Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:АНТИГИПОКСИЧЕСКОЕ И АНТИИШЕМИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ФИТОЭКДИСТЕРОНА И МЕХАНИЗМЫ ЕГО РАЗВИТИЯ

ДИССЕРТАЦИЯ
АНТИГИПОКСИЧЕСКОЕ И АНТИИШЕМИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ФИТОЭКДИСТЕРОНА И МЕХАНИЗМЫ ЕГО РАЗВИТИЯ - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
АНТИГИПОКСИЧЕСКОЕ И АНТИИШЕМИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ФИТОЭКДИСТЕРОНА И МЕХАНИЗМЫ ЕГО РАЗВИТИЯ - тема автореферата по медицине
Щулькин, Алексей Владимирович Санкт-Петербург 2013 г.
Ученая степень
кандидата медицинских наук
ВАК РФ
14.03.06
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему АНТИГИПОКСИЧЕСКОЕ И АНТИИШЕМИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ФИТОЭКДИСТЕРОНА И МЕХАНИЗМЫ ЕГО РАЗВИТИЯ

На правах рукописи

005049729

ЩУЛЬКИН Алексей Владимирович

АНТИГИПОКСИЧЕСКОЕ И АНТИИШЕМИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ФИТОЭКДИСТЕРОНА И МЕХАНИЗМЫ ЕГО РАЗВИТИЯ

14.03.06- фармакология, клиническая фармакология 14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

* фев т

Санкт-Петербург 2012

005049729

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук Якушева Елена Николаевна

доктор медицинских наук профессор Давыдов Виктор Викторович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Дьячук Георгий Иванович, ГБОУ ВПО «СЗГМУ им. И.И. Мечникова» Минздрава России, кафедра фармакологии, заведующий

доктор медицинских наук профессор Дергунов Анатолий Владимирович, ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ, кафедра патофизиологии, профессор

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов»

Защита диссертации состоится « <2» О 2 . "З^ЛЗ в 13 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.07 при ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ по адресу: 194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, дом 6

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ

Автореферат разослан « ( 2012 г.

Ученый секретарь совета

доктор медицинских наук профессор Богомолов Борис Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Экдистероиды - это липофильные полигидроксилированные стероиды, участвующие в жизнедеятельности большинства живых организмов. Они обнаружены во всех главных типах высших растений: папоротникообразных, голосеменных и покрытосеменных (фитоэкдистероиды); грибах (микоэкдистероиды); организме насекомых, ракообразных, нематод (зооэкдистероиды) (Volodin V.V. et al., 2002; Lafont R.J. et al., 2003).

Являясь у насекомых гормонами линьки, у млекопитающих экдистероиды выполняют регуляторные функции и оказывают разнообразные биологические эффекты (Сыров В.Н., 1994; Lafont R.J. et al., 2003). Выделяют следующие основные виды действия: анаболическое (Сыров В.Н. и соавт., 2012; Raskin I.A., 2009), актопротекторное (Dinan L.N, 2009), иммуномодулирующее (Dinan L.N., 2009), антигипергликемическое (Cahlíková L.L. et al., 2011; Dinan L.N., 2009;), нейропротекторное (Luo C.W. et al., 2011), кардиопротекторное (Cahlíková L.L. et al., 2011) и ряд других.

Установлено, что свое действие в организме насекомых экдистероиды реализуют через специфические рецепторы, являющиеся членами ядерного суперсемейства рецепторов (Henrich V.C., 2012). Их структура сходна со структурой других рецепторов стероидных гормонов (глюкокортикостероидов, половых гормонов, витамина D3 и ретиноидов) (Evans R.M., 1988).

В организме млекопитающих экдистероидные рецепторы до сих пор не найдены, и механизмы реализации их эффектов окончательно не установлены (Lafont R.J. et al., 2003). Предполагается, что они могут встраиваться в липидный мембранный бислой, изменяя структуры окружающих белков (Tuganova A.V., 1996), регулировать функционирование системы вторичных посредников (Lafont R.J. et al., 2003; Raskin I.A., 2009) и модулировать активность рецепторов (Tsujiyama S.W. et al., 1995).

Гипоксия - типовой патологический процесс, лежащий в основе патогенеза большинства заболеваний (Черешнев В.А. и соавт., 2009; Semenza G.L., 2011). Тяжесть течения и исход многих из них в конечном итоге определяются особенностями вторичных неспецифических метаболических расстройств, степенью дестабилизации клеточных мембран, а также возможностями реактивации структурных и ферментных белков в условиях гипоксии (Чеснокова Н.П. и соавт., 2006). Поэтому в лекарственную терапию разнообразных заболеваний, сопровождающихся развитием гипоксии, входят антигипоксанты - вещества, повышающие адаптацию и резистентность

организма к недостатку кислорода. Влияние экдистероидов на устойчивость организма к гипоксической гипоксии в доступной научной литературе нами обнаружено не было.

В то же время, исследования, проведенные в 60-80-х гг. XX века показали, что в патогенезе наиболее распространенных заболеваний человека (патология сердечно-сосудистой, дыхательной, эндокринной систем, злокачественные новообразования и др.) важную роль играют активные формы кислорода (АФК) (Semenza G.L., 2011). Последние являются инициаторами реакций свободно-радикального окисления, которые, в свою очередь, вызывают окислительную модификацию липидов, белков, нуклеиновых кислот, что, в ходе развития патологического процесса, может приводить к гибели клетки по апоптотическому или некротическому механизмам (Губский Ю.И. и соавт., 2008). Кроме того, было обосновано представление об общебиологической роли АФК, определенное количество которых образуется нейрохимическими и биоэнергетическими системами клетки в нормальных условиях, играя существенную роль в различных сторонах ее жизнедеятельности (Беленичев И.Ф. и соавт., 2004).

В последнее время активно изучается состояние лизосом и активность лизосомальных гидролаз при различных патогенных воздействиях (Пупышев А.Б., 2011). Это связано с тем, что была установлена важная роль лизосомальных ферментов в развитии не только некроза, но и апоптоза, опухолевого метастазирования и клеточной дифференцировки (Sheikh A.M. et al., 2010).

Таким образом, выявление у экдистероидов способности повышать резистентность организма к гипоксии, воздействовать на развитие свободно-радикальных реакций и снижать активность лизосомальных протеиназ может лежать в основе их биологической и фармакологической активности, а также последующего клинического применения.

Цель исследования

Изучить антигипоксическое и антиишемическое действие фитоэкдистерона, его влияние на развитие свободно-радикальных реакций и активность катепсина D в опытах in vitro и in vivo.

Задачи исследования

1. Изучить влияние фитоэкдистерона на резистентность беспородных белых крыс к тяжелой острой гипоксической гипоксии.

2. Исследовать действие фитоэкдистерона на морфологические изменения миокарда животных в условиях его острой тотальной ишемии.

3. Оценить прямую антиоксидантную активность фитоэкдистерона in vitro в сравнительном аспекте.

4. Изучить влияние фитоэкдистерона на выраженность окислительного стресса и состояние антиоксидантной системы при острой гипоксической гипоксии средней тяжести в головном мозге, миокарде и печени крыс.

5. Исследовать воздействие фитоэкдистерона на общую активность катепсина D при острой гипоксической гипоксии средней тяжести в головном мозге, миокарде и печени крыс.

6. Сравнить антигипоксическое, антиишемическое и антиоксидантное действие фитоэкдистерона и милдроната и их влияние на активность катепсина D.

Научная новизна

В работе впервые:

•установлена антигипоксическая активность фитоэкдистерона на модели тяжелой острой гипоксической гипоксии;

•выявлено антиишемическое и кардиопротекторное действие фитоэкдистерона при тотальной ишемии миокарда;

•установлена способность фитоэкдистерона ингибировать аскорбат- и НАДФН2-зависимое перекисное окисление липидов и стимулировать, в высоких концентрациях, генерацию супероксидного анион-радикала in vitro;

•выявлено, что применение фитоэкдистерона у крыс приводит к органоспецифическому снижению выраженности окислительного стресса в головном мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести;

•установлена способность фитоэкдистерона снижать общую активность лизосомального фермента катепсина D в головном мозге и миокарде крыс при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.

Практическая значимость работы

Антигипоксическое, антиишемическое, антиоксидантное действие фитоэкдистерона, выделенного из смолёвки поникшей (Silene nutans) и смолёвки татарской (Silene tatarica), и его способность снижать общую активность лизосомального фермента катепсина D по выраженности сопоставимы с эффектами милдроната.

В работе продемонстрирована относительная безопасность изученного вещества по его влиянию на биохимические показатели, характеризующие

состояние оксидантной и антиоксидантной систем головного мозга, миокарда и печени интактных белых крыс.

Полученные результаты позволяют рекомендовать фитоэкдистерон для дальнейшего изучения в доклинических исследованиях, а также клинической практике в целях комплексной терапии гипоксических состояний и патологий, сопровождающихся развитием окислительного стресса и активацией лизосомальных протеиназ.

Положения, выносимые на защиту

•Курсовое пероральное ежедневное введение фитоэкдистерона, выделенного из смолёвки поникшей (Silene nutans) и смолёвки татарской (Silene tataricá), в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней приводит к повышению резистентности белых крыс к тяжелой острой гипоксической гипоксии и повышает устойчивость кардиомиоцитов к тотальной ишемии.

•Фитоэкдистерон в опытах in vitro дозозависимо ингибирует железоиндуцируемое аскорбат- и НАДФН2-зависимое перекисное окисление липидов в гомогенатах мозга крыс.

•Профилактическое пероральное введение фитоэкдистерона в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней до воздействия гипоксической гипоксии средней тяжести приводит к снижению выраженности органных проявлений окислительного стресса в головном мозге, миокарде и печени крыс и уменьшению общей активности катепсина D в головном мозге и миокарде.

•По антигипоксическому, антиишемическому, антиоксидантному действию и по влиянию на общую активность катепсина D фитоэкдистерон сопоставим с препаратом метаболического действия - милдронатом.

Личное участие автора

Автором самостоятельно подготовлен аналитический обзор литературы по изучаемой проблеме (100%), составлена программа исследования (80%), проведены эксперименты in vitro и in vivo (100%), биохимические и морфологические исследования (80%), обработка и интерпретация данных (90%), подготовка публикаций по диссертационной работе (75%). В целом его личный вклад в исследование превышает 85%.

Апробация работы

Результаты исследования доложены на II Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения - 2007» (Санкт-Петербург, 2007); XV Межрегиональной конференции «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2009); IV Международной научной конференции молодых ученых медиков (Курск, 2010); XVII Российском

национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010); Итоговой научной конференции студентов и молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» (Москва, 2011); XI Всероссийской выставке Научно-технического творчества молодежи (Москва, 2011); IV Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения -2011» (Санкт-Петербург, 2011); XVIII Межрегиональной конференции «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2012); IV Съезде фармакологов России (Казань, 2012). Работа удостоена гранта «УМНИК 2011». По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 3 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

Внедрение результатов в практику

Основные положения работы используются в учебном процессе при обучении студентов, клинических интернов и ординаторов на кафедре фармакологии с курсом фармации и фармакотерапии ФДПО, патофизиологии, фармакогнозии с курсом ботаники ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 147 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы (глава 1), материалы и методы исследования (глава 2), результаты исследования (глава 3), обсуждение полученных результатов (глава 4), выводы и практическая значимость.

Диссертация иллюстрирована 18 рисунками и 22 таблицами. Список литературы включает 115 источников отечественной и 137 — зарубежной литературы. Работ, опубликованных за последние 5 лет, более 25%.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследовании использовали водную вытяжку из смолёвки поникшей (Silene nutans) и смолёвки татарской (Silene tatarica), которая содержала 0,1% фитоэкдистерона. Концентрацию вещества определяли спектрофотометрически при длине волны 242 нм. В ходе эксперимента препарат вводили экспериментальным животным в дозе 5 мг/кг массы (Мирзаев Ю.Р. и соавт., 2000).

Исследуемый препарат был любезно предоставлен заведующим кафедрой фармакогнозии с курсом ботаники ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России, профессором, д.ф.н. Дармограем В.Н. Дизайн исследования включал эксперименты in vitro и in vivo. Экспериментальная работа in vivo выполнена на 116 беспородных белых крысах-самцах, массой 200-250 г. У лабораторных животных, предварительно, за 40 дней до начала работы, определяли

устойчивость к гипоксической гипоксии (гипобарический тип) путем их подъема на высоту 11000 м со скоростью 50 м/с. В исследование включали только крыс со средней устойчивостью к гипоксии (время до начала развития клонико-тонических судорог составляло 5-15 мин). В качестве препарата сравнения в опытах in vivo использовалось метаболическое средство триметилгидрацина пропионат (милдронат, «Grindex», Латвия), которое вводили в дозе 250 мг/кг массы.

Исследуемые препараты (фитоэкдистерон и милдронат) вводили один раз в день в желудок с помощью зонда (2 раза в день вводили фитоэкдистерон курсом 3 дня в I группе). Интактным и контрольным крысам внутрижелудочно один раз в день вводили дистиллированную воду из расчета 5 мл/кг массы.

Все животные были разделены на 4 группы.

I группа - изучение влияния фитоэкдистерона на резистентность крыс к тяжелой острой гипоксической гипоксии (ОГГ), которую моделировали подъемом животных на высоту 11000 м с помощью проточной барокамеры со скоростью 50 м/с. Группа I включала 5 серий животных, каждая из которых состояла из 7 крыс: 1 серия - контрольные животные, подвергнутые воздействию ОГГ; 2 серия - животные, которым профилактически перед моделированием ОГГ вводили фитоэкдистерон в течение 3 дней; 3 серия -животные, которым профилактически перед моделированием ОГГ вводили фитоэкдистерон в течение 7 дней; 4 серия - животные, которым профилактически перед моделированием ОГГ вводили фитоэкдистерон в течение 14 дней; 5 серия - животные, которым профилактически перед моделированием ОГГ вводили милдронат в течение 7 дней. Об устойчивости к гипоксии судили по времени наступления клонико-тонических судорог и по времени потери позы и двигательной активности.

II группа - изучение антиишемического действия фитоэкдистерона, включала 3 серии, каждая из которых состояла из 6 крыс: 1 серия - контроль ишемии - животные, которым моделировали тотальную ишемию миокарда; 2 серия - животные, которым профилактически вводили фитоэкдистерон в течение 7 дней, а затем подвергали тотальной ишемии миокарда; 3 серия -животные, которым профилактически вводили милдронат в течение 7 дней, а затем подвергали тотальной ишемии миокарда. Тотальную ишемию миокарда моделировали по методике Remier К.А. et al. (1981) в модификации Сысолятиной Н.А. (1991). Под эфирным наркозом вскрывали грудную клетку крыс, извлекали сокращающееся сердце и быстро отмывали его от крови в физиологическом растворе (t 37,0°С). Отсекали предсердия, миокард

желудочков рассекали ножницами на 3 части. Одну часть сразу опускали в фиксирующую жидкость (10% нейтральный формалин), остальные 2 части помещали в нагретые до 37°С бюксы, на дне которых находилась фильтровальная бумага, смоченная физиологическим раствором. Бюксы плотно закрывали и ставили в термостат при температуре 37°С. Через каждые 15 мин кусочек миокарда извлекали из бюкса и помещали в фиксирующую жидкость. После фиксации кусочки миокарда заливали в парафин, готовили срезы толщиной 7-8 мкм и окрашивали по методу Селье Г.Х. (1958) с целью выявления фуксинофильного субстрата. Морфометрию гистологических препаратов миокарда осуществляли с использованием светооптического микроскопа Микмед-2, при увеличении в 280 раз. Микропрепараты фотографировали с помощью цифровой камеры Canon Power Shot G5 с переходником Carl Zeiss. Ввод и анализ изображений осуществляли с использованием компьютера Intel Pentium III и программы Photoshop CS2. Для определения удельной площади (SA, мм2/мм2) фуксинофильного субстрата был применен метод точечного счета.

III группа - изучение влияния фитоэкдистерона на выраженность окислительного стресса и состояние антиоксидантной системы при ОГГ средней тяжести, которую моделировали подъемом животных на высоту 8000 м со скоростью подъема и спуска 50 м/с и экспозицией в течение 30 мин. Группа III включала 5 серий животных, каждая из которых состояла из 7 крыс: 1 серия - интактные животные; 2 серия - животные, получавшие фитоэкдистерон в течение 7 дней; 3 серия - контрольные животные, подвергнутые воздействию ОГГ; 4 серия - животные, которым профилактически перед моделированием ОГГ вводили фитоэкдистерон в течение 7 дней; 5 серия - животные, которым профилактически перед моделированием ОГГ вводили милдронат в течение 7 дней. После спуска животных забивали под эфирным наркозом. Для исследования забирали головной мозг, сердце и печень. В гомогенатах этих органов определяли содержание малонового диальдегида (МДА) по методу Hoss R.A. в модификации Стальной Н.Д. и Горишвили Т.Г. (1987), свободных и белковых (общих) сульфгидрильных (SH) групп по методу Ellman G.L. (1959), активность супероксиддисмутазы (СОД) по методу Костюк В.А. и соавт. (1990), каталазы по методу Королюк М.А. с соавт. (1988), глутатионпероксидазы по методу Paglia D.E., Valentine W.N. в модификации Панкина В.З. (1976), глутатион-8-трансферазы по методу Keen J.N., Iakoby W.B. (1978), глутатионредуктазы по методу Carbery J.J., Maunervik B.N. (1975).

IV группа - изучение влияния фитоэкдистерона на общую активность катепсина D при ОГГ средней тяжести. Группа IV включала 4 серии животных, каждая из которых состояла из 7 крыс: 1 серия - интактные животные; 2 серия -контрольные животные, подвергнутые воздействию ОГГ; 3 серия - животные, которым профилактически перед моделированием ОГТ вводили фитоэкдистерон в течение 7 дней; 4 серия — животные, которым профилактически перед моделированием ОГГ вводили милдронат в течение 7 дней. После спуска животных забивали под эфирным наркозом. Для исследования забирали головной мозг, сердце и печень. В гомогенатах этих органов определяли общую активность катепсина D по методу Anson M.L. в модификации Покровского A.A. и Тутельяна В.А. (1976).

Изучение прямой антиоксидантной активности фитоэкдистерона in vitro осуществляли на четырех модельных системах:

1 модельная система - генерирующая супероксидный анион-радикал в ходе реакции аутоокисления кверцитина (Костюк В.А. и соавт., 1990).

2 модельная система - генерирующая супероксидный анион-радикал в ходе реакции аутоокисления адреналина (Сирота Т.В., 1999).

3 модельная система - неферментативного железоиндуцируемого аскорбат-зависимого перекисного окисления липидов (Зарубина И.В. и соавт., 2004).

4 модельная система - ферментативного железоиндуцируемого НАДФН2-зависимого перекисного окисления липидов (Зарубина И.В. и соавт., 2004).

При исследовании способности фитоэкдистерона связывать супероксидный анион-радикал, в качестве препарата сравнения использовалась аскорбиновая кислота («Serva»), а при изучении влияния фитоэкдистерона на аскорбат- и НАДФН2-зависимое перекисное окисление липидов (ПОЛ), -кудесан («Аквион», 1 мл кудесана содержит 30 мг коэнзима Qio и 4,5 мг витамина Е).

Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием программ «Биостат» и Statsoft Statistica 6.1. Характер распределения данных определяли по критерию Шапиро-Уилка. Для исследования статистической значимости показателей, имеющих нормальное распределение, внутри каждой группы использовали тест ANOVA, различия между сериями определяли по критерию Ньюмена-Кейсла.

Полученные данные, в случае нормального распределения признака, были представлены в виде среднего арифметического значения и стандартной ошибки среднего результата (М±гп).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние профилактического применения фитоэкдистерона на развитие тяжелой гипоксии. Превентивное введение фитоэкдистерона в течение 3-х дней достоверно не влияло на резистентность нелинейных белых крыс к тяжелой острой гипоксической гипоксии (ОГГ). Профилактическое назначение фитоэкдистерона в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 и 14 дней приводило к повышению резистентности животных к тяжелой ОГГ, что проявлялось увеличением времени развития клонико-тонических судорог на 52,5% (р<0,01) и 67,5% (р<0,01) и времени потери позы - на 40,9% (р<0,05) и на 60,6% (р<0,01) соответственно, по сравнению с показателями контрольных крыс (табл. 1).

Таблица 1

Влияние профилактического применения фитоэкдистерона и милдроната на время развития клонико-тонических судорог и время потери позы у крыс при тяжелой острой гипоксической гипоксии (М±ш)

Серия эксперимента Время начала развития клонико-тонических судорог, мин, п=7 Время потери позы, мин, п=7

Контроль (интактные крысы) 8,0±0,47 6,6±0,60

Введение фитоэкдистерона в течение 3 дней 10,2±0,77 8,0+0,69

Введение фитоэкдистерона в течение 7 дней 12,2±1,00* 9,3±0,63*

Введение фитоэкдистерона в течение 14 дней 13,4±1,12** 10,6±0,79**

Введение милдроната в течение 7 дней 11,8±0,99* 9,4±0,77*

* - р<0,05, ** - р<0,01 - достоверные различия по сравнению с показателями интактных крыс

Превентивное введение милдроната в дозе 250 мг/кг массы в течение 7 дней приводило к увеличению времени развития судорог на 47,5% (р<0,01) и времени потери позы - на 42,4% (р<0,05) по сравнению с показателями контроля.

При сравнении устойчивости к ОГГ (по времени развития клонико-тонических судорог и времени потери позы) у животных, получавших разные курсы фитоэкдистерона, не выявлено достоверных различий между сериями (р>0,05). Также не отмечалось статистически значимых различий между

эффектами двух изучаемых веществ - фитоэкдистерона и милдроната при их введении курсом 7 дней (р>0,05).

Исследование антиишемического эффекта фитоэкдистерона. Данный эффект оценивали по площади фуксинофильного субстрата в срезах миокарда. Полученные результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2

Влияние фитоэкдистерона и милдроната на площадь фуксинофильного субстрата при экспериментальной тотальной ишемии миокарда (М±т)

Серии опытов Площадь фуксинофильного субстрата в миокарде в динамике ишемии, п=6

0 мин 15 мин 30 мин

Контроль (интактные крысы) 0,25±0,019 0,49+0,027 0,61±0,031

Фитоэкдистерон профилактически 7 дней 0,27+0,025 0,31±0,038*,** 0,35+0,045*

Милдронат профилактически 7 дней 0,23±0,021 0,42±0,044** 0,47+0,037*

* - р<0,05 - достоверные различия по сравнению с показателями интактных крыс,

** - р<0,05 - достоверные различия между исследуемыми препаратами

В серии контроля ишемии сразу после забоя крыс фуксинофильный субстрат в кардиомиоцитах интактных крыс наблюдался редко. В полях зрения микроскопа обнаруживались единичные, диффузно расположенные кардиомиоциты с явлениями слабовыраженной фуксинофилии изотропных и анизотропных дисков. Через 15 мин удельная площадь поражения увеличилась на 96,0% (р<0,05). Характер фуксинофилии (отражающий развитие миокардиодистрофии) был различен. В некоторых кардиомиоцитах этот субстрат занимал отдельные сегменты, четко отграниченные вставочными дисками. Часто наблюдались клетки, лишенные поперечной исчерченности, «заполненные» однородной, гомогенной фуксинофильной массой. 30-минутная экспозиция острой тотальной ишемии сердечной мышцы обусловила более выраженную фуксинофилию - удельная площадь поражения возросла на 144,0% (р<0,05). В очагах дистрофии кардиомиоциты были набухшими, лишены поперечной исчерченности, в них отмечались явления кариопикноза и кариолизиса, а также утолщенные вставочные диски. Часто наблюдалась фрагментация дисков и вакуолизация цитоплазмы.

Сразу после забоя у крыс, профилактически получавших фитоэкдистерон и милдронат, гистологическая картина миокарда не отличалась от группы контроля ишемии. 15-минутная экспозиция миокарда на фоне

профилактического применения фитоэкдистерона приводила к снижению удельной площади поражения на 36,7% (р<0,05), а на фоне введения милдроната - на 14,3% (р>0,05). Слабовыраженный фуксинофильный субстрат локализовался в отдельных сегментах диффузно расположенных мышечных клеток по ходу изотропных, анизотропых, а также вставочных дисков. У животных, профилактически получавших милдронат, в миокарде встречались клетки, лишенные поперечной исчерченности. Через 30 мин ишемии, на фоне предварительного назначения фитоэкдистерона, удельная площадь фуксинофильного субстрата уменьшилась на 42,6% (р<0,05) по сравнению с данными контроля ишемии, а на фоне применения милдроната - лишь на 23,0% (р<0,05). Морфологические изменения сводились к локальному отсутствию поперечной и продольной исчерченности у отдельных, диффузно расположенных кардиомиоцитов. В единичных клетках наблюдалась фрагментация на уровне вставочных дисков, некоторые были набухшими. Значительно реже встречались небольшие очажки некроза ткани. Следует отметить, что на 15-ой мин ишемии при профилактическом введении фитоэкдистерона обнаруживалась достоверно меньшая площадь фуксинофильного субстрата по сравнению с серией применения милдроната (р<0,05).

Исследование антисупероксидной активности фитоэкдистерона in vitro. Полученные результаты представлены на рис. 1 и рис. 2. Фитоэкдистерон в конечных концентрациях в инкубируемом растворе от 1,3 мМ до 0,035 мМ активировал аутоокисление кверцетина от 46,2% (р<0,001) до 7,7% (р<0,05) соответственно, а в концентрациях от 0,1 мМ до 0,005 мМ - процесс аутоокисления адреналина от 150,4% (р<0,001) до 23,8% (р<0,05) соответственно.

В качестве препарата сравнения использовалась аскорбиновая кислота в диапазоне концентраций в инкубируемом растворе, аналогичном фитоэкдистерону. В отличие от фитоэкдистерона, аскорбиновая кислота, как классический антиоксидант, ингибировала как процесс аутоокисления кверцетина от 95,5% (р<0,001) в концентрации 1,3 мМ до 44,0% (р<0,001) в концентрации 0,035 мМ, так и окисление адреналина от 98,9% (р<0,001) в концентрации 0,1 мМ до 13,6% (р<0,01) в концентрации 0,001 мМ (рис. 1 и рис. 2).

Известно, что процесс самоокисления адреналина инициируется супероксидным анион-радикалом, образующимся при взаимодействии адреналина со следами металлов в щелочной среде. Ускорение данного

3 120 ■■•

S 100

я Я 80 •■

я а. а 60 -

о а 3 » Я S 40 20

S а 0 -

S S и -20 -

'Л О -40

а -60 -

X я -80 -

■*— аскорбиновая кислота •••• фитоэкдпстерон

***

— Г

Обозначения: * - р<0,05, ** - р<0,01,

*** - р<0,001 - достоверные

различия по сравнению с пробами, не содержащими изучаемые вещества

1,3 0,625 0,45 0,35 0,25 0,15 0,1 0,05 0,035 0,015 0,01 0,005 Концентрация веществ в реакционной смеси, мМ

Рисунок 1. Влияние фитоэкдистерона и аскорбиновой кислоты на аутоокисление кверцетина in vitro (M±m)

150 100 50 0 -50 -100 -150 -200

Г **>

0,1

•— аскорбиновая кислота ••••* фитозкдистерон

***

0,05 0,025 0,015 0,01 0,005 0,001 0,0005 0,0001 Концентрация веществ в реакционной смеси, мМ

Обозначения: **-р<0,01, ***-р<0,001-достоверные различия по сравнению с пробами, не содержащими изучаемые вещества

Рисунок 2. Влияние фитоэкдистерона и аскорбиновой кислоты на аутоокисление адреналина in vitro (M±m)

процесса может происходить при повышении температуры, защелачивании конечного раствора, добавлении в среду инкубации окислителей (например, K3[Fe(CN)6]) или генераторов супероксидного анион-радикала (гидроперекись-третбутила) (Сирота Т.В., 1999). При окислении кверцетина в щелочной среде, в присутствии тетраметилэтилендиамина, одним из промежуточных продуктов окисления является супероксидный анион-радикал. Усиление окисления кверцетина возможно при добавлении в среду инкубации ионов двухвалетного железа, продуцентов СЬ'", (гидроперекись-третбутила), а также при повышении температуры данной среды (Костюк В.А., 1990).

По химической структуре фитоэкдистерон не является окислителем. При изучении рН и температуры конечных растворов (после добавления фитоэкдистерона) установлено, что они остаются индифферентными. Следовательно, фитоэкдистерон потенциирует самоокисление адреналина и кверцетина, действуя как катализатор (ускоряя лимитирующую стадию данных реакций, то есть процесс образования супероксидного анион-радикала).

Влияние фитоэкдистерона на железоиндуцируемое аскорбат-зависгшое перекисное окисление липидов in vitro. Данное влияние препарата изучено в диапазоне концентраций в инкубируемой смеси от 0,35 мМ до 0,0035 мМ (табл. 3). Фитоэкдистерон достоверно дозозависимо подавлял железоиндуцируемое аскорбат-зависимое ПОЛ в примененных концентрациях при инкубации в течение 15 мин. В конечной концентрации в инкубируемом растворе 0,35 мМ фитоэкдистерон ингибировал процесс ПОЛ на 21,8% (р<0,05) через 5 мин инкубации и на 24,7% (р<0,05) - через 15 мин, при уровне 0,13 мМ - на 14,9% (р<0,05) и 9,7% (р<0,05), в концентрации 0,035 мМ - на 14,0% (р<0,05) и 7,5% (р<0,05), а при уровне 0,0035 мМ - на 10,5% (р<0,05) и 8,4% (р<0,05) в указанное время соответственно. К 30-ой мин процесса инкубации происходило истощение содержания фитоэкдистерона и антиоксидантной системы, и накопление МДА начинало повышаться: при концентрациях 0,35 мМ, 0,035 мМ и 0,0035 мМ - на 68,9% (р<0,05), 13,1% (р<0,05) и 20,1% (р<0,05) соответственно.

В качестве препарата сравнения был выбран комбинированный антиоксидант - кудесан в диапазоне доз от 400 мкл до 4 мкл. Антиоксидант кудесан в дозе, равной 400 мкл (конечная концентрация в растворе 1,86 мМ вит Е, 5,72 мМ CoQ), ускорял процессы ПОЛ, о чем свидетельствует увеличение накопления МДА на 29,1% (р<0,05) в течение первых 5 мин инкубации. В более

Влияние фитоэкдистерона и кудесана на железоиндуцируемое аскорбат-зависимое ПОЛ in vitro (M±m)

Серии 0,35 мМ экдистерон 0,13 мМ зкдистерон 0,035 мМ экдистерон 0,0035 мМ экдистерон кудесан 400 мкл кудесан 150 мкл кудесан 40 мкл кудесан 4 мкл 400 мкл буфера

%ингибирования через 5 мин 21,79 ±2,11* 14,86 ±1,23* 14,02 ±0,79* 10,47 ±1,32* -29,05 ±1,21* 29,73 ±2,30* 12,66 ±1,30* 22,97 ±5,40* 0,00 ±2,34

%ингибирования через 15 мин 24,67 ±1,78* 9,727 ±0,45* 7,47 ±1,09* 8,36 ±0,78* 69,39 ±6,80* 29,54 ±1,66* 7,29 ±0,45 -20,28 ±3,45* 0,00 ±4,58

%ингибирования через 30 мин -68,87 ±3,74* -0,26 ±0,06 -13,05 ±1,21* -20,09 ±2,24* -75,76 ±4,34* -0,68 ±0,11 -19,67 ±2,33* 17,24 ±3,45* 0,00 ±5,33

* - р<0,05 - достоверные различия по сравнению с пробами, не содержащими изучаемые вещества

Таблица 4

Влияние фитоэкдистерона и кудесана на железоиндуцируемое НАДФНг-зависимое ПОЛ in vitro (M±m)

Серии 0,35 мМ 0,13 мМ 0,035 мМ 0,0035 мМ кудесан кудесан кудесан кудесан 400 мкл

ждистерон экдистерон экдистерон экдистерон 400 мкл 150 мкл 40 мкл 4 мкл буфера

% ингибирования 31,32 11,23 3,16 3,90 85,42 50,59 6,13 4,15 0,00

через 5 мин ±3,21* ±1,11* ±0,91 ±0,36 ±6,33* ±4,98* ±0,45 ±0,77 ±6,54

%ингибирования 6,96 4,73 24,81 5,97 67,53 57,46 33,58 17,91 0,00

через 15 мин ±0,23 ±0,67 ±3,12* ±0,46 ±6,23* ±2,34* ±2,36* ±2,10* ±7,26

% ингибирования -71,14 -6,27 -28,52 19,80 -10,78 -26,84 -18,12 10,07 0,00

через 30 мин ±8,12* ±2,34 ±2,76* ±1,03* ±2,34* ±2,15* ±2,11* ±0,74* ±6,60

* - р<0,05 - достоверные различия по сравнению с пробами, не содержащими изучаемые вещества

низких дозировках, равных 150 мкл (0,7 мМ вит Е, 2,15 CoQ), 40 мкл (0,186 мМ вит Е, 0,572 мМ CoQ) и 4 мкл (0,0186 мМ вит Е, 0,0572 мМ CoQ) кудесан подавлял процессы ПОЛ, вызывая уменьшение накопления МДА через 5 мин инкубации на 29,7% (р<0,05), 12,7% (р<0,05) и 23,0% (р<0,05) соответственно. Через 15 мин протекания свободно-радикальных реакций кудесан в дозах 400 мкл и 150 мкл ингибировал их на 69,4% (р<0,05) и 29,5% (р<0,05), а в концентрации 4 мкл - ускорял на 20,3% (р<0,05). К 30-ой мин происходило окончательное истощение концентрации кудесана и антиоксидантной системы, что проявлялось усилением накопления МДА на 75,8 % (р<0,05) при концентрации кудесана 400 мкл и на 19,7% - при концентрации 40 мкл. Инкубируемый раствор, содержащий 150 мкл кудесана, через 30 мин протекания реакций не влиял на уровень прироста МДА, а содержащий 4 мкл препарата - уменьшил его на 17,2% (р<0,05).

Влияние фитоэкдистерона на железоиндуцируемое НАДФН2-зависимое перекисное окисление липидов in vitro. Данное влияние препарата изучено в диапазоне концентраций в инкубируемом растворе от 0,35 мМ до 0,0035 мМ (табл. 4). Фитоэкдистерон дифференцированно подавлял железоиндуцируемое НАДФНг-зависимое ПОЛ, что определялось его концентрацией в реакционной смеси. Через 5 мин инкубации накопление МДА уменьшилось на 31,3% (р<0,05) при концентрации фитоэкдистерона 0,35 мМ и на 11,2% (р<0,05) - при концентрации 0,13 мМ. На 15-ой мин протекания свободно-радикальных реакций уровень прироста МДА уменьшился на 24,8% (р<0,05) в растворе, содержащем 0,035 мМ фитоэкдистерона. На 30-ой мин опыта фитоэкдистерон подавлял накопление МДА в дозе 0,0035 мМ на 19,8% (р<0,05), а в концентрациях 0,35 мМ и 0,035 мМ - напротив усиливал его на 71,1% (р<0,05) и 28,5% (р<0,05) соответственно.

В качестве препарата сравнения в данной серии также использовался комбинированный антиоксидант - кудесан в диапазоне доз от 400 мкл до 4 мкл. В отличие от фитоэкдистерона, кудесан отчетливо подавлял железоиндуцируемое НАДФН2-зависимое ПОЛ в исследуемом диапазоне доз. Дозы 400 мкл (конечная концентрация в растворе 1,86 мМ вит Е, 5,72 мМ CoQ) и 150 мкл кудесана (0,7 мМ вит Е, 2,15 CoQ) подавляли процесс накопления МДА на 85,4% (р<0,05) и 50,6% (р<0,05) через 5 мин, на 67,5% (р<0,05) и 57,5% (р<0,05) - через 15 мин инкубации соответственно. В дозах 40 мкл (конечная концентрация в растворе 0,186 мМ вит Е, 0,572 мМ CoQ) и 4 мкл (конечная концентрация в растворе 0,0186 мМ вит Е, 0,0572 мМ CoQ) кудесан подавлял

процесс накопления МДА через 15 мин инкубации на 33,6% (р<0,05) и на 17,9% (р<0,05) соответственно. К 30-ой мин инкубации происходило истощение как содержания кудесана, так и антиоксидантной системы защиты, что проявлялось увеличением прироста МДА на 10,8% (р<0,05) при дозе кудесана 400 мкл, на 26,8% (р<0,05) - при дозе 150 мкл и на 18,1% (р<0,05) - при дозе 40 мкл. В то же время, в дозе 4 мкл (0,0186 мМ вит Е, 0,0572 мМ CoQ) кудесан подавлял процессы ПОЛ, вызывая уменьшение накопления МДА через 30 мин инкубации на 10,1% (р<0,05).

Установленное на моделях аскорбат- и НАДФН2-зависимого ПОЛ прямое антиоксидантное действие фитоэкдистерона связано, вероятно, с большим количеством гидроксильных групп в его молекуле (Flora J.S., 2009; Lafont R.J. et al., 2003).

Однако, по данным литературы известно, что концентрация экдистерона в плазме крови, после перорального введения в дозе 500 мг/кг массы, составляет, в среднем, 30 нг/мл (Kumpun S.J., 2011; Slama К.А. et al., 1995), что значительно меньше концентраций вещества, в которых оно способно подавлять аскорбат- и НАДФН2-зависимое железоиндуцируемое ПОЛ и активировать процесс образования супероксидного анион-радикала. Таким образом, антигипоксическое и антиишемическое действие фитоэкдистерона, скорее всего, связано с его непрямым влиянием на свободно-радикальные процессы.

Исследование антиоксидантного действия фитоэкдистерона in vivo. Полученные результаты представлены в табл. 5-7.

Введение фитоэкдистерона в течение 7 дней интактным крысам приводило к повышению активности глутатионпероксидазы на 8,3% (р<0,05) в мозге (табл. 5) и к увеличению активности каталазы на 28,6% (р<0,05) и снижению содержания МДА на 28,6% (р<0,05) в печени (табл. 7).

Экспозиция животных на высоте 8000 м в течение 30 мин сопровождалась сходными по направленности изменениями исследуемых показателей оксидантной и антиоксидантной систем в головном мозге, миокарде и печени по сравнению с показателями интактных крыс. В мозге отмечалось достоверное (р<0,05) повышение уровня МДА на 28,1%, снижение содержания свободных и белковых SH-групп на 27,3% и на 38,5% соответственно, уменьшение активности СОД на 26,4%, глутатион-S-трансферазы - на 10,5%, глутатионредуктазы - на 18,9%, глутатионпероксидазы - на 23,1% и повышение активности каталазы на 29,0% (табл. 5). В миокарде обнаруживалось достоверное (р<0,05) повышение уровня МДА на 35,2%, снижение концентрации свободных и белковых SH-групп на

36,8 и 30,9% соответственно, уменьшение активности СОД на 24,1%, каталазы

- на 33,3%, глутатион-Б-трансферазы - на 11,1%, глутатионредуктазы - на 15,3%, глутатионпероксидазы - на 19,2% (табл. 6). В печени наблюдалось достоверное (р<0,05) повышение уровня МДА на 36,7%, снижение содержания свободных и белковых БН-групп на 29,4% и на 44,3% соответственно, уменьшение активности СОД на 30,6%, каталазы - на 35,7%, глутатион-Б-трансферазы - на 8,9%, глутатионредуктазы - на 17,6%, глутатионпероксидазы

- на 25,3% (табл. 7).

Профилактическое введение фитоэкдистерона в течение 7 дней перед моделированием ОГГ, по сравнению с серией контроля гипоксии, приводило в мозге к повышению (р<0,05) содержания общих БН-групп на 62,5%, активности СОД на 31,5%, глутатион-Б-трансферазы - на 18,3% и нормализации (отсутствие достоверных различий с показателями интактных животных, р>0,05) уровня МДА, свободных БН-групп и активности глутатионредуктазы (табл. 5). В миокарде наблюдалось повышение (р<0,05) уровня свободных БН-групп на 41,7%, активности глутатионпероксидазы - на 7,6% и нормализация уровня МДА, активности СОД, каталазы, глутатион-Б-трансферазы, глутатионредуктазы (табл. 6). В печени происходило снижение уровня МДА на 20,4% (р<0,05), увеличение содержания белковых БН-групп на 45,5% (р<0,05), активности глутатион-Б-трансферазы - на 6,8%, глутатионпероксидазы - на 21,4%, каталазы - на 66,7% и нормализация содержания свободных БН-групп и активности СОД (табл. 7).

Превентивное назначение милдроната в течение 7 дней перед гипоксическим воздействием сопровождалось в мозге повышением (р<0,05) активности СОД на 33,2%, глутатион-Б-трансферазы - на 24,6%, глутатионредуктазы - на 26,2%, глутатионпероксидазы - на 23,9% по сравнению с серией животных контроля гипоксии, и нормализацией уровня МДА, концентрации свободных и белковых БН-групп (табл. 5). В миокарде отмечалось снижение уровня МДА на 34,6% (р<0,05), повышение содержания свободных БН-групп на 25,0% (р<0,05), активности глутатионпероксидазы - на 20,2% (р<0,05) и нормализация активности СОД, каталазы, глутатион-Б-трансферазы и глутатионредуктазы (табл. 6). В печени обнаруживалась нормализация уровня МДА, свободных БН-групп, активности СОД, глутатион-Б-трансферазы, глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы (табл. 7).

Следует отметить, что активность каталазы в печени у животных, профилактически получавших фитоэкдистерон перед ОГГ, превышала данный

Влияние фитоэкдистерона и милдроната на состояние антиоксидантной системы мозга крыс (М±ш)

Показатель Серии экспериментов

Интактные животные, п=7 Контроль гипоксии, п=7 Фитоэкдистерон 7 дней, п=7 Фитоэкдистерон 7 дней перед гипоксией, п=7 Милдронат 7 дней перед гипоксией, п=7

МДА, нмоль/мг ткани 13,3±1,05 17,1+1,10* 12,6±0,87 15,3±0,75 16,1±0,95

5Н-группы свободные, мкмоль/ мг ткани 0,11+0,008 0,08±0,004* 0,10±0,006 0,09±0,006 0,09 ±0,005

БН-группы общие, мкмоль/мг ткани 0,39±0,025 0,24±0,019* 0,44±Ю,039 0,39±0,030** 0,30±0,026

Активность СОД, МЕУмг ткани 4,0±0,27 2,9±0,20* 3,8±0,31 3,9±0,29** 3,9±0,23**

Активность каталазы, МЕ/мг ткани 1,2+0,07 1,6±0,08* 1,3±0,06 1,7±0,09* 1,6±0,11*

Активность глутатион-8-трансферазы, нмоль ХДНБ/минхмг ткани 112,2±3,50 100,4+2,50* 115,8+3,80 118,8+3,90** 125,1+4,50**

Активность глутатионредуктазы, нмоль НАДФН/минхмг ткани 24,9±1,11 20,2±0,95* 23,6±0,78 22,3±1,23 25,5±1,25**

Активность глутатионпероксидазы, нмоль НАДФН/минхмг ткани 8,5+0,32 6,5+0,15* 9,2±0,21* 7,1±0,38* 8,1±0,41**

* - р<0,05 - достоверные различия по сравнению с показателями интактных крыс, ** - р<0,05 - достоверные различия по сравнению с показателями контроля гипоксии

Влияние фитоэкдистерона и миддроната на состояние антиоксидантной системы миокарда крыс (М±ш)

Показатель Серии экспериментов

Интактные животные, п=7 Контроль гипоксии, п=7 Фитоэкдистерон 7 дней, п=7 Фитоэкдистерон 7 дней перед гипоксией, п=7 Милдронат 7 дней перед гипоксией, п=7

МДА, нмоль/мг ткани 2,5±0,15 3,4±0,25* 2,8+0,18 2,9±0,20 2,2±0,15

БН-группы свободные, мкмоль/ мг ткани 0,19+0,013 0,12±0,008* 0Д8±0,009 0,17+0,010** 0,15±0,009*,**

БН-группы общие, мкмоль/мг ткани 0,68±0,048 0,47±0,041* 0,65±0,053 0,51 ±0,032* 0,50±0,045*

Активность СОД, МЕ/мг ткани 3,4±0,15 2,6±0,12* 3,1±0,24 3,2±0,25 3,1±0,22

Активность каталазы, МЕ/мг ткани 5,4+0,32 3,6±0,20* 5,0±0,38 4,6±0,26 4,4±0,30

Активность глутатион-Б-трансферазы, нмоль ХДНБ/минхмг ткани 53,3+1,90 47,4+1,20* 55,2+2,70 48,1+2,10 49,7+2,20

Активность глутатионредуктазы, нмоль НАДФН/минхмг ткани 22,9+0,80 19,4+0,65* 21,0+0,90 20,9± 1,20 21,5+1,15

Активность глутатионпероксидазы, нмоль НАДФН/минхмг ткани 21,3+0,86 17,2±0,83* 20,5± 1,07 18,5±0,87** 20,7±1,35**

* - р<0,05 - достоверные различия по сравнению с показателями интактных крыс, ** - р<0,05 - достоверные различия по сравнению с показателями контроля гипоксии, *** - р<0,05 - достоверные различия между исследуемыми препаратами

Влияние фитоэкдистерона и милдроната на состояние антиоксидантной системы печени крыс (М±ш)

Показатель Серии экспериментов

Интактные животные, п=7 Контроль гипоксии, п=7 Фитоэкдистерон 7 дней, п=7 Фитоэкдистерон 7 дней перед гипоксией, п=7 Милдронат 7 дней перед гипоксией, п=7

МДА, нмоль/мг ткани 2,83+0,18 3,87±0,29* 2,02±0,12* 3,08+0,21 ** 3,26±0,25

БН-группы свободные, мкмоль/ мг ткани 0,17±0,011 0,12±0,008* 0,15±0,009 0,14±0,007 0,14+0,0097

БН-группы общие, мкмоль/мг ткани 0,79±0,045 0,44+0,033* 0,83±0,056 0,64±0,043** 0,59±0,038*

Активность СОД, МЕ/мг ткани 2,9±0,17 2,1+0,10* 2,8±0,14 2,6±0,09 2,43±0,17

Активность каталазы, МЕ/мг ткани 5,6±0,40 3,6±0,24* 7,2+0,50* 6,0±0,30** 4,0±0,28*,***

Активность глутатион-8-трансферазы, нмоль ХДНБ/минхмг ткани 140,7±2,60 128,1±2,30* 138,4±2,70 136,8±2,10** 133,36±2,9

Активность глутатионредуктазы, нмоль НАДФН/минхмг ткани 52,3±1,96 43,1+1,50* 48,9± 1,77 45,7±1,43* 47,67+1,65

Активность глутатионпероксидазы, нмоль НАДФН/минхмг ткани 22,5+1,35 16,8+0,75* 21,9+1,15 20,4±0,85** 18,87±1,1

* - р<0,05 - достоверные различия по сравнению с показателями интактных крыс, ** - р<0,05 - достоверные различия по сравнению с показателями контроля гипоксии, *** - р<0,05 - достоверные различия между исследуемыми препаратами

показатель у животных, превентивно получавших милдронат, на 33,3% (р<0,05).

Профилактическое введение фитоэкдистерона в течение 7 дней перед воздействием ОГГ предотвращало развитие окислительного стресса во всех исследуемых органах (мозге, миокарде и печени), за счет стимулирования разных звеньев антиоксидантной системы. Подобное действие фитоэкдистерона можно рассматривать как проявление его адаптогенной активности, то есть способности оптимизировать в разных органах наиболее важные для их жизнедеятельности компоненты антиоксидантной системы защиты (Зарубина И.В. и соавт., 2004; Яременко К.В., 2007).

Влияние фитоэкдистерона на общую активность катепсина D при острой гипоксии. При моделировании ОГГ средней тяжести наблюдалось повышение общей активности лизосомального фермента катепсина D в головном мозге крыс на 40,6% (р<0,05), в миокарде - на 44,4% (р<0,05). В печени активность катепсина D достоверно не изменялась (р>0,05) (табл. 8). Установлено, что повышение активности катепсина D вызывает дальнейшее повреждение клеток по типу некроза или апоптоза (Пупышев А.Б., 2011).

Таблица 8

Влияние фитоэкдистерона и милдроната на общую активность катепсина Б нмоль тирозина/мг белка в мин в головном мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести (М±т)_

Серии экспериментов Мозг, п=7 Миокард, п=7 Печень, п=7

Интактные крысы 2,29±0,179 1,62±0,115 3,48±0,245

Гипоксия (контроль) 3,22±0,253* 2,34±0,194* 4,20+0,337

Гипоксия на фоне введения фитоэкдистерона 2,29±0,170** 1,66±0,116** 3,72±0,271

Гипоксия на фоне введения милдроната 2,67±0,189 1,90±0,119** 3,86±0,288

* - р<0,05 - достоверные различия по сравнению с показателями интактных крыс,

** - р<0,05 - достоверные различия с показателями контроля гипоксии, *** - р<0,05 - достоверные различия между исследуемыми препаратами

Профилактическое пероральное введение фитоэкдистерона в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней перед гипоксическим воздействием приводило к снижению общей активности катепсина Б в мозге на 28,9% (р<0,05), в миокарде - на 29,1% (р<0,05) по сравнению с показателями серии контроля

гипоксии. При этом активность катепсина D во всех исследуемых органах достоверно не отличалась от значений у интактных животных.

Профилактическое введение милдроната в дозе 250 мг/кг массы в течение 7 дней перед моделированием ОГГ сопровождалось снижением общей активности катепсина D в миокарде на 27,2% (р<0,05) по сравнению с контролем гипоксии, и нормализацией (отсутствие достоверных различий с показателями интактных животных, р>0,05) данного показателя в головном мозге.

Таким образом, в настоящем исследовании установлено, что водная вытяжка из смолевки поникшей (Silene nutans) и смолевки татарской (Silene tatarica), содержащая 0,1% фитоэкдистерона, обладает выраженным антигипоксическим и антиишемическим эффектом. Данное действие может быть обусловлено способностью изучаемого вещества стимулировать активность антиоксидантных ферментов и снижать общую активность лизосомального фермента катепсина D и не связано с его прямым антиоксидантным эффектом.

ВЫВОДЫ

1. Курсовое пероральное ежедневное введение фитоэкдистерона, выделенного из смолёвки поникшей (Silene nutans) и смолёвки татарской (Silene tatarica), в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 и 14 дней приводит к повышению резистентности белых крыс к тяжелой острой гипоксической гипоксии.

2. Профилактическое пероральное ежедневное введение крысам фитоэкдистерона в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней повышает устойчивость кардиомиоцитов к тотальной ишемии.

3. В опытах in vitro в диапазоне концентраций 0,35-0,0035 мМ фитоэкдистерон дозозависимо ингибирует железоиндуцируемое аскорбат- и НАДФН2-зависимое перекисное окисление липидов в гомогенатах мозга крыс, а в высоких концентрациях (1,3 - 0,035 мМ) активирует образование супероксидного анион-радикала в модельных системах аутоокисления адреналина и кверцетина. По способности подавлять железоиндуцируемое аскорбат-зависимое перекисное окисление липидов фитоэкдистерон сопоставим с антиоксидантом кудесаном, а по влиянию на железоиндуцируемое НАДФН2-зависимое перекисное окисление липидов уступает ему.

4. Ежедневное назначение интактным крысам фитоэкдистерона per os в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней вызывает увеличение активности глутатионпероксидазы в мозге, повышение активности каталазы и уменьшение содержания малонового диальдегида в печени.

5. Развитие острой гипоксической гипоксии сопровождается активацией процессов перекисного окисления липидов в мозге, миокарде и печени крыс и повышением активности катепсина D в мозге и миокарде.

6. Профилактическое пероральное введение фитоэкдистерона в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней до воздействия гипоксической гипоксии средней тяжести приводит к органоспецифическому снижению выраженности окислительного стресса, которое характеризуется уменьшением концентрации малонового диальдегида, увеличением уровня сульфгидрильных групп и активности антиоксидантных ферментов в головном мозге, миокарде и печени и вызывает снижение общей активности катепсина D в головном мозге и миокарде.

7. По антигипоксическому, антиишемическому, антиоксидантному действию и по влиянию на общую активность катепсина D в опытах in vivo фитоэкдистерон сопоставим с препаратом метаболического действия -милдронатом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные результаты позволяют рекомендовать фитоэкдистерон для дальнейшего изучения в доклинических исследованиях, а также в клинической практике в целях комплексной терапии гипоксических состояний, ишемии миокарда, патологий, сопровождающихся развитием окислительного стресса и повышением активности лизосомальных протеиназ.

2. Наличие у фитоэкдистерона способности катализировать реакции образования супероксидного анион-радикала позволит создавать на его основе новые модельные системы для изучения антисупероксидной активности лекарственных препаратов in vitro.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Щулькин A.B. Изучение антигипоксического и антиишемического эффектов фитоэкдистерона / A.B. Щулькин, В.В. Давыдов, E.H. Якушева, В.Н. Дармограй, А.Г. Краснолобов // Рос. медико-биол. вестн. им. акад. И.П. Павлова. - 2011. - N3. - С. 30-36.

2. Щулькин A.B. Исследование прямой антиоксидантной активности фитоэкдистерона in vitro / A.B. Щулькин, E.H. Якушева, B.B. Давыдов, В.Н. Дармограй // Рос. медико-биол. вести, им. акад. И.П. Павлова.- 2012. - N1. - С. 51-57.

3. Щулькин A.B. Современные представления о фармакодинамике экдистероидов / A.B. Щулькин, E.H. Якушева, В.В. Давыдов, В.Н. Дармограй // Рос. медико-биол. вестн. им. акад. И.П. Павлова. - 2012. - N4. - С. 167-172.

4. Краснолобов А.Г. Состояние сократительных кардиомиоцитов в условиях острой тотальной ишемии сердца на фоне введения милдроната / А.Г. Краснолобов, A.B. Щулькин // Актуальные проблемы клинической и экспериментальной патологии: тематический сб. науч. тр., посвященный 100-летию со дня рождения Г. Селье. - Рязань: РязГМУ, 2007. - С. 98-100.

5. Щулькин A.B. Изучение антиоксидантной активности фитоэкдистерона in vitro / A.B. Щулькин // Материалы IV Междунар. науч. конф. молодых ученых медиков. - Курск: ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, 2010. -Т. 1,- С. 432-435.

6. Щулькин A.B. Особенности антиоксидантной системы у крыс с разной устойчивостью к гипоксии / A.B. Щулькин, В.В. Давыдов, E.H. Якушева // Тез. Шестой Междунар. крымской конф. «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии». - М.: ФГУ «РКНПК Росздрава», 2010. - С. 56.

7. Щулькин A.B. Влияние фитоэкдистерона на состояние антиоксидантной системы мозга нелинейных белых крыс при острой гипоксической гипобарической гипоксии / A.B. Щулькин // Тез. итоговой Всерос. науч. конф. молодых ученых исследователей с Междунар. участием «Татьянин день». Конкурс Первого МГМУ им. И.М. Сеченова на лучшую научную работу студентов 2010 г. - М., 2011. - С. 410-411.

8. Щулькин A.B. Влияние фитоэкдистерона на состояние антиоксидантной системы печени нелинейных белых крыс при острой гипоксической гипобарической гипоксии / A.B. Щулькин // Фундаментальная наука и клиническая медицина - Человек и его здоровье: тез. XIV Всерос. медико-биол. конф. молодых исследователей (с Междунар. участием). - СПб.: Изд-во СПбГУ, 2011. - С. 316-317.

9. Щулькин A.B. Изучение адаптогенной активности экдистерона / A.B. Щулькин // Тез. докл. II регионального итогового конкурса «УМНИК» -

10. Щулькин A.B. Антиоксидантная активность фитоэкдистерона в опытах in vitro и in vivo / A.B. Щулькин // Тез. XVIII межгородской конф. молодых ученых. - СПб.: Изд-во СПбГМУ, 2012. - С. 148-149.

11. Щулькин A.B. Изучение антигипоксического и антиишемического действия фитоэкдистерона / A.B. Щулькин // Материалы III Междунар. (X итоговой) науч.-практ. конф. молодых ученых. - Челябинск: Изд-во «Челябинская государственная медицинская академия», 2012. - С. 399-401.

12. Щулькин A.B. Изучение метаболической и антиоксидантной активности фитоэкдистерона в эксперименте / A.B. Щулькин, В.В. Давыдов, E.H. Якушева, В.Н. Дармограй // Актуальные вопросы медицинской биохимии: сб. науч. тр. по материалам Всерос. науч.-практ. конф. «Биохимические научные чтения памяти академика РАН Е.А. Строева». - Рязань: РИО РязГМУ, 2012.-С. 137-140.

13. Щулькин A.B. Исследование антиоксидантной активности фитоэкдистерона в опытах in vitro и in vivo / A.B. Щулькин // Материалы IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». - М.: Фолиум, 2012.-С. 203.

Научное издание

ЩУЛЬКИН Алексей Владимирович

АНТИГИПОКСИЧЕСКОЕ И АНТИИШЕМИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ФИТОЭКДИСТЕРОНА И МЕХАНИЗМЫ ЕГО РАЗВИТИЯ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология 14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Печатается на коммерческой основе за счет средств автора (Договор №18).

Сдано в печать 22.12.2012. Бумага писчая. Гарнитура Times. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,75. Тираж 100 экз. Заказ № 3352.

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации 390026, г. Рязань, ул. Высоковольтная, 9

Отпечатано в редакционно-издательском отделе ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России 390026, г. Рязань, ул. Т. Шевченко, 34

 
 

Оглавление диссертации Щулькин, Алексей Владимирович :: 2013 :: Санкт-Петербург

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Основные сведения о патогенезе гипоксии.

1.1.1. Гипоксия - типовой патологический процесс.

1.1.2. Патогенез вторичной тканевой гипоксии.

1.2. Основы теории свободно-радикальной патологии.

1.2.1. Роль кислорода в жизни клеток и тканей.

1.2.2. Активные формы кислорода.

1.2.3. Источники активных форм кислорода в физиологических условиях.

1.2.4. Свободнорадикальное окисление биомолекул.

1.2.5. Образование активных форм кислорода при гипоксии.

1.2.6. Антиоксидантная система защиты организма.

1.2.7. Антиоксидантные препараты.

1.3. Роль лизосомального фермента катепсина Б в норме и при патологии.

1.3.1. Лизосомы - внутриклеточные органеллы.

1.3.2. Катепсин Б и его роль в жизни клеток.

1.4. Основы фармакологии экдистероидов.

1.4.1. Краткие сведения об экдистероидах.

1.4.2. Механизм действия экдистероидов.

1.4.3. Основные эффекты экдистероидов на организм млекопитающих.

1.4.4. Влияние экдистероидов на процессы свободнорадикального окисления и состояние лизосомальных мембран.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

 
 

Введение диссертации по теме "Фармакология, клиническая фармакология", Щулькин, Алексей Владимирович, автореферат

2

2.2. Схема эксперимента.49

2.3. Моделирование острой гипоксической гипоксии.52

2.4. Исследование морфологических изменений при тотальной ишемии миокарда.53

2.5. Модельные системы для изучения антиоксидантной активности in vitro.54

2.6. Биохимические методы исследования.58

2.7. Методы статистического анализа полученных результатов.65

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.67

3.1. Влияние фитоэкдистерона на резистентность крыс к тяжелой острой гипоксической гипоксии.67

3.2. Влияние фитоэкдистерона на морфологические изменения в миокарде при тотальной ишемии.71

3.3. Исследование прямой антиоксидантной активности фитоэкдистерона in vitro.77

3.3.1. Влияние фитоэкдистерона на аутоокисление кверцетина и адреналина in vitro.77

3.3.2. Влияние фитоэкдистерона на железоиндуцируемое аскорбат-зависимое ПОЛ.80

3.3.3. Влияние фитоэкдистерона на железоиндуцируемое НАДФН2-зависимое ПОЛ.83

3.4. Исследование антиоксидантной активности фитоэкдистерона in vivo.86

3.4.1. Влияние фитоэкдистерона на концентрацию МДА в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.86

3.4.2. Влияние фитоэкдистерона на уровень безбелковых SH-групп в мозге, миокарде и печени крыс при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.87

3.4.3. Влияние фитоэкдистерона на уровень белковых 8Н-групп в мозге, миокарде и печени крыс при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.89

3.4.4. Влияние фитоэкдистерона на общую емкость антиокси-дантной системы в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.91

3.4.5. Влияние фитоэкдистерона на активность супероксид-дисмутазы в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.98

3.4.6. Влияние фитоэкдистерона на активность каталазы в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.100

3.4.7. Влияние фитоэкдистерона на активность глутатион-Б-трансферазы в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.102

3.4.8. Влияние фитоэкдистерона на активность глутатион-редуктазы в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.103

3.4.9. Влияние фитоэкдистерона на активность глутатион-пероксидазы в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.105

3.5. Влияние фитоэкдистерона на общую активность катепсина О в мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.107

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.109

ВЫВОДЫ.119

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.121

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.122

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДФ — аденозиндифосфат АМФ — аденозинмонофосфат АОС — антиоксидантная система АТФ — аденозинтрифосфат АФК — активные формы кислорода Вит Е — витамин Е

ГАМК - гамма-аминомасляная кислота

ГПТБ — гидроперекись третбутила

ДАТ - диацилглицерол

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ИЛ-3 — интерлейкин 3

ИФЗ -инозитол-1,4,5-трифосфат

МД - милдронат

M ДА - малоновый диальдегид мРНК — матричная рибонуклеиновая кислота

НАД - никотинамид-аденин-динуклеотид

НАДН2 — никотинамид-аденин-динуклеотид восстановленный

НАДФ — никотинамид-аденин-динуклеотид фосфат

НАДФН2 - никотинамид-аденин-динуклеотид фосфат восстановленный

ОГГ - острая гипоксическая гипоксия

ПОЛ - перекисное окисление липидов

CoQ - коэнзинм Qio

СОД - супероксиддисмутаза

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ТМЭД — тетраметилэтилендиамин

ФИФ2 — фосфатидилинозитол-дифосфат

ФИФЗ — фосфатидилинозитол-трифосфат

ФЭ — фитоэкдистерон

ХДНБ - хлординитробензол цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

Akt - протеинкиназа В

DTNB — 5,5-дитиобис(2-нитробензоат)

G-per - глутатионпероксидаза

G-red - глутатионредуктаза

GSH - глутатион восстановленный

GSSG - глутатион окисленный

G-tr — глутатион-Б-трансфераза

HIF - фактор, индуцируемый гипоксией

М - среднее арифметическое значение m - стандартная ошибка среднего арифметического значения SH-группы - сульфгидрильные группы

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Экдистероиды - это липофильные полигидроксилированные стероиды, участвующие в жизнедеятельности большинства живых организмов. Они обнаружены во всех главных типах высших растений: папоротникообразных, голосеменных и покрытосеменных (фитоэкдистероиды); грибах (микоэкдистероиды); организме насекомых, ракообразных, нематод (зооэкдистероиды) [ 183, 231 ].

Химический синтез экдистероидов - осуществим, но весьма дорог, поэтому главным источником их промышленного получения являются растения. Основными экдистероидсодержащими растениями принято считать: Якаропйсит саПкато1йе8 (левзея сафлоровидная, рапонтикум или маралий корень), БеггШиШ согопШа Ь. (серпуха венценосная), БИепе (смолевки) и некоторые другие. Однако, биологическая активность проявляется у незначительной части видов, что скорее всего связано с присутствием в растениях большого числа слабоактивных или неактивных фитоэкдистероидов [231].

Являясь у насекомых гормонами линьки, у млекопитающих экдистероиды выполняют регуляторные функции и оказывают разнообразные биологические эффекты [183, 107]. Выделяют следующие основные виды действия: анаболическое [220], актопротекторное [141], иммуномодулирующее [141], антигипергликемическое [141, 143], нейропротекторное [152], кардиопротекторное [143] и ряд других.

Установлено, что свое действие в организме насекомых экдистероиды реализуют через специфические рецепторы, являющиеся членами ядерного суперсемейства рецепторов [186]. Их структура сходна со структурой других рецепторов стероидных гормонов (глюкокортикостероидов, половых гормонов, витамина Б3 иретиноидов) [153].

В организме млекопитающих экдистероидные рецепторы до сих пор не найдены, и механизмы реализации их эффектов окончательно не 7 установлены [183]. Предполагается, что они могут встраиваться в липидный мембранный бислой, изменяя структуры окружающих белков [246], регулировать функционирование системы вторичных посредников [183, 220] и модулировать активность рецепторов [215].

Гипоксия - типовой патологический процесс, лежащий в основе патогенеза большинства заболеваний [90, 234]. Тяжесть течения и исход многих из них в конечном итоге определяются особенностями вторичных неспецифических метаболических расстройств, степенью дестабилизации клеточных мембран, а также возможностями реактивации структурных и ферментных белков в условиях гипоксии [113]. Поэтому в лекарственную терапию разнообразных заболеваний, сопровождающихся развитием гипоксии, входят антигипоксанты — вещества, повышающие адаптацию и резистентность организма к недостатку кислорода. Влияние экдистероидов на устойчивость организма к гипобарической гипоксической гипоксии в доступной научной литературе нами обнаружено не было.

В то же время, исследования, проведенные в 60-80-х гг. XX века показали, что в патогенезе наиболее распространенных заболеваний человека (патология сердечно-сосудистой, дыхательной, эндокринной систем, злокачественные новообразования) важную роль играют активные формы кислорода (АФК) [234]. Последние являются инициаторами реакций свободно-радикального окисления, которые, в свою очередь, вызывают окислительную модификацию липидов, белков, нуклеиновых кислот, что, в ходе развития патологического процесса, может приводить к гибели клетки по апоптотическому или некротическому механизмам [96]. Кроме того, было обосновано представление об общебиологической роли АФК, определенное количество которых образуется нейрохимическими и биоэнергетическими системами клетки в нормальных условиях, играя существенную роль в различных сторонах ее жизнедеятельности [6].

В последнее время активно изучается состояние лизосом и активность лизосомальных гидролаз при различных патогенных воздействиях [93]. Это 8 связано с тем, что была установлена важная роль лизосомальных ферментов в развитии не только некроза, но и апоптоза, опухолевого метастазирования и клеточной дифференцировки [179,191].

Таким образом, выявление у экдистероидов способности повышать резистентность организма к гипоксии, воздействовать на развитие свободно-радикальных реакций и снижать активность лизосомальных протеиназ может лежать в основе их биологической и фармакологической активности, а также последующего клинического применения.

Цель исследования

Изучить антигипоксическое и антиишемическое действие фитоэкдистерона, его влияние на развитие свободно-радикальных реакций и активность катепсина D в опытах in vitro и in vivo.

Задачи исследования

1. Изучить влияние фитоэкдистерона на резистентность беспородных белых крыс к тяжелой острой гипоксической гипоксии.

2. Исследовать действие фитоэкдистерона на морфологические изменения миокарда животных в условиях его острой тотальной ишемии.

3. Оценить прямую антиоксидантную активность фитоэкдистерона in vitro в сравнительном аспекте.

4. Изучить влияние фитоэкдистерона на выраженность окислительного стресса и состояние антиоксидантной системы при острой гипоксической гипоксии средней тяжести в головном мозге, миокарде и печени крыс.

5. Исследовать воздействие фитоэкдистерона на общую активность катепсина D при острой гипоксической гипоксии средней тяжести в головном мозге, миокарде и печени крыс.

6. Сравнить антигипоксическое, антиишемическое и антиоксидантное действие фитоэкдистерона и милдроната и их влияние на активность катепсина D.

Положения, выносимые на защиту

•Курсовое пероральное ежедневное введение фитоэкдистерона, выделенного из смолёвки поникшей {Silene nutans) и смолёвки татарской (Silene tatarica), в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней приводит к повышению резистентности белых крыс к тяжелой острой гипоксической гипоксии и повышает устойчивость кардиомиоцитов к тотальной ишемии.

•Фитоэкдистерон в опытах in vitro дозозависимо ингибирует железоиндуцируемое аскорбат- и НАДФН2-зависимое перекисное окисление липидов в гомогенатах мозга крыс.

•Профилактическое пероральное введение фитоэкдистерона в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней до воздействия гипоксической гипоксии средней тяжести приводит к снижению выраженности органных проявлений окислительного стресса в головном мозге, миокарде и печени крыс и уменьшению общей активности катепсина D в головном мозге и миокарде.

•По антигипоксическому, антиишемическому, антиоксидантному действию и по влиянию на общую активность катепсина D фитоэкдистерон сопоставим с препаратом метаболического действия - милдронатом.

Научная новизна

В работе впервые:

•установлена антигипоксическая активность фитоэкдистерона на модели тяжелой острой гипоксической гипоксии;

•выявлено антиишемическое и кардиопротекторное действие фитоэкдистерона при тотальной ишемии миокарда;

•установлена способность фитоэкдистерона ингибировать аскорбат- и НАДФНг-зависимое перекисное окисление липидов и стимулировать, в высоких концентрациях, генерацию супероксидного анион-радикала in vitro;

•выявлено, что применение фитоэкдистерона у крыс приводит к органоспецифическому снижению выраженности окислительного стресса в головном мозге, миокарде и печени при острой гипоксической гипоксии средней тяжести;

•установлена способность фитоэкдистерона снижать общую активность лизосомального фермента катепсина D в головном мозге и миокарде крыс при острой гипоксической гипоксии средней тяжести.

Практическая значимость работы

Антигипоксическое, антиишемическое, антиоксидантное действие фитоэкдистерона, выделенного из смолёвки поникшей {Silene nutans) и смолёвки татарской {Silene tatarica), и его способность снижать общую активность лизосомального фермента катепсина D по выраженности сопоставимы с эффектами милдроната.

В работе продемонстрирована относительная безопасность изученного вещества по его влиянию на биохимические показатели, характеризующие состояние оксидантной и антиоксидантной систем головного мозга, миокарда и печени интактных белых крыс.

Полученные результаты позволяют рекомендовать фитоэкдистерон для дальнейшего изучения в доклинических исследованиях, а также клинической практике в целях комплексной терапии гипоксических состояний и патологий, сопровождающихся развитием окислительного стресса и активацией лизосомальных протеиназ.

Внедрение результатов в практику

Основные положения работы используются в учебном процессе при обучении студентов, клинических интернов и ординаторов на кафедре

11 фармакологии с курсом фармации и фармакотерапии ФДПО, патофизиологии, фармакогнозии с курсом ботаники ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России.

Личное участие автора

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "АНТИГИПОКСИЧЕСКОЕ И АНТИИШЕМИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ФИТОЭКДИСТЕРОНА И МЕХАНИЗМЫ ЕГО РАЗВИТИЯ"

выводы

1. Курсовое пероральное ежедневное введение фитоэкдистерона, выделенного из смолёвки поникшей (<Silene nutans) и смолёвки татарской (iSilene tatarica), в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 и 14 дней приводит к повышению резистентности белых крыс к тяжелой острой гипоксической гипоксии.

2. Профилактическое пероральное ежедневное введение крысам фитоэкдистерона в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней повышает устойчивость кардиомиоцитов к тотальной ишемии.

3. В опытах in vitro в диапазоне концентраций 0,35-0,0035 мМ фитоэкдистерон дозозависимо ингибирует железоиндуцируемое аскорбат- и НАДФНг-зависимое перекисное окисление липидов в гомогенатах мозга крыс, а в высоких концентрациях (1,3 - 0,035 мМ) активирует образование супероксидного анион-радикала в модельных системах аутоокисления адреналина и кверцетина. По способности подавлять железоиндуцируемое аскорбат-зависимое перекисное окисление липидов фитоэкдистерон сопоставим с антиоксидантом кудесаном, а по влиянию на железоиндуцируемое НАДФН2-зависимое перекисное окисление липидов уступает ему.

4. Ежедневное назначение интактным крысам фитоэкдистерона per os в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней вызывает увеличение активности глутатионпероксидазы в мозге, повышение активности каталазы и уменьшение содержания малонового диальдегида в печени.

5. Развитие острой гипоксической гипоксии сопровождается активацией процессов перекисного окисления липидов в мозге, миокарде и печени крыс и повышением активности катепсина D в мозге и миокарде.

6. Профилактическое пероральное введение фитоэкдистерона в дозе 5 мг/кг массы в течение 7 дней до воздействия гипоксической гипоксии средней тяжести приводит к органоспецифическому снижению выраженности окислительного стресса, которое характеризуется уменьшением концентрации малонового диальдегида, увеличением уровня сульфгидрильных групп и активности антиоксидантных ферментов в головном мозге, миокарде и печени и вызывает снижение общей активности катепсина D в головном мозге и миокарде.

7. По антигипоксическому, антиишемическому, антиоксидантному действию и по влиянию на общую активность катепсина D в опытах in vivo фитоэкдистерон сопоставим с препаратом метаболического действия -милдронатом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные результаты позволяют рекомендовать фнтоэкдистерон для дальнейшего изучения в доклинических исследованиях, а также в клинической практике в целях комплексной терапии гипоксических состояний, ишемии миокарда, патологий, сопровождающихся развитием окислительного стресса и повышением активности лизосомальных протеиназ.

2. Наличие у фитоэкдистерона способности катализировать реакции образования супероксидного анион-радикала позволит создавать на его основе новые модельные системы для изучения антисупероксидной активности лекарственных препаратов in vitro.

 
 

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2013 года, Щулькин, Алексей Владимирович

1. Алексеенко Л.П. Определение активности протеиназ по расщеплению белковых субстратов / Л.П. Алексеенко // Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1968. - Т.2. - С. 112-137.

2. Андреев А.Ю. Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях / А.Ю. Андреев, Ю.Е. Кушнарева, A.A. Старков // Биохимия. -2005. Т.70, №2. - С. 246-264.

3. Артюхов В.Г. Биологические мембраны (структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами) / В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина. Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 2000. - 296 с.

4. Арутюнян A.B. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма / A.B. Арутюнян, Е.Е. Дубинина, H.H. Зыбина; под ред. В.Х. Хавинсона. СПб.: Б.и., 2000. - 103 с.

5. Арчаков А.И. Микросомальное окисление / А.И. Арчаков. М.: Наука, 1975.-С. 76-77.

6. Беленичев И.Ф. Сигнальная роль активных форм кислорода в регуляции физиологических функций / И.Ф. Беленичев, О.В. Ганчева // Патология. 2004. - Т.1, №1. - С. 4-9.

7. Бобков Ю.Г. Методологические подходы к поиску фармакологических средств, эффективных при гипоксии и ишемии мозга / Ю.Г. Бобков, И.А. Иванова // Патол. физиология и эксперим. терапия. 1987.- №6. С. 13-19.

8. Болдырев A.A. Роль активных форм кислорода в жизнедеятельности нейрона / A.A. Болдырев // Успехи физиол. наук. — 2003.- Т.34, №3. С. 21-34.

9. Бондарь Т.Н. Восстановление органических гидроперекисей глутатионпероксидазой и глутатион-8-трансферазой: влияние структурысубстрата / Т.Н. Бондарь, В.З. Ланкин, В.Л. Антоновский // Докл. АН СССР. 1989. - Т.304, №1. - С. 217-220.

10. Видаль специалист. Справочник «Кардиология». М.: АстраФармСервис, 2008. - 886 с.

11. Виноградов А. Д. Генерация супероксид-радикала ИАОНгубихинон-оксидоредуктазой митохондрий сердца / А.Д. Виноградов, В.Г. Гривенникова // Биохимия. 2005. - Т.70, №2. - С. 150-159.

12. Виноградов В.М. Гипоксия как фармакологическая проблема / В.М. Виноградов, О.Ю. Урюпов // Фармакология и токсикология. 1985. -Т.48, №4. — С. 9-20.

13. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. — М.: Наука, 1972.-252 с.

14. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты / Ю.А. Владимиров // Вестн. РАМН. 1998. - №7. - С. 43-51.

15. Влияние неробола и экдистерона на некоторые связанные инсулинзависимые процессы в норме и при инсулинорезистентности / М.И. Косовский и др. // Пробл. эндокринологии. 1989. - Т.35, №5. - С. 77-81.

16. Влияние прекондиционирования умеренной гипобарической гипоксией на экспрессию Мп-супероксиддисмутазы в гиппокампе крыс / С.А. Строев и др. // Нейрохимия. 2007. - Т.24, №3. - С. 218-223.

17. Влияние экдистерона на показатели половой функции в эксперименте и клинических условиях / Ю.Р. Мирзаев и др. // Эксперим. и клинич. фармакология. 2000. - Т.63, №4. - С. 35-37.

18. Волыхина В.Е. Супероксиддисмутазы: структура и свойства /

19. B.Е. Волыхина, Е.В. Шафрановская // Вестн. ВГМУ. 2009. - Т.8, №4. - С. 118.

20. Второй шанс (современные представления об энергокоррекции) /

21. C.А. Румянцева и др..- М.: МИГ «Медицинская книга», 2011. — 176 с.

22. Гаврилова В.Б. Анализ методов определения продуктов ПОЛ /

23. B.Б. Гаврилова, А.Р. Гаврилова, JIM. Мазул // Вопр. мед. химии. 1987. -№1. - С.118-120.

24. Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция: VI Российская конференция с международным участием (11-13 октября 2011 г.): материалы / редкол.: Л.Д. Лукьянова и др. // Патогенез. 2011. - Т.9, №3. - С.75.

25. Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция: Всероссийская конференция (2-4 декабря 1997 г.): материалы / ред. кол.: Л.Д. Лукьянова и др.. -М.: БЭБиМ, 1997. 151 с.

26. Гланц С. Медико-биологическая статистика: пер. с англ. / С. Гланц. М.: Практика, 1998. - 459 с.

27. Горанчук В.В. Гипокситерапия / В.В. Горанчук, Н.И. Сапова, А.О. Иванов. СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2003. - 563 с.

28. Гордеев И.Г. Коррекция дисфункции миокарда у больных стабильной стенокардией, подвергшихся коронарной реваскуляризации, на фоне приема цитопротектора милдроната / И.Г. Гордеев, Е.Е. Лучинкина,

29. C.B. Хегай // Рос. кардиол. журн. 2009. - №2(76). - С. 54-58.

30. Грек O.P. Гипобарическая гипоксия и метаболизм ксенобиотиков / O.P. Грек, A.B. Ефремов, В.И. Шарапов. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 120 с.

31. Гуцол A.A. Практическая морфометрия органов и тканей / A.A. Гуцол, Б.Ю. Кондратьев. Томск, 1988. - 121 с.

32. Данилова K.M. Морфологические тесты стресс реакции в миокарде человека / K.M. Данилова // Арх. патологии. - 1963. - №7. - С. 4248.

33. Дармограй В.Н. Фармакогностическое изучение некоторых видов семейства гвоздичных и перспективы использования их в медицинской практике: дис. в виде науч. докл. . д-ра фарм. наук / В.Н. Дармограй. — Рязань, 1996.-91 с.

34. Действие интервальной нормобарической гипоксии на кинетические свойства митохондриальных ферментов / Л.Д. Лукьянова и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2007. - Т. 144, №12. - С. 644652.

35. Друзья или враги. Активные формы кислорода и азота / Д.Б. Зоров и др. // Биохимия. 2005. - Т.70, №2. - С. 265-272.

36. Дубинина Е.Е. Антиоксидантная система плазмы крови / Е.Е. Дубинина // Укр. биохим. журн. 1992. - Т.64, №2. - С. 3-15.

37. Дудченко A.M. Влияние адаптации к периодической гипоксии на кинетические параметры ферментов дыхательной цепи мозга крыс / A.M. Дудченко, Л.Д. Лукьянова // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 1996. -Т. 121, №3. С. 252-255.

38. Ерин А.Н. Свободнорадикальные механизмы в церебральных патологиях / А.Н. Ерин, Н.В. Гуляева, Е.В. Никушкин // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1994. - Т.118, №10. - С. 343-348.

39. Зайцев В.Г. Связь между химическим строением и мишенью действия как основа классификации антиоксидантов прямого действия / В.Г. Зайцев, О.В. Островский, В.И. Закревский // Эксперим. и клинич. фармакология. 2003. - Т.66, №4. - С. 66-70.

40. Зарубина И.В. Адаптивные эффекты трекрезана при импульсной гипоксической тренировке / И.В. Зарубина, Т.В. Павлова // Психофармакология и биол. наркология. 2007. - Т.7, №1. - С. 1431 - 1435.

41. Зарубина И.В. Молекулярная фармакология антигипоксантов / И.В. Зарубина, П.Д. Шабанов. СПб.: ООО «Изд-во H-JI», 2004. - 368 с.

42. Зборовская И. А. Антиоксидантная система организма, ее значение в метаболизме. Клинические аспекты / И.А. Зборовская, М.В. Банникова // Вестн. РАМН. 1995. - №6. - С. 53-60.

43. Зенков Н.К. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах / Н.К. Зенков, Е.Б. Меньшикова // Успехи совр. биологии.- 1993.-Т.113,№3.-С. 286-296.

44. Зенков Н.К. Окислительный стресс. Биохимические и патофизиологические аспекты / Н.К. Зенков, В.З. Ланкин, Е.Б. Меньшикова. М.: Наука Интерпериодика, 2001. - 343 с.

45. Зенков Н.К. Особенности развития окислительного стресса при патологиях нервной системы / Н.К. Зенков, Е.Б. Меньшикова // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1994. - Т.113, №2. - С. 207.

46. Иванов К.П. Транспорт кислорода в тканях мозга в норме и при гипоксемии / К.П. Иванов // Оксибиотические и аноксибиотические процессы при экспериментальной и клинической патологии. Киев, 1975. - С. 94-95.

47. Кальвинып И .Я. Милдронат — механизм действия и перспективы его применения / И.Я. Кальвинып. Рига: Б.И., 2002. - 39 с.

48. Колесниченко Л.С. Глутатионтрансферазы / Л.С. Колесниченко, В .И. Кулинский // Успехи совр. биологии. 1989. - Т. 107, №2. - С. 179-194.

49. Колесова O.E. Перекисное окисление липидов и методы определения продуктов липопероксидации в биологических средах / O.E. Колесова, A.A. Маркин, Т.Н. Федорова // Лаб. Дело. 1984. - №9. - С. 540546.

50. Колчинская А.З. Дыхание при гипоксии / А.З. Колчинская // Физиология дыхания / отв. ред. И.С. Бреслав, Г.Г. Исаев. СПб.: Наука, 1994.-С. 589-624.

51. Колчинская А.З. Кислородная недостаточность, деструктивное и конструктивное действие / А.З. Колчинская, Б.Х. Хацуков, М.П. Закусило. -Нальчик, 1999.-207 с.

52. Контроль перекисного окисления липидов / В.Н. Ушкалова и др.. Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та., 1993. - 182 с.

53. Коржов В.И. Роль системы глутатиона в процессах детоксикации и антиоксидантной защиты (обзор литературы) / В.И. Коржов, В.Н. Жадан, М.В. Коржов // Журн. АМН Укршни. 2007. - Т. 13, №1. - С. 3-19.

54. Костюк В.А. Биорадикалы и биоантиоксиданты / В.А. Костюк, А.И. Потапович. Минск: БГУ, 2004. - 179 с.

55. Костюк В.А. Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцитина / В.А. Костюк, А.И. Потапович, Ж.В. Ковалева // Вопр. мед. химии. 1990. - Т.36, №2. - С. 88-91.

56. Коэнзим (^10: длительное введение и отмена / Е.И. Каленикова и др. // Фармация. 2009. - №2. - С. 42-45.

57. Критические состояния в клинической практике / С.А. Румянцева и др.. М.: МИГ «Медицинская книга», 2011. - 752 с.

58. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита / В.И. Кулинский // Соросовский образовательный журн. 1999. — №1. - С. 2-7.

59. Кулинский В.И. Биологическая роль глутатиона / В.И. Кулинский, Л.А. Колесниченко // Успехи совр. биологии. 1990. - №.114. -С. 20-33.

60. Кулинский В.И. Структура, свойства, биологическая роль и регуляция глутатионпероксидазы / В.И. Кулинский, JI.C. Колесниченко // Успехи совр. биологии. 1993. - Т. 113, № 1. - С. 107-122.

61. Курмуков А.Г. О противовоспалительных свойствах экдистерона / А.Г. Курмуков, В.Н. Сыров // Мед. журн. Узбекистана. 1988. - №10. - С. 68-70.

62. Ланкин В.З. Метаболизм липоперекисей в тканях млекопитающих / В.З. Ланкин // Биохимия липидов и их роль в обмене веществ. М.: Наука, 1981. - С. 75-95.

63. Ланкин В.З. Свободнорадикальные процессы в норме и при заболеваниях сердечно сосудистой системы / В.З. Ланкин, А.К. Тихазе, Ю.Н. Беленков. - М.: РКНПК МЗ РФ, 2001. - 78 с.

64. Лопухин Ю.М. Критерии жизнеспособности органов и тканей перед трансплантацией / Ю.М. Лопухин, Э.М. Коган. М.: Медицина, 1975. - 282 с.

65. Лукиенко П.Е. Последствия индукции цитохрома Р-450 (обзор) / П.Е. Лукиенко, Л.Б. Заводник, М.И. Бушма // Эксперим. и клинич. фармакология. 1995. - Т.58, №1. - С. 68-73.

66. Лукьянова Л. Д. Биоэнергетическая гипоксия: понятие, механизмы и способы коррекции / Л.Д. Лукьянова // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1997. - Т. 124, №9. - С. 244-254.

67. Лукьянова Л.Д. Влияние различных концентраций кислорода на содержание АТФ в изолированных гепатоцитах адаптированных и неадаптированных к гипоксии крыс / Л.Д. Лукьянова, A.M. Дудченко, В.В.

68. Белоусова II Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1994. - №12. - С. 576580.

69. Лукьянова Л.Д. Кислородзависимые процессы в клетке и ее функциональное состояние / Л.Д. Лукьянова, Б.С. Балмуханов, А.Г. Уголев. -М.: Б.И., 1982.-301 с.

70. Лукьянова Л. Д. Функционально-метаболические критерии адаптации к гипоксии / Л.Д. Лукьянова // Эколого-физиологические проблемы адаптации. М., 1998. - 234 с.

71. Магомедов Н.М. Перекисное окисление липидов в структурно-функциональных нарушениях различных мембран при гипоксии и ишемии: автореф. дис. . д-ра мед. наук. / Н.М. Магомедов. М.: Б.И., 1993. — 38 с.

72. Макарова В.Г. Активность лизосомальных ферментов при ИБС / В.Г. Макарова, Е.А. Строев, A.B. Бороздин // ИБС и артериальные гипертензии: сб. науч. тр. Рязань: Б.И., 1992. - С. 75-79.

73. Макроэргические фосфаты как показатель оценки степени тяжести гипоксии мозга / Е.М. Хватова и др. // Моделирование, патогенез и терапия гипоксических состояний. Горький: Б.И., 1989. - С. 4-10.

74. Матвеев А.Г. Феномен цитотоксичности и механизмы повреждения нейронов новой коры при гипоксии и ишемии / А.Г. Матвеев // Pacific Med. J. 2004. - №2. - P. 18-23.

75. Матвеева И.В. Роль протеолитических ферментов в механизме действия инсулина / И.В. Матвеева // Биохимия на рубеже 21 века: межрегион, сб. науч. тр. Рязань: РязГМУ, 2000. - С. 98-112.

76. Маянский А.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге / А.Н. Маянский, Д.Н. Маянский. Новосибирск: Наука, 1983.-264 с.

77. Меерсон Ф.З. Адаптация, дезадаптация и недостаточность сердца / Ф.З. Меерсон. М.: Медицина, 1977. - 344 с.

78. Механизм образования супероксидного радикала при взаимодействии Ь-лизина с дикарбонильными соединениями / К.Б. Шумаев и др. // Биохимия. 2009. - №74(4). - С. 568-74.

79. Мид Дж. Свободно-радикальные механизмы повреждения липидов и их значение для клеточных мембран / Дж. Мид // Свободные радикалы в биологии: в 2 т.: пер с англ. / под ред. У. Прайора. М.: Мир, 1979. - Т. 1. - С. 68-87.

80. Милдронат в кардиологической практике — итоги, новые направления, перспективы / В.П. Михин и др. // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2012. -№11(1). - С. 95-102.

81. Михин В.П. Перспективы применения милдроната у больных сердечно-сосудистой патологией / В.П. Михин, Ф.Е. Хлебодаров // Рос. кардиол. журн. 2010. - №4 (84). - С. 83-92.

82. Некоторые метаболические и патофизиологмческие корреляции при экспериментальной ишемии мозга / В.П. Бархатова и др. // Фармакологическая коррекция гипоксических состояний: материалы конференции. Гродно: Б.И., 1991. - 4.2. - С. 280-281.

83. Никулин С.Е. Изменение активности лизосомальных ферментов в печени крыс при экстремальных состояниях и возможные пути коррекции: автореф. дис. канд. биол. наук / С.Е. Никулин. М. 1989. - 24 с.

84. Никушкин Е.В. Перекисное окисление липидов в ЦНС в норме и при патологии / Е.В. Никушкин // Нейрохимия. 1989. - Т.8, №1 - С. 124145.

85. Новиков В.Е. Фармакология и биохимия гипоксии / В.Е. Новиков, Н.П. Катунина // Обзоры по клинич. фармакологии и лекарств, терапии. 2002. - Т.1, №2. - С. 73-87.

86. Овсянникова Е.Ю. Роль гликолиза и восстановления фумарата в сукцинат в механизме адаптации организма к гипоксии у млекопитающих / Е.Ю. Овсянникова, С.А. Козлов, Ю.В. Зиновьев // Космич. биология и авиакосмич. медицина. 1978. - Т. 12, №1. - С. 88-91.

87. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меньшикова и др.. М.: Слово, 2006. - 576 с.

88. Оксидативный стресс в генезе акушерских осложнений / JI.B. Ванько и др. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 264 с.

89. Окуневич И.В. Антиоксиданты: эффективность природных и синтетических соединений в комплексной терапии сердечно-сосудистых заболеваний / И.В. Окуневич, Н.С. Сапронов // Обзоры по клинич. фармакологии и лекарств, терапии. 2004. - Т.З, №3. - С. 2-17.

90. Панченко А.Ф. Роль пероксисом в патологии клетки / А.Ф. Панченко, A.M. Герасимов, В.Д. Антоненков. М.: Медицина, 1981. - 207 с.

91. Патология: учебник: в 2 т. / под ред. В.А. Черешнева и В.В. Давыдова. М.: Изд-во «ГЭОТАР-МЕДиа», 2009. -Т.1.-608 е.; Т.2. - 640 с.

92. Покровский A.A. Лизосомы / A.A. Покровский, В.А. Тутельян. М.: Наука, 1976.-382 с.

93. Противолучевые свойства экдистероидсодержащих препаратов / О.Г. Шевченко и др. // Радиац. биология и радиоэкология. 2007. - Т.47, №4.-С. 501-508.

94. Пупышев А.Б. Пермеабилизация лизосомных мембран как апоптогенный фактор / А. Б. Пупышев // Цитология. 2011. - Т.53, №4. - С. 313-324.

95. Пчеленко Л.Д. Адаптогенный эффект экдистероидсодержащей фракции Serratula coronata L. / Л.Д. Пчеленко, Л.Г. Метелкниа, С.О.

96. Володина // Химия растит, сырья. 2002. - №1. - С. 69-80.

97. Регуляция карнитин-зависимого метаболизма жирных кислот в миокарде у крыс при использовании 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионата / Ж.В. Шутенко и др. // Вопр. мед. химии. 1989. - №35(2). - С. 59-64.

98. Румянцева С.А. Патофизиологическая основа комплексной нейропротекции при ишемии мозга / С.А. Румянцева, В.В. Афанасьев, Е.В. Силина // Журн. неврологии и психиатрии им. Корсакова 2009. - №3. - С. 64-68.

99. Свободнорадикальные процессы в биосистемах: учебное пособие / Т.Н. Попова и др.. Воронеж: ИПК «Кириллица», 2008. - 192 с.

100. Селье Г. Профилактика некрозов сердца химическими средствами / Г. Селье. М.: Медгиз, 1961. - 321 с.

101. Середенин С.Б. Лекции по фармакогенетике / С.Б. Середенин. -М.:МИА, 2004.-303 с.

102. Сирота Т.В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использование его для измерения активности супероксиддисмутазы / Т.В. Сирота // Вопр. мед. химии. 1999. - №3. - С. 45-52.

103. Скворцов Ф.Ф. Опыт применения окраски миокарда по методу Г. Селье при скоропостижной смерти от сердечной недостаточности / Ф.Ф. Скворцов // Судеб. мед. экспертиза. - 1965. - Т. 8, №4. - С.51-52.

104. Смирнов A.B. Антигипоксанты в неотложной медицине / A.B. Смирнов, Б.И. Криворучко // Анестезиология и реаниматология. 1998. -№2. - С. 50-55.

105. Стальная И.Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью 2-тиобарбитуровой кислоты / И.Д. Стальная // Современные методы в биохимии. М.: Б.И., 1977. - С.66-68.

106. Сыров В.Н. Анаболические эффекты фитоэкдизона, туркестерона и туркестерона тетраацетата в эксперименте на крысах / В.Н. Сыров, А.Г. Курмуков // Пробл. эндокринологии. 1976. -№3. - С. 107-112.

107. Сыров В.Н. Фитоэкдистероиды: биологические эффекты в организме высших животных и перспективы использования в медицине / В.Н. Сыров // Эксперим. и клинич. фармакология. -1994. № 5. - С. 61-66.

108. Сысолятина H.A. Влияние бета-адренергических средств на лизосомы миокарда: дис. . д-ра мед. наук / H.A. Сысолятина. М.: Б.И., 1991.-243 с.

109. Усиление антикетогенного эффекта экзогенной глюкозы с помощью нового ингибитора бета-окисления — милдроната / Ж.В. Шутенко и др. // Вопр. мед. химии. 1991. - №37(2). - С. 59-60.

110. Фитоэкдистероиды (естественные синтоксины) как модуляторы адаптивных программ организма при действии раздражителей внешней и внутренней среды / В.Н. Морозов и др.. Тула.: Изд-во ТулГУ, 2006. — 54 с.

111. Хватова Е.М. Метаболизм острой гипоксии / Е.М. Хватова, Н.В. Мартынов. Горький: Волго-Вятское изд-во, 1977. - 160 с.

112. Чеснокова Н.П. Молекулярно-клеточные механизмы цитотоксического действия гипоксии. Патогенез гипоксического некробиоза / Н.П. Чеснокова, Е.В. Понукалина, М.Н. Бизенкова // Современные наукоемкие технологии. 2006. - №7. - С. 31-38.

113. Чеснокова Н.П. Современные представления о патогенезе гипоксий. Классификация гипоксий и пусковые механизмы их развития / Н.П. Чеснокова, Е.В. Понукалина, М.Н. Бизенкова // Современные наукоемкие технологии. 2006. - №5. - С. 23-27.

114. Шаповал Г.С. Механизмы антиоксидантной защиты организма при действии активных форм кислорода / Г.С. Шаповал, В.Ф. Громовая // Укр. биохим. журн. 2003. - Т.75, №2. - С.5-13.

115. Alterations in rat lipid metabolism following ecdysterone treatment / R.E. Catalán et al. // Сотр. Biochem. Physiol. B. 1985. - Vol. 81, №3. - P. 771-775.

116. Amanso A.M. Differential roles of NADPH oxidases in vascular physiology and pathophysiology / A.M. Amanso, K.K. Griendling // Front. Biosc. -2012.-Vol. 1, №4. P. 1044-1064.

117. Antioxidant effect of 20-hydroxyecdysone in a model system / A.I. Kuz'menko et al. // Ukr. Biokhim. Zh. 1999. - Vol. 71, №3. - P.35-38.

118. Antioxidant mechanisms of isoflavones in lipid systems: paradoxical effects of peroxyl radical scavenging / R.P. Patel et al. // Free Radical Biol. Med. -2001.-Vol.31.-P. 1570-1581.

119. Aspartic proteases in drug discovery / J. Eder et al. // Curr. Pharm. Des.-2007.-Vol. 13.-P. 271-285.

120. Benes P. Cathepsin D — many functions of one aspartic protease / P. Benes, V. Vetvicka, M. Fusek // Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2008. - Vol. 68, №1. -P. 12-28.

121. Berlett B.S. Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress / B.S. Berlett, E.R. Stadtman // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272. - P. 2031320316.

122. Berridge MJ. The versatility and universality of calcium signaling / M.J. Berridge, P. Lipp, M.D. Bootman // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2000. - Vol. 1, №1. -P. 11-21.

123. Bongarzone E.R. Oxidative damage to proteins and lipids of CNS myelin produced by in vitro generated reactive oxygen species / E.R. Bongarzone, J.M. Pasquini, E.F. Soto // J. Neurosc. Res. 1995. - Vol. 41, №2. - P. 213-221.

124. Bors W. The involment of oxygen radicals during the autooxident of adrenaline / W. Bors // Biochem. Biophys. Acta. 1978. - Vol. 250, №1. - P. 162172.

125. Brain glucose metabolism in hypobaric hypoxia / S.L. Harik et al. // J. Appl. Physiol. 1995. - Vol. 79, №1. - P. 136-140.

126. Brann D.W. Emerging diversities in the mechanism of action of steroid hormones / D.W. Brann, L.B. Hendry, V.B. Mahesh // J. of Steroid Bioch. and Mol. Biol. 1995. - Vol. 52. - P. 113-133.

127. Broker L.E. Cell death independent of caspases: a review / L.E. Broker, F.A. Kruyt, G. Giaccone // Clin. Cancer. Res. 2005. - Vol. 11. - P. 31553162.

128. Calcium channel antagonist induced inhibition of superoxide production in human neutrophils / K. Irita et al. // Biochem. Pharmacol. 1986. -Vol. 35.-P. 3465-3471.

129. Carbery J. Purification and characterization of the flavoenzyme, glutathione reductase from rat liver / J. Carbery, B. Maunervik // J. Biol. Chem. -1975. Vol. 250, №14. - P. 5425-5480.

130. Casalino E. A possible mechanism for initiation of lipid peroxidation by ascorbate in rat microsomes / E. Casalino, C. Sblano, C. Landriscina // Int. J. Biochem. and Cell Biol. 1996. - Vol. 28, №2. - P. 137-149.

131. Cathepsin D and apoptosis related proteins are elevated in the brain of autistic subjects / A.M. Sheikh et al. // Neuroscien. 2010. - Vol. 165, №2. - P. 363-370.

132. Cathepsin D-Bax death pathway in oxidative stressed neuroblastoma cells / R. Castino et al. // Free Radic. Biol, and Med. 2007. - Vol. 42. - P. 1305-1316.

133. Chambers D.E. Xanthine oxydase as a sourse of free radical damage in myocardial ischemia / D.E. Chambers, D.A. Parks, G.A. Patterson // J. Mol. Cell. Cardiol. 1985. - Vol. 17. - P. 145-152.

134. Characteristics of antioxidant properties of 20-hydroxyecdysone in low density lipoproteins by kinetic parameters of chemiluminescence / A.I. Kuz'menko et al. // Ukr. Biokhim. Zh. 1999. - Vol. 71, №6. - P.37-42.

135. Day B. J. Catalase and glutathione peroxidase mimics / B.J. Day // Bioch. Pharmacol. -2009. Vol. 77, №3. -P.285-296.

136. Decreased rat brain cytochrome oxidase activity after prolonged hypoxia / J.C. LaManna et al. // Brain Res. 1996. - Vol. 720, №1-2. - P. 1-6.

137. Dinan L. Phytoecdysteroids: biological aspects / L. Dinan // Phytochem. 2001. - Vol. 57. - P. 325-339.

138. Dinan L. The Karlson Lecture. Phytoecdysteroids: what use are they? / L. Dinan // Arch. Insect. Biochem. Physiol. 2009. - Vol. 72, №3. - P. 126-141.

139. Droge W. Free Radicals in the Physiological Control of Cell Function / W. Droge // Physiol. Rev. 2002. - №82. - P. 47-95.

140. Ecdysterone and its activity on some degenerative diseases / L. Cahlikovä et al. // Nat. Prod. Commun. 2011. - Vol. 6, №5. - P. 707-718.

141. Ecdysterone induces acetylcholinesterase in mammalian brain / R.E. Catalan et al. // Comp. Biochem. Physiol. C. 1984. - Vol. 78, №1. - P. 193195.

142. Effect of antioxidants on oxidative modification of LDL / H. Esterdaue et al. // Ann. Med. 1991. - Vol. 23. -P. 573-581.

143. Effects of hypoxia on muscle protein synthesis and anabolic signaling at rest and in response to acute resistance exercise / T. Etheridge et al. // AJP — Endo. 2011. - Vol. 301, №4. - P.697-702.

144. Effects of ischemia-reperfusion and pretreatment with mildronate on rat liver mitochondrial function / S. Trumbeckaite et al. // Pharmacol. Rep. 2009. - Vol. 61, №5. -P. 859-869.

145. Effects of long-term mildronate treatment on cardiac and liver functions in rat / E. Liepinsh et al. // Basic. Clin. Pharmacol. Toxicol. 2009. -Vol. 105, №6.-P. 387-389.

146. Ellman G.L. Tissue sulfhydiyl groups / G.L. Ellman // Archives of biochemistry and biophysics. 1959. - Vol. 82, №1. - P.70-77.

147. Eltzschig H.K. Hypoxia and inflammation / H.K. Eltzschig, P. Carmeliet // N. Engl. J. Med. 2011. - Vol. 364. - P. 656-665.

148. Engler R.L. Leucocyte plugging in myocardial ischemia and reperfusion in the dog / R.L. Engler, G.M. Schmid-Schonbeim, R.S. Paveles // Amer. J. Pathol. 1983. - Vol. 111. - P. 98-111.

149. Enhanced Angiogenesis and Astrocyte Activation by Ecdysterone Treatment in a Focal Cerebral Ischemia Rat Model / C. Luo et al. // Act. Neurochirurgica Suppl. 2011. - Vol. 110, №1 (Part II, Section V). - P. 151-155.

150. Evans R.M. The steroid and thyroid hormone receptor superfamily / R.M. Evans // Science. 1988. - Vol. 240. - P. 889-895.

151. Evolution of pharmacologic specificity in the pregnane X receptor / S. Ekins et al. // BMC Evol. Biol. 2008. - Vol. 8. - P. 103.

152. Ferrary R. The role of free radicals in the ischemic myocardium / R. Ferrary // Bratisl. Lek. List. 1991. - Vol. 92, №2. - P. 108-112.

153. Finkel T. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing / T. Finkel, N.J. Holbrook // Nature. 2000. - Vol. 408. - P. 239-247.

154. Flora S.J.S. Structural, chemical and biological aspects of antioxidants for strategies against metal and metalloid exposure / S.J.S. Flora // Oxid. Med. Cell. Longev. 2009. - Vol. 2, №4. - P. 191-206.

155. Free Radicals and Antioxidants in Cardiovascular Health and Disease / T. Bahorun et al. // Int.t J. Med. Upd. 2006. - Vol. 1, №2. - P. 182-195.

156. G protein-coupled time travel: evolutionary aspects of GPCR research / H. Rompler et al. // Mol. Interv. 2007. - Vol. 7. - P. 17-25.

157. Gao L. Beta-ecdysterone induces osteogenic differentiation in mouse mesenchymal stem cells and relieves osteoporosis / L. Gao, G. Cai, X. Shi // Biol Pharm. Bull. 2008. - Vol. 31, №12. - P. 2245-2249.

158. Giordano F.J. Oxygen, oxidative stress, hypoxia, and heart failure / F.J. Giordano // J. Clin. Invest. 2005. - Vol. 115, №3. - P. 500-508.

159. Girotti A. W. Lipid hydroperoxide generation, turnover, and effector action in biological systems / A.W. Girotti // J. Lipid Res. 1998. - Vol. 39. - P. 1529-1542.

160. Glutathione dysregulation and the etiology and progression of human diseases / N. Ballatori et al. // Biol. Chem. 2009. - Vol. 390, №3. - P. 191-214.

161. Glutathione peroxidase family an evolutionary overview / R. Margis et al. // FEBS J. - 2008. - Vol. 275, №15. - P. 3959-3970.

162. Glutathioneperoxidase 4 Senses and Translates Oxidative Stress into 12/15-Lipoxygenase Dependent- and AIF-Mediated Cell Death / A. Seiler et al. // Cell metab. 2008. - Vol. 8, №3. - P. 237-248.

163. Guarnieri C. Myocardial mitochondrial function in alpha-tocopherol deficient and refed rabbits / C. Guarnieri // Adv. Myocardiol. 1982. - Vol. 3, №2. -P.621-627.

164. Guicciardi M.E. Lysosomes in cell death / M.E. Guicciardi, M. Leist, G.J. Gores // Oncogene. 2004. - Vol. 23. - P. 2881-2890.

165. Hammond B. Oxygen radicals in the adult respiratory distress syndrome, in myocardial ischemia and reperfusion injury, and cerebral vascular damage / B. Hammond, H. Kontos, M. Hess // Canad. J. Physiol. Pharmacol. -1985.-Vol. 63.-P. 173-187.

166. Hasilik A. Biosynthesis of lysosomal enzymes in fibroblasts. Synthesis as precursors of higher molecular weight / A. Hasilik, E.F. Neufeld // J. Biol. Chem. 1980. - Vol. 255. - P. 4937-4945.

167. Hatagima A. Genetic polymorphisms and metabolism of endocrine disruptors in cancer susceptibility / A. Hatagima // Cad. Saud. Public. 2002. -Vol. 18.-P. 357—377.

168. Hayes J.D. Glutathione transferases / J.D. Hayes, J.U. Flanagan, I.R. Jowsey // Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2005. - Vol. 45. - P. 51-88.

169. Heart Protection Study Collaborative Group MRC/BHF // Lancet. -2002.-Vol. 360.-P. 23-33.

170. Herbette S. Seleno-independent glutathione peroxidases / S. Herbette, P. Roeckel-Drevet, J.R. Drevet // FEBS J. 2007. - № 274. - P. 21632180.

171. Hochachka P.W. Living without oxygen: Closed and open systems in hypoxia tolerace / P.W. Hochachka. Massachusetts; London, 1980. - 178 p.

172. Human breast milk contains procathepsin D-detection by specific antibodies / V. Vetvicka et al. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1993. - Vol. 30. - P. 921-928.

173. Hydrogen peroxide induces lysosomal protease alterations in PC 12 cells / Lee D.C. et al. //Neurochem. Res. 2007. - Vol. 32, №9. - P. 1499-1510.

174. Hypoxia regulates glutamate receptor trafficking an HIF-independent mechanism/E.C. Pack et al. //The EMBO J. -2012. Vol.10. - P. 1038-1049.

175. Increased yield of high-purity and active tetrameric recombinant human ECSOD by solid phase refolding / K. Ryu et al. // Microbiol. Biotechnol. -2008.-Vol. 18, №10.-P. 1648-1654.

176. Induction of cell death by the lysosomotropic detergent MSDH / W. Li et al. // FEBS Lett. 2000. - Vol. 470. - P. 35-39.

177. Insect hormones in vertebrates: anabolic effects of 20-hydroxyecdysone in Japanese quail / K. Slama et al. // Experientia. 1996. - Vol. 52,№7.-P. 702-706.

178. Involvement of two different cell death pathways in retinal atrophy of cathepsin D-deficient mice / M. Koike et al. // Mol. Cell. Neurosc. 2003. - Vol. 22.-P. 146-161.

179. Keen J.N. Glutathione transferases catalysis of nucleophylic reactions of glutathione / J.N. Keen, W.B. Iakoby // Biol. Chem. 1978. - Vol. 253, №16. -P. 5854-5858.

180. Lafont R. Practical uses for ecdysteroids in mammals including humans: an update / R. Lafont, L. Dinan // J. Insect. Sci. 2003. - Vol. 3, №7. - P. 1-30.

181. Landi S. Mammalian class theta GST and differential susceptibility to carcinogens: a review / S. Landi // Mutat. Res. 2000. - Vol. 463. - P. 247—283.

182. Landis G.N. Superoxide dismutase evolution and life span regulation / G.N. Landis, J. Tower // Mech. Ageing Dev. 2005. - Vol. 126, №3. - P. 365379.

183. Laudet V. Evolution of the nuclear receptor superfamily: early diversification from an ancestral orphan receptor / V. Laudet // J. of Mol. Endocrinology. 1997. - Vol. 19. - P. 207-226.

184. Link E.M. Enzymic pathways involved in cell response to H2C>2 / E.M. Link // Free Radic. Res. Commun. 1990. - Vol. 11. - P. 89-97.

185. Lu S.C. Regulation of glutathione synthesis / S. C. Lu. // Mol. Aspect. Med. 2009. - Vol. 30, №.1-2. - P. 42-59.

186. Lübke T. Proteomics of the lysosome / T. Lübke, P. Lobel, D.E. Sleat // Bioch. Bioph. Act. Mol. Cell Res. 2009. - Vol. 1793, №4. - P. 625-635.

187. Lysosomal labilization / A. Terman et al. // IUBMB Life. 2006. -Vol. 58. -P.531-539.

188. Lysosomal membrane permeabilization during apoptosis-involvement of Bax / K. Kagedal et al. // Int. J. Exp. Pathol. 2005. - Vol. 86. - P. 309-321.

189. Mice deficient for the lysosomal proteinase cathepsin D exhibit progressive atrophy of the intestinal mucosa and profound destruction of lymphoid cells / P. Saftig et al. // EMBO J. 1995. - Vol. 14. - P. 3599-3608.

190. Micromethods in single muscle fibus. Determination of grand glutathione reductase / R. Aushin et al. // Anal. Biochem. 1988. - Vol. 174, №2.-P. 575-579.

191. Mildronate treatment improves functional recovery following middle cerebral artery occlusion in rats / B. Svalbe et al. // Behav. Brain. Res. 2011. -Vol.12, №222 (1). -P. 26-32.

192. Mitochondria as the target for mildronate's protective effects in azidothymidine (AZT)-induced toxicity of isolated rat liver mitochondria / J. Pupure et al. // Cell. Biochem. Funct. 2008. -Vol. 26, №5. -P. 620-631.

193. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress mediate the physiological impairment induced by the disruption of autophagy / J.J. Wu et al. // Aging (Albany, NY). 2009. - Vol. 1, №4. - P. 425^37.

194. Modulatory effects of quercetin on hypobaric hypoxic rats / J. Zhou et al. // Eur. J. Pharmacol. 2012. - Vol. 674, №2-3. - P. 450-454.

195. Molecular forms of beta-hexosaminidase and cathepsin D in serum and urine of healthy subjects and patients with elevated activity of lysosomal enzymes / M. Zühlsdorf et al. // Biochem. J. 1983. - Vol. 213. - P. 733-740.

196. Monaghan P. Oxidative stress as a mediator of life history trade-offs: mechanisms, measurements and interpretation / P. Monaghan, N.B. Metcalfe, R. Torres // Ecology Letters. 2009. - Vol. 12, №1. - P.75-92.

197. Naviaux R.K. Oxidative Shielding or Oxidative Stress? / R.K. Naviaux // JPET. 2012. - Vol. 342., №3. - P. 608-618.

198. Neubauer J.A. Physiological and pathophysiological responses to intermitten hypoxia / J.A. Neubauer // J. Appl. Physiol. 2001. — Vol. 90. - P. 1593-1599.

199. Neuroprotective properties of mildronate, a mitochondria-targeted small molecule / J. Pupure et al. // Neurosci. Lett. 2010. - Vol. 12, №470(2). -P. 100-105.

200. Niedowicz D.M. The role of oxidative stress in diabetic complications / D.M. Niedowicz, D.L. Daleke // Cell Biochem. Biophys. 2005. - Vol. 43, №2. -P. 289-330.

201. Niizuma K. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction as determinants of ischemic neuronal death and survival / K. Niizuma, H. Endo, P.H. Chan // J. Neurochem. 2009. - Vol. 109, №1. - P. 133-138.

202. Normobaric hypoxia impairs human cardiac energetics / C. Holloway et al. // FASEB J. 2011. - Vol. 25, №9. - P. 3130-3135.

203. Osinskaia L.F. Antiradical properties and antioxidant activity of ecdysterone / L.F. Osinskaia, L.M. Saad, Y.D. Kholodova // Ukr. Biokhim. Zh. -1992. № 64, №1. - P. 114-117.

204. Over-expression of Hypoxia-inducible factor 1 alpha increases invasive potency of LNCaP cells in vitro / Y. Luo et al. // Zhongh. Yi Xue Za Zhi. 2006. - Vol. 29, №86 (32). - P. 2285-2288.

205. Oxidative Stress and Autophagy in the Regulation of Lysosome-Dependent Neuron Death / V.N. Pivtoraiko et al. // Antiox. Red. Sign. 2009. -Vol. 11, №3. - P. 481-496.

206. Oxidative stress and ischemic myocardial syndromes / M.K. Misra et al. // Med. Sei. Monit. 2009. - Vol.15, № 10. - P. 209-219.

207. Oxygen dependent regulation of hypoxia inducible factors by prolyl and asparaginyl hydroxylation / D. Lando et al. // Eur. J. Biochem. 2003. - Vol. 270, №5.-P. 781-790.

208. Paglia D.E. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathion peroxidase / D.E. Paglia, W.N. Valentine // J. Lab. Clin. Med. 1967. - Vol. 70. - P. 158-169.

209. Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase specific activity in tissues of rats of different age and comparison with other glutathione peroxidases/ L.P. Zhang et al. // Biochem. Biophys. Act. 1989. - Vol. 1006. - P. 140-143.

210. Phytoecdysteroids and Vitamin D Analogues — Similarities in Structure and Mode of Action / N. Toth et al. // Current Medicinal Chemistry. -2010.-Vol. 17, №18.-P. 1974-1994.

211. Phytoecdysteroids increase protein synthesis in skeletal muscle cells / J. Gorelick-Feldman et al. // J. Agric. Food Chem. 2008. - Vol. 56. - P. 35323537.

212. Potentiation of GABA-induced inhibition by 20-hydroxyecdysone, a neurosteroid, in cultured rat cortical neurons / S. Tsujiyama et al. // Japanese J. of Pharmac. 1995. - Vol. 68. - P. 133-136.

213. Protective action of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase against membrane-damaging lipid peroxidation / J.P. Thomas et al. // J. Biol. Chem. 1990. -№265. - P. 454-461.

214. Protective effect of ecdysterone on PC 12 cells cytotoxicity induced by beta-amyloid 25-35 / S.F. Yang et al. // Chin. J. Integr. Med. 2005. - Vol. 11, №4.-P. 293-296.

215. Purification of Glutathione reductase from porcine erythrocytes by the use of affinity chromatography on 2',5' ADP-sepharose 4B and crystallization of the enzyme / V. Boggaram et al. // Anal. Biochem. - 1979. - Vol. 98. - P. 335340.

216. Rapid, nongenomic responses to ecdysteroids and catecholamines mediated by a novel Drosophila G-protein-coupled receptor / D.P. Srivastava et al. //J. Neurosc. -2005. Vol. 25, №26. - P. 6145-6155.

217. Raskin I. Phytoecdysteroids Understanding their Anabolic Activity, abstract of the dissertation PhD /1. Raskin. - New Brunswick; New Jersey, 2009. -285 p.

218. Reactive oxygen species are critical in the oleic acid-mediated mitogenic signaling pathway in vascular smooth muscle cell / G. Lu et al. // Hypertension. 1998. - Vol. 32, №6. - P. 1003-1010.

219. Reilly P.M. Pharmacologic approach to tissue injury mediated by free radicals and other reactive oxygea metabolites / P.M. Reilly, H.J. Schiller, G.B. Dulkley // Amer. J. of Surgery. 1991. - Vol. 161, №4. - P. 488-503.

220. Relationship between intracellular pH and metabolite concentrations during metabolic inhibition in isolated ferret heart / G.L. Smith et al. // J. Physiol. London. 1993. - Vol. 472. - P. 11-22.

221. Rhee S.G. Regulation of phosphoinositide-specific phospholipase C / S.G. Rhee // Ann. Rev. Biochem. 2001. - Vol. 70. - P. 281-312.

222. Richo G. Proteolytic activation of human procathepsin D / G. Richo, G.E. Conner // Adv. Exp. Med. Biol. 1991. - Vol. 306. - P. 289-296.

223. Roberg K. Oxidative stress causes relocation of the lysosomal enzyme cathepsin D with ensuing apoptosis in neonatal rat cardiomyocytes / K. Roberg, K. Ollinger // Am. J. Pathol. 1998.-Vol. 152.-P. 1151-115 6.

224. Rost M. Luminol and lucigenin amplified chemiluminescence and lipid-peroxidation with brain microsmes from rats during ontogenic development / M. Rost, E. Karge, W. Klinger // Exp. and Toxicol. Pathol. 1998. - Vol. 50, №3. -P. 253-255.

225. Rozengurt E. Mitogenic signaling pathways induced by G proteincoupled receptors / E. Rozengurt // J. Cell. Physiol. 2007. - Vol. 213, №3. - P. 589-602.

226. Saftig P. Lysosome biogenesis and lysosomal membrane proteins: trafficking meets function / P. Saftig, J. Klumperman // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. -2009. -№ 10. -P. 623-635.

227. Screening plants of European North-East Russia for ecdysteroids / V. Volodin et al. // Bioch. Systemat. and Ecol. 2002. - Vol. 30, №6. - P. 525-578.

228. Semenza G. L. O2 regulated gene expression: transcriptional control of cardiorespiratory physiology by HIF1 / G.L. Semenza // J. Appl. Physiol. 2004. -Vol. 96, №3.-P. 1173-1177.

229. Semenza G.L. Oxygen Sensing, Homeostasis, and Disease / G.L. Semenza // N. Engl. J. Med. 2011. - Vol. 365. - P. 537-547.

230. Simon R.P. Blockade of NMDA receptors may protect against ischemic damage in the brain / R.P. Simon // Science. 1984. - Vol. 226. - P. 850852.

231. Skrzycki M. Extracellular superoxide dismutase (EC-SOD) -structure, properties and functions / M. Skrzycki, H. Czeczot // Postepy Hig. Med. Dosw. (Online). 2004. - Vol. 58. - P. 301-311.

232. Slama K. Insect hormones-ecdysteroids: their presence and actions in vertebrates / K. Slama, R. Lafont // Europ. J. Entomol. 1995. - Vol. 92, №1. - P. 355-377.

233. Solani G. Biochemical disfunction in heart mitochondria exposed to ischemia and reperfiision / G. Solani, D.A. Harris // Biochem. J. 2005. - Vol. 390.-P. 377-394.

234. Sphingosine-induced apoptosis is dependent on lysosomal proteases / K. Kagedal et al. // Biochem. J. 2001. - Vol. 359. - P. 335-343.

235. Steroid Hormones ecdysterone and calcitriol activates phosphoinositide messenger cascade in its early membrane phase of action / A.V. Kotsyuruba et al. // Ukr. Biokhim. Zh. 1999. - Vol. 71, №1. - P. 27-32.

236. The ecdysteroid inducible gene expression system: unexpected effects of muristerone A and ponasterone A on cytokine signalling in mammalian cells / S. Constantino et al. // Europ. Cytokine Network. 2001. - Vol. 12. - P. 365-367.

237. The inhibition of oxidative and nitrosative stresses by ecdysterone as the mechanisms of its cardio- and vasoprotective action in experimental diabetes type I / V.F. Sahach et al. // Fiziol. Zh. 2008. - Vol. 54, № 5. - P. 46-54.

238. The metabolism of 20-hydroxyecdysone in mice: relevance to pharmacological effects and gene switch applications of ecdysteroids / S. Kumpun // J. Steroid. Bioch. Mol. Biol. 2011. - Vol. 126, № 1 -2. - P. 1 -9.

239. The Molecular Mechanism of the Catalase Reaction / M. Alfonso-Prieto et al.//J. Am. Chem. Soc.- 2009.-Vol. 131,№33.-P. 11751-11761.

240. Thiel M. Stress, Hypoxia, and Immune Responses / M. Thiel, M. Sitkovsky, A. Chouker // Stress Chali. Immun. in Space. 2012. - Vol. 3. - P. 177-185.

241. Tuganova A.V. The in vitro interaction of C27-steroids with the erythrocyte membranes depends on the sterol structure and concentration / A.V. Tuganova, A.V. Kotsyuruba // Cel. and Mol. Biol. Letters. 1996. - Vol. 1. - P. 129-135.

242. UVB-dependent generation of reactive oxygen species by catalase and IgG under UVB light: Inhibition by antioxidants and anti-inflammatory drugs / M. Murakami et al. // Drug Discov. Ther. 2008. - Vol. 2, №2. - P. 85-93.

243. Vliegenthart J.F.G. Lipoxygenases / J.F.G. Vliegenthart, G.A. Veldink // Free Radicals in Biol. 1982. - №5. - P. 29-64.

244. Winczura A. Damage of DNA and proteins by major lipid peroxidation products in genome stability / A. Winczura, D. Zdzalik, B. Tudek // Free radic. res. -2012. -Vol. 1.-P. 1-41.

245. Wiseman H. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer / H. Wiseman, B. Halliwell //Biochem. J. 1996. - Vol. 313, №1. - P. 17-29.

246. Yamashima T. The role of lysosomal rupture in neuronal death / T. Yamashima, S. Oikawa. // Prog. Neurobiol. 2009. - Vol. 89, №4. - P. 343-358.