Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Анализ метаболически автономных минорных ядерных ДНК в нормальных и опухолевых клетках

РГ6 од

На правах рукописи

_ '' ' г ■

О :

СЕРДЮК Ольга Игоревна

АНАЛИЗ МЕТАБОЛИЧЕСКИ АВТОНОМНЫХ

МИНОРНЫХ ЯДЕРНЫХ ДНК В НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ

(14.00.14 - онкология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1997

Работа выполнена в лаборатории биохимии опухолей Онкологическо научного центра имени H.H. Блохина РАМН

Научный руководитель, доктор биологических наук A.B. Лихтенште*

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Л.Б. Горбачева доктор медицинских наук К.В. Ильин

Ведущее учреждение - Институт онкологии им. H.H. Петрова МЗРФ

Защита диссертации состоится "¿? " YS 1997 г. на заседании диссертационнс совета (К 001.17.01.) Онкологического научного центра им. H.H. Блохи (Москва, 115478, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОНЦ РАМН.

Автореферат разослан " v-ff " fAVtit*/?^ 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских на профессор B.C. Турусов.

Актуальность темы

Хромосомный аппарат клетки является основным, но не единственным нилищем генетической информации. Описано два типа экстрахромосомных ментов - амплифицированные последовательности и малые 1идисперсные кольцевые ДНК. Если вторые распространены весьма широко рмальные и опухолевые клетки, клеточные культуры и ткани животных), то вые встречаются исключительно в опухолевых клетках как проявление сущей им общей нестабильности генома и играют важную роль в церогенезе (Stark, 1994).

Недавно двумя независимыми методами [пульс-электрофорез апсулированной в агарозе интактной ДНК (Smith and Cantor, 1987) и Ьференциальная экстракция ДНК из иммобилизованных нуклеопротеидных плексов (Lichtenstein et al., 1991)] в ядрах клеток млекопитающих были аружены минорные (-2-3% тотальной ДНК) фракции так называемой бодной ДНК, не связанной физически с хромосомной ДНК и существенно ичающейся от последней своими метаболическими свойствами (Сухова и

1996). Поскольку общеизвестна роль экстрахромосомных элементов в церогенезе, представляло интерес выяснить, какова природа аруженных ДНК, в частности, являются ли они продуктами деградации мосом, или же существуют in vivo как особые элементы неизвестного ранее а.

В связи с этими предположениями казалось оправданным, используя в эстве экспериментальных моделей нормальные и опухолевые клетки, педовать структурные и метаболические свойства свободных ДНК: скорость геза и его чувствительность к различным ингибиторам, топологию, пределение уникальных и повторяющихся последовательностей, ■юкрипционную активность.

Цель и задачи исследования

В данной работе предполагалось исследовать ряд функционально важных Йоте свободных ДНК в сопоставлении с таковыми хромосомных ДНК на елях.нормальных и опухолевых клеток:

1. Синтез в различных условиях клеточного роста.

2. Присутствие структурных генов (некоторых протоонкогенов) и горяющихся последовательностей, используя методы молекулярной >идизации и PCR.

3. Топологические свойства.

4. Транскрипционную активность.

5. Попытаться визуализировать свободные ДНК методом избирательного вния BUdR с последующим иммунохимическим окрашиванием.

Научная новизна работы

Некоторые исследователи находили в ядрах зукариотических кле молекулы, не связанные с хромосомной ДНК и отличающиеся по ряду cbohi от известных типов экстрахромосомных элементов, но рассматривали преимущественно как результат апоптического распада ДНК. Свидетельства автономного существования, основывающиеся на анализе метаболизма топологических свойств, получены впервые.

Научно-практическая значимость исследования

В результате исследования получена новая информация о неизвестно! настоящее время типе экстрахромосомных элементов, о их метаболиз внутриклеточной локализации, транскрипционной активности. Эти данные мо пролить новый свет на механизмы возникновения и эволкн экстрахромосомных элементов, играющих большую роль в канцерогенезе.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены совместной научной конференции лабораторий вирусного канцерогенезг биохимии опухолей НИИ канцерогенеза ОНЦ РАМН (февраль 1997 г.).

Структура диссертационной работы

Диссертация построена по традиционному плану. Обзор литерат^ состоит из трех глав. Собственные исследования автора приведены в се главах, завершающихся разделами "Обсуждение результатов" и "Выво/з Указатель литературы включает 121 наименование. Диссерта! иллюстрирована 19 рисунками.

Принятые сокращения: хрДНК - хромосомные ДНК; свДНК - cвoбoд^ ДНК; мтДНК - митохондриальная ДНК; FUdR - 5-фтор-2'-дезоксиуридин; BUd 5-бром-2.'-дезоксиуридин; FIGE - пульс-электрофорез в инвертированном по • PCR - полимеразная цепная реакция; SSCP - конформационный полиморф! однонитевых фрагментов; ФДХ - фибробласты джунгарского хомя1 трансформированные SV40 (линия 4/21); УФ - ультрафиолетовое облучение.

s

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования. В работе использовали культивируемые клетки HeLa (рак шейки матки человека), НТ1080 (фибросаркома легких человека) tasheed et al., 1974), Namalwa (лимфома Беркитта) (Klein et al., 1972), эйробластомы мыши N1E-115 (Amano et al., 1972), ФДХ, а также ткани ивотных (мышей, крыс) и биоптаты, полученные при оперативном удалении ценокарциномы желудка (в качестве нормальной ткани использовали пизистую желудка, окружающую опухоль). Клетки HeLa выращивали в среде 39, содержащей 10% эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота. ФДХ сращивали в однослойной культуре на минимальной среде Игла с 10% ибриональной сывороткой в присутствии стрептомицина или гентамицина

000 ед/мл среды). Клетки N1E-115 выращивали в однослойной культуре в зеде DMEM с 10% эмбриональной сывороткой и с пенициллином и грептомицином.

Меченио ДНК радиоактивными предшественниками. В качестве адиоактивной метки использовали [3Н]тимидин (уд. рад. 54 Ки/ммоль) и *С]тимидин (уд. рад. 42 мКи/ммоль). Радиоактивные предшественники эбавляли в культуральную среду в концентрации 0,1-0,25 мкКи/мл и клетки этили на протяжении от 1 час до нескольких суток.

Экспериментальным животным внутрибрюшинно вводили [3Н]тимидин ,0-1,5 мкКи на грамм веса в сутки) на протяжении 2-3 сут. Животных |бивали, кусочки тканей печени, селезенки, мозга и тимуса измельчали, а 1тем гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса с лизирующим раствором, »держащим 2% Тритон Х-100. Содержание ДНК в пробах определяли луоресцентным методом с использованием красителя Hoechst 33258. змерения проводили на спектрофлуориметре Perkin-Elmer 3000 (длина волны »збуждения - 365 нм, длина волны эмиссии - 458 нм). Калибровочную кривую роили, используя растворы ДНК известной концентрации. Радиоактивность -IK определяли следующим образом. ДНК из проб с известной концентрацией м. выше) осаждали 10% ТХУ при 2-4°С 30 мин, переносили на фильтры GF/C i/hatman, Англия), промывали 2 раза 10% ТХУ и 1 раз 70% этанолом, >1сушивапи и измеряли радиоактивность в толуоловом сцинтилляторе на ¡етчике Mark II (Nuclear Chicago,США).

Нуклеопротеидцелитная хроматография ДНК. Клетки (0,5 - 1,0 х 106; 5 -

1 мкг ДНК) разрушали в лизирующем буфере (Забойкин и др., 1991) в могенизаторе Даунса. Лизаты клеток смешивали с суспензией 1,5 г целита I5 (60-80 mesh, L.P.C. Chemicals and Dyes, London) в 5-10 мл буфера TM при С и полученной смесью заполняли термостатируемую хроматографическую лонку. Из иммобилизованных на целите нуклеопротеидов экстрагировали НК тремя последовательными градиентами диссоциирующих агентов: NaCI, Dl-мочевины и температуры (Lichtenstein et al., 1991).

Стандартный электрофорез ДНК. Фракционирование молекул ДНК пс размеру осуществляли с помощью электрофореза в горизонтальном 1%-ноы геле агарозы (Chemapol, Praha, Czechoslovakia), приготовленном на буфере ТРЕ (Maniatis et al., 1984), 2-3 ч при комнатной температуре и напряжении 4-4,£ В/см. При анализе продуктов PCR (полимеразная цепная реакция] электрофорез проводили в горизонтальном 3,5% (2,5% Chemapol + 1% NuSieve Sigma) агарозном геле в 0,5 х ТРЕ буфере, 30 - 40 мин при комнатной температуре и напряжении 4-4,5 В/см. Бромистый этидий (0,5 мкг/мл; добавляли в электрофоретический буфер. Гели фотографировали на УФ-трансиллюминаторе.

Пульоэлектрофорез ДНК. Клетки инкапсулировали в низкоплавкой агарозе (Sigma), ДНК депротеинизировали стандартным методом (Smith апс Cantor, 1987). ДНК в агарозных вставках (1,5-6 мкг в 10-40 мкл) подвергал!' пульс-электрофорезу в вертикальном геле 1%-ной агарозы в разбавленном (вдвое) ТФЭ-буфере (Maniatis et al., 1984), 3 ч при 200 В и 17-20 С, используя для задания импульсов электрического поля прибор РС-750 (Hoefer) Длительность импульса вперед - 0,3 с, назад - 0,1 с (ramp factor 6.6). В качестве маркеров использовали мультимеры ДНК фага лямбда. Гели окрашивала бромистым этидием (0,5 мкг/мл) или красителем Hoechst 33258 (2,5 мкг/мл) Фракции ДНК, разделенные в пульсирующем поле (хрДНК - на старте геля свДНК - в геле), выделяли сорбцией на стекловолоконных фильтрах.

Топологическое тестирование ДНК. ХрДНК и свДНК разделяли пульс электрофорезом, как описано ранее, гели окрашивали бромистым этидием (0,1 мкг/мл) 20 мин, после чего вырезали нужные полосы. ДНК в срезах агарозь облучали при комнатной температуре в интервал доз от 0 до 20 крад (источник ■ 137Cs, 524 рад/мин). Срезы после облучения выдерживали 1 сут при 4°С, после чего подвергали пульс-электрофорезу в стандартных условиях. В качестве контроля использовали линейные молекулы ДНК размером 225 т.п.н (хромосома I S. cerevisiae), полученные из набора маркеров (CHEF DNA size standard, Bio-Rad Laboratories).

Концевое мечение ДНК in situ. Содержащие ДНК блоки агарозы суспендировали в 100 мкл 50 мМ NaCI, 10 мМ Трис-НС1,рН 7.5, 10 мМ MgCI2, 1 мМ дитиотреитол, добавляли 2 ед. фрагмента Кленова, 20 мкКи [32P)dCTP остальные dNTP (20 мкМ), после чего инкубировали 20 мин при комнатной температуре (Maniatis et al., 1984). Реакцию останавливали охлаждением е ледяной бане. Пульс-электрофорез проводили, как описано выше, гель высушивали и авторадиографировали.

Иммунохимическое окрашивание ДНК. Клетки нейробластомы мыип N1E-115, активно растущие или терминально дифференцированные t результате лишения сыворотки на протяжении 3 сут, метили в течении 1 сут 1С мкМ BUdR в присутствии 1 мкМ FUdR (FUdR, ингибитор тимидилатсинтетазы применяли для повышения включения BUdR в ДНК благодаря сниженик

конкуренции эндогенным тимидином). Препараты споласкивали раствором <енкса, клетки фиксировали 30 мин в смеси 95% этанола и 5% ледяной уксусной кислоты при комнатной температуре, после чего обрабатывали 3 N HCI 15 мин для денатурации ДНК. После многократного промывания фиксированных клеток раствором Хенкса (до рН 7,0) и удаления влаги вокруг жализируемого участка, последний покрывали 100 мкл раствора лоноклональных антител к BUdR (разведение 1:100) и инкубировали 1 ч при юмнатной температуре в боксе, насыщенном водными парами. Препараты инкубировали 30 мин при комнатной температуре с анти-мышиными чммуноглобулинами, конъюгированными с пероксидазой (разведение 1:150). JHK, включившую BUdR, окрашивали 7 мин раствором :убстрат/интенсификатор (Cell Proliferation Kit, Amersham, U.K.).

Дот-гибридизация ДНК. ДНК наносили на нейлоновые фильтры (Hybond J, Amersham) описанным ранее методом (Lichtenstein et al., 1989). После lepeHOca, фильтры споласкивали 2 х SSC, высушивали, после чего ДНК фиксировали 3 мин УФ-облучением. Предгибридизацию и гибридизацию |роводили 16-24 час при 42°С. Предгибридизационный раствор - 5 х SSC, 50% |еионизированный формамид, 0,1% SDS, 1 мМ ЭДТА, 0,1% BLOTTO, 100 ikt/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Для увеличения концентрации онда в состав гибридизационного раствора вводили 5,5% полиэтиленгликоль 000 (Sigma). ДНК зонда метили в . реакции ник-трансляции. После ибридизации фильтры отмывали 4 раза по 5 мин в 2 х SSC, 0,1% SDS при омнатной температуре и 4 раза по 15 мин в 0,1 х SSC, 0,1% SDS при 55° С.

PCR. При помощи регулируемого термостата "РТ 3.2/1" (Биолюкс, 1ущино, Россия) проводили 35 циклов (плавление - 95°С, 1,2 мин; отжиг - 55°С-3°С, 1 мин; полимеризация - 72 С, 1,5 мин). Первый цикл денатурации ДНК - 3 1ин, последний цикл элонгации - 7 мин. Поиск оптимальных праймеров существляли при помощи компьютерной программы (A computer program for election of oligonucleotide primers for polymerase chain reactions. Nucl. Acids. Res. 8, No 7, 1757-1761). Для определения температуры отжига использовали оотношение - 2°С (AT) + 4°С (GC). Использовали следующие пары праймеров: ) для гена c-Ha-ras 1 человека - 5-GTCATTGATGGGGAGACGTG-3' (sense), 5'-¡ACTTGGTGTTGTTGATGGC-3' (antisense); амплифицируемый фрагмент - 134 .н.; б) для гена с-тус человека (экзон 3) 5'-ACGCAGCGCCTCCCTCCACT-3' ¡ense), 5'-GCTCGTTCCTCCTCTGGCGC-3' (antisense); амплифицируемый »рагмент - 183 п.н; в) для гена L-myc человека (интрон 2) - 5'-AGTTCACTCACA-íGCCACAT-З' (sense); 5'-TGCATATCAGGAAGCTTGAG-3' (antisense); ампли-»ицируемый фрагмент - 267 п.н.

Сшивание матрицы ДНК с новообразованной РНК. Клетки НТ1080, астущие в среде Игла, метили [3Н]уридином (20 мкКи/мл) 2 ч, после чего 1етки лизировали в слабо притертом гомогенизаторе Даунса 5 мин в изирующем растворе (Забойкин и др., 1991). Лизат переносили в пластиковую

чашку Петри, предварительно охлажденную в ледяной бане, добавляли I метоксипсорален до конечной концентрации 5 мМ, и облучали сниа посредством LKB 2011 MacroVue transilluminator (8 mW/см, дважды по 5 мин интервалом 5 мин для охлаждения). После облучения ядра осаждал низкоскоростным центрифугированием (1000 х g), инкапсулировали в агароз< обрабатывали протеиназой К и SDS и подвергали FIGE. Из окрашеннь бромистым этидием гелей вырезали нужные участки, элюировали из них ДНК определяли радиоактивность [3Н]РНК, приходящуюся на 1 мкг ДНК.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Универсальное распространение свободных ДНК. Ранее лаборатории биохимии опухолей НИИ канцерогенеза методом колоночно хроматографии обнаружено и в настоящей работе подтверждено присутстви минорной фракции свДНК во всех исследованных клетках млекопитающи (нормальных и опухолевых, культивируемых и полученных из тканей животны и человека) (рис. 1).

Исследование данного явления было продолжено методом пулы электрофореза инкапсулированной в агарозе ДНК, обеспечивающег максимально возможную интактность анализируемых молекул (рис. 2). Во все случаях наряду с хрДНК, остающейся на ртарте геля из-за своих гигантски размеров, видны три дискретные полосы свДНК размерами около 400, 250 и 2 т.п.н. (обозначенных соответственно a-, 6-, и с-ДНК). При анализе пулы электрофорезом изолированных ядер или клеток в качестве исходно! материала распределение ДНК одно и то же, что свидетельствует о ядерно происхождении свДНК (при исследовании цитоплазматической фракции того и количества клеток ДНК не обнаруживается).

Метаболические особенности свободных ДНК. Возникает вопро являются ли свДНК физиологическими компонентами клетки или, напротив, ч присутствие вызвано теми или иными артефактами, такими как контаминацу агарозных блоков экзогенной (например, микоплазматической) ДНК или распа хрДНК (в последнем случае можно, в частности, предположить, что в любе клеточной популяции присутствует некоторая, пусть и относительно небольша доля апоптических клеток, распадающиеся хромосомы которых образук данную фракцию).

В связи с поставленным вопросом представляло интерес сравни! метаболические характеристики хромосомных и свободных ДНК, посколы метаболические отличия последних могли бы свидетельствовать в пользу v автономного существования in vivo. С этой целью в последующа экспериментах сопоставляли скорость включения радиоактивной метки хрДНК и свДНК в различных условиях клеточного роста.

Как известно, на протяжении одного клеточного цикла реплицируется вся

Рис. 1. Гистограмма относительного содержания (в %) разделенных хроматографическнм методом фракции ДНК б разных клетках млекопитающих.

Ill

л

хр-ДНК •

I 2 Ml М2 12 3 4

т1ГЩ ' - хр-ДНК— —

¡г .

а-ДНК • Ь-ДНК —

i

с-ДНК ■

а-ДНК—► * Ь-ДНК-> й

с-ДНК.

ононононон _ _ .J.1. — —и» WJj

И

/'к Ь

О

Рис.2. Пульс-электрофорез ДНК клеток и изолированных ядер.

А - культивируемые клетки НТ1080 (дорожка 1) и Namalwa (дорожка 2), М1 и М2 - маркеры (соответственно -конкатемеры ДНК фага лямбда и ДНК фага лямбда, рестрицированная Hind III). Стрелками указаны а-ДНК, Ь-ДНК и с-ДНК.

Б - клетки (дорожки 1. 2) и изолированные ядра (дорожки 3, 4) выделенные из тканей животного.

В - биоптаты тканей человека (н - нормальная слизистая желудка; о - рак желудка).

Il

ДНК и, следовательно, мечение клеток на протяжении одной или, более iro, нескольких клеточных генераций должно приводить к одинаковой 1ельной радиоактивности всех участков хрДНК. Если, напротив, после столь 1ительного мечения обнаруживаются фракции ДНК с разной удельной адиоактивностью, то это может свидетельствовать о независимости их <утриклеточного метаболизма и автономном существовании in vivo. Именно ■а последняя ситуация выявляется при исследовании самых разных льтивируемых клеток, длительное время меченных радиоактивными >едшественниками, независимо от того, каким методом (хроматографическим чи электрофоретическим) фракционируется их ДНК (рис. 3). Доминирующая ) массе хрДНК характеризуется максимальной удельной радиоактивностью, >гда как свДНК метится значительно слабее. Эта закономерность юслеживается при анализе быстро растущих клеточных популяций.

Далее исследовали кинетику мечения хрДНК и свДНК в опытах типа »льс-чейс (рис. 4). Видно, что независимо от длительности мечения и от »следующего чейс-периода количественные соотношения между величинами (ельной радиоактивности разных фракций остаются более или менее ютоянными. Этот факт свидетельствует об отсутствии между визируемыми фракциями взаимоотношений типа предшественник-продукт.

В следующих экспериментах исследовали зависимость синтеза свДНК от орости клеточной пролиферации. Внутренним стандартом в этих опытах |ужила хрДНК, репликация которой жестко сопряжена с фазой S клеточного 1кла. В качестве экспериментальных моделей были использованы льтивируемые клетки N1E-115 в фазе быстрого роста и в стадии рминальной дифференцировки (рис. 5), а также клетки покоящейся и генерирующей печени крысы (рис. 6). Оказалось, что в быстро юлиферирующих клетках хрДНК метится более интенсивно, чем свДНК, что !гласуется с ранее полученными данными (см. рис. 3). Напротив, в рминально дифференцированных клетках на фоне общего резкого падения ггенсивности мечения обеих фракций соотношение становится ютивоположным. Эта же закономерность прослеживается и в случае мечения vivo нормальной и регенерирующей печени крысы, пролиферативная тивность которых намного меньше, чем культивируемых клеток. Можно 'мать, что синтез свДНК в меньшей степени, чем синтез хрДНК, сопряжен с еточной пролиферацией.

Визуализация свободных ДНК. В предыдущих экспериментах методом сдельного фракционирования ядерной и цитоплазматической клеточных эакций была установлена ядерная локализация свДНК (см. выше). :новываясь на обнаруженных различиях метаболических свойств свДНК и ДНК мы сделали попытку выявить внутриклеточную локализацию свДНК ¡зависимым методом, а также визуализировать структуры, в состав которых и входят. В самом деле, в иокоящихся (в частности, в терминально

хроматография ДНК

0/ пульс-электрофорез ДНК " срш/ид

V. 100 90 80 70 ■ 60 50 -40 30 \ 20 10 О

1,

срт/ид

18000 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 О

2 3 4 5 6 7

фракции ДНК I Я% □ срт/ид I

100 90 80 70 60 50 40 30 -20 10 0

св-ДНК хр-ДНК фракции ДНК

16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0

Ш% Осрт/ид

в

Рис. 3. Гистограмма относительного содержания (в %) и удельной радиоактивности фракций ДНК клеток НТ1080, разделенных при помощи хроматографии (А) и пульс-электрофореза (Б). Клетки мстили на протяжении 1 сут |3Н]тимиднном (0,25 мкКи/м.ч).

Рис. 4. Кинетика мечеиия разных фракций ДНК клеток ФДХ в экспериментах типа "рике-сЬазе". Клетки метили 114С]тимиднном (0,25 мкКи/мл) на протяжении 1 сут (Л), 2 сут (В) и 2 сут с последующим выдерживанием 1 сут п среде, не содержащей радиоактивного предшественника (С). ДНК разделяли хроматографическим методом.

% ИМП/МИН X мкг %

100 12000 100

80 ■ 10000 80

ео . 8000 . 6000 60

40 -4000 40

20 -2000 20

0 | 1 , 0 0

св-ДНК хр-ДНК фракции

1% Оимп/мин X МКГ:

1

св-ДНК хр-ДНК фракции

имл/мин X мкг т 500

400 300 - 200 100 0

1% Пимп/мин X мкг

па»

кд

Рис. б. Гистограмма относительного содержания (в %) и удельной радиоактивности ДНК быстро пролиферируюших (А) и терминально дифференцированных (Б) клеток неиробластомы мыши N1 Е-115. К1егки метили |1-,С| тимидином (0,25 мкКи/мл) 1 сутки, ДНК денротеиннзирозалп п агарозных блоках п разделяли пульс-электрофорезом.

%

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

имп/мин X мкг

4000

:1И

Л.

12 3 4 5 6 7 8

фракции

■ % □имп/минхмкг

2000

100 90 ■ 80 ■ 70 60 50 40 30 20 10 о

имп/мин х мкг т 4000

1 2 3 4 5 8 7 8

фракции

Щ% □ имп/мин X ИКГ

Рис.6. Хроматография ДНК меченных 2 сут клеток ' нормальной (А) и регенерирующей печени (Г>).

IS

дифференцированных) клетках предшественники ДНК включаются, как эказано выше, преимущественно в свДНК, которые, по-видимому, зновляются независимо от клеточного цикла. Это дает возможность их зметить относительно избирательно аналогом тимидина BUdR и затем дуализировать посредством иммунохимической реакции. На рис. 7 зедставлены результаты выявления меченых структур в быстро эолиферирующих и терминально дифференцированных клетках N1E-115. В эрвом случае видны интенсивно окрашенные ядра, что говорит о эоисходящем в них активном синтезе ДНК. В покоящихся же клетках ^являются гранулярные структуры, которые локализованы исключительно в шточных ядрах и содержат, по-видимому, свДНК. Подобные ДНК-содержащие груктуры были недавно обнаружены с использованием иммунохимических етодов в ядрах различных культивируемых клеток человека (Saunders et а!., 391).

На основании вышесказанного можно сделать ряд заключений. Во-зрвых, независимость мечения свДНК, с одной стороны, и хрДНК, с другой, эедполагает существование первых in vivo в виде неких автономных зразований, размеры которых близки у клеток разных типов и которые зкализованы в ядрах в виде гранулярных структур. Во-вторых, включение здиоактивной метки в свДНК покоящихся клеток может указывать на гносительную независимость их синтеза от клеточного цикла. В-третьих, с эобходимостью возникает предположение о том, что свободные и зомосомные ДНК синтезируются с использованием разделенных омпартментализованных) фондов тимидиловых нуклеотидов.

Компартментализация фонда предшественников свДНК. В данном азделе работы исследовали влияние ингибитора синтеза нуклеотидов de novo i интенсивность мечения свДНК и хрДНК. Клетки НТ1080 подвергали эйствию возрастающих концентраций FUdR - ингибитора тимидилатсинтетазы inc. 8). Видно, что фракция хрДНК реагирует на подобное воздействие (ачительным повышением удельной радиоактивности, отражающим эдавление синтеза эндогенного тимидина и, соответственно, меньшее «ведение меченого предшественника. Максимального значения удельная адиоактивность хрДНК достигает при 1мкМ FUdR; при более высоких, эзможно токсических, концентрациях ингибитора она снижается. Мечение jflHK гораздо менее чувствительно к FUdR, что указывает на более медленное зтощение соответствующего фонда тимидинтрифосфатов. В целом, эти знные указывают на возможность участия разделенных фондов эедшественников в синтезе разных фракций клеточных ДНК.

Действие афидиколина. Способность свДНК включать радиоактивную етку в покоящихся клетках может означать, что в их синтез вовлечена ДНК-элимераза р - единственная полимераза, которая активна на протяжении всех аз клеточного цикла и вне цикла. Для проверки этого предположения клетки

А

Б

Рис.7. Иммунохимическое окрашивание меченных BUdR ДНК клеток N1E-115 (10 мкМ BUdR в присутствии 1 мкМ FUdR. 1 сут). А - быстро пролиферирующие клетки. Б -терминально дифференцированные клетки.

г

имп/мин X мкг 50000

40000

30000

20000

10000

0

О 0,1 0,5 1

. ----------Н - - Ц

5 10 50 100

Р1Ш (мкМ)

Рис.8. Влияние FUdR на мечение свДНК и хрДНК. Клетки НТ1080 метили [,4С]тимидином (0,25 мкКи/мл) 1 сут в присутствии различных концентраций (0-100 мкМ); ДНК разделяли хроматографически. 1 - удельная радиоактивность хрДНК; 2 • удельная радиоактивность свДНК.

НТ1080 обрабатывали афидиколином - антибиотиком, к котором резистентна только ДНК-полимераза |S. При этом наблюдалось более сильно подавление мечения хрДНК по сравнению со свДНК, что указывало на и биосинтетическую независимость друг от друга.

Топологические свойства свободных ДНК. Одной из обративших н себя внимание особенностей свДНК явилось непостоянство и электрофоретической подвижности относительно маркеров (конкатамеров ДН фага X), обнаруживаемое при различных условиях пульс-электрофорез (напряженность поля, длительность электрофреза и импульсов электрическог поля). Поскольку использованные маркеры были линейны, возникл предположение о нелинейной конформации свДНК. В связи с этим следующи эксперименты были посвящены исследованию топологических свойств свДН при помощи двух независимых подходов: индукции конверсии топологически изоформ внесением в ДНК одно- и двунитевых разрывов посредством • облучения и концевого мечения ДНК in situ при помощи фрагмента Кленова.

В случае кольцевых ДНК однонитевые разрывы индуцируют ступенчаты переход из кольцевой суперспирализованной формы в открытую, а одиночны двунитевой разрыв - в линейную. Эти переходы проявляются дискретным электрофоретическими сдвигами.

На рис. 9 представлены результаты топологического тестирования свДН клеток Namalwa. Срезы агарозы, полученные после первого пулы электрофореза и содержащие нужные фракции ДНК, облучали в дозах О, О, 0,5, 1,5 и 10 крад, после чего проводили повторный пульс-электрофорез стандартных условиях. В качестве контроля использовали линейную ДН хромосомы I (225 т.п.н.) S. cerevisiae. В контрольном препарате возрастающи дозы облучения расщепляют ДНК на линейные фрагменты различной длинк что проявляется в виде характерного электрофоретического шмера. Облучена а-ДНК дозами 5-10 крад приводило к возникновению дискретной полосы в зоь 25 т.п.н. В случае Ь-ДНК при малых дозах облучения (0,1-1,0 крад), способнь индуцировать только однонитевые разрывы, ее электрофоретическс подвижность уменьшалась и становилась равной таковой а-ДНК, а при дозах l 10 крад перемещалась в положение с-ДНК. Полученные данные позволяй предположить, что обнаруженные фракции свДНК являются топологическим изоформами с линейными размерами около 25 т.п.н. При этом а-ДНК и Ь-ДН находятся соответственно в открытой и суперспирализованной кольцевь формах, а появление двунитевых разрывов переводит их в линейную форму i ДНК.

Эти предположения согласуются с результатами концевого мечения ДН in situ (рис. 10). Видно, что метка включается исключительно в хрДНК практически отсутствует в а- и b-ДНК, что подтверждает предположение об i кольцевой структуре.

Сопоставление свДНК и апоптических фрагментов. Авторы ряда рабе

Рис.! 8. Топологическое тестирование св-ДНК. Срезы агарозы, полученные после первого пульс-электрофореа и содержащие нужные фракции ДНК, переносили в физиологический раствор и облучали в дозе 0, 0.1, 0.5, I, 5, и 10 крад (дорожки 1, 2, 3, 4, 5, и 6, соответственно). После 1 сут хранения при 4°С срезы агарозы помещали в лунки геля и проводили второй пульс-электрофорез в стандартных условиях. А - контроль (ДНК хромосомы I ЯассИаготусез сегеушае размером 225 т.п.н.); Б - а-ДНК клеток №та1\уа; В -Ь-ДНК клеток №та1и'а. Стрелкой указано положение ШмЯП фрагмента ДНК фага лямбда размером 23 т.п.н.

:о

хр-ДНК

а-ДНК-fc* Ь-ДНК

с-ДНКф.

tx ¡ <*■.,<*

«г

Рис.10. Концевое мечение ДНК клеток НТ1080 и Namalwa in situ. Реакцию проводили 30 мин при комнатной температуре с последующим FIGE в стандартных условиях. Гели окрашивали бромистым этидием, фотографировали и затем авторадиографировапи на протяжении ночи. А - фотография геля, окрашенного бромистым этидием (дорожка 1 - НИ 080; дорожка 2 - Namalwa). Б -авторадиография геля (дорожка 1 - НТ1080; дорожка 2 -Namalwa).

также обнаруживали методом пульс-электрофореза свДНК размерами от ) до 700 т.п.н. (Szabo et al., 1990; Oberhammer et al., 1993; Walker et al., 1994), > объясняли их присутствие апоптическим распадом хроматина. Поскольку >едставленные выше данные свидетельствуют, напротив, о присутствии >ДНК in vivo, то представляло интерес сопоставить их свойства со свойствами юптических фрагментов. В качестве модели использовали клетки Namalwa, юптоз которых индуцировали этопозидом. Инкапсулированные в агарозе 1Итрольные и апоптические клетки подвергали концевому мечению in situ, ДНК (зделяли пульс-электрофорезом с последующей авторадиографией (рис. 11). ке через 4 ч после начала действия этопозида появляется, а через 16 ч ановится преобладающей гетерогенная популяция фрагментов, (идетельствующая о распаде ДНК. При этом в контрольном препарате метка цутимо включается только в хрДНК; а- и Ь-ДНК остаются немечеными, что »гласуется с представлением о их кольцевой структуре. В случае юптических клеток метится гетерогенная популяция молекул, ютветствующая электрофоретическому шмеру, причем интенсивность !гнала возрастает пропорционально степени распада ДНК. Полученные »зультаты позволяют заключить, что присутствие в клетках свДНК не связано апоптическим распадом хроматина.

В другой серии опытов исследовали влияние у-облучения на юктрофоретическое поведение апоптических фрагментов! В отличие от ггактных свДНК, облучение которых индуцирует характерные для кольцевых элекул изменения электрофоретической подвижности (см. рис. 9), юптические фрагменты не обнаруживают признаков подобных конформацион-jx переходов.

Выявление в свДНК уникальных последовательностей и повторов, ззделенные хроматографическим методом фракции ДНК разных клеток IT1080, Namalwa, тканей крысы) денатурировали, переносили на нейлоновые ильтры и гибридизовали с гомологичной тотальной ДНК, меченной [32Р] в 1акции ник-трансляции. Затем фильтры отмывали в жестких условиях и ггорадиографировали. В этих условиях могут гибридизоваться, очевидно, !шь повторяющиеся последовательности. Их присутствие выявляется данным этодом как в хрДНК (рис. 12, фракция 8), так и в свДНК (фракции 1-7).

В последующих экспериментах исследовали присутствие в свДНК клеток Г1080 протоонкогенов c-Ha-ras\, с-тус, L-myc посредством PCR (рис. 13). нтенсивная полоса, соответствующая амплифицированной

юледовательнос-ти каждого из протоонкогенов, видна в хрДНК. Некоторые из ДНК также содержат эти уникальные последовательности.

Транскрипционная активность свДНК. Для оценки транскрипционной тивности отдельных фракций ДНК использовали метод сшивания с ними 1в0синтезир0ванных РНК. С этой целью клетки НТ1080 метили [3Н]уридином О мкКи/мл) 2 ч в отсутствии или присутствии актиномицина D (0,05 мкг/мл и 1

Рис.11. Концевое мечение фрагментов ДНК in situ при индуцированном этопозидом апоптозе клеток Namalwa. Клетки контрольные (дорожка 1) и обработанные этопозидом (5мкМ,4ч, 16ч -дорожки 2,3 соответственно) использовали для получения инкапсулированной в агароэе ДНК, которую подвергали концевому мечению. После FIGE гель авторадиографировали.

св-ДНК хр-ДНК

|-II-1

1 2 3.4 5 6 7 8

Рис.12.Повторяющиеся последовательности св-ДНК (фракции 1-7) и хр-ДНК (фракция 8) разных клеток, а -НТ1080, б - ЫатаЬ'а, в - мозг крысы, г - печень крысы. ДНК разделяли хроматографическим методом, переносили на нитроцеллюлозные фильтры и гибридизовали с тотальной [32Р]-ДНК тех же клеток, использованной в качестве зонда.

Ьв-ДНК Хр-ДНК

1 1 2 3 4 5 6 П '

Рис.13.Анализ методом ПЦР фракций ДНК клеток НТ1080. Фракции ДНК, полученные методом хроматографии, использовали в качестве матрицы с олигонуклеотидными праймерами к генам человека с-тус (экзон 3), с-Ha-ras I и L-myc (интрон 2). После 35 циклов аликвоты реакционной смеси анализировали электрофорезом в агарозном геле.

100 90 -I 80 70 60 50 40 30 20 10 0

fmL

имп/мин X мкг 6000

4000

2000

св-ДНК хр-ДНК

фракции ДНК

Рис. 14.Выявление транскрипционной активности св-ДНК. Клетки НТ1080, контрольные или обработанные актиномицином D (0,05 или 1 мкг/мл), метили |3Н] уридином (20 мкКи/мл) 2 ч, обрабатывали 8-метоксипсораленом и УФ. Инкапсулированные в агарозе препараты ДНК разделяли методом FIGE. Левая ось ординат - процентное соддржание ДНК во фракциях; правая ось ординат - радиоактивность РНК (имп/мин), отнесенная к I мкг ДНК. Столбцы: 1 - содержание ДНК (в %); 2 - радиоактивность РНК контрольных клеток; 3 -радиоактивность РНК клеток, обработанных 0,05 мкг/мл актиномицина D; 4 - радиоактивность РНК клеток, обработанных 1 мкг/мл актиномицина D.

мкг/мл). Клетки лизировали неионным детергентом, обрабатывали оксипсораленом и облучали УФ. На рис. 14 представлены результаты юрения относительной транскрипционной активности (радиоактивность РНК, есенная к 1 мкг ДНК) разных фракций ДНК контрольных клеток НТ1080 и ток, обработанных актиномицином D. Как в контрольных, ■ так и в юботанных ингибитором клетках преобладающая доля радиоактивности годится на хрДНК. Вместе с тем, хотя и небольшая, но достоверно ¡оделяемая радиоактивность в свДНК позволяет заключить, что они являют транскрипционную активность, чувствительную к актиномицину D.

ОБСУЖДЕНИЕ

Давно известны и хорошо охарактеризованы два типа экстрахромосомных 1ментов клеток млекопитающих: а) амплифицированные последовательности виде двойных минихромосом и эписом (Stark and Wahl, 1934) и б) 1идисперсные кольцевые ДНК небольшого размера (Rush and Misra, 1985). наруженные в настоящей работе свДНК по ряду показателей отличаются и гех и от других.

Амплификация генов - феномен чрезвычайно редкий даже в ^сформированных опухолевых клетках с присущей им нестабильностью ома. Он никогда не выявляется в нормальных клетках млекопитающих, что 1воляет рассматривать его как проявление клеточной патологии (Stark and hl, 1984). Обнаружить феномен амплификации удается лишь •роспективно, после предварительной селекции и экспансии ггветствующего клона. Тот факт, что свДНК обнаруживаются в популяциях (ток, не подвергнутых предварительной селекции, а также в нормальных >тках животных тканей, свидетельствует о том, что с феноменом плификации они непосредственно не связаны.

В клетках млекопитающих часто обнаруживаются, причем в довольно сокой внутриклеточной концентрации (0.7-3% тотальной ДНК) пидисперсные кольцевые ДНК, которые рассматриваются как побочные эдукты перестроек генома (Rush and Misra, 1985). Они обогащены, как авило, повторяющимися последовательностями, но могут, по-видимому, цержать и уникальные. Таким образом, по ряду свойств они близки свДНК, наруженным в настоящей работе. Существенное различие, однако, слючается в дискретности и относительно больших размерах свДНК.

В ряде последних работ, в которых использовалась техника пульс-екгрофореза, были обнаружены входящие в гель фракции ДНК с видимым змером от 50 до 700 т.п.н. (Szabo et al., 1990; Oberhammer et al., 1993; Walker al., 1994). Их присутствие обычно объясняют активацией эндогенных клеаз, активностью топоизомеразы II или апоптозом, хотя в ряде случаев добные фракции обнаруживают и в контрольных (т.е. не подвергнутых

никаким воздействиям) клетках. Однако, кольцевая структура свДНК, видимому, полностью исключает предположение о ее апоптичес происхождении.

По ряду показателей свДНК не могут быть отождествлены и с J митохондрий: а) раздельным исследованием ядерной и цитоплазматичес фракций показана их принадлежность первой из них, что подтверждаете результатами иммунохимического окрашивания; б) размеры митДНК (17 т.г меньше, чем свДНК (25 т.п.н.); в) содержание митДНК в клетках состава обычно доли процента, что существенно ниже содержания свДНК (около 3%]

В ядрах эукариотических клеток имеется ряд структурно-морфологичес образований (помимо ядрышка), некоторые из которых описаны много назад - перихроматиновые фибрилы, перихроматиновые грану интерхроматиновые гранулы и ядерные тельца (Monneron, Bernhard, 1S Raska et а)., 1991). К их числу добавились в последнее время и некото| другие, обнаружение которых стало возможным только благодаря применен новых иммуноцитохимических подходов - "ядерные точковые домены" (As< Maul, 1991) и полиморфные интерфазные кариосомные ассоциации Р (polymorphic interphase karyosomal association) (Saunders et al., 19! Последние образуют в ядрах всех исследованных культивируемых кле человека (как первичных, так и трансформированных) некие пространстве! ограниченные образования (домены), состоящие из варьирующих по форм размеру субструктур, в состав которых, по-видимому, входит ДНК. Поскол PIKA обнаруживаются и в покоящихся клетках, их формирование, по-видимо не связано с процессом репликации ДНК. Авторы этого исследова! рассматривают ядро клетки как компартментализованную (разделенную множество доменов) структуру, многие компоненты которой могут 6i выявлены только с использованием иммунохимических подход Обнаруженные в настоящей работе свободные ДНК могут происходить подобного рода образований. Их консерватизм (универсалы распространение, дискретность и однотипность размеров) мо> свидетельствовать о выполнении ими каких-то важных внутриклеточн функций. Можно предположить, что нарушение генетических функц присущее опухолевым клеткам, дает импульс эволюционированию в них свД с образованием типичных экстрахромосомных элементов - двойн минихромосом и эписом. Эта гипотеза является предметом дальнейи. исследований.

ВЫВОДЫ

1) Во всех исследованных типах эукариотических клеток (как нормальн! так и опухолевых) наряду с хромосомной ДНК присутствует гетерогени популяция свободных молекул немитохондриальной природы, составляют около 2-3% тотальной ДНК клетки.

2) Свободные ДНК присутствуют в клетках в виде топологических эорм с линейными размерами примерно 25 т.п.н.

3) Для синтеза свободных ДНК используется обособленный фонд |шественников.

4) Свободные ДНК отличаются от хромосомных ДНК рядом |болических особенностей: а) относительной независимостью синтеза от очного цикла и б) резистентностью синтеза к некоторым игибиторам (FUdR, диколин).

5) Свободные ДНК содержат структурные гены (протоонкогены) и 'оряющиеся последовательности.

6) Свободные ДНК отличаются рядом свойств от уже описанных рахромосомных элементов, что позволяет отнести их к клеточным юнентам неизвестного ранее типа.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

лехина Р.П., Сухова Т.И., Сердюк О.И., Моисеев В.Л., Шелепов В.П., аевская Г.Б., Лихтенштейн A.B. "Выявление свободных ДНК в ядрах ^кариотических клеток." ДАН. 1994. Т.338, N 3, стр. 397-400. клепов В.П., Арсенин С.Л., Алехина Р.П., Сухова Т.И., Сердюк О.И., юисеев В.Л., Раевская Г.Б., Лихтенштейн A.B. "Анализ экстрахромосомных НК нормальных и опухолевых клеток." Бюлл. эксп. биол. мед. 1995. Т. 119, N , стр. 533-536.

)ердюк О.И., Сухова Т.И., Алехина Р.П., Шелепов В.П., Арсенин С.Л., 1оисеев В.Л., Лихтенштейн A.B. "Метаболические и структурные свойства нехромосомных ДНК в клетках млекопитающих." Биохимия. 1996. Т. 61. N О, стр. 1825-1837.

!ухова Т.И., Сердюк О.И., Алехина Р.П., Шелепов В.П., Моисеев В.Л., рсенин С.Л., Раевская Г.Б., Лихтенштейн A.B. "Свойства свободных ДНК, бнаруживаемых в клеточных ядрах." Мол. биол. 1996. Т. 30. N 3, стр. 55264.