Антикоагулянтная активность низкомолекулярных гепаринов, полученных с помощью гидролаз

Толстенков, Александр Сергеевич

Диссертации по медицине → Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Антикоагулянтная активность низкомолекулярных гепаринов, полученных с помощью гидролаз

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Толстенков, Александр Сергеевич Старая Купавна 2009 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.00.25

Автореферат диссертации по медицине на тему Антикоагулянтная активность низкомолекулярных гепаринов, полученных с помощью гидролаз

На правах рукописи

Толстенков Александр Сергеевич

0034 /а ШЗ

АНТИКОАГУЛЯНТНАЯ АКТИВНОСТЬ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ГЕПАРИНОВ, ПОЛУЧЕННЫХ С ПОМОЩЬЮ ГИДРОЛАЗ

14.00.25,- Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 8 ОКТ от

Научные руководитель к.б.н. Н.Н.Дрозд Научный консультант д.х.11. профессор В.П.Варламов

Старая Купавна - 2009

003479109

Работа выполнена в лаборатории патологии и фармакологии гемостаза Государственного учреждения Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

кандидат биологических наук - Дрозд Наталья Николаевна Научный консультант:

доктор химических наук, профессор - Варламов Валерий Петрович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор - Хлябич Георгий Николаевич

доктор медицинских наук, профессор, член-корр. РАМН - Шимановский Николай Львович

Ведущая организация: Московский государственный медико-стоматологический университет

Защита состоится «27»октября.2009 года в 10 30 часов па заседании диссертационного совета Д 217.004.01 при Всероссийском научном центре по безопасности биологически активных веществ (ВНЦ БАВ) по адресу: 142450, Московская обл., г. Старая Купавна, ул. Кирова, 23

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ВНЦ БАВ

Автореферат разослан «........»....................2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук профессор

Л.В. Корольченко

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Профилактика и лечение тромбозов и эмболий - важнейшая медицинская проблема, связанная со значительной заболеваемостью и смертностью, в частности, у послеоперационных пациентов (Danny, 2007). Даже такая короткая процедура как артроскопия может привести к тромбозам (Holzheimer, 2004; Hirsh, 2005). От результатов профилактики и лечения тромбозов зависит успешность борьбы с инфарктами миокарда, инсультами, ДВС - синдромом и т.д. (Wallet, 2008; Otrosk 2008; Thachil, 2008).

Антикоагулянгы - основные средства для профилактики и лечения тромбоэмболических нарушений. Нефракционированный гепарин (НФГ) и производные кумаринов уже давно используются в клинической практике, механизм их действия достаточно полно изучен. На рисунке 1 представлена пентасахаридная последовательность гепарина.

Рис 1. Пентасахаридная последовательность гепарина

Механизм действия, возможность использования в клинике, преимущества перед НФГ низкомолекулярных гепаринов (НМГ), производных нефракционированного гепарина, исследовали последние десять лет (ШгбЬ, 1998; У^егамИ, 2008). Новые антикоагулянты (АК) разрабатывают с целью подавления активности ферментов или этапов свертывающей системы крови и для получения лекарственных средств с наименьшим числом побочных эффектов 2002; \Vittkowsky, 2008).

АК активность гепарина связана со способностью увеличивать скорость ингибирования сериновых протеиназ свертывающей системы крови - тромбина (Па), факторов Ха, 1Ха, Х1а, ХПа, в основном активируя плазменный ингибитор, серпин - антитромбин; при активации другого плазменного серпина, кофактора II гепарина, происходит ингибирование только тромбина. Существуют два разных механизма ингибирования фактора Ха и тромбина (На) активированным гепарином антитромбином (Рейои, 2001; \Vhisstock, 2005; Каи, 2007).

Однако гетерогенный НФГ со средним распределением молекулярных масс 15 кД, не специфически связывается с макрофагами, эндотелиальными клетками и плазменными белками, в результате чего имеет сложную фармакокинетнку и непредсказуемый антикоагулянтный эффект. Действует непродолжительно и требует частых повторных инъекций. Биодоступность НФГ снижается при подкожном введении, в сравнении с

внутривенным. Терапевтические дозы НФГ должны контролироваться с помощью теста АЧТВ. Кроме этого, неспецифическое связывание НФГ с белками плазмы - одна из главных причин "устойчивости к гепарину" (Levine, 1994; Liaw, 2001; Middeldorp, 2007). Индуцированная гепарином тромбоцитопения встречается у 1-3% пациентов после длительного лечения НФГ и вызвана способностью последнего связываться с фактором 4 тромбоцитов, который стимулирует формирование антител к комплексу НФГ-фактор 4 тромбоцитов (Lubenow, 2002; Mousa, 2007). Длительное лечение НФГ может вызывать остеопению. НФГ связывается с остеобластами, в результате чего происходит активация остеокластов и увеличивается ломкость костей (Schulman, 2002).

Вышеперечисленные недостатки НФГ стимулировали разработку новых АК средств.

Основное преимущество НМГ над НФГ - способность в меньшей степени связываться с белками плазмы и тромбоцитами (Yu, 2002; Gerotziafas, 2007), что приводит к более длинному периоду полувыведения, высокой биодоступности, низкому риску тромбоцптолении и остеопороза. Предсказуемость АК реакции, позволяющая вводить лекарство один или два раза в день подкожно, предполагает уход от потребности в регулировании дозы или лабораторном контроле у большинства пациентов, как считают некоторые авторы (Bounaraeaux, 2004; Russell, 2007).

Цель исследования. Выбор наиболее активного НМГ из ряда гидролизованных нефракционированных гепаринов разного происхождения.

Задачи исследования:

1) оценить способность ферментативных комплексов; Slreplomyces kurssanavii, лизощц протеаза С, папайи, целловиридин, химотрипсин, гидролизоватъ НФГ из легких крупного рогатого скота и слизистой оболочки кишечника свиней с целью получения НМГ с отношением активностей аХа /alla больше 1;

2) проанализировать влияние источника НФГ (из легких крупного рогатого скота и слизистой оболочки кишечника свиней) на специфическую аптикоагулянтную активность полученных НМГ;

3) оценить возможность комплексообразования с сульфатом протамина и хитозанами с молекулярной массой (ММ) 4-21 кДа и степенью дезацетилирования (СД) 61-93 %

4) исследовать способность сульфата протамина нейтрализовать антикоагулянтную активность НМГ, а также исследовать возможность использования хитозанов для нейтрализации антикоагулянтной активности НМГ;

5) определить фармакодинамические и фармакокинетические параметры некоторых образцов НМГ при внутривенном и подкожном введениях кроликам и крысам, и сравнить их с параметрами уже используемого коммерческого НМГ - фраксипарина.

Научная новизна.

1) Впервые установлено, что нефракционированный гепарин из легких крупного рогатого скота и из слизистой оболочки кишечника свиней может быть гидролизован с помощью ферментативных комплексов Streptomyces kurssanovii, лизоцим, протеаза С, папаин, целловиридин, химотрипсин, никогда для этих целей не использовавшихся, при этом происходит увеличение аХа активности и величины отношения аХа /alla.

2) Впервые показано, что НМГ, полученные с помощью гидролиза нефракционированного гепарина из легких крупного рогатого скота и из слизистой оболочки кишечника свиней, эффективно ингибируют активность факторов На и Ха, отношение активностей аХа /alla in vivo увеличивается по сравнению с исследованиями in vitro.

3) Разработан способ определения комплексов между полианионами НМГ и поликатионами сульфата протамина и хитозанов с молекулярной массой 6-21 кДа и степенью дезацетшшрования 61-93 %, патент РФ № 2006141290.

4) Впервые показана способность хитозанов с молекулярной массой 16/21 кДа и степенью дезацетшшрования 61/91 % нейтрализовать фибриногенсвертывающую и амидолитическуто активности тромбина in vitro.

Практическое значение

Результаты исследования позволяют предполагать, что производство НМГ путем гидролиза НФГ ферментативными комплексами: Streptomyces kurssanovii, лизоцим, протеаза С, папаин, целловиридин, химотрипсин, является перспективным с точки зрения получения эффективного антикоагуляптного препарата. Показано, что при подкожном введении некоторых полученных образцов НМГ кроликам период полувыведенпя сопоставим с периодом полувыведения фраксипарина при одинаковых дозах. Показана перспективность использования в качестве антидота сульфата протамина и хитозанов для нейтрализации АК активности полученных НМГ. Разработан способ определения комплексов между гепаринами и поликатионами.

Положения, выносимые на защит}'

1. Для получения НМГ со специфическими активностями не ниже 70 ЕД/мг возможно использование гидролиза НФГ из легких крупного рогатого скота или слизистой оболочки кишечника свиней посредством неспецифических пщролаз.

2. Уменьшение ММ полученных НМГ приводит к увеличению отношения апти-фактор Ха/ анти-фактор На активностей.

3. Использование биоспецифичного электрофореза позволяет быстро и качественно определить наличие комплексов между гепаринами и поликатионами (сульфат протамина, хитозаны с ММ 6-21 кДа и СД 61-93%) и наиболее активный антикоагулянт.

4. Сульфат протамина и хитозаны с ММ 16/21 кДа и СД 61/91% способны нейтрализовать специфическую антикоагулянтную активность образцов НМГ полученных с помощью гидролаз.

5. При подкожном введении некоторых полученных образцов НМГ кроликам период полувыведения сопоставим с периодом полувыведения фраксипарина при одинаковых дозах.

Апробация работы. Основные результаты и положения предлагаемой работы были представлены на Всероссийских и Международных съездах, конгрессах, симпозиумах, конференциях: Конгрессы Федерации Европейских биохимических обществ, Варшава (Польша) 2004, Будапешт (Венгрия) 2005, Афины (Греция) 2008; Вторая Европейская школа по биореологии, Варна (Болгария), 2006; 14 Конференция Европейского общества по клинической гемореологии и микроциркуляции, Дрезден (Германия), 2007; Международный конгресс: Тромбоз, гемостаз, патология сосудов, Санкт-Петербург, 2004; XI Национальный конгресс "Человек и лекарство", Москва, 2004; II Всероссийская конференция по клинической гемостазиологаи и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии, Москва, 2005; Первая международная научно-практическая конференция «Биологические и медицинские технологии: от научных результатов - к инновационным разработкам», Москва, 2005; Международная конференция "Гемореология в макро- и микроциркуляции", Ярославль, 2005; II Всероссийская конференция Всероссийской Ассоциации по изучению тромбозов, геморрагии и патологии сосудов им. А.А.Шмидта-Б.А.Кудряшова, Ярославль, 2005; Вторая Международная научно - практическая конференция «Перспективы развития биотехнологий в России», Пущино (Московская область), 2005; «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» РосХит, Казань, 2006 г; Третья Международная Научно-практическая Конференция Медбиотек «Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине», Москва, 2006; III съезд фармакологов России Фармакология -практическому здравоохранению, Санкт-Петербург, 2007; 3 Всероссийская конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии", Москва, 2007; III съезд фармакологов России Фармакология - практическому здравоохранению, Санкт-Петербург, 2007; IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008.

Структура н объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов исследования, их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 241 страницах. Список литературы содержит 439 ссылок.

Содержание работы Материалы и методы исследования

Исследовали влияние на свертывающую систему крови 61 образца гепаринов с ММ 1,6 - 9,0 кДа. Образцы низкомолекулярных и среднемолекулярных гепаринов получали в лаборатории инженерии ферментов Центра "Биоинжененрия" РАН и в лаборатории полимерных материалов Московского государственного текстильного университета им. А.Н.Косыгина. Образцы хитозанов с ММ 4-21 кДа и степенью дезацетилирования 61 - 93 % получали в лаборатории инженерии ферментов Центра "Биоинжененрия" РАН.

Влияние гепаринов на внутренний, внешний и общий пути свертывания крови оценивали, используя общепринятые тесты: время свертывания крови (Lee, 1913), время рекальцификации (Kennedy, 1973), активированное частичное тромбопластиновое время (Stuart, 1973), протромбиновое время (Liestil, 2002), тромбиновое время (Teien, 1975). Для определений применяли наборы отечественных (Ренам, Технология Стандарт) и зарубежных (Sigma, Biopool, Roche) фирм.

Специфическую антикоагулянтную активность гепаринов in vitro определяли по ингибированию фибриногепсвертывшощей и амцдолнтической активностям тромбина (антитромбиновая, анти-фактор lia, alla активность) (Teien, 1977) и фактора Ха (активность против фактора Ха, анти-фактор Ха, аХа активность) (Teien, 1976) в плазме человека и экспериментальных животных с использованием Международных стандартов гепаринов (NIBSC), основываясь на рекомендациях Российской Фармакопейной статьи и Европейской Фармакопейной статьи.

Комплсксообразование НМГ с поликатионами исследовали с использованием электрофореза. Ракетный биоспецифичный электрофорез (Drozd, 2001) растворов НМГ проводили в слое 1% агарозы в 0,1М Na-фосфатном буфере pH 6,8 толщиной 1 мм, содержащем сульфат протамина (Sigma) или хитозаны, на стеклянных пластинках. Нейтрализацию антикоагулянтной активности in vitro исследуемых образцов НМГ поликатионами проводили в тестах по ингибированию фибриногенсвертывающей или амидолитической активностей тромбина и фактора Ха (Racanelli, 1989; Toijemanea, 2007). Фармакологическую активность исследуемых образцов НМГ определяли при внутривенном или подкожном введениях кроликам или крысам. Фармакодинамические или фармакокинетические параметры оценивали, определяя антикоагулянтную активность плазмы в тестах активированного частичного тромбопластипового времени (АЧТВ) и с использованием набора РеаКлот-гепарин (НПО "Ренам") (Bates, 2005),. Крысам самцам Wistar весом 350-400 г в яремную вену вводили НМГ в дозах 39, 65, 104 и 390 аХа ЕД/кг.

Анти-IIa (Coyne, 1981) и аХа (Yin, 1973) активности плазмы крыс оценивали в разные интервалы времени после введения.

Кроликам образцы НМГ вводили внутривенно в дозах 0,3; 0,5; 0,8 и 3 мг/кг и подкожно в дозах 43 - 143 и 286 - 4980 аХа ЕД/кг, для сравнения в тех же дозах вводили фраксипарин (Sanofi Winthrop Industria). Кровь для исследования отбирали из краевой вены уха до введения и через 5, 15, 30, 60, 90,120, 180, 240 и 300 мин после внутривенного введения и через 60, 120, 180, 240, 300 мин и 24 час после подкожного введения. Анти-IIa и анти-Ха (Bates, 2005) активности плазмы кроликов оценивали в разные интервалы времени после введения. Для расчета фармакокинетических параметров (Drozd, 2001) данные представляли в виде полулогарифмических графиков выведения исследуемого вещества.

Фибринолнтнческую активность плазмы определяли с использованием набора НПО "Ренам" Реахром-Плазминоген (Christodoulides, 1990). Образцы НМГ вводили кроликам подкожно в дозах 3; 10; и 30 мг/кг 86 - 4980 аХа. Активность определяли по изменению оптической плотности раствора при длине волны 405 нм

Активность протеина С плазмы определяли с использованием набора НПО "Ренам" Реахром-Протеин-С (Баркаган, 2001). Образцы НМГ с ММ 5,4 и 4,7кДа (НМГ-5,4 и НМГ 4,7 кДа) вводили кроликам подкожно в дозах 3; 10; и 30 мг/кг 86 - 4980 аХа. Кровь для исследования отбирали из краевой вены уха до введения и через 60, 120, 180, 240, 300 мин и 24 час после введения. Активность определяли по изменению оптической плотности раствора при длине волны 405 нм.

Исследование антитромботнческои активности проводили на модели венозного стаза у крыс по Wessler и соавт. (Wessler, 1959). В эксперименте на белых крысах-самцах линии Wistar весом 250-350 г исследовали антнтромботическую активность образцов НМГ. Для наркоза внутрибрюшинно вводили нембутал в дозе 60 мг/кг лл 1 мл на 200 г веса животного. Образцы НМГ в объеме до 1 мл внутривенно вводили в левую яремную вену, в эту же вену, с целью подавления защитной реакции противосвертывающей системы, вводили раствор атропина сульфата в дозе 5 мг/кг. Для моделирования венозного тромбоза в противоположной яремной вене активировали свертывающую систему крови крыс сывороткой человека. Затем перевязывали нитью участок вены (0,5-0,7 см), которая не использовалась для введения веществ. Эффективность антитромботической активности оценивали: в баллах по форме тромба, извлеченного из перевязанного участка вены, по весу влажного тромба на аналитических весах, по концентрации белка в гомогенате тромба по Лоури (Lowry, 1951).

Геморрагическую активность НМГ определяли на крысах самцах Wistar весом 200250 г. Гемолиз эритроцитов проводили, добавляя к 10 мл дистиллированной воды салфетку,

извлеченную из-под кожи крысы. Через 2 ч, после полного гемолиза эритроцитов измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 540 им, определяя содержание гемоглобина по калибровочной кривой (Чевари, 1985).

Оценка значимости различий двух средних арифметических рядов экспериментальных данных проводили по ^критерию Стьюдента. Для определения связи между двумя признаками в рядах экспериментальных данных использовали корреляционный анализ (Айвазян, 1985). Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ Шоя1а1, ББРЭ, StagгapЫcsPlus.

Результаты и обсуждение.

Исследовали АК активность 21 образца НМГ [полученных с помощью гидролиза хитинолитическим ферментным комплексом Streptomyces kurssanovii (иммобилизованного и в растворе) НФГ из легких крупного рогатого скота и из слизистой оболочки кишечника свиней] с ММ от 1,6 до 7,4 кДа. Аибтитромбиновая активность достигала 141±П Ед/мг, активность против активированного фактора Ха 189±28 Ед/мг.

Отношения активностей аХа/а11а составили 1,12 - 4,72. На рисунке 2 показано, что величина аХа активности полученных НМГ в среднем превышает значение антитромбиновой активности, отношения активностей достигали значений 4,72 в основном за счет снижения антитромбиновой активности. У исходных НФГ антитромбнповая активность преобладала и отношение активностей аХа/а11а было ниже 1. Максимальное отношение активностей было у образца с ММ 1,6 кДа, но этот образец не прошел отбор по причине малой величины активностей (аХа 26±4 Ед/мг, alla 5,5±1,2 Ед/мг).

200,0

J ! i I à Й&-

IJW

I 100.0 | ------------------......-......—~......±.........................î.............-..........T-.....-.....------------------aîla, ЕД/МГ

I i £ f ^__—£ e>)X.l. ЕД/М,-

5 ! ——I §

£ ; Ш 26.o

0,0

0,0 2,0 4,0 5,0 8,0

Молекулярная масса образцов. кДа

Рисунок 2. Антитромбнповая активность (alla) и активность против активированного фактора Ха НМГ, полученных с помощью гидролиза хитинолитическим ферментным комплексом Streptomyces kurssanovii НФГ из легких крупного рогатого скота и из слизистой оболочки кишечника свиней

В результате деполимеризации хитинолитическим ферментным комплексом Streptomycess kurssanovii не было выявлено различий при использовании в качестве исходного продукта НФГ из легких крупного рогатого скота или НФГ из слизистой оболочки кишечника свиней. Гидролизаты исходных НФГ обладали высокими активностями до 179±17 аХа Ед/мг у образцов, полученных с помощью гидролиза гепарина из легких крупного рогатого скота и до 189±28 аХа Ед/мг нефракционированного гепарина из слизистой оболочки кишечника свиней. Важнее количество и состояние (раствор или иммобилизованный) ферментного комплекса, а также время действия и температурный режим. Образцы с наименьшей ММ получали путем деполимеризации иммобилизованным ферментным комплексом, но величина аХа и alla активностей и их отношение не зависели от состояния фермента.

Исследовали антикоагулянтную активность НМГ полученных с помощью гидролиза ферментами папайи, целловиридин, химотрипсин, протеаза С и лизоцим НФГ из легких крупного рогатого скота и из слизистой оболочки кишечника свиней. 27 полученных образцов НМГ показали высокие активности до 191 ±21 alla ЕД/мг и до 218±20 аХа Ед/мг. Отношение активностей достигало 2,52. У данных образцов наблюдали более значительную АК активность (alla и аХа активности), по сравнению с образцами, полученными с помощью ферментного комплекса Streptomyces kurssanovii, но как показано на рисунке 3 отношение активностей аХа/а11а в среднем ниже.

Рисунок 3. Аититромбиновая активность (alla) и активность против активированного фактора Ха НМГ, полученных с помощью гидролиза НФГ легких крупного рогатого скота и из слизистой оболочки кишечника свиней ферментными комплексами папапн, целловиридин, химотрипсин, протеаза С и лизоцим.

В результате оценки АК активности НМГ, полученных деполимеризацией НФГ ферментами папаин, химотрипсин, целловиридин и протеаза С не было выявлено достоверных различий при использовании в качестве исходного продукта гепарина из легких крупного рогатого скота или гепарина из слизистой оболочки кишечника свиней.

Практически все ферменты, используемые в исследовании, при оптимальных условиях гидролизовали исходные НФГ с образованием продуктов с аХа и alla активностями до 200 Ед/мг. У многих образцов (полученных с помощью гидролиза ферментным комплексом Streptomycess kurssanovii, протеаза С, целловиридин, папаин, химотрипсин) по сравнению с исходным НФГ аХа активность увеличивалась более чем на 10%. По всей вероятности, это указывает на то, что в процессе получения НМГ содержание высоко аффинных к AT молекул остается неизменным. Следовательно, не происходит разрушения антитромбинсвязывающей пентасахаридной последовательности, то есть, потери высокоаффинных участков (Alban, 2001). Отношение активностей aXa/alla увеличивается за счет снижения ММ образца, а, следовательно, и снижения alla активности при гидролизе протезой С, папаином, лизоцимом, ферментным комплексом Streptomycess kurssanovii. Причем, важными являются правильно подобранные условия гидролиза для каждого конкретного фермента.

Таблица 1. Характеристики образцов 1ШГ отобранных для исследования фармакодииамичсских параметров.

ММ, кДа Антикоагулянтная активность

alla, Ед/мг aXa, Ед/мг alla'aXa

4,7 68±8 155±23 2,28

5,4 наш 168±19 1,53

7,0 129±10 159±16 1,23

В результате исследования специфических активностей, для дальнейшей работы были отобраны образцы с ММ 4,7 кДа (НМГ- 4,7), полученный с помощью гидролиза НФГ ферментным комплексом &гер1отусгь$ кипзапогИ, низкомолекулярный гепарин с ММ 5,4 кДа (НМГ- 5,4), полученный с помощью гидролиза НФГ ферментным комплексом протеаза С, НМГ с ММ 7 кДа (НМГ-7,0), полученный гидролизом НФГ лизоцимом (табл. 1).

Более 180 сек

150

I юо

со 7

< 50

ж $ ё I

Доза,

.............мг/кг

»»0,3 & 0,5

...I......¿Л..И

: I

О 0,08, 0Д51 0,5 1 1,5 I 2 3 * { 5 I Время после введения, час :

200

150 160 140 120 100

г во | 60 г 40 20 О

более 180 секунд

■-------------------------------.................................-.Доза, * мг/кг

ко.з 00,5

......1 1 ¿1 | " вол I I .....•......... и

ВЩ 1 1!п,

О ! 0,0810,25 0,5 ' 1 ' 1,5 ! 2 { 3 I 1,111(11 Врвкя весла введевяя, час

Рисунок 4. Влияние НМГ-4,7 на время свертывании плазмы кроликов в тестс ЛЧТВ после внутривенного введения в дозах 0,3; 0,5; 0,8 и 3,0 мг/кг.

*- р<0,05- достоверность различий с точкой "до введения"; данные представлены как хср± стандартная ошибка среднего (п составляет 1015 кроликов)

Рисунок 5. Влияние НМГ-5,4 на время свертывания плазмы кроликов в тесте АЧТВ после внутривенного введения в дозах 0,3; 0,5; 0,8 н 3,0 мг/кг.

*- р<0,05- достоверность различий с точкой "до введения"; данные представлены как Хср± стандартная ошибка среднего (п составляет 10-15 кроликов)

Фармакодинамические исследования проводили на кроликах и крысах, при внутривенном и подкожном введении образцов.

\ 100 ;

I •"}■'

¿"1;.......1........1.....

¡180 ло !

Время после введения,

х 60 '

1 50

¡зо.......

I О-*

3 п

..................-.......МГ/КГ

Т . "г"г'

• 1 \ \ ■ В°'8

А А.........1.......1, •__________•

! 5.3 ■ 2 3

Время после введения, час

Рис. 6. Влияние НМГ-4,7 на время свертывания крови кроликов после внутривенного введения в дозах 0,3; 0,5; 0,8 и 3,0 мг/кг.

*- достоверность различий с точкой "до введения" (1,62±0,03 мин) р<0,05; данные представлены как хср± стандартная ошибка среднего (п составляет 10-12 кроликов)

Рис. 7. Влияние НМГ-5,4 на время свертывания крови кроликов после внутривенного введения в дозах 0,3; 0,5; 0,8 и 3,0 мг/кг

*- достоверность различий с точкой "до введения" (1,6±0,03 мин) р<0,05; данные представлены как хср± стандартная ошибка среднего (п составляет 10-17 кроликов)

При внутривенном введении НМГ-4,7 и 5,4 время свертывания плазмы кроликов в тесте АЧТВ (рис. 4 и 5) и время свертывания крови (рис. 6 и 7) достоверно отличались от показаний «до введения» в течение 5-тп часов после введения. Антитромбиновая и аХа активности плазмы кроликов достоверно исчезали ко 2-му и 3-му часам, соответственно.

Таблица 2. Аити-фактор Ха активность плазмы кроликов, после подкожного введения

аитикоагулянтов

АК доза, Время после введения, час

аХа ЕД/кг 1 2 3 4 5 24 36 48

ФН 1300 2,72± 0,33 *3 3,14± 0,27*3 3,63± 0,23*3 3,53± 0,53*3 3,52± 0,6*3 0,25± 0,0б*2 0,07 ±0,01* 0

2500 з,1± 0,25*3 3,15± 0,30*3 3,47± 0,29*3 3,6± 0,24*3 3,73± о,зо*3 0,35± 0,26*2 0,09 ±0,01* 0

3320 3,3± 0,27*3 4,2± 0,33 *3 4,25± 0,22*3 4,25± 0,5*3 4,29± 0,44*3 0,5 8± 0,08*2 0,15 ±0,09* 0

4150 3,8± 0,32*3 4,53± 0,37*3 4,49± 0,68*3 4,53± 0,54*3 4,6б± 0,72*3 0,78± 0,09*2 0,22 ±0,04*2 0

4980 4,0± 0,6*3 4,67± 0,82*3 4,71± 0,55*3 4,76± 0,23*3 4,85± 0,34*3 0,97± 0,07*2 0,25 ±0,05*2 0

НМГ-5,4 1300 2,69± 0,13*3 3,0± 0,26*3 3,33± 0,42*3 3,41± 0,39*3 3,47± 0,45*3 0,22± 0,04*2 0,03 ±0,01* 0

2500 2,94± 0,26*3 3,3 5± 0,41 *3 3,72± 0,4*3 3,59± 0,53*3 3,82± 0,38*3 0,47± 0,06*2 0,1 ±0,05*: 0

3320 3,3 8± 0,42*3 4,02± 0,37*3 4,11± 0,28*3 4,15± 0,29+3 4,37± 0,39*3 0,62± 0,04*2 0,19 ±0,05*2 0

4150 3,63± 0,44*3 4,42± 0,29*3 4,2± 0,37*3 4,03± 039*з 4,61± 0,29*3 0,88± 0,07*2 0,23 ±0,03*2 0

4980 3,81± 0,29*3 4,72± 0,51 *3 4,6± 0,48 *3 4,85± 0,36*3 4,9± 0,39*3 1,0± 0,23*2 0,27 ±0,06*2 0

НМГ-4,7 3320 2,72± 0,25*3 3,14± 0,34*3 3,63± 0,35*3 3,53± 0,34*3 3,52± 0,32*3 0,25± 0,032 *2 0±0 0

4150 2,94± 0,33 *3 4,42± 0,51*3 4,6± 0,49*3 4,85± 0,43 *3 4,61± 0,45 *3 0,2± 0,01 *2 0±0 0

4980 2,81± 0,31*3 4,б9± 0,43 *3 4,2± 0,49*3 4,03± 0,38*3 6,24± 0,55*3 1,18± 0,2 *3 0,29± 0,04 *2 0

3320 ЕД/кг - 20 мг/кг; 4150 ЕД/кг - 25 мг/кг; 4980 ЕД/кг - 30 мг/кг;

ФН- фраксииарин; АК -антикоагулянты; * - р<0,05; *2 - р<0,01; *3 - р<0,001 - достоверность

различий с точкой "до введения"; данные представлены как хср± стандартная ошибка среднего (п = 10); до введения аХа активность плазмы составила 0 ЕД/мл

При подкожном введении НМГ-4,7 и 5,4 кДа антитромбиновая и аХа активности плазмы исчезали более чем через 36 часов после введения (рис. 86; 8в и табл.2). Такие же показатели наблюдали у коммерческого НМГ фрассипарина (рис. 8а, табл. 2).

При сопоставимых дозах в аХа единицах, отношение активностей aXa/alla в плазме составило для фраксипарина от 1,8 до 3,5, для НМГ-4,7 от 2 до 4 за период от 1 до 5 час после введения. Антитромбиновая активность плазмы, аХа активность плазмы и продолжительность эффекта были сопоставимы после введения у сравниваемых антикоагулянтов. Наблюдаемый фармакодинамический профиль выведения НМГ-4,7 и НМГ-5,4 по антитромбиновой, аХа активностям плазмы и времени свертывания плазмы в тестах ВСК и АЧТВ соответствует фармакодинамическим профилям НМГ эноксапарина (Chen, 2002).

Для НМГ-4,7 отношение специфических активностей aXa/alla равно 2,3. Отношение активностей aXa/alla плазмы при внутривенном введении НМГ-4,7 возрастало с увеличением дозы с 1,33 до 2,09. Отношение активностей aXa/alla плазмы при подкожном введении НМГ-4,7 возрастало с увеличенитем дозы с 2,28 до 4,00; при введении фраксипарина - с 1,80 до 3,50. Отношение специфических активностей aXa/alla для НМГ-5,4 составляет 1,53. Отношение активностей при подкожном введении НМГ-5,4 достигало 2,0.

Возрастание величины отношения активностей aXa/alla при подкожном введении НМГ может свидетельствовать о влиянии этого антикоагулянта, например, на выброс из эндотелия сосудов ингибитора внешнего пути свертывания (TFPI); известно, что уровень TFPI в плазме повышается в 2-4 раза при подкожном или внутривенном введении НФГ и НМГ (Demirkan, 2002; Hoppensteadt, 1995). TFPI один из главных регуляторов внутреннего пути свертывания крови. Имеет способность ингибировать фактор Ха (Xin, 1999), что и объясняет возрастание отношения активностей aXa/alla по сравнении с исследованиями in vitro.

Бреня после введения, нив

Рис. 8а. Антитромбиновая активность плазмы кроликов после подкожного введения фраксипарина в дозах 286, 350, 571, 700, 857, 3320, 4150 и 4980 ЕД/кг ; *-

р<0,05 - достоверность различий с точкой "до введения"; данные представлены как хср± стандартная ошибка среднего (п = 10 -15)

"Доза, Ед/кг

время после введения, кия

3 Г -......................................-........-.....................................................-

.....,..................""..................Доза,

Т____________________________________ЕД/кг

............................................03320

jj —----------------------------□«SO

t « .__„ _,__ _ ■'1ЭЗ®

t,M,..............

И ! 2 ! 5 ; 4 i 5 24 I 36 ! 48 ; Время после ведения, час

Рис. 86. Антитромбиновая активность плазмы кроликов после подкожного введения НМГ-5,4 в дозах 286, 350, 571, 700, 857, 1300, 2500, 3320, 4150 и 4980 ЕД/кг ; *- р<0,05 - достоверность различий с точкой "до введения"; данные представлены как хср± стандартная ошибка среднего (п = 10 -15)

Рис. 8в. Антитромбнновая активность плазмы кроликов после подкожного введения НМГ-4,7 в дозах 3320 (20 мг/кг), 4150 (25 мг/кг) и 4980 (30 мг/кг) ЕД/кг; * - р<0,05 - достоверность различий с точкой "до введения"; данные представлены как хср± стандартная ошибка среднего (п = Ю);

НМГ-4,7 и НМГ-5,4 при подкожном введении кроликам в дозе 30 мг/кг достоверно снижали активность протеина С плазмы (рис. 9 и 10) кроликов, вероятно, способствуя выбросу в кровяное русло ингибитора активатора протина С (1'Cl). РС1 - песпсцнфический, гепарнн-связывающий ингибитор сериновых протеиназ (серпин). Целевые протеазы,

Время после введения, час Рис. 9. Влияние подкожного введения НМГ-4,7 в дозах 3, 10 и 30 мг/кг на активность протеина С плазмы кроликов.

* - р<0,05 - достоверность различий с контролем; п=10

°'04 !о'~Т]......V.......г'з".......Г.....Г!.....Тй4

I Время после введения, час

Рис. 10. Влияние подкожного введения НМГ-5,4 в дозах 3, 10 и 30 мг/кг на активность протеина С плазмы кроликов.

* - р<0,05 - достоверность различий с контролем; п=10

которые PCI ингибирует, включают активированный протеин С (АРС), тромбин, урокиназу (иРА), калликреины (Malleier, 2006). Гепарин увеличивает скорость взаимодействия PCI с большинством протеаз. Nishioka и др. (Nishioka, 1998) показали, что PCI связывается с фосфагидилэтаноламином, и что РС1 эффективно ингибирует фосфолипид-связанный аРС.

НМГ-4,7 и НМГ-5,4 при подкожном введении кроликам в дозе 30 мг/кг достоверно увеличивали активность плазминогена, которая к 24 часам после введения восстанавливалась до исходных значений (рис. 11 и 12). Скорее всего, увеличение активности плазминогена происходила за счет увеличения скорости формирования плазмина. По литературным данным гепарин увеличивает скорость формирования плазмина, опосредованную t-PA и иРА [312,344]. А также возможно снижением количества РА1-1. Некоторые авторы (Shalïq, 2006) отмечают снижение в 1,5-2 раза количества PAI-1 при подкожном введении НМГ -надропариц, дельтапарин, эноксапарин.

Рис. 11. Влнянне подкожного введения НМГ-4,7 в дозах 3, 10 н 30 мг/кг на активность плазминогена плазмы кроликов.

* - р<0,05 - достоверность различий с контролем; п=10.

НМГ-5,4 в дозах 3, 10 и 30 мг/кг на активность плазминогена плазмы кроликов.

* - р<0,05 - достоверность различий с контролем; п=10.

НМГ-4,7 и НМГ- 5,4 в одинаковой степени и также эффективно, как и фраксипарин, препятствуют развитию экспериментального тромбоза у крыс. Такие показатели как: форма тромба в баллах, вес влажного тромба, содержание бежа при дозах от 39 до 390 Ед/кг у НМГ-4,7 и НМГ- 5,4, сопоставимы с такими же показателями для фраксипарина (табл. 3 и 4).

Таблица 3. Антитромботический эффект НМГ-4,7 и фраксипарпна на модели венозного стаза у крыс.*

вещество Доза, Форма Вес [белок], аПа ЕД/мл аХа, ЕД/мл

аХа тромба, влажного мкг/мл

ЕД/кг балл тромба, мг

НМГ 39 3,4±0,2 7,6±1,0 131±11 0,21 ±0,02* 0,21 ±0,01 *

65 3,0±0,6* 3,7±0,6* 81±12* 0,29±0,04 * 0,36±0,06 *

104 0,9±0,4* 2,3±0,3* 70±16* 0,61 ±0,12 * 0,80±0,05 *

390 0±0* 1,4±0,3* 39±7* 0,98±0,16 * 1,20±0,07 *

ФН 39 3,6±0,4 8,3±1,2 133±9 0,12±0,05 * 0,09±0,01 *

65 3,2±0,5* 3,7±0,5* 86А15* 0,23±0,06 * 0,33±0,05 *

104 1,4±0,5* 2,6±0,4* 75±18* 0,57±0,10 * 0,84±0,07 *

390 0±0* 1,1±0,3* 28±9* 0,94±0,13 * 1,14±0,10 *

контроль 3,9±0,1 9,8±1,8 139±8 0±0 0±0

Таблица 4. Антитромботический эффект НМГ 5,4 кДа и фраксипарпна па модели венозного стаза у крыс*

вещество Доза, ЕД/кг Форма тромба, балл Вес влажного тромба, мг [белок], мкг/мл аПа", ЕД/мл аХал, ЕД/мл

НМГ 43 3,1±0,1 8,1±0,9 125±9 0,11±0,03* 0,17±0,06 *

71 2,7±0,5* 4,6±0,7* 78±11* 0,31±0,02 * 0,33±0,04 *

143 0,9±0,1* 2,8±0,5* 65±10* 0.55±0,07 * 0,77±0,06 *

390 0±0* 1,3±0,5* 24±5* 0,86±0,09 * 1,22±0,12 *

ФН 43 3,5±0,5 8,3±1,0 122±10 0,14±0,04 * 0,15±0,02 *

71 3,0±0,4* 4,0±0,7* 86±15* 0,27±0,05 * 0,35±0,03 *

143 1,1±0,6* 2,7±0,6* 61±9* 0,52±0,09 * 0,81±0,09 *

390 0±0* 1,4±0,6* 27±8* 0,91±0,15 * 1,19±0,11 *

контроль 3,8±0,2 9,6±1,5 125±7 0±0 0±0

* Примечание: ФН - фраксипарин; контроль - крысы, вместо НМГ получившие эквивалентный объем физиологического раствора; п=20; *- р<0,05; - достоверность различий с контролем; данные представлены как хср± стандартная ошибка среднего.

По всей вероятности, НМГ-4,7 и НМГ-5,4 обладают сравнимой антитромбогической активностью в силу того, что НМГ-4,7 имеет меньшую величину специфических активностей, но большее соотношение активнотей аХа/а11а, а НМГ-5,4 - большую величину специфических активностей, но меньшее соотношение активностей аХа/а11а. Зависимый от дозы НМГ антитромботический эффект отмечен в исследовании Л и соавторов на модели артериального тромбоза у крыс (11, 1999).

Низкомолекулярные гепарииы с ММ 4,7; 5,4 кДа и фраксипарин имеют сравнимую геморрагическую активность (рис. 13 и 14). воп^ и соавторы показали, что НФГ и НМГ имеют сравнимую геморрагическую активность (йогс^ и соавт., 2004).

36 | 65 ! 104 1390 I Доза, Ед/кг

43 ¡71 i 143 ! Доза, Ед/кг !

Рис. 13. Геморрагическая активность НМГ-4,7

Контроль - крысы, получившие эквивалентный объем физиологического раствора (п=20); * - р<0,05 - достоверность различий с контролем.

Рис. 14. Геморрагическая активность НМГ-5,4

Контроль- крысы, получившие эквивалентный объем физиологического раствора (п=20); * - р<0,05 - достоверность различий с контролем.

Традиционно, сульфат протамина (СП) используют для нейтрализации АК активности НФГ или НМГ.

Каждый из исследованных в данной работе НМГ может образовывать комплексы с классическим для гепаринов антидотом - сульфатом протамина. Это подтверждается появлением преципитатов, перемещающихся в электрическом поле. В результате чего появляются пики преципитации или "ракетки" (рис. 15 А), аналогичные пикам преципитации, которые получаются при проведении иммуноэлектрофореза. Анализируя связь между размерами пиков преципитации и антикоагулянтной активностью, можно предположить успешное использование этого метода при скрининге большого количества сульфатированных полисахаридов различного происхождения для быстрого выбора

наиболее активных образцов, так как отмечали сильную положительную корреляцию между степенью сульфатирования и АК активностью/размерами пиков преципитации.

Антитромбиновую активность образца НМГ с ММ 7,0 кДа (гидролиз лизоцимом) ш vitro в плазме человека нейтрализовал классический антидот сульфат протамина в весовом соотношении примерно 1:1, несмотря на сообщения о том, что ПС из-за сниженного заряда молекулы НМГ, не будет нейтрализовать его активность (Crowther, 2002). Полной

,-. А ,, !

tu А А /Ц Ut a i\ \ %

la lb 2а 2b За 3b 4a 4b la 5a 5b 6a 6b

f\ Л /•) Л A

/ i л / /I / t \ U A A '

• /1 / / / - M /1 • 4 ( Ai f / . I u\k-\t. 1 ; I 3

3b 3a 6b 6a lb la 4b 4a 5b 5a 2b

Рис. 15. Бноспсцифичный электрофорез ннзкомолскулярных гепарннов в агарозном геле с сульфатом протамина (А) и хптозаном (ММ 16 кДа, СД 91%; В)

НМГ и НФГ (а-1,25 мкг, Ь-2,5 мкг) добавляли в 3-4 мм лунки, вырезанные в 1% геле агарозы. Электрофорез проводили при градиенте 10 В/см в 0,02 М веропал-медипаловом буфере рН 8,6. Через 2 часа пластины с гелем окрашивали 0.1% раствором альцианового синего. Пластины с высохшим гелем сканировали и измеряли пики преципитации в формате jpg.

1- НФГ 15 кДа; 2- 5,1 кДа; 3- 7,4 кДа; 4- 4,7 кДа; 5- 4,0 кД; 6-2,7 кДа.

нейтрализации alla активности добиться не удалось, максимальное снижение активности составило 80 % (рис. 17). Результаты практически идентичны итогам нейтрализации НФГ, снижение антитромбиновой активности также на 80 % (рис. 16). Хотя по литературным данным alla активность НФГ нейтрализуется полностью (Okajima, 1981; Matsuo, 1983).

Неполную нейтрализацию alla активности можно объяснить тем, что ПС самостоятельно влияет на alla активность плазмы, что показано на рисунке 16 и 17.

> 0.3 i

| 0.6 I "

f 0,4 j~

0.2 f -

о L

Кон^чцнцнн ЦФГ.

00.000125 Eo.ttws

Do,00034 ■ 0.0005

0,0(017 | 0.0025 ! 0,0X25 0 00034 ] 0,000s i 1 1 ! Концентрация ПС, мг/мл

___________ __________________

J ài il il

'00,00017

So.0002

&.OOOÎ5 О.0003Й

q 0,000170,0002 0,00025 0,00034 0,0005 ........Концентрация ПС, мг/мл

Рис. 16. Нейтрализация сульфатом иротамина антитромбииовой

активности НФГ в тесте АЧТВ

* р<0,05 - достоверность различий с показаниями без антидота

Рис. 17. Нейтрализация сульфатом иротамина антитромбииовой

активности НМГ-7,0 в тесте АЧТВ

* р<0,05 - достоверность различий с показаниями без антидота

Из образцов хитозанов, которые исследовали на способность нейтрализовать alla активность плазмы крови человека в тесте АЧТВ наибольшего внимания заслуживает образец с маркировкой Х6 (с ММ 21 кДа и степенью дезацетилировання 61%). В конечных концентрациях 0,001 и 0,0001 мг/мл хитозан достоверно снижал антитромбиновую активность НМГ с ММ 7,0 кДа (гидролиз лизоцимом) при весовом соотношении поликатион; полианион=1,0:3,3 (т.е. хитозана требовалось в 3,3 раза меньше, однако, только при концентрации хитозана 0,0001 мг/мл) (рис 18). Но при возрастании концентрации хитозана наблюдали увеличение alla активности плазмы, это можно объяснить тем, что некоторые хитозаны влияют на процесс свертывания крови (Huang, 2003; Vikhoreva, 2005).

Рис. 18. Влияние хитозана Х6 на антитромбиновую активность плазмы с НМГ-7,0, в тесте АЧТВ

* р<0,05 - достоверность различий с показаниями без антидота

Таким образом, деполимеризация НФГ из легких крупного рогатого скота или слизистой оболочки кишечника свиней посредством неспецифических гидролаз приводит к получению образцов НМГ с высокими специфическими alla и аХа активностями до 150 -200 ЕД/мг, что сравнимо со специфическими антикоагулянтными активностями коммерческих НМГ. Уменьшение молекулярной массы НМГ приводит снижению alla активности и увеличению отношения активностей анти-фактор Ха/ анти-фактор На до 4. Использование биоспецифичного электрофореза позволяет определить наличие комплексов между гспаринами и сульфатом протамина/хитозанами с ММ 6-21 кДа и степенью дезацетилирования 61-91%,. Специфическую антикоагулянтную активность образцов НМГ можно успешно нейтрализовать с помощью сульфата протамина. Обнаружен образец хитозана, способный частично (на 42%) нейтрализовать антитромбиновую активность НМГ (в весовом соотношении 1:3). При подкожном введении некоторых полученных образцов НМГ кроликам период полувыведения сопоставим с периодом полувыведения фраксипарина при одинаковых дозах.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показана возможность деполимеризации Na+ и Са++ солей нефракционированых гепаринов из легких крупного рогатого скота и из слизистой оболочки кишечника свиней с помощью иммобилизованного и в растворе ферментного комплекса Streptomyces kurssanovii с получением низкомолекулярных образцов с меньшей антитромбиновой активностью и отношением аХа /alla активностей 1,5-4,4.

2. Впервые показана способность ферментов папанн, целловиридин, химотрипсин, протеаза С и лизоцим гидролизовать НФГ из легких крупного рогатого скота и из слизистой оболочки кишечника свиней с получением НМГ, у которых отношение активностей аХа /alla достигает 1,5 - 2,52; при гидролизе НФГ применяли ферменты, никогда в этих целях не использовавшиеся

3. Показано, что специфическая антикоагулянтная активность образцов НМГ полученных деполимеризацией НФГ из легких крупного рогатого скота, не отличается от специфической антикоагулянтной активности образцов НМГ, полученных деполимеризацией НФГ из слизистой оболочки кишечника свиней.

4. Разработан эффективный, быстрый и качественный способ фиксирования комплексов между гспаринами и поликатионами (сульфат протамина, хитозаны с ММ 6-21 кДа и степенью дезацетилирования 61 - 93 %), позволяющий вычленять из ряда анализируемых гепаринов образцы с наибольшей антитромбиновой активностью.

5. Показана способность сульфата протамина нейтрализовать ингибирование образцами НМГ амидолитической активности тромбина на 90-100% и фактора Ха на 100% (в зависимости от ММ гепарина); показана способность сульфата протамина нейтрализовать удлинение образцами НМГ времени появления фибринового сгустка в тесте АЧТВ на 80 %.

6. Показано, что фармакодинамические параметры НМГ с ММ 5,4 кДа (гидролиз НФГ протеазой С), НМГ с ММ 4,7 кДа (гидролиз ферментным комплексом Streptomyces kurssanovii) при внутривенном (0,3; 0,5; 0,8 и 3 мг/кг) и подкожном (43 - 143 ЕД/кг и 286 -4980 аХа ЕД/кг) введениях сопоставимы с фармакодинамическими параметрами фраксипарина; соотношение aXa/alla активностей плазмы кроликов при подкожном и внутривенном введениях образцов НМГ с ММ 5,4 кДа (гидролиз НФГ протеазой С) и НМГ с ММ 4,7 кДа выше отношения специфических активностей in vitro.

7. НМГ 5,4 и НМГ 4,7 в одинаковой степени и также эффективно, как фраксипарин, препятствуют развитию экспериментального тромбоза у крыс; геморрагическая активность НМГ 5,4 и 4,7 сравнима с таковой для фраксипарина; НМГ-4,7 и НМГ-5,4 при подкожном введении кроликам снижают активность протеина С плазмы кроликов; НМГ-4,7 и НМГ-5,4 при подкожном введении кроликам достоверно увеличивают активность плазминогена.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Дрозд H.H. Антикоагулянтная активность низкомолекулярных гепаринов, полученных с помощью комплекса гидролаз / Дрозд H.H., Толстенков A.C., Банникова Г.Е., Мифтахова Н.Т., Лапикова Е.С., Макаров В.А., Варламов В.П. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2007 - Т.70.- №6,- С. 19-24.

2. Дрозд H.H. Антикоагулянтная активность оригинальных синтетических производных пептидов // Дрозд H.H., Толстенков A.C., Макаров В.А., Мифтахова Н.Т., Воюшина Т.Л., Сергеев М.Е. / Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008 -Т. 145.- № 1,- С.57-60.

3. Дрозд H.H. Взаимодействие хитозанов с низкомолекулярными гепаринами / Дрозд H.H., Толстенков A.C., Банникова Г.Е., Столбушкина П.П., Макаров В.А., Варламов В.П., Вихорева Г.А. // Материалы II всероссийской конференции по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии. - М. 2005,- С.98-99.

4. Дрозд H.H. Влияние внутривенного введения сульфатированного галактоманнана на антикоагулянтую активность плазмы крыс/ Дрозд H.H., Макаров В.А., Толстенков A.C., Лапикова Л.С., Мифтахова Н.Т., Местечкина Н.М., Щербухин В.Д., Ильина A.B., Варламов В.П.// Патологическая физиология и экспериментальная терапия. -2008 - №3.- С.20-23.

5. Дрозд H.H. Влияние низкомолекулярного гепарина, полученного с помощью хитинолитического комплекса на антикоагулянтную активность плазмы кроликов и крыс. / Дрозд Н.Н, Толстенков A.C., Макаров В.А., Мифтахова Н.Т., Банникова Г.Е., Суханова П.П., Варламов В.П, Вихорева Г.Е. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2007 - Т.70.- №2,- С.40-44.

6. Дрозд H.H. Ингибирование фукоиданом из бурой водоросли Laminaria saccharina активности тромбина и фактора Ха / Дрозд H.H., Лапикова Е.С., Давыдова А.И., Толстенков A.C., Ильина A.B., Устюжанина Н.Е., Макаров В.А., Варламов В.П., Билан М.И., Усов А.И. , Нифантьев Н.Э. // Материалы "IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов". - Новосибирск 2008. - С.345.

7. Дрозд H.H. Связь между молекулярной массой сульфатированных полисахаридов из морских водорослей и их антикоагулянтной активностью / Дрозд H.H., Толстенков A.C., Кшотина М., Банникова Г.Е., Макаров В.А., Варламов В.П., Кузнецова Т.А., Беседнова H.H., Звягинцева Т.Н.// Материалы Международной конференции "Гемореология в макро- и микроциркуляции". - Ярославль 2005.- С.45-46.

8. Дрозд H.H. Сульфатированные полисахариды антикоагулянтная активность / Дрозд H.H., Макаров В.А., Толстенков A.C., Лапикова Е.С., Варламов В.П, Ильина А.И, Лопатин С.А., Нифантьев Н.Э., Устюжанина Н.Е., Усов А.И., Билан М.И., Местечкина Н.М.// Материалы III съезд фармакологов России Фармакология практическому здравоохранению «Психофармакология и биологическая наркология». - Санкт-Петербург 2007. - Т.7.- Ч.1.- С. 1679.

9. Дрозд H.H. Фармакодинамические параметры аптикоагулянтов на основе сульфатированных полисахаридов из морских водорослей / Дрозд H.H., Толстенков A.C., Макаров В.А., Кузнецова Т.А., Беседнова Н.Н, Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - Т.7. - № 10. - С.36-37.

10. Дрозд H.H. Фармакодинамические параметры антикоагулянтов на основе сульфатированных полисахаридов из морских водорослей / Дрозд H.H., Толстенков A.C., Мигаль И., Киютина М., Банникова Г.Е., Макаров В.А., Варламов В.П., Кузнецова Т.А., Беседнова H.H., Звягинцева Т.Н. // Материалы XII Всероссийской конференции Всероссийской Ассоциации по изучению тромбозов, геморрагий и патологии сосудов им. A.A. Шмидта-Б.А. Кудряшова. "Тромбы, кровоточивость и болезни сосудов". - Ярославль 2005.- №3.- С.32-34.

П.Лапикова Е.С. Антикоагулянтная активность фукоидана из бурых водорослей Fucus evanescens / Лапикова Е.С. , Толстенков A.C., Дрозд H.H., Макаров В.А., Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н. // Материалы III всероссийской научной конференции по клинической гсмостазиологии и гсморсологии в сердечно-сосудистой хирургии. -Москва 2007,-С.122-123.

12. Макаров В.А., Антикоагулянтная активность сульфатированных полисахаридов /Макаров В.А., Дрозд Н.Н., Толстенков А.С., Варламов В.П., Ильина А.И., Лопатин С.А., Нифантьсв Н.Э., Устюжанина Н.Е., Усов А.И., Билан М.И., Местечкина Н.М. // Материалы Трс. " Международной Научно-практической Конференции МЕДБИОТЕК «Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине». - Москва 2006.- С.136.

13. Местечкина Н.М. Антикоагулянтная активность низкомолекулярных сульфатированных производных галактоманнана семян cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub. / Местечкина H.M., Щербухин В.Д., Банникова Г.Е., Варламов В.П., Дрозд Н.Н., Толстенков А.С., Макаров В.А., Тихонов В.Е. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2008 - Т.44.-№1.- С.111-116.

14. Толстенков А.С. Биоспецифичный электрофорез комплексов между низкомолекулярными хитозанами и гепаринами / Толстенков А.С., Дрозд Н.Н., В.А.Макаров, Г.Е.Банникова, Варламов В.П. // Материалы конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана»,- Казань 2006,- С. 253-256.

15. Толстенков А.С. Влияние галактоманнана из семян Tetragonoloba (L.) taub. на антикоагулянтную активность плазмы крыс при внугривенном введении / Толстенков А.С., Дрозд Н.Н., Лапикова Е.С., Макаров В.А. Местечкина Н.М., Банникова Г.Е., Ильина А.В., Варламов В.П. // Материалы III всероссийской научной конференции по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии. -Москва 2007. - С.242-243.

16. Tolstenkov A.S. Anticoagulant properties of glycosaminoglycan low molecular weight heparin that was prepared by depolymerization with enzyme complex streptomyces kursanovii / Tolstenkov A.S., Lapikova E.S., Drozd N.N., Makarov V.A., Varlamov V.P.// FEBS Journal. - 2008- V.275.- №1,- P.247.

17. Tolstenkov A.S. Glycosaminiglycan chitosan and it's ability to neutralize anticoagulant activity of a low molecular weight heparins / Tolstenkov A.S., Drozd N.N., Makarov V.A., Bannikova G.E., Varlamov V.P.// 2-nd Eurosummer school on biorheology and symposium on micro mechanobiology of cells, tissues and systems. - Varna, Bulgaria 2006,- PI 1.

ТслстенЕОв Александр Сергеевич

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 23.09.2009 г. Формат 60x90,1/16. Объем 1.5п.л. Тираж 60 экз. Заказ №1415

Отпечатано в ООО "Фирма Блок" 107140, г. Москва, ул. Краснопрудная, вл.13. т. (499) 264-30-73

www.firmablok.ru Изготовление брошюр, авторефератов, печать и переплет диссертаций.

Оглавление диссертации Толстенков, Александр Сергеевич :: 2009 :: Старая Купавна

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Современные антикоагулянтные средства.

1.2. Антикоагулянтная активность сульфатированных полисахаридов.

1.3. Гепарин.

1.3.1. Биосинтез гепарина.

1.3.2. Выделение гепарина.

1.3.3. Строение и антикоагулянтная активность гепарина.

1.3.4. Деполимеризация гепарина.

1.3.5. Нейтрализация антикоагулянтной активности гепарина.

2. Материалы и методы.

3. Результаты.

3.1. Антикоагулянтная активность фракций низкомолекулярного гепарина (НМГ) фирмы «Selsus lab».

3.2. Антикоагулянтная активность НМГ, полученного экструзионной деполимеризацией нефракционированного гепарина (НФГ).

3.3. Антикоагулянтная активность НМГ, полученных с помощью ферментативных способов гидролиза нефракционированпых гепаринов.

3.3.1. Антикоагулянтная активность НМГ, полученных с помощью гидролиза

НФГ ферментным комплексом Streptomycess kurssanovii.

3.3.1.1. Антикоагулянтная активность НМГ, полученных с помощью гидролиза иммобилизованным ферментным комплексом Streptomycess kurssanovii НФГ из легких крупного рогатого скота (Московский эндокринный завод).

3.3.1.2. Антикоагулянтная активность НМГ, полученных с помощью гидролиза иммобилизованным ферментным комплексом Streptomycess kurssanovii НФГ из кишечника свиней (Changzhou quianhong bio-pharm со Ltd, Китай).

3.3.1.3. Сравнение ангикоагулянтной активности Са+3 модификацикаций НФГ (ОАО "Белмедпрепарат") из легких крупного рогатого скота и его гидролизованиых с помощью ферментного комплекса Streptomycess kurssanovii фракций.

3.3.1.4. Антикоагулянтная активность гидролизатов разных по времени партий НФГ (Changzhou quianhong bio-pharm со Ltd, Китай) из слизистой оболочки кишечника свиней, полученных ферментативной деполимеризацией.

3.3.1.5. Влияние НМГ-4,7 кДа на генерацию тромбина in vitro.

3.3.2. Антикоагулянтная активность образцов НМГ, полученных с помощью гидролиза НФГ ферментным комплексом препарата Протеаза С.

3.3.2.1. Антикоагулянтная активность НМГ. полученных с помощью гидролиза НФГ (ООО '"Синтез") из легких крупного рогатого скота.

3.3.2.2. Антикоагулянтная активность НМГ, полученных с помощью гидролиза НФГ (АО «Синтез») из легких крупного рогатого скота иммобилизованной Протеазой С в разных соотношениях.

3.3.3. Антикоагулянтная активность образцов НМГ, полученных с помощью деполимеризации НФГ гидролазами.

3.3.3.1. Антикоагулянтная активность образцов НМГ. полученных с помощью деполимеризации НФГ (ОАО "Белмедпрепарат") из легких крупного рогатого скота папаином, целловиридином, химотрипсином.

3.3.3.2. Антикоагулянтная активность НМГ с ММ 3,4; 4,1 и 5,1 кДа, полученных с помощью гидролиза химотрипсином в растворе НФГ (Changzhou quianhong bio-pharm со Ltd, Китай) из слизистой оболочки кишечника свиней.

3.3.3.3. Антикоагулянтная активность НМГ, полученных с помощью гидролиза иммобилизованным химотрипсином НФГ (Changzhou quianhong bio-pharm со Ltd, Китай) из слизистой оболочки кишечника свиней.

3.3.3.4. Антикоагулянтная активность НМГ. полученных гидролизом папаина НФГ (Changzhou quianhong bio-pharm со Ltd, Китай) из слизистой оболочки кишечника свиней.

3.3.3.5. Антикоагулянтная активность НМГ, полученных с помощью гидролиза иммобилизованным папаином НФГ (ОАО "Белмедпрепарат") из легких крупного рогатого скота.

3.3.4. Антикоагулянтная активность НМГ, полученных деполимеризацией НФГ лизоцимом.

3.3.4.1. Антикоагулянтная активность НМГ, полученных деполимеризацией НФГ (ОАО "Белмедпрепарат") и его Са +2 модификации с помощью лизоцима.

3.3.4.2. Сравнение антикоагулянтной активности НМГ, полученных гидролизом лизоцимом и ферментным препаратом Протеаза С НФГ (ОАО "Белмедпрепарат").

3.3.4.3. Антикоагулянтная активность НМГ, полученных гидролизом НФГ (ОАО "Белмедпрепарат") иммобилизованным лизоцимом и лизоцимом в растворе.

3.4. Влияние НМГ-7,0 кДа (гидролиз лизоцимом) и НМГ-9,0 кДа (гидролиз ферментным комплексом Протеаза С) на агрегацию тромбоцитов человека in vitro.

3.5. Исследование образования комплексов между полианионами НМГ и поликатионами.

3.5.1. Биоспецифичиый электрофорез комплексов НМГ (полученных гидролизом НФГ ферментным комплексом Streptomycess kurssanovii) с поликатионами.

3.5.2. Биоспецифичный электрофорез комплексов НМГ (полученных гидролизом НФГ ферментным комплексом Протеаза С) с сульфатом протамина.

3.5.3. Нейтрализация антикоагулянтной активности образцов НМГ.

3.5.3.1. Нейтрализация антитромбиновой активности НМГ в тесте АЧТВ.

3.5.3.2. Нейтрализация сульфатом протамина ингибирования гепаринами амидолитической активности тромбина.

3.5.3.3. Нейтрализация ингибирования гепаринами амидолитической активности фактора Ха сульфатом протамина.

3.6. Фармакодинамические и фармакокинетические параметры низкомолекулярных гепаринов, полученных с помощью ферментативного гидролиза НФГ.

3.6.1. Фармакодинамические и фармак0кине1ические параметры НМГ с ММ 4,7 кДа (НМГ- 4,7), полученного с помощью гидролиза НФГ ферментным комплексом Slreptomycess knrssanovii.•.

3.6.1.1. Влияние НМГ-4,7 на время свертывания плазмы кроликов при внутривенном введении.

3.6.1.2. Влияние НМГ-4,7 на время свертывания плазмы кроликов при подкожном введении.

3.6.2. Фармакодинамические и фармакокинетические параметры низкомолекулярного гепарина с ММ 5,4 кДа, полученного с помощью гидролиза НФГ ферментным комплексом Протеаза С.

3.6.2.1. Влияние НМГ-5,4 на время свертывания плазмы кроликов при внутривенном введении.

3.6.2.2. Влияние НМГ-5,4 на время свертывания плазмы кроликов при подкожном введении.

3.6.3. Влияние НМГ с ММ 7 кДа, полученного гидролизом лизоцимом НФГ на время свертывания плазмы кроликов при подкожном введении.

3.7. Антитромботическая активность низкомолекулярных гепаринов, полученных с помощью гидролиза НФГ ферментным комплексом Streptomycess kurssanovii (НМГ-4,7) и Протеаза С (НМГ-5,4).

3.8. Геморрагическая активность низкомолекулярных гепаринов, полученных с помощью гидролиза НФГ ферментным комплексом Streptomycess kurssanovii (НМГ-4,7) и Протеаза С (НМГ-5.4).

3.9. Влияние НМГ-4,7 кДа и НМГ-5.4 кДа на активность протеина С плазмы кроликов в результате подкожного введения.

3.10. Влияние НМГ-4,7 кДа и НМГ-5,4 кДа на активность плазминогена плазмы кроликов в результате подкожного введения.

4. Обсуждение.

Выводы.

Введение диссертации по теме "Фармакология, клиническая фармакология", Толстенков, Александр Сергеевич, автореферат

Актуальность проблемы. Профилактика и лечение тромбозов и эмболий -важнейшая медицинская проблема, связанная со значительной заболеваемостью и смертностью, в частности, у послеоперационных пациентов. Даже такая короткая процедура как аргроскопия может привести к тромбозам [172,177]. От результатов профилактики и лечения тромбозов зависит успешность борьбы с инфарктами миокарда, инсультами, ДВС -синдромом и т.д.

Антикоа1 улянты - основные средства для профилактики и лечения тромбоэмболических нарушений. Нефракционированный гепарин (НФГ) и производные кумаринов уже давно используются в клинической практике, механизм их действия достаточно полно изучен. Механизм действия, возможность использования в клинике, преимущества перед НФГ низкомолекулярных гепаринов (НМГ), производных нефракционированного гепарина, исследовали последние десять лет [169]. Новые антикоагуляты (АК) разрабатывают с целью подавления специфических ферментов или этапов свертывания крови и для получения лекарственных средств с наименьшим числом побочных эффектов. Новые АК средства получают либо из тканей кровососущих паукообразных, либо с применением технологий для производства рекомбинантных ДНК, либо в соответствии со связью между структурой и активностью предполагаемого природного полусиптетического или синтетического образца [423].

АК активность гепарина связана со способностью увеличивать скорость ингибирования сериновых протеиназ свертывающей системы крови - тромбина (Па), факторов Ха, IXa, Х1а, ХНа, в основном активируя плазменный ингибитор, серпин - антитромбин; при активации другого плазменного серпина, кофактора II гепарина, происходит ингибирование только тромбина. Существуют два разных механизма ингибирования фактора Ха и тромбина (Па) активированным гепарином антитромбином [320].

Однако, гетерогенный НФГ. со средним распределением молекулярных масс 15 кД, не специфически связывается с макрофагами, эндотелиальными клетками и плазменными белками, в результате чего имеет сложную фармакокинетику и непредсказуемый антикоагулянтный эффект. Действует непродолжительно и требует частых повторных инъекций. Биодоступность НФГ снижается при подкожном введении, в сравнении с внутривенным. Терапевтические дозы НФГ должны контролироваться с помощью теста АЧТВ. Кроме этого, неспецифическое связывание НФГ с белками плазмы - одна из главных причин "устойчивости к гепарину" [228]. Индуцированная гепарином тромбоцитопения встречается у 1-3% пациентов после терапии и лечения НФГ и вызвана способностью последнего связываться с фактором 4 тромбоцитов, который стимулирует формирование антител к комплексу НФГ-фактор 4 тромбоцитов [255]. НФГ вызывает остеопению, связываясь с остеобластами, в результате чего происходит активация остеокластов и увеличивается ломкость костей [361].

Вышеперечисленные недостатки НФГ стимулировали разработку новых АК средств. Современные АК, находящиеся на стадии клинических испытаний, принадлежат к следующим группам: 1. ингибиторы пути фактор УПа/тканевой фактор; 2. прямые и непрямые ингибиторы фактора Ха; 3. активированный протеин С и растворимый тромбомодулин; 4. прямые ингибиторы тромбина [173]. Низкомолекулярные гепарины (НМГ), являясь продуктом гидролиза сульфатированного природного полисахарида, принадлежат к числу непрямых ингибиторов фактора Ха [31].

Коммерческие НМГ (Nadroparin calcium (Fraxiparin [Sanofi]), Certoparin. Dalteparin sodium (Fragmin [Pharmacia]), Enoxaparin sodium (Clexane [Aventis]), Nadroparin, Reviparin, Tinzaparin) имеют среднюю молекулярную массу 3,5-6,0 кДа, и используются для профилактики и лечения тромбозов глубоких вен. венозных тромбоэмболии [168], инфаркта миокарда [436], тромботического инсульта, порока сердца, тяжелых заболеваниях легких [351], при лечении пациентов со злокачественными опухолями [369]. Среди пациентов, перенесших хирургическое вмешательство при переломе бедра или избирательную замену бедра/коленной чашечки, использование НМГ снижает риск венозного тромбоза до 50 % по сравнению с placebo [161].

Основное преимущество НМГ над НФГ - способность в меньшей степени связываться с белками плазмы и тромбоцитами [436], что приводит к более длинному периоду полувыведения, высокой биодоступности, низкому риску тромбоцитопении и остеопороза. Предсказуемость АК реакции, позволяющая вводить лекарство один или два раза в день подкожно, предполагает уход от потребности в регулировании дозы или лабораторном контроле у большинства пациентов, как считают некоторые авторы [68].

Задачи исследования:

1) оценить способность ферментативных комплексов: Streptomyces kurssanovii, лизоцим, протеаза С, папаин, триходерма, химотрипсин, гидролизовать НФГ из легких крупного рогатого скота и слизистой оболочки кишечника свиней с целью получения НМГ с отношением аХа /alia активностей больше 1;

2) проанализировать влияние источника НФГ (из легких крупного рогатого скота и слизистой оболочки кишечника свиней) на специфическую антикоагулянтную активность полученных НМГ;

4) исследовать способность сульфата протамина нейтрализовать антикоагулянтную активность НМГ. а также исследовать возможность использования хитозанов для нейтрализации антикоагулянтной активности НМГ.

5) определить фармакокинегические и фармакодинамические параметры некоторых образцов НМГ при внутривенном и подкожном введениях кроликам и крысам и сравнить их с параметрами уже используемого коммерческого НМГ - фраксипарина;

Научная новизна.

Впервые установлено, что пефракциопированный гепарин из легких крупного рогатого скота и из слизистой оболочки кишечника свиней может быть гидролизован с помощью ферментативных комплексов Slreptomyces kurssanovii, лизоцим, протеаза С, папаин, фитопаин, триходерма, химотрипсин. никогда для этих целей не использовавшимися, при этом происходит увеличение аХа активности и отношения аХа /alia.

Впервые показано, что НМГ, полученные с помощью гидролиза нефракционированного гепарина из легких крупного рогатого скота и из слизистой оболочки кишечника свиней, эффективно ингибируют факторы На и Ха, отношение аХа /alia активностей in vivo увеличивается по сравнению с исследованиями in vitro.

Разработан способ определения комплексов между полианионами НМГ и поликатионами сульфата протамина и хитозанов, патент РФ № 2006141290 [7].

Впервые показана способность хитозанов нейтрализовать фибриногенсвертывающую активность и амидолитическую активность фактора Ха in vitro.

Практическое значение

Результаты исследования позволяют предполагать, что производство НМГ путем гидролиза НФГ ферментативными комплексами: Streptomyces kurssanovii, лизоцим, протеаза С, папаин, триходерма, химотрипсин, является перспективным с точки зрения получения эффективного антикоагулянтного препарата. Показано, что при подкожном введении некоторых полученных образцов НМГ кроликам период полувыведения сопоставим с периодом полувыведения фраксипарина при одинаковых дозах. Показана перспективность использования в качестве антидота сульфата протамина и хитозанов для нейтрализации АК активности полученных НМГ. Разработан способ определения комплексов между гепаринами и поликатионами.

Положения, иыпосимые на защиту

2. Уменьшение ММ полученных НМГ приводит к увеличению отношения анти-фактор Ха/ анти-фактор Па активностей.

3. Использование биоспецифичного электрофореза позволяет быстро и качественно определить наличие комплексов между гепаринами и поликашонами (сульфат протамина, хитозаны с ММ 4-21 кДа и СД 61-93% ) и наиболее активный антикоагулянт.

4. Сульфат протамина и хитозаны способны нейтрализовать специфическую антикоагулянтную активность образцов НМГ полученных с помощью гидролаз.

2005; Первая международная научно-практическая конференция «Биологические и медицинские технологии: от научных результатов - к инновационным разработкам», Москва, 2005; Международная конференция "Гемореология в макро- и микроциркуляции", Ярославль, 2005; II Всероссийская конференция Всероссийской Ассоциации по изучению тромбозов, геморрагии и патологии сосудов им. А.А.Шмидта-Б.А.Кудряшова, Ярославль, 2005; Вторая Международная научно - практическая конференция «Перспективы развития биотехнологий в России», Пущино (Московская область). 2005; «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» РосХит, Казань. 2006 г; Третья Международная Научно-практическая Конференция МЕДБИОТЕК «Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине». Москва, 2006; III съезд фармакологов России Фармакология -практическому здравоохранению, Санкг-Петербург, 2007; 3 Всероссийская конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии", Москва. 2007; III съезд фармакологов России Фармакология - практическому здравоохранению. Санкт-Пегербург, 2007; IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск. 2008;

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов исследования, их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена па 241 страницах. Список литературы содержит 439 ссылок.

Заключение диссертационного исследования на тему "Антикоагулянтная активность низкомолекулярных гепаринов, полученных с помощью гидролаз"

ВЫВОДЫ

2. Впервые показана способность ферментов папаин, целловиридин, химотрипсин, протеаза С, лизоцим гидролизовать НФГ из легких крупного рогатого скота и из слизистой оболочки кишечника свиней; при гидролизе НФГ ферментами, никогда в этих целях не использовавшимися, молекулярная масса снижалась и возрастало отношение активностей аХа /alia до 1,5 — 2,52.

4. Разработан эффективный, быстрый и качественный способ фиксирования комплексов между гепаринами и поликатионами (сульфат протамина, хитозаны ММ 4-21 кДа и степенью дезацетилирования 61 - 93 %), позволяющий вычленять из ряда анализируемых гепаринов образцы с наибольшей антитромбиновой активностью.

5. Показана способность сульфата протамина нейтрализовать ингибирование образцами НМГ амидолитической активности тромбина до 90-100% и фактора Ха до 100% (в зависимости от ММ гепарина); показана способность сульфата протамина нейтрализовать удлинение образцами НМГ времени появления фибринового сгустка в тесте АЧТВ на 80 %.

6. Показано, что фармакодинамические параметры НМГ с ММ 5,4 кДа (гидролиз НФГ протеазой С), НМГ с ММ 4,7 кДа (гидролиз ферментным комплексом Streptomyces kurssanovii) при внутривенном (0,3; 0,5; 0,8 и 3 мг/кг) подкожном (43 - 143 ЕД/кг и 286 -4980 аХа ЕД/кг) введениях сопоставимы с фармакодинамическими параметрами фраксипарина; соотношение aXa/alla активностей плазмы кроликов при подкожном и внутривенном введениях образцов НМГ с ММ 5,4 кДа (гидролиз НФГ протеазой С) и НМГ с ММ 4,7 кДа выше отношения специфических активностей in vitro.

7. НМГ 5,4 и 4,7 в одинаковой степени и также эффективно, как фраксипарин, препятствуют развитию экспериментального тромбоза у крыс; геморрагическая активность НМГ 5,4 и 4,7 сравнима с таковой для фраксипарина; НМГ-4,7 и НМГ-5,4 при подкожном введении кроликам снижают активность протеина С плазмы кроликов; НМГ-4,7 и НМГ-5,4 при подкожном введении кроликам достоверно увеличивают активность плазминогена

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Толстенков, Александр Сергеевич

1. Баранов Г.А., Беляев А.А. Оникиеико С.Б. и др. Взаимодействие луча С02 с падающей каплей жидкости при модификации растворенных в ней биообъектов// Письма в ЖТФ.- 2003,- Т.29,- В. 13,- С.57-63

2. Баркаган З.С. Момот А. П. «Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза» Москва.: Ньюдиамед 2001 - 74с.

3. Бернхард С., «Структура и функция ферментов, пер. с англ.» Москва.: Мир 1971.

4. Введение в прикладную этимологию. Иммобилизованные ферменты, под ред. И. В. Березина, К. Мартинека Москва.: Мир 1982.

5. Государственная Фармакопея СССР XI издание, том 1. статья 42-1256-79

6. Дрозд Н.Н., Макаров В.А., Башков Г.В. и др. Влияние совместного введения гепарина и сернокислого эфира хитозана на функцию гемостаза // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1996. - № 59,- В.1.- С. 30-33.

7. Дрозд Н.Н., Толстенков А.С., Макаров В.А., Банникова Г.Е., Варламов В.П., Скрябин К.Г. Способ обнаружения комплексов между гепаринами и поликатионами. Патент РФ №2006141290, опубл. 27.05.2008 Бюл. № 15

8. Ермак И.М. Соловьева Т.Ф. «Сборник инвестиционных предложений I Международного инвестиционного конгресса "Новейшие технологии в системе интегральных процессов территорий стран АТР"» Владивосток,- 2000,- С. 276.

9. Заиков Г.Е. Деструкция и стабилизация полимеров. Москва.: МИТХТ им. М.В. Ломоносова, 1993.-248с.

10. Ильина А.В., Варламов В.П. Ферментативная деполимеризация N-сукцинилхитозана //Биоорг. Хим. -2007,- № 33,- В.1.- С. 156-159.

11. И. Ильина А.В., Татарипова Н.Ю., Тихонов В.Е., Варламов В.П.// Внеклеточные протеаза и хитиназа, продуцируемые культурой Streptomyces kurssanovii // Прикладная биохимия и микробиология.- 2000,- Т. 36. № 2,- С. 184-188.

12. Иммобилизованные ферменты. Современное состояние и перспективы, под ред. И. О. Березина.- Москва.: Изд-во МГУ 1976,-т. 1-2.

13. Козлов Л. В., «Биоорганическая химия» Москва: Наука 1980,- т. 6,- № 8.- с. 1243-54.

14. Козлов Л. В.; Введение в прикладную энзимологию: Учебное пособие / Под. Ред. ИВ Березина и К Мартинека М.: Изд-во Моск. Универ, 1982 - С 384

15. Максименко А.В., Тищенко Е.Г., Голубых В.Л. Аптитромботическое действие производных каталазы и хондроитинсульфата при артериальном поражении у крыс// Вопр Мед Хим.- 1999,- Т 45,- №6,- С. 20-25.

16. Мосолов В. В. «Протеолитические ферменты», Москва: Наука 1971.

17. Назаров И.В., Шевченко Н.М. Ковалев Б.М., Хотимченко Ю.С. Действие на систему комплемента полисахаридов из красных водорослей. // Биология моря,- 1998.- т. 24,- №1.-С.50-53.

18. Никитин В.М., Оболенская А.В., Щеголев В.П." Химия древесины и целлюлозы", М.: Лесная промышленность, 1978.- С. 75-78.

19. Нортроп Д., Кунитц М., Херриотт Р. «Кристаллические ферменты, пер. с англ» М.: Наука 1950.

20. Прикладная статистика. Исследование зависимостей: Справ. Изд./ С.А. Айвазян, И.С. Енюков, Л.Д. Мешалкин; Под ред. С.А. Айвазяна. М.: Финансы и статистика, 1985.- С 61.

21. Струкова С.М. Нарушения в системе протеина С у больных с антифосфолипидным синдромом // Тромбозы, кровоточивость и болезни сосудов.- 2002,- №2,- С. 21-26.

22. Тривен ML «Иммобилизованные ферменты. Вводный курс и применение в биотехнологии» М . Мир 1983.

23. Тюкавкина Н.А., Ю.И. Бауков «Биоорганическая химия» издание второе, переработанное и дополненное. М.: Медицина, 1991

24. Уайт А. Хендлер Ф. Смит Э . Хилл Р. Леман И., Основы биохимии. М.: Мир.- 1981.

25. Усов А И., Смирнова Г.II , Билап М.И., Шашков А.С., Структурные особенности фукоиданов // Биоорг. Химия 1998,- Т. 24,- №6.- С.437-445.

26. Филлипс Д., «Трехмерная структура молекулы фермента, в сборнике: Молекулы и клетки, пер. с англ» М.: Мир 1968.- В 3.

27. Химия белка, сборник статей / Под. ред. М.М. Ботвинник.-М.: Мир, 1969.

28. Чазов Е.И., Лаким К.М. Ан гикоагуляпты и фибринолшические средства// Москва: Медицина, 1977,- С. 172-185

29. Чевари С.И., Чаба С.А. Спектрофотометрический метод определения гемоглобина в крови // Лаб. дело.- 1985,- №8,- С.457-460.

30. Abatangelo G., Barbucci R., Brun P., Lamponi S. Biocompatibility and enzymatic degradation studies on sulphated hyaluronic acid derivatives // Biomaterials. 1997.- V.18.- №21.-P. 1411-1416.

31. Adler B.K. Unfractionated heparin and other antithrombin mediated anticoagulants // Clin Lab Sci. 2004,- V. 17.- №2,- P. 113-120.

32. Ahsan A. Jeske W., Hoppensteadt D., et al. Molecular profiling and weight determination of heparins and depolymerized heparins // J. Pharm. Sci. 1995.- №84.- P.724-727.

33. Alban S., Gastpar R. Plasma levels of total and free tissue factor pathway inhibitor (TFPI) as individual pharmacological parameters of various heparins // Thromb Haemost.- 2001,- №85.- P. 824-829.

34. Albuquerque I.R., Queiroz K.C., Alves L.G., et al. Heterofucans from Dictyota menstrualis have anticoagulant activity // Braz. J. Med. Biol. Res.- 2004,- V.37.- №2,- P. 167-171.

35. Alderman E.L., Levy J.H., Rich J.B., et al. Analyses of coronary graft patency after aprotinin use: results from the International Multicenter Aprotinin Graft Patency Experience (IMAGE) trial //J Thorac Cardiovasc Surg.- 1998.- №.116.- P.716-746.

36. Amiral J., Bridey F., Dreyfus M.,'et al. Platelet factor 4 complexed to heparin is the target for antibodies generated in heparin induced thrombocytopenia // Thromb. Haemost.- 1992,- №.68.-P.95-101.

37. Andrade-Gordon P., Strickland S. Interaction of heparin with plasminogen activators and plasminogen: effects on the activation of plasminogen // Biochemistry.- 1986.- №.25,- P. 40334073.

38. Anthony C. Leslie В., Hugh O'B., et al. Covalent Antithrombin-Heparin Complexes with High Anticoagulant Activity // J Biol Chem.- 1997,- V.272.- №35,- P.22111-22117.

39. Bal dit Sollier C., Kang C., Berge N. et al. Activity of a synthetic hexadecasaccharide (SanOrgl23781 A) in a pig model of arterial thrombosis // M.Journal of Thrombosis and Haemostasis.- 2004.- V2.- №6.- P.925-930.

40. Bara L. Samama M.M. Pharmacokinetics of low molecular weight heparins // Acta Chir Scand.- 1988.- №.543,- P.65-72.

41. Barbanti M, Calanni F. Marchi E. et al. A low molecular weight dermatan sulphate, reduces the weight of preformed thrombi in rats made afibrinogenemic by ancrode.// Thrombosis haemost.- 1995,- V73.-№2.- P. 287-377.

42. Barbucci R., Lamponi S., Magnani A, Renier D. The influence of molecular weight on the biological activity of heparin like sulphated hyaluronic acids// Biomaterials.- 1998.- №.19.- P.801-807.

43. Barrow R.T., Parker E T , Krishnaswamy S. and Lollar P. Inhibition by heparin of the human blood coagulation intrinsic pathway factor X activator // J. Biol. Chem.- 1994.- V.269.-№43.- P.26796-26800.

44. Barrowcliffe T.W., Mulloy В., Johnson E.A., Thomas D.P. The anticoagulant activity of heparin: measurement and relationship to chemical structure // Circulation.- 2001,- V.7.- №2.-P.2994-3018.

45. Ba§ar N, Uzun L, Giiner A, Denizji A. Lysozyme purification with dye-affinity beads under magnetic field // International Journal of Biological Macromolecules 2007,- V.41.- №3.- P.234-242.

46. Bates S.M., Weitz J.I. Coagulation Assays // Circulation. 2005. -V 112,- N 4. P 53-60.

47. Bedford RF and ТЕ O'Brien Comparison of bovine lung and porcine intestinal heparin for arterial thrombosis in man American // Journal of Hospital Pharmacy.- 1977.- V.34.- №. 9.-P.936-939 .

48. Bendayan P, Boccalon H, Dupouy D. Boneu B. Dermatan sulfste is a more potent inhibitor of clot-bound thrombin than unfractionated and low molecular weight heparins // Thromb Haemost.- 1994,- V.71.-№5.- P.576-656.

49. Bentolila A. Vlodavsky I., Ishai-Michaeli R., et al. Poly(N-acryl amino acids): a new class of biologically active polyanions // Med. Chem.- 2000,- V.43.- №13.- P.2591-2600.

50. Bergqvist D. Nilsson В., Hedner U., et al. The effects of hepaiin fragments of different molecular weight in experimental thrombpsis and hacmostasis // Thromb. Res.- 1985.- V38.-№6.-P.589-601.

51. Bernard G.R. Vincent J.L., Lalerre P.F., et al. Efficacy and safety of lecombinant human activated protein С for severe sepsis //N Engl J Med.- 2001.- V.344.- №10 P.699-709.

52. Bcrteau O, Mulloy В Sulfated fucans, fresh perspectives: structures, functions, and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide //Glycobiology.- 2003,-V.13.-№6.-P.29-40.

53. Bianchini P., Liverani L., Mascellani G., Parma B. Heterogeneity of unfractionated heparins studied in connection with species, souice, and production processes // Semin Thromb Hemost.- 1997,- V.23.- №1.- P.3-10.

54. Bianchini P., Liverani L., Spelta F., et al. Variability of Heparins and Heterogeneity of Low Molecular Weight Heparins // Seminars in Thrombosis and Haemostasis.- 2007.- V. 33,- №5.-P.- 496-502.

55. Bijsterveld, Nick R., Vink et al. Recombinant factor Vila reverses the anticoagulant effect of the long-acting pentasaccharide idraparinux in healthy volunteers // British Journal of Haematology.- March 2004,- V.124.- №5,- P.653-658.

56. Bilan M.I., Grachev A.A., Ustuzhanina N.H., et al. Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens C.Ag.//Carbohydr. Res.- 2002,- V.337.- №8,- P. 719-730.

57. Bisio A. Guglieri S., Frigerio M., et al. Controlled gamma-ray irradiation of heparin generates oligosaccharides enriched in highly sulfated sequences Carbohydr Polym // Arzneimittelforschung.- 2004.- V.55.-№I.- P.10I-112.

58. Bittl J.A., Chaitman B.R., Feit F., et al. Bivalirudin versus heparin during coronary angioplasty for unstable or post-infarction angina: the final report of the Bivalirudin Angioplasty Study. // Am Heart .1,- 2001 Dec.- V.142.- №6,- P.952-961.

59. Black M. The keratoses of the larynx // Proc R Soc Med.- 1954.- V.47.- №.4.- P.245-254.

60. Blondin C., Chaubet F., Nardella A., et al. Relationships between chemical characteristics and anticomplementary activity of fucans // Biomaterials. 1996,- V.l7.- №6.- P.597-603.

61. Boisson-Vidal C., Haroun-Bouhedja F., Ellouali M., et al. Biological activities of polysaccharides from marine algae // Drugs of the Future, 1995.- V.20.- №.5.- P. 1237-1249.

62. Boneu B. Low molecular weight heparins: Are they superior lo unfractionated heparins to prevent and to treat deep vein thrombosis? // Thromb Res. 2000.- VI00.- №2,- P. 113-120.

63. Boneu В., Caranobe C., Cadroy Y., et al. Pharmacokinetic studies of standard UFH, and low molecular weight heparins in the rabbit // Semin Thromb Hemost. 1988,- V. 14.- №1.- P. 18-27.

64. Bounameaux H., de Moerloose P. Is laboratory monitoring of low-molecular-weight heparin therapy necessary? No. // J Thromb Haemosl. 2004,- V.2.- №2,- P.551 -555.

65. Bradbrook I.D., Magnani H.N. Moelker H.C., et al. ORG 10172: a low molecular weight heparinoid anticoagulant with a long half life in man // Br J Clin Pharmacol. 1987.- V.23.- №6.-P.667-675.

66. Bratl G., Tornebohm E., Widlund L. et al. Low molecular weight heparin (KABI 2165, FRAGMIN): pharmacokinetics after intravenous and subcutaneous administration in human volunteers//Thromb Res. 1986.- V.42.-№5,-P.613-620.

67. Bray A.A.The evolution of the terrestrial vertebrates: environmental and physiological considerations //Trans R Soc Lond В Biol Sci. 1985.- V. 309.- №1138,- P.289-322.

68. Brian F., Gage M.D., Charles S. Pharmacogenetics and Anticoagulant Therapy // Journal of Thrombosis and Thrombolysis. 2003,- V.16.- №1/2.- P. 73-78.

69. Brufatto N., Nesheim M.E. The use of prothrombin S525C) labeled with fluorescein to directly study the inhibition of prothrombinase by antithrombin during prothrombin activation // J Biol Chem. 2001.- V.276.- №21.- P. 17663-17671.

70. Buchanan M. R., Liao P. Smith L. J., and Ofusu F. A.Prevention of thrombus formation and growth by anti thrombin III and heparin cofactor Il-dependent thrombin inhibitors: impotance of heparin cofactor II //Thromb. Res. 1994,- V.74.- №5.- P.463-475.

71. Buchanan M.R., Blister S.J., Ofosu F. prevention and treatment of thrombosis novel strategies arising from our understanding the healthy endothelium // Wien. Klin. Wochenschr. 1993. V.105.- №11.- P.309-313.

72. Burgess J.K., Chong B.H. The platelet proaggregating and potentiating effects of unfractionated heparin, low molecular weight heparin and heparinoid in intensive care patients and healthy controls//Eur J Haematol. 1997,- V.58.-№4.- P.270-355.

73. Bussel J.B., Steinherz P.G., Miller D.R. Hilgartner M.W. A heparin-like anticoagulant in an eight-month-old boy with acute monoblastic leukemia // Am J Hematol. 1984.- V.16.- №1. P.83-90.

74. Byun Y., Singh V.K., Yang V.C. Low Molecular Weight Protamine:A Potential Nontoxic Heparin Antagonist // Thrombosis Research 1999.- V.94.- №1,- P.53-61.

75. Cade J.F., Buchanan M.R., Boneu В. et al. A comparison of the antithrombotic and haemorrhagic effects of low molecular weight heparin fractions: the influence of the method of preparation // Thromb Res. 1984.- V.35.- №6,- P.613-625.

76. Calabrese G.C., Alberto M.F., Tubio R., et al. A small fraction of dermatan sulfate with significantly increased anticoagulant activity was selected by interaction with first complement protein.// Thromb. Res. 2004.- V.l 13.- №3-4,- P.243-250.

77. Capila I.,Linhardt R. J. Hcparin-protein interactions // Angew. Chem. Int. Ed. 2002-V.41.- №3,- P.390-412.

78. Carr J.A., Silverman N., The heparin protamine interaction // J. Cardiovasc. Surg. 1999.-V.40.- №3.- P.659-665.

79. Carter C.J., Kelton J.G., Hirsh J., et al. The relationship between the hemorrhagic and antithrombotic properties of low molecular weight heparins in rabbits // Blood 1982.- V.59.- №6.-P.1239-1245.

80. Casati V., Guzzon D., Oppizzi M\. et al. Hemostatic effects of aprotinin, tranexamic acid and £-aminocaproic acid in primary cardiac surgery // Ann Thorac Surg 1999,- V.68.- №1.- P.2252-2256.

81. Casu B. Structure and biological activity of heparin // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1985,- №.43,- P.51-134.

82. Casu В. Guerrini M., Naggi A., et al. Characterization of sulfation patterns of beef and pig mucosal heparins by nuclear magnetic resonance spectroscopy // Arzneimittelforshung. 1996.-V.46.-№5.- P.472-477.

83. Casu В. Lindahl U. Structure and biological interactions of heparin and heparan sulfate // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 2001.- №57.- P. 159-206.

84. Casu В., Guerrini M., Guglieri S., et al. Undersulfated and glycol-split heparins endowed with antiangiogenic activity // J. Med. Chem. 2004,- V.47.- №4,- P. 838-848.

85. Casu B. Structure and active domains of heparin // Elsevier Ltd. .- 2006.- V.399.- №.1.-P.l-28.

86. Cetinel S., Ercan F., Sirvanci S., et al. The ameliorating effect of melatonin on protamine sulfate induced bladder injury and its lelationship to interstitial cystitis // J.Urol. 2003.- V.169.-№4,-P. 1564-1568.

87. Chargaff E., Olson K.B.: Studies on the chemistry of blood coagulation. VI. Studies on the action of heparin and other anticoagulants. The influence of protamine on the anticoagulant effect in vivo // J Biol Chem. 1937.- V. 122,- №1.- P. 153-167.

88. Chavante S.F., Santos E.A., Oliveira F.W. A novel heparan sulphate with high degree of N-sulphation and high heparin cofactor-II activity from the brine shrimp artemia franciscana // Int.J.Biol.Macromol.2000.- V.27.- №1.- P. 49-57.

89. Chen W.H., Lau C.P., Lau Y.K., et al. Stable and Optimal Anticoagulation is Achieved With a Single Dose of Intravenous Enoxaparin in Patients Undeigoing Percutaneous Coronary Intervention // J Invasive Cardiol 2002,- V. 14 №8,- P.439-442.

90. Chevolot L., Foucault A., Chaubet F. et al Further data on the structure of brown seaweed fucans: relationships with anticoagulant activity // Carbohydr. Res. 1999.- V.319.- №1-4,- P. 154165.

91. Chong B.H., Berndt M.C. Heparin-induced thrombocytopenia // Blut 1989,- V.58.- №2.-P.53-60.

92. Chong B.H., Ismail F. The mechanism of heparin-induced platelet aggregation // Eur J Haematol 1989,-V.43.-№3,- P.245-296.

93. Cohen M. The role of low-molecular-weight heparins in arterial diseases: Optimizing antithrombotic therapy // Thromb Res. 2000,- V.100.- №2,- P. 131- 139.

94. Colliec S., Boisson-Vidal C., Jozefonvicz J. A low molecular weight fucoidan fraction from the brown seaweed Palvetia canaliculata //Phytochemistry 1994,- V.35.- №3,- P. 697-700.

95. Colucci M. Saidella L., Barbanti M„ et al. Thrombolysis enhancing activity of a low molecular weight dermatan sulfate (Desmin 370) in experimental pulmonary embolism in rats // Thromb. Res. 1997,- V. 87,- №5.- P. 441-146.

96. Connolly S. J. Atrial Fibrillation Investigators. Risk factors for stroke and efficacy of antithrombotic therapy in atrial fibrillation // Arch Intern Med 1994,- V.154.- №4.- P. 1449-1457.

97. Conrad H. E. Heparin-Binding Proteins // Academic Press: San Diego. V.10.- №2.- P. 137141.- 1998.

98. Coyne E. «Heparin past, present and future. In.: Chemistry and biology of heparin. Ed. Lundblad R.L., Brown W.V., Mann K.G., et al.» - New-York: EIsevier/North-Holland. 1981,- p.9-17.

99. Crowther M.A. Berry L.R., Monagle P.T., Chan A.K.Mechanisms responsible for the failure of protamine to inactivate low-molecular-weight heparin // British Journal of Haematology, 2002,- V.l 16,- №1,- P.178-186.

100. Cumming A.M. Jones G.R., Wensley R.T., Cundall R.B.: In vitro neutralization of heparin in plasma prior to the activated partial thromboplastin time test: an assessment of four heparin // Thromb Res. 1986,- V.41.-№1.- P.43-56.

101. D'Ambra M.N., Akins C.W. Blackstone E.H., et al. Aprotinin in primary valve replacement and reconstruction: a multicenter, double-blind, placebo-controlled trial // J Thorac Cardiovasci

102. Surg. 1996,- V.l 12,- №4.- P.1081-1090.

103. Daud A.N., Ahsan A., Iqbal O., et al. Synthetic heparin pentasaccharide depolymerization by heparinase 1 : molecular and biological implications // Clin. Appl. Thromb. Hemost. 2001,-V.7.- №1.- P.58-64.

104. Dehmer G. J., Fisher M., Tate D. A., et al.Reversal of Heparin Anticoagulation by Recombinant Platelet Factor 4 in Humans // Circulation, 1995,- V.91.- №8,- P.2188-2194.

105. Del Re M.R., Ayd J.D., Schultheis L.W. Heitmiller E.S., Protamine and left ventricular function: a transesophageal echocardiography study // Anesth. Analg. 1993,- V.77.- №6.-P.1098-1103.

106. Delorme M.A., Xu L., Berry L., et al. Anticoagulant dermatan sulfate proteoglycan (decorin) in the term human placenta // Tromb. Res. 1998.- V.90.- №4.- P. 147-153.

107. Demir M. Iqbal O., Hoppensteadt D.A., et al. Anticoagulant and antiprotease profiles of a novel natural heparinomimetic mannopentaose phosphate sulfate (PI-88) // Clin Appl Thromb Hemost. 2001.- V.7.- №2,- P. 131 -171.

108. Demirkan A., Mesut A., Aykut S., Kutlay N. Effect of Intraperitoneal Administration of Low-Moleculai-Weight Heparin on Plasma Tissue Factor Pathway Inhibitor Levels in CAPD Patients // Nephron.- 2002,-№91,- P. 162-163.

109. Desai U. R. New Antithrombin-based anticoagulants // Med. Res. Rev. 2004,- V.24.- №24.-P.151-181.

110. Deux J.F., Meddahi-Pelle A., Le Blanche A.F., et al. Low Molecular Weight Fucoidan Prevents Neointimal Hyperplasia in Rabbit Iliac Artery In-Stent Restenosis Model. Letourneur Arterioscler // ThiombVasc Biol. 2002,- V.22.- №10,- P.1604-1609.

111. Dol F, Caranobe C, Dupouy D, Petitou M, et al. Effects of increased sulfation of dermatan sulfate on its in vitro and in vivo pharmacological properties // Thromb Res, 1988.- V52.- №2.-P. 153-217.

112. Douketis J.D., Foster G.A., Crowther M.A., et al. Clinical risk factors and timing of recurrent venous thromboembolism during the initial 3 months of anticoagulant therapy // Arch Intern Med 2000,- V. 160,-№22.- P.3431-3436.

113. Doutremepuich С., Bonini F., Toulemonde F., et al. In vivo neutralization of low-molecular weight heparin fraction CY 216 by protamine // Semin Thromb Hemost. 1985.- V.ll.- №3,-P.318-322.

114. Drozd N.N., Sher A.I., Makarov V.A., et al. Comparison of antithrombin activity of the polysulphate chitosan derivatives in in vivo and in vitro system // Tromb. Res. 2001,- V.102.- №5,-P.445-500.

115. Dunaevsky Y. E., Gruban'T. N. Belyakova G. A., Belozersky M. A. Proteinase inhibitors in higher plants Hi. Plant Physiol. 1998.- V. 152,- №6.- P.349-353

116. Dyke C.K., Becker R.C., Kleiman N.S., et al. First experience with direct factor Xa inhibition in patients with stable coronary disease: a pharmacokinetic and pharmacodynamic evaluation // Circulation. 2002,- V.105.- №20,- P.2385-2391.

117. Edens R. E., Al-Hakim A., Weiler J. M. et al Gradient Polyacrylamide Gel Electrophoresis for Determination of the Molecular Weights offleparin Preparations and Low-Molecular-Weight Heparin Derivatives // J. Pharm. Sci. 1992,- V.81.- №8,- P.823-827.

118. Edward В., Braun, Karen L., et al. Intraoperative Use of Aminocaproic Acid in Liver // Transplant RecipientsAnesthesiology 2006.- V.105.-№3.- P. 1685.

119. Edwards J.O., Curci R. Fenton type activation and chemistry of hydroxyl radical. In: Strukul G ed. Catalytic Oxidations with Hydrogen Peroxide as Oxidant // London: Kluwer Academic. 1992,- P.97-153.

120. Eikelboom J.W., Quinlan D.J., Douketis J.D. Extended-duration prophylaxis against VTE after total hip or knee replacement: a meta-analysis ofthe randomised trials // Lancet. 2001.-V.358.- №9275.- P.9-15.

121. Esko J. D.Xindahl U. Molecular diversity of heparan sulfate // J. Clin. Invest. 2001.-V.108.- №2,- P.169-173.

122. Esmon CT. The protein С pathway.// Chest 2003. V.124.- S.3.- P.26S-32S.

123. European Pharmacopoeia, 5th edition published 15.6.2004, valid from 1.1.2005

124. Fabian I, Aronson M. Polycations as possible substitutes for protamine in heparin neutralization//Thromb Res. 1980.- V.17.-№1-2.-P.239-247.

125. Fareed J., Fu K., Yang L.H., et al. Pharmacokinetics of low molecular weight heparins in animal models // Semin Thromb Hemost 1999.- V.25.- S.3.- P.51 -55.

126. Farias W.R.L. Valente A-P., Pereira M.S., Mourao P.A.S. Structure and Anticoagulant Activity of Sulfated Galactans.// J. Biol. Chem., 2000.- V. 275.- №.38,- P.29299-29307.

127. Ferguson J.J. Meeting highlights В American Heart Association scientific sessions 2001 // Circulation 2002,- V106.- №7,-P.e24-e30.

128. Fernarndez C., Hattan C.M., Kerns R.J. Semi-synthetic heparin derivatives: chemical modifications of heparin beyond chain length, sulfate substitution pattern and N-sulfo/N-acetyl groups//Carbohydrate Research. 2006.- V.341.- №10.-P.1253-1265.

129. Fiore M. M., Kakkar V. V.Platelet factor 4 (PF4) neutralizes heparan sulfate-dependent inactivation of factor Xa by preventing enzyme interaction with polysaccharide //Biochem Biophys Res Commun. 2003.- V.311.- №1.- P.71-76.

130. Fischer A. Die Bindung von Heparin an Eiweiss // Biochem Zeit. 1935,- P. 278-133

131. Francis C.W., Davidson B.L., Berkovvitz S.D., et al. Ximelagatran versus warfarin for the prevention of venous thromboembolism after total knee arthroplasty. A randomized, double-blind trial // Ann Intern Med. 2002,- V. 137,- №8. P.648-655.

132. Frydman A . Bara L., Leroux Y.„ et al. The antithrombotic activity and pharmacokinetics of Enoxaparin. a low molecular weight heparin, in man given single subcutaneous doses of 20 up to 80 mg//J Clin Pharmacol. 1988.- V.28.-№1.- P.609-618.

133. Fugedi P. The potential of the molecular diversity of heparin and heparan sulfate for drug development // Mini Rev. Med. Chem. 2003.- V.3.- №7. P.659-667.

134. Gage B.F., Cardinalli А.В., Albers G.W., Owens D. Costeffectiveness of warfarin and aspirin for prophylaxis of stroke in patients with nonvalvular atrial fibrillation // Stroke, 1998.-V.29.- №6 P. 1083-1174.

135. Ghosh R., Cui Z.F. Purification of lysozyme using ultrafiltration // Biotechnol Bioeng, 2000,- V.68.- №2,- P.191-203.

136. Giraux J.L., Tapon-Bretaudiere J., Matou S., Fischer A.M. Fucoidan, as heparin, induces tissue factor pathway inhibitor release from cultuied human endothelial cells // Thromb Haemost. 1998,- V.80.- №4,- P.692-697.

137. Godal H C. A comparison of two heparin-neutralizing agents: protamine and polybrene // Scan J Clin Lab Invest, I960,- №.12,- P.446-457.

138. Gorog D.A., Alamgir Mn K., Michael S Marbcr. Role of LMWH in ACS, with or without PCI and GP Ilb/IIIa blockade // Br J Cardiol, 2004,- V. 11.- №2,- P.AIC45-AIC52.

139. Grabovac V., Schmitz Т., Foger F., Bernkop-Schniuch A. Papain: an effective permeation enhancer for orally administered low molecular weight heparin // Pharm Res. 2007,- V.24.- №5.-P.1001-1007.

140. Grauffel V., Kloareg В. Mabeau S. et al. New natural polysaccharides with potent antithrombic activity: fucans from brown algae // Biomaterials, 1989.- V. 10,- №6,- P.363-371.

141. Greinacher A. Volpel H, Janssens U, et al. Recombinant hirudin (lepirudin) provides safe and effective anticoagulation in patients with heparininduced thrombocytopenia: a prospective study // Circulation, 1999,- V.99.- №1,- P.73-80.

142. Griffin С. C., Linhardt R. J., VanGorp C. L., et al. Isolation and characterization of heparan sulfate from crude porcine intestinal mucosa peptidoglycan heparin // Carbohydr. Res. 1995,-V.276.- №1.- P.183-197.

143. Griffith M.J. Heparin-catalyzed inhibitor/protease reactions: kinetic evidence for a common mechanism of action of heparin // Proc Natl Acad Sci USA. 1983,- V.80.- №18,- P.5460-5464.

144. Gunay N.S. Linhardt R.J. Heparinoids: structure, biological activities and therapeutic applications //Planta Med. 1999,- V.65.- №4,- P.301-306.

145. Gustalsson D. Nystrom J.E., Carlsson S., et al. The direct thrombin inhibitor melagatran and its oral piodrug H 376/95: intestinal absorption properties, biochemical and pharmacodynamic effccts // Thromb Res. 2001.- V. 101.- №3P. 171 -181

146. Handoll H.H., Farrar M.J. McBiinie J., et al. Heparin, low molecular weight heparin and physical methods for preventing deep vein thrombosis and pulmonary embolism following surgery for hip fractures // Thromb Haemost., 1998,- V.79.- №1,- P.902-906.

147. Harenberg J. Pharmacology of low molecular weight heparins // Semin Thromb H 1990.- V.16.- №12.- P.18.

148. Harenberg J., Gnasso A., de Vries J.X. et al. J. Inhibition of low molecular weight h< by protamine chloride in vivo // Thromb Res., 1985,- V.38.- №1.- P. 11- 20.

149. Haroun-Bouhedja F., Ellouali M. Sinquin C. Boisson-Vidal C. Relationship b sulfate groups and biological activities of fucans // Thromb Res. 2000.- V.100.- №5.- P.453-4parinveen

150. Hayakawa Y., Hayashi Т., Lee J., et al. Inhibition of thrombin by sulfated polysacc^-^ isolated from green algae // Biochim.Biophys.Acta. 2000.- V. 1543,- №1.- P.86-94.

151. Herault J.P., Cappelle M., Bernat A., et al. Effect of SanOrg 123781A, a s\.1.:hetichexadecasaccharide, on clot-bound thrombin and factor Xa in vitro and in vivo // J Thromb 2003,- V.I.- №9.- P. 1959-1965.

152. Hickey A.M., Marie L., McCreedy Т. et al. Immobilization of thermophilic enz^^es inminiaturized flow reactors // Biochem Soc Trans. 2007,- V.35.- №6,- P. 1621-1624.

153. Hirsh J., Levine M.N. Low molecular weight heparin // Blood 1992,- V.79.- № 1.- P17.

154. Hirsh J.,Warkentin Т.Е., Raschke R., et al. Heparin and low-molecular-weight ^1. Parin:ety //

155. Mechanisms of action, pharmacokinetics, dosing considerations, monitoring, efficacy and ^ Chest 1998.- V.l 14.- S.5.- P.489S-510S.

156. Hirsh J. Current anticoagulant therapy—unmet clinical needs // Thromb Res. 20031. V-15.1,- P.1-8.

157. Hirsh J., Raschke R. Heparin and Low-Molecular-Weight Heparin// Chest, 2004-126,1. S.3.- P.188S-203S.

158. Hirsh J., O'Donnell M., and Weitz J. 1. New anticoagulants // Blood, 2005.- V.Jq^ P. 453-463.

159. Holmer E., Mattsson C., Nilsson S. Anticoagulant and antithrombotic effects of heparin and low molccular weight heparin fragments in rabbits // Thromb Res. 1982 V.25.- №2.- P.475- 485.

160. Holmer E., Soderberg K,. Bergqvist D. et al. Heparin and its low molecular weight derivatives: anticoagulant and antithrombotic properties // Haemostasis 1986.- V.16.- S.2.- P. 1—7.

161. Holzheimer R.G. Low-molecular-weight heparin (LMWH) in the treatment of thrombosis // Eur J Med Res. 2004,- V.30.- №4,- P.225-264.

162. Hongo R.H., Ley J., Dick S.E., Yee R.R. The effect of clopidogrel in combination with aspirin when given before coronary artery bypass grafting // J Am Coll Cardiol 2002,- V.40.- №2,-P.231-238.

163. Hoppensteadt D.A., Jeske W„ Ahsan A.,et al. Biochemical and pharmacologic profile of defined molecular weight fractions of heparin // Semin Thromb Hemost 1993.- V. 19.- S.I.- P.12-19.

164. Hoppensteadt D.A., Iqbal 0., Fareed J. Basic and clinical differences of heparin and low molecular weight heparin treatment. In: Garg HG, Linhardt RJ, Hales CA eds.Chemistry and Biology of Heparin and Heparan Sulfate.Elsevier Ltd, 2006.- P.583-606.

165. Home A., Gettins P. IHNMRspectroscopic studies on the interaction between human plasma antithrombin 111 and defined low moleculai weight heparin fragments // Biochemistry 1992,- V.31.- №8.- P.2286-2294.

166. Horrow J.C., Protamine: a review of its toxicity // Anesth. Analg. 1985,- V.64.- №3,- P.348-361.

167. Horstadius S., Lorch I.J., Chargaff E. The effect of deoxyribonucleic acids extracted from sea urchin sperm on the development of sea urchin eggs // Exp Cell Res. 1954,- V6.- №2,- P.440-492.

168. Hoylaerts M., Rijken D.C., Lijnen H.R., Collen D. Kinetics of the activation of plasminogen by human tissue plasminogen activator. Role of fibrin // J Biol Chem 1982,- V.257.-№6.- P.2912—2921.

169. Huang R., Du Y., Yang J. Preparation and anticoagulant activity of carboxybutyrylated hydroxyethyl chitosan sulfates // Carbohydrate polymers 2003.- V.51.- №4.- P.431-438.

170. Huang R., Du Y., Yang J., Fan L Influence of functional groups on the in vitro anticoagulant activity of chitosan sulfate // Carbohydr Res. 2003,- V.338.- №6.- P.483-492.

171. Hubbard A.R., Jennings A. Neutralisation of heparan sulphate and low molecular weight heparin by protamine // Thromb Haemost 1985,- V.53.- №1,- P.86- 95.

172. Hulin M.S., T.W. Wakefield P.C. Andrews, S.K. et al. A novel protamine variant reversal of heparin anticoagulation in human blood in vitro // J. Vase. Surg. 1997.- V.26.- №6.-P.1043-1048.

173. Hulin MS, Wakefield TW, Andrews PC, et al. Comparison of the hemodynamic and hematologic toxicity of a protamine variant alter reversal of low-molecular-weight heparin anticoagulation in a canine model // Lab Animal Sci., 1997.- V.47.- №2.- P. 153-60.

174. Hurlen M., Abdelnoor M. Smith P. et al. Warfarin, aspirin, or both alter myocardial infarction // N Engl J Med. 2002,- V.347.- №13.- P.969-974.

175. Hursting M.J. Alford K.L., Becker J.C. et al. Novastan (biand of argatroban): a small-molecule, direct thrombin inhibitor // Semm Thromb Haemost. 1997.- V.23.- №6,- P.503-516.

176. Il'ina A.V., Varlamov V.P. Enzymatic depolymerization of N-succinylchitosan // Bioorg Khim. 2007.- V33.- №1.- P. 156-165.

177. Ishihara M., Ono K. Structure and function of heparin and heparan sulfate: heparinoid library and modification of FGF-activities // Trends Glycosci Glycotechnol. 1998.- V.10.- №1.-P.223-233.

178. Ishiquro K., Ohira Y., Oku H. Preventive effects of Impatiens balsamina on the hen egg-white lysozyme (HEL)-induced decrease in blood flow // Biol. Pharm. Bull. 2002.- V.25.- №4,-P.505-513.

179. Islam Т. Butler M. Sikkander S. A., et al. Further evidence that periodate cleavage of heparin occurs primarily through the antithrombin binding site // Carbohydr. Res. 2002,- V.337.-№21-23.-P.2239- 2243.

180. Janes K. J., Fresneau M. P., Marazuela A., et al. Chitosan nanopartieles as delivery systems for doxorubicin // J Cont Rel., 2001.- V.73.- №2-3,- P.255-267.

181. Jenniskens G.J., Oosterhof A., Brandwijk R., et al. Heparan sulfate heterogeneity in skeletal muscle basal lamina: demonstration by phage display-derived antibodies // J Neurosci. 2000.-V.20.- №11.- P.4099-4111.

182. Ji H., Li S. P., Cheng X., et al. Antithrombotic effects of low-molecular-weight heparin calcium (LMWH-Ca) in experimental models // General Pharmacology 1999.- V.33.- №2,- P.207-211.

183. Johnson E.A., Kirkwood T.B., Stirling Y., et al. Four heparin preparations: anti-Xa potentiating effect of heparin after subcutaneous injection // Thromb Haemost 1976.- V.35.- №3,-P.586-591.

184. Johnson E.A., Mulloy B. The molecular weight range of commeicial heparin preparations // Carbohydr Res., 1976.- V.51.-№1- P. 119-127.

185. Johnson P. H„ HIRUDIN: Clinical Potential of a Thrombin Inhibitor // Annual Review of Medicine 1994,- V.45.- №1.- P. 165-177.

186. Jones G.R. Hashim R., Power D.M. A comparison of the strength of binding of antithrombin III, protamine and poly (L-lysine) to heparin samples of different anticoagulant activities // Biochimica Biophysica Acta 1986.- V.883.- №1.- P.69-76.

187. Jordan R.E., Oosta G.M. Gardner W.T., et al. The kinetics of hemostatic enzyme-antithrombin interactions in the presence of low molecular weight heparin // J Biol Chem 1980. V.255.- №21,- P.10081-10090.

188. Karkouti K., Beattie W.S. Aprotinin is useful as a hemostatic agent in cardiopulmonary surgery: no // Thromb Haemost, 2006,- V.4.- №9.- P. 1879-1881

189. Karst N. A., Linhardt R. J. Recent chemical and enzymatic approaches to the synthesis of glycosaminoglycan oligosaccharides. //Curr. Med. Chem. 2003.- V.10.- №19.- P. 1993-2031.

190. Kaufman P.Л., Gockerman J.P., Gieenberg C.S. Production of a novel anticoagulant by neoplastic plasma cells: report of a case and review of the literature // Am J Med 1989.- V.86.-№5.- P.612-616

191. Kennedy C.C., Rocks W.J. Bedside control of heparin therapy simple whole blood clotting method// J Clin Phatol, 1973,- V.26.- №11.- P.897-894.

192. Khoory M.S., Nesheim M.E., Bowie E.J. Mann K.G. Circulating heparan sulfate proteoglycan anticoagulant from a patient with a plasma cell disorder // J Clin Invest 1980,- V.65.-№3,- P.666-674.

193. Kifune K. In in "The developm'ent and application of chitin and chitosan", Industrial Technology Assotiation, Tokyo, 1987,- P.233.

194. Kindlei C., A. Bircher, P. Stulz, Protamine-induced fulminant noncardiogenic pulmonary edema following cardiopulmonary bypass // Eur. J. Cardiothorac. Surg. 1996.- V.10.- №6.-P.463— 466.

195. Kjellen L„ Lindahl U. Proteoglycans: structures and interactions // Ann Rev Biochern. 1991.- V.60.-№1.- P.443-475.

196. Kuberan В., Beeler D. L., Lech M., et al. Chemoenzymatic synthesis of classical and non-classical anticoagulant heparan sulfate polysaccharides // J. Biol. Chem. 2003.- V.278.-№352.- p. 52613-52621.

197. Kumada Т., Abiko Y. Fibrinolytic action of a new semi-synthetic polysaccharide sulfate, galactan polysulfate (DH6322), in the rat // Thromb Res 1985.- V.39.- №1.- P.9-19.

198. Kumar M. N. A review of chitin and chitosan applications, React Funct Polym // J Am Chem Soc. 2005,- V.127.- №22,- P.8204-8217.

199. Kurtz A.B., Gray R.S. Markanday S., Nabarro J.D. Circulating IgG antibody to protamine in patients treated with protamine-insulins // Diabetologia 1983.- V.25.- №4,- P.322-324.

200. Kyogashima M. Onaya J„ Miyauchi S., et al. Antitrombotic activity of avian crown dermatan sulfate.//Tromb. Res. 1999.- V.9,6.- №6.- P.459-465.

201. Lane D.A., Denton J. Flynn A.M., et al. Anticoagulant activities of heparin oligosaccharides and their neutralization by platelet factor 4 // Biochem J., 1984,- V.218.- №3.-P.725-732.

202. Lauient T.C., Tengblad A., Thunberg L., et al. The molecular-weight-dependence of the anti-coagulant activity of heparin // Biochem J. 1978.- V.175.- №2.- P.691-701.

203. Lee J. Y., Nam S. H., Im S. Y. et al. Enhanced bone formation by controlled giowth factor delivery from chitosan-based biomaterials // J Cont Rel, 2002.- V.78.- №1-3,- P. 187-197.

204. Lee R.I., White P.D. A clinical study of the coagulation time of blood // Am J Med Science, 1913.-№.145,-P.495-503.

205. Lemmer Jr. J.H., Dilling E.W. Morton J.R., et al. Aprotinin for primary coronary artery bypass grafting: a multicenter trial of three dose regimens // Ann Thorac Surg 1996.- V.62.- №2,-P. 1659-1726.

206. Lever R., Page C. P., Novel drug development opportunities for heparin // Nat. Rev Drug Discov. 2002.- V.I.- №2,- P.140-148.

207. Levine M. N., Raskob G., Landefeld S., Kearon C. Hemorrhagic complications of anticoagulant treatment // Chest 2001.- V. 119,- № 1.- P. 108S-121S.

208. Levine M.N., Hirsh J., Gent M., et al. A randomized trial comparing activated thromboplastin time with heparin assay in patients with acute venous thromboembolism requiring large daily doses of heparin // Arch Intern Med. 1994.- V.154.- №1.- P.49-56.

209. Levy J.H., Bailey J.M., Salmenpera M. Pharmacokinetics of aprotinin in preoperative cardiac surgical patients//Anesthesiology 1994,- V.80.-№5.- P. 1013-1021.

210. Levy J.H., Cormack J.G., Morales A. Heparin neutralization by recombinant platelet factor 4 and protamine // Anesih. Analg. 1995.- V.81№1.- P.35-37.

211. Levy J.H., Ramsay J.G., Guyton R.A. Aprotinin in cardiac surgery // N Engl J Med 2006.-V.354.- №4.- P.1953-1960.

212. Lin P., Sinha U. Betz A. Antithrombin binding of lowmolecular weight heparins and inhibition of factor Xa//Biochim Biophys Acta 2001.- V.1526.-№1.- P. 105-113.

213. Lindblad В., Borgstrom A., Wakefield T.W., et al. Protamine reversal of anticoagulation acheived with a low molecular weight heparin. The effect on eicosanoids, clotting and complement factors // Thromb Res 1987,- V.48.- №1,- P.31-40.

214. Lindblad В., Prolamine sulphate: a review of its effects: hypersensitivity and toxicity // Eur. J. Vase. Surg. 1989,- V.3.- №3,- P. 195-201.240., Linhardt R. J., Galliher P. M.,Cooney C. L. Polysaccharide lyases // Appl. Biochem.j |

215. Biotechnol. 1986,- V. 12,- №2,- P. 135-176,i

216. Linhardt R. J., Rice K. G., Kim Y. S., et al. Mapping and quantification of the major oligosaccharide components of heparin // Biochem. J. 1988.- V.254.- №3,- P.781-787.

217. Linhardt R. J. Heparin: an important drug enters its seventh decade // Chem. Ind. 1991.-V.2.- №1.- P.45-50.

218. Linhardt R. J., Toida T. «Heparin oligosaccharides: new analogues development and applications. In Carbohydrates in Drug Design» Witczak Z. J., Nieforth K. A. Marcel Dekker: New York, 1997.- Ch.7.- P.277-341.

219. Linhardt R. J., Gunay N. S. Production and Chemical Processing of Low Molecular Weight Heparins // Semin. Thromb. Hemostasis 1999,- V.25.- №3,- P.5-16.

220. Linhardt, R. J. Heparin: structure and activity // J. Med. Chem. 2003,- V.46.- №1.- P.2551-2564.

221. Linhardt R.J., Toida T.T. Role of glycosaminoglycans in cellular communication // Acc. Chem. Res. 2004,- V.37.- №7,- P.431^138.

222. Liu J., Thorp S. C. Cell surface heparan sulfate and its roles in assisting viral infections // Med. Res. Rev. 2002,-V.22.-№1.- P. 1-25.

223. Llamas P., OuteirhTo J., Espinoza J., et al. Report of three cases of circulating heparin-like anticoagulants // Am J Hematol 2001.- V.67.- №4.- P.256-258.

224. Loganathan D., Wang H. M., Mallis L. M., Linhardt R. J. Structural variation in the antithrombin III binding site region and its occurrence in heparin from different sources // Biochemistry 1990.- V.29.- №18,- P.4362-4368.

225. Logeart-Avramoglou D., Josefonvicz J. Carboxymethyl benzylamide sulfonate dextrans (CMDBS) , a family of biospecific polymers endowed with numerous biological properties: A review // J. Biomed. Mater. Res. 1999,- V.48.- №4,- P.578-590.

226. Lohse D. L., Linhardt R. J. Purification and characterization of heparin lyases from Flavobacterium heparinum // J. Biol. Chem. 1992,- V.267.- №34.- P.24347-24355.

227. Lonneau J.C., Herault J.P. Compaiative inhibition of extrinsic and intrinsic thrombin generation by standard heparin, a low molecular weight heparin and the synthetic ATIII-binding pentasaccharide//Thromb Haemost 1993.- V69.-№2.- P. 152.

228. Lowary L. R., Smith F. A., Coyne E., Dunham N. W. Comparative neutralization of lung-and mucosal-derived heparin by prolamine sulfate using in vitro and in vivo methods // Journal of Pharmaceutical Sciences 1970,- V.60.- №4,- P.638-640.

229. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent// J Biol Chem 1951,- V.193.- №1 P.265-340.

230. Lubenow N., Kempf R., Eichner A., et al. Heparin-induced thrombocytopenia: temporal pattern of thrombocytopenia in relation to initial use or reexposure to heparin // Chest. 2002,-V.122.- № 1 P.37-42.

231. Ma Q., Tobu M, Schultz C., et al. Molecular weight dependent tissue factor pathway inhibitor lelease by heparin and heparin oligosaccharides // Thrombosis Research 2007.- V.119.-№.5,- P.- 6^3-661.

232. Maccarana M., Sakura Y., Tawada A., et al. Domain structure of heparan sulfates from bovine org ms // J Biol Chem 1996,- V.271.- №30,- P. 17804-17810.

233. Magnani A., Albanese A, Lamponi S, Barbucci R. Blood-interaction performance of defferently sulphated hyaluronic acids//Thrombosis Res, 1996.- V. 81.- №3.-P.383-395.

234. Malleier J., Oskolkova O., Bochkov V., et al. Phosphatidylserine and oxidized phosphatidylethanolamine interact with Protein С Inhibitor (PCI) and modify its activity // Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2006.- V.4.- №1,- P.199-199.

235. Markwardt F., Klocking H.P. Heparin-induced release of plasminogen activator // Haemostasis 1977,- V.6.- №6,- P.370-374.

236. Maruyama H.B., Suhara Y., Suzuki-Watanabe J., et al. A new antibiotic, fumaramidmycin I. Production, biological properties and characterization of producer strain // J Antibiot (Tokyo). 1975,- V.28.- №9.- P.636-47.

237. Masuda K.H., Kyogashima M., Ishii T. Isolation and partial characterization of fucan sulfates from the body wall of sea cucumber Stichopus japonicus and their ability to inhibit osteoclastogenesis // Carbohydr. Res. 2004,- V.339.- №7.- P.1339-1346.

238. Mateo C, Grazu V, Pessela ВС, et al. Advances in the design of new epoxy supports for enzyme immobilization-stabilization // Biochem Soc Trans. 2007,- V.35.- №6.- P.1593-601.

239. Matsuo Т., Shanberge J.N., Matsuo О. Effect of protamine sulphate on antithrombin III activity// Clin Chim Acta 1983.- V.131.- №3,- P.233-238.

240. Matthiasson S.E., Lindblad В., Stjernquist U., Bergqvist D. The Haemorragic effect of low molecular weight heparins, dermatan sulphate and hirudin // Haemostasis 1995.- V.25.- №5.-P.203-211.

241. Mattsson C., Palm M., Soderberg K., Holmer E. Antitrombotic effects of heparin oligosaccharides//Ann. N. Y. Acad. Sci.,1989.-V.556.-№1.- P.323-32.

242. Matzsch Т., Bergqvist D., Hedner U., et al. Effect of an enzymatically depolymerized heparin as compared with conventional heparin in healthy volunteers // Thromb Haemost 1987.-V.57.- №1.- P.97-101.

243. Mauray S., De Raucourt E., Chaubet F., et al. Comparative anticoagulant activity and influence on thrombin generation of dextran derivatives and of a fucoidan fraction // J Biomater Sci Polym Ed., 1998,- V.9.- №4,- P.373-460.

244. McEvoy G.K. American Hospital Formulary Service Drug Information 1998 // American Society of Health-System Pharmacists, 1998.- V.33.- №6.- P.611-612.

245. Melo F.R., Pereira M.S., Foguel D., Mourao P.A. Antithrombin-mediated anticoagulant activity of sulfated polysaccharides: different mechanisms for heparin and sulfated galactans // J. Biol. Chem. 2004,- V.279.- №20,- P.20824-20859.

246. Messmore H. L., Wehrmacher W. H., Coyne E., Fareed J. Heparin to pentasaccharide and beyond: the end is not in sight // Semin. Thromb. Hemost. 2004,- V.30.- №1,- P.81-88.

247. Mestechkina N. M., Shcherbukhin V. D., Bannikova G. E., et al. Anticoagulant activity of low-molecular-weight sulfated derivatives of galactomannan from Cyamopsis tetragonoloba (L.) seeds // Prikl Biokhim Mikrobiol. 2008,- V.44.- № 1.- P. 111 -117

248. Mikola J., Suolinna E. Purification and properties of an inhibitor of microbial alkaline proteinases from barley // Arch. Biochem. Biophys. 1971.- V.l44,- №2.- P.566-575.

249. Mine Y., Ma F., Lauriau S. J. Antimicrobial peptides released by enzymatic hydrolysis of hen egg white lysozyme // Agric Food Chem. 2004,- V.52.-№5.- 1088-2030.

250. Minix R., Doctor V. Interaction of fucoidan with proteases and inhibitors of coagulation and fibrinolysis // Tromb. Res. 1997,- V.87.- №1.- P.419-429.

251. Mitchell M. A., Wilks J. W. Inhibitors, of angiogenesis Academic Press: San Diego, 1992.-V. 27.

252. Mochizuki Т., Olson P.J., Szlam F., et al. Protamine reversal of heparin affects platelet aggregation and activated clotting time after cardiopulmonary bypass // Anesth Analgesia 1998,-V.87.- №4,- P.781-786.

253. Mohammad S. F., Anderson W. H., Smith J. В., Chuang H. Y. Effects of heparin on platelet aggregation and release and thromboxane A2 production.and R. G. Mason // Am J Pathol. 198.- 1,-V.104.- №2,- P.132—141.

254. Moll S., Lindley C., Pescatore S., et al. Phase 1 study of a novel recombinant human soluble thrombomodulin ART-123 // J Thromb Haemost. 2004,- V.2.- №10,- P. 1745-1796.

255. Monien B.H., Henry B.L., Raghuraman A., et al Novel chemo-enzymatic oligomers of cinnamic acids as direct and indirect inhibitors of coagulation proteinases // Bioorg Med Chem. 2006.- V. 14,- №23.- P.7988-7998.

256. Mosolov V. V., Sokolova E.V., Livenskaya O. A. Spectra of circular dichroism of proteinase inhibitors from corn// Biokhimiya 1983.- V.48.- №9,- P.1538-1579.

257. Mosolov V.V., Grigor'eva L.I., Valueva T.A. The role of proteolytic enzymes and their inhibitors in plant protection (review) // Prikl Biokhim Mikrobiol. 2001.- V.37.- №2,- P.131-171.

258. Mosolov V.V., Valueva T.A. Participation of proteolytic enzymes in the interaction of plants with phytopathogenic microorganisms // Biochemistry (Mosc). 2006.- V.71.- №8.- P.838-883.

259. Motulsky H.J., Cristopoulos A. «Fitting Models to Biological Data using Linear and Nonlinear Regression» GraphPad Software Inc , San Diego С A, 2003.

260. Mourao P.A., Pereira M.S. Searching for alternatives to heparin. Sulfated fucan from marine invertrbrates // Trends Cardiovasc.Med. 1999.- V.9.- №8.- P.225-232.

261. Mousa S., Fareed J. Overview: from heparin to low molecular weight heparins: beyond anticoagulation// Curr Opin Invest Drug 2001.- V.2.- №8.- P. 1077-1080.

262. Muzzarelli R., in "Advances in chitin and chitosan " (Eds Brine C.J., Sndoford PA, Zikakis JP), Elsevier Applied Science, London and New-York, 1992.- P.-25

263. Myllymaki O., Eerikainen Т., Suortti Т., et al. Depolymerization of Barley Starch during Extrusion in Water Glycerol Mixtures // Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie 1997.- V.30.-№4.- P.351-358.

264. Nader H. В., Dietrich C. P. Natural occurrence and possible biological role of heparin. In Heparin Chemical and Biological Properties, Clinical Applications; Lane D. A., Lindahl U., Eds.; CRC Press: Boca Raton, FL, 1989.- P. 115-133.

265. Nader H.B., Lopes C.C, Rocha H.A., et al. Heparins and heparinoids: occurrence,structure and mechanism of antithrombotic and hemorrhagic activities // Curr. Pharm . Des.2004.- V.10.-№9.- P.951-966.

266. Naggi A., Casu В., Perez M., et al Modulation of the heparanase-inhibiting activity of heparin through selective desulfation, graded N-acetylation, and glycol splitting // J. Biol. Chem. 2005.- V.280.- №13.- P. 12103-12113. "

267. Nishino Т., Yamauchi Т., Horie M., et al. Effects of a fucoidan on the activation of plasminogen by u-PA and t-PA // Thromb Res. 2000.- V.99.- №6.- P.623-659.

268. Ockelford P. A, Carter C.J., Cerskus A., et al. Comparison of the in vivo hemorrhagic andvantithrombotic effects of a low antithrombin-III affinity heparin fraction // Thromb Res 1982.-V.27.- №1.- P.679-690.

269. Ofosu F. A., Modi G. J., Blajchman M. A., et al. Increased sulphation improves the anticoagulant activities of heparan sulphate and dermatan sulphate // Biochem J. 1987.- V.15.-№248,- P. 889-896.

270. Ofosu A., Gray E. Mechanisms of action of heparin: applications to the development of derivatives of heparin and heparinoids with antithrombotic properties // Sem Thromb Haem, 1988,-V.14.- №1.- P.9-15.

271. Okajima Y., Kanayama S., Maeda Y., et al. Studies on the neutralizing mechanism of antithrombin activity of heparin by protamine // Thromb. Res. 1981,- V.24.- №2,- P.21-29.

272. Oku K., Kawamura Y., Nakade H., et al. Heparin-induced aggregation is recognized on platelets activated by physical stimuli // Japanese Journal of Medical Technology 2003.- V.52.-№12,- P.1431-1435.

273. O'Leary R., Rerek M., Wood E. Fucoidan modulates the effect of transforming growth factor (TGF)-betal on fibroblast proliferation and wound repopulation in in vitro models of dermal wound repair // J. Biol Pharm Bull. 2004,- V.27.- №2 .- P266-336.

274. Otakara A., in "The development and application of chitin and chitosan", Industrial Technology Assotiation, Tokyo, 1987.- P.161.

275. Padilla A., Gray E., Duncan S. et al. Inhibition of thrombin generation by heparin and low molecular weight (LMW) heparins in the absence and presence of platelet factor 4 (PF4) // British Journal of Haematology 2008,- V. 82,- №2,- P.406 413.

276. Palm M., Mattsson C. Pharmacokinetics of heparin and low molecular weight heparin fragment (Fragmin) in rabbits with impaired renal or metabolic clearance // Thromb Res 1985.-V.40.-№1.- P. 129-133.

277. Palmer R.N., Rich M.E., Rick P.D., et al. Circulating heparin sulfate anticoagulant in a patient with a fatal bleeding disorder // N Engl J Med 1984,- V.310.- №7,- P. 1696-1699.

278. Paques E.P., Stohr H.A., Pleimburger N. Study on the mechanism of action of heparin and related substances on the fibrinolytic system: relationship between plasminogen activators and heparin // Thromb Res 1986.-V.42,- №2,- P.797-807.

279. Pavao M.S.G., Aiello K.R.M., Wemeck C.C., et al. Higly sulfated dermatan sulfates from Ascidians // J.Biol.Chem. 1998,- V.273.- №43.- P.27848-27857.

280. Pejler G., Danielsson A., Bjork I., et al. Structure and antithrombin binding properties of heparin isolated from the clams Anomalocardia brasiliana and Tivela macroides // J Biol Chem 1987,- V.262.- №17,- P.l 1413-11421.

281. Pellegrini A., Thomas U., Bramas N. et al. Identification and isolation of a bactericidal domain in chicken egg white lysozyme // Appl. Microbiol. 1997.- V.82.- №3,- P.372-380.

282. Pereira M.S., Mulloy В., Mourao P.A.S. Structure and anticoagulant activity of sulfated fucans // J.Biol.Chem. 1999,- V.274.- №43,- P.7656-7667.

283. Pereira M.S., Melo F.R., Mourao P.A. Is there a correlation between structure and anticoagulant action of sulfated galactans and sulfated fucans? // Glycobiology 2002,- V.12.-№10.- P.573-580.

284. Pervin A., Gallo C., Jandik К A., et al. Preparation and structural charactcrization of large heparinderived oligosaccharides // Glycobiology 1995.- V.5.- №1,- P.83-95.

285. Petitou M., Herault J.P., Bernat A., et al. Synthesis of Ihrombin-inhibiting heparin mimelics without side effects //Nature.1999.- V.398.- №6726,- P.417-422.

286. Petitou M., Imberty A., Duchaussoy P., et al. Experimental proof for the structure of a thrombin-inhibiting heparin molecule // Chemistry. 2001,- V.7.- №1.- P.858-931.

287. Pires L., Gorin P.A.J., Reicher F., Sierakowski M. R. An active heparinoid obtained by sulphation of a galactomannan extracted from the endosperm of Senna macranthra seeds // Caibohydr. Res 2001.- V.46.- №2,- P.165-169.

288. Pletcher C.H., Nelsestuen G.L. Two-substrate reaction models for the heparin-catalyzed bovine antithrombin/protease reaction // J Biol Chem 1983.- V.258.- №3,- P 1086-1091.

289. Poller L., Thomson J.M., Taberner D.A., Clarke D.K.The correction of coagulometer effects on international normalized ratios: a multicentre evaluation // Bi J Haematol. 1994 V.86.- №1.-P.l 12-119.

290. Ponce N.M., Pujol C.A., Damonte E.B., et al. Fucoidans from the brown seaweed Adenocystis utricularis: extraction methods, antiviral activity and structural studies // Carbohydrate Research, 2003,- V.338.- №2,- P. 153-165.

291. Porsche R., Brenner Z.R. Allergy to protamine sulfate // Heart Lung 1999.- V.28.- №3,-P.418^128.

292. Pouplard C., Courvet C.,Regina S., et al. Development of antibodies specific to polyanion-modified platelet factor 4 during treatment with fondaparinux // J Thromb Haemost 2005,- V.3.-№3,- P.2813-2818.

293. Prandoni P., Biuchi O., Sabbion P., et al. Prolonged thromboprophylaxis with oral anticoagulants after total hip arthroplasty: a prospective controlled randomized study.// Arch Intern Med. 2002.- V.162.- №17.- P.l966-1971.

294. Preston F.W. The antihepann effect of Polybrene. (A polymer of N,N,N',N,-Tetramethylhexamethylenediamine and trimethylene bromide) // J Lab Clin Med 1952.- V.40.-№3.- P.927.

295. Pugsley M.K., Kalra V., Froebel-Wilson S. Protamine is a low molecular weight polycationic amine that produces actions on cardiac muscle // Life Sci. 2002.- V.72.- P.293-305.

296. Rabenstein D.L. Heparin and heparan sulfate: structure and function // Nat. Prod. Rep. 2002.- V.19.- №3,- P.312-331.

297. Racanelli A., Hoppensteadt D.A., Fareed J. In vitro protamine neutralization profiles of heparins differing in source and molecular weight // Semin Thromb Hemostasis. 1989.- V.l5.- №4,-P.386-389.

298. Racanelli A., Fareed J. Neutralization of the antithrombotic effects of heparin and Fraxiparin by protamine sulfate // Thrombosis Research 1992,- V.68.- №3.- P.211-222.

299. Redman A.R. Implications of cytochrome P450 2C9 polymorphism on warfarin metabolism and dosing // Pharmacotherapy 2001,- V.21.- №2.-P.235-242.

300. Refino C.J., Jeet S., DeGuzman L., et al. A human antibody that inhibits factor IX/IXa function potently inhibits arterial thrombosis without increasing bleeding // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2002,- V.22.- №3,- P.517-522.

301. Rent R., Ertel N., Eisenstein R., Gewurz H. Complement activation by interaction of polyanions and polycations. I. Heparin-protamine induced consumption of complement // J. Immunol. 1975.-V.l 14,-№2,- P.120- 124.

302. Rezaie A.R. Heparin chain-length dependence of factor Xa inhibition by antithrombin in plasma// Thrombosis Research 2007.- V.l 19,- №4,- P.481-488.

303. Rezaie A.R. Prothrombin protects factor Xa in the prothrombinase complex from inhibition by the heparin-antithrombin complex // Blood. 2001.- V.97.- №5,- P.2308-2313.

304. Ridker P.M., Goldhaber S.Z., Danielson E., et al. Long-term, low-intensity warfarin therapy for the prevention of recurrent venous thromboembolism // N Engl J Med 2003,- V.348.- №2.-P. 1425-1434.

305. Rijken D.C., Wijngaards G., Welbergen J. Immunological characterization of plasminogen activator activities in human tissue and body fluids // J Lab Clin Med 1981,- V.97.- №3.-P477-563.

306. Robinson H. С., Horner А. А., Но"о"к М„ et al proteoglycan form of heparin and its degradation to singlechain molecules // J. Biol. Chem. 1978,- V.253.- №12.- P.6687-6693.

307. Robson R. The use of bivalirudin in patients with renal impairment // J Invasive Cardiol. 2000.- V.12.- №10.- P.33F-36F.

308. Rosa A.T., Rotshild A.M., Rotshild Z. Fibrinolytic activity evoked in plasma of the normal and adrenalectomized rat by cellulose sulfate // Br J Pharmacol 1972,- V.45.- №3,- P.470-475.

309. Rosenberg R.D. Biological actions of heparin // Siminars in Hematology, 1977,- V.14.-№1.- P.427 — 440.

310. Ross D.N. Theophylline-ethylenediamine in the measurement of blood circulation time // Br Heart J. 1951.- V.13.- №5.- P.56-60.

311. Rossmann P., Matousovic К., Horacek V. Protamineheparin aggregates, their fine structure, histochemistry and renal deposition. Virchows Archiv 1982,- V.40.- P.81-98.

312. Salmivirta M., Lidholt K., Lindahl U. Heparan sulfatc:a piece of information // FASEB J. 1996.- V.10.- №1,- P.1270-1279.

313. Salzman E.W., Rosenberg R.D., Smith M.H., et al. Effect of Heparin and Heparin Fractions on Platelet Aggregation // J Clin Invest. 1980,- V. 65.- №3. P.64-73.

314. Salzman E.W., Rosenberg R.D., Smith M.H., et al. Effect of heparin and heparin fractions on platelet aggregation // J Clin Invest 1980.- V.65.- №3.- P.64-73.

315. Samama M.M., Gerotziafas G.T. Evaluation of the pharmacological properties and clinical results of the synthetic pentasaccharide (fondaparinux) // Thromb Res. 2003,- V.109.- P. 1-11

316. Sandeep Chauhan, Bisoi Akshay Kumar, Beeraka Heramba Rao, et al. Efficacy of aprotinin, epsilon aminocaproic acid, or combination in cyanotic heart disease // Ann Thorac Surg2000,- V.70.- №5,- P. 1308-1312

317. Sanderson R. D. Heparan sulfate proteoglycans in invasion and metastasis // Semin. Cell Dev. Biol. 2001.- V. 12,- №2,- P.89-98;

318. Sanmartin M., Bonvini R. F., Verin V., et al. Bivalirudin in Acute Coronary Syndromes // N Engl J Med 2007.- V.356.-№2.- P. 1069-1071.

319. Sasisekharan R., Shriver Z., Venkataraman G., Narayanasami U. Nat. Rev. Cancer 2002,-V.2.- №3.- P.521-528.

320. Sasisekharan R., Venkataraman G. Heparin and heparan sulfate: biosynthesis, structure and function// Curr. Opin. Chem.Biol. 2000,- V.4.- №6.- P.626-631.

321. Satomi O., Yoshitaka N., Sunao H., et al. Human antithrombin Ill-derived heparin-binding peptide, a novel heparin antagonis // Life Sciences 2003.- V.73.- №3,- P.2793-2806.

322. Schick B.P., Gradowski J.F., San Antonio J.D., Martinez J. Novel design of peptides to reverse the anticoagulant activities of heparin and other glycosaminoglycans // Thromb. Haemost.2001.-V.85.-№3.-P.482-487.

323. Schjetlcin R., Sletnes K.E., Wishnff F. A quantitative, semi-automated and computer-assisted test for lupus anticoagulant // Thromb Res 1993,- V.69.- №1.- P.239-250.

324. Schulman S., Hellgren-Wangdahl M. Pregnancy, heparin and osteoporosis // Thromb Haemost 2002.- V.87.- №3.- P. 180-181.

325. Scully M.F., Ellis V., Shah N., Kakkar V. Effect of a heparan sulphate with high affinity for antithrombin III upon inactivation of thrombin and coagulation Factor Xa // Bioch J, 1989.-V.262.- №2,- P.651-568.

326. Serruys P.W., Herrman J.P., Simon R., et al.Acomparison of hirudin with heparin in the prevention of restenosis after coronary angioplasty. Helvetica Investigators // N Engl J Med. 1995.-V.333.- №1.- P.757-763.

327. Sharath M.D., Metzger W.J., Richerson H.B., et al., Protamineinduced fatal anaphylaxis: prevalence of antiprotamine immunoglobulin E antibody // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1985.-V.90.- №1.- P.86-90.

328. Shenoy S., Harris R.B., Sobel M., Development of heparin antagonists with focused biological activity // Curr. Pharm. 1999,- V.5.- №2,- P.965- 986.

329. Shigemasa Y., Saito K., Sashiwa H., Saimoto H.Enzymatic degradation of chitins and partially deacetylated chitins // Int J Biol Macromol. 1994.-V.16,- №l.-P.43-49.

330. Siragusa S., Cosmi В., Piovella F., et al. Low-molecularweight heparins and unfractionated heparin in the treatment of patients with acute venous thromboembolism: results of a meta-analysis //Am JMed 1996,-V. 100,-№4,- P.269-146.

331. Skrzypczak-Jankun E., Carperos V.E. Ravichandran K.L., et al. Structure of the hirugen andhirulog 1 complexes of alpha-thrombin//J Mol Biol. 1991.- V221.- №1.- P.1379-1393.

332. Smith J.W., Kanuer D.J. A heparin binding site in antithrombin III // J Biol Chem 1987.-V.25.- №2,- P. 11964-12034.

333. Stuart R.K., Michel A. Monitoring heparin therapy with the activated partial thromboplastin time // Can Med Assotiation J, 1971,- V.l()4.- №6.- P.385-388.

334. Suhara Y., Maruyama H.B., Koto Y., et al. A new antibiotic, fumaramidmycin. II. Isolation, structure and syntheses // J Antibiot (Tokyo). 1975,- V.28.- №2.- P.648-703. 1

335. Suraj G. Kamat, Alan Michelson, Stephen E. et al. Fibrinolysis Inhibits Shear Stress-Induced Platelet Aggregation // Circulation. 1995,- V.92.- №2,- P.1399-1407.

336. Taylor F.B. Jr. Role of tissue factor and factor Vila in the coagulant and inflammatory response to LD100 Escherichia coli in the baboon // Haemostasis. 1996.- V.26 .- J^2.- P.83-91.

337. Teien A.M., Lie M. Heparin assay in plasma a comparison of five clotting methods // Thromb Res. 1975,- V.7.- №2,- P.777-788.

338. Teien A.M., Lie M., Abilldgaard U. Assay of heparin in plasma using a chromogenic substrate for activated factor X // Thromb Res. 1976.- V.8.- №3.- P.413-419.

339. Teien A.N., Lie M. Evaluation of an amidolytic heparin assay method: increased sensitivity by adding purified antithrombin III // Thromb Res. 1977,- V.10.- №5,- P.399-410.

340. Thorsen S. The mechanism of plasminogen activation and the variability of the fibrin effector during tissue-type plasminogen activatorc- mediated fibrinolysis // Ann NY Acad Sci 1992,- V.301.- №2,- P.52-63.

341. Tinker J.H., Roberts S.L. Management of cardiopulmonary bypass. In // Kaplan JA, ed. Cardiac Anesthesia. 1987,- V.2.- №2.- P.895-926.

342. Tiu R. V., Kalmadi S. R., Lowe C., et al. Epsilon aminocaproic acid (EACA) is effective in controlling thrombocytopenic hemorrhage in patients with hematologic malignancies // Journal of Clinical Oncology, 2005.- V.23.- №7,- P.6648-6652.

343. Toida Т., Yoshida H., Toyoda H., et al. Structural Differences and the Presence of Unsubstituted Amino Groups in Heparan Sulphates from Different Tissues and Species // Biochem. J. 1997,- V.322.- №1,- P.499-506.

344. Tokura S., Nishi N., Nishimura S., Somorin O. Inhibition of the hydrolytic activity of thrombin by chitin heparinoids // Carbohydr Res. 1986. 1983.- V.15.- №1,- P.-286-378.

345. Tollefsen D.M., Peacock M.E, Monafo W.J. Molecular size of dermatan sulfate oligosaccharides required to bind and activate heparin cofactor II // J Biol Chem, 1986.- V.261.-№19,- P.8854-8912.

346. Torjemanea L., Guermazib S. Ladeba S., et al Heparin-like anticoagulant associated with multiple myeloma and neutralized with protamine sulfate // Blood Coagulation and Fibrinolysis 2007,- V.18.- №1.-P.279-281.

347. Toschi V., Lettino M., Gallo R. et al. Biochemistry and biology of hirudin // Coron Artery Dis. 1996.- V.7.- №7,- P.420-428.

348. Toshiaki I., Akio K„ Masaki F. et al. Factor Xa-Inhibitor (Dx-9065a) Modulates the Leukocyte-Endothelial Cell Interaction in Endotoxemic Rat // Shock. 2002 .- V.17.- N°2.- P.159-162.

349. Trento F., Cattaneo F., Pescador R., et al. Antitrombin activity of an algae polysaccharide // Tromb. Res. 2001.- V.102.- №5,- P.457-465.

350. Turnbull J, Powell A., Guimond S. Heparan sulfate: decoding a dynamic multifunctional cell regulator // Trends Cell Biol. 2001.- V.l 1.- №2,- P.75-82.

351. Turnbull J. E. Integral glycan sequencing of hepaian sulfate and heparin saccharides. Methods Mol. Biol. 2001,- V.l71.- №2.- P. 129-139.

352. Turnbull J. E., Ilopwood J. J., Gallagher J. T. A strategy for rapid sequencing of heparan sulfate and heparin saccharides // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999.- V.96.- №4,- P.2698-2703.

353. Turpie A.G., Bauer K.A., Eriksson B.I., et al. Postoperative fondaparinux versus postoperative enoxaparin for prevention of VTE after elective hipreplacement surgery: a randomised double-blind trial // Lancet. 2002,- V.359.- №16,- P.1721-1726.

354. Tyrrell D. J., Home A. P., Holme K.R., et al. Heparin in inflammation: potential therapeutic applications beyond anticoagulation // Adv. Pharmacol. 1999,- V.46.- №3.- P.151-208.

355. Van Walraven C., Hart R.G., Singer D.E., et al. Oral anticoagulants vs aspirin in nonvalvular atrial fibrillation: An individual patient meta-analysis // JAMA 2002,- V.288.- №14,-P.2441-2448.

356. Vermeer F., Vahanian A., Fels P.W., et al. Argatroban and alteplase in patients with acute myocardial infarction: the ARGAMI Study // J Thromb Thrombolysis. 2000,- V.10.- №4,- P.233-240.

357. Verrecchio A., Germann M.W., Schick B.P., et al. Design of peptides with high affinities for heparin and endothelial cell proteoglycans // J Biol Chem 2000,- V.275.- №4,- P.7701-7708.

358. Vikhoreva G., Bannikova G., Stolbushkina P., et al. Preparation and anticoagulant activity of a low-molecular-weight sulfated chitosan // Carbohydrate polymers 2005.- V.62.- №.4,- P.327-332.

359. Violand B.N., Castellino F J. Mechanism of the urokinase-catalyzed activation of human plasminogen//J Biol Chem 1976.- V.251.- P.3906-3918.

360. Vismara E., Pierini M., Guglieri S., et al. Structural Modification Induced in Heparin by a Fenton-Type Depolymerization Process Semin // Thiomb Hemost. 2007.- V.33.- №3.- P.466-477.

361. Volpi N. Characterization of heparins with different relative molecular masses (from 11,600 to 1600) by various analytical techniques // J Chromatogr. 1993,- V.622.- №1,- P. 13-20.

362. Vyas К.Л., Patel H.V., Vyas A.A. . Wu W. Glycosaminoglycans bind to homologous cardiotoxins with different specificity // Biochemistry. 1998.- V.37.- №13,- P.4527-4534.

363. Wagenvoord R., Dieri R.A., van Dedem G., et al, Linear diffusion of thrombin and factor Xa along the heparin molecule explains the effects of extended heparin chain lengths // Thrombosis Research 2008,- V.122.- №2,- P.237-282.

364. Wakefield T.W., Bouffard J.A., Spaulding S.A., et al. Sequestration of platelets in the pulmonary circulation as a consequence of protamine reversal of the anticoagulant effects of heparin // J Vase Surg 1987.- V.5.- №2,- P. 187-280.

365. Wakefield T.W., Andrews P.C., Wrobleski S.K., et al. Effective and less toxic reversal of low-molecular weight heparin anticoagulation by a designer variant of protamine // J Vase Surgery 1995.- V.21.- №4,- P.839-49.

366. Wakefield T.W., Andrews P.C., Wrobleski S.K., et al. A +18RGD. protamine variant for nontoxic and effective reversal of conventional heparin and low molecular weight heparin anticoagulation // J Surg Res 1996.- V.63.- №7.- P.280-286.

367. Walenga J., Jeske W., Hoppensteadt D., Fareed J. Factor Xa inhibitors:Today and beyong // Cur Opin invest Drugs 2003.- V.4.-№3.- P.272-281.

368. Wall D., Douglas S., Ferro V., et al. Characterisation of the anticoagulant properties of a range of structurally diverse sulfated oligosaccharides // Thromb Res. 2001,- V.103.- №4.- P.325-360.

369. Wallis R.B. Hirudins: from leeches to man // Semin Thromb Hemost. 1996.- V.22.- №6.-P.185-196.

370. Wang W., Bo S., Li S., Qin W. Determination of the Mark-Houwink equation for chitosans with different degrees of deacetylation // Int J Biol Macromol 1991,- V. 13.- №5,- P.281-286.

371. Warda M., Mao W., Toida Т., Linhardt R. J. Turkey intestine as a commercial source of heparin? Comparative structural studies of intestinal avian and mammalian glycosaminoglycans // Сотр. Biochem. Physiol. 2003.-V, 134.-№11.-P. 189-197.

372. Warkentin Т.Е., Levine M.N., Hirsh J., et al. Heparin-induced thrombocytopenia in patients treated with low molecular weight heparin or unfractionated heparin // N Engl J Med 1995,- V.332.-№2.- P.1330-1335.

373. Weitz J.I. Low-molecular-weight heparins // New Engl J Med 1997,- V.337.- №10,- P.688-698.

374. Weitz J.I., Buller H.R. Direct thrombin inhibitors in acute coronary syndromes: present and future // Circulation. 2002,- V.105.- №8,- P.1004-1011.

375. Wessel H. P., Bartsch S. Conformational flexibility in highly sulfated beta-D-glucopyranoside derivatives // Carbohydr Res. 1997,- V.8.- №274,- P. 1-9.

376. Wessler S., Reimer S.M., Sheps M.C. Biologic assay of a thrombosis-inducing activity in human serum // J. Appl Physiol 1959.- V. 14,- №1.- P.943-946.

377. Whinna H.C., Blinder M.A., Szcwczyk M., et al. Role of lysine 173 in heparin binding to heparin cofactor II // J Biol Chem, 1991.- V.266.- №13.- P.8129-8164.

378. Whitelock J. M., Iozzo R. V. Heparan sulfate: a complex polymer charged with biological activity // Chem. Rev. 2005,- V.l05.- №7.- P.2745-2764.

379. Xin H., Thomas J. Girard, Pamela Baum, et al. Structural Requirements for TFPI-Mediated Inhibition of Neointimal Thickening After Balloon Injury in the Rat Arteriosclerosis // Thromb Vase Biol. 1999,- V.19.-№3.- P.2563-2567.

380. Yamada S., Sugahara K. Structure of oligosaccharides isolated from heparan sulfate and heparin and substrate specificities of the degrading enzymes of bacterial origin // Trends Glycosci.Glycotechnol. 1998.- V.10.- №6,- P.95-123.

381. Yamagishi R., Niwa M., Sakuragawa N. Thrombin inhibitory activity of heparin cofactor II depends on the molecular weight and sulfate amount of dextran sulfate // Thromb Res. 1986.-V.44.- №3.- P.347-401.

382. Yates E. A., Guimond S. E., Turnbull J. E. Highly diverse heparan sulfate analogue libraries: providing access to expanded areas of sequence space for bioactivity screening // J. Med. Chem. 2004,- V.47.- №1.- P.277-280.

383. Yin E.T., Wessler S., Butler J.V. Plasma heparin: a unique, practical, submicrogram-sensitive assay // J Lab Clin Med. 1973,- V.81.- №2.- P.298-310.

384. Yokoyama Т., Hosaka Y., Takagi S. The place of chemical leeching with heparin in digital replantation: subcutaneous calcium hepaiin for patients not treatable with systemic heparin // Plast Reconstr Surg. 2007,- V. 119,- №4.- P. 1284-1377.

385. Young E., Cosmi В., Weitz J., Hirsh J. Comparison of the non-specific binding of unfractionated heparin and low molecular weight heparin (enoxaparin) to plasma proteins // Thromb Haemost 1993 V.70.- №1,- P.625- 655.

386. Yu G., Gunay N.S., Linhardt R.J., Toida Y., et al. Preparation and anticoagulant activity of the phosphosulfomannan PI-88 // Eur J Med Chem. 2002,- V37.- №10.- P.783-874.

387. Zaikov G.E. Degradation and Stabilization of Polymers // N.Y.:Nova Sci. Publ., 1999.-P.296.

388. Zanon C„ Bortolini M., Chiappino I. Low-molecular-weight heparin and calcium heparin in thrombosis prophylaxis in patients with percutaneous arterial and venous ports for colorectal liver metastases // Tumor 2005,- V.91.- №6,- P.477-557.

389. Zhang D., Raghavan N., Chen S.Y., et al. Reductive isoxazole ring-opening of the anticoagulant razaxaban is the major metabolic clearance pathway in rats and dogs // Drug Metab Dispos. 2008,- V.36.- №2.- P.303-318.

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Антикоагулянтная активность низкомолекулярных гепаринов, полученных с помощью гидролаз

Автореферат диссертации по медицине на тему Антикоагулянтная активность низкомолекулярных гепаринов, полученных с помощью гидролаз

Оглавление диссертации Толстенков, Александр Сергеевич :: 2009 :: Старая Купавна

Введение диссертации по теме "Фармакология, клиническая фармакология", Толстенков, Александр Сергеевич, автореферат

Заключение диссертационного исследования на тему "Антикоагулянтная активность низкомолекулярных гепаринов, полученных с помощью гидролаз"

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Толстенков, Александр Сергеевич

Похожие научные работы

Каталог диссертаций