Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Анализ мутаций в генах FLT3, KIT, MLL, NPMI у детей с острым миелоидным лейкозом

004611094

На правах рукописи

Гук Лариса Викторовна

Анализ мутаций в генах FLT3, KIT, MLL, NPM1 у детей с острым миелоидным лейкозом

14.01.21 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 1 OKI 20Ю

Москва 2010

004611094

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии ФГУ ФНКЦ ДГОИ.

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор

Научный консультант: Кандидат биологических наук

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Масчан Алексей Александрович

Савицкая Татьяна Владимировна

Мякова Наталья Валерьевна Маякова Светлана Александровна

Ведущая организация:

ГУ Научный центр здоровья детей РАМН.

Защита состоится ¿2.10.10 -в часов на заседании диссертационного совета в ФНКЦ гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава по адресу 117997, Москва, Ленинский проспект, 117, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ФНКЦ ДГОИ и на сайте www.niidg.ru

Автореферат разослан « 22 » сентября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Чернов Вениамин Михайлович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) представляет собой гетерогенную группу заболеваний, морфологическим субстратом которых являются миелоидные бластные клетки. К лейкозной трансформации при ОМЛ приводит накопление приобретенных соматических генетических изменений в кроветворных клетках-предшественниках.

Спектр молекулярных и генетических аберраций при ОМЛ очень широкий: это изменения числа и структуры хромосом, мутации генов, эпигенетические нарушения регуляции их активности. Клеточные процессы, которые подвергаются патологическим изменениям в результате этих молекулярных нарушений, включают регуляцию пролиферации, дифференцировки и выживания клеток, а также клеточные реакции, отвечающие за репарацию ДНК, стабильность и модулирование хроматина. Несмотря на широкую генетическую гетерогенность ОМЛ, современные модели лейкомогенеза предполагают, что в каждом конкретном случае развитие заболевания может быть вызвано двумя генетическими аберрациями. Была предложена «двухударная» теория патогенеза лейкозов (Gilliland D. 2001). По этой теории, гены, вовлеченные в патогенез ОМЛ, делятся на функциональные группы. Первая группа (класс I) включает гены, мутации в которых вызывают активацию определенных путей сигнальной трансдукции, что приводит к повышенной пролиферации и/или выживанию лейкозных клеток-предшественников. К этой группе относятся мутации, ведущие к активации тирозинкиназных рецепторов FLT3 или KIT, а также мутации генов семейства RAS, JAK2 и других. Вторая группа (класс И) включает мутации и/или хромосомные изменения, которые воздействуют на активность и специфичность факторов транскрипции или компонентов комплекса активации транскрипции и модулирования хроматина. Такие мутации приводят к возникновению блока дифференцировки кроветворных клеток-предшественников. Результатом мутаций II класса являются химерные гены, возникающие при хромосомных транслокациях t(8;21), inv(16), t(16;16) и t(15;17), а также при многочисленных хромосомных аберрациях, затрагивающих локус llq23 (ген MLL). В эту же группу относятся и мутации в генах СЕВРА и, возможно, NPM1 (Dohner Н., 2007). К «наработке» лейкемического клона приводит только сочетание мутаций I и II класса.

Хотя при большинстве лейкозов удается выявить повторяющиеся или «случайные»

нарушения кариотипа, примерно у 30 % больных с ОМЛ никаких цитогенетических отклонений

выявить не удается, и такие лейкозы условно носят название лейкозов с «нормальным

3

кариотипом». В последние годы у таких больных был выявлен целый спектр онкогенных мутаций, представляющих собой в основном точечные мутации и дупликации небольших генных фрагментов. Сегодня эти мутации стали существенным фактором прогноза ОМЛ и определения стратегии лечения (Dohner Н., 2007). К наиболее часто наблюдаемым подобным мутациям относятся:

- мутации в гене нуклеофосмина (NPM1, хромосомная локализация - 5q35), который кодирует ядерный фосфопротеин с многочисленными функциями (Grisendi S., 2005). Мутации в гене NPM1 являются самой распространенной генетической аберрацией при ОМЛ у взрослых людей (около 35% всех случаев ОМЛ и около 60% случаев ОМЛ с нормальным кариотипом). У детей NPM1 мутации встречаются реже (около 10% всех случаев ОМЛ и приблизительно 25% случаев ОМЛ с нормальным кариотипом) и связаны с благоприятным прогнозом (Wertheim G., 2008).

- ген FLT3 (13ql2.2) кодирует тирозинкиназный рецептор III класса. Наиболее распространенными мутациями в гене FLT3 являются внутренние тандемные дупликации (ITD) в околомембранном домене и точечные мутации в тирозинкиназном домене (TKD), которые приводят к активации рецептора и ассоциируются с высоким риском реццдива и низкой общей выживаемостью (Бавыкин А., 2006; Kaspers G., 2007; Krstovski N., 2009). Мутации FLT3/ITD у взрослых с ОМЛ встречаются более чем в 30% случаев ОМЛ с нормальным кариотипом, в то время как FLT3/TKD - в 10-15% случаев (Schlenk R., 2008). У детей FLT3/ITD и FLT3/TKD типы мутаций встречаются примерно с одинаковой частотой - 5-10% (Kaspers G., 2007; Krstovski N., 2009). Если FLT3/ITD связаны с неблагоприятным прогнозом, то FLT3/TKD мутации не оказывают влияния на частоту ремиссий, но снижают общую и безрецидивную выживаемость (Thiede Ch., 2002; Thiede Ch., 2003). По мнению других авторов, мутации FLT3/TKD не влияют на показатели общей и безрецидивной выживаемости (Frohling S.,2002; Yamamoto Y., 2001).

- ген KIT - также как и ген FLT3 кодирует рецепторную тирозинкиназу, которая вместе со своим лигавдом - фактором стволовых клеток (stem cell factor, SCT), играет ключевую роль в выживании, пролиферации и дифференцировке кроветворных клеток-предшественников (Lennartsson J.,2005; Ronnstrand L., 2004]. Мутации в гене KIT найдены приблизительно в 30% случаев ОМЛ с геномными нарушениями в CBF генах и реже при других вариантах ОМЛ. У детей частота встречаемости мутаций в KIT гене при

ОМЛ - около 5% (Kaspers G., 2007). Мутации в гене KIT обычно ассоциируются с высоким риском рецидива и снижением общей выживаемости (Shimada А., 2006); - MLL (myeloid/lymphoid = mixed lineage leukemia, llq23) - ген, кодирующий ДНК-связывающий белок, который регулирует генную экспрессию при гемопоэзе. MLL является ключевым белком модулирования хроматина, который входит в комплекс транскрипции многих генов (Krivtsov А., 2007; Slany R., 2009). Ген MLL имеет более 100 хромосомных транслокаций, с образованием химерных генов, которые ассоциированы со многими вариантами острого лейкоза, в том числе обусловленными действиями терапии (therapy related leukemia; t-AML или t-ALL) (Daser A., 2005; Liedtke M., 2009). У пациентов с 1 Iq23/MLL - реаранжировкой прогноз расценивается как «промежуточный» и плохой; частота достижения ремиссии у этих больных высокая, но выживаемость низкая. Прогноз у взрослых пациентов и у детей с t(9;l I)(p21;q23) лучше, чем у больных с другими транслокациями, в которые вовлечен гене MLL. В гене MLL выявлен другой тип аберрации, при котором происходит копирование небольшого кодирующего участка 5' области гена, получившей название «частичная тандемная дупликация» (PTD). MLL/PTD аберрация выявляется приблизительно в 5-10% случаев ОМЛ с нормальным кариотипом, и связана с неблагоприятным прогнозом (Basecke J., 2006). Мутации отдельных генов при ОМЛ не всегда являются однозначными факторами прогноза, и зачастую течение болезни определяется комбинацией генных мутаций и соотношением экспрессии мутантного и нормального аллелей, а так же тактикой терапии. В частности, это справедливо для мутаций генов FLT3 и NPM1. Исследование мутаций в некоторых важнейших генах миелопоэза у детей с ОМЛ и стало предметом данного исследования.

Цель исследования:

Охарактеризовать мутации генов KIT, FLT3, MLL, NPM1, оценить их частоту и прогностическое значение у детей больных ОМЛ. Задачи исследования:

1. Сравнить частоту выявления мутаций в генах FLT3, KIT, NPM1, MLL в архивном материале (препараты костного мозга больных на предметных стеклах, замороженные образцы венозной крови и костного мозга) и в свежеприготовленном костном мозге у детей с ОМЛ.

2. Оценить частоту и характеристики мутаций в генах FLT3, KIT, NPN1 и MLL у пациентов с ОМЛ в сравнении со здоровыми донорами - добровольцами.

3. Сравнить клинико-гематологические характеристики ОМЛ с мутациями FLT3, KIT, NPMI и MLL с ОМЛ без мутаций в данных генах.

4. Провести оценку результатов терапии у детей с ОМЛ в зависимости от выявленных мутаций.

Научная новизна:

Оптимизированы методики для выявления молекулярных изменений в генах FLT3, KIT, NPM1 и MLL. Молекулярно-генетический анализ нуклеотидных последовательностей в клетках здоровых доноров и пациентов позволил выявить ранее не описанные нейтральные точечные замены в нуклеотидных последовательностях генов KIT, NPMI, а также мутации в генах FLT3 и KIT.

Показано неблагоприятное влияние внутренних тандемных дупликаций в гене FLT3 на прогноз детей с ОМЛ, несмотря на проведение интенсивной химиотерапии с высокой «плотностью» дозы.

Практическое значение:

Внедрение в практику методик по выявлению мутаций гена FLT3, KIT, NPMI, MLL расширяет представление о патогенетических механизмах ОМЛ, позволяет осуществлять дифференцированный подход к лечению больных и создает методологическую основу для разработки эффективной терапии.

Скрининг указанных генов в контрольной группе исключает ошибочную интерпретацию факта не описанных ранее изменений нуклеотидных последовательностей как мутаций, связанных с развитием ОМЛ у детей.

Положения, выносимые на защиту

При молекулярно-генетическом исследовании у 14,5 % (18/124) пациентов обнаружены мутации гена FLT3.

Наличие мутаций гена FLT3 у больных с ОМЛ ассоциировано со статистически значимым снижением безрецидивной выживаемости по сравнению с пациентами без мутаций: 0.22 против 0.52 соответственно, р=0,03..

В генах NPMI и KIT были обнаружены ранее не описанные изменения нуклеотидной последовательности, являющиеся аллельными полиморфизмами, что было показано в результате скрининга контрольной группы.

У 1 (55) пациента в гене KIT обнаружена вставка шести нуклеотидов, не приводящая к сдвигу рамки считывания. Для оценки влияния мутаций гена KIT на развитие OMJI у детей требуется дальнейшее исследование.

При молекулярно-генетическом исследовании гена MLL у исследуемой группы пациентов не были выявлены внутренние тандемные дупликации.

Апробация диссертации

Основные положения диссертации доложены на VII Международном симпозиуме «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний» (Москва, январь 2009 г.). Апробация работы состоялась 30.06.2010 г. на совместном заседании лаборатории молекулярной биологии ФНКЦ ДГОИ, отдела координации и планирования научных исследований ФНКЦ ДГОИ, отделом молекулярной и экспериментальной гематологии, онкологии и иммунологии ФНКЦ ДГОИ и отделений гематологии и трансплантации костного мозга.

По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Федерального научно-клинического центра гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития на базе Российской детской клинической больницы Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из 4 глав: обзора литературы, главы материалы и методы, главы собственных результатов исследования и обсуждения, выводов, приложения, указателя литературы, включающего 7 отечественных и 68 иностранных источника. Работа изложена на 90 страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 таблицами и 38 рисунками.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Пациенты. В исследование были включены 124 ребёнка, в возрасте от 1 месяца до 18 лет (медиана 10,70 лет), поступивших в клиники-участницы исследования с 1999 года по 2009 год, мальчиков 79 (63,7%), девочек 45 (36,8%). Соотношение пациентов мужского и женского пола -1,75:1. Шестьдесят девять детей были включены в исследование в РНПЦ ДОГ, Республика Беларусь, Минск; 48 - в ФГУ ФНКЦ ДГОИ на базе РДКБ, Москва; 7 - в МДГКБ Москва.

7

Морфологические характеристики. В табл. 1 представлена частота различных вариантов О МЛ в группе детей, включённых в исследование.

Таблица 1. Структура морфологических характеристик ОМЛ в исследуемой группе.

Вариант ОМЛ Количество пациентов(п=124)

МО 2,4% (3)

М1 15,3% (19)

М2 33% (41)

МЗ 5,6% (7)

М4 16,1% (20)

М4Е0 1,6% (2)

М5 16,9% (21)

Мб 4,8% (6)

М7 2,4% (3)

MX 1,6% (2)

Как видно из табл. 1, М2 вариант ОМЛ встречается у 33% больных, следующим по частоте идёт вариант М5 - 16,9%, М4 - 16,1% больных, М1 - 15,3%, МЗ - 5,6%, Мб - 4,8%, М7 - 2,4%, МО -2,4%, МХ - 1,6%, М4Е0 - 1,6% пациентов.

Терапия исследуемой группы пациентов. Терапия исследуемой группы пациентов представлена в табл. 2. Содержание протоколов представлено в приложениях 1-7.

Таблица 2. Протоколы лечения исследуемой группы пациентов

Протокол Количество пациентов ((п=124)

AML-BFM-87 (приложение 1) 1,6% (2)

AML-BFM -93 (приложение 2) 4% (5)

ОМЛ-ММ - 2000 (приложение 3) 75% (93)

ОМЛ-ММ -2006 (приложение 4) 10,4% (13)

APL-2003 (приложение 5) 4% (5)

APL-98 (приложение 6) 1,6% (2)

TRIAL-Relapsed AML 2001/2002. (приложение 7) 5,6% (7)

Цитогенетические характеристики больных. Хромосомный анализ был проведён у 108/124 (87,1%) больных. Аномалии кариотипа были обнаружены у 80/124 больных (64,5%)

(табл. 3). Подробное описание индивидуального кариотипа представлено в диссертационной работе на стр.34.

Таблица 3. Аномалии кариотипа выявленные в исследуемой группе пациентов

Кариотип Число больных

Вся группа 108

Нормальный кариотип 30

Аномалии региона 11ц23 15

Сложный кариотип 10

Потеря хромосом 6

^8;21) 26

1(15,17) 8

Н1У(16) 10

1(3 ;5) 1

1(4; 10) 1

Кб; 14) 1

Молекулярно-генетические характеристики больных. Молекулярно-генетическое исследование на наличие в клетках костного мозга (к.м.) больных химерных онкогенных мРНК (транскриптов) было проведено у 116/124 (93,5%) пациентов. Аномальные транскрипты обнаружены у 57/116 (59,1%) (табл. 4).

Таблица 4. Аномальные транскрипты выявленные в исследуемой группе больных ОМЛ

Аномальные транскрипты Число больных

AML1/ETO 28

CBFB/MYH1 9

MLL/AF9 8

MLL/AF10 3

NPM/ML 1

SET/SCAN 1

dupllMLL/MLL 2

PML\RARA 5

Диагностика ОМЛ. Морфологические исследования у больных ОМЛ (гемограмма, миелограмма с цитохимическим исследованием, анализ иммунофенотипа и исследование ликвора) проводили в лаборатории морфологии ФГУ ФНКЦ ДГОИ, Москва (заведующая -к.м.н. Л.В. Байдун) и в клинико-диагностической лаборатории РНПЦ ДОГ, Минск (заведующая -Н.В. Липай).

Хромосомный анализ лейкемических клеток, методом в-окрашивания, проводили в лаборатории цитогенетики Института Канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Блохина РАМН, Москва (руководитель научной группы - д.м.н. Е.В. Флейшман) и в лаборатории молекулярное генетических исследований научного отдела РНПЦ ДОГ, Минск (заведующий лабораторией -к.б.н. Т.В. Савицкая).

Молекулярно-генетическое исследование химерных генов методом мультиплексной ПЦР кДНК генов слияния АМЬ/ЕТО, СБИр-МУНП, РМЬ-ЯАЯа, МШАТ4, МШАР9, Л/ШЕЫ, МШАПц, МША?6, МШМИ проводили в Центре биологических микрочипов НИИ Молекулярной биологии им. Энгельгардта РАН, Москва (руководитель научной группы - д.б.н. Т.В. Наседкина) и в лаборатории молекулярно-генетических исследований научного отдела РНПЦ ДОГ, Минск (заведующий лабораторией - к.б.н. Т.В. Савицкая).

Диагностические критерии ОМЛ. Диагноз ОМЛ ставили согласно критериям ВОЗ (1999 год) при обнаружении 20% и более лейкемических бластов в аспирате костного мозга. Пациенты с цитогенетичекими аномалиями 1(8;21) (ц22;ц22), ¡пу (16)(р13ц22) или с 1( 16; 16)(р13;ч11), 1(15;17)(я22;ц21) считаются ОМЛ независимо от содержания бластных клеток.

Цитохимическое исследование: 3% и более бластов дают при окраске положительную реакцию на миелопериксидазу или Судан чёрный В, диагностируется ОМЛ. Если бласты пероксидазонегативны, но позитивны в реакции на бутират или неспецифическую нафтил ацетат эстеразу, то так же диагностируется ОМЛ.

Иммунологические характеристики миелойдной дифференцировки: линейно неспецифические маркёры гемопоэтических предшественников С034, НЬА-ОЯ; панмиелойдные маркёры СШЗ, СЭЗЗ, С056; маркёры, ассоциированные с моноцитами и гранулоцитами СО 14, СО]5; линейно специфические мегакариоцитаные маркёры С041, С061; внутриклеточная миелопероксидаза МПО.

Контрольная группа. В качестве контрольной группы использовались замороженные образцы венозной крови 32 взрослых здоровых доноров-добровольцев, не являющихся родственниками пациентов.

Получение материала и его характеристика. В качестве материала использовали архивные и свежеприготовленные образцы:

• замороженные образцы костного мозга больных (11 образцов).

• замороженные образцы венозной крови больных (при наличии лейкемических клеток в периферической крови) (3 образца).

• препараты костного мозга больных на предметных микроскопических стеклах (41 образец).

• свежеприготовленные образцы костного мозга (69 образцов).

Выделение ДНК. ДНК из архивных образцов выделяли с использованием набора «ДНК-сорб-В» (производства АмплиСенс, Москва) ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора в соответствии с методикой производителя. ДНК из свежеприготовленных образцов выделяли с использованием протеинкиназы К и фенольной экстракции (Маниатис Т., 1984).

Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Таблица 5. Последовательность праймеров, использованных для проведения ПЦР

Название 5'-3' последовательность

FLT/ITD 11F GCA ATT TAG GTA TGA AAG CCA GC

FLT/ITD 12R CCT TCA GCA TTT TGA CG G CAA CC

FLT3 14exF GAC TCA TCA TTT CAT CTC TGA AGC

FLT3 14exR CAT TTG GCA CAT TCC ATT CTT AC

FLT3 15exF ACG TAC TCA CCA TTT GTC TTT GC

FLT3 15cxR TGC TGT CCT TCC ACT ATA CTG TAC С

FLT3 20exF ACT CTG GTG TCA TTC TTG ACA GTG

FLT3 20exR GAA ATA GCA GCC TCA CAT TGC

FLT3 AL F CCG CCA ACG TGC TTG

FLT3 AL R CAC AGT AAT ATT CCA TAT GAC CAG A/A TC

CKIT 8exF АСА TAT GGC CAT TTC TGT TTT CC

CKIT 8exR TGC CAA AAA TAA TCA TCT CAC CTC

CKIT 9exF TTC TTC CCT TTA GAT GCT CTG С

CKIT 9exR ATA TGG TAG ACA GAG CCT AAA CAT CC

CKIT 10-1 lexF TCC АСА TTT CTC TTC CAT TGTAGA G

CKIT 10-llexR AGC CCC TGT TTC ATA CTG ACC

CKIT 17exF TCT CCT CCA ACC TAA TAG TGT ATT CAC

CKIT 17exR TCA AGC AGA GAA TGG GTA CTC AC

CKIT 18exF TGT GCT TCT ATT АСА GGC TCG AC

CKIT 18exR TGG CAA GGA TCA TTT TAC СТА AAG

NPM1 12exF GAA GTG TTG TGG TTC CTT AAC CAC

NPM1 12exR CAG TTA AAT AAG TCA ATA GAA ACC GTG С

MLL 2exF FAM - CCT TTG TTG TAG GAT GAG CAA TTC

MLL 2exR AGA AGG CAA GAG GAA GCC AC

MLL 4exF FAM - TAT TGT TTT TGG ATT GCC TCA TAT TC

MLL 4exR TGA CCT TCT TGA CCT ACC АТС ATT С

MLL 6exF FAM - TTG TTT TCC TAG GAT GAG AAA ATG TC

MLL 6exR TTT AAC AAC ACT ACC TTT AGC TTG CTT С

MLL 22exF FAM - GAG ATG TGA ATT CTG CCA AAA GC

MLL 22exR CCT TTG АТС AAA TCC CGA TGT С

B2M 2exF FAM - TAT TCC TCA GGT ACT CCA AAG ATT CAG

B2M 2exR AAA GAA TGT AAG ACT TAC CCC ACT TAA СТА TC

В праймер FLT3 AL R, внесена нуклеотидная замена (G на Т), которая приводит к появлению сайта узнавания рестриктазой EcoRV (выделена жирным шрифтом и курсивом).

ПЦР из архивных образцов проводили по стандартной двухпраймерной схеме. Последовательность праймеров представлена в табл. 5.

Реакционная смесь для генов FLT3, KIT, NPM1 и MIL в конечном объёме 25 мкл содержала: 0,25 мкг ДНК, по 5 пкмолей каждого праймера, по 25 ммоль дНТФ, 1 единица активности Taq ДНК-полимеразы (производства «ИЗОГЕН»), ПЦР буфер (производства «ИЗОГЕН»), MgCh в соответствии с условиями, подобранными при оптимизации ПЦР.

ПЦР проводили в автоматическом режиме, используя амплификатор Dyad. Амплификацию для генов FLT3, KIT, NFMI и MLL проводили в следующем режиме: 95°С - 5 мин

94°С- 15 сек 65°С -15 сек 72°С - 45 сек

10 циклов

94°С- 15 сек 55°С- 15 сек 72°С-45 сек

20 циклов

Анализ мутаций проводился методом прямого секвенирования.

Анализ мутаций в гене FLT3 из свежеприготовленных образцов проводился по описанной ранее методике (Mills К., 2005). Последовательность праймеров для выявления тандемной дупликации гена FLT3 (FLT/ITD) и для амплификации последовательности, кодирующей киназный домен (FLT3 AL) представлена в табл. 5.

Длина 1TD определялась как разница длины ПЦР фрагмента нормального гена FLT3 и длины мутантного ПЦР фрагмента.

В петле активации киназного домена FLT3 определяли точечные мутации, замены остатка аспарагиновой кислоты в позиции 835 и/или остатка изолейцина в позиции 836 (D835/I836). Эти мутации приводят к потере сайта узнавания для рестриктазы EcoRV (GATATC), что позволяет различать нормальную и мутантную формы гена FLT3.

Очистка продуктов амплификации генов FLT3, KIT, NPM1. Очистку продукта амплификации проводили осаждением 96% этиловым спиртом в присутствии ацетата аммония. Качество продукта ПЦР и его концентрацию определяли методом вертикального электрофореза. После очистки 2 мкл растворенного в воде амплификата смешивали с буфером для электрофореза, содержащим бром-феноловый и ксилен-цианоловый красители, и наносили на 8%-ный полиакриламидный гель (соотношение акриламида и бис-акриламида 29:1,3). Гели окрашивали раствором бромистого этидия (0,1мкг/мл) в течение 10 минут и визуализировали продукты ПЦР в ультрафиолетовом свете.

Проведение реакции секвенирования. Реакция секвенирования проводилась по протоколу фирмы - производителя Applied Biosystems с использованием набора реагентов Big Dye Terminator vl.l Cycle Sequencing KIT, 3 - 25нг продукта ПЦР и 5 пкмолей праймера. Очистку продукта секвенирования проводили осаждением 96% этиловым спиртом в присутствии ЭДТА.

Электрофорез проводили на приборе Applied Biosystems 3130x1 согласно протоколу фирмы - производителя RapidSeq36_POP7_l. Анализ первичных данных осуществлялся по протоколу фирмы - производителя 3130_POP7_BDvl. Определение нуклеотидной последовательности проводилось в программе Sequencing Analysis 5.2.

Фрагментный анализ гена MLL проводили на приборе Applied Biosystems 3130x1 согласно протоколу фирмы - производителя FragmentAnalysis36_POP7_l в присутствии GeneScan - 500 LIZ Size Standard. Для анализа результатов использовали программу Gene Mapper v.4.0. Оценка результатов проводилась по протоколу Loss of Heterozygosity Analysis фирмы - производителя.

Результаты исследования

Оптимизированы методики для выявления мутаций в генах FLT, KIT, NPMI и дупликаций в гене MLL.

Для уточнения частот встречаемости мутаций в указанных генах использовалась электронная база данных Wellcome Trust Sanger Institute (www.sanger.ac.uk).

В соответствии с этими данными были разработаны и оптимизированы полимеразные цепные реакции для амплификации последовательностей тех экзонов генов FLT, KIT, NPMI, в которых данным мутации у взрослых пациентов встречались не реже чем в 1% образцов (табл.6).

Таблица 6. Экзоны генов FLT, KIT, NPMI, в которых мутации у взрослых пациентов встречались не реже чем в 1% образцов

№ Ген Экзон

1. NPM1 12

2. FLT3 14, 15,20

3. KIT 8,10 + 11,17,18

Наличие мутаций определялось методом прямого секвенирования.

По литературным данным внутренняя дупликация гена МП приводит к тандемному удвоению семи экзонов (с 3 по 9) (Са^шп М.А., 1997; БоИпег К., 2005). Для выявления дупликации были подобраны условия для попарных амплификаций 2, 4, 6 и 22 экзонов. При этом один экзон из области дупликации (4 или 6) амплифицировался одновременно с одним контрольным экзоном, расположенным за пределами дупликации (2 или 22). ПЦР-реакции были оптимизированы на образцах доноров таким образом, чтобы в каждой реакции эффективность амплификации экзона из области дупликаций и контрольного экзона были одинаковы.

После ПЦР с меченными праймерами проводился фрагментный анализ ПЦР-продуктов.

Анализ мутаций в исследуемой и контрольной группах. В табл. 7 представлено

количество проанализированных пациентов и доноров.

Таблица 7. Количество пациентов и здоровых доноров-добровольцев проанализированных по 8, 9, 10-11, 17, 18 экзонам гена К1Т, 14, 15, 20 экзонам гена ЯТЗ, 12 экзону гена К'РАП, 2, 4, 6, 10, 22 экзонам гена МП

Проанализированные экзоны Количество пациентов Количество здоровых доноров - добровольцев

Ген KIT

8,17,11 экзоны 65 32

9,10,18 экзоны 55 32

Ген FLT3

14,15 экзоны 124 32

20 экзон 84 32

Ген NPMI

12 экзон 55 32

Ген MLL

2,4,6, 10,22 экзоны 23 32

Результаты исследования контрольной группы

При тестировании контрольной группы из 32 здоровых доноров-добровольцев у двоих человек был выявлен ранее не описанный аллель гена KIT: замена аденина на цитозин в положении 1621, приводящая к замене метионина на лейцин в кодоне 541 в 10 экзоне, частота 3,1 % (2 из 64 хромосом). Указанный аллель в гетерозиготном состоянии был также выявлен у 2 пациентов, частота составляет 1,8% (2 из 110 хромосом).

При тестировании контрольной группы у 19 человек была выявлена ранее не описанная делеция тимина в положении 1621 в 5' некодирующей области мРНК гена NPM1 в гетерозиготном состоянии. Та же делеция была выявлена в гетерозиготном состоянии у 6 пациентов. Аллельная частота составляет 18,7 % (6 из 32 хромосом).

Результаты исследования пациентов с OMJI

В результате молекулярно-генетического исследования, мутации гена FLT3 обнаружены у 14,5% пациентов. Из них: внутренняя тандемная дупликация обнаружена у 12,9% пациентов (15/124) и у 3,6% (3/84) - мутации в 835 кодоне последовательности, кодирующей киназный домен. В табл. 8 представлена частота встречаемости мутаций гена FLT3 и вариант ОМЛ при котором эта мутация встречается, у исследуемой группы пациентов.

Таблица 8. Частота встречаемости мутаций гена РЬТЗ у исследуемой группы пациентов при

различных вариантах ОМЛ

Вариант ОМЛ. Частота встречаемости мутаций гена РШ. FLT3/ITD FLT3/TDK

М1 22,2% (4/18) 4/4

М2 50% (9/18) 8/9 1/9

МЗ 5,5% (1/18) 1

М4 11% (2/18) 1/2 1/2

М5 11% (2/18) 1/2 1/2

Как видно из табл. 8, мутации гена встречаются при М2 варианте О МЛ в 50% случаев, М1 - 22,2%, М4 - 11%, М5 - 11%, МЗ- 5,5%.

Клиническая характеристика 18 пациентов с мутацией гена РЬТЗ представлена в табл. 9 - 10.

Таблица 9. Характеристика 18 пациентов с мутацией гена Е1ТЗ

№ пациента

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Пол м M M M M M ж м м

Возраст (годы) 13 11 13 1 5 14 8 15 14

РАВ М2 M2 М2 МЗ М2 М5 М4 М2 Ml

Цитогенетика 46XY данных нет 46XY 46XY 1(15;17) 46XY-13 мег,46Х Y,del(9)(p 13р22)-4 мет. 46XY 46ХХ 47,XY,+8 46XY, l(6;14Xq2J-24;q32) • 27 мет., 45XY.t(6;14X q23-24.q32),-21-3 мет.. 43XY.H6.14X q23-24;q32), -14.-16.-21 2 мет.

Молекулярная биология del(16) q23 нет нет нет нет нет нет нет нет

Мутация гена РЬТЗ ITD ITD ITD ITD ITD ITD D835-Y835 ITD ITD

Бластоз в к/м 41% 40,8% 55,6% 67% 44% 86% 92% 85,5% 90%

Лейкоциты (тыс/мкл) 4 29 41 120 4,4 22,2 102 102 73,8

Бласты п/к 67% 71% 74% 92% 0 42 87% 87% 41%

Печень (см) 0 0,5 1,5-1 4 2 2,5 2 5 3

Селезёнка (см) 0 0 0,5 2 0 0 5 3 0,5

Поражение ЦНС ЦНС I ЦНС I ЦНС I ЦНС I ЦНС I ЦНС I ЦНС I ЦНС IV ЦНС I

Терапия ОМЛ (протокол) AML-BFM-87 AML-BFM-S7 AML-BFM-93 APL-98 омл-2000 ОМЛ-2000 омл-2000 ОМЛ-2000 омл-2ооо

Ремиссия после индукции (да/нет) нет да да да да да да да да

ППР нет 11,2 8,8 3,3 13,66 9,3 62,23 9,23 14,46

Рецидив: к/м, к/м+ЦНС рефракт ерноетъ к/м к/м нет к/м к/м к/м к/м к/м

Исход заболевания: Смерть от рецидива Смерть or рецидива Смерть ОТ рецидива смерть в ремисии Смерть от рецидива Смерть от рецидива Смерть от рецидива Смерть от рецидива Смерть от рецидива

Таблица 10. Характеристика 18 пациентов с мутацией гена FLT3 (продолжение табл.9)

№ пациента

10 п 12 13 14 15 16 17 18

Пол м м ж м ж ж м м м

Возраст (годы) 1 15 9 11 17 15 11 17 4

FAB М5 Ml Ml М2 М2 М4 М2 Ml М2

Цитогенетика 46.XY, t(9;UXp22,q2 3)-1Э 47,XY,1(9;1IX p22,q23).+ 197 метафаэ. 46 XY, t(4;10) 47ХХ;+ 8 43 X,-Y,t (8,21)(q2 2;q22)- 9 мет., 46 XY-6 мет 46ХХ 47,XX,+8 данны х нет 46 XY 46,XY, tftll)

Молекулярная биология MLL/ AF9 данных нет нет AML1/ ЕЮ нет AML1/ET0 данных нет нет MLL/AF9

Мутация гена FLT3 D835-Н835 ITD ITD ITD D835-Y835 ITD ITD ITD ITD

Бластоз в к/м 74,5% 90% 89,5% 47% 85% 62,5% 66,5% 70% 85%

Лейкоцитоз 220 34,2 325 ЗД 11,3 10,6 2,6 28,1 6,3

Бласты п/к 51% 64% 94% 26% 64% 52% 4% 76% 26%

Печень (см) 9 1 4 2 2 2 1 0 2

Селезёнка (см) 4 0 4 1 1,5 0 0 0 0

Поражение ЦНС ЦНС I ЦНС I ЦНС I ЦНС IV ЦНС I ЦНС I ЦНС I ЦНС I ЦНС I

Терапия ОМЛ (протокол) ОМЛ-2000 омл-2006 омл-2006 омл-2000 омл-2000 омл-2000 омл-2006 ОМЛ-2000 ОМЛ-2000

Ремиссия после индукции (да/нет) да да да да да да да да да

ППР 8,7 14,46 15 70,4 71,83 18,4 11,95 6,63 6,03

Рецидив: к/м, К.М.+ЦНС к/м к/м нет нет нет к/м к/м к/м к/м

Исход заболевания: Смерть от рецидива I1CCR смерть в ремисии ICCR ICCR Смерть от рецидива IICCR Смерть от рецидива Смерть от рецидива

Из таблиц 9-10 видно, что у детей с ОМЛ с нормальным кариотипом мутации гена FLT3 встречаются в 33,33% случаев (6/18). Основную группу больных с мутацией гена FLT3 составляют больные с М1и М2 - вариантами OMJI - на их долю приходится 72,2% среди всех обследованных больных с данной мутацией. В результате исследования не выявлено возрастных различий у детей с ОМЛ с мутациями гена FLT3 и без мутаций, что составляет 12,48 и 10,35 лет соответственно. У взрослых пациентов с мутацией гена FLT3, выше количество лейкоцитов и процент бластных клеток в крови и костном мозге. В то же время у детей с FLT3/ITD не обнаружено ни характерного для взрослых более высокого лейкоцитоза, ни более высокого процента бластных клеток в крови и костном мозге. Дети с ОМЛ и мутацией гена FLT3 не имеют ни морфологических, ни генетических отличий по сравнению с детьми с ОМЛ и без мутации гена FLT3.

Результаты ТГСК у 8 больных с мутацией гена FLT3. После ТГСК рецидивировали 75% (6/8), рефрактерные 12,5% (1/8), в ремиссии 12,5% (1/8), умерли 87,5 (7/8). Несмотря на то, что количество пациентов вошедших в исследование с ТГСК и мутацией гена FLT3 небольшое, можно сделать вывод, что включение в лечебную программу ТГСК не дает преодолеть негативное влияние мутации гена FLT3.

Результаты терапии всей группы пациентов с мутацией и без мутации гена FLT3 представлены в табл. 11. На рис. 1-3 представлена вероятность бессобытийной (EFS), безрецидивной (RFS) и общей выживаемости (OS) больных.

Таблица 11. Результаты терапии в группе пациентов с мутацией и без мутации гена РЬТЗ

Результаты терапии Число больных с мутацией гена FLT3. Число больных без мутации гена FLT3.

Число больных во всей группе 18 106

Смерть в индукции 0/18 9/106 (8,4%)

Ремисссия 17/18 (94,44%) 91/106 (86 %)

Рефрактерность 1/18(5,5%) 4/106 (3,7%)

Потерян 0/18 2/106(1,9%)

I ППР 2/18(11,1%) 41/106 (38,6%)

Медиана I ППР, мес 56,2 74,5

Смерть в ремиссии 2/18(11,11%) 11/106 (10,37%)

Рецидивы 14/18 (77,7%) 41/106 (38,6%)

ЕР5 0,16±0,07 0,43±0,05

0,22 ±0,10 0,52 ± 0,05

ОБ 0,17±0,10 0,54± 0,05

0.7

ё о.б

0,5 \ц пациенты 0еэ мутации гена Я.ГЗ (С14Э-*-0.05)

пациенты с мутациеи гена РС.ТЭ (0,16-*-0,07)

20 40 60 во 100 120 140

Рисунок 1. Вероятность ЕББ у 106 пациентов без мутации гена ПТЗ составляет 0,43 ± 0,05 и у 18 пациентов с мутацией гена ГЬТЗ 0,16 ± 0,07, достоверность р>0,05.

0,7

I °'6

о 0.5 0,4 0,3

пациенты без мутации генаЯ1ГЗ (0,54+-0,05)

пациенты с кугациеи гена/^ГЗ(0.17+-0,10)

О 20 40 60 80 100 120 140 160

Рисунок 2. Вероятность 08 у 106 пациентов без мутации гена П,ТЗ составляет 0,54 ± 0,05 и у 18 пациентов с мутацией гена ПТЗ 0,17 ± 0,10, достоверность р>0,05.

0,9

О,В

е

i

0.7

0.6

пациенты без мутации reHafiT3 р ,52+^3,05)

т 0,4

пациенты с мутацией гена ПГЗ Р.22*-0,10]

0.3

0,2

0,1

0,0

О

20

40

GO GO 100 120 140 1Б0

Рисунок 3. Вероятность RFS у 106 пациентов без мутации гена FLT3 составляет 0,52 ± 0,05 и у 18 пациентов с мутацией гена FLT3 0,22 ± 0,10, достоверность р<0,05.

Как видно из приведённых данных, в группе детей без мутации гена FLT3 вероятность долгосрочной бессобытийной выживаемости была выше, чем в группе детей с мутацией гена FLT3 (0,43±0,05 и 0,16±0,07, р=0,07). Более высокая вероятность долгосрочной общей выживаемости (0,54±0,5) наблюдалась в группе пациентов без мутаций гена FLT3, по сравнению с группой пациентов с мутацией гена FLT3 (0,17±0,10) р=0,07. Данные не являются статистически достоверными.

Частота ремиссий при современной терапии у больных с мутацией гена FLT3 не отличалась от больных без мутации гена FLT3, 94,44% (17/18) и 86% (91/106) соответственно. Но продолжительность безрецидивной выживаемости у пациентов с нативной структурой гена FLT3 была достоверно выше, чем у пациентов с мутацией гена FLT3 (0,52±0,05 и 0,22±0,10, р=0,03).

Результаты лечения больных ОМЛ с мутацией и без мутации гена FLT3, получавших только химиотерапию, представлены в табл. 12. На рис. 4-6 представлена вероятность бессобытийной (EFS), безрецидивной (RFS) и общей выживаемости (OS) этих больных.

Таблица 12. Результаты лечения больных ОМЛ с мутацией и без мутации гена И,73, получавших только химиотерапию

Результаты терапии Число больных с мутацией гена FLT3. Число больных без мутации гена FLT3.

Число больных во всей группе 18 106

Смерть в индукции 0/18 9/106 (8,4%)

Ремисссия 17/18 (94,44%) 91/106(86%)

Рефрактерность 1/18(5,5%) 4/106 (3,7%)

Потерян 0/18 2/106(1,9%)

I ППР 2/18(11,1%) 45/106(42,45%)

Медиана I ППР, мес 56,2 33,36

Смерть в ремиссии 2/18(11,11%) 7/106 (6,6%)

Рецидивы 7/18(38,8%) 34/106 (32,07%)

ЕРБ 0,12±0,08 0,34±0,05

0,14 ±0,06 0,47 ± 0,06

С« 0,15± 0,13 0,85±0,03

1.0 0.9

о,в

0,7

8

0.3 Е ОЛ 0.3 0.3 0.) 0,0

О 20 ДО 60 80 100 120 140 16.0

месяцы

Рисунок 4. Вероятность бессобытийной выживаемости (ЕРБ) у 106 пациентов без мутации и у 18 пациентов с мутацией Л.73, получавших только химиотерапию. ЕРБ 0,34 ± 0,05 уз 0,12 ± 0,08, достоверность р=0,03.

'i^ пациенты бе» мутации гена П.ГЗ(0.34

Пациенты С мутациеА 'гн* FLГЗ (0 .12*-0.03)

р=0,0Э

1,0 0,9 0.8 0,7

I 0,6 I °'5

" 0,4 0.3 0,2 0,1 0.0

0 20 40 60 60 100 120 140 160

месяцы

Рисунок 5. Вероятность общей выживаемости у 106 пациентов без мутации и у 18 пациентов с мутацией FLT3, получавших только химиотерапию. 0,85 ¿0,03 vs 0,15 ± 0,13, достоверность р<0,047.

1.0 0.9 0.S 0,7

i °-6 1 °-5 ш 0.4

0.3

0.2

0.1

0.0

О 20 40 ео 60 100 120 140 160

месяцы

Рисунок 6. Вероятность безрецидивной выживаемости у 106 пациентов без мутации гена FLT3 и у 18 пациентов с мутацией FLT3, получавших только химиотерапию. RFS составляет 0,47 ± 0,06 vs 0,14 ± 0,12, достоверность р>0,05.

Как видно из приведённых данных, в группе детей с ОМЛ без мутации гена FLT3, получавших только химиотерапию, вероятность долгосрочной бессобытийной выживаемости была достоверно выше, чем в группе детей с мутацией гена FLT3 (0,34±0,05 и 0,12±0,08, р=0,03). Долгосрочная общая выживаемость составила (0,85±0,03) в группе пациентов без

х

ÜV

¡ v-i^ пациенты без мутации гена FLT3 (0,85-»-0,03)

I пациенты с мутациеи гена FLT3 (0,is+-0,13)

р=0.047

1

■-1 Li }

( пациенты Oes мутации гена F£.T3(0.47+-0.06)

пациенты с м/тацией гена FLT3 (0.14+-0.12)

р=0,07

мутаций гена FLT3, по сравнению с группой пациентов с мутацией гена FLT3 (0Д5±0,13) р=0,047. Данные являются статистически достоверными. Продолжительность безрецидивной выживаемости у пациентов с нативной структурой гена FLT3 была выше, чем у пациентов с мутацией гена FLT3 (0,47±0,06 и 0,14±0,12, р=0,07)., данные не являются статистически достоверными.

При молекулярно-гснстическом исследовании 8, 9, 10, 11, 12, 17 и 18 экзонов гена KIT у одного пациента была выявлена инсерция 6 нуклеотидов в 9 экзоне, у другого пациента точечная замена в кодоне 546 гена KIT (замена аденина на гуанин в положении 1638, что не приводит к замене лизина в 546 кодоне (р.546 Lys>Lys, с. 163 8 A>G) в 10 экзоне. Очевидно, что у второго пациента выявлена нейтральная мутация в 10 экзоне, т. к. в этом случае замены аминокислоты в белковой молекуле не происходит. Данные о пациентах с выявленными мутациями гена KIT представлены в табл. 13.

Таблица 13. Данные о пациентах с выявленными мутациями гена ЮТ

Возраст/Ds Цитогенетика Мутация Исход

5лет ОМЛ М2 t(8;21)AML/ETO 9 экзон инсерция 6 нуклеотидов Смерть от прогрессии заболевания.

1 мес. ОМЛ М5а данных нет 10 экзон замена с. 163 8 A>G р.546 Lys>Lys данных нет

В отношении значения инсерции в гене KIT выводы делать не представляется возможным, учитывая небольшое число пациентов вошедших в исследование.

Результаты терапии пациентов с полиморфизмом и без полиморфизма гена ИРМ! представлены в табл. 14. При молекулярно-генетическом исследовании 12 экзона гена ИРМ1 у пациентов не были выявлены мутации. Обнаруженная ранее у доноров делеция одного нуклеотида в 5' некодирующей части 12 экзона гена К'РМ! была выявлена в гетерозиготном состоянии у 6 пациентов. Аллельная частота составляет 18,7 % (6 из 32 хромосом). Таблица 14. Результаты терапии в группе детей с полиморфизмом и без полиморфизма гена

NPM1

Результаты терапии Число больных с полиморфизмом гена NPMI. Число больных без полиморфизма гена NPMI.

Число больных во всей группе 13 42

Смерть в индукции 0/13 2/42 (4,7%)

Ремисссия 11/13(84,6%) 36/42 (85,7%)

Рефрактерность 1/13 (7,69%) 3/42 (7,1%)

Выбыли из исследования 1/13 (7,69%) 1/42 (2,3%)

I ППР 6/13 (46,15%) 11/42 (26,2%)

Смерть в ремиссии 1/13 (7,69%) 5/42 (11,9%)

Рецидивы 5/13 (38,4%) 22/42 (52,38%)

EFS 0,32 ±0,06 0,39 ±0,15

RFS 0,37 ± 0,08 0,53 ±0,15

OS 0,48 ±0,07 0,45 ±0,18

На рис. 7-9 представлена вероятность бессобытийной, безрецидивной и общей выживаемости больных. Как видно из приведённых данных, в группе детей, с полиморфизмом гена №М1 ЕИБ была выше, чем в группе детей, без полиморфизма гена Л'/3Л// (0,39±0,15 и 0,32±0,06, р=0,2). Также недостоверные различия были получены в отношении вероятности долгосрочной (0,53±0,15 и 0,37±0,08 соответственно р=0,3) и долгосрочной ОБ (0,45±0,18 и 0,48±0,07 соответственно, р=0,4). Приведённые данные могут косвенно свидетельствовать, что

Рисунок 7. Вероятность ЕЕБ у 42 пациентов без полиморфизма гена ЫРМ1 составляет 0,32 ± 0,06 и у 13 пациентов с полиморфизмом гена ЫРМ1 0,39 ±0,15, достоверность р>0,05.

1.0 0,9 0,0 0,7 £ 0,6 I

™ 0.4 0,3 0.2 0,1

0,0

0 20 40 60 80 100 120 140

Месяцы

Рисунок 8. Вероятность ОБ у 42 пациентов без полиморфизма гена ЫРМ! составляет 0,48 ± 0,07 и у 13 пациентов с полиморфизмом гена АГРМ1 0,45 ±0,18 достоверность р>0,05 .

1,0 0.9 О.В 0.7

I 0,6 1 °-5 ™ 0.4

0.3

0,2

0,1

0.0

О 20 40 60 80 100 120 140

Месяцы

Рисунок 9. Вероятность ЯРБ у 42 пациентов без полиморфизма гена ЫРМ1 составляет 0,37 ± 0,08 и у 13 пациентов с полиморфизмом гена ИРМ1 0,53 ±0,15, достоверность р>0,05 .

При молекулярно-генетическом исследовании гена МЫ в исследуемой группе пациентов тандемные мутации обнаружены не были.

Результаты исследования в зависимости от использованного материала. В табл. 15 представлен материал, который использовался в данном исследовании (архивный материал высушенные на воздухе мазки к.м. пациентов, замороженные без криопротекторов образцы к.м. и венозной крови пациентов, а так же свежеприготовленный материал к.м пациентов) и какие

Р'0.4

р=0,3

изменения из этого материала удалось выявить при молекулярно - генетическом исследовании в изучаемых генах (подробно описано выше).

Таблица 15. Результаты исследования в зависимости от использованного материала

Материал Ген FLT3 Ген c-K.IT Ген NPM1 Ген MLL

Архивный материал 0/41 0/41 9,'7% (4/41) 0/9

(высушенные на воздухе Аллельный

мазки к.м. пациентов). полиморфизм

Архивный материал 3/14 (21,4%) ITD 2/14 (14,2%) 64,2% (9/14) 0/14

(замороженные без мутации в 9,10 Аллельный

криопротекторов экзонах полиморфизм

образцы к.м. и венозной

крови пациентов).

Свежеприготовленный 12/69 (17,3%) ITD не не использовался не

материал к.м. пациентов. 3/27 (11%) D385 использовался использовался

В связи с ограниченностью материала в мазках к.м. для молекулярно - генетического исследования желательно использовать свежеприготовленный материал к.м. пациентов, либо замороженные без криопротекторов образцы к.м. и венозной крови пациентов.

На основании данного исследования можно говорить о необходимости скрининга пациентов для выявления мутаций в гене FLT3 при ОМЛ у детей. Это вызвано, с одной стороны, крайне неблагоприятным прогностическим значением этих мутаций, с другой стороны, наличием препаратов, ингибирующих функцию FLT3 тирозинкиназы (сорафениб), которые могут быть использованы в составе комбинированной терапии. В отношении значения мутаций в гене KIT выводы делать не представляется возможным, учитывая небольшое число пациентов. Тем не менее, данные, полученные у взрослых пациентов, говорят о необходимости продолжения исследований. Мутации гена NPMI являются благоприятным прогностическим маркером, исключение составляют только случаи совместного присутствия FLT3/ITD и NPM1 мутаций.

Выводы:

1. Проведен анализ молекулярных изменений в генах FLT3, KIT, NPM1, MLL у взрослых доноров-добровольцев и пациентов с различными вариантами ОМЛ. Обнаружены следующие мутации:

1.1. внутренние тандемные дупликации гена FLT3 в 12,9% (15/124) и мутации в области, кодирующей киназный домен FLT3, в 3,5% (3/84).

1.2. инсерция шести нуклеотидов в гене А'/Г выявлена у одного пациента.

1.3. в генах NPM1 и MLL мутации выявлены не были.

1.4. при анализе контрольной группы были выявлены ранее не описанные аллельные полиморфизмы в гене KIT (замена аденина на гуанин в 10 экзоне) и NPM1 (делеция одного нуклеотида в 5' некодирующей части 12 экзона), такие же аллели были обнаружены и у пациентов.

2. У пациентов с ОМЛ и мутацией гена FLT3, включение в лечебную программу ТГСК не дает преодолеть негативное влияние мутации гена FLT3.

2.1. Наличие мутаций гена FLT3 у детей с ОМЛ ассоциировано со статистически значимым снижением безрецидивной выживаемости по сравнению с пациентами без мутаций: 0,22 ±0,10 против 0,52±0,05, р=0,03.

2.2. Полиморфизм гена NPM1 на прогноз основного заболевания не повлиял.

3. ОМЛ с мутацией гена FLT3 у детей не имеют ни гематологических, ни клинических отличий от ОМЛ без мутаций гена FLT3.

4. Частота молекулярных изменений из свежеприготовленных образцов составила 21,9% (15/69), замороженных без криопротекторов образцов к.м. и венозной крови - 92,8% (13/14), а из архивных препаратов к/м на предметных стеклах частота молекулярных изменений составила 9,7% (4/14).

Практические рекомендации

1. Всем пациентам с первичным ОМЛ необходимо проводить скрининг на наличие активирующих мутаций гена FLT3, учитывая неблагоприятное влияние на долгосрочную бессобытийную, общую и безрецидивную выживаемость по сравнению с пациентами без мутаций гена FLT3.

2. Больным ОМЛ, с нормальным кариотипом, с наличием мутиции гена FLT3, учитывая низкую эффективность стандартной химиотерапии, необходимо рассмотреть вопрос об альтернативных методах терапии.

3. Больным с первичным ОМЛ, для поиска мутаций в генах FLT3, KIT, NPMl, MLL, рекомендуется использовать свежезабранные образцы к.м., венозной крови (при наличии лейкемических клеток в периферической крови более 40%), либо замороженные (при температуре - 20°С) без криопротекторов образцы к.м. и венозной крови пациентов.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Гук Л. В. Анализ мутаций в гене KIT у детей с острым миелобластным лейкозом (тезисы). Онкогематология 2008; 4: 43.

2. Гук Л. В. Анализ мутаций в гене FLT3 у детей с острым миелобластным лейкозом (тезисы). Онкогематология 2008; 4: 43 - 44.

3. Гук Л.В., Савицкая Т.В., Домнинский Д.А., Бобрынина В.О., Шнейдер М.М., Масчан A.A., Алейникова О.В. Анализ частоты и прогностического значения мутаций генов FLT3, KIT и NPMI у детей с острым миелобластным лейкозом. Онкогематология 2009; 4: 27-32.

Список сокращений

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

к/м Костный мозг

МДГКБ Морозовская Детская Городская Клиническая Больница

ОМЛ Острый миелобластный лейкоз

ПЦР Полимеразная цепная реакция

РНПЦДОГ Республиканский Научно-Практический Центр Детской Онкологии и Гематологии

ФГУ ФНКЦ дгои Федеральный Научно-Клинический Центр Детской Гематологии, Онкологии и Иммунологии

цнс Центральная нервная система

AML1/ETO аномальный транскрипт при t(8;21)

CBF/MYH11 аномальный транскрипт при inv(16) или t (16;16)( pl2;q23)

СЕВРА (С/ЕВРа) ген кодирует фактор транскрипции (ССААТ/участок ДНК связывающий белок а)

EFS бессобытийная выживаемость

FLT3 fms-like tyrosine kinase 3

inv инверсия

ITD внутренняя тандемная дупликация

KIT v-KIT feline sarcoma viral oncogene homolog

MLL myeloid/lymphoid = mixed lineage leukemia

NPMI нуклеофосмин

OS общая выживаемость

PTD частичная тандемная дупликация

RFS безрецидивной выживаемости

t транслокация

Подписано в печать: 21.09.10 Объем: 1,5 усл.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 769854690, Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г.Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ

Острый миелоидный лейкоз (OMJI) представляет собой гетерогенную группу заболеваний, морфологическим субстратом которых являются миелоидные бластные клетки. К лейкозной трансформации при OMJI приводит накопление приобретенных соматических генетических изменений в кроветворных клетках-предшественниках.

Спектр молекулярных и генетических аберраций при OMJI очень широкий: это изменения числа и структуры хромосом, мутации генов, эпигенетические нарушения регуляции их активности. Клеточные процессы, которые подвергаются патологическим изменениям в результате этих молекулярных нарушений, включают регуляцию пролиферации, дифференцировки и выживания клеток, а также клеточные реакции, отвечающие за репарацию ДНК, стабильность и модулирование хроматина. Несмотря на широкую генетическую гетерогенность OMJI, современные модели лейкомогенеза предполагают, что в каждом конкретном-" случае развитие заболевания может быть вызвано двумя генетическими аберрациями. Была предложена «двухударная» теория патогенеза лейкозов [27]. По этой теории, гены, вовлеченные в патогенез, были условно разбиты на две группы. Одна группа (класс I) включает гены, мутации в которых вызывают активацию определенных путей сигнальной трансдукции, что приводит к повышенной пролиферации и/или выживанию лейкозных клеток-предшественников. К этой группе относятся мутации, ведущие к активации тирозинкиназных рецепторов FLT3 или KIT, а также мутации генов семейства RAS. Другая группа (класс II) включает мутации и/или хромосомные изменения, которые воздействуют на активность и специфичность факторов транскрипции или компонентов комплекса активации транскрипции и модулирования хроматина. Эти мутации приводят к возникновению блока дифференцировки кроветворных клеток-предшественников. Результатом мутаций II класса являются химерные гены, возникающие при хромосомных транслокациях t(8;21), inv(16), t(16;16) и t(15;17), а также при многочисленных хромосомных аберрациях, затрагивающих локус llq23 (ген MLL). В эту же группу относятся и мутации в генах СЕВРА и, возможно, NPM1 [17, 35]. Только сочитание мутаций I и II класса приводит к наработке лейкемического клона.

Хотя при большинстве лейкозов удается, выявить - повторяющиеся или «случайные» нарушения кариотипа, примерно у 30. % больных с OMJI никаких цитогенетических отклонений выявить не удается, и такие лейкозы условно носят название лейкозов с «нормальным кариотипом»., В последние годы у таких больных был выявлен целый спектр онкогенных мутаций, представляющих собой в основном точечные мутации и дупликации небольших генных фрагментов. Сегодня эти мутации стали существенным фактором прогноза ОМЛ и определения стратегии лечения [17]. К наиболее часто наблюдаемым подобным мутациям относятся:

- мутации в гене нуклеофосмина (NPM1, хромосомная локализация - 5q35), который кодирует ядерный фосфопротеин с многочисленными функциями [30]. Мутации в гене NPM1 являются самой распространенной генетической аберрацией при ОМЛ у взрослых людей (около 35% всех случаев ОМЛ и около 60% случаев ОМЛ с нормальным кариотипом). У детей NPM1 мутации встречаются реже (около 10% всех случаев ОМЛ и приблизительно

25% случаев OMJI с нормальным кариотипом) и связаны с благоприятным прогнозом [72].

- ген FLT3 (13ql2.2) кодирует тирозинкиназный рецептор III класса. Наиболее распространенными мутациями в гене FLT3 являются внутренние тандемные дупликации (ITD) в околомембранном домене и точечные мутации в тнрозинкиназном домене (TKD), которые приводят к активации рецептора и ассоциируются с высоким риском рецидива и низкой общей выживаемостью [1,34,38]. Мутации FLT3/ITD у взрослых с OMJI встречаются более чем в 30% случаев OMJI с нормальным кариотипом, в то время как FLT3/TKD - в 10-15% случаев [61]. У детей FLT3/ITD и FLT3/TKD типы мутаций встречаются примерно с одинаковой частотой - 5-10% [34,38]. Если FLT3/ITD связаны с неблагоприятным прогнозом, то FLT3/TKD мутации не оказывают влияния на частоту ремиссий, но снижают общую и безрецидивную выживаемость [68,69]. По мнению других авторов, мутации FLT3/TKD не влияют на показатели общей и безрецидивной выживаемости [25,74].

- ген KIT - также как и ген FLT3 кодирует тирозинкиназный рецептор, который вместе со своим лигандом - фактором стволовых клеток (SCT, stem cell factor), играет ключевую роль в выживании, пролиферации и дифференцировке кроветворных клеток-предшественников [40,59]. Мутации в гене KIT найдены приблизительно в 30% случаев ОМЛ с геномными нарушениями в CBF генах и реже при других вариантах ОМЛ. У детей частота встречаемости мутаций в KIT гене при ОМЛ - около 5% [34]. Мутации в гене KIT обычно ассоциируются с высоким риском рецидива и снижением общей выживаемости [64];

- MLL (myeloid/lymphoid = mixed lineage leukemia, llq23) - ген, кодирующий ДНК-связывающий белок, который регулирует генную экспрессию при гемопоэзе. MLL является ключевым белком модулирования хроматина, который входит в комплекс транскрипции многих генов [37,65]. Ген MLL имеет более 100 хромосомных транслокаций, с образованием химерных генов, которые ассоциированы со многими вариантами острого лейкоза, в том числе обусловленными действиями терапии (therapy related-leukemia; t-AML или t-ALL) [15,41]. У пациентов с Ilq23/MLL - реаранжировкой прогноз расценивается как «промежуточный» и плохой; частота достижения ремиссии у этих больных высокая, но выживаемость низкая. Прогноз у взрослых пациентов и у детей с t(9;ll)(p21;q23) лучше, чем у больных с другими транслокациями, в которые вовлечен гене MLL. В гене MLL выявлен другой тип аберрации, при котором происходит копирование небольшого кодирующего участка 5' области гена, получившей название «частичная тандемная дупликация» (PTD) [11]. MLL/PTD аберрация выявляется приблизительно в 5-10% случаев OMJI с нормальным кариотипом, и связана с неблагоприятным прогнозом [11]. Мутации отдельных генов при OMJI не всегда являются однозначными факторами прогноза, и зачастую течение болезни определяется комбинацией генных мутаций и соотношением экспрессии мутантного и нормального аллелей, а так же тактикой терапии. В частности, это справедливо для мутаций генов FLT3 и NPM1. Исследование мутаций в некоторых важнейших генах миелопоэза у детей с OMJI и стало предметом даного исследования.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Охарактеризовать мутации генов KIT, FLT3, MLL, NPM1, оценить их частоту и прогностическое значение у детей больных ОМЛ.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Сравнить частоту выявления мутаций в генах FLT3, KIT, NPM1, MLL в архивном материале (препараты костного мозга больных на предметных стеклах, замороженные образцы венозной крови и костного мозга) и в свежеприготовленном костном мозге у детей с ОМЛ.

2. Оценить частоту и характеристики мутаций в генах FLT3, KIT, NPN1 и MLL у пациентов с ОМЛ в сравнении со здоровыми донорами - добровольцами.

3. Сравнить клинико-гематологические характеристики OMJI с мутациями FLT3, KIT, NPM1 и MLL с OMJI без мутаций в данных генах.

4. Провести оценку результатов терапии у детей с ОМЛ в зависимости от выявленных мутаций.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Оптимизированы оригинальные методики для выявления молекулярных изменений в генах FLT3, KIT, NPM1 и MLL. Молекулярно-генетический анализ нуклеотидных последовательностей в клетках здоровых доноров и пациентов позволил выявить ранее не описанные нейтральные точечные замены в нуклеотидных последовательностях генов KIT, NPM1, а также мутации в генах FLT3 и KIT.

Показано неблагоприятное влияние внутренних тандемных дупликаций в гене FLT3 на прогноз детей с ОМЛ, несмотря на проведение интенсивной химиотерапии с высокой «плотностью» дозы.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Внедрение в практику методик по выявлению мутаций гена FLT3, KIT, NPM1, MLL расширяет представление о патогенетических механизмах OMJI, позволяет осуществлять дифференцированный подход к лечению больных и создает методологическую основу для разработки эффективной терапии.

Скрининг указанных генов в контрольной группе исключает ошибочную интерпретацию факта не описанных ранее изменений нуклеотидных последовательностей как мутаций, связанных с развитием OMJI у детей.

ВЫПОЛНЕНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Федерального научно-клинического центра детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития (директор ФГУ ФНКЦ ДГОИ - член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор Румянцев А.Г.) на базе Российской детской клинической больницы Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ (главный врач - заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор Ваганов Н.Н.).

ВЫВОДЫ:

1. Проведен анализ молекулярных изменений в генах FLT3, KIT, NPM1, MLL у взрослых доноров-добровольцев и пациентов с различными вариантами ОМЛ. Обнаружены следующие мутации:

1.1. внутренние тандемные дупликации гена FLT3 в 12,9% (15/124) и мутации в области, кодирующей киназный домен FLT3, в 3,5% (3/84).

1.2. инсерция шести нуклеотидов в гене KIT выявлена у одного пациента.

1.3. в renax NPMl uMLL мутации выявлены не были.

1.4. при анализе, контрольной группы были выявлены; ранее, не описанные аллельные полиморфизмы в гене KIT (замена аденина на гуанин в 10 экзоне) и NPMI (делеция; одного нуклеотида в 5' некодирующей части 12 экзона), такие же аллели были обнаружены.и у пациентов.

2. У пациентов с ОМЛ и мутацией гена FLT3, включение в лечебную программу ТГСК не дает преодолеть негативное влияние мутации гена FLT3.

2.1. Наличие мутаций гена i^L^i у детей с ОМЛ ассоциировано со статистически значимым снижением безрецидивной выживаемости по сравнению с пациентами без мутаций: 0,22 ±0,10 против 0,52±0,05, р=0,03.

2.2. Полиморфизм гена NPM1 на прогноз основного заболевания не повлиял.

3. . ОМЛ с мутацией гена FLT3 у детей не имеют ни гематологических, ни клинических отличий от ОМЛ без мутаций гена

4. Частота молекулярных изменений из свежеприготовленных образцов составила 21,9% (15/69), замороженных без криопротекторов образцов к.м. и венозной крови - 92,8% (13/14), а из архивных препаратов к/м на предметных стеклах частота молекулярных изменений составила 9,7% (4/14).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Всем пациентам с первичным ОМЛ необходимо проводить скрининг на наличие мутации гена FLT3, учитывая неблагоприятное влияние на долгосрочную бессобытийную, общую и безрецидивную выживаемость по сравнению с пациентами без мутаций гена FLT3.

2. Больным ОМЛ, с нормальным кариотипом, с наличием мутиции гена FLT3, учитывая низкую эффективность стандартной химиотерапии терапии, необходимо рассмотреть вопрос об альтернативных методах терапии.

3. Больным с первичным ОМЛ, для поиска мутаций в генах FLT3, KIT, NPM1, MLL, рекомендуется использовать свежезабранные образцы к/м, венозной крови (при наличии лейкемических клеток в периферической крови более 40%), либо замороженные (при температуре - 20°С) без криопротекторов образцы к/м и венозной крови пациентов.

Рисунок 23. Дизайн протокола OML-BFM - 87.

Терапевтическая схема протокола OML-BFM - 87 представлена на рис. 20. Терапия состоит из: индукции ремиссии ADE (Ara-С, даунорубицин, этопозид), консолидация ремиссии и два блока интенсификации (Ara-С - Зг/м2, этопозид) с или без краниального облучения.

Алло-ТКМ рекомендуется только пациентам высокой группы риска и проводится в первой полной ремиссии.

Рисунок 24. Дизайн протокола ОМЛ - BFM - 93.

Терапевтическая схема протокола OML-BFM - 93 представлена на рис. 21. Терапия начинается с индукции ремиссии ADE или AIE. После индукции, пациенты лечатся в зависимости от группы риска (группа стандартного риска, М1-М2 тип ОМЛ по FAB классификации с палочками Аура, М4Е0 с < 5% бластов в костном мозге на 15 день, все остальные пациенты относятся к группе высокого риска). Пациенты высокой группы риска получают НАМ (Ara-С Зг/м2, каждые 12 часов 3 дня и митоксантрон 4 и 5 дни), затем консолидацию или консолидацию, затем НАМ. Пациенты стандартной группы риска получают только консолидацию. Впоследствии, все пациенты получают блок консолидации НАЕ (Ara-С Зг/м2, каждые 12 часов 3 дня и этопозид 125 мг/м2 2 и 5 дни), затем облучении в дозе 18 грей (стандартная доза для детей > 3 лет) или облучение ЦНС. Поддерживающая терапия TG 40 мг/м2 и Ага-С 40 мг/м2 в течении 18 месяцев. Алло-TKM рекомедуется в первой полной ремиссии, если донор - сиблинг.