Автореферат и диссертация по медицине (14.00.26) на тему:Аноцептин при лечении туберкулезных хориоретинитов (экспериментальное исследование)

На Правах рукописи

КАРЕЦКИЙ Андрей Валентинович

АНОЦЕПТИН ПРИ ЛЕЧЕНИИ ТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ХОРИОРЕТИНИТОВ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14 00 26 -фтизиатрия 14 00 08 - глазные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2008

003170802

Диссертация выполнена в Федеральном государственном учреждении «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт

фтизиопульмонологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» и ГУ «Институт физиологии им И П Павлова РАН»

Научные руководители доктор медицинских наук, профессор

Хокканен Валентина Михайловна доктор биологических наук Крылов Борис Владимирович Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор

Браженко Николай Андреевич доктор медицинских наук, профессор Бойко Эрнест Витальевич Ведущая организация ГУ «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН» Защита состоится «24» июня 2008 г в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208 092 01 при Федеральном государственном учреждении «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Росмедтехнологий» (191036, Санкт-Петербург, Литовский пр , д 2-4, тел 579-25-84)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственною учреждения «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Росмедтехнологий» (191036, Санкт-Петербург, Литовский пр , д 2-4, тел 579-25-87) и на сайте www spbnnf ru

Автореферат разослан «/^2» 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Тавьяш Ивановна Виноградова

Актуальность проблемы Туберкулезные поражения глаз в последние годы прочно занимают 2-3 место в структуре внелегочного туберкулеза (Устинова ЕИ, 2002, Попова СГ, 2005, Левашев ЮН, Репин ЮМ, 2006) Дола увеитов туберкулезной этиологии среди общею числа больных с увеальной патологией по-прежнему высока и составляет в среднем около 20% (Кацнельсон Л А, Танковский ВЭ, 1998, Устинова ЕИ, 2001, Бурылова Е А, Черноскутова Э А , 2006) По данным отделения туберкулеза глаз ФГУ «СПб НИИФ Росмедтехнологий», частота встречаемости задних увеитов (хориоретинитов) за последние пять лет достигла 70%

Туберкулезные очаговые хориоретиниты характеризуются выраженной экссудацией с преобладанием параспецифического компонента воспаления (Азнабаев МТ, 2003, Хокканен ВМ, 2006) По данным литературы (Измайлов АС, 2001, Ионова О Г, 2006 и другие авторы), при этом заболевании, особенно при центральной и парацентральной локализации очага, наблюдаются наиболее грозные осложнения - отслойка пигментного и нейроэпителия, вторичная дистрофия сетчатки, фиброз стекловидного тела, геморрагии, которые приводят к сюйкому снижению зрения, вплоть до слепоты

В этой связи остается актуальным поиск новых средств и методов коррекции различных звеньев патологического процесса, позволяющих максимально сохранить клетки сетчатки

В рамках программ Отделения биологических наук РАН «Фундаментальная науке - медицине» и «Поддержка инноваций и разрабоюк» в Институте физиологии им И П Павлова РАН разработана лекарственная форма препарата «Аноцептин» в виде раствора для инъекций Действующей субстанцией препарата является производная гамма-пирона -коменовая кислота, получаемая путем прямого химического синтеза Препарат «Аноцептин» является оригинальным, относится к V классу малотоксичных соединений, не влияет на эмбриогенез, не индуцирует тератогенез и мутагенез, а также не провоцирует рост новообразований

Лекарственная форма стабильна В настоящее время препарат проходит 1 фазу клинических исследований но безопасности и фармакокинетике как ненаркотическое анальгетическое и противовоспалительное средство (разрешение Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития N 158 от 03 05 2007 г )

Анальгетические свойства препарата реализуются за счет непосредственного влияния на систему кодирования ноцицептивной информации, трансдуктором сигнала в которой является Na/K-АТФаза мембраны сенсорных нейронов спинальных ганглиев (Крылов Б В и соавт, 1999)

Доклинические исследования показали, чю препарат «Аноцептин» стимулирует системный иммунитет путем повышения фагоцитарной активности макрофагов Поскольку Na/K-АТФаза проявляет функцию трансдуктора сигнала при регуляции процессов роста и пролиферации клеток разных тканей (Пеннияйнен В А и соавт, 2003, Лопатина ЕВ и соавт, 2005, Xie Z , Askan А , 2002, Schonner W, 2002, 2005), можно предполагать перспективность использования препарата «Аноцептин» при лечении туберкулезных хориоретинитов, объединяющих в себе ряд воспалительных и деструктивных изменений в оболочках глазною яблока

Цель исследования изучить влияние препарата «Аноцептин» на гкань сетчатки в органотипической культуре и возможность его использования в комплексной терапии туберкулезных хориоретинитов Задачи исследования

1 Изучить влияние препарата «Аноцептин» на рост эксплантатов ткани сетчатки в органотипической культуре и оценить возможный механизм действия препарата

2 Определить клеточный состав эксплантатов ткани сетчатки 10-12 дневных куриных эмбрионов в условиях органотипического культивирования при использовании препарата

3 Исследовать влияние препарата «Аноцептин» на рост штаммов М tuberculosis Н37 Rv и ЛИХТ-98

4 Оценить эффективность препарата «Аноцептин» как патогенетическою средства в лечении экспериментального туберкулезного хориоретинита у кроликов

Научная новнзна работы. Исследования, проведенные на эксплантатах ткани сетчатки 10-12 дневных куриных эмбрионов, впервые позволили обнаружить влияние препарата «Аноцептин» на процессы пролиферации нейро- и пигментного эпителия Экспериментально показано, что в основе механизма действия препарата лежит его способность регулировать транедукторную функцию Na/K-АТФазы клеток сетчатки Установлена четкая зависимость роста эксплантатов ткани сетчатки oí дозы препарата в opi анотшшческой культуре Доказано, что препарат «Аноцептин» не оказывает ингибирующего влияния на штаммы М tuberculosis Н37 Rv и ЛИХТ-98 т vitro Препарат «Аноцептин» впервые использован в лечении экспериментального туберкулезного хориоретинита и доказана его эффективность как патогенетического средства

Практическая значимость работы. Полученные данные об эффективности препарата «Аноцептин» на фоне химиотерапии туберкулезных хориоретинитов MOiyr быть использованы при его изучении в условиях другой экспериментальной патологии глазного дна, а также при проведении второй и третьей фазы клинических испытаний как во фтизиатрии, так и в офтальмологии

Основные положения, выносимые на защиту

1 Препарат «Аноцептин» регулирует процесс пролиферации клеток ткани сетчатки 10-12 дневного куриного эмбриона в органотипической культуре

2 Механизм регуляторного действия препарата основан на непосредственном влиянии на транедукторную функцию Na/K-АТФазы клеток ткани сетчатки

3 Эффективность препарата «Аноцептин» при включении его в противотуберкулезную терапию экспериментальных хориоретинитов не связана с непосредственным влиянием на М tuberculosis

4 Препарат «Аноцептин» способствует максимальному сохранению клеток пигментного эпителия сетчатки, что предотвращает ее дистрофические изменения

Реализация результатов работы. На основании проведенных исследований зарегистрирована заявка на изобретение «Регенерирующее противовоспалительное средство и способы лечения с помощью этого средства» N 2007135967/15(039320)

Основные положения диссертации используются в экспериментальных исследованиях отделения туберкулеза глаз ФГУ «СПбНИИФ Росмедтехноло1 ий», научно-исследовательской работе Института физиологии им И П Павлова РАН, отдела экспериментальной и клинической фармакологии ФГУ «ФЦСКИЭ им В А Алмазова Росмедтехнологий»

Апробация работы . Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на международной конференции Фонда А фон Гумбольдта (Санкт-Петербург, 2004), на XIX съезде физиологического общества им И П Павлова (Екатеринбург 2004), на научно-практической конференции «Клеточные технологии в офтальмологии и медицине» (Москва, 2005), на V международном конгрессе по нейроморфологии (Санкт-Петербург, 2006)

По результатам диссертационного исследования опубликовано 9 работ Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 103 страницах и состоит из введения, обзора литературы, трех глав с изложением использованных методов и результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 179 источников, в том числе 121 отечественных и 58 иностранных Работа иллюстрирована 9 таблицами и 16 рисунками

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования Метод органотшшчсского культивирования ткани сетчатки

0рган01ипическую культуру ткани сетчатки получали путем энуклеации глаз 10-12 дневного куриного эмбриона Культивирование эксплантатов ткани сетчатки выполняли в С02 инкубаторе (Sanyo, Япония) в течение 3 суток Использовали стандартную пита1ельную среду (pH 7,2), содержащую 40% раствора Хенкса, 40% среды Игла, 15% фетальной сыворотки коровы, 5% куриною эмбрионального экстракта с добавлением глюкозы (0,6%), инсулина (0,5 ед/мл), гентамицина (100 ед/мл), гчютамина (0,35%) Контрольные эксплантат культивировали в стандартной питательной среде В питательную среду опытных эксплантатов вводили препарат «Аноцсптин» в диапазоне концентраций от 106 М до 10 10 М (в пересчете на действующую субстанцию - коменовую кислоту) Для выявления возможного механизма действия «Аноцептина» в части экспериментов использовали блокатор Na/K-АТФазы - сердечный гликозид оуабаин (Sigma, USA) в концентрациях от 108 М до 10° М

Для количественной оценки влияния исследуемых веществ на рост эксплантатов ткани сетчатки применяли морфометрический метод Интенсивность роста эксплантатов оценивали с помощью относительного критерия - индекса площади (ИП), который рассчитывали как отношение площади всего эксплантата, включая периферическую зону роста, к площади центральной зоны За условную единицу площади принимали квадрат сетки микроскопа, сторона квадрата при увеличении 3,5x10 равна 150 мкм Величину ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принимали за 100%

В каждой серии опытов "п" - количество культивируемых эксплантатов

Цитологические методы исследования. Для проведения цитологических исследований эксплантаты ткани сетчатки культивировали в СОг

инкубаторе на стектах, помещенных в чашки Петри Через 3-е суток стекла с прикрепленными эксплантатами обрабатывали по общепринятым в гистологии технологиям, окрашивали гематоксилином и эозином (Меркулов ГА, 1969) Препараты фотографировали при помощи установки, включающей микроскоп Carl Zeiss Axiostar Plus, цифровую фотокамеру Nicon 8М и компьютер с пакетом программного обеспечения для обработки изображений

Методика определения действия препарата «Аноцептин» на рост микобактерий туберкулеза. Использовали стандартный метод двукратных серийных разведений препарата в синтетической полужидкой среде Сотона с добавлением 25% нормальной лошадиной сыворотки и питательного агара (0,35 г на 100 мл среды) Диапазон исследуемых доз препарата «Аноцептин» составил 1,56 - 200 мкг/мл Конгролем питательной среды служила плотная среда Левенштейна-Йенсена Суспензии тест-культур М tuberculosis Н37 Rv и ЛИХТ-98 в объеме 0,2 мл (10 миллионов микробных тел) засевали методом поверхностного наслоения в контрольные и опытные пробирки Результаты учитывали через 7 суток инкубации посевов в условиях термостата при +37°С по интенсивности роста микобактериальной пленки на поверхности питательной среды

Изучение препарата «Аноцептин» in vivo. Опыты выполнены на 23 кроликах (46 глаз) породы «Шиншилла» Местное раздражающее действие при парабульбарном введении «Аноцептина» изучено на 3 здоровых кроликах (6 глаз) Наличие реактивных изменений оценивали ежедневно в течение 10 дней (курс назначения препарата) пальпаторно и по офтальмоскопической картине глазного дна В конце эксперимента осуществляли визуальное исследование глаза и параорбитальной клетчатки Моделирование туберкулезного хориоретинита выполнено на 20 кроликах (40 глаз) по методике, разработанной Э Н Белендиром и соавг (1971) После формирования хориоретинальных очагов (в среднем на 7-10 день после заражения) всем животным на протяжении всего периода исследования

проводили стандартную противотуберкулезную терапию (ПТТ), включающую изонназид - 3% раствор парабульбарно (но 0,5 мл в оба ыаза) и 10% раствор внутримышечно (10 мг/ кг), стрептомицин - внутримышечно (40 ООО ЕД/кг)

После стабилизации процесса (в среднем на 45-й день после заражения) кролики распределены на серии в зависимости от проводимой терапии 1-ая (п=10) - местно (парабульбарно) 2% раствор «Аноцепшна» по 0,5 мл в каждый глаз на фоне ПТТ, 2-ая (п=10) - животные, получающие только ПТТ Курс лечения «Аноцептином» составил 10 дней Основная и контрольная серии были репрезентативны по основным офтальмологическим параметрам (размеру очага, проминенции и экссудации) Эффективность лечения экспериментального туберкулезного хориорегинита оценивали по динамике массы тела живогных, общеповеденческим реакциям, офтальмоскопической картине Офтальмоскопическое исследование выполняли один раз в 3 дня Через 6 недель от начала лечения «Аноцептином» экспериментальных животных выводили из опыта путем введения в краевую вену уха раствора тиопентала натрия (10% - 10 мл) Глаза энуклеировали, по стандартной методике готовили гистологические препараты (окраска гематоксилином и эозином) и фотографировали их , как указано выше Всего было изготовлено и исследовано более 160 срезов

Эффективность лечения экспериментальных туберкулезных хориоретинитов в процентах для каждого из трех изучаемых параметров (размер очага, проминенция, экссудация) вычисляли по формуле

а= юо,

(</,+</,)/2

где </, и - величина показателя до и после лечения в реальных единицах измерения

Методы статистической обработки полученных результатов.

Статистическую обработку данных выполняли на персональном компьютере с использованием прикладных программ для статистического анализа

«Microsoft Excel» и «STATGRAPHICS Plus» for Windows. Вычисляли среднее и их ошибки (р<0,05).

Результаты исследования и их обсуждение

Влияние препарата «Аноцептин» на процесс пролиферации клеток сетчатки в органотипической культуре

*

10" 10-* Ю-' 10*

Моль

EJ котролъ ■ aHoiiermiH

Рис.1. Влияние «Аноцептина» на рост эксплантатов ткани сетчатки 1012-дневных куриных эмбрионов.

* р<0,05 - достоверность различий между опытными и контрольными результатами.

Из рисунка 1 видно, что при введении в питательную среду препарата «Аноцептин» (10~й М) наблюдали достоверное угнетение роста эксплантатов ткани сетчатки на 24,0±2% (п=25; р<0,05) по сравнению с контролем (п=25). В концентрации 10~7 М «Аноцептин» незначительно подавлял рост эксплантатов ткани сетчатки. ИП эксплантатов был ниже контрольного значения на 17,5±2% (п=27). Добавление в культуральную среду препарата в более низких концентрациях - 10"8 М (п=25) и 10"'° М (п=25) приводило к достоверной стимуляции роста эксплантатов ткани сетчатки на 18,0±2% и 50% (соответственно) по сравнению с котролем (п=25, р<0,05).

Таким образом, впервые установлено дозозависимое действие препарата «Аноцептин» на регуляцию роста эксплантатов ткани сетчатки 1012 дневных куриных эмбрионов. На фиксированных препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, обнаружено, что зону роста контрольных и экспериментальных эксплантатов составляют клетки пигментного эпителия сетчатки, ганглиозные клетки, палочки, колбочки.

Для того, чтобы оценить механизм обнаруженного трофического действия препарата «Аноцептин» и участие в этом процессе Ыа/ К-АТФазы, в следующей части работы исследовали действие оуабаина на процесс пролиферации клеток сетчатки глаза 10-12 дневных куриных эмбрионов. Стимулирующий эффект препарата «Аноцептин» изучали в присутствии блокатора Иа/ К-АТФазы оуабаина.

Влияние блокатора Nа/ К-АТФазы оуабаина на процесс пролиферации клеток сетчатки в органотипической культуре

N87 К-АТФаза является единственной мишенью для действия оуабаина. Контрольными являлись эксплантаты, культивируемые только в питательной среде.

ИП%

140120 100 80 60 40 20 0

10"" 10"12 10"" Ю"10 10* 10"8 м

ы контроль иоуаоаин

Рис.2. Влияние оуабаина нарост эксплантатов сетчатки 10-12-дневных куриных эмбрионов. * р<0,05 - достоверность различий между опытными и контрольными результатами.

Рисунок 2 демонстрирует активацию роста ткани сетчатки при добавлении в питательную среду блокатора Na/ К-АТФазы оуабаина в концентрации 10~13 М, о чем свидетельствует увеличение ИП на 34% по сравнению с контрольными значениями (п=25, р<0,05) Выявлено, что при использовании более высоких доз стимулирующий эффект оуабаина ослабевал При увеличении концентрации с 10"12 М (п=25) до 1010 М наблюдали снижение активирующего влияния вещества с 18% до 5% (соответственно) В присутствии оуабаина в концентрации 10УМ отмечено незначительное угнетение роста эксплантатов ткани сетчатки Оуабаин полностью ингибировал рост эксплантатов в концентрации 10~8 М

Цитологическое исследование показало, что в зоне роста контрольных и экспериментальных эксплантатов, окрашенных гематоксилином и эозином, присутствовали клетки пигментного эпителия сетчатки, ганглиозные клетки, палочки и колбочки

Результаты этого раздела работы, а также данные, полученные в аналогичных экспериментальных условиях на других тканях, позволяют считать, что действие оуабаина на регуляцию пролиферации клеток ткани сетчатки является дозозависимым и тканеспецифичным В его основе лежит механизм активации низкими концентрациями оуабаина трансдукторной функции Na/ К-АТФазы (Пеннияйнен В А и соавт, 2003, Лопатина Е В и соавт , 2005, Schoner W , 2005)

Оценка возможного механизма действия препарата «Аноцептин»

В питательную среду опытной серии вводили «Аноцептин» в дозе Ю~10 М, в которой отмечена достоверная стимуляция роста эксплантатов ткани сетчатки и блокатор Na/ К-АТФазы оуабаин в концентрации 108 М, вызывающей полное ингибирование пролиферации клеток сетчатки

ип%

1 1 1 1

■ контроль ■оуабаин Щаноцептин □ оуабаин-^аноиептин

Рис. 3 Влияние Анодептина в присутствии оуабаина на рост эксплантатов сетчатки 10-12-дневных куриных эмбрионов р<0,05.

Полученные в этом эксперименте данные иллюстрирует рисунок 3. Обнаружено, что величина ИП опытных эксплантатов не отличалась от контрольного значения. Таким образом, можно заключить, что в основе механизма нейротрофического действия препарата «Аноцептин» на клетки сетчатки лежит его способность регулировать трансдукторную функцию Na' К-АТФазы. Это согласуется с данными Пеннияйнен В. А. и соавторов (2003), Лонатиной Е.В. и соавторов (2005), Xie Z., Askari А. (2002), Schonner W. (2002; 2005). свидетельствующими о том, что Na/K-АТФаза проявляет функцию трансдуктора сигнала при регуляции процессов роста и пролиферации клеток тканей разного типа (кардиомиоциты, сенсорные нейроны).

Проведенные исследования показали перспективность изучения действия препарата «Аноцептин» в экспериментах in vivo в лечении туберкулезных хориоретинитов, объединяющих в себе компонент воспаления и элементы деструктивных изменений в оболочках глазного яблока.

Результаты действия «Аноцептина» на рост микобактерий туберкулеза

В опытах in vitro в пробирках опытного и контрольного рядов наблюдали идентичный рост тест-культур М tuberculosis Н37 Rv и ЛИХТ-98 in vitro (на среде Левенштейна-Иенсена - инициальный рост) Эти данные свидетельствуют о том, что препарат «Аноцептин» в исследуемых концентрациях не обладает антимикробным действием на М tuberculosis

Результаты исследования препарата «Аноцептин» в комплексной терапии экспериментального туберкулезного хориоретинита у кроликов Видимых изменений офтальмоскопической картины глазного дна, а также параорбитальной клетчатки, у здоровых кроликов, получавших «Аноцептин» парабульбарно в течение 10 дней, не выявлено, что указывает на отсутствие местного раздражающего действия препарата

Присоединение «Аноцептина» к противотуберкулезной терапии экспериментального туберкулезного хориоретинита способствовало положительной динамике офтальмоскопических показателей (размер очага -d, уровень проминенции - h, экссудации - е) Так, средний суммарный npupoci эффективности лечения туберкулезного хориоретинита по трем тестируемым параметрам за счет применения «Аноцептина» составил 37,7% Как видно из рисунка 4, результативность терапии в основной серии по отношению к размеру очага, уровню проминенции и экссудации была соответственно на 21%, 77% и 15 % выше, чем в контроле (р<0,01 ) В ходе гистологического исследования сетчатки кроликов установлено, что у животных, получавших дополнительно «Аноцептин» на фоне эгиотропной терапии, удалось сохранить пигментный эпителий сетчатки не только в иерифокальной зоне (90%), но и на периферии очага (33%) В контрольной серии, i дс проводилась только ПТТ, пигментный эпителий был почти полностью разрушен (рис 5)

(1 И е

Я ПТТ+Аноцептин ИПТТ

(1- размер очага; Ь- проминенция; е- экссудация

Рис.4. Эффективность использования препарата «Аноцептин»

(*- достоверность различий по отношению к контрольной серии, р<0,01 ).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют об эффективности использования препарата «Аноцептин» в комплексной терапии экспериментального хориоретинита.

гранулема Пигментный

а б

Рис.5. Гистологический срез тканей глаза (окраска гематоксилином и эозином, Х200): а- контрольная серия (ПТТ); б- основная серия (ПТТ+ «Аноцентин»),

выводы

1 Действие препарата «Аноцептин» на рост эксплантатов гкани сетчатки 10-12 дневных куриных эмбрионов является дозозависимым

2 В основе механизма нейротрофического эффекта препарата «Аноцептин» лежит его способность регулировать трансдукторную функцию Na/ К-АТФазы клеток сетчатки

3 В опытах in vitro препарат «Аноцептин» не проявляет антимикробную активность в отношении микобактерий туберкулеза

4 Использование «Аноцептина» в составе химиотерапии экспериментального туберкулезного хориоретинита сопровождается повышением результатов лечения за счет достоверного уменьшения воспалительных явлений в очаге поражения

5 «Аноцептин», оказывая активирующее влияние на трофические процессы в сетчатке, на фоне комплексной противотуберкулезной терапии экспериментальных туберкулезных хориоретннитов способствует сохранению клеток пигментного эпителия в 90% в зоне параспецифического воспаления и в 33% в области очага

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Пеннияйнен В А, Лопатина Е В , Карецкий А В , Хокканен В М , Крылов Б В Влияние оуабаина и норадреналина на рост клеток сетчатки в органотипической культуре ткани // Современные возможности лечения витрео-ретинальной патологии Материалы Всерос науч -практ конф -М , 2004 - С 51

2 Пеннияйнен В А , Лопатина Е В , Карецкий А В , Хокканен В М , Крылов Б В аЗ изоформа Na/Ка-АТФазы модулирует процессы роста клеток сетчатки // Рос физиол журн им И М Сеченова - 2004 - Т 90, №8 -С 331-332

3 Карсцкий А В , Лопатина Е В , Крылов Б В , Пеннияйнен В А , Хокканен ВМ Влияние Q-134 на рост клеток сетчатки в органотипической культуре ткани // Клеточные технологии в офгальмологии Регенеративная медицина и трансплантация тканей в офтальмологии Материалы межд конф - М , 2005 - С 26-27

4 Karetskyi А V , Lopatina Е V , Penniyaynen V А аЗ-izoform of Na*, К+-ATPase modulates process of cells growth in the chicken retina // Technologies of the 21st century biological, physical, informational and social aspects Humboldt-Kolleg Conference - Saint-Petersburg, 2005 - P 30-32

5 Лопатина E В , Карецкий А В , Пеннияйнен В А , Хокканен В М, Крылов Б В Моделирование процесса пролиферации клеток сехчатки теплокровных//Морфология -2006 -Т 129, №2 -С 55

6 Хокканен В М , Ба1аев В М , Соловьева М В , Ионова О Г, Белова О Ю , Карецкий А В Основные направления повышения эффективности диагностики и лечения туберкулеза глаз // Пробл туберкулеза и болезней легких - 2006 - №11 - С 24-29

7 Карецкий А В , Хокканен В А , Лопатина Е В Использование метода органотипической культуры ткани в экспериментальной офтальмологии // Новейшие достижения в лечении и диагностике глазных заболеваний Материалы 11 ежегод конф - М , 2007 - С 45-46

8 Заявка на изобретение РФ Регенерирующее противовоспалительное средство и способы лечения с помощью этого средства / Лопатина Е В , Карецкий А В , Крылов Б В - № 2007135967/15, заявл 20 09 07

Лицензия ПД № 2-69-626 от 20 06 2001 г Подписано в печать 12 05 08 Формат 60x90 1/16 Бумага офсетная Печать ризографическая Уел печ л 1,25 Тираж 100 экз Заказ № 209

Отпечатано с I отового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии ООО «Фирма «Стикс» 196128, Санкт-Петербург, ул Кузнецовская, 19

Несмотря на рост основных показателей заболеваемости по туберкулезу, показатель заболеваемости для внелегочных форм туберкулеза снижается 2,0/100 тыс. населения в 2005 году против 3,2/100 тыс. населения в 2000 году (Левашев Ю.Н. и соавт., 2005). Туберкулезные поражения глаз при этом прочно занимают 2-3 место среди внелегочного туберкулеза (Устинова Е.И., 2002; Попова С.Г., 2005; Левашев Ю.Н. и соавт, 2006). Доля увеитов туберкулезной этиологии среди общего числа больных с увеальной патологией по-прежнему высока и составляет в среднем около 20% (Шульпина Н.Б., Гонтуар Н.С., 1985; Кацнельсон Л.А., Танковский В.Э., 1998; Хокканен В.М., 1999; Устинова Е.И., 2001, Бурылова Е.А., Черноскутова Э.А., 2006). По данным отделения туберкулеза глаз ФГУ «СПб НИИФ Росмедтехнологий» удельный вес увеитов туберкулезной этиологии среди поступивших больных с воспалительными заболеваниями органа зрения в период с 2002 по 2007 год составляет около 34% .

Основной формой в структуре туберкулезных поражений глаз в современных эпидемиологических условиях являются очаговые хориоретиниты, которые отличаются наибольшей частотой развития осложнений (Тарасова Л.Н. и соавт., 2001; Устинова Е.И., 2002, Ионова О.Г., 2006; Bouza Е. et al., 1997). В активной стадии заболевания для подавления острого воспалительного процесса применяются антибактериальные средства и кортикостероиды (Хоменко А.Г., 1996; Хокканен В.М., 1998, 1999). При лечении туберкулезного хориоретинита в неактивной стадии используют патогенетические средства, направленные на устранение осложнений (Александров Е.И. и соавт., 1995; Тарасова Л.Н., Панова И.Е., 2001; Полунин Г.С., 2002; Устинова Е.И., 2001,

Хокканен В.М. и соавт., 1998, 1999, 2002; Bakkali М., 2001; Ishihara М. 1998; Waheeb S.2001). Однако даже при своевременно начатом лечении, площадь поражения на глазном дне остается значительной. Причиной этого, как правило, является перифокальное воспаление, при котором главным образом страдает пигментный эпителий и как следствие развивается вторичная дистрофия сетчатки.

В последние годы туберкулезные хориоретиниты характеризуются выраженной экссудацией с преобладанием параспецифического компонента воспаления (Азнабаев М.Т. 2003; Хокканен В.М., 2006). По данным литературы (Измайлов А.С., 2001; Ионова О.Г., 2006 и другие авторы), при этом заболевании, особенно при центральной и парацентральной локализации очага, наблюдаются наиболее грозные , осложнения - отслойка пигментного и нейроэпителия, вторичная дистрофия сетчатки, фиброз стекловидного тела, геморрагии, которые приводят к стойкому снижению зрения, вплоть до слепоты.

Необходимость предотвращения возникновения и лечения осложнений требует совершенствования патогенетических методов . лечения (Беллендир Э.Н. 1986, 2000; Иванова JI.A. и соавт., 1998, Ионова О.Г., 2006).

В этой связи остается актуальным поиск новых средств и методов коррекции различных звеньев патологического процесса, позволяющих максимально сохранить клетки сетчатки.

В рамках программ Отделения биологических наук РАН «Фундаментальная наука - медицине» и «Поддержка инноваций и разработок» в Институте физиологии им. И. П. Павлова РАН разработана лекарственная форма препарата «Аноцептин» в виде раствора для инъекций. Действующей субстанцией препарата является производная гамма-пирона - коменовая кислота, получаемая путем прямого химического синтеза. Препарат «Аноцептин» является оригинальным, относится к V классу малотоксичных соединений, не влияет на эмбриогенез, не индуцирует тератогенез и мутагенез, а также не провоцирует рост новообразований. Лекарственная форма стабильна. В настоящее время препарат проходит 1 фазу клинических исследований по безопасности и фармакокинетике как анальгетическое противовоспалительное средство (разрешение Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития N 158 от 03 05.2007 г.).

Анальгетические свойства препарата реализуются за счет непосредственного влияния на систему кодирования ноцицептивной информации, трансдуктором сигнала в которой является Na/K-АТФаза мембраны сенсорных нейронов спинальных ганглиев (Крылов Б.В. и соавт., 1999).

Доклинические исследования показали, что препарат «Аноцептин» стимулирует системный иммунитет за счет повышения фагоцитарной активности макрофагов. Поскольку Na/K-АТФаза проявляет функцию трансдуктора сигнала при регуляции процессов роста и пролиферации, клеток разных тканей (Пеннияйнен В. А. и соавт., 2003; Лопатина Е.В. и соавт., 2005; Xie Z., Askari А., 2002; Schonner W., 2002, 2005), было высказано предположение о том, что препарат «Аноцептин» может оказаться эффективным при лечении туберкулезных хориоретинитов, объединяющих в себе ряд воспалительных и деструктивных изменений в оболочках глазного яблока.

Цель исследования. Изучить влияние препарата «Аноцептин» на ткань сетчатки, в органотипической культуре и оценить перспективы его использования в патогенетической терапии туберкулезных хориоретинитов.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние препарата «Аноцептин» на процесс пролиферации клеток сетчатки в органотипической культуре и оценить возможный механизм действия препарата.

2. Определить клеточный состав эксплантатов ткани сетчатки 10-12 дневных куриных эмбрионов, в условиях органотипического культивирования при использовании препарата.

3. Исследовать влияние препарата «Аноцептин» на рост штаммов М. tuberculosis Н37 Rv и ЛИХТ-98.

4. Оценить эффективность препарата «Аноцептин» как патогенетического средства при лечении экспериментального туберкулезного хориоретинита у кроликов.

Научная новизна.

Исследования, проведенные на эксплантатах ткани сетчатки 10-12 дневных куриных эмбрионов, впервые позволили обнаружить влияние препарата «Аноцептин» на процессы пролиферации нейро- и пигментного эпителия. Экспериментально показано, что в основе механизма действия препарата лежит его способность регулировать трансдукторную функцию Na/K-АТФазы клеток сетчатки. Установлена четкая зависимость роста эксплантатов ткани сетчатки от дозы препарата. Доказано, что препарат «Аноцептин» не оказывает ингибирующего влияния на штаммы M.tuberculosis Н37 Rv и ЛИХТ-98 in vitro. Препарат «Аноцептин» впервые использован в лечении экспериментального туберкулезного хориоретинита и доказана его эффективность как патогенетического средства.

Практическая значимость работы. Полученные данные об эффективности препарата «Аноцептин» на фоне химиотерапии туберкулезных хориоретинитов могут быть использованы при его изучении в условиях другой экспериментальной патологии глаз, а также при проведении второй и третьей фазы клинических испытании, как во фтизиатрии, так и в офтальмологии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Препарат «Аноцептин» регулирует процесс пролиферации клеток ткани сетчатки 10-12 дневного куриного эмбриона в органотипической культуре.

2. Механизм регуляторного действия препарата основан на непосредственном влиянии на трансдукторную функцию Na/K-АТФазы клеток ткани сетчатки.

3. Эффективность препарата «Аноцептин» при включении его в противотуберкулезную терапию не связана с непосредственным влиянием на М. tuberculosis .

4. Препарат «Аноцептин» способствует максимальному сохранению клеток пигментного эпителия сетчатки, что предотвращает ее дистрофические изменения.

Реализация результатов работы

На основании проведенных исследований подана патентная заявка «Регенерирующее противовоспалительное средство и способы лечения с помощью этого средства» N 2007135967/15(039320).

Основные положения диссертации используются в экспериментальных исследованиях отделения туберкулеза глаз ФГУ «СПбНИИФ Росмедтехнологий», научно-исследовательской работе Института физиологии им И.П.Павлова РАН, отдела экспериментальной и клинической фармакологии ФГУ «ФЦСКИЭ им. В. А. Алмазова Росмедтехнологий».

Апробация материалов работы

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на международной конференции Фонда А.фон Гумбольдта (Санкт-Петербург, 2004), на XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург 2004), на конференции «Клеточные технологии в офтальмологии и медицине» (Москва 2005 год); на V международном конгрессе по нейроморфологии, (Санкт-Петербург, 2006). По результатам диссертационного исследования опубликовано 9 работ.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 103 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных методов и результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 179 источников, в том числе 121 отечественный и 58 иностранных. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 16 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. Действие препарата «Аноцептин» на рост эксплантатов ткани сетчатки 10-12 дневных куриных эмбрионов является дозозависимым.

2. В основе механизма нейротрофического эффекта препарата «Аноцептин» лежит его способность регулировать трансдукторную функцию Na/ К-АТФазы клеток сетчатки.

3. В опытах in vitro препарат «Аноцептин» не оказывает антимикробную активность в отношении микобактерий туберкулеза.

4. Использование «Аноцептина» в составе химиотерапии экспериментального туберкулезного хориоретинита сопровождается повышением результатов лечения за счет достоверного уменьшения воспалительных явлений в очаге поражения.

5. «Аноцептин», оказывая активирующее влияние на трофические процессы в сетчатке, на фоне комплексной противотуберкулезной терапии экспериментальных туберкулезных хориоретинитов способствует сохранению клеток пигментного эпителия в 90% в зоне параспецифического воспаления и в 33% в области очага.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современная неблагополучная эпидемиологическая обстановка по туберкулезу в значительной мере связывается с возникновением и широким распространением множественной лекарственной устойчивости в популяциях возбудителя. В клинико-морфологическом плане это сказывается в появлении прогрессирующих форм туберкулеза легких и внелегочного туберкулеза. Течение туберкулезных хориоретинитов, протекающих в последнее время с выраженным параспецифическим компонентом (Ариэль Б.М., Талантов В.А.,2000; Хокканен В.М., 1998, 1999; 2006), в большинстве случаев носит осложненный характер. Хориоретиниты специфической природы, как правило, сопровождаются развитием дистрофических изменений не только в гранулеме, но и в перифокальной зоне, что приводит к образованию абсолютных и относительных скотом и сужению поля зрения. В случае центрального или парацентрального расположения гранулемы резко снижается острота зрения, что способствует длительной потере трудоспособности.

Причины развития вторичной хориоретинальной дистрофии многообразны. В первую очередь изменения на глазном дне возникают вследствие отека в перифокальной области и связанной с этим гипоксией клеток, к которой, как производная нервной ткани, очень чувствительна ткань сетчатки. Нейротоксическое действие противотуберкулезных препаратов и токсичность корд-фактора микобактерий туберкулеза вызывают нарушения функциональной активности клеток сетчатки (Н.А.Шмелев Н.А., Степанян Э.С., 1977).

Гистологические исследования показали, что в гранулеме и прилегающей к ней области в хориоидее и сетчатке многие сосуды находятся в разрушенном состоянии. Нарушается микроциркуляция в слоях внутренней оболочки и метаболизм в клетках сетчатки. Часто возникают ретинальные геморрагии и кровоизлияния в стекловидное тело. Повреждение мембран эритроцитов приводит к гемолизу, распаду гемоглобина и накоплению большого количества ионов железа. Перекись водорода, которая является естественным метаболитом макрофагов и нейтрофилов, мигрирующих к хориоретинальному очагу, взаимодействует с ионами железа. Образующиеся при этом гидроксильные свободные радикалы оказывают повреждающее действие на окружающие ткани, особенно на сетчатку (Полунин Г.С. и соавт., 2000).

Новообразованные сосуды, в свою очередь, прорастают сквозь мембрану Бруха под пигментный эпителий либо через сами дефекты пигментного эпителия, отслаивая его вместе с рецепторным слоем. Все это создает предпосылки к возникновению различных осложнений, в частности — хориоретинальной дистрофии. Возникающие дефекты в пигментном эпителии сетчатки провоцируют нарушение его функций: барьерной, транспортной, абсорбции световой энергии, фагоцитоза наружных сегментов фоторецепторов, метаболизм витамина А ( Миронов?. ^ Э.М., 1990).

На разных этапах заболевания (в основном после купирования острых воспалительных проявлений) при лечении туберкулезных хориоретинитов, помимо этиотропной терапии, применяются различные средства, обладающие ретинопротекторными и ретиностимулирующими свойствами, улучшающие микроциркуляцию и метаболизм тканей, воздействующие на местный иммунитет. Существующие в настоящее время медикаментозные, лазерные и хирургические методы лечения туберкулезных хориоретинитов направлены, в основном, на борьбу с источником заболевания, а не на профилактику осложнений. Кроме этого, многие методы дороги, требуют наличия сложной лазерной или микрохирургической аппаратуры, высококвалифицированного медицинского персонала, должны выполняться несколько раз в год, что не всегда доступно в современных российских условиях.

Поэтому поиск препаратов с различными механизмами действия, воздействующих на разные патогенетические звенья заболевания, способных защитить ткани сетчатки от негативных воздействий эндогенной и экзогенной природы, направленных на предупреждение возникновения вторичных дистрофических изменений, является актуальным и обоснованным.

В данном исследовании в органотипической культуре ткани и модели экспериментального туберкулезного хориоретинита изучено действие оригинального лекарственного препарата «Аноцептин», созданного специалистами Института физиологии им. И. П. Павлова РАН. Действующей субстанцией препарата является производная гамма-пирона коменовая кислота, получаемая путем прямого химического синтеза. Препарат «Аноцептин» является оригинальным, относится к V классу малотоксичных соединений, не оказывает негативного влияния на сердечно-сосудистую, пищеварительную, нервную, репродуктивную системы организма. Специальные исследования показали, что «Аноцептин» не стимулирует рост трансплантируемых опухолей: карциномы Эрлиха и лимфосаркомы Плисса.

Лекарственная форма стабильна и представляет собой раствор для инъекций. Содержание коменовой кислоты (действующей субстанции препарата Аноцептин) в 1 мл 2% раствора составляет 20 мг.

В настоящее время препарат проходит первую фазу дорегистрационных клинических исследований по безопасности и фармакокинетике как анальгетическое противовоспалительное средство (Разрешение Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития N 158 от 3 мая 2007 года).

Анальгетические свойства препарат реализует за счет непосредственного влияния на систему кодирования ноцицептивной информации, трансдуктором сигнала в которой является Na/K-АТФаза мембраны сенсорных нейронов спинальных ганглиев (Крылов Б.В. и соавт., 1999).

Na/K-АТФаза - встроенный в мембрану фермент, регулирующий метаболизм клеток в норме и при развитии патологии. Особенности строения Na+, К+-АТФазы объясняют фармакологические эффекты, веществ модулирующих ее активность.

Na+, К+-АТФаза состоит из трех субъединиц а, (3 и у, каждая из которых имеет изоформы. а-субъединица Na+, К+-АТФазы регулирует каталитические и транспортные свойства фермента, содержит сайты связывания с АТФ, ионами Na+ и К+ и сердечными гликозидами. (3-субъединица необходима для биогенеза и активности ферментного комплекса. Роль у субъединицы №+,К+-АТФазы не ясна (Blanco G, Mercer R.W, 1998; Mobasheri A. et al., 2000).

В качестве ионного насоса Na+, К+-АТФаза регулирует метаболизм клеток, сохраняя в определенном соотношении концентрации ионов Na+ и К+ в цитоплазме (Болдырев А.А., 1998). В последние годы в литературе появились работы, описывающие новые свойства фермента, не связанные с его насосной функцией (Крылов Б.В. и соавт. 1999; Xie Z, 2001; Xie Z, Askari A., 2002; Schonner W, 2002 a. b; Schonner W. 2005).Функция Na+, К+-АТФазы в регуляции процессов, не связанных с активным транспортом ионов через цитоплазматическую мембрану против их химических градиентов, получила название сигнальной или трансдукторной. Она была обнаружена в присутствии низких концентраций сердечного гликозида оуабаина. Термин трансдуктор сигнала был впервые использован при описании участия Na ,К -АТФазы в регуляции пролиферации клеток ткани сердца (Xie Z, 2001).

В настоящее время принято считать, что в качестве трансдуктора сигнала Na+, К+-АТФаза направленно регулирует внутриклеточную сигнализацию и процесс роста и развития клеток разных тканей (Крылов Б.В. и соавт. 1999; Пеннияйнен В. А. и соавт., 2003; Лопатина Е.В. и соавт. 2005 а; Лопатина Е.В. и соавт., 2005 б ; Xie Z, Askari А., 2002; Schonner W, 2002 a.b ; Schonner W. 2005). Наиболее ярко эта функция фермента проявляется при стрессе, возникновении дополнительной нагрузки на организм, утомлении, развитии патологических процессов в клетках и тканях.

Доклинические исследования показали что препарат «Аноцептин» стимулирует системный иммунитет за счет повышения фагоцитарной активности макрофагов. Поскольку, Na/K-АТФаза проявляет функцию трансдуктора сигнала при регуляции процессов роста и пролиферации тканей разного типа (Пеннияйнен В. А. и соавт., 2003; Лопатина Е.В. и соавт. 2005 а; Лопатина Е.В. и соавт., 2005 б; Xie Z, Askari А., 2002; Schonner W, 2002 a,b; Schonner W. 2005), было высказано предположение о том, что препарат «Аноцептин» может оказаться эффективным при лечении туберкулезных хориоретинитов, объединяющих в себе компонент воспаления и элементы деструктивных изменений в оболочках глазного яблока.

В работе исследовали влияние препарата «Аноцептин» на ткань сетчатки, в органотипической культуре и возможность его использования в патогенетической терапии туберкулезных хориоретинитов.

Метод органотипического культивирования ткани позволяет корректно оценить влияние фармакологических агентов на развитие клеточного сообщества, составляющего ткань сетчатки глаза in vitro. При культивировании ткани сетчатки, как правило, изучаются процессы распластывания эксплантатов, морфологическая и функциональная дифференцировка клеток, процесс пролиферации, гистохимические отличия клеток, представленных в ткани сетчатки в культуре и in vivo. Выживание клеток ткани сетчатки в организме зависит как от периферических, так и от центральных трофических воздействий (Викторов И.В. и соавт., 2006).

В опытах in vitro препарат исследован в концентрациях: 10" М, 10"

О 1 Q

М, 10" М, 10" М (в пересчете на действующую субстанцию - коменовую кислоту). Впервые обнаружено дозозависимое действие препарата «Аноцептин» по отношению к регуляции роста эксплантатов ткани сетчатки 10-12 дневных куриных эмбрионов. В концентрациях

10"6 М и

10" М он достоверно угнетал рост эксплантатов сетчатки на 24 % и 17% о соответственно. В концентрации 10" М «Аноцептин» оказывал стимулирующее влияние на рост эксплантатов сетчатки. Индекс площади экспериментальных эксплантатов превышал контрольное значение на 18%. Введение в питательную среду препарата в концентрации Ю"10 М достоверно стимулировало рост эксплантатов сетчатки 10-12 дневных куриных эмбрионов на 50% .

Цитологические исследования показали, что в зоне роста контрольных и экспериментальных препаратов присутствуют клетки пигментного эпителия, ганглиозные клетки, палочки, колбочки.

Поскольку, анальгетические и противовоспалительные свойства препарата «Аноцептин» основаны на модуляции трансдукторной функции Na/ К-АТФазы для того, чтобы выявить возможный механизм обнаруженного трофического действия препарата дополнительно исследовали действие блокатора Na/ К-АТФазы оуабаина на процесс пролиферации клеток сетчатки глаза 10-12 дневных куриных эмбрионов. Затем оценивали стимулирующий эффект препарата «Аноцептин» в присутствии оуабаина.

Блокатор Na/ К-АТФазы оуабаин был исследован в диапазоне

О j j концентраций от 10" М до 10" . Впервые обнаружено, что при введении в питательную среду оуабаина в концентрации 10"8 М рост эксплантатов ткани сетчатки отсутствовал. Последнее, хорошо согласуется с результатами, полученными при исследовании действия оубаина на процессы роста и пролиферации нейритов сенсорных нейронов спинальных ганглиев (Пеннияйнен В.А. и соавт., 2003) и эксплантатов ткани сердца 10-12 дневных куриных эмбрионов (Лопатина Е.В. и соавт., 2005 а,б).

В концентрации 10"9 М сердечный гликозид незначительно угнетал рост эксплантатов ткани сетчатки. Введение в питательную среду препарата в концентрациях Ю"10 М, 10"ПМ, 10~12 М вызывало стимуляцию роста эксплантатов ткани сетчатки от 5% до 18% соответственно. Проведенные исследования впервые позволили обнаружить, что оуабаин в концентрации 10"13 М достоверно стимулирует рост ткани сетчатки на 34%.

Таким образом, нами было обнаружено, что действие оуабаина на регуляцию пролиферации клеток, составляющих эксплантаты ткани сетчатки, является дозозависимым.

Ранее в экспериментах на культуре ткани 10-12 дневных куриных эмбрионов было показано, что в концентрации Ю"10 М оуабаин достоверно стимулирует рост эксплантатов ткани сердца на 30% (Лопатина Е.В. и соавт., 2005) и угнетает рост нейритов сенсорных нейронов на 50% (Пеннияйнен В.А. и соавт., .2003). Анализ полученных результатов и литературных данных (Пеннияйнен В.А. и соавт., .2003; Лопатина Е.В. и соавт., 2005 а, б) позволяет считать, что действие оуабаина в отношении регуляции роста и пролиферации клеток тканей разного типа является дозозависимым, и тканеспецифичным.

При исследовании стимулирующего рост эксплантатов ткани сетчатки действия препарата «Аноцептин» в концентрации 10"lu М в присутствии оуабаина в концентрации полностью ингибирующей рост о ткани сетчатки (10" М) было обнаружено полное снятие ингибирующего эффекта оуабаина. Уровень пролиферации клеток, составляющих ткань сетчатки 10-12 дневного куриного эмбриона, экспериментальных эксплантатов не отличался от контрольного значения.

Полученные данные позволили заключить, что в основе механизма нейротрофического действия препарата «Аноцептин» на клетки ткани сетчатки лежит его способность направленно регулировать трансдукторную функцию Na/ К-АТФазы.

Для того, чтобы оценить перспективы использования препарата «Аноцептин» в патогенетической терапии туберкулезных хориоретинитов в опытах in vitro исследовали действие препарата на штамм M.tuberculosis Н37 Rv и ЛИХТ-98. Было обнаружено, что препарат не обладает ингибирующим эффектом в отношении М. tuberculosis. Результат хорошо сочетался с экспериментальными данными о механизме действия препарата на клеточном уровне, полученными в опытах на культуре ткани сетчатки.

В экспериментах in vivo на модели туберкулезного хориоретинита было изучено влияние препарата «Аноцептин» на течение специфического процесса при парабульбарном введении. Эффективность лечения оценивали по офтальмоскопическим признакам и гистологической картине.

Местного раздражающего действия препарата при его парабульбарном введении не обнаружено. Изменения на глазном дне и в параорбитальной клетчатке отсутствовали. Последнее свидетельствует о безопасности применения препарата «Аноцептин» при таком способе введения.

Влияние препарата «Аноцептин» на течение туберкулезного хориоретинита исследовали у 10 кроликов (20 глаз). Полученные сведения сравнивали с контрольной серией животных, где проводилась лишь стандартная ПТТ.

В обеих сериях животных наблюдали положительную динамику лечения туберкулезных хориоретинитов. Однако, результаты лечения экспериментальных животных основной серии, которые наряду со стандартной ПТТ получали в течение 10 дней 0,5 мл 2% раствора препарата «Аноцептин» парабульбарно превосходили таковые у животных контрольной серии.

Присоединение «Аноцептина» к ПТТ экспериментального туберкулезного хориоретинита способствовало положительной динамике офтальмоскопических показателей (размер очага - d, уровень проминенции - h, экссудации - е).

Так, средний суммарный прирост эффективности лечения туберкулезного хориоретинита по трем тестируемым параметрам за счет применения «Аноцептина» составил 37,7%. Результативность терапии в основной серии по отношению к размеру очага, уровню проминенции, экссудации была на 21%, 77% и 15 % выше, чем в контроле (р<0,01 ).,

В ходе гистологических исследований тканей глазного дна кроликов установлено, что у животных, получавших дополнительно «Аноцептин» на фоне этиотропной терапии, удалось сохранить пигментный эпителий сетчатки не только в перифокальной зоне (90%), но и на периферии очага (33%). В контрольной серии, где проводилась только ПТТ, пигментный эпителий был почти полностью разрушен.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют об эффективности использования препарата «Аноцептин» в комплексной терапии экспериментального туберкулезного хориоретинита.

Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать препарат «Аноцептин» для дальнейших экспериментальных исследований в офтальмологии при лечении другой патологии глаз и использования при проведении второй и третьей фазы клинических испытании, как во фтизиатрии, так и в офтальмологии.