Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Фармакологическая характеристика экстракта донника

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ АКАДЕМИКА И.П. ПАВЛОВА

УДК 615.322+615.451.16

р тгш

г. окт^я

рукописи

ЛОКТЕВА Ольга Михайловна

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСТРАКТА ДОННИКА

14.00.25 - фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1999

Диссертационная работа выполнена на кафедре фармакологии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии

Научный консультант:

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Е.Е. Лесиовская

кандидат фармацевтических наук, доцент Б.К. Котовский

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., профессор Денисенко П.П. Д.м.н., профессор Михайлов И.Б

Ведущая организация: Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И.Мечникова

Защита диссертации состоится 17 сентября 1999г. в 14 ч 30 мин на заседании диссертационного совета К 074.37.02 в Санкт-Петербургском государственном медицинском университете им. акад. И.П. Павлова по адресу: 197089, г. Санкт-Петербург, ул. Л.Толстого, 6/8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова (197089, г. Санкт-Петербург, ул. Л.Толстого, 6/8)

Автореферат разослан « Ученый секретарь диссертационного

совета, д.м.н., профессор Э.Э.Звартау

Актуальность проблемы

В настоящее время на рынке лекарственных средств России широко представлены препараты растительного происхождения, содержащие полифенольные соединения. Известно, что полифенольные соединения обладают широким спектром биологических эффектов: антигипоксическим, антиоксидантным, капилляроукреплягощии, противовоспалительным и др. [Барабой В .А., 1976; Васильченко Е.А.И др., 1996; Лукьянчук В.Д.,1998].

Экстракционные препараты из лекарственного полифенолсодержащего растительного сырья являются перспективными для коррекции состояний, сопровождающихся гипоксией, ишемией. Однако большинство из них производятся за рубежом. Поэтому создание эффективных лекарственных средств растительного происхождения на основе полифенолсодержащего растительного сырья является актуальной задачей отечественной медицины.

В Санкт-Петербургской государственной .химико-фармацевтической академии на протяжении ряда лет ведутся исследования лекарственного растительного сырья, богатого фенольными соединениями. Одним из наиболее перспективных видов является донник лекарственный - МеИЫт о^рстаШ (Ь). £>е$г. семейство бобовые. При фитохимическом исследовании надземной части растения были выявлены кумарины, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, сапонины, полисахариды, микроэлементы.

В предварительных фармакологических экспериментах у различных извлечений из травы донника были установлены антигипоксическая, противовоспалительная [Лесиовская Е.Е.,1993], иммуномодулирующая [Подколзин А.А. и др., 1996] и др. виды активности.

Настоящее исследование является продолжением работ, проводимых в Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по изучению экстракта донника лекарственного.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования являлось фотохимическое и фармакологическое изучение сухого водорастворимого экстракта донника лекарственного.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1.Провести оценку качества экстракта донника и разработать основные параметры его стандартизации.

2.0ценить острую, хроническую токсичность экстракта донника.

3.Оценить спектр антигипоксических свойств экстракта донника на основных моделях гипоксических состояний.

4.Исследовать защитное действие экстракта донника на модели ишемии головного мозга крыс.

5. Изучить противовоспалительное, ранозаживляющее, обезболивающее, капилляроукрепляющее, иммуномодулирующее действие экстракта донника.

6. Провести предварительные фармакологические исследования новых лекарственных форм с экстрактом донника.

Научная новизна

Впервые проведена оценка качества и стандартизация экстракта донника по основным действующим веществам - кумарину и сумме флавоноидов. Установлено, что экстракт; обладает низкой токсичностью. Впервые изучен спектр антигипоксических свойств сухого водорастворимого экстракта донника лекарственного. Доказано, что он в широком диапазоне доз повышает переносимость животными острой гилобарической гипоксии, острой гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме, гистотоксической гипоксии и превосходит по эффекту эталонные антигилоксанты. Установлена связь нейропротекторного и антиоксидантаого эффектов экстракта донника в условиях циркуляторной гипоксии мозга. Выявлен широкий спектр фармакологических эффектов

экстракта, включающий обезболивающие, противовоспалительные, капилляроукрепляющие и иммуномодулирующие свойства.

Впервые разработаны методы стандартизации и проведена фармакологическая оценка препарата «Мелилотин» (экстракт донника по 0,01 в таблетках).

Проведены скрининговые фармакологические исследования мягких лекарственных форм с экстрактом донника.

Научно-практическое значение работы

Результаты проведенной работы позволили определить основные направления в создании лекарственных форм на основе экстракта донника -таблеток для приема внутрь, мягких лекарственных форм. Новые сведения о спектре действия извлечений из донника лекарственного расширяют общие представления о возможных областях применения препаратов на его основе, в частности использование в качестве антигипоксантов с ранозаживляющими и иммуномодулирующими свойствами.

Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу кафедр фармакологии и технологии лекарств и фитопрепаратов СПХФА и использованы при создании препаратов «Экстракт донника сухой» и «Мелилотин».

Материалы диссертации легли в основу отчетов о доклинических испытаниях экстракта донника и препарата «Мелилотин» и использованы при создании проектов ВФС на сухой экстракт донника и таблетки «Мелилотин», представленные в Фармакологический и Фармакопейный Государственные Комитеты МЗ РФ, а также лабораторные регламенты на получение экстракта донника и таблетки «Мелилотин».

£

Положения, выносимые на защиту

1.Экстракт донника обладает выраженным антигипоксическим действием на основных моделях гипоксических состояний.

2.Экстракт донника проявляет антиоксидантный и нейропротекторный эффекты при экспериментальной ишемии головного мозга у крыс.

3.Экстракт донника оказывает обезболивающий,

противовоспалительный, иммуномодулирующий, капилляроукрегамющий эффекты, не токсичен и перспективен для создания на его основе лекарственных препаратов.

Апробапия работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции «Современные перспективы научных исследований в области фармации» (Самара, 1996), Всероссийской конференции «Актуальные проблемы создания лекарственных средств» (Санк-Петербург, 1996), Международной конференции «Фармация в XXI веке: инновации и традиции» (Санкт-Петербург, 1999), VI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1999).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на /г? страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 25 таблицами, рисунками и состоит из введения, @ глав, обсуждения результатов, выводов и научно-практических рекомендаций, приложения и указателя литературы, включающего источников, из них 23 на иностранных языках.

Приложение включает проект ВФС на сухой экстракт донника и таблетки «Мелилотин».

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служил сухой водорастворимый экстракт донника лекарственного (ЭД), полученный на кафедре технологии лекарств и фитопрепаратов и лаборатории готовых лекарственных форм и фитопрепаратов СПХФА под руководством доцента. Котовского Б.К.

Фотохимические исследования были проведены в лаборатории готовых лекарственных форм и фитопрепаратов СПХФА. Использовали общепринятые методики, регламентированные соответствующими статьями ГФ XI.

Подлинность определяли с использованием как цветных реакций, так и методами физико-химического анализа: тонкослойной хроматохрафии (ТСХ) и высоко эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Количественное определение суммы флавоноидов проводили с использованием метода спектрофотометрии, кумарин определяли ВЭЖХ методом стандартной добавки.

Фармакологические исследования проводили на кафедре фармакологии СПХФА. Для экспериментов использовали 590 белых беспородных крыс обоего пола и 400 белых беспородных мышей самцов, а также 100 мышей самцов линии Fi(CBAxC57), полученных из питомника РАН «Рапполово».

Острую токсичность оценивали по методу В.Б. Прозоровского (1978)

Острую гипобарическую гипоксию (ОГБГ), гипоксию с гиперкапнией в гермообъеме (ГГГ), острую гистотоксическую гипоксию (ОГТГ) моделировали в соответствии с рекомендациями Фармакологического Государственного Комитета МЗ РФ.

Ишемию головного мозга воспроизводили билатеральной окклюзией обеих сонных артерий у белых беспородных крыс самцов и самок массой тела 150 - 200г (Ведомости Фармакологического Комитета, 1998).

Психофизиологический статус животных определяли с помощью разработанного на кафедре фармакологии методического подхода,

позволяющего оценить степень индивидуальной устойчивости животных к экстремальным воздействиям, в частности к гипоксии (Лесиовская Е.Е., 1993).

Изучение ангиопротекторного действия проводили на мышах (Барнаулов Л.Д. и др., 1980).

Анальгетическую активность оценивали по влиянию экстракта на латентный период отдергивания хвоста при локальном термическом воздействии (тест "tail-flick") и на порог вокализации при электростимуляции корня хвоста крысы (Дмитриев А.В., 1984; Зайцев А.А., 1984; Игнатов Ю.Д., 1990).

Противовоспалительную активность оценивали на моделях бутадионовой язвы желудка у крыс, методике адреналинового отека легких у мышей и ватной гранулемы (Методические рекомендации по экспериментальному (доклиническому) изучению нестероидных противовоспалительных фармакологических веществ, 1990).

Ранозаживляющие свойства исследовали на модели линейных ран (Шехгер А.Б. и др., 1977)

Иммуномодулирующие свойства оценивали по реакции торможения миграци лейкоцитов (РТМЛ) и реакции агглютинации (Никитин В.М.,1982; Методическое пособие по оценке иммунного статуса организма в лечебных учреждениях Советской Армии и Военно-морского флота, 1987).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием t критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

В ходе фотохимического исследования были установлены физико-химические свойства изучаемого экстракта. ЭД - порошок светло-коричневого цвета, пряного (кумаринового) запаха, горьковатого вкуса. Экстракт

малоггароскопичен, при хранении на воздухе медленно поглощает влагу, темнеет, легко растворим в воде, практически нерастворим в спирте и хлороформе.

Главными действующими веществами экстракта являются кумарины и флавоноидные соединения. Поэтому количественную стандартизацию экстракта проводили по содержанию кумарина (ВЭЖХ методом стандартной добавки) и сумме флавоноидов (спектрофотометрический метод). Установлено, что содержание кумарина в экстракте должно быть не менее 0,15 % , а суммы флавоноидов должно быть не менее 4,0%.

На первом этапе фармакологических исследований были выполнены эксперименты по оценке острой токсичности экстракта донника. Установлено, что для мышей при внугрибрюшинном введении исследуемого экстракта 1Л)5о составила 4300 мг/кг. Максимальная доза при пероральном приеме составила не более 6000 мг/кг ЭД. При этом гибели животных не наблюдали.

При исследовании спектра антигипоксической активности установлено, что ЭД обладает выраженным эффектом в широком диапазоне доз на моделях ОГБГ, ОГТГ и ГТТ при однократном внутрибрюшинном введении (рис. 1,2,3).

Контроль Гуптин Таимая ЭД5 ЭД.60 ЭД.120 ЭДЗОО

Рис. 1.ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТА ДОННИКА НА ПЕРЕНОСИМОСТЬ МЫШАМИ ОСТРОЙ ГИПОБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ

* -о-пнчйя огконтрольной группы статисгичсски значимы, р<0,05

{С

Коирош Тупыш ЭДЗ ЭД.60 ЭД.120 ЭД, 300

Рж£ ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТА ДОННИКА. НА ГРОДОЛЖИГЕЛЪНОСТЬ ЖЮНИ МЫШЕЙ ПРИ ГИПОКСИИ С ТИШРКАШИЕЙ В ГЕРМООБЪЕМЕ * - спличнхоткошрольаой группы стшютгксж значимы, р<0,05

Кок роль Гутман Ташан ЭД5 ЭД.60 ЭД.120 ЭД 300

Рис:5 ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТА ДОННИКА НА ПРОДОЛЖЮЫТЬИОСГЬ ЖЮНИ МШ1Й ПРИ ОСТРОЙ ГИСТОТОКСИЧБСКОЙ гипоксии

* - ОТЛИЧИ! ОТ КОНфОЛЬНОЙ гр>Р.Пы сшшстпчесжн зтчиыи, р <0,05

По активности ЭД не уступает, а в ряде случаев превосходит препарат сравнения гутимин и близок к танакану. Гутимин - антигипоксант, активизирует процессы гликолиза, избирательно блокирует процессы свободно-радикального окисления, способствует эффективному сопряжению окисления с фофорнлированием. Танакан - стандартизированный экстракт листьев гинкго двулистного (Е§761), широко используется при недостаточности мозгового коровотока (дисциркуляторной энцефалопатии), нарушениях периферического кровообращения, является антиоксидантом и антигипоксантом [Дамулин И.В. и др., 1996., Захаров В.В., 1997].

Мозг по чувствительности к дефициту кислорода и времени начального достоверного роста продуктов ПОЛ при ишемии стоит на первом месте [Хачатурьян М.Л., и др., 1996]. Образование свободных радикалов ведет к повреждению липопротеидных мембран и цитоплазматических органелл нейронов, а также к изменению конформации белков, ДНК и, в конечном итоге, гибели нервных клеток [Лукьянова Л.Д., и дрЛ998].

ЭД в дозах 60-120 мг/кг нормализовал содержание в ткани мозга МДА -маркера ПОЛ, и по своей активности не уступал при профилактическом пероральном введении (1 неделя) танакану (рис.4).

Результаты биохимических исследований были подтверждены при гистологическом изучении идентичных областей гиппокампа и новой коры головного мозга крыс. В контрольной группе в значительном количестве наблюдали нейроны с темной, гомогенно окрашенной цитоплазмой (сморщенные, а также вытянутые в длину). В таких нейронах ядро не имело четких контуров и было окрашено в темный цвет гомогенно, ядрышко не просматривалось (гиперхромные нейроны). Наряду с этим встречались клетки со светлым ядром и выраженным ядрышком, в которых базофильное вещество обнаруживалось лишь вокруг ядра (краевой хроматолиз), либо было распылено

(диффузный хроматолиз). Встречались также сохранные нейроны (Рис.5). При введении танакана в гиппокампе имелись отдельные гиперхромные нейроны, в новой коре наблюдали небольшое количество гиперхромных нейронов, а также нейронов с выраженным хроматолизом.

ЭД был наиболее эффективен в дозе 60 мг/кг (рис. 6). В этой группе как и у животных, получавших танакан в гиппокампе и новой коре преобладала сохранные нейроны и клетки с явлениями краевого хроматолиза.

Рис.5 Гистологическая картина клеток гиппокампа контрольной группы (окраска по Нисслю) (ув. х 400)

Рис.6. Гистологическая картина клеток гиппокампа при введении экстракта донника в дозе 60 мг/кг (окраска по Нисслю) (ув. х 400)

В дальнейших экспериментах выявлена зависимость антигипоксического действия ЭД от исходного психофизиологического профиля животного. Оптимальный защитный эффект ЭД при ишемическом повреждении головного мозга выявили в группах умеренно низко- и низкоустойчивых животных.

Лукьянова Л.Д. и соавт. (1995) показали, что для мозга низкоустойчивых животных характерна меньшая экономичность процессов энергообразования в митохондриях, окисляющих НАД-зависимые субстраты, и более активное, по сравнению с мозгом высокоустойчивых крыс, использование сукцинатоксидазного пути окисления в качестве компенсаторного механизма при острой гипоксии. Результаты наших экспериментов свидетельствуют о том, что ЭД способен, по-видимому, шунтировать дыхательную цепь у низкоустойчивых животных на субстратном участке путем прямого включения полифенолов.

Наличие антигипоксической и антиоксидантной активности у ЭД позволило предположить у него широкий спектр лечебных эффектов. Результаты исследования спектра фармакологической активности ЭД представлены в табл.1.

Препарат малотоксичен при однократном введении. При длительном введении ЭД в терапевтических и токсических дозах лабораторным животным не оказывал токсического действия на основные системы организма животных

Уникальный фотохимический состав обусловливает широкий спектр фармакологической активности. Сочетание антигипоксического, антиоксидантного, анальгетического, капилляроукрепляющего,

противовоспалительного эффектов позволяют говорить о перспективности ЭД в качестве антиишемического средства

Таблица 1

Фармакологическая активность экстракта донника лекарственного

Активность Модель Эффективная доза, мг/кг Изменения регистрируемых показателей по отношению к контролю

Антиальте-ратавная Бутадионовая язва желудка 60 Уменьшение общего количества язв на 65,8%

Антяэкссу-дативная Адреналиновый отек 60 Уменьшение легочного коэффициента на 36,6%

Антипроли-феративная Ватная гранулема 30 Уменьшение массы сухой гранулемы в 2,5 раза

Ранозажив-ляющая Линейные раны 120 Увеличение массы груза, необходимого для разрыва рубца на 87,9%

Капилляро-укрепляющая Повреждение кожи ксилолом 60-120 Удлинение времени появления петехий на 90-103%; уменьшение количества петехий на 54%

Обезболивающая Определение латентного периода отдергивания хвоста и тест tail-flick 60-120 Удлинение латентного периода отдергивания хвоста на 52-59%; увеличение порога вокализации на 80%

Влияние на иммунитет РТМЛ Реакции агглютинации 120 Снижение индекса миграции лейкоцитов на 14%; положительная реакция агглютинации в седьмом разведении

В лаборатории готовых лекарственных форм и фитопрепаратов был получен препарат «Мелилотин» - ЭД по 0,01 в таблетках. Нами проведена оценка качества и стандартизация таблеток. Установлено, что содержание кумарина в таблетке должно быть не менее 0,015 мг, а суммы флавоноидов не менее 0,4 мг.

Фармакологическое исследование таблеток показало наличие антиишемической, антиоксидантной, противовоспалительной,

обезболивающей, иммуномодулирукмцей активностей.

Были проведены скрининговые фармакологические исследования мягких лекарственных форм с ЭД. Результаты этих экспериментов представлены в табл.2.

Таблица 2

Результаты исследовааний фармакологической активности лекарственных форм с экстрактом донника

Лекарственная форма, содержание экстракта Активность

Мазь на гидрофобной основе, 0,2% Ранозаживляющая

Мазь на гидрофильной основе, 0,2% Капилляроукрепляющая, ранозаживляющая

Таким образом, ЭД является оригинальным эффективным низкотоксичным лекарственным средством. Доказана перспективность разработок различных лекарственных форм на его основе.

ВЫВОДЫ

1.Проведена стандартизация экстракта донника по основным действующим веществам - сумме флавоноидов не менее 4,0% и кумарину - не менее 0,15%. Эти параметры включены в проект ВФС на экстракт донника и лабораторный регламент на его производство.

2.В опытах по оценке острой, хронической и субхронической токсичности доказана низкая токсичность экстракта донника.

3.Экстракт донника проявляет выраженный антигипоксический эффект на всех основных моделях гипоксии.

4.Выявлено защитное действие экстракта донника на модели ишемии головного мозга у крыс.

5.Выявлена связь между нейропротекгорной и антиоксидантной активностью экстракта донника в условиях экспериментальной ишемии мозга.

6.Установлено, что экстракт донника обладает противовоспалительными капилляроукрепляюпщми, ранозаживляющими и иммуномодулирующими свойствами, оказывает благоприятное влияние на течение всех фаз воспалительного процесса.

7.Изученный экстракт проявляет обезболивающую активность

8.Разработан состав, технология, стандартизация таблеток «Мелилотин», а также их фармакологическая активность. Результаты исследования включены в проект ВФС на таблетки «Мелилотин» и лабораторный регламент на их производство. Проведены скрининговые фармакологические исследования и доказана перспективность разработки мягких лекарственных форм с экстрактом донника.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

На основании проведенного исследования рекомендовано использовать ЭД для создания новых лекарственных растительных препаратов.

Целесообразно продолжить фармакологические испытания новых лекарственных форм с экстрактом донника: мази на гидрофильной основе - в качестве венотонизирующего и капилляроукреплягощего средства; мази на гидрофобной основе для заживления ран; суппозиториев для лечения трещин заднего прохода и геморроя (ректальные) и для лечения вагинитов (вагинальные).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Локтева О.М. Защитное действие экстракта донника при ишемии головного мозга //Тез. докл Всероссийского молодежного научного Форума «Интелектуальный потенциал России - в XXI век»,- СПб, 1995.-С.15.

2. Локтева О.М. Антигипоксические свойства экстракта донника лекарственного //Тез. докл. 2-ого научного конгресса «Традиционная медицина: теоретические и практические аспекты» .-Чебоксары, 1996.-С.86.

3. Локтева О.М., Фролова Н.Ю., Котовский Б.К., Лесиовская Е.Е. Донник лекарственный - перспективный источник новых кардиотропных препаратов //Тез. докл. научн. конф. «Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств». - СПб., 1996.-С.143.

4. Лесиовская Е.Е., Саканян Е.И., Фролова Н.Ю., Мельникова Т.И., Бахтина С.М., Локтева О.М., Тамм Е.Л., Дихтяренко В.В., Сафонов В.В., Дрожжина Е.В., Шустова Л.И. О некоторых результатах разработки лекарственных и лечебно-профилактических средств на основе природных полифенольных комплексов //Матер. 2 Междунар. Съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». - СПб-Валаам, 1998. С.59-62.

5. Локтева О.М., Котовский Б.К., Лесиовская Е.Е., Фролова Н.Ю., Пастушенков Л.В., Саканян Е.И. К вопросу об антигипоксических свойствах

экстракта донника лекарственного //Тез. докл. Всероссийской научной конференции «От Materia medica к современным медицинским технологиям». - СПб., 1998. С.98.

6. Лесиовская Е.Е., Фролова Н.Ю., Мельникова Т.И., Локтева О.М., Авенирова Е.Л., Вишневская Е.К. О фармакологических исследованиях фитопрепаратов в СПХФА //Мат. научно-практ. конф. «Традиционные методы лечения -основные направления и перспективы развития». - М., 1998. С.133.

7. Локтева О.М. К вопросу создания нового антиишемического препарата на основе экстракта донника лекарственного //Тез. докл. меэвд. научн. конф. «Фармация в XXI веке: инновации и традиции». - СПб., 1999. С. 174.