Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Антикоагулянтная активность сульфатов пектина, инулина и целлюлозы

На правах рукописи

Кужим Анастасии Александровна

Антикоагулянтная активность сульфатов пектина, инулина и целлюлозы

14.03.06- фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 2 АПР 2015

Москва - 2015

005567614

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ ГНЦ Минздрава России)

Научный руководитель:

доктор биологических наук ,

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

руководитель клинико-диагностического отдела

ФГБУ «Институт хирургии им. A.B. Вишневского»

Дрозд Наталья Николаевна

Минздрава России

Демидова Валентина Семеновна

доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией защитных систем крови имени Б.А. Кудряшова кафедры физиологии человека и животных биологического факультета ФГБОУ

МГУ им. М.В. Ломоносова Ляпина Людмила Анисимовна

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Минздрава России

Защита диссертации состоится «_»_2015 года в_на заседании

диссертационного совета Д 001.024.01 , созданного на базе ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ученой части ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8 и на сайте www.academpharm.ru

Д.8.

Автореферат разослан «_»

2015 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Вальдман Елена Артуровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Для профилактики и лечения тромбозов у людей применяют, в том числе, и антикоагулянты (АК) [Geerts W., 2008; Ageno W., 2014]. Различают АК непрямого и прямого типа действия [Molteni М., 2014; Vo Т., 2014]. АК непрямого действия (производные кумарина и индандиона - варфарин, аценокумарол, фенилин [Pomin V.H., 2014]) блокируют витамин-К зависимый синтез биологически активных форм кальций-зависимых факторов свертывания крови II, VII, IX, и X [Kreuziger L., 2013]. Механизм действия АК прямого действия связан либо с непосредственным ингибированием активности тромбина или фактора Ха, либо с активацией их плазменного ингибитора антитромбина [Choay J., 1983; Vo Т., 2014].

Используемые в настоящее время АК средства не удовлетворяют полностью потребности практической медицины. При несомненной эффективности у непрямых АК и у препаратов гепарина есть ограничения. Один из самых распространенных побочных эффектов всех современных АК — кровотечение [Levi М., 2010; Tosetto А., 2013; James Р., 2012; Liotta Е., 2012]. Наряду с препаратами гепаринов и АК непрямого действия, кровотечения провоцируют и современные ингибиторы тромбина / фактора Ха для перорального и парентерального применения [Ganetsky V., 2014; Limdi MA., 2013; Roskell N.. 2013; Scaglione F., 2013]. Поэтому актуальны разработки новых АК соединений с разной химической структурой и меньшей геморрагической активностью.

Интерес к биодеградируемым полимерам из природных источников сырья связан с их биосовместимостью, химическим разнообразием, возобновляемым ресурсом, низкой токсичностью и низким риском патогенности для людей [Silva ТН., 2012], что позволяет рассматривать, например, полисахариды, выделяемые из микроорганизмов, водорослей, грибов, наземных растений и животных как перспективные соединения для разработки лекарственных средств. Так, антикоа-гулянтная и антитромботическая активности природных и химически обработанных полисахаридов растительного происхождения (фукоиданы, каррагенаны, ульваны, альгинаты, маннаны, галактаны, галактоманнаны, пектины, крахмал,

целлюлоза) зависят от физико-химических свойств, электрического заряда молекул, средней молекулярной массы, внутренней вязкости, числа и качества замещенных групп [Almedia-Lima J., et al 2013; Andrade G.P et al 2013 ; Bijak M., 2014; Cipriani, T.R., 2009; Cai W., 2013; Camara R.B.G., 2011; Colliec-Jouault S., 2012; Fan L., 2012; Heniy BL., 2009; Lu X., 2012; Luo L., 2013; Maas N.C., 2012; McMillan E., 2011; Morya V.K., 2012; Naqash S.Y., 2011; Pawlaczyk I., 2011; Ye L., 2012]. Высока вероятность получения новых, более доступных, экономически выгодных АК с меньшим риском геморрагических осложнений в этом ряду соединений по сравнению с НФГ.

Несмотря на огромный потенциал сульфатированных полисахаридов из морских растений и организмов, их техническое и фармацевтическое использование ограничивается высокой сложностью молекул [Chawla L., 2004]. Поэтому разработка новых АК на основе сульфатов полисахаридов из травянистых и древовидных сухопутных растений с линейной структурой представляется наиболее перспективной [Во S., 2013; Cai W., 2013; Cipriani, T.R., 2009; Fan L., 2012; Jindal M., 2013; Lu X., 2012; Maas N.C., 2012; McMillan E., 2011; Naqash S.Y., 2011; Pawlaczyk I., 2012, 2013].

По сравнению с нефракционированным гепарином, АК на основе природных веществ, выделенных из растений, могут иметь следующие преимущества и особенности: практически неограниченная сырьевая база; источники не содержат опасного для человека вирусного материала и прионов, которые могут сопровождать полисахариды, выделяемые из тканей млекопитающих; в несколько раз меньшая, в отличие от НФГ, активность против фактора Ха. И все это на фоне наличия, на рынке нашей страны, субстанций НФГ производства только фирм Китая и Германии.

Цель работы: Исследование влияния in vitro сульфатов целлюлозы, выделенной из растения рода Gossypium, сульфатов инулина, выделенного из Helianthus tuberosus, сульфатов пектина, выделенного из Siberian abies, на некоторые составляющие плазменного, клеточного гемостаза человека и анализ антикоагулянтной

активности наиболее перспективного соединения при введении экспериментальным животным.

Задачи исследования:

1. Оценить влияние сульфатов целлюлозы, выделенной из Gossypium hirsutum L. (хлопок, молекулярная масса 22 - 50 кДа, степень сульфатирования 0,8 - 2,4), сульфатов инулина, выделенного из Helianthus tuberosus (топинамбур, молекулярная масса 8 кДа, степень сульфатирования 0,6 - 1,6), сульфатов пектина, выделенного из Abies sibirica ¿.(пихта сибирская, молекулярная масса 24 кДа, степень сульфатирования 0,8 - 1,1), на время свертывания плазмы человека в тестах активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), тромби-нового времени (ТВ), протромбинового времени (ПВ) и в тесте РеаКпот-Гепарин.

2. Исследовать влияние сульфатов целлюлозы, сульфатов инулина и сульфатов пектина на активность тромбина и фактора Ха по отношению к специфическим хромогенным субстратам в присутствии антитромбина и без антитромбина.

3. Оценить влияние сульфатов целлюлозы, сульфатов инулина и сульфатов пектина на время свертывания плазмы человека в тесте при активации свертывания плазмы коагулазой из змеиного яда щитомордника обыкновенного.

4. Проанализировать влияние сульфатов целлюлозы, сульфатов пектина, сульфатов инулина на агрегацию тромбоцитов человека без добавления индуктора и при добавлении аденозиндифосфорной кислоты.

5. Исследовать подвижность преципитатов сульфата протамина с сульфатами исследуемых полисахаридов при электрофорезе и оценить нейтрализацию in vitro сульфатом протамина антикоагулянтной активности сульфатов целлюлозы.

6. Оценить антикоагулянтную активность плазмы кроликов после внутривенного введения сульфата целлюлозы хлопка (молекулярная масса <50 кДа; степень сульфатирования 2,4) и возможность использования сульфата протамина в качестве антидота для нейтрализации антикоагулянтной активности плазмы кроликов.

7. Провести анализ антитромботической и геморрагической активностей сульфата целлюлозы хлопка (молекулярная масса <50 кДа; степень сульфатирования 2,4) в сравнении с нефракционированным гепарином.

б

Научная новизна. Впервые исследована in vitro антикоагулянтная активность сульфатов инулина, выделенного из Helianthus tuberosus (молекулярная масса 8 кДа; степень сульфатирования 0,6-1,6) и сульфатов пектина, выделенного из Siberian abies (молекулярная масса 24 кДа, степень сульфатирования 0,8-1,1). Впервые проанализирована связь между степенью сульфатирования (от 0,8 до 1,5) и антикоагулянтной активностью сульфатов целлюлозы хлопка с молекулярной массой 22 кДа. Показано, что in vitro без добавления антитромбина (ингибитора сериновых протеаз свертывающей системы крови) исследуемые полисахариды не влияют на активность тромбина и активированного фактора X (десять). Впервые показано, что образцы сульфатов целлюлозы (молекулярная масса < 50 кДа; степень сульфатирования 0,8-2,4) и образы сульфатов пектина (молекулярная масса 24 кДа; степень сульфатирования 0,8-1,1) не влияют на полимеризацию фибриногена. Показано увеличение антикоагулянтной активности плазмы кроликов с увеличением дозы сульфата целлюлозы хлопка с молекулярной массой < 50 кДа и степенью сульфатирования 2,4 при внутривенном введении. Впервые обнаружена возможность нейтрализации сульфатом протамина антикоагулянтной активности плазмы кроликов, возникающей после внутривенного введения сульфата целлюлозы хлопка с молекулярной массой < 50 кДа (степень сульфатирования 2,4). Впервые исследованы антитромботическая и геморрагическая активности сульфата целлюлозы хлопка с молекулярной массой < 50 кДа (степень сульфатирования 2,4), в сравнении с нефракционированным гепарином.

Научно-практическая значимость работы. Новые знания о связи между молекулярной массой / степенью сульфатирования полисахаридов, выделенных из хлопка, топинамбура, пихты сибирской и их антикоагулянтным эффектом могут быть использованы при разработке соединений с антитромботической активностью на основе растительного сырья.

После завершения необходимых дополнительных испытаний сульфат целлюлозы хлопка с молекулярной массой < 50 кДа и степенью сульфатирования 2,4 будет передан для определения острой и хронической токсичности.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Увеличение в плазме человека концентрации исследованных сульфатов целлюлозы, выделенной из растений рода Gossypium hirsutum L., сульфатов инулина, выделенного из Helianthus tuberosus, сульфатов пектина, выделенного из Siberian abies, приводит к возрастанию времени свертывания плазмы в тестах АЧТВ, ТВ, ПВ, РеаКлот-Гепарин и связано с наличием в плазме антитромбина.

2. Исследованные сульфаты целлюлозы и сульфаты пектина не влияют на время свертывания плазмы человека при активации анцистроном (коагулаза яда щитомордника обыкновенного Agkistrodon halys halys).

3. Добавление к богатой тромбоцитами плазме человека сульфатов целлюлозы, выделенной из растений рода Gossypium hirsutum L., сульфатов инулина, выделенного из Helianthus tuberosus, или сульфатов пектина, выделенного из Siberian abie , в плазменной концентрации до 106 мкг/мл не приводит к агрегации кровяных пластинок.

4. В опытах in vitro можно наблюдать преципитаты между сульфатом протамина и сульфатами целлюлозы, сульфатами пектина, сульфатами инулина. Вероятно, поэтому сульфат протамина нейтрализует антикоагулянтную активность сульфатов целлюлозы in vitro.

5. При внутривенном введении кроликам увеличивающихся доз сульфата целлюлозы с молекулярной массой < 50 кДа (степень сульфатирования 2,4) увеличивается антикоагулянтная активность плазмы, которую можно' снизить внутривенным введением сульфата протамина; увеличение дозы сульфата целлюлозы при введении крысам приводит к увеличению антитромботического эффекта на модели венозного тромбоза и геморрагического эффекта, в сравнении с нефракцио-нированным гепарином. ,

Апробация работы. Диссертационная работа апробирована 30 сентября 2014 года на заседании проблемной комиссии «Проблемы донорства, производства и контроля качества компонентов и препаратов крови, разработки средств воздействия на систему крови» в Федеральном государственном

бюджетном учреждении "Гематологический научный центр" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Результаты исследования были представлены в виде устных и стендовых сообщений на отечественных и международных конференциях, конгрессах и симпозиумах: Конгресс гематологов России, Москва, 2012; V Международная научно-практичская конференция «Современная медицина и фармацевтика: анализ и перспективы развития», Москва, 2012; VI Всероссийская конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием), Москва, 2013; Первая Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств», Москва 2013; II Российская научно-практическая конференция «Клинические и лабораторные аспекты современной гематологии», Москва, 2013; II Конгресс гематологов России, Москва, 2014; XII Международная конференция «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», Пермь, 2014.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования России, и 7 работ - в материалах российских и международных конференций (2 статьи и 5 тезисов).

Личный вклад соискателя. Автором лично был проведен анализ литературы по теме диссертации. На основе проведенного анализа совместно с руководителем выбраны адекватные' методы определения антикоагулянтной активности исследуемых соединений в опытах in vitro / ex vivo. Автором самостоятельно спланирован' ход экспериментов, получены и проанализированы результаты, сформулированы выводы и практические рекомендации. При активном участии автора, подготовлены публикации по результатам диссертационного исследования.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах, состоит из следующих разделов: введение, литературный обзор, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические рекомендации, список использованной

литературы, включающий 269 источника, из них 24 отечественных и 245 зарубежных. Диссертация содержит 14 таблиц и 21 рисунок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении сформулированы цель работы, актуальность проблемы, основные положения, выносимые на защиту, научная новизна и практическая значимость работы. В первой главе "Обзор литературы" рассматриваются используемые в современной медицинской практике антикоагулянты, а также разрабатываемые соединения из растительных материалов, обладающие антикоагулянтными свойствами.

Материалы и методы исследования

В таблице 1 представлены характеристики исследуемых сульфатированных полисахаридов.

Таблица 1. Структурные характеристики сульфатов целлюлозы, сульфатов инулина и сульфатов пектина.

Соединение Шифр Исходный полисахарид ММ, кДа СС

Сульфат целлюлозы СЦ 615-2 МКЦ, хлопчатник (Gossvpium hirsutum L.) 22 0,8

СЦ 676 22 1,3

СЦ 614-1 22 1,5

СЦ 906 <50 2,4

Абиенан Абиенан Пектин, пихта сибирская (Abies sibirica L) 15 0

Сульфат пестнна СПКТ 639-2 24 0,8

СПКТ 639-1 24 1,1

Сульфат инулина СИ 715-2 Инулин, топинамбур (Helianthus tuberosus) 8 0,6

СИ 715-1 8 1,0 '

СИ 719 8 . 1,6

Примечание: МКЦ - микрокристаллическая целлюлоза; ММ - молекулярная масса; СС -степень сульфатирования.

Образцы сульфатов целлюлозы (СЦ), сульфатов инулина (СИ), сульфатов пектина (СПКТ), абиенана (пектин из пихты, не сульфатированный) с изученными структурными характеристиками были предоставлены Торлоповым М. [лаборатория химии растительных полимеров Института химии Коми научного центра УрО РАН (г. Сыктывкар)].

Влияние АК на свертывание плазмы человека in vitro оценивали, используя общепринятые тесты: активированное частичное тромбопластиновое время

(АЧТВ) [Scaglione F., 2013], протромбиновое время (ПВ) [Rosenberg, R.D., 1977], тромбиновое время (ТВ) [Teien, A.N., 1975], набор РеаКлот - Гепарин (НПО "Ре-нам" Россия, Москва) [Yin Е.Т., 1973]; для изучения влияния на полимеризацию фибриногена использовали тест анцистронового времени при добавлении яда змеи Agkistrodon halys halys (яд щитомордника) под торговой маркой Анцистрон (анцистроновый тест-АВ) [Баркаган 3., 2001]. Все коагулологические тесты (с плазмой человека) проводили на коагулометрах «Минилаб 701-М». Для оценки АК потенциала полученных соединений графически определяли эффективные концентрации 2АЧТВ, 2ПВ, 2ТВ, 2РеаКлот, которые находили по абсциссами точек, расположенных на кривых зависимости концентрация антикоагулянта -эффект; ординаты точек — 2-х кратное увеличение времени свертывания плазмы, в сравнении с контролем, то есть без добавления антикоагулянтов.

Для исследования механизма АК действия сульфатированных полисахаридов было проанализировано влияние образцов и НФГ на гидролиз специфических хромогенных субстратов тромбином и фактором Ха в присутствии и без антитромбина. По изменению оптической плотности инкубационного раствора за минуту судили об активности исследуемого образца и сравнивали со стандартом НФГ; определяли концентрации полисахаридов ('А ДА 405/ мин), при которых изменение оптической плотности инкубационной смеси за минуту снижалось в 2 раза, в сравнении с контролем (без добавления АК).

Влияние НФГ СЦ, СПКТ и СИ на агрегацию тромбоцитов по методу Борна [Баркаган 3., 2001] исследовали с помощью агрегометра фирмы Chrono-Log (штат Пенсильвания, США) Model 500) по изменению оптической плотности богатой тромбоцитами плазмы человека. • . •

Для наглядного определения.возможности связывания исследуемых'соединений с антидотом-поликатионом использовали горизонтальный биоспецифический электрофорез; в агарозу добавляли хитозан с ММ 10 кДа (степень дезаце-тилирования 85%, получен в лаборатории инженерии ферментов Центра "Биоинженерия" РАН ферментативным гидролизом из высокомолекуляного крабового хитозана, ЗАО «Биопрогресс», Россия) или сульфат протамина (СПТ, Sigma); в

лунки агарозного геля на стеклянных пластинах добавляли исследуемые соединения. После проведения электрофореза пластины сканировали и определяли высоту и площадь пиков преципитации в программе Photo M 1,31[ Дрозд Н.Н. патент РФ № 2006141290 (2008)]. Нейтрализацию антнкоагулянтной активности образцов СЦ или НФГ сульфатом протамина оценивали с помощью теста АЧТВ.

Часть экспериментальных исследований ex vivo выполнена на 115 кроликах породы Шиншилла обоего пола массой 2,83 - 5,07 кг и 138 белых крысах-самцах линии Wistar весом 150 - 270 г, полученных из питомника РАМН "Столбовая" и находившихся на стандартной диете в боксированных помещениях с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах (European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and Other Scientific Purposes. Ctrasbourg, 1986). Животные контрольных и опытных групп одного возраста, были получены из питомника одновременно.

Фармакологическую активность СЦ с ММ < 50 кДа и СС 2,4 определяли при внутривенном введении СЦ, НФГ (субстанция "Bio-pharm CoLtd", Шанхай-Гонконг, Китай; alla активность 173 ЕД/мг, аХа активность 168 Ед/мг) или физиологического раствора в краевую ушную вену кроликов. Также были определены АК активности плазмы кроликов при введении СЦ и последующей нейтрализации сульфатом протамина в эквивалентных дозах. Для введений использовали соединения в дозах 3, 5 и 7 мг/кг Длительность действия, силу эффекта, антитромбино-вую (alla) и анти-фактор Ха (аХа) активности плазмы кроликов оценивали, используя тесты АЧТВ и РеаКлот-Гепарин (НПО "Ренам").

На модели венозного стаза у крыс по. методу S. Wessler исследовали антитром-ботическую (АТБ) активность образца СЦ с ММ < 50 кДа и СС 2,4 (в дозах 0,3, 1 и 3 мг/кг), в сравнении с НФГ (в дозах 0,3, 0,5 и 1 мг/кг) и физиологическим раствором [Wessler S., 1959]. После наркоза, введения АК и сыворотки человека, активирующей свертывающую систему крыс, из перевязанного участка вены извлекали тромб. Эффективность антитромботической активности оценивали по форме тромба в баллах и по концентрации белка по методу Лоури. Геморрагиче-

скую активность образца СЦ с ММ < 50 кДа и СС 2,4 определяли по [Hobbelen P.M., 1987] при введении крысам.

Результаты исследования представлены как средние арифметические со стандартными ошибками средних арифметических (для in vitro экспериментов по 4-7 независимым определениям, для ex vivo экспериментов по 7-10 независимым экспериментам). Достоверность различий между показаниями (р<0,05) оценивали по критерию Стьюдента и по критерию Колмогорова-Смирнова. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ Biostat и Sta-graphics Plus.

Результаты исследования

Влияние исследуемых соединений на время свертывания плазмы в тесте активированное частичное тромбопластиновое время, тромбиновое, протромбиновое время и РеаКлот-гепарин (НПО "Ренам").

Для оценки эффективности антикоагулянтов на практике в клинике используют показатель удвоенного времени свертывания плазмы или крови человека в некоторых коагулологических тестах, в сравнении с показаниями до введения лекарственного средства [Ng HJ., 2003]. В опытах in vitro нами показано, что эффективные концентрации исследованных соединений (2АЧТВ, 2ПВ, 2ТВ, 2РеаКлот см. материалы и методы) снижались с увеличением степени сульфатирования; подобная закономерность для сульфатов полисахаридов растительного происхождения показана в ряде работ [AlmediaLima J., 2010; Ciancia М., 2007; Cipriani, T.R., 2009; Camara R.B.G., 2011; Colliec-Jouault S.,.2012; Luo L., 2013; Maas N.C., 2012; McMillan E„ 2011; Qi X., " 2012; Silva TH„ 2012; Уе L„ 2012]. ' - • . ■ " • " • . -

. При добавлении Образцов в цитратную плазму человека in vitro время появления фибринового сгустка в тестах АЧТВ, ТВ, ПВ и РеаКлот-гепарин увеличивается, поэтому соединения являются антикоагулянтами прямого действия. Наибольшего внимания заслуживают образцы СЦ 906 и СЦ 614-1 (табл.2), так как их антитромбиновые активности достигали 88,2±4,7 и 122,7±2,4 ЕД/мг, соответственно, а эффективные концентрации в тесте ТВ

достоверно не отличались от таковых для НФГ и были равны 6,7±0,6 и 9,4±0,8 мкг/мл, соответственно (табл.2).

Таблица 2. Эффективные концентрации, антитромбиновая и анти-Ха активность группы

сульфатов целлюлозы (СЦ), сульфатов инулина (СИ), сульфатов пектина (СПКТ).

ММ, 2ПВ, 2ТВ, 2АЧТВ, а11а, ЕД/мг 2РеаКлот, аХа, ЕД/мг

№ п/п СС мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл

кДа плазмы плазмы плазмы плазмы

НФГ 15 1,8 12,7±1,8 4,5±0,2 0,65±0,09 160 1,7+0,03 148

СЦ 615-2 22 0,8 109,0±5,5 20,2±1,4 9,5±1,3 45,4±1,5 133,0±8,9 21,911,8

СЦ 676 22 1,3 103,7±7,1* 17,8±1,2* 7,6±3,3* 54,8+1,6* 15,4+0,2* 30,314,3*

СЦ 614-1 22 1,5 76,3±11,5 б,7±0,6 2,9±1,1 122,7±2,4 39,7±6,1 12,7+2,5

СЦ 906 <50 2,4 88,4±5,1 9,4±0,8 7,6±0,6 88,2±4,7 46,4±4,7 7,4+1,6

Абиенан 15 0 >1500* >200 >1000* 0 >200 0

СПКТ 639-2 24 0,8 680138* 17,8±4,5* 8,0±2,6* 29,3±1,9* 77,4±3,3* 9,8+0,5

СПКТ 639-1 24 1Д 411±22* 9,4±2,1* 4,4±1,7* 38,7±2,5* 45,6±3,9* 13,311,5

СИ 715-2 8 0,6 >2000 >1500 126,4±87,3* 5,5±2,4 >2000 0

СИ 715-1 8 1,0 1907±79 433,3±113,3 40,3±15,6 11,4±4,9 447141 1,4+0,03

СИ 719 8 1,6 >2000* 1260,0±36,1* 37,1±10,6* 8,2±2,2 18131365 0,410,1

Примечание: Эффективные концентрации (2ПВ. 2ТВ ) — концентрации сульфатов полисахаридов, при которых время свертывания плазмы увеличивается в 2 раза, в сравнении с контролем (без АК); * - р<0,05 — достоверность различий с показаниями для НФГ; п = 4-7.

Помимо этого было отмечено, что активность против фактор Ха у наиболее перспективных соединений в несколько раз меньше, чем антитромбиновая активность, когда как у НФГ эти активности одинаковы [ЬтЬагсК Я., 2012]. Влияние исследуемых соединений на время свертывания плазмы в тесте ан-цистронового времени.

В тесте анцистронового времени (АВ) введение образцов СЦ 615-2, СЦ 906; СПКТ 639-2, так же как и НФГ в концентрации от 0,833 до 416,6 мкг/мл не вызывало достоверного увеличения времени по отношению к нулевой точке (без АК) (рис. 1) . При добавлении образцов СЦ 614-1 и СПКТ 639-1 в концентраций 416,6 мкг/мл время появления сгустка достоверно увеличивалось до 58,2±5,0 и 54,2±1,7 сек, соответственно; также было ' отмечено появление хлопьев (агрегатов) в пробирке.

Таким образом, добавление к плазме человека НФГ и образцов СЦ и СПКТ (до 200 мкг/мл) не влияло на время свертывания в тесте анцистронового времени. Подобный факт может свидетельствовать об отсутствии влияния СЦ и СПКТ на полимеризацию фибриногена.

70 i

i ..

1 i * . , ■ CU61S-2 W Л СЦ614-1 ■ СЦ906

1 го : * 5

,4-

бО i

«

si 1

Jl *

1 ......*.......

-100 L. 100 200 ИТ рация СПКТв 300 400 500

В)

б)

Рисунок 1. Изменение времени свертывания плазмы человека в тесте Анцистронового времени при добавлении исследуемых образцов, (данные представлены как х„р± стандартная ошибка среднего; п= 4-5). а - Влияние образцов из группы СЦ на свертывание плазмы человека; б - Влияние образцов из группы СИ на свертывание плазмы человека; в - Влияние образцов из группы СПКТ на свертывание плазмы человека. Ингибирование исследуемыми соединениями амидолитической активности

тромбина и фактора Ха.

Добавление образцов СЦ 615-2, СЦ 676, СЦ 614-1 и СЦ 906 в инкубационную смесь, содержащую антитромбин, тромбин и хромогенный субстрат S 2238 приводило к снижению скорости гидролиза хромогенного субстрата в 2 раза (рис 2а), в сравнении с контролем, при концентрациях 22,10±5,40; 11,10±2,70; 3,00±0,70; 2,88±0,69 мкг/мл, соответственно; антитромбиновая активность образцов составила 15,60±1,30; 79,01±19,10; 104,00±9,61; 77,40±9,72 Ед/мг, соответственно.

Снижение скорости гидролиза хромогенного субстрата наблюдали при внесении исследуемых образцов в инкубационную смесь, содержащую антитромбин, фактор Ха и хромогенный субстрат S 2222 (рис. 26).

1000 юосю

конечная концентрация янтикоагуляктое, мкг/мл g )

Рисунок 2. Влияние образцов из группы СЦ на амидолитическую активность тромбина и фактора Ха в присутствии антитромбина (данные представлены как хср± стандартная ошибка среднего; п= 4-7). а) Влияние образцов из группы СЦ на амидолитическую активность тромбина в присутствии антитромбина; б) Влияние образцов из группы СЦ на амидолитическую активность фактора Ха в присутствии антитромбина.

Без добавления антитромбина снижения скорости гидролиза специфических хромогенных субстратов тромбином или фактором Ха для исследуемых образцов, в частности группы СЦ не наблюдали (рис. 3).

0,001

Рисунок 3. Влияние образцов на амидолитическую активность тромбина и фактора Ха без антитромбина (данные представлены как хср± стандартная ошибка среднего; п= 4-7). а) Влияние образцов из группы СЦ на амидолитическую активность тромбина без антитромбина; б) Влияние образцов из группы СЦ, СИ, СПКТ и абиенана на амидолитическую активность фактора Ха без антитромбина.

По результатам исследования показано, что соединения группы СЦ опосредованно, с участием плазменного ингибитора сериновых протеаз - антитромбина, снижали амидолитическую активность тромбина. Из этой группы можно выделить образцы СЦ 614-1, СЦ 906, СЦ 676 с антитромбиновой активностью более 70 ЕД/мг. Антитромбиновая активность (рассчитанная в тесте с хромогенным субстратом на тромбин) образцов СЦ 615-2, СИ и СПКТ была менее 35 ЕД/мг. Образцы СЦ 614-1, СЦ 906 обладали наибольшей alla активностью, как и при измерении в тесте АЧТВ.

Отношение антитромбиновой активности к аХа активности наиболее активных сульфатов целлюлозы и сульфатов пектинов составило 3 — 4,5 и 2,3 - 2,9, соответственно. Такое же превалирование антитромбиновой активности над аХа активностью наблюдали некоторые авторы для фукоиданов, гапактанов, галактоманнанов, пектинов, лигнинов [Дрозд .H.H., 2008; Costa LS., 2010; Henry BL., 2010; Pomin V.H., 2014; Vityazev FV., 2010]. Влияние соединений на агрегацию тромбоцитов человека.

Агрегацию тромбоцитов проводили в богатой тромбоцитами плазме (PRP-плазме); количество тромбоцитов достигало 271-384 тыс/мкл (норма 250-400 тыс./мкл [Angiolillo D., 2010]).

Группа сульфатов инулина и СЦ 615-2 не влияли на изменение степени агрегации, и только СПКТ 639-2 провоцировал самостоятельную агрегацию тромбоцитов до 62 % (рис. 4а). Все остальные соединения показали примерно одинаковые значения с гепарином.

При добавлении к богатой тромбоцитами плазме с исследуемыми АК индуктора агрегации - Аденозиндифосфоной кислоты ( АДФ) и при увеличении плазменных концентраций образцов увеличение степени агрегации не отмечали, за исключением группы СПКТ (рис. 46).

Г ~ ~ ""

11 I 1 ;.......1

Рисунок 4. Влияние образцов из группы СЦ, СИ, СПКТ и НФГ на агрегацию тромбоцитов человека (данные представлены как хср± стандартная ошибка среднего; п= 4-7). а) Самостоятельное влияние образцов СЦ, СИ, СПКТ и НФГ на агрегацию тромбоцитов человека; * - р< 0,05 -достоверность различий влияния образцов в концентрации 34 мкг/мл от образцов в концентрации 1,28 мкг/мл; б) Влияние образцов СЦ, СИ, СПКТ и НФГ на индуцированную АДФ агрегацию тромбоцитов человека

Таким образом, некоторые из исследованных сульфаты целлюлозы и сульфаты инулина самостоятельно не вызывали агрегацию тромбоцитов человека и не увеличивали агрегацию тромбоцитов человека индуцированную АДФ. Наиболее перспективным образцом является один из образцов СЦ с ММ < 50 кДа и СС 2,4, обладающий достаточной антитромбиновой активностью и сравнимыми с НФГ результатами по влиянию на агрегацию тромбоцитов человека. •

Проведение горизонтального биоспецифичного электрофореза с поликатионами в геле агарозы. -*

При помощи метода биоспецифического электрофореза мы определили, что возможна преципитация между исследуемыми полисахаридами (СЦ, СИ, СПКТ) и сульфатом протамина.

На рис. 5 показано, что при увеличении количества полисахаридов в лунках агарозы при биоспецифическом электрофорезе, увеличивались размеры пиков

преципитации с СПТ в форме «ракеток». Также было отмечено, что при введении в лунки наиболее активного образца (СЦ 614-1 в количестве 6,00 мкг), высота пиков преципитации была больше, в сравнении с введением образцов с меньшей АК активностью (СЦ 615-2 и СЦ 614-1). Таким образом, можно говорить о тенденции связи между АК активностью исследованных СЦ и размерами пиков преципитации с СПТ.

Рисунок 5. Области преципитации сульфатов полисахаридов с сульфатом протамина (А - нефракционированный гепарин; Б - сульфаты целлюлозы; В - сульфаты инулина и сульфаты пектина). 1-НФГ; 2- СЦ 615-1; 3- СЦ 614-1; 4-СЦ 906; 5- СИ 715-2; 6- СИ 719; 7- СПКТ 639-2; 8-СГПСТ 639-1.Количество, вносимое в лунки геля агарозы, сульфатов полисахаридов^ - 0,38 мкг; Ь - 0,75 мкг; с -1,50 мкг; с! - 3,00 мкг; е - 6,00 мкг

[Б ■■■■■■■■■В

При введении образцов СИ и СПКТ в лунки застывшего агарозного геля мы наблюдали достоверные меньшие размеры пиков преципитации в сравнении с НФГ.

При постановке электрофореза с хитозаном в условиях, идентичных проведению электрофореза с сульфатом протамина, наблюдали пики преципитации только с СЦ (рис. 6). Пики преципитации с НФГ, СИ и СПКТ выходили за пределы стекла, и возможности их охарактеризовать не представилось. Мы наблюдали увеличение размеров пиков преципитации с хитозаном при увеличении количества образцов СЦ в 11-30 раз.

Рисунок 6. Области преципитации сульфатов полисахаридов^ хитозаном. 1- СЦ 615-1; 2- СЦ 614-1; 3-СЦ 906. Количество, вносимое в лунки геля агарозы, сульфатов полисахаридов:. а - 0,38 мкг; Ь - 0,75 мкг, с - 1,50 мкг; (1 - 3,00 мкг; е - 6,00 мкг

Для последующих экспериментов по нейтрализации АК активности исследованных полисахаридов в качестве антидота выбран применяемый в клинической практике СПТ.

Нейтрализация сульфатом протамина антикоагулянтной активности исследуемых соединений в опытах in vitro.

Способность СПТ нейтрализовать антикоагулянтную активность СЦ 614-1 и СЦ 906 оценивали по времени свертывания плазмы в тесте АЧТВ и по alla активности плазмы.

С увеличением концентрации АК [диапазон концентраций НФГ и группы СЦ составили от 0,36 до 0,81 мкг/мл и от 0,71 до 3,57 мкг/мл, соответственно], в пробах без СПТ, время свертывания плазмы и alla достоверно возрастали (рис. 7).

а)

комц«итр*ци»

б)

Рисунок 7. Изменение времени свертывания плазмы человека при добавлении исследуемых образцов и СПТ в различных концентрациях в тесте АЧТВ (данные представлены как х ср± стандартная ошибка среднего; 4-6): а - Влияние СПТ и НФГ; б -») Влияние СПТ и СЦ 614-1; в - Влияние СПТ и СЦ 906 Примечание: * - р<0,05 - достоверность различии с показаниями без введения СПТ.

При добавлении сульфата протамина к раствору с АК время образования сгустка и антитромбиновая активность уменьшались.

При увеличении концентрации СПТ и добавлении его в плазму к СЦ 614-1 или к СЦ 906 отмечали снижение АК активности. Сульфат протамина полностью нейтрализовал антитромбиновую активность СЦ 614-1 и СЦ 906 при весовом отношении 2,0-6,0 и 0,5-6,0, соответственно, для НФГ весовое отношение антидот/антикоагулянт составило 0,7 - 1,6, что совпадает с литературными данными.

Для последующих экспериментов был отобран образец СЦ 906, т.к. для снижения его АК активности требовалось меньшее количество протамина.

Внутривенное введение кроликам образца СЦ 906 (молекулярная масса < 50 кДа, степень сульфатирования 2,4) и сульфата протамина.

В тесте АЧТВ и в тесте РеаКлот-гепарин при увеличении дозы СЦ 906 ( с 3 до 7 мг/кг) и НФГ (с 0,75 до 1 мг/кг) наблюдали, что время образования сгустка и сила АК эффекта (alla и аХа активности) возрастали (рис. 8, рис. 9).

а)

б)

Рисунок 8. Время свертывания плазмы кроликов в тесте АЧТВ при внутривенном введении кроликам СЦ 906 в дозах 3, 5 и 7 мг/кг (а) и НФГ в дозах 0,75 и 1 мг/кг (б); п=7-10. Примечание: * - р<0,05 - достоверность различий к показаниям наименьшей дозы ( к дозе 0,75 мг/кг для НФГ; к дозе 3 мг/кг для СЦ).

| J 5 . ™

• СЦЗж/юг ШСЦЪш/ю

*СЦ7 ш/ю

а)

Рисунок 9. Время свертывания плазмы кроликов в тесте РеаКлот-гепарин при внутривенном введении кроликам СЦ 906 в дозах 3, 5 и 7 мг/кг (а) и НФГ в дозах 0,75 и 1 мг/кг (б); п=7-10. Примечание: * - р<0,05 - достоверность различий к показаниям наименьшей дозы ( к дозе 0,75 мг/кг для НФГ; к дозе 3 мг/кг для С.Ц).

Максимальные alla и аХа активности плазмы и время образования фибринового сгустка мы отметили на 5 минуте после введения СЦ 906 и НФГ в кровь (рис. 8, рис. 9), что совпадает с литературными данными при внутривенном введении антикоагулянта прямого действия НФГ [Jeske W., 2012].

Последовательное введение сульфата протамина за сульфатом целлюлозы или за нефракционированным гепарином (в одинаковых дозах) приводило к снижению времени свертывания плазмы кроликов в тестах АЧТВ / РеаКлот-Гепарин и к снижению alla / аХа активностей плазмы (рис. 10, рис. 11).

Через 15 мин после введения СЦ и СПТ время свертывания плазмы в тесте АЧТВ в зависимости от дозы было в 2,3 - 4,4 раз меньше, чем при введении

только СЦ; для НФГ и СПТ эта разница на 15 мин составила 6 и 9 раз, в зависимости от дозы (рис. 10).

НФГвдемг/мдКПТ 0,75 ««/мп

ШГ.1мг/мл*СП1 г мг/кг

Интервалы отбора

а)

5 10 15 30 60 1» 180 240 Интервалы отбора крови, мни

б)

Рисунок 10. Время свертывания плазмы кроликов в тесте АЧТВ при внутривенном введении кроликам СЦ 906 + СПТ в дозах 3, 5 и 7 мг/кг (а) и НФГ+ СПТ в дозах 0,75 и 1 мг/кг (б); п=7-10. Примечание: *- р< 0,05 - достоверность различий СЦ+СПТ или НФГ'+ СПТ от СЦ или НФГ

II

■ СЦ Ï мг/кг СПТ Э мг/кг

» СЦ 7 МГ/КГ * СЛГ 7 мг/кг

* НФГ 0,75 мг/нм-СПТ 0,75 мг/кг

• НФГ 1 ш/ш *С«Т 1 мг/кг

lllllllll

ю 15 зо ы> 1?о 1йо гад

Интервалы отбора кроен, мин

10 15 30 Интервалы отбора крови, м

170 180 740

а) --------6)

Рисунок 11. Время свертывания плазмы кроликов в тесте РеаКлот-гепарин при внутривенном введении кроликам СЦ 906 + СПТ в дозах 3, 5 и 7 мг/кг (а) и НФГ+ СПТ в дозах 0,75 и 1 мг/кг (б); п=7-10 Примечание: *-р< 0,05 - достоверность различий СЦ+СПТ или НФГ+СПТ от СЦ или НФГ

При введении СЦ 906 в краевую ушную вену кроликам в разных дозах отметили, что соединение вызывает антикоагулянтный эффект в плазме. В исследованиях, при совместном введении СЦ 906 и СПТ кроликам мы получили данные, свидетельствующие о нейтрализации alla и аХа активностей плазмы сульфатом протамина. Для нейтрализации антикоагулянтной активности СЦ 906.может быть достаточно использование. сульфата протамина и антикоагулянта в .одинаковых дозах.

Геморрагическая активность СЦ 906 (молекулярная масса < 50 кДа, степень сульфатирования 2,4).

Геморрагическую активность СЦ 906 исследовали по оптической плотности при длине волны 540 нм гемолизатов крови крыс.

В сравнении с контролем (введение физиологического раствора) концентрации гемоглобина в водных гемолизатах крови крыс после ведения СЦ 906 или НФГ

были в несколько раз больше (табл. 3). С увеличением дозы СЦ 906 и НФГ концентрация гемоглобина и, соответственно, геморрагическая активность возрастала.

Таблица 3. Концентрация гемоглобина в гемолизатах крови крыс (г/л) при внутривенном введении антикоагулянтов (п=10).

——-_Доза АК, аПа ЕД/кг АК " —-___ 0 48 96 192

СЦ 906 0,00060 ±0,00002 0,220±0,024* 0,440±0,041* 0,680±0,035*

НФГ 0,410±0,034 0,730±0,025 0,930±0,041

Примечание: АК - антикоагулянт: * - р<0,05 - р- достоверность различий с показаниями при введении гепарина.

Меньший геморрагический эффект СЦ 906 можно объяснить меньшей, чем у НФГ, ингибиторной активностью по отношению к фактору Ха. Подобные эффекты для сульфатированного гапактоманнана и фукоидана отражены в работах МагйшсИеп-Неггего 1 и др. и Дрозд Н. и др. [Дрозд Н.Н. ,2011 ; МаПЫсЬеп-Неггего .1С., 2005].

Антитромботическая активность СЦ 906 ( молекулярная масса < 50 кДа, степень сульфатирования 2,4).

На модели венозного тромбоза у крыс отметили снижение размеров тромбов (в баллах) и концентрации белка в гомогенатах тромбов с увеличением дозы СЦ 906 от 0,3 до 3,0 мг/кг или с увеличением дозы НФГ 0,3 до 1,0 мг/кг (рис. 12).

Доза введения СЦ выше гепарина в связи с его меньшей АК активностью, но тем не менее, СЦ 906 эффективно препятствует развитию экспериментального венозного тромбоза.

.фор« пк»«а. ь>ллл Рисунок 12. Антитромботический эффект СЦ

Л * а

906 и НФГ на модели венозного тромбоза у крыс (п=8-10). Примечание: * - р<0,05 (по В1оз1а1) достоверность различий с показаниями при введении физиологического раствора (0 мг/кг).

I

ш концентрация белка е голкхенаге (ромба. *г/мл

0,3 0,5 НФГ

Выводы:

1. Новые антикоагулянты прямого действия сульфаты целлюлозы, выделенной из Gossypium hirsulum L., с молекулярной массой 22 < 50 кДа (степень сульфатиро-вания 0,8-2,4), сульфаты инулина, выделенного из Helianthus tuberosus, с молекулярной массой 8 кДа (степень сульфатирования 0,6-1,6), сульфаты из пектина, выделенного из Abies sibirica L., с молекулярной массой 24 кДа (степень сульфатирования 0,8-1,1) осуществляют активность посредством взаимодействия с антитромбином.

2. Антикоагулянтная активность исследованных сульфатов полисахаридов увеличивается с возрастанием степени сульфатирования; максимальная антитромбино-вая активность сульфатов целлюлозы, сульфатов пектина и сульфатов инулина достигает 122,7±2,4, 38,7±2,5 и 11,4±4,9 ЕД/ мг, соответственно; анти-фактор Ха активность сульфатов целлюлозы не превышает 30 ЕД/мг.

3. В плазменной концентрации до 200 мкг/мл сульфаты целлюлозы (молекулярная масса 22<50 кДа, степень сульфатирования 0,8; 1,5 и 2,4) и сульфаты пектина (молекулярная масса 24 кДа, степень сульфатирования 0,8 и 1,1), так же как и не-фракционированный гепарин, не влияют на механизм действия анцистрона (коа-гулазы яда щитомордника обыкновенного Agkistrodon halys halys), отщепляющего от фибриногена фибринопептид А.

4. Сульфаты целлюлозы (молекулярная масса 22<50 кДа, степень сульфатирования 0,8; 1,5 и 2,4) и сульфаты инулина (молекулярная масса 8 кДа, степень суль-

- фатирования 0,6 и 1,6) не вызывают самостоятельно агрегацию тромбоцитов че-

- ловека и не потенцируют агрегацию тромбоцитов человека, индуцированную аденозиндифосфорной кислотой.

5. Сульфаты целлюлозы (молекулярная масса 22<50 кДа, стецень сульфатирования 0,8; 1,5 и 2,4) образуют с сульфатом протамина и хитозаном (молекулярная масса 10 кДа, степень дезацетилирования 85%) пики преципитации при проведении биоспецифичного электрофореза. Сульфат протамина in vitro нейтрализует антитромбиновую активность сульфатов целлюлозы с молекулярной массой 22 и

< 50 кДа (степень сульфатирования 1,4 и 2,4); весовые отношения антидот / антикоагулянт достигают 0,5-6,0.

6. С увеличением дозы сульфата целлюлозы (молекулярная масса < 50 кДа; степень сульфатирования 2,4) от 3 до 7 мг/кг, при внутривенном введении кроликам, возрастает антитромбиновая активность плазмы, а внутривенное введение сульфата протамина в эквивалентных дозах приводит к ее снижению.

7. Антитромботическая активность сульфата целлюлозы (молекулярная масса < 50 кДа; степень сульфатирования 2,4) увеличивается с повышением дозы при внутривенном введении крысам с моделированным венозным тромбозом; его геморрагическая активность ниже, чем у нефракционированного гепарина. Практические рекомендации. Для получения сульфатов инулина и сульфатов пектина с большей антикоагулянтной активностью рекомендуется увеличить степень сульфатирования до 2 и более. Для увеличения в два раза антитромбиновой активности плазмы кроликов рекомендуется внутривенное введение сульфата целлюлозы (при условии, что его специфическая антитромбиновая активность превышает 70 ЕД/мг) в диапазоне доз 3-5 мг/кг. Для нейтрализации антикоагулянтного эффекта рекомендуется внутривенное введение сульфата протамина в дозах 3-5 мг/кг.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи

1. Дрозд H.H. Зависимость антикоагулянтной активности крахмала и инулина от степени сульфатирования [Текст] / H.H. Дрозд, М.А. Торлопов, A.A. Кужим, В.А. Макаров // Экспериментальная и клиническая фармакология,- 2012. -Т.75. -№6. -С.31-35.

2. Кужим A.A. Связь между антикоагулянтной активностью сульфатирован-ных растительных полисахаридов и размером области их преципитации с поликатионами, при проведении биоспецифичного электрофореза [Текст] / A.A. Кужим, H.H. Дрозд, М.А. Торлопов , A.B. Ильина // Экспериментальная и клиническая фармакология. -2013.-Т.76. -№10,- С.20-24

3. Кужим A.A. Нейтрализация сульфатом протамина антикоагулянтной активности сульфатированной целлюлозы, выделенной из Gossypium hirsutum L. [Текст] / A.A. Кужим, H.H. Дрозд, М.А. Торлопов // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2014. —№ 1. - С.34-38.

Статьи в материалах конференций

1.Дрозд H.H. Размеры области преципитации сульфатов целлюлозы с сульфатом протамина или хитозаном при электрофорезе [Текст] / H.H. Дрозд, A.A. Кужим, В.А. Макаров, A.B. Ильина, М.А. Торлопов // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. Материалы XII-й Международной конференции. -Пермь: Изд-во Центр "Биоинженерия" РАН» - 2014. — с. 131 — 135.

2. Кужим A.A. Нейтрализация антикоагулянтной активности сульфатированной целлюлозы, выделенной из Gossypium hirsutum, сульфатом протамина in vitro и in vivo [Текст] / A.A. Кужим, H.H. Дрозд, М.А. Торлопов // Материалы II Российской научно-практической конференции «Клинические и лабораторные аспекты современной гематологии». Вестник последипломного медицинского образования. - -2013. - № 3. - С. 38.

Тезисы

1.Кужим A.A. Влияние степени сульфатирования антикоагулянтной активности крахмала и инулина [Текст] / A.A. Кужим, H.H. Дрозд, М.А. Торлопов, В.А. Макаров // Гематология и транфузиология: Конгресс гематологов России. -М., 2012. -Т.57. - №3 (приложение).-С.118-119.

2.Кужим A.A. Влияние растительных сульфатированных полисахаридов на индуцированное коагулазами ядов змей Agkistrodon halys halys и Echis multisquamatus свертывание плазмы человека [Текст] / A.A. Кужим, H.H. Дрозд, М.А. Торлопов // Первая Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств» - Москва, 2013. - С. 52.

3. Кужим A.A. Влияние сульфатов: целлюлозы, инулина, пектина на агрегацию тромбоцитов человека in vitro [Текст] / A.A. Кужим, H.H. Дрозд, М.А. Торлопов, В.А. Макаров // Современная медицина и фармацевтика: анализ и перспективы развития: V Международная научно-практическая конференция «Современная медицина и фармацевтика: анализ и перспективы развития». — М., - 2012,- с.33-36.

4. Кужим A.A. Нейтрализация сульфатом протамина антикоагулянтной активности сульфатов целлюлозы in vitro [Текст] / A.A. Кужим, H.H. Дрозд, М.А. Торлопов, В.А. Макаров // Гематология и транфузиология: II Конгресс гематологов России. - М., -2014,- Т.59. - №1 (приложение). - С.48-49.

5.Кужим А.А Влияние сульфатов целлюлозы на звенья клеточного и плазменного гемостаза [Текст] / A.A. Кужим, H.H. Дрозд, М.А. Торлопов, В.А. Макаров // Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии: VI Всероссийская конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием). — М., - 2013.- С.174-175.

Подписано в печать: 19.03.2015 Тираж: 100 экз. Заказ № 1187 Объем: 1,0 усл.п.л Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77www.reglet.ru