Антикоагулянтная активность нативных и модифицированных фукоиданов и гуарового галактоманнана

Лапикова, Елена Сергеевна

Диссертации по медицине → Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Антикоагулянтная активность нативных и модифицированных фукоиданов и гуарового галактоманнана

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Лапикова, Елена Сергеевна Москва 2009 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.00.25

Автореферат диссертации по медицине на тему Антикоагулянтная активность нативных и модифицированных фукоиданов и гуарового галактоманнана

Ои34УЭ ЮБ

На правах рукописи

ЛАПИКОВА ЕЛЕНА СЕРГЕЕВНА

АНТИКОАГУЛЯНТНАЯ АКТИВНОСТЬ НАТИВНЫХ И МОДИФИЦИРОВАННЫХ ФУКОИДАНОВ И ГУАРОВОГО ГАЛАКТОМАННАНА

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 8 ОКТ 2009

Старая Купавна - 2009

003479105

Работа выполнена в лаборатории патологии и фармакологии гемостаза Государственного учреждения Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Дрозд Наталья Николаевна

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор Варламов Валерий Петрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор - Хлябич Георгий Николаевич

доктор медицинских наук, професср, член-корр. РАМН - Шимановский Николай Львович

Ведущая организация: Московский государственный медико-стоматологический университет

Защита диссертации состоится « 27 » октября 2009 г

В 10.30 часов на заседании диссертационного совета Д 217.004.01 при Всероссийском научном центре по безопасности биологически активных веществ (ВНЦ БАВ) по адресу: 142450, Московская обл., г. Старая Купавна, Кирова ул., 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ВНЦ БАВ Автореферат разослан « »_2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Л.В.Корольченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. В настоящее время для предотвращения и лечения тромбоэмболических осложнений широко используемыми в клинической практике препаратами являются нефракционированный гепарин, низкомолекулярпые гепарины, а также антагонисты витамина К (Haas S. 2009; Liodakis Е. и соавт. 2009; Laskin С.А. и соавт. 2009). Однако, эти вещества обладают рядом побочных эффектов, такими как непредсказуемость (в случае нефракционированного гепарина), кровотечения, развитие тромбоцитопении, остеопороза и др (Liodakis Е. и соавт. 2009; Sugimoto Т., Matsuo Т., Wanaka К. 2009; Le Templier G„ Rodger M.A. 2008; Cuermazi S„ EIloumi-ZghaL H., Ben Hassine L 2007; Rajgopal R и соавт. 2008 ). В связи с этим значимым и перспективным является поиск фармакологических средств для профилактики и лечения тромбозов на основе антикоагулянтов прямого типа действия из ряда новых полусинтетических и природных сульфатированных полисахаридов.

Сульфатированные полисахариды проявляют разные виды фармакологической активности, такие как антикоагулянтная, антитромботическая, противовирусная, радиопротекторная, противоязвенная (Hayashi К., Nakano Т., Hashimoto М. 2008; Chen J.H. и соавт. 2009; Medeiros V.P. и соавт. 2008; Alekseyenko T.V. и соавт. 2007; Kiphuth I.C. и осавг. 2009; Li N. и соавт. 2005). В качестве ангитромботических средств, кроме нефракционированного гепарина в настоящее время используется ряд низкомолекулярных гепаринов со средним распределением молекулярных масс от 4 до 7 кДа и отношением активностей против тромбина и фактора Ха (alla/aXa) от 1,5 до 5. Интенсивно используются в разработках по изысканию антитромботических средств и другие представители основных классов гликозаминогликанов. Отмечена корреляция между структурой и антикоагулянтной/антитромботической активностями

нефракционированного, низкомолекулярных гепаринов и сульфатов гепарана, дерматана, хондроитина, которые выделяют из тканей млекопитающих (Glauser B.F., Pereira M.S., Monteiro R.Q. 2008; Osborne S.A. и соавт. 2008; Bethea H.N. и соавт. 2008; Korir A.K., Larive C.K. 2009). Значительный интерес представляют сульфатированные полисахариды из бурых, красных и зеленых морских водорослей (фукоиданы, каррагинаны) и беспозвоночных (фуканы). Эти сульфатированные полисахариды ингибируют активность тромбина, факторов 1Ха и Ха посредством активации плазменных ингибиторов сериновых протеиназ свертывающей системы крови - антитромбина III и кофактора гепарина II. При значительной молекулярной массе (80-100 кДа) удельная анти-На активность у отдельных

фукоиданов достигает 130 ЕД/мг (Nishino Т. и соавт. 1994; Jenniskens G.J. и соавт. 2000). Антитромботический эффект фукоиданов усиливается за счет высвобождения из эндотелия сосудов ингибитора пути тканевого фактора (Boisson-Vidal С. и соавт. 2008; Giraux J.L. и соавт. 1998). Кроме того, такие природные полимеры как хитозан, галактоманнан сульфатируют для придания им антикоагулянтных свойств.

Цель исследования - исследование связи между структурами и механизмами антикоагулянтного действия нативных и химически модифицированных фукоиданов из бурых морских водорослей Fucus evanescens, Laminaria cichorioides, Undaria pimatifida, Laminaria gurjanovae, Laminaria japónica, Costaría Costata, а также сульфатированного галактоманнана [СГМ, ММ=127 кДа и степень сульфатирования (СС)=1,46] из семян Cyamopsis tetragonoloba (L).

Задачи исследования:

1. Исследование влияния сульфатированных полисахаридов растительного происхождения [фукоиданов из бурых морских водорослей Fucus evanescens, Laminaria cichorioides, Undaria pinnatiflda, Laminaria gurjanovae, Laminaria japónica, Costaría Costata], а также СГМ (MM=127 кДа и СС=1,46) из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.)) и полисахаридных ионных комплексов (ПИК) на свертывающую систему крови человека in vitro:

- оценка влияния на разные этапы свертывания крови;

- определение ингибиторной активности сульфатированных полисахаридов по отношению к тромбину и активированному фактору Ха;

2. Исследование влияния сульфатированных полисахаридов на свертывающую систему крови in vivo:

- оценка фармакодинамических параметров сульфатированных полисахаридов при внутривенном введении кроликам, крысам;

- оценка антитромботической активности сульфатированных полисахаридов при экспериментальном венозном тромбозе у крыс;

- изучение влияния на содержание уровня плазминогена и протеина С в плазме экспериментальных животных;

- оценка геморрагической активности сульфатированных полисахаридов;

3. Поиск веществ-антидотов для нейтрализации антитромбиновой активности сульфатированных полисахаридов;

4. Фиксирование комплексов между полианионами сульфатированными полисахаридами

и поликатионом антидотом - сульфатом протамина с помощью биоспецифичного электрофореза;

5. Нейтрализация аититромбиновой активности образцов фукоиданов из Fucus evanescens и Laminaria cichorioides сульфатом протамина в тесте АЧТВ.

Практическая значимость работы

Ввиду того, что используемые в настоящее время антикоагулянтные средства обладают рядом побочных эффектов (тромбоцитопения, геморрагический эффект, остеопороз, неэффективность при врожденной или приобретенной недостаточности антитромбина III, неспособность ингибировать тромбин, связанный с фибрином и др.), поиск фармакологических средств для профилактики и лечения тромбозов является значимым и перспективным.

Установлены некоторые моменты механизма действия фукоиданов из бурых водорослей Fucus evanescens, Laminaria cichorioides, Undaria pinnatifida, Laminaria gurjanovae, Laminaria japónica, Costaría Costata, СГМ (MM=127 кДа и CC=1,46) из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub и ПИК на свертывающую систему крови in vitro / in vivo и выбраны наиболее активные вещества для дальнейшего исследования.

Положения, выносимые на защиту:

1. Антикоагулянтная активность фукоиданов из бурых морских водорослей Fucus evanescens, Laminaria cichorioides, Undaria pinnatifida, Laminaria gurjanovae, Laminaria japónica, Costaría Costata и СГМ (MM=127 кДа и СС=1,46) из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) зависит от молекулярной массы, моносахаридного состава и степени сульфатирования.

2. Внутривенное введение фукоиданов из бурых морских водорослей Fucus evanescens, Laminaria cichorioides и СГМ (ММ=127 кДа и СС=1,46) из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) кроликам и крысам приводит к возрастанию антикоагулянтной активности плазмы с увеличением дозы.

3. Антитромботическая активность фукоидана из Fucus evanescens на модели венозного стаза увеличивается при внутривенном введении крысам в диапазоне доз 2,5-10 мг/кг. При внутривенном введении СГМ (ММ=127 кДа и СС=1,46) 100% ингибирование роста тромба достигается при дозе 3 мг/кг.

4. Электрофоретическая подвижность (размеры пиков преципитации с сульфатом протамина) фукоиданов из бурых морских водорослей Fucus evanescens, Laminaria

cichorioides, Undaria pinnatiflda, Laminaria gurjanovae, Laminaria japónica, Costaría Cosíala и СГМ (MM=127 кДа и CC=1,46) из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) в агарозном геле с сульфатом протамина положительно коррелирует с антикоагулянтной активностью исследуемых образцов.

5. Сульфат протамина нейтрализует антитромбиновую активность фукоиданов из бурых морских водорослей Fucus evanescens и Laminaria cichorioides.

6. Фукоидан из бурой морской водоросли Fucus evanescens и СГМ (ММ=127 кДа и СС=1,46) из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) в конечных концентрациях от 0,1 до 0,5 мг/мл ингибируют агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ.

7. Показана связь между химическим строением компонентов и проявляемой антикоагулянтной активностью ПИК, состоящих из "+" галактозилированного хитозана, "-" сульфатированного галактоманнана и "+" и "-" N-сукцинилхитозана в разных весовых сочетаниях

Апробация диссертации

Основные результаты и положения диссертации были представлены на Всесоюзных и Международных съездах, конгрессах, симпозиумах, конференциях: III съезд фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению», Санкт-Петербург, 2007; III Всероссийская конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии», Москва, 2007; V Всероссийская конференция-школа «Химия и технология растительных веществ», Уфа, 2008; «IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов», Новосибирск, 2008; IX Международная конференция «Современные тенденции в исследованиях и использовании хитина и хитозана», Ставрополь, 2008; 31 Конгресс Федерации Европейских биохимических обществ, Афины, Греция, 2008; IV Всероссийская конференция по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии (с международным участием), Москва 2009.

Апробация диссертации проведена на заседании проблемной комиссии «Патология гемостаза» (протокол №9 от 24.06.2009).

Публикации: по теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 5 работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов диссертационных исследований.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на _ страницах машинописного текста и состоит из

введения, главы «Материалы и методы», 2 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка использованной литературы, включающего 295 источников, из них 26 отечественных, 269 зарубежных. Работа иллюстрирована 34 таблицами и 36 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Выделение, модифицирование и исследование структуры образцов для определения антикоагулянтной активности проводили в следующих организациях: фукоиданы (Fucus evanscens, ММ=20-40 кДа; моносахаридный состав представлен фукозой, галактозой, ксилозой, глюкозой в соотношении 71:9:10:8, соотношение фукозы и сульфатного остатка - 1 : 0,9; Laminaria cichorioides, MM 40-80 кДа, соотношение S042' : Fue составляет 1,8:1,0; фукоидан из Laminaria japónica, MM 30-40 кДа, Fue: Gal: Man: Xyl: Glc в соотношении - 70 :15 : 8 : 4 : 3; Undariapinnatiflda - UpF 790: S04 25%, Man 14. Gal 46; Undaria pinnatiflda - UpF 786: SO4 36%, Man 1. Gal 70; Laminaria guijanovae - LgFl 601: SO4 4%, Man 40. Gal 9; Laminaria gurjanovae -LgF2 602: S04 30%, Man 2, Gal 36; Laminaria japónica - LjF 675: S04 26%, Man 11. Gal 27; Laminaria japónica- LjFL 605: S04 13%, Man 26, Gal 28; Costaria Costata - CcF 772: S04 5%, Man 9, Gal 30; Fucus evanescens - FeF 794: SO4 33%, Man 4, Gal 1; Fucus evanescens - FeF 647: S04 14%, Man 4, Gal 15; Laminaria cichorioides - LcFL 644: SO4 5%, Man 9, Gal 2; Laminaria cichorioides - LcFL 454: SO4 20%, Man 6, Gal 0 и Laminaria cichorioides - LcF 799: S04 36%, Man 3, Gal 0 с содержанием SO4" 2 групп в диапазоне 4-36. Моносахаридный состав представлен маннозой, фукозой, галактозой, ксилозой, глюкозой и рамнозой в соотношениях (1-40) : (14-97) : (0-70) : (013) : (0-75) : (0-9) - в лаборатории химии ферментов Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН (г.Владивосток); фукоидан из бурой водоросли Laminaria saccharina [фракции F-26 (Fue 31,5; Xyl 0,9; Man 2,2; Glc 0; 6,5; уроновые кислоты 6,5; сульфат 34,8), F-43(Fuc 15,8; Xyl 2,4; Man 6,1; Glc 1,7; Gal 14,8; уроновые кислоты 17,7; сульфат 14,8) и F-44 (Fue 46,7; Xyl 1,3; Man 0; Glc 0; Gal 4,3; уроновые кислоты 0; сульфат 36,7)] - в лаборатории химии гликоньюгатов Института органической химии им. Н.Д. Зелинского; галактоманнаны гуар с молекулярной массой от 12,6 до 245,6 кДа, сульфат деполимеризованного галактоманнана гуар из семян Cyamópsis telragonôlobus (L.) Taub (MM 127 кДа; отношение Ман:Гал 1,64; степень сульфатирования

1,46) и полисахаридные ионные комплексы, состоящие из галактозилированного хитозана (С3=0.10; СД-0.79) - NH3 + , хитозан-сукцинила - COO ~ (С3=0,8) и сульфатированного галактоманнана ГМ - HSO3' (СЗ = 1,46 и 0,6), в разных весовых сочетаниях - в лаборатории инженерной энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, в лаборатории инженерии ферментов Центра «Биоинженерия» РАН.

Влияние образцов фукоданов, галактоманнанов и полисахаридных ионных комплексов на внутренний, внешний и общий пути свертывания крови оценивали используя общепринятые тесты: время свертывания крови, время рекальцификации, активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПВ) и тромбиновое время (ТВ).

Специфическую антикоагулянтную активность образцов in vitro определяли по ингибированию фибриногенсвертывающей и амидолитической активностей тромбина (антитромбиновая, анти-фактор На, alla активность) и фактора Ха (активность против фактора Ха, анти-фактор Ха, аХа активность) в плазме человека или экспериментальных животных с использованием Международных стандартов гепаринов, основываясь на рекомендациях Российской Фармакопейной статьи и Европейской Фармакопейной статьи (Государственная Фармакопея СССР, 1978; European Pharmacopoeia, 6th edition, 2009). Определение активности плазмина и протеина С в плазме экспериментальных животных проводили с использованием наборов Реахром-Плазминоген и Реахром-Протеин-С НПО «Ренам».

Комплексообразование фукоданов и галактоманнанов с сульфатом протамина исследовали с использованием биоспецифического электрофореза (Drozd N.N. и соавт. 2001). Нейтрализацию антикоагулянтной активности in vitro исследуемых образцов фукоиданов сульфатом протамина проводили в тесте по ингибированию фибриногенсвертывающей активности тромбина (Coyne Е. 1981; Баркаган З.С., Момот А.П., 2001). За основу брали метод АЧТВ. Агрегационную способность тромбоцитов исследовали по методу G. Born (1962).

Заключительной частью работы стали серии острых экспериментов in vivo, в которых исследования были направлены на изучение антикоагулянтной активности образцов при их внутривенном введении кроликам и крысам. Эксперименты на лабораторных животных были выполнены на 58 кроликах породы «Шиншилла» обоего пола массой 2,5-4,5 кг и на 195 крысах-самцах Wistar массой 250-400 г. Исследование антитромботаческой активности проводили на модели венозного стаза у крыс по методу

S.Wessler и соавт. (1959). Геморрагическую активность образцов фукодана и СГМ определяли на крысах-самцах линии Wistar весом 200-250 г (Чсвари С.И. 1985).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Антикоагуляитная активность in vitro/in vivo нативных и модифицированных фукоиданов из бурых водорослей Fucus evanescens и Laminaria cichorioides

В настоящей работе исследовали антикоагулянтную активность in vitro и in vivo образцов нативных и модифицированных фукоиданов из бурых водорослей Fucus evanescens и Laminaria cichorioides, преимущественно состоящих из фукозы, ксилозы, маннозы и галактозы. Величина антикоагулянтной активности коррелирует со структурными характеристиками исследуемых образцов. Нативные фукоиданы из Fucus evanescens (MM 20-40 кДа) и Laminaria cichorioides (MM 40 - 80 кДа) ингибируют активность тромбина и фактора Ха. Значения alla и аХа активностей достигают 22±7 и 28±7 ЕД/мг для фукоидана из Fucus evanescens и 43±8 и 31±8 ЕД/мг для фукоидана из Laminaria cichorioides, соответственно. Дезацетилирование нативного фукоидана из Fucus evanescens и освобождение от полифенолов и белков не приводит к увеличению антикоагулянтной активности. При снижении молекулярной массы, которая достигается ферментативным гидролизом нативных фукоиданов из Fucus evanescens (вязкость 0,75 дл/г), Laminaria cichorioides (вязкость 0,90 дл/г) ферментным комплексом Целловиридин антикоагуляитная активность низкомолекулярных фракций (вязкость 0,01 - 0,21 дл/г) не меняется. Значения alla и аХа активностей низкомолекулярных фракций достигают 10±2 - 15±3 и 13±4 - 11±3 ЕД/мг для фукоидана из Fucus evanescens и 7±1 - 7±1 и 4,5±1 - 5±2 ЕД/мг для фукоидана из Laminaria cichorioides, соответственно. Антитромбиновая активность фракции с ММ 8-10 кДа (получена гидролизом фукоидана из Fucus evanescens гепариназой) в сравнении с нативным выше.

Показано, что фракция, полученная при гидролизе фукоидана из Laminaria saccharina экстрактом гепатопанкреаса камчатского краба эффективнее в 1,7 или 4,7 раза, чем нативный фукоидан ингибирует фибриногенсвертывающую (15,9±1,2 в сравнении с исходным образцом - 9,6±0,9 ЕД/мг) и амидолитическую активности (12,70±0,07 в сравнении с исходным образцом - 2,70±0,04 ЕД/мг) фактора Ха. По всей вероятности, при гидролизе не разрушаются последовательности полисахарида, отвечающие за связь с антитромбином III, а для осуществления антикоагулянтной активности нативному фукоидану недостаточно только антитромбина III. Гидролизованный образец лучше исходного снижал активность фактора Ха. Отсутствие связи между эффективными

концентрациями фукоиданов и их антитромбиновой активностью по нефракционированному гепарину свидетельствует о разных механизмах влияния этих веществ на внутренний путь свертывающей системы крови. Такая же закономерность отмечена и при определении способности фукоиданов ингибировагь амидолитическую активность тромбина и фактора Ха. Различия в эффективных концентрациях фукоиданов в коагулологических (где присутствует плазменные ингибиторы антитромбин III и кофактор гепарина И) и амидолитических тестах (присутствует только антитромбин III) свидетельствует о том, что для проявления антикоагулянтной активности фукоидану из L. saccharina необходим кофактор гепарина И.

Исследовали антикоагулянтную активность хроматографически выделенных фракций фукоиданов из водоросли Laminaria saccharina. Получили фракции F-26 (Fue 31,5; Xyl 0,9; Man 2,2; Glc 0; Gal 6,5; уроновые кислоты 6,5; Сульфат 34,8); F-43 (Fue 15,8; Xyl 2,4; Мал 6,1; Glc 1,7; Gal 14,8; уроновые кислоты 17,7; Сульфат 14,8); F-44 (Fue 46,7; Xyl 1,3; Man 0; Glc 0; Gal 4,3; уроновые кислоты 0; Сульфат 36,7). Анализ образцов нативного фукоидана из Laminaria saccharina после анионообменной хроматографии показал, что в проявлении антикоагулянтной активности (47,0±4,9 и 50,7±6,2 ЕД/мг для образцов F-26 и F-44, соответственно) играют роль остатки фукозы и сульфат.

Выбор поликатиона-антидота.

С целью выбора поликатиона-антидота, используя биоспецифичный электрофорез, показали способность сульфата протамина создавать комплексы с образцами фукоиданов из бурых водорослей Fucus evanescens (MM 20-40 кДа) и Laminaria cichorioides (MM 40 -80 кДа), гидролизованных ферментным комплексом «Целловиридин» или ферментом гепариназой, дезацетилированных и освобожденных от белка и фенолов. Высота пиков преципитации и площадь умеренно коррелируют с антикоагулянтной активностью. Так, при анализе гидролизованных ферментным комплексом «Целловиридин» образцов, наиболее высокой антитромбиновой активностью (22±7 ЕД/мг) обладает нативный образец фукоидана из Fucus evanescens (MM 20-40 кДа), который имеет самую высокую площадь (1229±80; 94±7 пке) и высоту (94±7;49±6 пке) пиков преципитации при концентрациях 1000 и 500 мкг/мл, соответственно. Для фукоидана из Laminaria cichorioides (MM 40 - 80 кДа) с антитромбиновой активностью 43±8 ЕД/мг эта площадь составляет 1230±75 - 104±3 пке; высота - 373±23 - 46±2 пке, при концентрациях 1000 и 500 мкг/мл, соответственно.

Нейтрализация антитромбиновой активности фукоиданов Fucus evanescens и Laminaria cichorioides сульфатом протамина в тесте АЧТВ

При добавлении сульфата протамина в концентрации 6,73 мкг/мл наблюдали достоверное снижение антитромбиновой активности фукоидана из Fucus evanescens в концентрации 6,73 мкг/мл. Отмечали достоверное снижение alla активности фукоидана из Fucus evanescens на 46,4% при гравиметрическом соотношении 6,73 мкг ПС/6,73 мкг Fucus evanescens = 1. При добавлении сульфата протамина в диапазоне концентраций от 0,673 до 1,35 мкг/мл наблюдали достоверное снижение антитромбиновой активности фукоидана из Laminaria cichorioides в концентрациях от 0,673 до 1,68 мкг/мл на 66,4%. В среднем гравиметрическое соотношение для нейтрализации фукоиданов из Fucus evanescens и Laminaría cichorioides составило 1.

Фармакодинамические параметры фукоиданов из Fucus evanescens и Laminaría cichorioides при внутривенном введении крысам и кроликам

Внутривенное введение крысам исходных образцов фукоиданов из Fucus evanescens и Laminaria cichorioides в дозах 5 и 10 мг/кг приводит к увеличению антикоагулянтной активности плазмы с возрастанием дозы от 5 и до 10 мг/кг. Наблюдали достаточную для терапевтического эффекта антитромбиновую активность плазмы крыс (2,5±0,36 ЕД/мг) и незначительную активность плазмы крыс против Ха фактора (0,3±0,02 ЕД/мг) для фукоидана из Fucus evanescens при дозе 10 мг/кг соответственно. Длительность эффекта по антитромбиновой активности составила около трех часов. Период полувыведения-15 и 60 мин в зависимости от дозы.

У образца фукоидана из Laminaria cichorioides, с большей специфической аХа активностью - 31 ±8 ЕД/мг (для фукоидана из Fucus evanescens аХа активность составила 28±7) наблюдали и большую аХа активность плазмы крыс. Антитромбияовая активность плазмы крыс доходила до 3,1 ±0,24 ЕД/мг, активность плазмы против Ха фактора достигала 1 ЕД/мг (0,95±0,06 ЕД/мг).Длительность эффекта по аХа активности составила два часа при большей дозе. Период полувыведения - 60 мин. Длительность эффекта по антитромбиновой активности была более трех часов, а период полувыведения 60 и 90 мин в зависимости от дозы.

При внутривенном введении кроликам фукоидана из Fucus evanescens в дозах 1,3 и 5 мг/кг увеличиваются антитромбиновая и аХа активности плазмы. На 5 минуте после введения наблюдали профилактическую концентрацию аХа активности плазмы при дозе 1

мг/кг (0,15-0,35 ЕД/мл ) и терапевтическую - (0,35-0,7 ЕД/мл) при дозе 3 мг/кг. Максимальную величину антитромбиновой активности 1,9±0,4 ЕД/мл наблюдали через 5 мин после введения в дозе 5 мг/кг. Анти фактор Ха активность плазмы возрастала с увеличением дозы с 0,31±0,1 ЕД/мл при дозе 1 мг/кг до 1,03±0,3 ЕД/мл при дозе 5 мг/кг.

Антитромботическая и геморрагическая активности фукоидана из Fucus evanescens

На модели венозного стаза у крыс наблюдали зависимый от дозы эффект. С увеличением дозы от 2,5 до 10 мг/кг антитромботическая активность фукоидана возрастает, EDgo составила 5-7 мг/кг, EDioo-10 мг/кг.

С увеличением дозы фукоидана от 2,5 до 10,0 мг/кг ( или от 150 до 600 ЕД/кг) и нефракционированного гепарина увеличивается геморрагическая активность. Однако, для всех доз кроме 300 ЕД/мл наблюдали достоверное снижение геморрагической активности фукоидана в сравнении с НФГ. Это можно объяснить большей удельной аХа активностью нефракционированного гепарина.

Активность плазмина и протеина С плазмы кроликов после внутривенного введения фукоидана из Fucus evanescens

При исследовании влияния внутривенного введения фукоидана из Fucus evanescens на активность протеина С плазмы кроликов отмечали достоверное снижение скорости гидролиза хромогенного субстрата в 1,4-1,9 раз, а следовательно и снижение активности протеина С при дозах 5 и 10 мг/кг через 1 час после введения. Показано достоверное увеличение активности плазмина в 3-5 раз при введении фукоидана в дозах 3 мг/кг через 15-60 мин после введения; в дозе 5 мг/кг через 5-240 мин после ведения; в дозе 10 мг/кг через 5-300 мин после введения.

Антикоагулянтная активность фукоиданов из бурых водорослей lindaría pinnatiflda, Laminaria gurjanovae, Laminaria japónica, Costaría Costata, Fucus evanescens и Laminaria cichorioides

Сравнивали антикоагулянтную активность фукоиданов из бурых водорослей Undaria pinnatiflda (UpF 790: S04 25%, Man 14. Gal 46), Undaria pinnatiflda (UpF 786: S04

36%, Man 1. Gal 70), Laminaria gurjanovae (LgFl 601: S04 4%, Man 40. Gal 9), Laminaria gurjanovae (LgF2 602: S04 30%, Man 2, Gal 36), Laminaria japónica (LjF 675: S04 26%, Man 11. Gal 27), Laminaria japónica (LjFL 605: S04 13%, Man 26, Gal 28), Costaria Costata (CcF 772: S04 5%, Man 9, Gal 30), Fucus evanescens (FeF 794: S04 33%, Man 4, Gal 11), Fucus evanescens (FeF 647: S04 14%, Man 4, Gal 15), Laminaria cichorioides (LcFL 644: S04 5%, Man 9, Gal 2), Laminaria cichorioides ( LcFL 454: S04 20%, Man 6, Gal 0) и Laminaria cichorioides ( LcF 799: S04 36%, Man 3, Gal 0) с содержанием S04'2 групп в диапазоне 436. Моносахаридный состав представлен маннозой, фукозой, галактозой, ксилозой, глюкозой и рамнозой в соотношениях (1-40) : (14-97) : (0-70) : (0-13) : (0-75) : (0-9). Все исследованные образцы влияют на внутренний и внешний пути свертывания крови, увеличивая время свертывания плазмы в тестах протромбинового и тромбинового времени. Антитромбиновая активность по АЧТВ в сравнении со стандартом нефракционированного гепарина составляет от 1,9 до 53,3 ЕД/мг. Активность против активированного фактора Ха в тесте РеаКлот составляет от 4,1 до 22,1 ЕД/мг. Антитромбиновая активность при амидолигическом определении находится в диапазоне от 0,2±0,1 до 14±2,8 ЕД/мг. Активность против активированного фактора Ха в амидолитическом исследовании достигает 0,36±0,1 - 8±3,1 ЕД/мг. Для осуществления антитромбиновой активности фукоиданов из Fucus evanescens (Fef 647) Undaria pinnatifîda, (TJpF 790) и Laminaria gurjanovae (LgFi601, Lgf2 602), обладающих наибольшей антитромбиновой активностью (от 30,9 до 53,3 Ед/мг) кроме антитромбина III требуются, вероятно, другие серпины, так как при ингибировании амидолитической активности тромбина в чистой системе только с антитромбином III alla активность составила 0,8-3,9 ЕД/мг. Обращает на себя внимание тот факт, что величина глюкозы в моносахаридном составе фукоиданов Fef 647, Upf 790, LgFj601 и Lgfi 602 составляет 0-3. Образец же фукоидана из Laminaria cichorioides (LcFL 644) осуществляет свою активность исключительно за счет антитромбина III, так как величины антитромбиновой активности при определениях в коагулологических и амидолитических тестах составили 14±1,9 и 14±2,8 ЕД/мг, соответственно, а величина глюкозы в моносахаридном составе достигала 75 и самое низкое количество SO групп - 5. Таким образом, на антитромбиновую активность исследованных фукоиданов влияет величина S04"2 групп и механизм антикоагулянтного действия зависит от моносахаридного состава. Вероятно, количество глюкозы в моносахаридном составе играет роль в связывании с антитромбином III. Наибольшую активность при ингибировании фактора Ха показали образцы из фукоидана Laminaria gurjanovae (LgFi601, LgF2 602) и Laminaria japónica (LjFL 605) - 18,7±3,7; 22,1±5,8 ЕД/мг и 17,8±3,6. Для осуществления анти Xa активности

этим образцам кроме антитромбина III требуются другие серпины, так как анти Ха активность, определенная в чистой системе с антитромбином III была в диапазоне от 9,8 до 49,4 раз меньше. В наибольшей степени ингибировали амидолитическую активность образцы из Laminaria cichorioides (LcFl 644, LcFL 454 и LcF 799), анти Xa активность составила от 2,5 до 8,0 ЕД/мг. Для осуществления анти Ха активности образцам с шифрами LcFL 644, LcF 799, кроме антитромбина III необходимы другие серпины, так как анти Ха активность, рассчитанная по тесту РеаКлот была в 2,9 и 2,2 раза соответственно выше чем при амидолитическом определении.

При проведении биоспецифического электрофореза образцов фукоиданов из бурых водорослей Undaria pinnatifida, Laminaria gurjanovae, Laminaria japónica, Costaría Cosíala, Fucus evanescens и Laminaria cichorioides с сульфатом протамина наблюдали рост пиков преципитации (площади и высоты) пропорционально концентрации исследуемых образцов. Наибольшую площадь пиков преципитации имели образцы LgFjöOl (1756±370; 4969±567 и 5075±511 пкс) и LgF2602 (2145±222; 4945±790 и 6769±870 пкс) при концентрациях 0,25; 0,5 и 1 мг/мл, соответственно. Данные образцы обладали и наибольшей высотой пиков преципитации, составившей для LgFj601 - 57,8±9,3; 163±5,9 и 146,8±22,2 пкс и для LgF2 602 - 73,3±3,3; 197,8±22,4 и 259,2±48,2 пкс при концентрациях 0,25; 0,5 и 1 мг/мл, соответственно. Высота и площадь пиков преципитации коррелировала с антитромбиновой (53,5±7,7) и анти-факторХа активностями (22,1±5,8 ЕД/мг), которые были максимальными для образца LgF2 602. Образцы CcF 792 и LjF675 обладали минимальными антитромбиновой (1,9±0,5; 5,5±1,7) и анти-фактор Ха активностями (6±2,8; 4,1±1,8 ЕД/мг) и не образовывали комплексы с сульфатом протамина Таким образом, размеры пиков преципитации напрямую зависят от антикоагулянтной активности исследуемых образцов. Кроме того, в целях первичного отбора при скрининге образцов фукоиданов на предмет наличия антикоагулянтной активности можно использовать метод фиксирования комплексов с сульфатом протамина, так как имеется возможность выбора для анализа образцов с наиболее высокими пиками преципитации.

Антикоагулянтная активность низкомолекулярных сульфатированных производных галактоманнана из семян Cyamopsis tetragonoloba (L) in vitro

Исследовали сульфатированные фракции галактоманнан гуар из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub, в диапазоне молекулярных масс от 12,6 до 245,6 кДа. Антикоагулянтная активность in vitro исследуемых образцов различается не существенно.

Данные сульфогалактоманпаны обладают значительной антитромбиновой активностью, доходящей до 65-87 ЕД/мг, несмотря на низкую аХа активность (6,8-12,6 ЕД/мг), что дает основание для дальнейшего изучения их механизма действия, а также для анализа фармакодинамических и фармакокинетических параметров при введении экпериментальным животным.

Поликатион сульфат протамина образует комплексы, подвижные в электрическом поле с исследуемыми сульфогалактоманнанами - полианионами. Размеры пиков преципитации увеличиваются с увеличением антитромбиновой активности Коээффициенты корреляции между высотой и площадью пиков преципитации, с одной стороны, и антитромбиновой активностью с другой, составили 0,70 - 0,75 (р<0,02). Какой либо связи между размерами пиков преципитации и молекулярной массой или количеством сульфогрупп не отмечено. Фракция СГМ с ММ=81,9 кДа и количеством SO4' 2 =46,56% обладает максимальной антитромбиновой активностью - 87±7 ЕД/мг и наибольшими размерами пиков преципитации.

Антикоагулянтная активность in vitro/in vivo сульфата деполнмернзованного галактоманнана гуар из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) с молекулярной массой 127 кДа

Сульфат деполимеризованного галактоманнана гуар (соотношение Ман:Гал 1,64; ММ=127 кДа; СС=1,46) имеет невысокую специфическую антитромбиновую активность (35,8±1,8 ЕД/мг) и совсем незначительную анти-фактор Ха активность - 6,6±0,5 ЕД/мг. Однако при внутривенном введении крысам в дозах 1, 2 и 3 мг/кг вызывает высокую антикоагулянтную активность плазмы. Так, на 5 минуте после введения исследуемого образца alla активность составляет 1,56±0,6 ЕД/мл при дозе 1 мг/кг, при дозе 3 мг/кг возростает до 4,14±1,16 ЕД/мл. При дозе 3 мг/кг наблюдается 100% ингибирование роста тромба. Агрегация тромбоцитов человека, индуцированная АДФ, достоверно снижается в 1,9; 3,9 и в 6,8 раз в концентрациях 0,1; 0,25 и 0,5 мг/мл и составляет 34,7±4,0; 17,0±1,1; 9,8±1,0 % (в сравнении с контролем 67,1±4,1 %). Полное ингибирование роста тромба на модели венозного стаза у крыс наблюдали при дозе 3 мг/кг, что в 3.3 раза меньше, чем для фукоидана из Fucus evanescens (10 мг/кг). Это может коррелировать с большим влиянием галактоманнана на агрегационную функцию тромбоцитов, индуцированную АДФ, так как при одинаковых конечных концентрациях (от 0,1 до 0,5 мг/мл) агрегационная функция галактоманнана достоверно снижается в 1,8 - 6,4 раза, для фукоидана - в 1,3-1,9 раз.

Антикоагуляитная активность ионных комплексов полисахаридов, содержащих хитозан, сукцинилхитозан и сульфатированиый галактоманнан

Проведен анализ величин антикоагулянтной активности in vitro образцов полисахаридных ионных комплексов, компонентами которых служили галактозилированный хитозан, N-сукцинилхитозан и СГМ в разных весовых сочетаниях. ПИК, состоящие из ГМ-HSOj" (степень замещения-СЗ=1,46 и 0,6), галактозшшрованного хитозана (С3=0,10; степень дезацетилирования - СД-0,79)-МНз+ и хитозан сукцинила-СОО" (С3=0,8) в разных весовых сочетаниях демонстрировали АК активность in vitro. В комплексах ГМ-HSO/ (С3=1,46) с галактозилированным хитозаном (С3=0,10; СД-0,79)-NH3+ и хитозан - сукцинилом - СОО" (С3=0,80) с увеличением доли первого до 67% антитромбиновая активность (рассчитанная по стандарту НФГ) возрастает в 1,6 раза в сравнении с чистым сульфатом галактоманнана. Добавление к TM-HSCV (С3=1,46) галактозилированного хитозана (С3=0,10; СД=0,79)- ЫНз+ и хитозан-сукцинил -СОО" (С3=0,80) не приводит к изменению эффективной концентрации 2РеаКлот с плазмой кроликов и аХа активности (по стандарту НФГ). Отсутствие в сочетании хитозан-сукцинила - СОО" (С3=0,80) приводит к возрастанию эффективных концентраций 2АЧТВ/2РеаКлот (концентрация ингибитора, при которой время свертывания плазмы увеличивается в два раза, в сравнении с контролем) и снижению alla и аХа активностей. Снижение степени сульфатирования ГМ- HSO3" с 1,46 до 0,60 приводит к снижению АК активности ГМ и ПИК.

Выводы:

1. Нативные фукоиданы из Fucus evanescens (MM 20-40 кДа) и Laminaria cichorioides (MM 40 - 80 кДа) ингибируют активность тромбина (22±7 и 43±8 ЕД/мг) и фактора Ха (28±7 и 31±8 ЕД/мг) in vitro

2. Антикоагулянтная активность низкомолекулярных фракций (вязкость 0,01 - 0,21 дл/г), полученных гидролизом фукоиданов из Fucus evanescens (вязкость 0,75 дл/г), Laminaria cichorioides (0,90 дл/г) ферментным комплексом «Целловиридин», не превышает антикоагулянтную активность нативных фукоиданов. Антитромбиновая активность фракции с молекулярной массой 8-10 кДа (получена гидролизом фукоидана из Fucus evanescens гепариназой) в сравнении с нативным выше на 25%. Специфическая антикоагулянтная активность фукоидана из Laminaria saccharina после гидролиза экстрактом гепатопанкреаса камчатского краба увеличивается в 1,7-4,7 раз.

3. Фукоиданы из бурых водорослей Undaria pinnatifida, Laminaria gurjanovae, Laminaria japónica, Costaría Costata, Fucus evanescens и Laminaria cichorioides с количеством сульфатных групп от 4 до 36 и разным моносахаридным составом ингибируют активности тромбина и фактора Ха in vitro, достигая 53,3±7,7 ЕД/мг по антитромбиновой активности и 22,1±5,8 ЕД/мг по анти-фактор Ха активности, соответственно.

4. Внутривенное введение крысам исходных образцов фукоиданов из Fucus evanescens и Laminaria cichorioides в дозах 5 и 10 мг/кг приводит к увеличению антикоагулянтной активности плазмы с возрастанием дозы. При внутривенном введении кроликам фукоидана из Fucus evanescens в дозах 1, 3 и 5 мг/кг увеличиваются антитромбиновая и аХа активности плазмы. При внутривенном введении крысам фукоидана из Fucus evanescens в дозах 2, 5-10,0 мг/кг возрастает антитромботическая активность, а при дозах от 150 до 600 ЕД/кг наблюдается достоверное снижение геморрагической активности фукоидана из Fucus evanescens.

5. Сульфат деполимеризованного галактоманнана гуар (соотношение Ман:Гал 1,64; молекулярная масса - 127 кДа; степень дезацетилирования - 1,46) имеет специфическую антитромбиновую активность 35,8±1,8 ЕД/мг и незначительную анти-фактор Ха активность - 6,6±0,5 ЕД/мг. При внутривенном введении крысам в дозах 1, 2 и 3 мг/кг сульфат деполимеризованного галактоманнана гуар вызывает высокую антикоагулянтную активность плазмы: на 5 мин после введения образца alla активность составляет 1,56±0,6 ЕД/мл при дозе 1 мг/кг; при дозе 3 мг/кг антитромбиновая активность возрастает до 4,14±1,16 ЕД/мл. При дозе 3 мг/кг наблюдается 100% ингибирование роста тромба

6. Сульфат протамина образует комплексы с сульфогалактоманнанами и образцами фукоиданов из бурых водорослей Undaria pinnatifida, Laminaria gurjanovae, Laminaria japónica, Laminaria cichorioides (MM 40 - 80 кДа) и Fucus evanescens (MM 20-40 кДа), размеры которых положительно коррелируют с антикоагулянтной активностью; сульфат протамина нейтрализует анти-Па активность фукоиданов из Fucus evanescens и Laminaría cichorioides в гравиметрическом соотношении 0,5-1,2.

8. Фукоидан из Fucus evanescens достоверно снижает АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов в диапазоне конечных концентраций от 0,1 до 0,5 мг/мл. Агрегация тромбоцитов, вызванная введением АДФ, при добавлении сульфата деполимеризованного галактоманнана гуар достоверно снижается в 1,9; 3,9 и в 6,8 раз в концентрациях 0,1; 0,25 и 0,5 мг/мл и составляет 34,7±4,0; 17,0±1,1; 9,8±1,0 % (в сравнении с контролем 67,1±4,1 %). Ни фукоидан из Fucus evanescens, ни сульфатированный галактоманнан из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) не индуцируют агрегацию тромбоцитов человека.

9. Полисахаридные ионные комплексы, состоящие из сульфатированного галактоманнана (СЗ = 1,46 и 0,6), галактозилированного хитозана (С3=0.10; СД-0.79) - NH3 + и хитозан-сукцинила - СОО ~ (С3=0,8) в разных весовых сочетаниях демонстрируют антикоагулянтную активность in vitro. Для получения полисахаридных ионных комплексов с большими антитромбиновой и аХа активностями следует использовать сульфатированный галактоманнан со степенью сульфатирования не ниже 1,46 процентное соотношение в полисахаридных ионных комплексах не ниже 50 и увеличивать процентное отношение в полисахаридных ионных комплексах сукцинилированного хитозана (более 28%), а процентное отношение галактозилированного хитозана снижать (менее 17%).

Практические рекомендации:

Данные о связи структуры и антикоагулянтной активности исследованных сульфатированных полисахаридов могут быть использованы для получения новых более активных антикоагулянтов.

В результате проведенных исследований выбраны образцы [(фукоидан из Fucus evanescens (ММ 20-40 кДа); фукоидан из Laminaria cichorioides (ММ 40 - 80 кДа), а также сульфат деполимеризованного галактоманнана гуар (соотношение Ман:Гал 1,64; молекулярная масса - 127 кДа; степень дезацетилирования - 1,46)] для проведения дальнейших испытаний фармакологической и токсикологической активности.

Список печатных работ по теме диссертации:

1. Антикоагулянтная активность ионных комплексов полисахаридов, содержащих хитозан, сукцинилхитозан и сульфатированный галактоманнан / Н.Н. Дрозд, А.В. Ильина, Н.М. Местечкина, А.С. Толстенков, Е.С. Лапикова, В.А. Макаров, В.П. Варламов, В.Д. Щербухин// Вопросы биологической, медицинской и фармакологической химии. - 2008. -№5.- С.52-56.

2. Антикоагулянтная активность низкомолекулярных гепаринов, полученных с помощью комплекса гидролаз /Н.Н.Дрозд, А.С. Толстенков, Г.Е. Банникова, Н.Т. Мифтахова, Е.С. Лапикова, В.А. Макаров, В.П. Варламов// Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2007. - Т. 70.- № 6. -С. 19-24.

3. Антикоагулянтные свойства N-сульфосукцинил-карбоксиметилхитозанов с разной олекулярной массой / Е.С. Лапикова, Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров, А.Н. Левов, А.В.

Ильина, В.П. Варламов// IV съезд Росссийского общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск, 2008.- С. 434

4. Антикоагулянтная активность фукоидана из бурых водорослей Fucus evanescens/ Е.С.Лапикова, A.C. Толстенков, H.H. Дрозд, В.А. Макаров, Н.М. Шевченко, Т.Н. Звягинцева // Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии: материалы III всероссийской научной конференции. - Москва, 2007. -С. 122123.

5. Антикоагулянтная активность in vitro сульфатированного арабиногалактана и экстракта коры кедра/ H.H. Дрозд, С.А. Кузнецова, Е.С. Лапикова, А.И. Давыдова,

B.А. Макаров, Б.Н. Кузнецов, А.И. Бутылкина// Экспериментальная и клиническая фармакология. -2008.- №7. - С.30-34.

6. Влияние внутривенного введения сульфатированного галактоманнана на антикоагулянтную активность плазмы крыс / H.H. Дрозд, В.А. Макаров, A.C. Толстенков, Е.С. Лапикова, Н.Т. Мифтахова, Н.М. Местечкина,В.Д. Щербухин, A.B. Ильина, В.П. Варламов// Патологическая физиология и экспериментальная терапия. -2008,- №3.- С. 20-23.

7. Влияние галактоманнан из семян Cyamopsis Tetragonoloba (L.) taub, на антикоагулянтную активность плазмы крыс при внутривенном введении / A.C. Толстенков, H.H. Дрозд, Е.С. Лапикова, В.А. Макаров, Н.М. Местечкина, Г.Е. Банникова, A.B. Ильина, В.П. Варламов // Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии: материалы III всероссийской научной конференции. - Москва, 2007. -С. 242-243.

8. Ингибирование тромбина и фактора Ха фукоиданом из Fucus evanescens и его модифицированными аналогами / Е.С. Лапикова, H.H. Дрозд, A.C. Толстенков, В.А. Макаров, Т.Н. Звягинцева, Н.М. Шевченко, И.Ю. Бакунина, H.H. Беседнова, Т.А. Кузнецова //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2008. -№146. -

C.328-33.

9. Ингибирование фукоиданом из бурой водоросли Laminaria saccharina активности тромбина и фактора Ха / H.H. Дрозд, Е.С. Лапикова, А.И. Давыдова, A.C. Толстенков, A.B. Ильина, Н.Е. Устюжанина, В.А. Макаров, В.П. Варламов, М.И. Билан, А.И. Усов, Н.Э. Нифантьев// IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск, 2008.-№60.-, С. 345.

Ю.Лапикова Е.С. Влияние фукоидана из Fucus evanescens на антикоагулянтную активность плазмы кроликов при внутривенном введении/ Е.С. Лапикова, H.H. Дрозд,

В.А. Макаров// Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии: IV всероссийская научная конференция. -Москва, 2009. - С.275.

11. Лекарственная регуляция функции гемостаза / В.А. Макаров, Г.Г. Белозерская, Л.С. Малыхина, С.Г.Малыхина, Т.М. Васильева, Н.Н. Дрозд, Г.Н. Петрухина, Н.Т. Мифтахова, Е.В. Климанова, Е.С. Лапикова, А.А. Тер-Арутюнянц, А.С. Толстенков // Проблемы патологии системы гемостаза. - Барнаул. -2007.-С. 135-139.

12. Сульфатированные полисахариды и антикоагулянгная активность / Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров, А.С. Толстенков, Е.С. Лапикова, В.П. Варламов, А.В. Ильина, С.А. Лопатин, Н.Э Нифантьев, Н.Е. Устюжанина, А.И. Усов, Н.И.Билан, Н.М. Местечкина // Психофармакология и биологическая наркология: материалы III съезда фармакологов России. -2007.-Т. 7.-Ч. I.

13. A. Tolstenkov, Е. Lapikova, N. Drozd, V. Makarov, and V. Varlamov «Anticoagulant properties of glycosaminoglycan low molecular weight heparin that was prepared by depolymerization with enzyme complex Streptomyces kurssanovii» FEBS Journal 275 (Suppl.l) 99-437 (2008) P.247

14. E.S. Lapikova, A.S. Tolstenkov, N.N. Drozd, V.A Makarov, N.M. Mestechkina, G.E. Bannikova, V.D. Scherbukhin, V.P. Varlamov «Anticoagulant properties of a sulfate low molecular weight galactomannan derivatives from Cyamopsis Tetragonoloba (L.) taub seeds» FEBS Journal 275 (Suppl.l) 99-437 (2008) P.362

Оглавление диссертации Лапикова, Елена Сергеевна :: 2009 :: Москва

Введение.7

Обзор литературы.13

Глава I. Антикоагулянтная активность сульфатированных полисахаридов растительного происхождения. 13

1.1. Антикоагулянтная активность фукоиданов. Взаимосвязь между структурой и проявляемой фармакологической активностью.15

1.2. Антикоагулянтная активность галактоманнанов.30

1.3.Антикоагулянтная активность сульфатированных полисахаридов животного происхождения.33

1.4. Антикоагулянтная активность гликозаминогликанов.33

1.5. Антикоагулянтная активность сульфата хитозана.37

1.6. Нейтрализация антикоагулянтной активности.43

Глава II. Материалы и методы исследования.49

Собственные исследования

Глава III. Антикоагулянтная активность нативных и модифицированных фукоиданов из бурых морских водорослей.61

3.1. Антикоагулянтная активность in vitro/in vivo и комплексообразование с сульфатом протамина нативных и частично гидролизованных фукоиданов из Fucus evanescens и Laminaria cichorioides.61

3.2. Нейтрализация антитромбиновой активности фукоиданов из Fucus evanescens и Laminaria cichorioides сульфатом протамина в тесте АЧТВ.67

3.3. Влияние нативного и дезацетилированного образцов фукоиданов из Fucus evanescens на агрегационную способность тромбоцитов

3.4. Фармакодинамические параметры фукоиданов из Fucus evanescens и Laminaria cichorioides при внутривенном введении крысам.74

3.5. Фармакодинамические параметры фукоидана из Fucus evanescens при внутривенном введении кроликам.75

3.6. Активность протеина С в плазме кроликов после внутривенного введения фукоидана из Fucus evanescens.78

3.7. Влияние на амидолитическую активность плазмина в плазме кроликов после внутривенного введения фукоидана из Fucus evanescens.79

3.8. Антитромботическая активность фукоидана из Fucus evanescens.80

3.9. Геморрагическая активность фукоидана из Fucus evanescens.

3.10. Сравнение антикоагулянтной активности in vitro и комплексообразования с сульфатом протамина химически модифицированных и нативных фукоиданов из Fucus evanescens.83

3.11. Влияние нативных образцов фукоиданов FeF и FeFl из Fucus evanescens на агрегационную функцию тромбоцитов in vitro.92

3.12. Антикоагулянтная активность гидролизованных и хроматографически выделенных фракций фукоиданов из водоросли Laminaria saccharina.95

3.13. Антикоагулянтная активность фукоиданов из водорослей Fucus evanescens, Undaria pinnatijida, Laminaria gurjanovae, Laminaria japónica, Laminaria cichorioides, Costaría Costata .107

3.14.Комплексообразование при биоспецифическом электрофорезе.120

Глава IV. Антикоагулянтная активность галактоманнанов

4.1. Антикоагулянтная активность низкомолекулярных сульфатированных производных галактоманнана из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub in vitro.124

4.2. Антикоагулянтная активность галактоманнана-НБОзКа из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub, in vitro.132

4.3. Влияние rM-HSC^Na на агрегационную способность тромбоцитов.134

4.4. Фармакодинамические параметры и антитромботическая активность галактоманнана-HSC^Na из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub.135

4.5. Антикоагулянтная активность ионных комплексов полисахаридов, содержащих хитозан, сукцинилхитозан и сульфатированный галактоманнан.138

Введение диссертации по теме "Фармакология, клиническая фармакология", Лапикова, Елена Сергеевна, автореферат

Актуальность проблемы

На сегодняшний день для предотвращения и лечения тромбоэмболических осложнений широко используемыми в клинической практике препаратами являются НФГ, НМГ, а также антагонисты витамина К [119,178,166]. Однако, эти вещества обладают рядом побочных эффектов, такими как непредсказуемость (в случае НФГ), кровотечения, развитие тромбоцитопении, остеопороза и др [178, 254, 117, 167, 230]. В связи с этим значимым и перспективным является поиск фармакологических средств для профилактики и лечения тромбозов на основе антикоагулянтов прямого типа действия из ряда новых синтетических, полусинтетических и природных СП.

СП демонстрируют разные виды фармакологической активности, такие как АК, AT, противовирусная, радиопротскторная, противоязвенная и многие другие [122, 70, 190, 33, 155, 174]. В качестве AT средств, кроме НФГ в настоящее время используется ряд НМГ со средним распределением ММ от 4 до 7 кДа и отношением alla/aXa от 1,5 до 5. Интенсивно используются в разработках по изысканию AT средств и другие представители основных классов ГАГ. Отмечена корреляция между структурой и АК/АТ активностями НФГ, ГС, НМГ и гепариноподобных соединений из тканей млекопитающих. Значительный интерес представляют СП из бурых морских водорослей и морских беспозвоночных — фукоиданы, фуканы, СП из красных водорослей - каррагинаны. Эти СП ингибируют тромбин и фактор Ха посредством активации плазменных ингибиторов сериновых протеиназ свертывающей системы крови - AT III и кофактора гепарина II. При значительной ММ (80100 кДа) удельная анти-Па активность у отдельных фукоиданов достигает 130 ЕД/мг. Так, фуколдан из Fucus vesiculosiis обладает специфической антитромбиновой активностью, измеренной в тесте АЧТВ 9-13 ЕД/мг (в качестве стандарта использовали НФГ с alla активностью 167 ЕД/мг) [211, 142]. Фукоидан из Laminaria brasiliens имеет большую антитромбиновую активность (30 ЕД/мг), хотя содержание сульфатных групп в его молекуле меньше. Тромбин, фактор Ха, а также фактор 1Ха могут быть вовлечены в сферу деятельности фукоиданов, для предотвращения венозного тромбоза. Высвобождение из эндотелия TFPI, которое стимулируется фукоиданом мощнее, чем гепарином, может также усиливать AT эффект [111]. Кроме природных СП многие доступные природные полимеры (хитозан, декстран, ГМ) сульфатируют для придания им АК свойств.

Цель работы:

Исследование характера и механизмов АК действия нативных и химически модифицированных фукоиданов из бурых морских водорослей Fucus evanescens, Laminaria cichorioides, Undaria pinnatifida, Laminaria gurjanovae, Laminaria japónica, Costaría Costata, a также СГМ (MM=127 кДа и CC=1,46) из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.)).

Задачи исследования:

1. Исследование влияния СП растительного происхождения [фукоиданов из бурых морских водорослей Fucus evanescens, Laminaria cichorioides, Undaria pinnatifida, Laminaria gurjanovae, Laminaria japónica, Costaría Costata], а также CFM (MM=\21 кДа и CC=1,46) из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.)) и ПИК на свертывающую систему крови человека in vitro : а. Изучение влияния на разные этапы свертывания крови; б. Оценка ингибиторной активности СП по отношению к тромбину и активированному фактору Ха;

2. Исследование влияния СП на свертывающую систему крови in vivo:

- оценка фармакодинамических параметров СП при внутривенном введении кроликам, крысам;

- оценка AT активности СП при экспериментальном венозном тромбозе у крыс;

- изучение влияния на содержание уровня плазминогена и протеина С;

- оценка геморрагической активности;

3. Поиск веществ-антидотов для нейтрализации антитромбиновой активности СП;

4. Фиксирование комплексов между полианионами СП и поликатионом антидотом — ПС с помощью биоспецифичного электрофореза;

5. Нейтрализация антитромбиновой активности образцов фукоиданов из Fucus enanescens и Laminaria cichirioides ПС в тесте АЧТВ.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

Научная новизна и теоретическая значимость работы заключается в выявлении механизмов действия фукоиданов из бурых морских водорослей Fucus evanescens, Laminaria cichorioides, Undaria pinnatifida, Laminaria gwjanovae, Laminaria japónica, Costaría Costata, СГМ (MM=127 кДа и CC=1,46) из семян Cyamopsis tetragonoloba (L. )] и ПИК на систему гемостаза. Установлено, что фукоиданы действуют на факторы внутреннего и внешнего путей каскада свертывающей системы крови и обладают ингнбиторной активностью по. отношению к тромбину и фактору Ха. Показана зависимость АК активности фукоиданов и СГМ от, их структурных особенностей (ММ, степень сульфатирования). Показано, что фукондан, выделенный из бурой водоросли Охотского моря Fucus evanescens и СГМ влияют на свертывающую систему крови человека in vitro и экспериментальных животных in vivo; исследовали AT действие этих образцов СП при моделировании венозного тромбоза у крыс, а также — геморрагическую активность при внутривенном введении крысам. Впервые показана способность ПС образовывать комплексы с образцами исследуемых фукоиданов и СГМ, а также нейтрализовать антитромбиновую активность фукоиданов из бурых водорослей Fucus evanescens и Laminaria cichorioides ПС в тесте АЧТВ. Впервые исследована связь между химическим строением и АК активностью комплексов на основе природных гетерополисахаридов; показано, что в комбинации ПИК между "+" галактозилированным хитозаном, "-" сульфатированным галактоманнаном и ''+" и "-" Nзо сукцинилхитозаном в разных весовых сочетаниях с увеличением доли антитромбиновая активность возрастает в 1,7 раз, в сравнении с исходным ГМ.

Практическая значимость работы

Ввиду того, что используещиеся в настоящее время антикоагулянтные обладают рядом побочных эффектов (тромбоцитопения, геморрагический э ф c|z» -с^мес-г-., остеопороз, неэффективность при врожденной или приобретенной недостаточности A" Jl Хц, неспособность ингибировать тромбин, связанный с фибрином и др.), фармакологических средств для профилактики и лечения» тромбозов на антикоагулянтов прямого типа действия из ряда новых синтетических, полусинтетическп^зс^с и природных сульфатированных полисахаридов является значимым и перспективным.

Установлены некоторые моменты механизма действия фукоиданов из бз^-рэьтх водорослей Fucus evanescens, Laminaria cichorioides, Undaria pinnatifida, Lamzzí^z-^r^ís-ici gurjanovae, Laminaria japónica, Costaría Costata, СГМ (MM=127 кДа и CC= 1,46) из Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub и ПИК на свертывающую систему крови ш vitro и ш выбраны наиболее активные вещества для дальнейшего исследования.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. АК активность фукоиданов из бурых морских водорослей Fucus evanescens, Ьатж^гг^гг-га cichorioides, Undaria pinnatifida, Laminaria gurjanovae, Laminaria japónica, Costaría Cosr^-czzícz и СГМ (MM=127 кДа и СС=1,46) из семян Cyamopsis tetragonoloba (L. )] определяется: ^IN/IJVÍ, моносахаридным составом и степенью сульфатирования.

2. Внутривенное введение исследуемых образцов фукоиданов из бурых мо^>оких водорослей Fucus evanescens, Laminaria cichorioides и СГМ (ММ=127 кДа и СС=1 из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) кроликам и крысам вызывает рост АК активности плисазмы с увеличением дозы.

3. Внутривенное введение фукоидана из Fucus evanescens крысам в дозах 2,5-10 мг/кг вызывает рост АТ активности на модели венозного стаза. При внутривенном введении СГМ (ММ=127 кДа и СС=1,46) 100% ингибирование роста тромба достигается при дозе 3 мг/кг.

4. Электрофоретическая подвижность (размеры пиков преципитации с сульфатом протамина) фукоиданов из бурых морских водорослей Fucus evanescens, Laminaría cichorioides, Undaria pinnatifida, Laminaria gurjanovae, Laminaria japónica, Costaría Costata и СГМ (MM=127 кДа и СС=1,46) из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) в агарозном геле с ПС положительно коррелирует с АК активностью исследуемых образцов.

7. Показана связь между химическим строением компонентов и проявляемой АК активностью ПИК, состоящих из "+" галактозилированного хитозана, "-" сульфатированного галактоманнана и "+" и "-" N-сукцинилхитозана в разных весовых сочетаниях.

Апробация работы

Афины, Греция, 2008; IV Всероссийская конференция по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии (с международным участием), Москва, 2009.

Публикации. Основные положения и результаты работы отражены в 14 научных работах, в том числе: 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов кандидатских диссертаций, 9 статей и тезисов, опубликованных в материалах Всесоюзных, Всероссийских и международных конференций и симпозиумов.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 197 страницах машинописного текста и состоит из введения, главы «Материалы и методы», 2 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка использованной литературы, включающего 295 источников, из них 26 отечественных, 269 зарубежных. Работа иллюстрирована 34 таблицами и 36 рисунками.

Заключение диссертационного исследования на тему "Антикоагулянтная активность нативных и модифицированных фукоиданов и гуарового галактоманнана"

ВЫВОДЫ

1. Образцы нативных фукоиданов из Fucus evanescens (MM 20-40 кДа) и Laminaria cichorioides (MM 40 - 80 кДа) ингибируют активность тромбина (22±7 и 43±8 ЕД/мг) и фактора Ха (28±7 и 31 ±8 ЕД/мг) in vitro

2. Антикоагулянтная активность низкомолекулярных фракций (вязкость 0,01 - 0,21 дл/г), полученных гидролизом фукоиданов из Fucus evanescens (вязкость 0,75 дл/г). Laminaria cichorioides (0,90 дл/г) ферментным комплексом «Целловиридин», не превышает антикоагулянтную активность нативных фукоиданов. Антитромбиновая активность фракции с молекулярной массой 8-10 кДа (получена гидролизом фукоидана из Fucus evanescens гепариназой) в сравнении с натпвным выше на 25%. Специфическая антикоагулянтная активность фукоидана из Laminaria saccharina после гидролиза экстрактом гепатопанкреаса камчатского краба увеличивается в 1,7-4,7 раз. Большую роль в проявлении антикоагулянтной активности фракций фукоиданов, полученных ионообменной хроматографией, играют остатки фукозы и сульфат.

5. Сульфат деполимеризованного галактоманнана гуар (соотношение МангГал 1,64; молекулярная масса - 127 кДа; степнь дезацетилирования - 1,46) имеет невысокую специфическую антитромбиновую активность (35,8±1,8 ЕД/мг) и совсехм незначительную анти-фактор Ха активность — 6,6±0,5 ЕД/мг. При внутривенном введении крысам в дозах 1, 2 и 3 мг/кг сульфат деполимеризованного галактоманнана гуар вызывает высокую антикоагулянтную активность плазмы. Так, на 5 минуте после внутривенного введения исследуемого образца alla активность составляет 1,56±0,6 ЕД/мл при дозе 1 мг/кг, при дозе 3 мг/кг возростает до 4,14±1,16 ЕД/мл. При дозе 3 мг/кг наблюдается 100% ингнбирование роста тромба

6. Сульфат протамина образует комплексы с сульфогалактоманнанами и образцами фукоиданов из бурых водорослей Undaria pinnatifîda, Laminaria gurjanovae, Laminaria japónica, Laminaria cichorioides (MM 40 - 80 кДа) и Fucus evanescens (MM 20-40 кДа), размеры которых положительно коррелируют с антикоагулянтнон активностью; сульфат протамина нейтрализует анти-Па активность фукоиданов из Fucus evanescens и Laminaria cichorioides в гравиметрическом соотношении 0,5-1,2.

8. Фукоидан из Fucus evanescens достоверно снижает АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов в диапазоне конечных концентраций ог 0,1 до 0,5 мг/мл. Агрегация тромбоцитов, вызванная введением АДФ, при добавлении сульфата деполимеризованного галактоманнана гуар достоверно снижается в 1,9; 3,9 и в 6,8 раз в концентрациях 0,1; 0,25 и 0,5 мг/мл и составляет 34,7±4,0; 17,0±1Д; 9,8±1,0 % (в сравнении с контролем 67,1±4,1 %). Ни фукоидан из Fucus evanescens, ни сульфатированный галактоманиан из семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) не индуцируют агрегацию тромбоцитов человека.

9. Полисахаридные ионные комплексы, состоящие из ГМ - HSO3" (СЗ = 1,46 и 0,6), галактозилированного хитозана (С3=0.10; СД-0.79) - NH3 + и хитозан-сукцинила - СОО ~ (С3=0,8) в разных весовых сочетаниях демонстрируют антикоагулянтную активность ш vi tro. Дпя получения полисахаридных ионных комплексов с большими антитромбиповой и аХа активностями следует использовать сульфатированный галактоманнан со степенью сульфатирования не ниже 1,46 процентное соотношение в полисахаридных ионных комплексах не ниже 50 и увеличивать процентное отношение в полисахаридных ионных комплексах сукцинилированного хитозана (более 28%), а процентное отношение галактозилированного хитозана снижать (менее 17%).

Практические рекомендации:

В результате проведенных исследований выбраны образцы [(фукоидан из Fucus evanescens (ММ 20-40 кДа); фукоидан из Laminaria cichorioides (ММ 40 — 80 кДа), а также сульфат деполимеризованного галактоманнана гуар (соотношение Ман:Гал 1,64; молекулярная масса - 127 кДа; степень дезацетилирования - 1,46)] для проведения дальнейших испытаний фармакологической и токсикологической активности.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Лапикова, Елена Сергеевна

1. Баркаган, З.С Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза/ З.С. Баркаган, А.П. Момот.-М.:Ньюдиамед, 2001.-296 с.

2. Вистлер, Р. Методы химии углеводов/ Пер с англ. под ред.чл. корр. АН СССР НК. Кочеткова.-М.: Мир, 1967.

3. Гальбрайх, JI.C. Хитин и хитозан: строение, свойства, применение/ J1.C. Гальбрайх // Соросовский образовательный журнал. -2001.-Т.7.-№1. -С.51-56.

4. Государственная Фармакопея СССР : М.: Медицина, 1978.- издание XI, вып 1.- статья 42-1256-79.

5. Дрозд H.H., Башков Г.В., Макаров В.А. и др. Механизм антикоагулянтпого эффекта эфиров сульфатов хитозана//Вопр. Мед. Хим., 1992,- Т.38, №5.- С.12-14.

6. Дрозд H.H., Макаров В.А., Башков Г.В. и др. Эффект совместного введения гепарина эфира сульфата хитозана на функцию гемостаза// Эксп. Клин. Фарм., 1996,- Т59, №1.- С. 3033.

7. Дрозд H.H., Макаров В.А., Варламов В.П., Банникова Г.Е., Гальбрайх JI.C., Вихорева Г.А., Суханова П.П.//Материалы Шестой Международной конф. «Новые достижения в исследовании хитинаи хитозана»М.:ВНИРО. 2001; С.161-163.

8. Дрозд, H.H. Антикоагулянтная активность сульфатированных полисахаридов/ Н.Н.Дрозд, Г.Е. Банникова, В.А.Макаров// Экспер и клин. Фармакология.- 2006. -Т. 69.-№6. С.51-60.

9. Дрозд, H.H. Антикоагулянтная активность низко-молекулярных гепаринов, полученных с помощью комплекса гидролаз/ H.H. Дрозд, A.C. Толстенков, Г.Е. Банникова // Экспер Клин фармакол.- 2007.- № 70. -С. 19-24.

10. Дюк, В. Обработка данных на ПК в примерах/ В.Дюк. -СПб.: Питер, 1997.-214 с.

11. Егоров, A.B. Состав и структура макромолекулы галактоманнана семян Gleditsia feroxJA.B. Егоров, Н.М. Местечкина, В.Д. Щербухин// Прикл. биох. и микробиол. -2004. -Т.40.-№3.-С.370-375.

12. Ильина, A.B. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом Целловиридин Г20х/ A.B. Ильина, Ю.В. Ткачева, В.П. Варламов// Прикл. биохимия и микробиол. -2002. -Т.38.-№2.-С.132-135.

13. Ильина, A.B. Полиэлектролитные комплексы на основе хитозана/ A.B. Ильина, В.П. Варламов// Прикл. биохимия и микробиология.- 2005. -Т.41,№1.-С.9-16.

14. Ильина, A.B. Деполимеризация галактоманнанов семян бобовых Целловиридином Г20Х/ А.В.Ильина, Н.М. Местечкина, В.Д. Щербухин и др.//Прикл. биох. и микробнол.-2006.-Т.42,№5.-С.580-586.

15. Ильина, A.B. Галактозилированные производные низкомолекулярного хитозана: получение, свойства/ A.B. Ильина, В.П. Варламов// Прикл. биохимия и микробиол. -2007. -Т.43,№1. -С.82-87.

16. Ильина, A.B. Ферментативная деполимеризация N-сукцинилхитозана/ A.B. Ильина,

17. B.П. Варламов// Биоорганическая химия. -2007. -Т.33,№1. -С.156-159.

18. Кузнецова Т.А., Беседнова H.H., Мамаев А.Н. и др. Антикоагулянтная активность фукоиданов из бурых водорослей Охотского моря//Бюл. Эксп. Бнол. Мед., 2003.- Т.136, №5.1. C.471-473.

19. Марголин, О.В, Васильев С.А. Патогенез, диагностика п лечение генетически детерминированных тромбофилий // Клиническая гемостазиология и гемореалогия в сердечно-сосулистой хирургии: М-лы IV всерос. научн. конф. —Москва, 2007. -311 с.

20. Местечкина, Н.М. Синтез сульфатов галактоманнанов/Н.М. Местечкина, A.B. Егоров, В.Д. Щербухин// Прикл биохимия и микробиология. -2006.-Т.42, №3. -С.368-373.

21. Розкин, М.Я. Сравнительное пселедовапне аптикоагулянтной активности сульфатированных полисахаридов бурых морских водорослей/ М.Я. Розкин, М.Н. Левина, B.C. Ефимов и др.// Фармакол. и токсикол.-1988.-№4.-С.63-68.

22. Урванцева, A.M. Выделение очищенного фукоидапа из природного комплекса с полифенолами и его характеристика/ A.M. Урванцева, И.Ю. Бакунина, Н.Ю. Ким и др. // Химия раст сырья. -2004. -№3. -С. 15-24.

23. Чазов, Е.И. Антикоагулянты и фибринолитические средства/ Е.И.Чазов, К.М. Лаким // -М: Медицина, 1977,- С. 172-185.

24. Чевари, С.И. Спектрофотометрпческий метод определения гемоглобина в крови/ С.И. Чевари, С.А. Чаба// Лаб дело,- 1985,- №8.-С. 457-460.

25. Шевченко, Н.М. Полисахариды и липидные композиции бурых водорослей Laminaria gurjanovae/ Н.М. Шевченко, С.Д. Анастюк, Н.И. Герасименко и др. // Рос. Ж. Биоорг. Хим. -2007. Т. 33, №1,- С. 88-98.

26. Щербухин, В.Д. Галактоманнаны семян бобовых (обзор)/ В.Д. Щербухин, О.В. Анулов// Прпкл биохимия и микробиология.- 1999.- Т. 35, № З.-С. 257-274.

27. Щербухин, В.Д. Галактоманнан гледичии обыкновенной (Gleditsia triacanthos L.), интродуцированной в России. / В.Д. Щербухин, Н.М. Местечкина, Н.И. Смирнова и др. //Прикл. биох. и микробиол.-1997. -Т.ЗЗ, №2. -С.213-216.1. Иностранная литература

28. Adang А.Е., Peters A.M., Gerritsma S. et al. Solution-phase and solid-phase synthesis of novel transition state inhibitors of coagulation enzymes incorporating a piperidinyl moiety// Bioorg Med Chem Lett. -1999. -Vol. 9.-№9.-P. 1227-32.

29. Adhikari C.G., Mateu K„ Chattopadhyay el al. Structure and antiviral activity of sulfated fucans from Stoechospermum marginatum // Phytochemistry. -2006. —Vol.67. -№22. -P.2474-82.

30. Alban S., Gastpar R. Plasma levels of total and free tissue factor pathway inhibitor (TFPI) as individual pharmacological parameters of various heparins// Thromb Haemost. -2001. -Vol. 85. -№5.-P.824-9.

31. Alban S., Franz G. Anticoagulant activity of p-l,3-glucan sulfates in dependence on their molecular weight/ //Pure Appl. Chem. -1994,-Vol. 66.- №10. -P.2403-2406.

32. Alban S., Schauerte A., Franz G. Anticoagulant sulfated polysaccharides: Part I. Synthesis and structure-activity relationships of new pullulan sulfates/ //Carbohydr. Polym.-2002. -Vol. 47.-№3. -P.267-276.

33. Albuquerque I.R., Queiroz K.C., Alves L.G. Heterofucans from Dictyota menstrualis have anticoagulant activity // Braz J Med Biol Res. -2004. Vol. 37. -№2. -P. 167-71.

34. Alekseyenko T.V., Zhanayeva S.Y., Venediktova A.A. et al. Antitumor and antimetastatic activity of fucoidan, a sulfated polysaccharide isolated from the Okhotsk Sea Fucus evanescens brown alga// Bull Exp Biol Med. -2007. -Vol. 143.-№6. -P.30-2.

35. Alves A.P., Mulloy B., Diniz J.A., Mourao P.A. Sulfated polysaccharides from the egg jelly layer are species-specific inducers of acrosomal reaction in sperms of sea urchins // J.Biol.Chem. -1997. -Vol. 272. -№11.-P.6965-6971.

36. Alves A.P., Mulloy B., Moy G.W. et al. Females of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus differin the structure of their egg jelly sulphated fucans //Glycobiology. -1998. -Vol. 8.-№-9. -P.939-946.

37. Angelo M., Stockner I., Wiedermann C.J. Bleeding risk and perioperative management of patients anticoagulated with vitamin K antagnosists //Wien Med Wochenschr. -2008.-Vol. 158. -№21 -22.-P.615-20.

38. Arvanitoyannis I., Nakayama A., Aiba S.I. Chitosan and gelatin based edible films: stale diagrams, mechanical and permeation properties // Carbohydr. Polym. -1998.-Vol. 37.-P.371-382.

39. Assreuy A.M., Gomes D.M., M.S. da Silva et al. Biological effects of a sulfated-polysaccharide isolated from the marine red algae Champia feldmannii // Biol Pharm Bull. -2008.-Vol. 31.-№4.-P.691-5.

40. Athukorala Y., Jung W.K., Park P.J. Evaluation of biomolecular interactions of sulfated polysaccharide isolated from Grateloupia filicina on blood coagulation factors// J Microbiol Biotechnol. -2008. -Vol. l.-№ 8.-P.503-11.

41. Bakoush O., Ohlin A.K., Strandberg K. et al. Low Plasma Activated Protein C-Protein C Inhibitor Complex Concentration Is Associated with Vascular Access Failure in Hemodialysis Patients//Nephron Clin Pract. -2008. -Vol.110.-№3. -P.151-157.

42. Bakunina I.Y., Sova V.V., Nedashkovskaya O.I. et al. Alpha-galactosidase of the marine bacterium Pseudoalteromonas sp. KMM 701 //Biochemistry (Mosc). -1998,-Vol. 63.-№10.-P.1209-15.

43. Barbeyron T., L'Haridon S., Michel G. et al. Mariniflexile fucanivorans sp. nov., a marine member of the Flavobacteriaceae that degrades sulphated focans from brown algae // Int J Syst Evol Microbiol. -2008.-Vol. 58.-№9.-P.2107-13.

44. Barroso E.M., Costab L.S., Medeiros V.P. A non-anticoaguulant heterofucan has antithrombotic activity in vivo // Planta Med. -2008. -Vol. 74. -№7. -P.712-8.

45. Berger J., Reist M., Mayer J.M. et al. Structure and interactions in chitosan hydrogels formed by complexation or aggregation for biomedical applications. // Eur. J. Pharam. Biopharam. -2004. -Vol. 7. -№1. —P. 19-34.

46. Beiteau O., Mulloy B. Sulfated fucans, fresh perspectives: structures, functions, and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide//Glycobiology.-2003. -Vol. 13. -№6. -P. 9R-40R.

47. Bethea H.N., Xu J., Liu et al. Redirecting the substrate specificity of heparan sulfate 2-0-sulfotransferase by structurally guided mutagenesis// Proc Natl Acad Sci USA. -2008. -Vol. 105.-№48.-P. 18724-9.

48. Bick R.L., Frenkel E.P., Walenga J. Unfractionated heparin, low molecular weight heparins, and pentasaccharide: basic mechanism of actions, pharmacology, and clinical use// Hematol Oncol Clin North Am. -2005. -Vol. 19. -№1. -P. 1-51.

49. Bilan M.I., Grachev A.A., Ustuzhanina N.E. Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens//C.Ag.Carbohydr Res. -2002.-Vol. 337,- №8. -P.719-30.

50. Bilan M.I., Kusaykin M.I., Grachev A.A. et al. Effect of enzyme preparation from the marine mollusk Littorina kurila on fucoidan from the brown alga Fucus distichus // Biochemistry (Mosc). -2005.-Vol. 70,- №12.- P. 1321-6.

51. Black W.A.P. The seasonal variation in the combined L-fucose content of the common British laminariaceae and fucaceae// .T. Sci. Food Agr. -1954. -Vol.5. —P. 445-448.

52. Blondin C., Fisher A.M., Boisson-Vidal C. Inhibition of complement activation by natural sulfated polysaccharides (fucans) from brown seaweed // Molecular Immunology. 1994. -Vol. 31. -№4. -P.247-253.

53. Bode V., Franz G. Physiological activity of new heparinoids derived from plant polysaccharides//Arch.Pharm.-l99l.-Vol.324.-№6. -P.363-365.

54. Boisson-Vidal C., Haroun F., Ellouali M. et al. Biological activities of polysaccharide from marine algae //Drugs Fut. -1995. -Vol. 20. -P.1237-1249.

55. Boisson-Vidal C., Chaube F., Chevolot L. et al. Relationship between antithrombotic activities of fucans and their structure //Drug Devel. Res. -2000. -Vol. 51. -P.216-224.

56. Bom G.V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal//Nature. -1962.-Vol.194. -P.927-9.

57. Bosman M., Royston D. // Aprotinin and renal dysfunction/ Expert Opin Drug Saf. -2008.-Vol. 7. -№6. —P.663-77.

58. Burtseva Y.V., Kusaikin M.I., Sova V.V. et al. Distribution of fucoidan hydrolases and some glycosidases among marine invertebrates//Russ. J. Mar.Biol. -2000.- Vol. 26. -P.453-456.

59. Burtseva Y.V., Sova V.V., Pivkin M.V. et al. Enzymes of carbohydrate metabolism of mycelial fungi from marine environments. beta-l,3-glucanase of the marine fungus Chaetomium indicum //-2000. -Vol. 65. -№10. -P. 1175-83.

60. Carr J.A., Silverman N. The heparin protamine interaction // J. Cardiovasc. Surg. -1999. -Vol. 40. -№3. -P.659-665.

61. Carvalho G., Bezerra M.E. et al. Heparinoids algal and their anticoagulant, hemorrhagic activities and platelet aggregation/.// Biomed Pharmacother. -2008 Epub ahead of print.

62. Castanon M.M., Gamba C., Kordich L.C. Insight into the profibrinolitic activity of dermatan sulfate: effects on the activation of the plasminogen mediated by tissue and urinary plasminogen activators // Thromb Res. -2007. -Vol. 120.-№5. -P.745-52.

63. Casu B., Orcste P., Torri G. et al. The structure of heparin oligosaccharide fragments with high anti-(factorXa) activity containing the minimal antithrombin Ill-binding sequence.// Biochem. J . -1981.-Vol. 197. -№3. -P.599-609.

64. Cetinel S., Ercan F., Sirvanci S. et al. The ameliorating effect of melatonin on protamine sulfate induced bladder injury and its relationship to interstitial cystitis// J.Urol. -2003. -Vol. 169. -№4. -P.1564-1568.

65. Chang X., Chang R., Yamada K. Inhibition of antithrombin by hyaluronic acid may be involved in the pathogenesis of rheumatoid arthritis// Arthritis Res Ther. -2005. -Vol. 7. -№2. -P. R268-73.

66. Chang L.C., Lee H.F., Yang Z.Q. Low Molecular Weight Protamine (LMWP) as Nontoxic Heparin/Low Molecular Weight Heparin Antidote (I): Preparation and Characterization/ // A APS FharmSci. -2001.-Vol. 3. -№3.:article 17. DOI: 10.1208/ps030317.

67. Charef S, Petit E., Barritault D. Effects on coagulation of a synthetic heparan mimetic given intraperitoneally or orally// J Biomed Mater Res A. -2007. -Vol. 83. -№4. -P. 1024-31.

68. Chargaff E., Olson K.B. Studies on the chemistry of blood coagulation. VI. Studies on the action of heparin and other anticoagulants. The influence of protamine on the anticoagulant effect in vivo// J Biol Chem. -1937. -Vol. 122. -№1. -P.153-167.

69. Charnaia, M.A., Morozov I.A., Gladysheva V.G. et al. Comparison of two schemes of administering the Russian protamine sulfate after extracorporeal circulation in cardiosurgical patients // Anesteziol Rcanimatol. -2006. -Vol.5. -P.31-3.

70. Chen J.H., Lim J.D., Sohn E.H. et al. Growth-inhibitory effect of a fucoidan from brown seaweed Undaria pinnatifida on Plasmodium parasites //Parasitol Res. -2009,-Vol. 104. -№2. -P.245-50.

71. Chevolot L., Foucault A., Kervarec N. et al. Further data on the structure of brown seaweed fucans: relationships with anticoagulant activity.// Carbohydr. Res.- 1999.- Vol. 319. -P. 154-165.

72. Chevolot L., Mulloy B., Ratiskol J. et al. disaccharide repeat unit is the major structure in fucoidans from two species of brown algae// Carbohydr. Res. -2001. -Vol. 330. -№4. -P.529-535.

73. Chizhov A.O. Dell A., Morris H.R. et al.// A study of fucoidan from the brown seaweed Chordafilum/Carbohydr. Res. -1999.-Vol. 320. -№1-2. -P.108-119.

74. Church F.C., Meade J.B., Treanor R.E., Whinna H.C. Antithrombin activity of fucoidan. The interaction of fucoidan with heparin colactor II, antithrombin III, and thrombin // J Biol Chem. -1989. -Vol. 264. -№6. -P.3618-23.

75. Ciancia M., Ciancia I., Quintana, Vizcargucnaga M.I. et al. Polysaccharides from the green seaweeds Codium fragile and C. vermilara with controversial effects on hemostasis// Int J Biol Macromol. -2007. -Vol. 41. -№5. -P.641-9.

76. Claeson G. Synthetic peptides and peptidomimetics as substrates and inhibitors of thrombin and other proteases in the blood coagulation system// Blood Coagul Fibrinolysis -1994. —Vol. 5. -№3. -P.411-36.

77. Colwell N.S., Grupe M.J., Tollefsen D.M. Amino acid residues of heparin cofactor II required for stimulation of thrombin inhibition by sulphated polyanions // Biochim. Biophys. Acta. -1999. -Vol. 1431.-№1.-P. 148-156.

78. Coyne E. Heparin — past, present and future. In.: Chemistry and biology of heparin, Ed. Lundblad R.L., Brown W.V., Mann K.G., Roberts H.R. Ch. I. New-York: Elsevier/North-Holland. -1981.-P.9-17.

79. Crowther M.A., Berry L.R., Monagle P.T. et al. Mechanisms responsible for the failure of protamine to inactivate low-molecular-weight heparin// British Journal of Haematology. 2002. — Vol. 116. -№1.-P. 178-186.

80. Cumming A.M., Jones G.R., Wensley R.T. et al. In vitro neutralization of heparin in plasma prior to the activated partial thromboplastin time test: an assessment of four heparin //Thromb. Res. -1986. -Vol. 41. -№1. -P.43-56.

81. Dace R., McBride E., Brooks K. el al. Comparison of the anticoagulant action of sulfated and phoshorylated polysaccharides //Thromb.Res. -1997. -Vol. 87. -№1. -P.l 13-121.

82. Daniel R., Berteau O., Jozefonvicz J. et al. Degradation of algal (Ascophyllum nodosum) fucoidan by an enzymatic activity contained in digestive glands of the marine mollusk Pectcn maximus//Carbohydr. Res. -1999. -Vol. 322. -P.291-297.

83. Davenport A. Low-molecular-weight heparin for routine hemodialysis// Hemodial Int. -2008. -Vol.12. -№2. -P.34-7.

84. De Lorenzo F., Newberry D., Scully M. Low molecular weight heparin (bemiparin sodium) and the coagulation profile of patients with heart failure // Am Heart 1. -2002. -Vol.143. №4. -P. 689.

85. Dehmer G. J., Fisher M, Tate D.A. et al. Reversal of Heparin Anticoagulation by Recombinant Platelet Factor 4 in Humans // Circulation.- 1995. -Vol. 91.- №8,- P.2188-2194.

86. Del Re M.R., Ayd J.D., Schultheis L.W. et al. Protamine and left ventricular function: a transesophageal echocardiography study // Anesth. Analg. -1993. -Vol.77. -№6. -P.1098-1103.

87. Demir M., Iqbal O., Hoppensteadt D.A. Anticoagulant and antiprotease profiles of a novel natural heparinomimetic mannopentaose phosphate sulfate (PI-88) //Clin Appl Thromb Hemost. -2001. -Vol. 7. -№2. -P.l31-140.

88. Descamps V., Colin S., Lahaye M. et al. Isolation and culture of a marine bacterium degrading the sulfated fucans from marine brown algae Mar Biotechnol (NY) -2006. -Vol. 8. -№1. -P. 27-39.

89. D'iaz-Nido J., Wandosell F., Avila J. Glycosaminoglycans and beta-amiloid, prion and tan peptides in neurodegenerative diseases// Peptides.- 2002. -Vol. 23. -№7. -P.1323-1332.

90. Digiovanni C.W. Current Concepts Review: Heparin-Induced Thrombocytopenia // Foot Ankle Int. -2008. -Vol. 29. -№11. -P.l 158-1167.

91. Doutremepuich C., Bonini F. Toulemonde F. et al. In vivo neutralization of low-molecular weight heparin fraction CY 216 by protamine// Semin Thromb Hemost. -1985. -Vol. 11. -№3. -P.318-322.

92. Drozd N.N., A.I. Sher, Makarov V.A. et al. Comparison of antithrombin activity of the polysulphate chitosan derivatives in in vivo and in vitro system // Tromb. Res. -2001. -Vol. 102. -№5. -P.445-455.

93. Drozd N.N., Tolstenkov A.S., Makarov V.A. et al. Pharmacodynamic parameters of anticoagulants based on sulfated polysaccharides from marine algae // Bull Exp Biol Med. -2006. -Vol. 142. -№5. -P.591-3.

94. Du J., Zhang S., Sun R. et al. Novel polyelcctrolyte carboxymethyl konjac glucomannan-chitosan nanoparticlcs for drug delivery. II Release of albumin in vitro // J.Biomed Mater Res B Appl Biomater. -2005. -Vol. 72. -№2. -P.299-304.

95. Duarte M.E., Cardoso M.A., Noseda M. D.et al. Structural studies of fucoidans from the brown seaweed Sargassum stenophyllum// Carbohydr Res. -2001. -Vol.333. -№4. -P. 281-293.

96. Durand E., Helley D., A. Al Haj Zen et al.// Effect of low molecular weight fucoidan and low molecular weight heparin in a rabbit model of arterial thrombosis//E. Durand, J Vase Res. -2008. -Vol. 45. -№.6. —P.529-37.

97. Durig J., Bruhn T., Zurborn K.H. et al. Anticoagulant fucoidan fractions from Fucus vesiculosus induce platelet activation in vitro// Thromb Res. -1997. -Vol. 85. -№6. -P.479-91.

98. Dutkiewicz J.K. Superabsorbent materials from shellfish waste—a review//J Biomed Mater Res. -2002. -Vol.63. -№3. -P.373-81.

99. European Pharmacopoeia, 6th edition 2009 (6.3)- published 15.6.2004, http://online.pheur.org/entry.htm ; Created by 2exVia with Master edit 7 allée Kastner, CS 30026, F67081 Strasbourg, France MasterEdit® article.

100. Fabian I., Aronson M. Polycations as possible substitutes for protamine in heparin neutralization// Thromb Res. -1980. -Vol. 17. -№1-2. -P.239-247.

101. Fareed J., Hoppensteadt D.A., Fareed D. et al. Survival of heparins, oral anticoagulants, and aspirin after the year 2010 //Scmin Thromb Hemost. -2008. -Vol. 34.-№l. -P.58-73.

102. Farias W.R., Nazareth R.A., Mourao P.A. Dual effects of sulfated D-galactans from the red algae Botryocladia occidentalis preventing thrombosis and inducing platelet aggregation// Thromb Haemost.- 2001. -Vol.86. -№6. -P. 1540-6.

103. Fiore M.M., Kakkar V.V. Platelet factor 4 (PF4) neutralizes heparan sulfate-dependent inactivation of factor Xa by preventing enzyme interaction with polysaccharide // Biochem Biophys Res Commun. -2003.-Vol. 311. №1. -P.71-76.

104. Fonseca R.J., Mourao P.A. Fucosylatcd chondroitin sulfate as a new oral antithrombotic agent // Thromb Haemost. -2006. -Vol. 96. -№6. -P.822-9.

105. Fonseca R.J., Oliveira S.N., Melo F.R. Slight differences in sulfation of algal galactans account for differences in their anticoagulant and venous antithrombotic activities //Thromb Haemost. -2008. -Vol. 99.-№3. -P.539-45.

106. Fritrsche J., Alban S., Ludwig R.J. The influence of various structural parameters of semisynthetic sulfated polysaccharides on the P-selectin inhibitory capacity//Biochem Pharmacol. -2006. -Vol. 72. №4. -P.474-485.

107. Galebskaia L.V., Riumina E.V., Bogomaz T.A. The mechanisms of fucoidan action on human complement //Biomed Khim. -2003. -Vol. 49. -№6. -P.542-7.

108. Giraux J.L. Tapon-Bretaudiere J., Matou S. et al. Fucoidan as heparin induces tissue factor pathway inhibitor release from cultured human endothelial cells// Thromb Haemost.- 1998. —Vol. 80.-№4. -P.692-695.

109. Giraux J.L., Matou S., Broset A. et al. Modulation of human endothelial cell proliferation and migration by fucoidan and heparin// Eur.J.Cell.Biol. -1998. -Vol. 77. -№4. -P. 352-359.

110. Glauser B.F., Pereira M.S., Monteiro R.Q. Serpin-independent anticoagulant activity of a fucosylated chondroitin sulfate//Thromb Haemost. -2008. -Vol. 100. -№3. -P.420-8.

111. Grauffel V., Kloareg B., Mabeau S. New natural polysaccharides with potent antithrombotic activity: fucans from brown algae // Biomaterials. -1989. —Vol. 10. -№6. -P.363-8.

112. Grzeszczuk A., Lapiriski T.W., Panasiuk A. Levels of hyaluronic acid in chronic viral C hepatitis with relationship to liver steatosis// Wiad Lek. -2002. -Vol.55. -№ 1-2. -P.35-41.

113. Guermazi S., Elloumi-ZghaL H., Ben Hassine L. Homozygous antithrombin type HBS deficiency; a family study //Pathol Biol (Paris). -2007. -Vol. 55.-№5. -P.256-61.

114. Guermazi S., Znazen R. Resistance to curative treatment by unfractioned heparin//Rev Med Interne.-2009. -Vol. 30. -№4. -P.331-4.

115. Haas S. New anticoagulants towards the development of an "ideal" anticoagulant // Vasa. -2009. -Vol. 38. -№1. -P. 13-29.

116. Hagiwara K., Kuribayashi Y., Iwai H. A sulfated chitin inhibits hemagglutintion by Thcileria sergenti merozoites // Carbohydr. Polym. -1999. -Vol. 39.-№3. -P.245-248.

117. Haroun-Bouhedja F., Mostafa E., Sinquin C. et al. Relationship between Sulfate Groups and Biological Activities of Fucans // Thrombosis Research. -2000. -Vol.l00.-№5. -P.453-459.

118. Hayashi K., Nakano T., Hashimoto M. Defensive effects of a fucoidan from brown algae Undaria pinnatifida against herpes simplex virus infection//Int Immunopharmacol.- 2008. —Vol. 8. -№1.-P.109-16.

119. Henry M.L., Davidson L.B., Wilson J.E. et al. Whole blood aggregation and coagulation in db/db and ob/ob mouse models of type 2 diabetes// Blood Coagul Fibrinolysis. -2008.-Vol.l9.№2. -P. 124-34.

120. Hirano S. Chitin and chitosan as novel bioteclinological materials //Polym. Int. -1999.-Vol.48. -P.732-734.

121. Hirohashi N., Vilela-Silva A.C., Mourao P.A. et al. Structural requirements for species-specific induction of the sperm acrosome reaction by sea urchin egg sulfated fucan// Biochem. Biophys.Res. Commun.-2002. -Vol. 298. -№3. -P.403-407.

122. Hirsh J., Raschke R. Heparin and low molecular weight heparin: the Seventh ACCP conference on antithrombotic and thrombolytic therapy // Chest.- 2004.-Vol. 126. -P. 188-203.

123. Hirsh J., O'Donnell M, Weitz J.I. New anticoagulants// Blood.- 2005. Vol. 105, N 2.- P. 453463.

124. Holmer E., Soderberg K., Bcrgquist D. Heparin and its low molecular weight derivatives: anticoagulant and antithrombotic properties // Hemostasis. -1986. -Vol.16, №2. -P.1-7.

125. Holtkamp A.D., Kelly S., Ulber S.A.// Fucoidans and fucoidanases-focus on techniques for molecular structure elucidation and modification of marine polysaccharides/ Appl Microbiol Biotechnol. -2009. -Vol. 82, №1.-P.1-11.

126. Hoppensteadt D.A., Jeske W., Walenga J. The future of anticoagulation // Semin Respir Crit Care Med.- 2008,- Vol. 29, N 1,- P. 90-99.

127. Horrow J.C. Protamine: a review of its toxicity// Anesth. Analg. -1985. -Vol. 64, №3. -P.348-361.

128. Horstadius S., Lorch I.J., Chargaff E. The effect of deoxyribonucleic acids extracted from sea urchin sperm on the development of sea urchin eggs //Exp Cell Res.-1954. -Vol. 6, №2. -P.440-452.

129. Horton B., Just E.K. Preparation from chitan of (1—>4)-2-amino 2-deaxy-D-gluco pyranuronan and its 2-sulfoamino analog having blood-anticoagulant properties // Carbohydr. Res. -1973.-Vol. 29. —P.173-179.

130. Huang R., Du Y., Yang J. Influence of functional groups on the in vitro anticoagulant activity of chitosan sulfate// Carbohydr Res. -2003.-Vol. 33 8,№6. -P.483-489.

131. Hubbard A.R., Jennings A. Neutralisation of heparan sulphate and low molecular weight heparin by protamine // Thromb Haemost.- 1985.-Vol. 53, №1. -P.86- 95.

132. Hubbard A.R., Jennings A. Neutralisation of heparan sulphate and low molecular weight heparin by protamine // Thromb Haemost. -1985. Vol.53.- №1.- P.86- 95.

133. Hulin M.S., Wakefield T.W., Andrews P.S. et al. A novel protamine variant reversal of heparin anticoagulation in human blood in vitro// J. Vase. Surg. -1997,-Vol. 26, №6. -P.1043-1048.

134. Izaguirre G., Rezaie A.R., Olson S.T. Engineering functional antithrombin exosites in alpha 1-proteinase inhibitor that specifically promote the inhibition of factor Xa and factor IXa. //J Biol Chem. -2009.-Vol. 284, №3. -P. 1550-8.

135. Jae-Young Je., Pyo-Jam Park, Kim S.K. Prolyl-endopeptidase inhibitory activity of chitosan sulfates with different degree of deacetylation// Carbohydr. Polym. -2005. -Vol. 60.-P.553-556.

136. Jayakumar R. New N., Tokura S. Sulfated chitin and chitosan as novel biomaterials// International J of Biol Macromolecules. -2007.-Vol. 40, №3. -P.175-181.

137. Jenniskens G.J., A. Oosterhof., R. Brandwijk et al. Heparan sulfate heterogeneity in skeletal muscle basal lamina: demonstration by phage display-derived antibodies// J Neurosci. -2000,-Vol.20. P.4099-4111.

138. Jenniskens G.J., Oosterhof A., Brandwijk R. et al. Heparan sulfate heterogeneity in skeletal muscle basal lamina: demonstration by phage display-derived antibodies // J Neurosci. -2000,-Vol.20. P.4099-4111.

139. Jones G.R., Hashim R., Power D.M. A comparison of the strength of binding of antithrombin III, protamine and poly (L-lysine) to heparin samples of different anticoagulant activities //Biochimica Biophysica Acta. -1986.-Vol.883, №1. -P.69-76.

140. Kagoma Y.K., Crowther M.A. Use of antifibrinolytic therapy to reduce transfusion in patients undergoing orthopedic surgery: A systematic review of randomized trials //J. Thromb Res. -2009.-Vol. 123,№5.-P.687-96.

141. Karkouti K., Beattie W.S. Aprotinin is useful as a hemostatic agent in cardiopulmonary surgery: no // Thromb Haemost.- 2006.-Vol. 4,№9.-P. 1879-1881.

142. Karthikeyan G., Mehta S.R., Eikelboom J.W. Fondaparinux in the treatment of acute coronary syndromes:evidence from OASIS 5 and 6 Expert Rev //Cardiovasc Ther. -2009.-Vol. 7. №3. -P.241-9.

143. Kaufman P.A. Production of a novel anticoagulant by neoplastic plasma cells: report of a ease and review of the literature Kaufman, P.A. Gockerman J.P., Greenberg C.S. // Am J Med 1989; 86(5): 612-616(163) 140

144. Kennedy C.C., Rocks W.J. Bedside control of heparin therapy simple whole blood clotting method // J Clin Phatol.-1973.-Vol. 26, №11.-P.897-894.

145. Khoory M.S., Nesheim M.E., Bowie E.J. Circulating heparan sulfate proteoglycan anticoagulant from a patient with a plasma cell disorder // J Clin Invest. -I980.-Vol. 65, №3.-P.666-674.

146. Killing H. Zur biochemie der Meersalgen. HZ. Physiol. Chem.-1913.-Vol. 83.-P. 171-197.

147. Kim W.J., Kinx S.M., Lee Y.H. Isolation and characterization of marine bacterial strain degrading fucoidan from Korean Undaria pinnatifida Sporophylls // J Microbiol Biotechnol. -2008. -Vol.18, №4. -P.616-23.

148. Kiphuth I.C., Staykov D., Kohrmann M. et al. Early administration of low molecular weight heparin after spontaneous intracerebral hemorrhage. A safety analysis. // Cerebrovasc. Dis. -2009.-Vol.27, №2.-P.-146-5 O.

149. Kloareg B., Demarty M., Mabeau S. Polyanionic characteristic of purified sulphated homofucans from brown algae// Int J Biol Macromol. -1986.-Vol.8.-P.380-386.

150. Kloareg B., Quatrano R.S. Structure of the cell walls of marine algae and ecophysiological functions of the matrix polysaccharides //Oceanography and Marine biology.-1988.-№26.-P.259-315.

151. Korir A.K., Larive C.K. Advances in the separation, sensitive detection and characterization of heparin and heparin sulfate// Anal bioanal chem.-2009.-Vol.393, №1.-P. 155-69.

152. Kort M., Buijsrnaii C. A., van Boeckel C. A Synthetic heparin derivatives as new anticoagulant drug// Drug Discov Today., 2005.- V. 10, N 11.- P. 769-779.

153. Kurtz A.B., Gray R.S., Markanday S. et al. Circulating IgG antibody to protamine in patients treated with protamine-insulins//Diabetologia.- 1983. -Vol.25, №4. -P.322-324.

154. Kusaykin M.I., Chizhov A.O., Grachev A.A. A comparative study of a specificity of fucoidanases from marine microorganisms and invertebrates // J. Appl. Phycol.- 2006.-Vol.18.-P.369-373.

155. Kweon D.K., Song S.B., Park Y.Y. Preparation of water-soluble chitosan/heparin complex and its application as wound healing accelerator //Biomaterials.- 2003 .-Vol.24.-P.l 595-1601.

156. Lam L.H., Silbert J.E., Rosenberg R.D. The separation of active and enactive forms of heparin/ZBiochem Biophys Res Commun.- 1976.-Vol.69,№ 2.-P.570-577.

157. Lapikova E.S., Drozd N.N., Tolstenkov A.S. et al. Inhibition of thrombin and factor Xa by Fucus evanescens fucoidan and its modified analogs//Bull Exp Biol Med. -2008.-Vol. 146, №3.-P.328-33.

158. Laskin C.A., Spitzer K.A., Clark C.A. et al. Low Molecular Weight Heparin and Aspirin for Recurrent Pregnancy Loss: Results from the Randomized, Controlled HepASA Trial.// J Rheumatol. -2009 Epub ahead of print.

159. Le Templier G., Rodger M.A. Heparin-induced osteoporosis and pregnancy //Curr Opin Pulm Med. -2008.-Vol. 14,№5.-P.403-7.

160. Lee R.I. White P.D. A clinical study of the coagulation time of blood // Am J Med Science.-1913.-Vol. 145.-P.495-503.

161. Levy J.H., Ramsay J.G., Guyton R.A. Aprotinin in cardiac surgery// N Engl J Med -2006.-Vol. 354,№4.-P. 1953-1960.

162. Levi M. Emergency reversal of antithrombotic treatment// Intern Emerg Med. -2008 Epub ahead of print.

163. Li B., Lu F., Wei X. et al. Fueoidan: structure and bioactivity// Molecules. -2008.-Vol. 13, №8.-P. 1671-95.

164. Li C., Gao Y., Li M. et al. Effect of Laminaria japonica polysaccharides on lowing serum lipid and anti-atherosclerosis in hyperlipemia quails //Zhong Yao Cai. -2005.-Vol. 28, №8.-P.676-9.

165. Li N., Zhang Q. J. Song Toxicological evaluation of flicoidan extracted from Laminaria japonica in Wiatar rats// Food and chemical Toxicology. -2005.-Vol. 43,№3. -P.421-6.

166. Lima M.M.S., Ono S.L., Reicher F. et al. Structure and interactions in chitosan hydrogels formed by complexation or aggregation for biomedical applications // Lat.Am.Appl. Res. -1996.-Vol.26. -P. 457-465.

167. Linhardt R., J. Toida T. Heparin oligosaccharides: new analogues development and applications. In Carbohydrates in Drug Design Witczak Z. J., Nieforth K. A. Marcel Dekkcr: New York, 1997.- Ch.7.- P.277-341.

168. Linhardt R.J., Dordick J.S., Deangelis P.L et al. Enzymatic synthesis of glycosaminoglycan heparin // Semin thromb Hemost. -2007,-Vol. 33, №5.-P.453-65.

169. Liodakis E., Hildebrand F., Frink M. et. al. Heparin-induced thrombocytopenia and liver hemorrhage following polytrauma//Chirurg. -2009 Epub ahead of print.

170. Liu J., Pedcrsen L.C. Anticoagulant heparin sulfate: structural specifity and biosynthesis // Appl Microbiol Biotechnol.- 2007,-Vol. 74,№2.-P.263-72.

171. Liu W.G., Zhang J.R., Cao Z.Q. et al.Chitosan-arginine conjugate as a novel anticoagulation biomaterial/ //J Mater Sei Mater Med.- 2004,-Vol. 15,№1 l.-P.l 199-1203.

172. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. et al. Protein measurement with the folin phenol reagent//J Biol Chem.- 1951.-Vol. 193.-P.265-75.

173. Mao W., Li H., Li Y. et al. Chemical characteristic and anticoagulant activity of the sulfated polysaccharide isolated from Monostroma latissimum (Chlorophyta)//Int J Biol Macromol. -2009.-Vol.44, №1.-P.70-4.

174. Markwardt F., Klocking H.P. Heparin-induced release of plasminogen activator// Haemostasis.- 1977.-Vol. 6, №6.-P.370-374.

175. Martin de Kort., Rogier Buijsman C., Constant A.A, et al. Synthetic heparin derivatives as new anticoagulant drugs // Drug Discov Today.- 2005.-Vol. 10, №11.-P. 769-779.

176. Masic L.P. Arginine mimetic structures in biologically active antagonists and inhibitors// Curr MedChem. -2006,-Vol. 13,№30.-P.3627-48.

177. McRae S.J., Stafford A.R., Fredenburgh J.C. et al. In the presence of phospholipids, glycosaminoglycans potentiate factor Xa-mediated protein C activation by modulating factor Xa activity//Biochemistry. -2007.-Vol. 46, №13.-P.4195-203.

178. Medeiros V.P., Queiroz K.C., Cardoso M.L. et al. Sulfated galactofucan from Lobophora variegata: anticoagulant and anti-inflammatory properties// Biochemistry (Mose). -2008. -Vol. 73,№9.-P.1018-24.

179. Melo F.R., Pereira M.S., Fogucl D. et al. Antithrombin -mediated anticoagulant activity of sulphated polysaccharides: different mechanisms for heparin and sulfated galactans //J. Biol. Chem. -2004.-Vol. 279, №20.-P.20824-35.

180. Mian A.J., Percival E. et. al. Carbohydrates of the seaweeds Himanthalia lorea, Bifurcaria bifurcata, and Padina pavonia//Carbohyd. -1973.-Vol.26.-P. 133-146.

181. Mikkonen K.S., Rita H., Helen H. et al. Effect of polysaccharide structure on mechanical and thermal properties of galactomannan-based films//Biomacromolecules. -2007.-Vol. 8, №10.-P.3198-205.

182. Millet J., Jouault S.C., Mauray S. Antithrombotic and anticoagulant activities of a low molecular weight fucoidan by the subcutaneous route // Thromb Haemost. -1999.-Vol. 8.-P. 391 -395.

183. Monien B.H., Henry B.L, Raghuraman A. et al. Novel chcmo-enzymatic oligomers of cinnamic acids as direct and indirect inhibitors of coagulation proteinases // Bioorg Med Chem. -2006,-Vol. 14,№23.-P.7988-7998.

184. Mosesson M. V. Fibrinogen and fibrin structure and functions //J. Thromb. Haemosts. -2005. -Vol.3.-N8-P. 1894-1904.

185. Mosolov V.V., Grigor'eva L.I., Valueva T.A. The role of proteolytic enzymes and their inhibitors in plant protection (review) // Prikl Biokhim Mikrobiol. -2001,-Vol. 37,№2.-P.131-140.

186. Mourao P.A.S., Bastos I.G. Highly acidic glycans from sea cucumbers // Eur. J. Biochem. -1987.-Vol. 166.-P.63 9-645.

187. Mourao P.A., Pereira M.S. Searching for alternatives to heparin: sulfated fucans from marine invertebrates//Trends Cardiovasc.Med. -1999.-Vol. 9, №8.-P.225-232.

188. Mousa, S.A. Heparin, low molecular weight heparin and derivatives in thrombosis, angiogenesis and inflammation emerging links// Semin Thromb Hemost.- 2007.-Vol.33, №5.-P.524-533.

189. Mulloy B., Ribeiro A.C., Alves A.P. et al. Sulfated fiicans from echinoderms have a regular tetrasaccharide repeating unit defined by specific patterns of sulfation at the 0-2 and 0-4 positions //J.Biol.Chem.-1994.-Vol.269, №3 5 .-P.22113 -22123.

190. Mulloy B., Mourao P.A., Gray E. Structure/function studies of anticoagulant sulphated polysaccharides using NMR// Joumal of Biotechnology.- 2000.-Vol. 77,№1.-P.123-135.

191. Murata J., Saiki I., Nishimura S.I. et al. Inhibitory effect of chitin heparinoids on the lung metastasis of B-16-BL6 melanoma//Jpn. J. Cancer Res. -1989.-Vol. 80.-P.866-872.

192. Muzzarelli R.A.A. // Chitin Handbook / Eds. R.A.A Muzzarelli, M.g. Peter. Grottammare (Italy): Atec, -1997. -P. 153-163.

193. Muzzarelly R.A.A. Natural Chelating Polymers, Pergaman, New York, 1973, pp.83; J.P.Jikakis (Ed.), Chitin, Chitozan and Related Enzymes, Academic, Orlando, FL, 1984, pp. XVII-XVIV.

194. Muzzarelli R.A.A., Tanfani F., Emanuelly M., Pace D.P, Chiurazzi E, Piani M, in: R. Muzzarelli, CJeuniaux, W.G.Goodday (Eds.) Chitin in Nature and Technology, Plenum, New York.-1986. -P.469.

195. Muzzarelli R.A.A.// Chitin Handbook/ Eds. R.A.A. Muzzarelli , M.g. Peter. Grottammare (Italy): Atec. -1997. -P.153-163.

196. Nader H.B., Lopes C.C., Rocha H.A. et al. Heparins and heparinoids: occurrence, structure, and mechanism of antithrombotic and hemorrhagic activities//Curr Pharm.- 2004.-Vol. 10,№9,-P.951-66.

197. Nishimura S-I., Kai H., Shinada K. et al. Regioseleetive syntheses of sulfated polysaccharides specific anti-HIV-1 activity of novel chitin sulfates//Carbohydr. Res. -1998.-Vol.306.-P.427-433.

198. Nishino T., Nagumo T., Kiyohara H. et al. Structural characterization of a new anticoagulant sulfate from the brown seaweed Eklonia kurome //Carbohyd. Res.-1991.-Vol. 211, №1,-P.77-90.

199. Nishino T., Nishioka C., Ura H. et al. Isolation and partial characterization of a novel amino sugar-containing fucan sulfate from commercial Fucus vesiculosus fiicoidan //Carbohydr.Res.-1994.-Vol. 255.-P.213-24.

200. Nishino T., Fukuda A., Nagumo T. Inhibition of the generation of thrombin and factor Xa by a fucoidan from the brown seaweed Ecklonia kurome //Thromb.Res.-1999.-Vol.96.-P.37-49.

201. Nishino T., Yamauchi T., Horie M. et al. Effects of fucoidan on the activation of plasminogen by u-PA and t-PA//Thromb.Res. -2000.-Vol. 99, №6.-P.623-634.

202. Noti C., Seeberger P. Chemical Approaches to Define the Structure-Activity Relationship of Heparin-like Glycosaminoglycans // Chem Biol.- 2005.-Vol.l2,№7.-P.731-756.

203. Nybo M., Madsen J.S. Serious anaphylactic reactions due to protamine sulfate: a systematic literature review // Basic Clin Pharmacol Toxicol. -2008.-Vol.103, №2.-P. 192-6.

204. Okajima Y., Kanayama S., Maeda Y. et al. Studies on the neutralizing mechanism of antithrombin activity of heparin by protamine // Thromb. Res. -1981.-Vol. 24, №2.-P. 21-29.

205. Osborne S.A., Daniel R.A., Desilvak et al. Antithrombin activity and disaccharide composition of dermatan sulfate from different bovine tissue// Glycobiology.-2008.-Vol. 18, №3.-P.225-34.

206. Palmer R.N., Rich M.E., Rick P.D. et al. Circulating heparin sulfate anticoagulant in a patient with a fatal bleeding disorder // N Engl J Med.- 1984.-Vol.310,№7.-P. 1696-1699.

207. Pantaleone D., Yalpani M., Scallas M. //Carbohydrates and Carbohydrate Polymers, Analysis, Biotechnology, Modification, Antiviral Biomedical and Other Applications. / Ed. M. Yalpani, Shrevsbury (USA): ATL Press. -1993. P. 44-51.

208. Patankar M.S., Oehninger S., Baraett T. et.al. A revised structure for fucoidan may explain some of its biological activities //J. Biol. Chem.- 1993.-Vol. 268,№ 29.-P.21770-21776.

209. Percival E.G.V., Ross A.G. Fucoidan. Part l.The isolation and purification of fucoidin from brown seaweeds // J. Chem. Soc. -1950.-P.717-720.

210. Petitou M., van Boeckel C.A.//A synthetic antithrombin III binding pentasaccharide is now a drug! What comes next?//Angew Chem Int Ed Engl. -2004.-Vol.43,№.24.-P.3118-33.

211. Pires L., Gorin P.A.J., Reicher F. et.al. An active heparinoid obtained by sulphation of a galactomannan extracted from the endosperm of Senna macranthera seeds //Carbohydr. Polym. -2001.-Vol. 46.-P.165-169.

212. Pletcher C., Cunningham M., Nelsestuen G. Kinetic analysis of various heparin fractions and heparin substitutes in the thrombin inhibition reactio //Biochim Biophys Acta.-1985.-Vol. 838,№1.-P.106-113.

213. Ponedelkina I., Lukina E.S, Odinokov V.N. Acid glycosaminoglycans and their chemical modification// Bioorg Khim. -2008.-Vol. 34, №l.-P.5-28.

214. Preston F.W. The antiheparin effect of Polybrene. (A polymer of N,N,N',N,-Tetramethylhexamethylenediamine and trimethylene bromide) // J Lab Clin Med.- 1952.-Vol.40,№3.-P.927.

215. Racanelli A., Fareed J. Neutralization of the antithrombotic effects of heparin and Fraxiparin by protamine sulfate // Thrombosis Research.- 1992,-Vol. 68,№3.-P.211-222.

216. Rajgopal R., Bear M., Butcher M.K. et al. The effects of heparin and low molecular weight heparins on bone//Thromb Res. -2008.-Vol.l22,№3.-P.293-8.

217. Rey E., Garneau P., David M. et al Dalteparin for the prevention of recurrence of placental-mediated complications of pregnancy in women without thrombophilia: a pilot randomised controlled trial//J Thromb Haemost. -2009.-Vol. 7, №l.-P.58-64.

218. Rezaie A.R. Determinants of specificity of factor xa interaction with its physiological inhibitors // Mini Rev Med Chem. 2006,-Vol. 6, №8.-P.859-865.

219. Ribeiro A.C., Vieira R.P, Mourao P.A et al. A sulfated a-L-fucan from sea cucumber//Carbohyd. Res. -1994.-Vol. 255.-P.225-240.

220. Rocha H.A.O., Moraes F.A., Trindade E.S. et al. Structural and Hemostatic Activities of a Sulfated Galactofucan from the Brown Alga Spatoglossum schroederi// J. Biol. Chem.-2005.-Vol. 280,№50.-P.41278-41288.

221. Rosenberg R.D. Biological actions of heparin// Siminars in Hematology.-1977.-Vol. 14, №4.-P.427 440.

222. Rudd T.R., Skidmore M.A., Guimond S.E. et al. Glycosaminoglycan origin and structure revealed by multivariate analysis of NMR and CD spectra// Glycobiology. -2OO9.-V01.19,№1.-P.52-67.

223. Ruprecht R.M., Gama Sosa M.A., Fazely F. et.al. N-carboxymethilchitosan N, O, sulfate inhibits HIV-1 replication//Biochem. Biophys. Res.Commun. -1991.-Vol. 174.-P.489-496.

224. Rusconi C.P., Scardino E., Layzer J. et al. RNA aptamers as reversible antagonists of coagulation factor IXa//Nature. -2002.-Vol. 419,№6902.-P.23-4.

225. Sagnella S., Mai-Ngam K. Chitosan based surfactant polymers designed to improve blood compatibility on biomaterials //Colloids Surf B Biointerfaces. -2005.-Vol. 42, №2.-P.147-155.

226. Saiki I., Murata J., Nakajima J. et al. Inhibition by sulfated chitin derivatives of invasion throught extracellular matrix and melanoma enzymatic degradation by metastatic melanoma cells//Cancer Res. -1990.-Vol.50.-P.3631-3637.

227. Salzman E.W., Rosenberg R.D, Smith M.H.et al. Effect of heparin and heparin fractions on platelet aggregation//.! Clin Invest.- 1980.-Vol.65.-P.64-73.

228. Schedin-Weiss S., Richard B., Hjelm R. et al. Antiangiogenic Forms of Antithrombin Specifically Bind to the Anticoagulant Heparin Sequence (dagger)//Biochemistry. -2008.-Vol.47, №51.-P. 13610-9.

229. Schick B.P., Maslow D., Moshinski A. et al. Novel concatameric heparin-binding peptides reverse heparin and low-molecular-weight heparin anticoagulant activities in patient plasma in vitro and in rats in vivo//Blood. -2004. -Vol. 103, №4. -P. 1356-63.

230. Schjetlein R., Sletnes K. E., Wisloff F. A quantitative, semi-automated and computer-assisted test for lupus anticoagulant // Thromb Res. -1993.-Vol. 69, №l.-P.239-250.

231. Schmidt B., Pringsheim W., Kunzer W. Epsylon-aminocaproic acid in the treatment of severe and dominating hyperfibrinolysis in a premature infant//Helv Paediatr Acta. -1980.-Vol. 35, №3.-P.273-9.

232. Senni K., Gueniche F., Foucault-Bertaud A. et. al. Fucoidan a sulfated polysaccharide from brown algae is a potent modulator of connective tissue proteolysis// Arch Biochem Biophys. -2006,-Vol. 445, №1. -P.56-64.

233. Sharath M.D., Metzger W.J., Richerson Ii.B. et al. Protamineinduced fatal anaphylaxis: prevalence of antiprotamine immunoglobulin E antibody // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. -1985.-Vol. 90, №l.-P.86-90.

234. Shenoy S., Harris R.B., Sobel M. Development of heparin antagonists with focused biological activity // Curr. Pharm. -1999.-Vol. 5,№2.-P.965- 986.

235. Silva T.M., Alves L.G., de Queiroz K.C. et al. Partial characterization and anticoagulant activity of a heterofiican from the brown seaweed Padina gymnospora//Brazilian J. of Med. and Biol. Res. -2005.-Vol.38, №4.-P.523-533.

236. Smits N.C., Lensen J.F. Phage display-derived human specific glycosaminoglycan epitopes //Methods enzymol.- 2006.-Vol.416.-P.61-87.

237. Souza M.L., Dellias J.M., Melo F.R. et al. Structural composition and anticoagulant activity of dermatan sulfate from the skin of the electric eel Electrophorus elcctricus (L.) // Comp Biochem B.Biochem Mol Biol. -2007.-Vol. 147,№3.-P.387-94.

238. Srivastava M., Kapoor V.P. Seed galactomannans: an overview //Chem Biodivers. -2005.-Vol. 2, №3.-P.295-317.

239. Stuart K., Panitch A. Characterization of Gels Composed of Blends of Collagen I, Collagen III, and Chondroitin Sulfate//Biomacromolecules. -2009. -Vol. 10, №1.-P.25-31.

240. Sugimoto T., Matsuo T., Wanaka K. Heparin-induced Thrombocytopenia in Two Patients Undergoing Abdominal Aortic Aneurysm Surgery //Clin Appl Thromb Hemost. -2009 Epub ahead of print.

241. Tanaka K. Hydrolysis of fucoidan by abalone liver a-L-fucosidase/K. Tanaka, S. Sorai. FEBS Lett. -1970.-Vol. 9, №1.-P. 45-48.

242. Tang Z.L., Shen S.F. A study of Laminaria digitata powder on experimental hyperlipoproteinemia and its hemorrheology// Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. -1989.-Vol.9, №4,-P.223-5.

243. Tapie N., Malhiac C. Hucher N. et al. Determination of galactose and mannose residues in natural galactomannans using a fast and efficient high-performance liquid chromatography/!!V detection// J Chromatogr. -2008,-Vol. 1181, №l-2.-P.45-50.

244. Teien A.N., Lie M. Heparin assay in plasma a comparison of five clotting methods // Thromb Res. -1975. -Vol. 7, №5.-P.777 788.

245. Teien A.N., Lie M., Abildgaard U. Assay of heparin in plasma using a chromogenic substrate for activated factor X //Thromb Res.- 1976.-Vol.8,№3.-P.413-416.

246. Teien A.N., Lie M. Evaluation of an amidolytic heparin assay method: increased sensitivity by adding purified antithrombin III // Thromb Res. -1977.-Vol. 10, №3.-P.399-410.

247. Thachil J., Gatt A., Martlew V. Management of surgical patients receiving anticoagulation and antiplatelet agents //Br J Surg. -2008.-Vol.95, №12.-P.1437-48.

248. Thanassi N.M., Nakada H. Enzymic degradation of fucoidan by enzymes from the hepatopancreas of abalone. Haliotus species // Arch.Biochem.Biophys. -1967.-Vol. 118, №1,-P.172-177.

249. Trento F., Cattaneo F., Pescador R. et al. Antitrombin activity of an algal polysaccharide// Thiomb. Res. -2001.-Vol. 102, №5.-P.457-65.

250. Ushakova N.A., Morozevich G.E., Ustiuzhanina N.E. et al. Anticoagulant activity of fiicoidans from brown alga//Biomed Kliim. -2008. -Vol. 54, №5. -P.597-606.

251. Van de Westerlo., Smetsers T.F. et al. Human single chain antibodies against heparin: selection, characterization, and effect on coagulation // Blood. -2002.-Vol. 99.-P.2427-2460.

252. Vasseur E. Chemical studies on the jelly coat of the sea-urchin egg//Acta Chem. Scand.-1948.-Vol. 2.-P.900-913.

253. Vaugelade P., Hoebler C., Bernaid F. et al. Non-starch polysaccharides extracted from seaweed can modulate intestinal absorption of glucose and insulin response in the pig// Reprod Nutr Dev. -2000.-Vol.40, №l.-P.33-47.

254. Vitale C., Verdecchia C., Bagnis C. et al.// Effects of dermatan sulfate for anticoagulation in continuous renal replacement therapy// J Nephrol. -2008.-Vol. 21, №2.-P.205-12.

255. Volpi N., Maccaii F. Structural characterization and antithrombin activity of dermatan sulfatepurified from marine clam Scapharca inaequivalvis//Glycobiology. -2009.-Vol. 19,№4.-P.356-367.

256. Volpi N. Maccari F. Electrophoretic approaches to the analysis of complex polysaccharides // J. Chromatogr.-2006; B 834.-P. 1-13.

257. Volpi N. Therapeutic applications of glycosaminoglycans // Curr Med Chem. 2006.-Vol. 13, №15.-P. 1799-810.

258. Von Holdt M.M., Ligthelm S. P, Nunn J.R. South African seaweeds: seasonal variations in the chemical composition of some phaeophyceae// J. Sci. Food. -1955. -Vol.6.-P.193-197.

259. Vongchan P., Sajomsang W., Subyen D. Anticoagulant activity of a sulfated chitosan // Carbohydr. Res. -2002.-Vol. 337, №13.-P. 1233-1236.

260. Wakefield T.W., Andrews P.C. Wrobleski S.K. et al. Effective and less toxic reversal of low-molecular weight heparin anticoagulation by a designer variant of protamine // J Vase Surgery.-1995,-Vol. 21,№5.-P.839-49.

261. Walenga J.M., Fareed J. Preliminary biochemical and pharmacologic studies on a chemically synthesired pentasaccharide //Semin Thromb Hemost. -1985.-Vol. 11. №2.-P.89-99.

262. Wang H., Ooi E.V., Ang P.O. Antiviral polysaccharides isolated from Hong Kong brown seaweed Hydroclathrus clathratus// Sci China C Life Sci. -2007,-Vol. 50, №5.-P.611-8.

263. Wang Y., Xin D., Liu K. et al. Heparin-Paclitaxel conjugates using mixed anhydride as intermediate: synthesis, influence of polymer structure on drug release, anticoagulant activity and in vitro efficiency //Pharm Res. -2009.-Vol. 26,№4.-P.785-93.

264. Weitz J.I., Middeldorp S., Geerts W. et al. Thrombophilia and New Anticoagulant Drugs// Hematology Am Soc Hematol Educ Program. -2004.- P. 424-438.

265. Weitz J.I., Bates S.M. New anticoagulants// Thromb. Haem. -2005.-Vol. 3.-P.1843-1854.

266. Wessler S, Reimer S.M., Sheps M.C. Biologic assay of a thrombosis inducing activity in human serum // J.Appl.Physiol. -1959.-Vol. 14.-P.943-946.

267. Whistler R.J., Kosik M. Anticoagulant activity of oxidired and N- and O- sulfated chitosan// Arch. Biochem. Biophys. -1971.-Vol. 142.-P.106-110.

268. Xing R., Liu S., Yu H. et al. Preparation of low molecular-weight and high-sulfate-content chitosans under microwave radiation and their potential antioxidant activity in vitro // Carbohydr Res. -2004.-Vol.339,№15.-P.2515-2519.

269. Yamamoto K., Tsuji Y, Kumagai H. et al. Induction and purification of a-L-fucosidase from Fusarium oxysporum!7Agric.Biol. Chem. -1986.-Vol.50.-P.1689-1695.

270. Yang C., Chung D., Shin I.S et al. Effects of molecular weight and hydrolysis conditions on anticancer activity of lucoidans from sporophyll of Undaria pinnatifida//Int J Biol Macromol. -2008.-Vol.43, №5.-P.433-7.

271. Yang L., Manithody C., Rezaie A.R. Contribution of basic residues of the 70-80-loop to heparin binding and anticoagulant function of activated protein C// Biochemistry.-2002.-Vol. 41,№19.-P.6149-6157.

272. Yaphe W., Morgan K. Enzymic hydrolysis of fucoidin by Pseudomonas atlantica and Pseudomonas carrageenova//Nature. -1959.-Vol. 183, №4663. -P.761-762.

273. Yin E.T., Wessler S., Butler J.V. Plasma heparin: a unique, practical, submicrogram-scnsitive assay // J Lab Clin Med.-1973.-Vol. 81, №2.-P. 298-310.

274. Yoon S.J., Pereira M.S., Pava~o M.S. et al. The medicinal plant Porana volubilis contains polysaccharides with anticoagulant activity mediated by heparin cofactor II//Thromb Res.- 2002.-Vol. 106,№1.-P.51— 58.

275. Yoon S.J., Pyun Y.R., Hwang J.K. et al. A sulfated fucan from the brown alga Laminaria cichorioides has mainly heparin cofactor II-dependent anticoagulant activity//Carbohydr Res. -2007,-Vol. 342, №15.-P.2326-30.

276. Young E., Cosmi B., Weitz J. et al. Comparison of the non-specific binding of unfractionated heparin and low molecular weight heparin (enoxaparin) to plasma proteins// Thromb Haemost.-1993.-Vol. 70,№1 .-P.625-655.

277. Yu G., Gunay N.S., Linhardt R.T. et al. Preparation and anticoagulant activity of the phosphosulfomamian PI-88 // Eur. J. Med. Chem. -2002,-Vol. 37, №10.-P. 783-791.

278. Zhang F., Zhang Z, Thistle R. Structural characterization of glycosaminoglycans from zebrafish in different ages//Gliconj J. -2009.-Vol. 26,№2.-P.211-8.