Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:АНТИГИПОКСИЧЕСКОЕ И АНТИИШЕМИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ФИТОЭКДИСТЕРОНА И МЕХАНИЗМЫ ЕГО РАЗВИТИЯ

На правах рукописи

005049729

ЩУЛЬКИН Алексей Владимирович

АНТИГИПОКСИЧЕСКОЕ И АНТИИШЕМИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ФИТОЭКДИСТЕРОНА И МЕХАНИЗМЫ ЕГО РАЗВИТИЯ

14.03.06- фармакология, клиническая фармакология 14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

* фев т

Санкт-Петербург 2012

005049729

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук Якушева Елена Николаевна

доктор медицинских наук профессор Давыдов Виктор Викторович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Дьячук Георгий Иванович, ГБОУ ВПО «СЗГМУ им. И.И. Мечникова» Минздрава России, кафедра фармакологии, заведующий

доктор медицинских наук профессор Дергунов Анатолий Владимирович, ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ, кафедра патофизиологии, профессор

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов»

Защита диссертации состоится « <2» О 2 . "З^ЛЗ в 13 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.07 при ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ по адресу: 194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, дом 6

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ

Автореферат разослан « ( 2012 г.

Ученый секретарь совета

доктор медицинских наук профессор Богомолов Борис Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Экдистероиды - это липофильные полигидроксилированные стероиды, участвующие в жизнедеятельности большинства живых организмов. Они обнаружены во всех главных типах высших растений: папоротникообразных, голосеменных и покрытосеменных (фитоэкдистероиды); грибах (микоэкдистероиды); организме насекомых, ракообразных, нематод (зооэкдистероиды) (Volodin V.V. et al., 2002; Lafont R.J. et al., 2003).

Являясь у насекомых гормонами линьки, у млекопитающих экдистероиды выполняют регуляторные функции и оказывают разнообразные биологические эффекты (Сыров В.Н., 1994; Lafont R.J. et al., 2003). Выделяют следующие основные виды действия: анаболическое (Сыров В.Н. и соавт., 2012; Raskin I.A., 2009), актопротекторное (Dinan L.N, 2009), иммуномодулирующее (Dinan L.N., 2009), антигипергликемическое (Cahlíková L.L. et al., 2011; Dinan L.N., 2009;), нейропротекторное (Luo C.W. et al., 2011), кардиопротекторное (Cahlíková L.L. et al., 2011) и ряд других.

Установлено, что свое действие в организме насекомых экдистероиды реализуют через специфические рецепторы, являющиеся членами ядерного суперсемейства рецепторов (Henrich V.C., 2012). Их структура сходна со структурой других рецепторов стероидных гормонов (глюкокортикостероидов, половых гормонов, витамина D3 и ретиноидов) (Evans R.M., 1988).

В организме млекопитающих экдистероидные рецепторы до сих пор не найдены, и механизмы реализации их эффектов окончательно не установлены (Lafont R.J. et al., 2003). Предполагается, что они могут встраиваться в липидный мембранный бислой, изменяя структуры окружающих белков (Tuganova A.V., 1996), регулировать функционирование системы вторичных посредников (Lafont R.J. et al., 2003; Raskin I.A., 2009) и модулировать активность рецепторов (Tsujiyama S.W. et al., 1995).

Гипоксия - типовой патологический процесс, лежащий в основе патогенеза большинства заболеваний (Черешнев В.А. и соавт., 2009; Semenza G.L., 2011). Тяжесть течения и исход многих из них в конечном итоге определяются особенностями вторичных неспецифических метаболических расстройств, степенью дестабилизации клеточных мембран, а также возможностями реактивации структурных и ферментных белков в условиях гипоксии (Чеснокова Н.П. и соавт., 2006). Поэтому в лекарственную терапию разнообразных заболеваний, сопровождающихся развитием гипоксии, входят антигипоксанты - вещества, повышающие адаптацию и резистентность

организма к недостатку кислорода. Влияние экдистероидов на устойчивость организма к гипоксической гипоксии в доступной научной литературе нами обнаружено не было.

В то же время, исследования, проведенные в 60-80-х гг. XX века показали, что в патогенезе наиболее распространенных заболеваний человека (патология сердечно-сосудистой, дыхательной, эндокринной систем, злокачественные новообразования и др.) важную роль играют активные формы кислорода (АФК) (Semenza G.L., 2011). Последние являются инициаторами реакций свободно-радикального окисления, которые, в свою очередь, вызывают окислительную модификацию липидов, белков, нуклеиновых кислот, что, в ходе развития патологического процесса, может приводить к гибели клетки по апоптотическому или некротическому механизмам (Губский Ю.И. и соавт., 2008). Кроме того, было обосновано представление об общебиологической роли АФК, определенное количество которых образуется нейрохимическими и биоэнергетическими системами клетки в нормальных условиях, играя существенную роль в различных сторонах ее жизнедеятельности (Беленичев И.Ф. и соавт., 2004).

В последнее время активно изучается состояние лизосом и активность лизосомальных гидролаз при различных патогенных воздействиях (Пупышев А.Б., 2011). Это связано с тем, что была установлена важная роль лизосомальных ферментов в развитии не только некроза, но и апоптоза, опухолевого метастазирования и клеточной дифференцировки (Sheikh A.M. et al., 2010).

Таким образом, выявление у экдистероидов способности повышать резистентность организма к гипоксии, воздействовать на развитие свободно-радикальных реакций и снижать активность лизосомальных протеиназ может лежать в основе их биологической и фармакологической активности, а также последующего клинического применения.

Цель исследования

Изучить антигипоксическое и антиишемическое действие фитоэкдистерона, его влияние на развитие свободно-радикальных реакций и активность катепсина D в опытах in vitro и in vivo.

Задачи исследования

1. Изучить влияние фитоэкдистерона на резистентность беспородных белых крыс к тяжелой острой гипоксической гипоксии.

2. Исследовать действие фитоэкдистерона на морфологические изменения миокарда животных в условиях его острой тотальной ишемии.

3. Оценить прямую антиоксидантную активность фитоэкдистерона in vitro в сравнительном аспекте.

4. Изучить влияние фитоэкдистерона на выраженность окислительного стресса и состояние антиоксидантной системы при острой гипоксической гипоксии средней тяжести в головном мозге, миокарде и печени крыс.

5. Исследовать воздействие фитоэкдистерона на общую активность катепсина D при острой гипоксической гипоксии средней тяжести в головном мозге, миокарде и печени крыс.

6. Сравнить антигипоксическое, антиишемическое и антиоксидантное действие фитоэкдистерона и милдроната и их влияние на активность катепсина D.

Научная новизна

В работе впервые:

•установлена антигипоксическая активность фитоэкдистерона на модели тяжелой острой гипоксической гипоксии;

•выявлено антиишемическое и кардиопротекторное действие фитоэкдистерона при тотальной ишемии миокарда;

•установлена способность фитоэкдистерона ингибировать аскорбат- и НАДФН2-зависимое перекисное окисление липидов и стимулировать, в высоких концентрациях, генерацию супероксидного анион-радикала in vitro;

•выявлено, что применение фитоэкдистерона у крыс приводит к органоспецифическому снижению выраженности окислительного стресса в головном мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести;

•установлена способность фитоэкдистерона снижать общую активность лизосомального фермента катепсина D в головном мозге и миокарде крыс при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.

Практическая значимость работы

Антигипоксическое, антиишемическое, антиоксидантное действие фитоэкдистерона, выделенного из смолёвки поникшей (Silene nutans) и смолёвки татарской (Silene tatarica), и его способность снижать общую активность лизосомального фермента катепсина D по выраженности сопоставимы с эффектами милдроната.

В работе продемонстрирована относительная безопасность изученного вещества по его влиянию на биохимические показатели, характеризующие

состояние оксидантной и антиоксидантной систем головного мозга, миокарда и печени интактных белых крыс.

Полученные результаты позволяют рекомендовать фитоэкдистерон для дальнейшего изучения в доклинических исследованиях, а также клинической практике в целях комплексной терапии гипоксических состояний и патологий, сопровождающихся развитием окислительного стресса и активацией лизосомальных протеиназ.

Положения, выносимые на защиту

•Курсовое пероральное ежедневное введение фитоэкдистерона, выделенного из смолёвки поникшей (Silene nutans) и смолёвки татарской (Silene tataricá), в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней приводит к повышению резистентности белых крыс к тяжелой острой гипоксической гипоксии и повышает устойчивость кардиомиоцитов к тотальной ишемии.

•Фитоэкдистерон в опытах in vitro дозозависимо ингибирует железоиндуцируемое аскорбат- и НАДФН2-зависимое перекисное окисление липидов в гомогенатах мозга крыс.

•Профилактическое пероральное введение фитоэкдистерона в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней до воздействия гипоксической гипоксии средней тяжести приводит к снижению выраженности органных проявлений окислительного стресса в головном мозге, миокарде и печени крыс и уменьшению общей активности катепсина D в головном мозге и миокарде.

•По антигипоксическому, антиишемическому, антиоксидантному действию и по влиянию на общую активность катепсина D фитоэкдистерон сопоставим с препаратом метаболического действия - милдронатом.

Личное участие автора

Автором самостоятельно подготовлен аналитический обзор литературы по изучаемой проблеме (100%), составлена программа исследования (80%), проведены эксперименты in vitro и in vivo (100%), биохимические и морфологические исследования (80%), обработка и интерпретация данных (90%), подготовка публикаций по диссертационной работе (75%). В целом его личный вклад в исследование превышает 85%.

Апробация работы

Результаты исследования доложены на II Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения - 2007» (Санкт-Петербург, 2007); XV Межрегиональной конференции «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2009); IV Международной научной конференции молодых ученых медиков (Курск, 2010); XVII Российском

национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010); Итоговой научной конференции студентов и молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» (Москва, 2011); XI Всероссийской выставке Научно-технического творчества молодежи (Москва, 2011); IV Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения -2011» (Санкт-Петербург, 2011); XVIII Межрегиональной конференции «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2012); IV Съезде фармакологов России (Казань, 2012). Работа удостоена гранта «УМНИК 2011». По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 3 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

Внедрение результатов в практику

Основные положения работы используются в учебном процессе при обучении студентов, клинических интернов и ординаторов на кафедре фармакологии с курсом фармации и фармакотерапии ФДПО, патофизиологии, фармакогнозии с курсом ботаники ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 147 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы (глава 1), материалы и методы исследования (глава 2), результаты исследования (глава 3), обсуждение полученных результатов (глава 4), выводы и практическая значимость.

Диссертация иллюстрирована 18 рисунками и 22 таблицами. Список литературы включает 115 источников отечественной и 137 — зарубежной литературы. Работ, опубликованных за последние 5 лет, более 25%.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследовании использовали водную вытяжку из смолёвки поникшей (Silene nutans) и смолёвки татарской (Silene tatarica), которая содержала 0,1% фитоэкдистерона. Концентрацию вещества определяли спектрофотометрически при длине волны 242 нм. В ходе эксперимента препарат вводили экспериментальным животным в дозе 5 мг/кг массы (Мирзаев Ю.Р. и соавт., 2000).

Исследуемый препарат был любезно предоставлен заведующим кафедрой фармакогнозии с курсом ботаники ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России, профессором, д.ф.н. Дармограем В.Н. Дизайн исследования включал эксперименты in vitro и in vivo. Экспериментальная работа in vivo выполнена на 116 беспородных белых крысах-самцах, массой 200-250 г. У лабораторных животных, предварительно, за 40 дней до начала работы, определяли

устойчивость к гипоксической гипоксии (гипобарический тип) путем их подъема на высоту 11000 м со скоростью 50 м/с. В исследование включали только крыс со средней устойчивостью к гипоксии (время до начала развития клонико-тонических судорог составляло 5-15 мин). В качестве препарата сравнения в опытах in vivo использовалось метаболическое средство триметилгидрацина пропионат (милдронат, «Grindex», Латвия), которое вводили в дозе 250 мг/кг массы.

Исследуемые препараты (фитоэкдистерон и милдронат) вводили один раз в день в желудок с помощью зонда (2 раза в день вводили фитоэкдистерон курсом 3 дня в I группе). Интактным и контрольным крысам внутрижелудочно один раз в день вводили дистиллированную воду из расчета 5 мл/кг массы.

Все животные были разделены на 4 группы.

I группа - изучение влияния фитоэкдистерона на резистентность крыс к тяжелой острой гипоксической гипоксии (ОГГ), которую моделировали подъемом животных на высоту 11000 м с помощью проточной барокамеры со скоростью 50 м/с. Группа I включала 5 серий животных, каждая из которых состояла из 7 крыс: 1 серия - контрольные животные, подвергнутые воздействию ОГГ; 2 серия - животные, которым профилактически перед моделированием ОГГ вводили фитоэкдистерон в течение 3 дней; 3 серия -животные, которым профилактически перед моделированием ОГГ вводили фитоэкдистерон в течение 7 дней; 4 серия - животные, которым профилактически перед моделированием ОГГ вводили фитоэкдистерон в течение 14 дней; 5 серия - животные, которым профилактически перед моделированием ОГГ вводили милдронат в течение 7 дней. Об устойчивости к гипоксии судили по времени наступления клонико-тонических судорог и по времени потери позы и двигательной активности.

II группа - изучение антиишемического действия фитоэкдистерона, включала 3 серии, каждая из которых состояла из 6 крыс: 1 серия - контроль ишемии - животные, которым моделировали тотальную ишемию миокарда; 2 серия - животные, которым профилактически вводили фитоэкдистерон в течение 7 дней, а затем подвергали тотальной ишемии миокарда; 3 серия -животные, которым профилактически вводили милдронат в течение 7 дней, а затем подвергали тотальной ишемии миокарда. Тотальную ишемию миокарда моделировали по методике Remier К.А. et al. (1981) в модификации Сысолятиной Н.А. (1991). Под эфирным наркозом вскрывали грудную клетку крыс, извлекали сокращающееся сердце и быстро отмывали его от крови в физиологическом растворе (t 37,0°С). Отсекали предсердия, миокард

желудочков рассекали ножницами на 3 части. Одну часть сразу опускали в фиксирующую жидкость (10% нейтральный формалин), остальные 2 части помещали в нагретые до 37°С бюксы, на дне которых находилась фильтровальная бумага, смоченная физиологическим раствором. Бюксы плотно закрывали и ставили в термостат при температуре 37°С. Через каждые 15 мин кусочек миокарда извлекали из бюкса и помещали в фиксирующую жидкость. После фиксации кусочки миокарда заливали в парафин, готовили срезы толщиной 7-8 мкм и окрашивали по методу Селье Г.Х. (1958) с целью выявления фуксинофильного субстрата. Морфометрию гистологических препаратов миокарда осуществляли с использованием светооптического микроскопа Микмед-2, при увеличении в 280 раз. Микропрепараты фотографировали с помощью цифровой камеры Canon Power Shot G5 с переходником Carl Zeiss. Ввод и анализ изображений осуществляли с использованием компьютера Intel Pentium III и программы Photoshop CS2. Для определения удельной площади (SA, мм2/мм2) фуксинофильного субстрата был применен метод точечного счета.

III группа - изучение влияния фитоэкдистерона на выраженность окислительного стресса и состояние антиоксидантной системы при ОГГ средней тяжести, которую моделировали подъемом животных на высоту 8000 м со скоростью подъема и спуска 50 м/с и экспозицией в течение 30 мин. Группа III включала 5 серий животных, каждая из которых состояла из 7 крыс: 1 серия - интактные животные; 2 серия - животные, получавшие фитоэкдистерон в течение 7 дней; 3 серия - контрольные животные, подвергнутые воздействию ОГГ; 4 серия - животные, которым профилактически перед моделированием ОГГ вводили фитоэкдистерон в течение 7 дней; 5 серия - животные, которым профилактически перед моделированием ОГГ вводили милдронат в течение 7 дней. После спуска животных забивали под эфирным наркозом. Для исследования забирали головной мозг, сердце и печень. В гомогенатах этих органов определяли содержание малонового диальдегида (МДА) по методу Hoss R.A. в модификации Стальной Н.Д. и Горишвили Т.Г. (1987), свободных и белковых (общих) сульфгидрильных (SH) групп по методу Ellman G.L. (1959), активность супероксиддисмутазы (СОД) по методу Костюк В.А. и соавт. (1990), каталазы по методу Королюк М.А. с соавт. (1988), глутатионпероксидазы по методу Paglia D.E., Valentine W.N. в модификации Панкина В.З. (1976), глутатион-8-трансферазы по методу Keen J.N., Iakoby W.B. (1978), глутатионредуктазы по методу Carbery J.J., Maunervik B.N. (1975).

IV группа - изучение влияния фитоэкдистерона на общую активность катепсина D при ОГГ средней тяжести. Группа IV включала 4 серии животных, каждая из которых состояла из 7 крыс: 1 серия - интактные животные; 2 серия -контрольные животные, подвергнутые воздействию ОГГ; 3 серия - животные, которым профилактически перед моделированием ОГТ вводили фитоэкдистерон в течение 7 дней; 4 серия — животные, которым профилактически перед моделированием ОГГ вводили милдронат в течение 7 дней. После спуска животных забивали под эфирным наркозом. Для исследования забирали головной мозг, сердце и печень. В гомогенатах этих органов определяли общую активность катепсина D по методу Anson M.L. в модификации Покровского A.A. и Тутельяна В.А. (1976).

Изучение прямой антиоксидантной активности фитоэкдистерона in vitro осуществляли на четырех модельных системах:

1 модельная система - генерирующая супероксидный анион-радикал в ходе реакции аутоокисления кверцитина (Костюк В.А. и соавт., 1990).

2 модельная система - генерирующая супероксидный анион-радикал в ходе реакции аутоокисления адреналина (Сирота Т.В., 1999).

3 модельная система - неферментативного железоиндуцируемого аскорбат-зависимого перекисного окисления липидов (Зарубина И.В. и соавт., 2004).

4 модельная система - ферментативного железоиндуцируемого НАДФН2-зависимого перекисного окисления липидов (Зарубина И.В. и соавт., 2004).

При исследовании способности фитоэкдистерона связывать супероксидный анион-радикал, в качестве препарата сравнения использовалась аскорбиновая кислота («Serva»), а при изучении влияния фитоэкдистерона на аскорбат- и НАДФН2-зависимое перекисное окисление липидов (ПОЛ), -кудесан («Аквион», 1 мл кудесана содержит 30 мг коэнзима Qio и 4,5 мг витамина Е).

Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием программ «Биостат» и Statsoft Statistica 6.1. Характер распределения данных определяли по критерию Шапиро-Уилка. Для исследования статистической значимости показателей, имеющих нормальное распределение, внутри каждой группы использовали тест ANOVA, различия между сериями определяли по критерию Ньюмена-Кейсла.

Полученные данные, в случае нормального распределения признака, были представлены в виде среднего арифметического значения и стандартной ошибки среднего результата (М±гп).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние профилактического применения фитоэкдистерона на развитие тяжелой гипоксии. Превентивное введение фитоэкдистерона в течение 3-х дней достоверно не влияло на резистентность нелинейных белых крыс к тяжелой острой гипоксической гипоксии (ОГГ). Профилактическое назначение фитоэкдистерона в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 и 14 дней приводило к повышению резистентности животных к тяжелой ОГГ, что проявлялось увеличением времени развития клонико-тонических судорог на 52,5% (р<0,01) и 67,5% (р<0,01) и времени потери позы - на 40,9% (р<0,05) и на 60,6% (р<0,01) соответственно, по сравнению с показателями контрольных крыс (табл. 1).

Таблица 1

Влияние профилактического применения фитоэкдистерона и милдроната на время развития клонико-тонических судорог и время потери позы у крыс при тяжелой острой гипоксической гипоксии (М±ш)

Серия эксперимента Время начала развития клонико-тонических судорог, мин, п=7 Время потери позы, мин, п=7

Контроль (интактные крысы) 8,0±0,47 6,6±0,60

Введение фитоэкдистерона в течение 3 дней 10,2±0,77 8,0+0,69

Введение фитоэкдистерона в течение 7 дней 12,2±1,00* 9,3±0,63*

Введение фитоэкдистерона в течение 14 дней 13,4±1,12** 10,6±0,79**

Введение милдроната в течение 7 дней 11,8±0,99* 9,4±0,77*

* - р<0,05, ** - р<0,01 - достоверные различия по сравнению с показателями интактных крыс

Превентивное введение милдроната в дозе 250 мг/кг массы в течение 7 дней приводило к увеличению времени развития судорог на 47,5% (р<0,01) и времени потери позы - на 42,4% (р<0,05) по сравнению с показателями контроля.

При сравнении устойчивости к ОГГ (по времени развития клонико-тонических судорог и времени потери позы) у животных, получавших разные курсы фитоэкдистерона, не выявлено достоверных различий между сериями (р>0,05). Также не отмечалось статистически значимых различий между

эффектами двух изучаемых веществ - фитоэкдистерона и милдроната при их введении курсом 7 дней (р>0,05).

Исследование антиишемического эффекта фитоэкдистерона. Данный эффект оценивали по площади фуксинофильного субстрата в срезах миокарда. Полученные результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2

Влияние фитоэкдистерона и милдроната на площадь фуксинофильного субстрата при экспериментальной тотальной ишемии миокарда (М±т)

Серии опытов Площадь фуксинофильного субстрата в миокарде в динамике ишемии, п=6

0 мин 15 мин 30 мин

Контроль (интактные крысы) 0,25±0,019 0,49+0,027 0,61±0,031

Фитоэкдистерон профилактически 7 дней 0,27+0,025 0,31±0,038*,** 0,35+0,045*

Милдронат профилактически 7 дней 0,23±0,021 0,42±0,044** 0,47+0,037*

* - р<0,05 - достоверные различия по сравнению с показателями интактных крыс,

** - р<0,05 - достоверные различия между исследуемыми препаратами

В серии контроля ишемии сразу после забоя крыс фуксинофильный субстрат в кардиомиоцитах интактных крыс наблюдался редко. В полях зрения микроскопа обнаруживались единичные, диффузно расположенные кардиомиоциты с явлениями слабовыраженной фуксинофилии изотропных и анизотропных дисков. Через 15 мин удельная площадь поражения увеличилась на 96,0% (р<0,05). Характер фуксинофилии (отражающий развитие миокардиодистрофии) был различен. В некоторых кардиомиоцитах этот субстрат занимал отдельные сегменты, четко отграниченные вставочными дисками. Часто наблюдались клетки, лишенные поперечной исчерченности, «заполненные» однородной, гомогенной фуксинофильной массой. 30-минутная экспозиция острой тотальной ишемии сердечной мышцы обусловила более выраженную фуксинофилию - удельная площадь поражения возросла на 144,0% (р<0,05). В очагах дистрофии кардиомиоциты были набухшими, лишены поперечной исчерченности, в них отмечались явления кариопикноза и кариолизиса, а также утолщенные вставочные диски. Часто наблюдалась фрагментация дисков и вакуолизация цитоплазмы.

Сразу после забоя у крыс, профилактически получавших фитоэкдистерон и милдронат, гистологическая картина миокарда не отличалась от группы контроля ишемии. 15-минутная экспозиция миокарда на фоне

профилактического применения фитоэкдистерона приводила к снижению удельной площади поражения на 36,7% (р<0,05), а на фоне введения милдроната - на 14,3% (р>0,05). Слабовыраженный фуксинофильный субстрат локализовался в отдельных сегментах диффузно расположенных мышечных клеток по ходу изотропных, анизотропых, а также вставочных дисков. У животных, профилактически получавших милдронат, в миокарде встречались клетки, лишенные поперечной исчерченности. Через 30 мин ишемии, на фоне предварительного назначения фитоэкдистерона, удельная площадь фуксинофильного субстрата уменьшилась на 42,6% (р<0,05) по сравнению с данными контроля ишемии, а на фоне применения милдроната - лишь на 23,0% (р<0,05). Морфологические изменения сводились к локальному отсутствию поперечной и продольной исчерченности у отдельных, диффузно расположенных кардиомиоцитов. В единичных клетках наблюдалась фрагментация на уровне вставочных дисков, некоторые были набухшими. Значительно реже встречались небольшие очажки некроза ткани. Следует отметить, что на 15-ой мин ишемии при профилактическом введении фитоэкдистерона обнаруживалась достоверно меньшая площадь фуксинофильного субстрата по сравнению с серией применения милдроната (р<0,05).

Исследование антисупероксидной активности фитоэкдистерона in vitro. Полученные результаты представлены на рис. 1 и рис. 2. Фитоэкдистерон в конечных концентрациях в инкубируемом растворе от 1,3 мМ до 0,035 мМ активировал аутоокисление кверцетина от 46,2% (р<0,001) до 7,7% (р<0,05) соответственно, а в концентрациях от 0,1 мМ до 0,005 мМ - процесс аутоокисления адреналина от 150,4% (р<0,001) до 23,8% (р<0,05) соответственно.

В качестве препарата сравнения использовалась аскорбиновая кислота в диапазоне концентраций в инкубируемом растворе, аналогичном фитоэкдистерону. В отличие от фитоэкдистерона, аскорбиновая кислота, как классический антиоксидант, ингибировала как процесс аутоокисления кверцетина от 95,5% (р<0,001) в концентрации 1,3 мМ до 44,0% (р<0,001) в концентрации 0,035 мМ, так и окисление адреналина от 98,9% (р<0,001) в концентрации 0,1 мМ до 13,6% (р<0,01) в концентрации 0,001 мМ (рис. 1 и рис. 2).

Известно, что процесс самоокисления адреналина инициируется супероксидным анион-радикалом, образующимся при взаимодействии адреналина со следами металлов в щелочной среде. Ускорение данного

3 120 ■■•

S 100

я Я 80 •■

я а. а 60 -

о а 3 » Я S 40 20

S а 0 -

S S и -20 -

'Л О -40

а -60 -

X я -80 -

■*— аскорбиновая кислота •••• фитоэкдпстерон

***

— Г

Обозначения: * - р<0,05, ** - р<0,01,

*** - р<0,001 - достоверные

различия по сравнению с пробами, не содержащими изучаемые вещества

1,3 0,625 0,45 0,35 0,25 0,15 0,1 0,05 0,035 0,015 0,01 0,005 Концентрация веществ в реакционной смеси, мМ

Рисунок 1. Влияние фитоэкдистерона и аскорбиновой кислоты на аутоокисление кверцетина in vitro (M±m)

150 100 50 0 -50 -100 -150 -200

Г **>

0,1

•— аскорбиновая кислота ••••* фитозкдистерон

***

0,05 0,025 0,015 0,01 0,005 0,001 0,0005 0,0001 Концентрация веществ в реакционной смеси, мМ

Обозначения: **-р<0,01, ***-р<0,001-достоверные различия по сравнению с пробами, не содержащими изучаемые вещества

Рисунок 2. Влияние фитоэкдистерона и аскорбиновой кислоты на аутоокисление адреналина in vitro (M±m)

процесса может происходить при повышении температуры, защелачивании конечного раствора, добавлении в среду инкубации окислителей (например, K3[Fe(CN)6]) или генераторов супероксидного анион-радикала (гидроперекись-третбутила) (Сирота Т.В., 1999). При окислении кверцетина в щелочной среде, в присутствии тетраметилэтилендиамина, одним из промежуточных продуктов окисления является супероксидный анион-радикал. Усиление окисления кверцетина возможно при добавлении в среду инкубации ионов двухвалетного железа, продуцентов СЬ'", (гидроперекись-третбутила), а также при повышении температуры данной среды (Костюк В.А., 1990).

По химической структуре фитоэкдистерон не является окислителем. При изучении рН и температуры конечных растворов (после добавления фитоэкдистерона) установлено, что они остаются индифферентными. Следовательно, фитоэкдистерон потенциирует самоокисление адреналина и кверцетина, действуя как катализатор (ускоряя лимитирующую стадию данных реакций, то есть процесс образования супероксидного анион-радикала).

Влияние фитоэкдистерона на железоиндуцируемое аскорбат-зависгшое перекисное окисление липидов in vitro. Данное влияние препарата изучено в диапазоне концентраций в инкубируемой смеси от 0,35 мМ до 0,0035 мМ (табл. 3). Фитоэкдистерон достоверно дозозависимо подавлял железоиндуцируемое аскорбат-зависимое ПОЛ в примененных концентрациях при инкубации в течение 15 мин. В конечной концентрации в инкубируемом растворе 0,35 мМ фитоэкдистерон ингибировал процесс ПОЛ на 21,8% (р<0,05) через 5 мин инкубации и на 24,7% (р<0,05) - через 15 мин, при уровне 0,13 мМ - на 14,9% (р<0,05) и 9,7% (р<0,05), в концентрации 0,035 мМ - на 14,0% (р<0,05) и 7,5% (р<0,05), а при уровне 0,0035 мМ - на 10,5% (р<0,05) и 8,4% (р<0,05) в указанное время соответственно. К 30-ой мин процесса инкубации происходило истощение содержания фитоэкдистерона и антиоксидантной системы, и накопление МДА начинало повышаться: при концентрациях 0,35 мМ, 0,035 мМ и 0,0035 мМ - на 68,9% (р<0,05), 13,1% (р<0,05) и 20,1% (р<0,05) соответственно.

В качестве препарата сравнения был выбран комбинированный антиоксидант - кудесан в диапазоне доз от 400 мкл до 4 мкл. Антиоксидант кудесан в дозе, равной 400 мкл (конечная концентрация в растворе 1,86 мМ вит Е, 5,72 мМ CoQ), ускорял процессы ПОЛ, о чем свидетельствует увеличение накопления МДА на 29,1% (р<0,05) в течение первых 5 мин инкубации. В более

Влияние фитоэкдистерона и кудесана на железоиндуцируемое аскорбат-зависимое ПОЛ in vitro (M±m)

Серии 0,35 мМ экдистерон 0,13 мМ зкдистерон 0,035 мМ экдистерон 0,0035 мМ экдистерон кудесан 400 мкл кудесан 150 мкл кудесан 40 мкл кудесан 4 мкл 400 мкл буфера

%ингибирования через 5 мин 21,79 ±2,11* 14,86 ±1,23* 14,02 ±0,79* 10,47 ±1,32* -29,05 ±1,21* 29,73 ±2,30* 12,66 ±1,30* 22,97 ±5,40* 0,00 ±2,34

%ингибирования через 15 мин 24,67 ±1,78* 9,727 ±0,45* 7,47 ±1,09* 8,36 ±0,78* 69,39 ±6,80* 29,54 ±1,66* 7,29 ±0,45 -20,28 ±3,45* 0,00 ±4,58

%ингибирования через 30 мин -68,87 ±3,74* -0,26 ±0,06 -13,05 ±1,21* -20,09 ±2,24* -75,76 ±4,34* -0,68 ±0,11 -19,67 ±2,33* 17,24 ±3,45* 0,00 ±5,33

* - р<0,05 - достоверные различия по сравнению с пробами, не содержащими изучаемые вещества

Таблица 4

Влияние фитоэкдистерона и кудесана на железоиндуцируемое НАДФНг-зависимое ПОЛ in vitro (M±m)

Серии 0,35 мМ 0,13 мМ 0,035 мМ 0,0035 мМ кудесан кудесан кудесан кудесан 400 мкл

ждистерон экдистерон экдистерон экдистерон 400 мкл 150 мкл 40 мкл 4 мкл буфера

% ингибирования 31,32 11,23 3,16 3,90 85,42 50,59 6,13 4,15 0,00

через 5 мин ±3,21* ±1,11* ±0,91 ±0,36 ±6,33* ±4,98* ±0,45 ±0,77 ±6,54

%ингибирования 6,96 4,73 24,81 5,97 67,53 57,46 33,58 17,91 0,00

через 15 мин ±0,23 ±0,67 ±3,12* ±0,46 ±6,23* ±2,34* ±2,36* ±2,10* ±7,26

% ингибирования -71,14 -6,27 -28,52 19,80 -10,78 -26,84 -18,12 10,07 0,00

через 30 мин ±8,12* ±2,34 ±2,76* ±1,03* ±2,34* ±2,15* ±2,11* ±0,74* ±6,60

* - р<0,05 - достоверные различия по сравнению с пробами, не содержащими изучаемые вещества

низких дозировках, равных 150 мкл (0,7 мМ вит Е, 2,15 CoQ), 40 мкл (0,186 мМ вит Е, 0,572 мМ CoQ) и 4 мкл (0,0186 мМ вит Е, 0,0572 мМ CoQ) кудесан подавлял процессы ПОЛ, вызывая уменьшение накопления МДА через 5 мин инкубации на 29,7% (р<0,05), 12,7% (р<0,05) и 23,0% (р<0,05) соответственно. Через 15 мин протекания свободно-радикальных реакций кудесан в дозах 400 мкл и 150 мкл ингибировал их на 69,4% (р<0,05) и 29,5% (р<0,05), а в концентрации 4 мкл - ускорял на 20,3% (р<0,05). К 30-ой мин происходило окончательное истощение концентрации кудесана и антиоксидантной системы, что проявлялось усилением накопления МДА на 75,8 % (р<0,05) при концентрации кудесана 400 мкл и на 19,7% - при концентрации 40 мкл. Инкубируемый раствор, содержащий 150 мкл кудесана, через 30 мин протекания реакций не влиял на уровень прироста МДА, а содержащий 4 мкл препарата - уменьшил его на 17,2% (р<0,05).

Влияние фитоэкдистерона на железоиндуцируемое НАДФН2-зависимое перекисное окисление липидов in vitro. Данное влияние препарата изучено в диапазоне концентраций в инкубируемом растворе от 0,35 мМ до 0,0035 мМ (табл. 4). Фитоэкдистерон дифференцированно подавлял железоиндуцируемое НАДФНг-зависимое ПОЛ, что определялось его концентрацией в реакционной смеси. Через 5 мин инкубации накопление МДА уменьшилось на 31,3% (р<0,05) при концентрации фитоэкдистерона 0,35 мМ и на 11,2% (р<0,05) - при концентрации 0,13 мМ. На 15-ой мин протекания свободно-радикальных реакций уровень прироста МДА уменьшился на 24,8% (р<0,05) в растворе, содержащем 0,035 мМ фитоэкдистерона. На 30-ой мин опыта фитоэкдистерон подавлял накопление МДА в дозе 0,0035 мМ на 19,8% (р<0,05), а в концентрациях 0,35 мМ и 0,035 мМ - напротив усиливал его на 71,1% (р<0,05) и 28,5% (р<0,05) соответственно.

В качестве препарата сравнения в данной серии также использовался комбинированный антиоксидант - кудесан в диапазоне доз от 400 мкл до 4 мкл. В отличие от фитоэкдистерона, кудесан отчетливо подавлял железоиндуцируемое НАДФН2-зависимое ПОЛ в исследуемом диапазоне доз. Дозы 400 мкл (конечная концентрация в растворе 1,86 мМ вит Е, 5,72 мМ CoQ) и 150 мкл кудесана (0,7 мМ вит Е, 2,15 CoQ) подавляли процесс накопления МДА на 85,4% (р<0,05) и 50,6% (р<0,05) через 5 мин, на 67,5% (р<0,05) и 57,5% (р<0,05) - через 15 мин инкубации соответственно. В дозах 40 мкл (конечная концентрация в растворе 0,186 мМ вит Е, 0,572 мМ CoQ) и 4 мкл (конечная концентрация в растворе 0,0186 мМ вит Е, 0,0572 мМ CoQ) кудесан подавлял

процесс накопления МДА через 15 мин инкубации на 33,6% (р<0,05) и на 17,9% (р<0,05) соответственно. К 30-ой мин инкубации происходило истощение как содержания кудесана, так и антиоксидантной системы защиты, что проявлялось увеличением прироста МДА на 10,8% (р<0,05) при дозе кудесана 400 мкл, на 26,8% (р<0,05) - при дозе 150 мкл и на 18,1% (р<0,05) - при дозе 40 мкл. В то же время, в дозе 4 мкл (0,0186 мМ вит Е, 0,0572 мМ CoQ) кудесан подавлял процессы ПОЛ, вызывая уменьшение накопления МДА через 30 мин инкубации на 10,1% (р<0,05).

Установленное на моделях аскорбат- и НАДФН2-зависимого ПОЛ прямое антиоксидантное действие фитоэкдистерона связано, вероятно, с большим количеством гидроксильных групп в его молекуле (Flora J.S., 2009; Lafont R.J. et al., 2003).

Однако, по данным литературы известно, что концентрация экдистерона в плазме крови, после перорального введения в дозе 500 мг/кг массы, составляет, в среднем, 30 нг/мл (Kumpun S.J., 2011; Slama К.А. et al., 1995), что значительно меньше концентраций вещества, в которых оно способно подавлять аскорбат- и НАДФН2-зависимое железоиндуцируемое ПОЛ и активировать процесс образования супероксидного анион-радикала. Таким образом, антигипоксическое и антиишемическое действие фитоэкдистерона, скорее всего, связано с его непрямым влиянием на свободно-радикальные процессы.

Исследование антиоксидантного действия фитоэкдистерона in vivo. Полученные результаты представлены в табл. 5-7.

Введение фитоэкдистерона в течение 7 дней интактным крысам приводило к повышению активности глутатионпероксидазы на 8,3% (р<0,05) в мозге (табл. 5) и к увеличению активности каталазы на 28,6% (р<0,05) и снижению содержания МДА на 28,6% (р<0,05) в печени (табл. 7).

Экспозиция животных на высоте 8000 м в течение 30 мин сопровождалась сходными по направленности изменениями исследуемых показателей оксидантной и антиоксидантной систем в головном мозге, миокарде и печени по сравнению с показателями интактных крыс. В мозге отмечалось достоверное (р<0,05) повышение уровня МДА на 28,1%, снижение содержания свободных и белковых SH-групп на 27,3% и на 38,5% соответственно, уменьшение активности СОД на 26,4%, глутатион-S-трансферазы - на 10,5%, глутатионредуктазы - на 18,9%, глутатионпероксидазы - на 23,1% и повышение активности каталазы на 29,0% (табл. 5). В миокарде обнаруживалось достоверное (р<0,05) повышение уровня МДА на 35,2%, снижение концентрации свободных и белковых SH-групп на

36,8 и 30,9% соответственно, уменьшение активности СОД на 24,1%, каталазы

- на 33,3%, глутатион-Б-трансферазы - на 11,1%, глутатионредуктазы - на 15,3%, глутатионпероксидазы - на 19,2% (табл. 6). В печени наблюдалось достоверное (р<0,05) повышение уровня МДА на 36,7%, снижение содержания свободных и белковых БН-групп на 29,4% и на 44,3% соответственно, уменьшение активности СОД на 30,6%, каталазы - на 35,7%, глутатион-Б-трансферазы - на 8,9%, глутатионредуктазы - на 17,6%, глутатионпероксидазы

- на 25,3% (табл. 7).

Профилактическое введение фитоэкдистерона в течение 7 дней перед моделированием ОГГ, по сравнению с серией контроля гипоксии, приводило в мозге к повышению (р<0,05) содержания общих БН-групп на 62,5%, активности СОД на 31,5%, глутатион-Б-трансферазы - на 18,3% и нормализации (отсутствие достоверных различий с показателями интактных животных, р>0,05) уровня МДА, свободных БН-групп и активности глутатионредуктазы (табл. 5). В миокарде наблюдалось повышение (р<0,05) уровня свободных БН-групп на 41,7%, активности глутатионпероксидазы - на 7,6% и нормализация уровня МДА, активности СОД, каталазы, глутатион-Б-трансферазы, глутатионредуктазы (табл. 6). В печени происходило снижение уровня МДА на 20,4% (р<0,05), увеличение содержания белковых БН-групп на 45,5% (р<0,05), активности глутатион-Б-трансферазы - на 6,8%, глутатионпероксидазы - на 21,4%, каталазы - на 66,7% и нормализация содержания свободных БН-групп и активности СОД (табл. 7).

Превентивное назначение милдроната в течение 7 дней перед гипоксическим воздействием сопровождалось в мозге повышением (р<0,05) активности СОД на 33,2%, глутатион-Б-трансферазы - на 24,6%, глутатионредуктазы - на 26,2%, глутатионпероксидазы - на 23,9% по сравнению с серией животных контроля гипоксии, и нормализацией уровня МДА, концентрации свободных и белковых БН-групп (табл. 5). В миокарде отмечалось снижение уровня МДА на 34,6% (р<0,05), повышение содержания свободных БН-групп на 25,0% (р<0,05), активности глутатионпероксидазы - на 20,2% (р<0,05) и нормализация активности СОД, каталазы, глутатион-Б-трансферазы и глутатионредуктазы (табл. 6). В печени обнаруживалась нормализация уровня МДА, свободных БН-групп, активности СОД, глутатион-Б-трансферазы, глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы (табл. 7).

Следует отметить, что активность каталазы в печени у животных, профилактически получавших фитоэкдистерон перед ОГГ, превышала данный

Влияние фитоэкдистерона и милдроната на состояние антиоксидантной системы мозга крыс (М±ш)

Показатель Серии экспериментов

Интактные животные, п=7 Контроль гипоксии, п=7 Фитоэкдистерон 7 дней, п=7 Фитоэкдистерон 7 дней перед гипоксией, п=7 Милдронат 7 дней перед гипоксией, п=7

МДА, нмоль/мг ткани 13,3±1,05 17,1+1,10* 12,6±0,87 15,3±0,75 16,1±0,95

5Н-группы свободные, мкмоль/ мг ткани 0,11+0,008 0,08±0,004* 0,10±0,006 0,09±0,006 0,09 ±0,005

БН-группы общие, мкмоль/мг ткани 0,39±0,025 0,24±0,019* 0,44±Ю,039 0,39±0,030** 0,30±0,026

Активность СОД, МЕУмг ткани 4,0±0,27 2,9±0,20* 3,8±0,31 3,9±0,29** 3,9±0,23**

Активность каталазы, МЕ/мг ткани 1,2+0,07 1,6±0,08* 1,3±0,06 1,7±0,09* 1,6±0,11*

Активность глутатион-8-трансферазы, нмоль ХДНБ/минхмг ткани 112,2±3,50 100,4+2,50* 115,8+3,80 118,8+3,90** 125,1+4,50**

Активность глутатионредуктазы, нмоль НАДФН/минхмг ткани 24,9±1,11 20,2±0,95* 23,6±0,78 22,3±1,23 25,5±1,25**

Активность глутатионпероксидазы, нмоль НАДФН/минхмг ткани 8,5+0,32 6,5+0,15* 9,2±0,21* 7,1±0,38* 8,1±0,41**

* - р<0,05 - достоверные различия по сравнению с показателями интактных крыс, ** - р<0,05 - достоверные различия по сравнению с показателями контроля гипоксии

Влияние фитоэкдистерона и миддроната на состояние антиоксидантной системы миокарда крыс (М±ш)

Показатель Серии экспериментов

Интактные животные, п=7 Контроль гипоксии, п=7 Фитоэкдистерон 7 дней, п=7 Фитоэкдистерон 7 дней перед гипоксией, п=7 Милдронат 7 дней перед гипоксией, п=7

МДА, нмоль/мг ткани 2,5±0,15 3,4±0,25* 2,8+0,18 2,9±0,20 2,2±0,15

БН-группы свободные, мкмоль/ мг ткани 0,19+0,013 0,12±0,008* 0Д8±0,009 0,17+0,010** 0,15±0,009*,**

БН-группы общие, мкмоль/мг ткани 0,68±0,048 0,47±0,041* 0,65±0,053 0,51 ±0,032* 0,50±0,045*

Активность СОД, МЕ/мг ткани 3,4±0,15 2,6±0,12* 3,1±0,24 3,2±0,25 3,1±0,22

Активность каталазы, МЕ/мг ткани 5,4+0,32 3,6±0,20* 5,0±0,38 4,6±0,26 4,4±0,30

Активность глутатион-Б-трансферазы, нмоль ХДНБ/минхмг ткани 53,3+1,90 47,4+1,20* 55,2+2,70 48,1+2,10 49,7+2,20

Активность глутатионредуктазы, нмоль НАДФН/минхмг ткани 22,9+0,80 19,4+0,65* 21,0+0,90 20,9± 1,20 21,5+1,15

Активность глутатионпероксидазы, нмоль НАДФН/минхмг ткани 21,3+0,86 17,2±0,83* 20,5± 1,07 18,5±0,87** 20,7±1,35**

* - р<0,05 - достоверные различия по сравнению с показателями интактных крыс, ** - р<0,05 - достоверные различия по сравнению с показателями контроля гипоксии, *** - р<0,05 - достоверные различия между исследуемыми препаратами

Влияние фитоэкдистерона и милдроната на состояние антиоксидантной системы печени крыс (М±ш)

Показатель Серии экспериментов

Интактные животные, п=7 Контроль гипоксии, п=7 Фитоэкдистерон 7 дней, п=7 Фитоэкдистерон 7 дней перед гипоксией, п=7 Милдронат 7 дней перед гипоксией, п=7

МДА, нмоль/мг ткани 2,83+0,18 3,87±0,29* 2,02±0,12* 3,08+0,21 ** 3,26±0,25

БН-группы свободные, мкмоль/ мг ткани 0,17±0,011 0,12±0,008* 0,15±0,009 0,14±0,007 0,14+0,0097

БН-группы общие, мкмоль/мг ткани 0,79±0,045 0,44+0,033* 0,83±0,056 0,64±0,043** 0,59±0,038*

Активность СОД, МЕ/мг ткани 2,9±0,17 2,1+0,10* 2,8±0,14 2,6±0,09 2,43±0,17

Активность каталазы, МЕ/мг ткани 5,6±0,40 3,6±0,24* 7,2+0,50* 6,0±0,30** 4,0±0,28*,***

Активность глутатион-8-трансферазы, нмоль ХДНБ/минхмг ткани 140,7±2,60 128,1±2,30* 138,4±2,70 136,8±2,10** 133,36±2,9

Активность глутатионредуктазы, нмоль НАДФН/минхмг ткани 52,3±1,96 43,1+1,50* 48,9± 1,77 45,7±1,43* 47,67+1,65

Активность глутатионпероксидазы, нмоль НАДФН/минхмг ткани 22,5+1,35 16,8+0,75* 21,9+1,15 20,4±0,85** 18,87±1,1

* - р<0,05 - достоверные различия по сравнению с показателями интактных крыс, ** - р<0,05 - достоверные различия по сравнению с показателями контроля гипоксии, *** - р<0,05 - достоверные различия между исследуемыми препаратами

показатель у животных, превентивно получавших милдронат, на 33,3% (р<0,05).

Профилактическое введение фитоэкдистерона в течение 7 дней перед воздействием ОГГ предотвращало развитие окислительного стресса во всех исследуемых органах (мозге, миокарде и печени), за счет стимулирования разных звеньев антиоксидантной системы. Подобное действие фитоэкдистерона можно рассматривать как проявление его адаптогенной активности, то есть способности оптимизировать в разных органах наиболее важные для их жизнедеятельности компоненты антиоксидантной системы защиты (Зарубина И.В. и соавт., 2004; Яременко К.В., 2007).

Влияние фитоэкдистерона на общую активность катепсина D при острой гипоксии. При моделировании ОГГ средней тяжести наблюдалось повышение общей активности лизосомального фермента катепсина D в головном мозге крыс на 40,6% (р<0,05), в миокарде - на 44,4% (р<0,05). В печени активность катепсина D достоверно не изменялась (р>0,05) (табл. 8). Установлено, что повышение активности катепсина D вызывает дальнейшее повреждение клеток по типу некроза или апоптоза (Пупышев А.Б., 2011).

Таблица 8

Влияние фитоэкдистерона и милдроната на общую активность катепсина Б нмоль тирозина/мг белка в мин в головном мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести (М±т)_

Серии экспериментов Мозг, п=7 Миокард, п=7 Печень, п=7

Интактные крысы 2,29±0,179 1,62±0,115 3,48±0,245

Гипоксия (контроль) 3,22±0,253* 2,34±0,194* 4,20+0,337

Гипоксия на фоне введения фитоэкдистерона 2,29±0,170** 1,66±0,116** 3,72±0,271

Гипоксия на фоне введения милдроната 2,67±0,189 1,90±0,119** 3,86±0,288

* - р<0,05 - достоверные различия по сравнению с показателями интактных крыс,

** - р<0,05 - достоверные различия с показателями контроля гипоксии, *** - р<0,05 - достоверные различия между исследуемыми препаратами

Профилактическое пероральное введение фитоэкдистерона в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней перед гипоксическим воздействием приводило к снижению общей активности катепсина Б в мозге на 28,9% (р<0,05), в миокарде - на 29,1% (р<0,05) по сравнению с показателями серии контроля

гипоксии. При этом активность катепсина D во всех исследуемых органах достоверно не отличалась от значений у интактных животных.

Профилактическое введение милдроната в дозе 250 мг/кг массы в течение 7 дней перед моделированием ОГГ сопровождалось снижением общей активности катепсина D в миокарде на 27,2% (р<0,05) по сравнению с контролем гипоксии, и нормализацией (отсутствие достоверных различий с показателями интактных животных, р>0,05) данного показателя в головном мозге.

Таким образом, в настоящем исследовании установлено, что водная вытяжка из смолевки поникшей (Silene nutans) и смолевки татарской (Silene tatarica), содержащая 0,1% фитоэкдистерона, обладает выраженным антигипоксическим и антиишемическим эффектом. Данное действие может быть обусловлено способностью изучаемого вещества стимулировать активность антиоксидантных ферментов и снижать общую активность лизосомального фермента катепсина D и не связано с его прямым антиоксидантным эффектом.

ВЫВОДЫ

1. Курсовое пероральное ежедневное введение фитоэкдистерона, выделенного из смолёвки поникшей (Silene nutans) и смолёвки татарской (Silene tatarica), в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 и 14 дней приводит к повышению резистентности белых крыс к тяжелой острой гипоксической гипоксии.

2. Профилактическое пероральное ежедневное введение крысам фитоэкдистерона в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней повышает устойчивость кардиомиоцитов к тотальной ишемии.

3. В опытах in vitro в диапазоне концентраций 0,35-0,0035 мМ фитоэкдистерон дозозависимо ингибирует железоиндуцируемое аскорбат- и НАДФН2-зависимое перекисное окисление липидов в гомогенатах мозга крыс, а в высоких концентрациях (1,3 - 0,035 мМ) активирует образование супероксидного анион-радикала в модельных системах аутоокисления адреналина и кверцетина. По способности подавлять железоиндуцируемое аскорбат-зависимое перекисное окисление липидов фитоэкдистерон сопоставим с антиоксидантом кудесаном, а по влиянию на железоиндуцируемое НАДФН2-зависимое перекисное окисление липидов уступает ему.

4. Ежедневное назначение интактным крысам фитоэкдистерона per os в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней вызывает увеличение активности глутатионпероксидазы в мозге, повышение активности каталазы и уменьшение содержания малонового диальдегида в печени.

5. Развитие острой гипоксической гипоксии сопровождается активацией процессов перекисного окисления липидов в мозге, миокарде и печени крыс и повышением активности катепсина D в мозге и миокарде.

6. Профилактическое пероральное введение фитоэкдистерона в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней до воздействия гипоксической гипоксии средней тяжести приводит к органоспецифическому снижению выраженности окислительного стресса, которое характеризуется уменьшением концентрации малонового диальдегида, увеличением уровня сульфгидрильных групп и активности антиоксидантных ферментов в головном мозге, миокарде и печени и вызывает снижение общей активности катепсина D в головном мозге и миокарде.

7. По антигипоксическому, антиишемическому, антиоксидантному действию и по влиянию на общую активность катепсина D в опытах in vivo фитоэкдистерон сопоставим с препаратом метаболического действия -милдронатом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные результаты позволяют рекомендовать фитоэкдистерон для дальнейшего изучения в доклинических исследованиях, а также в клинической практике в целях комплексной терапии гипоксических состояний, ишемии миокарда, патологий, сопровождающихся развитием окислительного стресса и повышением активности лизосомальных протеиназ.

2. Наличие у фитоэкдистерона способности катализировать реакции образования супероксидного анион-радикала позволит создавать на его основе новые модельные системы для изучения антисупероксидной активности лекарственных препаратов in vitro.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Щулькин A.B. Изучение антигипоксического и антиишемического эффектов фитоэкдистерона / A.B. Щулькин, В.В. Давыдов, E.H. Якушева, В.Н. Дармограй, А.Г. Краснолобов // Рос. медико-биол. вестн. им. акад. И.П. Павлова. - 2011. - N3. - С. 30-36.

2. Щулькин A.B. Исследование прямой антиоксидантной активности фитоэкдистерона in vitro / A.B. Щулькин, E.H. Якушева, B.B. Давыдов, В.Н. Дармограй // Рос. медико-биол. вести, им. акад. И.П. Павлова.- 2012. - N1. - С. 51-57.

3. Щулькин A.B. Современные представления о фармакодинамике экдистероидов / A.B. Щулькин, E.H. Якушева, В.В. Давыдов, В.Н. Дармограй // Рос. медико-биол. вестн. им. акад. И.П. Павлова. - 2012. - N4. - С. 167-172.

4. Краснолобов А.Г. Состояние сократительных кардиомиоцитов в условиях острой тотальной ишемии сердца на фоне введения милдроната / А.Г. Краснолобов, A.B. Щулькин // Актуальные проблемы клинической и экспериментальной патологии: тематический сб. науч. тр., посвященный 100-летию со дня рождения Г. Селье. - Рязань: РязГМУ, 2007. - С. 98-100.

5. Щулькин A.B. Изучение антиоксидантной активности фитоэкдистерона in vitro / A.B. Щулькин // Материалы IV Междунар. науч. конф. молодых ученых медиков. - Курск: ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, 2010. -Т. 1,- С. 432-435.

6. Щулькин A.B. Особенности антиоксидантной системы у крыс с разной устойчивостью к гипоксии / A.B. Щулькин, В.В. Давыдов, E.H. Якушева // Тез. Шестой Междунар. крымской конф. «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии». - М.: ФГУ «РКНПК Росздрава», 2010. - С. 56.

7. Щулькин A.B. Влияние фитоэкдистерона на состояние антиоксидантной системы мозга нелинейных белых крыс при острой гипоксической гипобарической гипоксии / A.B. Щулькин // Тез. итоговой Всерос. науч. конф. молодых ученых исследователей с Междунар. участием «Татьянин день». Конкурс Первого МГМУ им. И.М. Сеченова на лучшую научную работу студентов 2010 г. - М., 2011. - С. 410-411.

8. Щулькин A.B. Влияние фитоэкдистерона на состояние антиоксидантной системы печени нелинейных белых крыс при острой гипоксической гипобарической гипоксии / A.B. Щулькин // Фундаментальная наука и клиническая медицина - Человек и его здоровье: тез. XIV Всерос. медико-биол. конф. молодых исследователей (с Междунар. участием). - СПб.: Изд-во СПбГУ, 2011. - С. 316-317.

9. Щулькин A.B. Изучение адаптогенной активности экдистерона / A.B. Щулькин // Тез. докл. II регионального итогового конкурса «УМНИК» -

10. Щулькин A.B. Антиоксидантная активность фитоэкдистерона в опытах in vitro и in vivo / A.B. Щулькин // Тез. XVIII межгородской конф. молодых ученых. - СПб.: Изд-во СПбГМУ, 2012. - С. 148-149.

11. Щулькин A.B. Изучение антигипоксического и антиишемического действия фитоэкдистерона / A.B. Щулькин // Материалы III Междунар. (X итоговой) науч.-практ. конф. молодых ученых. - Челябинск: Изд-во «Челябинская государственная медицинская академия», 2012. - С. 399-401.

12. Щулькин A.B. Изучение метаболической и антиоксидантной активности фитоэкдистерона в эксперименте / A.B. Щулькин, В.В. Давыдов, E.H. Якушева, В.Н. Дармограй // Актуальные вопросы медицинской биохимии: сб. науч. тр. по материалам Всерос. науч.-практ. конф. «Биохимические научные чтения памяти академика РАН Е.А. Строева». - Рязань: РИО РязГМУ, 2012.-С. 137-140.

13. Щулькин A.B. Исследование антиоксидантной активности фитоэкдистерона в опытах in vitro и in vivo / A.B. Щулькин // Материалы IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». - М.: Фолиум, 2012.-С. 203.

Научное издание

ЩУЛЬКИН Алексей Владимирович

АНТИГИПОКСИЧЕСКОЕ И АНТИИШЕМИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ФИТОЭКДИСТЕРОНА И МЕХАНИЗМЫ ЕГО РАЗВИТИЯ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология 14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Печатается на коммерческой основе за счет средств автора (Договор №18).

Сдано в печать 22.12.2012. Бумага писчая. Гарнитура Times. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,75. Тираж 100 экз. Заказ № 3352.

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации 390026, г. Рязань, ул. Высоковольтная, 9

Отпечатано в редакционно-издательском отделе ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России 390026, г. Рязань, ул. Т. Шевченко, 34

2

2.2. Схема эксперимента.49

2.3. Моделирование острой гипоксической гипоксии.52

2.4. Исследование морфологических изменений при тотальной ишемии миокарда.53

2.5. Модельные системы для изучения антиоксидантной активности in vitro.54

2.6. Биохимические методы исследования.58

2.7. Методы статистического анализа полученных результатов.65

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.67

3.1. Влияние фитоэкдистерона на резистентность крыс к тяжелой острой гипоксической гипоксии.67

3.2. Влияние фитоэкдистерона на морфологические изменения в миокарде при тотальной ишемии.71

3.3. Исследование прямой антиоксидантной активности фитоэкдистерона in vitro.77

3.3.1. Влияние фитоэкдистерона на аутоокисление кверцетина и адреналина in vitro.77

3.3.2. Влияние фитоэкдистерона на железоиндуцируемое аскорбат-зависимое ПОЛ.80

3.3.3. Влияние фитоэкдистерона на железоиндуцируемое НАДФН2-зависимое ПОЛ.83

3.4. Исследование антиоксидантной активности фитоэкдистерона in vivo.86

3.4.1. Влияние фитоэкдистерона на концентрацию МДА в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.86

3.4.2. Влияние фитоэкдистерона на уровень безбелковых SH-групп в мозге, миокарде и печени крыс при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.87

3.4.3. Влияние фитоэкдистерона на уровень белковых 8Н-групп в мозге, миокарде и печени крыс при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.89

3.4.4. Влияние фитоэкдистерона на общую емкость антиокси-дантной системы в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.91

3.4.5. Влияние фитоэкдистерона на активность супероксид-дисмутазы в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.98

3.4.6. Влияние фитоэкдистерона на активность каталазы в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.100

3.4.7. Влияние фитоэкдистерона на активность глутатион-Б-трансферазы в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.102

3.4.8. Влияние фитоэкдистерона на активность глутатион-редуктазы в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.103

3.4.9. Влияние фитоэкдистерона на активность глутатион-пероксидазы в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.105

3.5. Влияние фитоэкдистерона на общую активность катепсина О в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.107

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.109

ВЫВОДЫ.119

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.121

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.122

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДФ — аденозиндифосфат АМФ — аденозинмонофосфат АОС — антиоксидантная система АТФ — аденозинтрифосфат АФК — активные формы кислорода Вит Е — витамин Е

ГАМК - гамма-аминомасляная кислота

ГПТБ — гидроперекись третбутила

ДАТ - диацилглицерол

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ИЛ-3 — интерлейкин 3

ИФЗ -инозитол-1,4,5-трифосфат

МД - милдронат

M ДА - малоновый диальдегид мРНК — матричная рибонуклеиновая кислота

НАД - никотинамид-аденин-динуклеотид

НАДН2 — никотинамид-аденин-динуклеотид восстановленный

НАДФ — никотинамид-аденин-динуклеотид фосфат

НАДФН2 - никотинамид-аденин-динуклеотид фосфат восстановленный

ОГГ - острая гипоксическая гипоксия

ПОЛ - перекисное окисление липидов

CoQ - коэнзинм Qio

СОД - супероксиддисмутаза

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ТМЭД — тетраметилэтилендиамин

ФИФ2 — фосфатидилинозитол-дифосфат

ФИФЗ — фосфатидилинозитол-трифосфат

ФЭ — фитоэкдистерон

ХДНБ - хлординитробензол цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

Akt - протеинкиназа В

DTNB — 5,5-дитиобис(2-нитробензоат)

G-per - глутатионпероксидаза

G-red - глутатионредуктаза

GSH - глутатион восстановленный

GSSG - глутатион окисленный

G-tr — глутатион-Б-трансфераза

HIF - фактор, индуцируемый гипоксией

М - среднее арифметическое значение m - стандартная ошибка среднего арифметического значения SH-группы - сульфгидрильные группы

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Экдистероиды - это липофильные полигидроксилированные стероиды, участвующие в жизнедеятельности большинства живых организмов. Они обнаружены во всех главных типах высших растений: папоротникообразных, голосеменных и покрытосеменных (фитоэкдистероиды); грибах (микоэкдистероиды); организме насекомых, ракообразных, нематод (зооэкдистероиды) [ 183, 231 ].

Химический синтез экдистероидов - осуществим, но весьма дорог, поэтому главным источником их промышленного получения являются растения. Основными экдистероидсодержащими растениями принято считать: Якаропйсит саПкато1йе8 (левзея сафлоровидная, рапонтикум или маралий корень), БеггШиШ согопШа Ь. (серпуха венценосная), БИепе (смолевки) и некоторые другие. Однако, биологическая активность проявляется у незначительной части видов, что скорее всего связано с присутствием в растениях большого числа слабоактивных или неактивных фитоэкдистероидов [231].

Являясь у насекомых гормонами линьки, у млекопитающих экдистероиды выполняют регуляторные функции и оказывают разнообразные биологические эффекты [183, 107]. Выделяют следующие основные виды действия: анаболическое [220], актопротекторное [141], иммуномодулирующее [141], антигипергликемическое [141, 143], нейропротекторное [152], кардиопротекторное [143] и ряд других.

Установлено, что свое действие в организме насекомых экдистероиды реализуют через специфические рецепторы, являющиеся членами ядерного суперсемейства рецепторов [186]. Их структура сходна со структурой других рецепторов стероидных гормонов (глюкокортикостероидов, половых гормонов, витамина Б3 иретиноидов) [153].

В организме млекопитающих экдистероидные рецепторы до сих пор не найдены, и механизмы реализации их эффектов окончательно не 7 установлены [183]. Предполагается, что они могут встраиваться в липидный мембранный бислой, изменяя структуры окружающих белков [246], регулировать функционирование системы вторичных посредников [183, 220] и модулировать активность рецепторов [215].

Гипоксия - типовой патологический процесс, лежащий в основе патогенеза большинства заболеваний [90, 234]. Тяжесть течения и исход многих из них в конечном итоге определяются особенностями вторичных неспецифических метаболических расстройств, степенью дестабилизации клеточных мембран, а также возможностями реактивации структурных и ферментных белков в условиях гипоксии [113]. Поэтому в лекарственную терапию разнообразных заболеваний, сопровождающихся развитием гипоксии, входят антигипоксанты — вещества, повышающие адаптацию и резистентность организма к недостатку кислорода. Влияние экдистероидов на устойчивость организма к гипобарической гипоксической гипоксии в доступной научной литературе нами обнаружено не было.

В то же время, исследования, проведенные в 60-80-х гг. XX века показали, что в патогенезе наиболее распространенных заболеваний человека (патология сердечно-сосудистой, дыхательной, эндокринной систем, злокачественные новообразования) важную роль играют активные формы кислорода (АФК) [234]. Последние являются инициаторами реакций свободно-радикального окисления, которые, в свою очередь, вызывают окислительную модификацию липидов, белков, нуклеиновых кислот, что, в ходе развития патологического процесса, может приводить к гибели клетки по апоптотическому или некротическому механизмам [96]. Кроме того, было обосновано представление об общебиологической роли АФК, определенное количество которых образуется нейрохимическими и биоэнергетическими системами клетки в нормальных условиях, играя существенную роль в различных сторонах ее жизнедеятельности [6].

В последнее время активно изучается состояние лизосом и активность лизосомальных гидролаз при различных патогенных воздействиях [93]. Это 8 связано с тем, что была установлена важная роль лизосомальных ферментов в развитии не только некроза, но и апоптоза, опухолевого метастазирования и клеточной дифференцировки [179,191].

Таким образом, выявление у экдистероидов способности повышать резистентность организма к гипоксии, воздействовать на развитие свободно-радикальных реакций и снижать активность лизосомальных протеиназ может лежать в основе их биологической и фармакологической активности, а также последующего клинического применения.

Цель исследования

Изучить антигипоксическое и антиишемическое действие фитоэкдистерона, его влияние на развитие свободно-радикальных реакций и активность катепсина D в опытах in vitro и in vivo.

Задачи исследования

1. Изучить влияние фитоэкдистерона на резистентность беспородных белых крыс к тяжелой острой гипоксической гипоксии.

2. Исследовать действие фитоэкдистерона на морфологические изменения миокарда животных в условиях его острой тотальной ишемии.

3. Оценить прямую антиоксидантную активность фитоэкдистерона in vitro в сравнительном аспекте.

4. Изучить влияние фитоэкдистерона на выраженность окислительного стресса и состояние антиоксидантной системы при острой гипоксической гипоксии средней тяжести в головном мозге, миокарде и печени крыс.

5. Исследовать воздействие фитоэкдистерона на общую активность катепсина D при острой гипоксической гипоксии средней тяжести в головном мозге, миокарде и печени крыс.

6. Сравнить антигипоксическое, антиишемическое и антиоксидантное действие фитоэкдистерона и милдроната и их влияние на активность катепсина D.

Положения, выносимые на защиту

•Курсовое пероральное ежедневное введение фитоэкдистерона, выделенного из смолёвки поникшей {Silene nutans) и смолёвки татарской (Silene tatarica), в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней приводит к повышению резистентности белых крыс к тяжелой острой гипоксической гипоксии и повышает устойчивость кардиомиоцитов к тотальной ишемии.

•Фитоэкдистерон в опытах in vitro дозозависимо ингибирует железоиндуцируемое аскорбат- и НАДФН2-зависимое перекисное окисление липидов в гомогенатах мозга крыс.

•Профилактическое пероральное введение фитоэкдистерона в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней до воздействия гипоксической гипоксии средней тяжести приводит к снижению выраженности органных проявлений окислительного стресса в головном мозге, миокарде и печени крыс и уменьшению общей активности катепсина D в головном мозге и миокарде.

•По антигипоксическому, антиишемическому, антиоксидантному действию и по влиянию на общую активность катепсина D фитоэкдистерон сопоставим с препаратом метаболического действия - милдронатом.

Научная новизна

В работе впервые:

•установлена антигипоксическая активность фитоэкдистерона на модели тяжелой острой гипоксической гипоксии;

•выявлено антиишемическое и кардиопротекторное действие фитоэкдистерона при тотальной ишемии миокарда;

•установлена способность фитоэкдистерона ингибировать аскорбат- и НАДФНг-зависимое перекисное окисление липидов и стимулировать, в высоких концентрациях, генерацию супероксидного анион-радикала in vitro;

•выявлено, что применение фитоэкдистерона у крыс приводит к органоспецифическому снижению выраженности окислительного стресса в головном мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести;

•установлена способность фитоэкдистерона снижать общую активность лизосомального фермента катепсина D в головном мозге и миокарде крыс при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.

Практическая значимость работы

Антигипоксическое, антиишемическое, антиоксидантное действие фитоэкдистерона, выделенного из смолёвки поникшей {Silene nutans) и смолёвки татарской {Silene tatarica), и его способность снижать общую активность лизосомального фермента катепсина D по выраженности сопоставимы с эффектами милдроната.

В работе продемонстрирована относительная безопасность изученного вещества по его влиянию на биохимические показатели, характеризующие состояние оксидантной и антиоксидантной систем головного мозга, миокарда и печени интактных белых крыс.

Полученные результаты позволяют рекомендовать фитоэкдистерон для дальнейшего изучения в доклинических исследованиях, а также клинической практике в целях комплексной терапии гипоксических состояний и патологий, сопровождающихся развитием окислительного стресса и активацией лизосомальных протеиназ.

Внедрение результатов в практику

Основные положения работы используются в учебном процессе при обучении студентов, клинических интернов и ординаторов на кафедре

11 фармакологии с курсом фармации и фармакотерапии ФДПО, патофизиологии, фармакогнозии с курсом ботаники ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России.

Личное участие автора

выводы

1. Курсовое пероральное ежедневное введение фитоэкдистерона, выделенного из смолёвки поникшей (<Silene nutans) и смолёвки татарской (iSilene tatarica), в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 и 14 дней приводит к повышению резистентности белых крыс к тяжелой острой гипоксической гипоксии.

2. Профилактическое пероральное ежедневное введение крысам фитоэкдистерона в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней повышает устойчивость кардиомиоцитов к тотальной ишемии.

3. В опытах in vitro в диапазоне концентраций 0,35-0,0035 мМ фитоэкдистерон дозозависимо ингибирует железоиндуцируемое аскорбат- и НАДФНг-зависимое перекисное окисление липидов в гомогенатах мозга крыс, а в высоких концентрациях (1,3 - 0,035 мМ) активирует образование супероксидного анион-радикала в модельных системах аутоокисления адреналина и кверцетина. По способности подавлять железоиндуцируемое аскорбат-зависимое перекисное окисление липидов фитоэкдистерон сопоставим с антиоксидантом кудесаном, а по влиянию на железоиндуцируемое НАДФН2-зависимое перекисное окисление липидов уступает ему.

4. Ежедневное назначение интактным крысам фитоэкдистерона per os в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней вызывает увеличение активности глутатионпероксидазы в мозге, повышение активности каталазы и уменьшение содержания малонового диальдегида в печени.

5. Развитие острой гипоксической гипоксии сопровождается активацией процессов перекисного окисления липидов в мозге, миокарде и печени крыс и повышением активности катепсина D в мозге и миокарде.

6. Профилактическое пероральное введение фитоэкдистерона в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней до воздействия гипоксической гипоксии средней тяжести приводит к органоспецифическому снижению выраженности окислительного стресса, которое характеризуется уменьшением концентрации малонового диальдегида, увеличением уровня сульфгидрильных групп и активности антиоксидантных ферментов в головном мозге, миокарде и печени и вызывает снижение общей активности катепсина D в головном мозге и миокарде.

7. По антигипоксическому, антиишемическому, антиоксидантному действию и по влиянию на общую активность катепсина D в опытах in vivo фитоэкдистерон сопоставим с препаратом метаболического действия -милдронатом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные результаты позволяют рекомендовать фнтоэкдистерон для дальнейшего изучения в доклинических исследованиях, а также в клинической практике в целях комплексной терапии гипоксических состояний, ишемии миокарда, патологий, сопровождающихся развитием окислительного стресса и повышением активности лизосомальных протеиназ.

2. Наличие у фитоэкдистерона способности катализировать реакции образования супероксидного анион-радикала позволит создавать на его основе новые модельные системы для изучения антисупероксидной активности лекарственных препаратов in vitro.