот цфг достоверны. Влияния аптамера ЯАЗб на время свертывания плазмы кроликов в тестах РеаКлот-гепарин не обнаружено. Концентрация 2РеаКлот-ГепаринцАз6 в 2 раза больше в определениях с плазмой крыс, чем в определениях с плазмой человека.

2

1 1,5 я

(3

£ 1 й) '—' =г ^ I (55

0 ^

1 ь

а —

¡■0,5

О)

« -1

-1,5

О аптамер п!А36 Д

В НФГ ■ р-гирудин гТ-

гЗЕ-

■

и ■

_?я 7Р.Р УРояНпт

2,5

1,5=

х к £ та .5.

2,5

□ аптамер В Д.'¿6

инфг

|р-гирудин

2тв

2эхв

2ВР 2РеаКлот

Рис. 5. Эффективные концентрации аптамера ЯА36, НФГ и р-гирудина в коагулологических тестах : А. в плазме человека, Б. в крови/плазме кроликов, В. в плазме крыс; где 2ТВ, 2ЭХВ, 2ВР, 2РеаКлот, 2ВСК - концентрации, при которых время свертывания крови или плазмы увеличивается в 2 раза, в сравнении с контролем, в тестах тромбиновое время, эхитоксовое время, время рекальцификации, РеаКлот-гепарин, время свертывания крови, соответственно. Ось X - название эффективной концентрации; ось У -значение эффективной концентрации Щмкг/мл].

Для увеличения времени появления фибринового сгустка в плазме человека в тесте ТВ в 2 раза, в сравнении с контролем, ЯАЗб было необходимо достоверно в 18 раз больше, чем р-гирудина; концентрации 2ТВказ6 и 2ТВ Нфг соспотавимы и составили около 2,5 мкг/мл (рис. 5А). В диапазоне концентраций 1,63-222,3 мкг/мл ЯА36 удлинял время свертывания плазмы кроликов в ТВ с увеличением концентрации, так же как и препараты сравнения. Концентрации 2ТВ ЯАЗб, р-гирудина и НФГ достоверно отличались и составили 5,25±0,88, 1,00±0,21 и 1,6(±0,23 мкг/мл, соответственно. Для увеличения времени свертывания плазмы крыс в тесте ТВ в 2 раза, в сравнении с контролем (15,6±0,42 сек), 11А36 требовалось в 9 - 10 раз больше, чем р-гирудина и НФГ; концентрации 2ТВ ЯАЗб, р-гирудина и НФГ составили 8,13±0,06, 0,83±0,034 и 0,93±0,05

мкг/мл, соответственно. Концентрация 2ТВ ra зб в определениях с плазмой человека, была в 2-3 раза меньше, чем в определениях с плазмой кроликов и крыс.

С увеличением концентрации RA36 в плазме человека и крыс время появления фибринового сгустка, инициированного добавлением эхитокса - коагулазы из яда эфы многочешуйчатой, возрастало. В диапазоне концентраций 5 - 100 мкг/мл НФГ практически не влиял на время свертывания плазмы человека в тесте ЭХВ. Аптамера для равного эффекта потребовалось в 3 раза больше, чем р-гирудина. Влияния аптамера RA36 в диапазоне концентраций 2,5 - 100 мкг/мл на время свертывания плазмы кроликов в ЭХВ не обнаружено (рис. 5).

Эффективные концентрации аптамера в тесте ЭХВ на плазме крыс были достоверно больше в 58 и 4 раза, по сравнению с р-гирудином и НФГ, соответственно, что свидетельствует о меньшем влиянии RA36 на свертывание плазмы, вызванное активацией протромбина до мейзотромбина.

Влияние аптамера RA36 на скорость и агрегациоииую способность тромбоцитов человека

Образцы аптамера в диапазоне концентраций в плазме 0,133 - 12,711 мкг/мл, р-гирудина с концентрациями 0,111 - 0,464 мкг/мл и НФГ в диапазоне концентраций в плазме 0,111-7,737 мкг/мл не оказывали влияния на агрегацию тромбоцитов, вызванную добавлением АДФ, и на скорость агрегации кровяных пластин. Исследуемые образцы не вызывали агрегацию тромбоцитов в отсутствие аденозиндифосфорной кислоты.

Таким образом, сульфаты целлюлозы, полученной из древесины осины (Pópulus trémula), с ММ от 12,7 до 18,9 кД и содержанием серы 8-8,7% проявляют свойства антикоагулянтов прямого действия (45,6-53,8 alla ЕД/мг), также как и сульфат целлюлозы из древесины пихты (Abies sibirica Ledetí) со степенью сулъфатирования 1,65 (87,37 alla ЕД/мг). Ингибнторная активность исследованных СЦ по отношению к тромбину в среднем выше в 5 раз, чем по отношению к активированному фактору X. Ингибирование СЦ из древесины осины свертывания плазмы человека, активированного коагулазой яда эфы многочашуйчатой (Echis multisquamahis) - эхитокс, говорит о возможном связывании образцов СЦ с экзосайтом-I тромбина или об их влиянии на саму коагулазу. Размеры пиков преципитации сульфатов целлюлозы, выделенной из древесины Pópulus trémula, с сульфатом протамина в геле агарозы при электрофорезе значительно положительно коррелируют с alla и аХа активностями СЦ, что можно использовать для первичного анализа АК активности СЦ. Специфическую антикоагулянтную активность образцов сульфатов целлюлозы из древесины осины можно успешно нейтрализовать с помощью

сульфата протамина. Образцы СЦ, выделенной из древесины осины или хлопка, в конечных концентрациях 0 - 0,3 мг/мл не влияли самостоятельно на агрегационные характеристики тромбоцитов человека и при индукции агрегации АДФ.

Внутривенное введение кроликам образцов сульфата целлюлозы из растения рода Gossypium (хлопок) с ММ 30-6 0 кД и C3s=08,-2,5, также как и подкожное введение СЦ, выделенной из Abies sibirica Ledeb (пихта), со степенью сульфатирования 1,65, приводило к увеличению АК активности плазмы с возрастанием дозы. Внутривенное введение СЦ из пихты крысам в дозах 1-5 мг/кг приводило к увеличению АТБ активности на модели венозного стаза.

Синтезированный аптамер RA36 с молекулярной массой 10000 Д является антикоагулянтом прямого действия, удлиняя время свертывания плазмы человека, кроликов и крыс в коагулологических тестах. Механизм действия не связан с ингибированием каталитического сайта тромбина, так как не ингибирует амидолитическую активность фермента как в буферном растворе, так и в плазме человека, кроликов и крыс. Антикоагулянтная активность RA36 по тесту тромбинового времени (с плазмой человека) соизмерима с таковой для НФГ, но меньше, чем у рекомбинантного гирудина; в тестах ВСК, РеаКлот-Гепарин и BP сила эффекта аптамера меньше, чем у НФГ и рекомбинантного гирудина. Вероятно, при ингибировании свертывания плазмы человека, активированного коагулазой яда эфы многочашуйчатой (Echis rmdtisquamatus) -эхитокс, аптамер связывается с экзосайтом-I тромбина; чувствительность плазмы человека к аптамеру в 5 раз больше, чем чувствительность плазмы крыс. Для предполагаемого последующего анализа влияния внутривенного введения аптамера на плазму следует выбрать крыс, так как, плазма кроликов оказалась не чувствительна к аптамеру в тесте ЭХВ. Диапазон доз RA36, рассчитанных с учетом чувствительности тестов ТВ и ЭХВ, с использованием формулы: [(эффективная концентрация RA36 / эффективная концентрация р-гирудина) ■ 0,4 мг/кг], где 0,4 мг/кг - применяемая при внутривенном болюсном введении доза р-гирудина, для человека и крыс может составить 4-11 мг/кг. Аптамер RA36 самостоятельно не влияет на агрегацию тромбоцитов человека и не увеличивает агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ.

Выводы

1. Сульфаты целлюлозы, выделенной из древесины осины (Pápulas trémula),

являются антикоагулянтами прямого типа действия, ингибируют посредством антнтромбина амидолитическую активность тромбина и удлиняют время свертывания плазмы человека в коагулологических тестах in vitro.

2. Сульфаты целлюлозы, выделенной из древесины осины (Póputus trémula), образуют комплексы с сульфатом протамина; размеры пиков преципитации прямо пропорционально зависят от количества сульфата целлюлозы. Весовое соотношение сульфат целлюлозы / сульфат протамина для полной нейтрализации АК активности составляет 1/(2-20).

3. При внутривенном введении кроликам сульфата целлюлозы, выделенной из хлопка (Gossypium), с увеличением дозы от 0,3 до 5 мг/кг увеличивается антикоагулянтная активность плазмы.

4. Антикоагулянтная активность плазмы кроликов возрастает при подкожном введении сульфата целлюлозы, выделенной из древесины пихты (Abies sibirica Ledeb) в дозах от 20 до 40 мг/кг; с увеличением дозы сульфата целлюлозы увеличивается антнтромботическая активность при внутривенном введении крысам, а геморрагическая активность меньше, чем у гепарина.

5. Аптамер RA36 не ингибирует амидолитическую активность тромбина, что может свидетельствовать об отсутствии связи с каталитическим центром фермента, при этом по тесту тромбинового времени (с плазмой человека) данное соединение является антикоагулянтом прямого действия, с силой эффекта соизмеримой с действием нефракционированного гепарина, но меньшей, чем у рекомбинантного гирудина. В коагулологнческих тестах время свертывания крови, время рекальцификации, тромбиновое время, РеаКлот-Гепарин, эхитоксовый тест аптамер RA36 удлиняет время свертывания плазмы человека и крыс.

6. В диапазоне конечных концентраций до 0,3 мг/мл сульфаты целлюлозы, выделенной из древесины осины (Pópulus trémula) или хлопка {Gossypium), и аптамер RA36 не влияют на АДФ - индуцированную агрегацию тромбоцитов человека и ее скорость, также данные соединения самостоятельно не вызывают агрегирование кровяных пластинок человека.

Практические рекомендации

1. В качестве антидота для нейтрализации актикоагулянтного эффекта сульфата целлюлозы, полученной из древесины осины (Pópulus trémula) (MM 12,7-18,9 кД; содержание серы 8,0-8,7%) рекомендуем использовать поликатион сульфат протамина в гравиметрическом отношении антидот/антикоагулянт 1 к 20. Образцы сульфатов целлюлозы, выделенной из хлопка (Gossypium, ММ 30-60 кД , C3s=0,8-2,5) или древесины пихты (Abies sibirica Ledeb, динамическая вязкость 1,65 сПа, C3s=l,65), рекомендуем для дальнейших исследований их фармакологической и токсикологической активности.

2. Предполагаем использовать антикоагулянт прямого действия синтетический аптамер RA36 с молекулярной массой 10000 Д для проведения дальнейших фармакологических испытаний при внутривенном введении экспериментальным животным в диапазоне доз 4-11 мг/кг.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Савчик, Е. Выявление антикоагулянтной активности у соединений на основе сульфатированной целлюлозы и исследование ее связи с подвижностью их комплексов с сульфатом протамина в электрическом поле / Е. Савчик // XVII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов. Секция «Биология». - М., 2010. - С. 62.

2. Савчик, Е.Ю. Влияние сульфатов целлюлозы на активность некоторых факторов свертывания крови / Е.Ю. Савчик, Т.Б. Калинина, H.H. Дрозд, С.А. Кузнецова, A.B. Левданский, В.А. Макаров // 5-я Международная конференция «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам». - М., 2010. - С. 76.

3. Савчик, Е.Ю. Оценка антикоагулянтной активности соединений на основе сульфатированной целлюлозы / Е.Ю. Савчик, H.H. Дрозд, С.А. Кузнецова, В.А. Макаров, A.B. Левданский // Научно-практический журнал «Вестник гематологии». -2010.-Т. VI, №3.-С. 53.

4. Савчик, Е.Ю. Влияние соединений на основе сульфатированной целлюлозы на активность факторов свертывания - тромбина и активированного десятого фактора / Е.Ю. Савчик // Ш Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010». - Нижний Новгород, 2010. - С. 186.

5. Савчик, Е.Ю., Влияние соединений на основе сульфатированной целлюлозы на агрегацию тромбоцитов человека / Е.Ю. Савчик, H.H. Дрозд, С.А. Кузнецова, В.А.Макаров, A.B. Левданский // Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению». - М., 2010. - С. 78.

6. Гурвиц, И.Д., Фибринолитическая активность in vivo сульфатированной целлюлозы, выделенной из Gossypium Herbaceum / И.Д. Гурвиц, Е.Ю. Савчик, Т.Б. Калинина, H.H. Дрозд, М.А. Торлопов, В.А. Макаров, А.Л. Берковский // Пятая всероссийская конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием). - М., 2011. - С. 154-155.

7. Савчик, Е.Ю. Нейтрализация антитромбииовой активности сульфатов целлюлозы, выделенной из древесины Pópulus trémula, сульфатом протамина в тесте тромбинового времени / Е.Ю. Савчнк, Н.Н. Дрозд, С.А. Кузнецова, В.А. Макаров, А.В. Левданский // Пятая всероссийская конференция «Клиническая гемостазиология н гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием). - М., 2011. - С. 442-443.

8. Дрозд, Н.Н. Противотромботическая и геморрагическая активности фукоидана, выделенного из бурой водоросли Fucus evanescens / Н.Н. Дрозд, Н.Т. Мифтахова, Е.Ю. Савчик, Т.Е. Калинина, В.А. Макаров, Т.Н. Имбс, Т.Н. Звягинцева, С.А. Кузнецова, Н.Н. Беседнова // Экспериментальная и клиническая фармакология. — 2011. — Т.74, № 5. - С. 26-30.

9. Drozd, N.N. Chitosan neutralize amydolytic activity of sulphate polysaccharides / N.N. Drozd, V.A. Makarov, A.S. Tolstenkov, E.Iu. Savchik, G.E. Bannikova, A.V. Il'ina, A.N. Levov, V.P. Varlamov, G.A. Vikhoreva / The 10th international conference of the European chitin Society, St.-Petersburg, 2011. // Advances in chitin science. - 2011. - Vol. 11. - P. 7681.

10. Savchik, E. Inhibition of fibrin clot formation with sulfated cellulose from Pópulus trémula wood / E. Savchik, N. Drozd, S. Kuznetsova, V. Makarov, V. Levdanskiy, B. Kusnetsov / 36th FEBS Congress "Biochemistry for tomorrow's medicine", Turin, 2011. // The FEBS journal. - 2011. - Vol. 278. - Suppl. 1. - P.478.

11. Savchik, E.Y. Influence of protamine sulfate on antithrombin activity of sulfated cellulose from Pópulus trémula wood / E.Y. Savchik, N.N. Drozd, S.A. Kuznetsova, V.A. Makarov, V.A. Levdanskiy, B. Kuznetsov / XXIII Congress of the international Society on Thrombosis and Haemostasis, Kyoto, 2011. // Journal of thrombosis and haemostasis. - 2011. - Vol. 9. - Suppl. 2. - P. 363-364.

12. Савчик, Е.Ю. Влияние сульфата целлюлозы на индукцию гидролиза хромогенного субстрата на плазмин и антикоагулянтную активность в плазме кроликов / Е. Ю. Савчик, Т.Е. Калинина, И.Д. Гурвиц, М.А. Торлопов, Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров, А.В. Кучин // Химико-фармацевтический журнал. - 2012. - Т. 46. - №2. - С. 26-31.

13. Савчик, ЕЛО. Анализ антикоагулянтной активности ДНК аптамера RA36 с использованием плазмы человека, кроликов, крыс / Е.Ю. Савчик, Т.Б. Калинина, Н.Н. Дрозд, Н.Т. Мифтахова, В.А. Макаров, Е.Г. Завьялова, Е.Н. Лаптева, А.В. Бабий, Н.Н. Мудрик, Г.В. Павлова, А.В. Головин, A.M. Копылов/ Конгресс гематологов России, Москва, 2012. // Гематология и трансфузиология. - 2012. - Т. 57. - № 3. - С. 135-136.

14. Савчнк, Е.Ю. Сравнительный анализ антикоагулянтной активности in vitro ДНК аптамера RA 36, добавленного в плазму человека, кроликов и крыс / Е.Ю. Савчик, Т.Е. Калинина, H.H. Дрозд, В.А. Макаров, Е.Г. Завьялова, E.H. Лаптева, A.B. Бабий, H.H. Мудрик, Г.В. Павлова, A.B. Головин, A.M. Копылов // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2012. - Т. 75. — №11. -С. 13-18.

15. Савчик, Е.Ю. Влияние антикоагулянтной активности сульфатов целлюлозы, выделенной из древесины Pópuíus trémula, на подвижность в электрическом поле преципитатов с сульфатом протамина / Е.Ю. Савчик, H.H. Дрозд, С.А. Кузнецова, В.А. Макаров, A.B. Левданский // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2012. -№12 - С. 46-54.

Список сокращений AB - анцистроновое время АК - антикоагулянтная активность AT - антитромбин

АТБ — антитромботическая активность

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время

ВСК - время свертывания крови

BP — время рекальцификации

ММ — молекулярная масса

НМГ - низкомолекулярный гепарин

НФГ - нефракционированный гепарин

ПВ — протромбиновое время

СП - сульфатированные полисахариды

СЦ - сульфат целлюлозы

ТВ — тромбиновое время

ф11а — тромбин, фактор На

ЭХВ - эхитоксовый тест

Подписано в печать 14.02.2013 года Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии «Сору General» 101000 Москва, Б. Златоустинский пер. 7/1 Тел.: +7 495 775 08 44/43 www.copygeneral.ru