Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Анализ механизмов клеточных реакций врожденного иммунитета иглокожих

На правах рукописи

ДЬЯЧКОВ Иван Сергеевич

АНАЛИЗ МЕХАНИЗМОВ КЛЕТОЧНЫХ РЕАКЦИЙ ВРОЖДЁННОГО ИММУНИТЕТА ИГЛОКОЖИХ

14.00 36 — Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-

ии^иььа

2007 „ ___

003066915

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Полевщиков Александр Витальевич,

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Кокряков Владимир Николаевич, доктор медицинских наук, профессор Симбирцев Андрей Семенович

Ведущая организация:

Государственный Научный Центр -"Институт иммунологии ФМБА России"

Защита диссертации состоится " 2007 г в часов на заседании

Диссертационного совета Д001.022 01 при ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул Акад Павлова, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН

Автореферат разослан " /3 " сл+^г^з^Я 2007 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор медицинских наук Бурова Лариса Александровна

Актуальность проблемы. Решение фундаментальных проблем иммунологии связанно с изучением процесса становления иммунной системы, поиском молекулярных и клеточных основ реакций врожденного и приобретенного иммунитета позвоночных и сравнительно-иммунологическим анализом процесса эволюции функций иммунной системы

Традиционно в иммунологических исследованиях особое внимание уделяется изучению защитных реакций наиболее продвинутых форм животных, к которым, в первую очередь, относятся млекопитающие Однако единственный путь, который позволяет выявить причины возникновения, изучить процесс становления отдельных элементов иммунной системы и понимания характера их взаимосвязи и перейти к пониманию всего явления иммунной защиты в целом, - это обращение к филогенетически более древним формам жизни В результате поиска примитивных форм реакций приобретенного иммунитета, характерными чертами которого у позвоночных животных являются специфичность и память, основанные на распознающих молекулах иммуноглобулинового суперсемейства, накопились данные не только о наличии механизмов реаранжировки генов поверхностных рецепторов для различных лигандов (Zhang et al, 2001, Pancer et al, 2004), но и о сходстве процессов перестройки некоторых групп генов (семейства скавенджер-рецепторов и То11-подобных белков) с иммуноглобулиновыми генами позвоночных животных (Pancer, 1999, Pancer, Cooper, 2006) Вместе с этим до сих пор весьма дискутабельным остается вопрос о наличии иммунологической памяти у беспозвоночных животных, обладающих только врожденным иммунитетом (Кудрявцев И В , 2006, Kurtz, 2005).

Реакции врожденного иммунитета отличаются немедленной активацией клеток-эффекторов (Du Pasquier L2001), основаны на распознающих молекулах, закрепленных в геноме, реаранжировка которых не является необходимой, а также характеризуются отсутствием клонального размножения вовлеченных в ответ однотипных клеток При этом распознавание идет за счет высоко консервативных паттернов, представления о которых были сформулированы в середине 1990-х годов Ч Дженуэем и Р Меджитовым, что вывело сравнительно-иммунологические исследования на принципиально новый уровень и оказались исключительно плодотворными (Кокряков ВН, 2006)

Для врожденного иммунитета характерно принципиальное решение проблемы распознавания "свое" - "чужое" Эволюция привела к сохранению паттернов распознавания как "несвоего", так и "своего" Эта древняя, но далеко не примитивная система детектирования "несвоего" является базовой и в противоинфекционном иммунитете позвоночных (В Н Кокряков, 2006) Сохранение в эволюции живого высококонсервативных элементов

микроорганизмов (РАМР-элементы) обусловило закрепление в геноме макроорганизма распознающих их высокоаффинных рецепторов — PRR (скавенджер-рецепторы, лектины, TLR, ЛПС- и маннозо-связывающие белки и др), которые играют центральную роль как в активации врожденного иммунитета (фагоцитоз, инкапсуляция, процесс формирования узелков, адгезии циркулирующих клеток) (Beck G ,1996, Pancer Z ,2006)

Работы по защитным реакциям иглокожих проводятся на различных представителях классов морских звезд, ежей и голотурий (одиночные исследования проводились на офиурах и морских лилиях) Иглокожие рано отделились от магистрального пути эволюции данной группы, образовав архаичный высоко специализированный тип, представители которого обладают полностью сформированной вторичной полостью тела и находятся в основании всего древа Deuterostonua, к которому относятся и позвоночные Поэтому их иммунную систему гипотетически можно рассматривать в качестве предковой по отношению к иммунной системе эволюционно более продвинутых форм (Купер, 1980, Галактионов, 1995)

Клеточным типом, давшим начало внутренней мезенхимальной среде организма и всем группам циркулирующих клеток, мог быть блуждающий амебоцит, который независимо многократно появлялся у первично- и вторичноротых животных, на что указывали еще И И Мечников и акад АА.Заварзин (Мечников, 1947, Заварзин, 1953) Дискуссионным остается вопрос о наличии прямых филогенетических связей между блуждающими амебоцитами низших многоклеточных и лимфоцитами вторичноротых животных (Купер, 1980)

Хотя изучение защитных механизмов иглокожих и является весьма перспективным направлением с точки зрения их родственных связей с хордовыми, однако данные об этих механизмах остаются весьма фрагментарными Многочисленные исследования особенностей защитных реакций иглокожих касались механизмов трансплантационного иммунитета, однако и эти исследования остались незавершенными, а результаты не стали однозначными Гораздо более тонкие молекулярно-генетические исследования были связаны с поиском компонентов комплемента (L Courtney Smith, 19982002, Кудрявцев И В , 2006), цитокиноподобных факторов у иглокожих (Beck et al, 1986-2004) однако в настоящее время число работ в этом направлении сократилось, хотя вопрос о функциональной активности выявленных цитокиноподобных молекул иглокожих остался

Тем не менее, ряд важных с иммунологической точки зрения вопросов, касающихся организации защитных реакций иглокожих, остается неясным К их числу относятся аспекты регуляции их защитных реакций, в частности, механизмов цитотоксических реакций, отличающихся высокой

эффективностью и обеспечивающих выживание группы на протяжении миллионов лет эволюции Важным представляется изучение перекрестной реактивности медиаторных молекул млекопитающих и регуляторных молекул иглокожих A. rubens в отношении их влияния на показатели клеточных реакций

Цель работы анализ механизмов клеточных реакций врожденного иммунитета иглокожих

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи

1 Сравнение синтетических и пролиферативных свойств популяций целомоцитов морской звезды Asterias rubens,

2 Разработка метода оценки цитотоксичности клеточных защитных реакций иглокожих,

3 Оценка параметров аллогенных реакций иглокожих in vitro,

4 Поиск примитивных медиаторных сигналов, необходимых для реализации реакций врожденного иммунитета иглокожих

Научная новизна работы Впервые разработана модель оценки цитотоксических реакций иглокожих, представляющая собой безгелевую модификацию реакции локального гемолиза. Впервые оценена временная динамика продукции оксида азота NO целомоцитами иглокожих на фоне митогенной и антигенной стимуляции Экспериментально доказана способность целомоцитов иглокожих к распознаванию растворимых и корпускулярных антигенов и различный характер ответа на эти антигены Подтверждена способность иглокожих к аллогенному распознаванию и проведена морфологическая характеристика процесса Впервые получены данные о влиянии иммуноактивных молекул человека на свойства целомоцитов иглокожих и о временной динамике продукции цитокиноподобных молекул иглокожих в ответ на антигенную и митогенную стимуляции

Научно-практическая значимость Разработанный метод оценки цитотоксичности может быть использован при изучении защитных реакций представителей разных таксонов беспозвоночных животных Полученные экспериментальные доказательства влияния цитокинов человека на функции целомоцитов иглокожих свидетельствуют о большей эволюционной древности цитокинов IL-1, TNFa, IFNy, чем считалось ранее Накопленный материал существенно дополняет данные о ранних этапах эволюции иммунной системы и может быть использован в педагогическом процессе в рамках лекционных курсов по общей и сравнительной иммунологии

Основные положения, выносимые на защиту

1 Разработан новый метод оценки цитотоксичности циркулирующих клеток беспозвоночных Фракции целомоцитов морской звезды A. rubens

различаются по цитотоксической активности в отношении эритроцитов человека

2 Циркулирующие целомоциты иглокожих слабо включают 3Н-тимидин, отвечают изменением активности редуктаз и продукции NO на антигенную и митогенную стимуляцию и в условиях смешанной культуры В ответ на корпускулярный зимозан или растворимый ЛПС A.rubens развивают разные формы цитотоксичности

3 В основе регуляции защитных реакций морской звезды A.rubens лежат медиаторные сигналы, связанные с цитокиноподобными молекулами, обеспечивающих межклеточную кооперацию

4 В целомической жидкости и надосадках клеточных культур целомоцитов иглокожих содержатся факторы, которые обладают перекрестной реактивностью с цитокинами IL-1, TNFa и IFNy человека Рекомбинантные цитокины человека оказывают влияние на цитотоксическую активность целомоцитов A.rubens

Реализация работы По теме работы опубликовано 34 работы, в том числе 1 обзор литературы и 11 оригинальных статей

Личный вклад в проведение исследования Личный вклад автора в выполненную работу включает самостоятельное проведение большинства исследований, разработку и адаптацию ряда методов исследования, а также интерпретацию полученных результатов Вклад остальных соавторов ограничивается помощью в постановке и освоении новых методов исследования, сбором экспериментальных животных в их среде обитания, а также предоставлением в распоряжение автора ряда реактивов

Апробация-работы Материалы работы были доложены и обсуждены на VI и VII сессиях морской биологической станции СПбГУ (2005, 2006гг), на конференции молодых ученых "Физиология и медицина" (Санкт-Петербург, 2005 г), на 1-м Съезде физиологов СНГ (Москва, 2005 г), на конференции "Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов европейского Севера" (Вологда, 2005 г), на летней школе "Current Trends in Comparative Immunology" (Санкт-Петербург, 2005 г), на заседаниях общества иммунологов (март 2005 и апрель 2006 г), на юбилейной конференции молодых ученых, посвященной 110-летию основания Института экспериментальной медицины (2005 г), на Российской научно-практической конференции "Иммунология и педиатрия" (Санкт-Петербург, 2005 г), на Российской научно-практической конференции "Современные технологии в иммунологии иммунодиагностика и иммунотерапия" (Курск, 2006 г), на X и XI Российской конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2006, 2007 гг), на 1-м симпозиуме "Клуб профессиональных иммунологов" (Анталья, 2006 г), на научно-практической конференции молодых ученых, посвященной памяти

Н Н Кеворкова (Пермь, 2006 г) Диссертационная работа была апробирована на заседании научной конференции отдела иммунологии ГУ НИИЭМ РАМН 8 мая 2007 г

Структура и объем работы Работа изложена на 136 страницах текста и состоит из обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов, их обсуждения и выводов Работа проиллюстрирована 25 рисунками и фотографиями и 28 таблицами Библиографический указатель содержит 172 источника, в том числе 11 работ отечественных авторов и 161 - зарубежных

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

В качестве объекта исследования был выбран вид Asterias rubens (тип Echinodermata* класс Asteroidea, отряд Foreipulata) Сбор животных производили в июне - сентябре 2004-2006 гг на базе ББС им акад О А Скарлато ЗИН РАН При исследованиях m vivo для оценки специфичности защитных реакций морских звезд использовали следующие модельные частицы эритроциты человека группы 0 (ЭЧ), культуру бактерий E.coh, а также суспензию зимозана на ФР

Выделение целомоцитов. Забор целомической жидкости (ЦЖ) с клетками осуществляли при помощи одноразового шприца, содержащего ЭДТА Подсчет клеток проводили в гемоцитометре Горяева Центрифугированием клетки отделяли от ЦЖ, освобождали от ЭДТА и отмывали охлажденным модифицированным р-ром Дальбекко без Са2+ и Mg2+ с последующим переводом в соответствующие целям исследований условия

Фракционирование целомоцитов A.rubens. Для получения фракций целомоцитов клеточную суспензию наносили на фазы диатризоата натрия с концентрациями 20, 15, 12,5 и 10% (в порядке наслоения) на искусственной морской воде (ASW) Полученные после центрифугирования фракции целомоцитов снимали с интерфаз градиента и отмывали р-ром Дальбекко без Са2+ и Mg при осмотичности 24%о. Освоение метода фракционирования стало возможным благодаря дружеской помощи ИВ Кудрявцева, которому автор выражает искреннюю благодарность

Оценка функциональной активности целомоцитов A.rubens. Анализ функциональной активности целомоцитов проводили на модели митогенной стимуляции клеток, оценивая пролиферативную активность, изменения активности редуктаз в МТТ-тесте и продукции оксида азота NO, а также по продукции цитокиноподобных факторов Для изучения влияния митогенной стимуляции на целомоциты A. rubens использовали адаптированный метод митоген-индуцированной бласттрансформации, основанный на включении

меченых предшественников синтеза ДНК целомоцитами in vitro, параллельно с применением колориметрического МТТ-теста В качестве митогенов использованы лектины животного и растительного происхождения (ФГА-Р, Кон А) и препарат "Лимфоцитарный митоген" (JIM, 1% р-р IgG-фракции антилимфоцитарной сыворотки) Целомоциты вносили в 96- и 24-луночные плоскодонные планшеты (Sarstedt), в охлажденной полной культуральной среде RPMI-1640 без фенолового красного, содержащей 25 г/л NaCl, HEPES, бикарбонат Na, 2% фетальной сыворотки, 2 мМ L-Glu и 80 мкг/мл гентамицина (ПКС) Клетки выдерживали в течение 12-120 ч в эксикаторе с 3% уровнем С02 при t~+5°C

Определение метаболической активности целомоцитов (МТТ-тест)

Колориметрический МТТ-метод отражает активность митохондриальных редуктаз и общую метаболическую активность клетки Результаты теста выражали в единицах ОП на 1 млн целомоцитов, а также рассчитывали ИС как отношение ОП опыта к ОП контроля

Оценка продукции NO целомоцитами A.rubens. Материалом для оценки уровня продукции NO целомоцитов служила надосадочная жидкость (НЖ), собранная по истечении разных сроков инкубации из лунок планшета, которую смешивали в равных объемных соотношениях с реактивом Грисса Учет продукции N0 вели спектрофотометрией при длине волны А,=530 нм при комнатной температуре через 10 мин после смешивания Результат выражали в единицах ОП

Оценка продукции целомоцитами цитокиноподобных факторов.

Супернатанты культур по окончании сроков инкубации представляли собой материал для оценки способности целомоцитов к продукции медиаторов с помощью метода твердофазного двухдетерминантного ИФА с использованием диагностических наборов производства ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург) ИФА проводили в соответствии с рекомендациями изготовителя Супернатанты также были использованы для оценки функциональной характеристики тех факторов, которые выделяются при дегрануляции целомоцитов A.rubens в ходе их активации и клоттинга В результате были получены четыре типа надосадков, использованных в тестах оценки пролиферативной активности и оценки их влияния на продукцию цитокиноподобных факторов различными клеточными фракциями.

Модель переноса. Суть данной модели заключалась в поиске метода выявления активности медиаторов морской звезды in vivo С этой целью экспериментальных животных разделили на условные группы доноров и реципиентов Донорам опытной группы инъекцией в целомическую полость вводили 2 мл 0,4% суспензии зимозана или равный объем 0,2% р-ра ЛПС на ASW Животным-донорам контрольной группы вводили равный объем

фильтрованной морской воды (ФМВ) аналогичным способом Через 3 или 12 ч, в зависимости от условий эксперимента, от животных-доноров как опытной, так и контрольной групп с помощью шприца получали образцы ЦЖ, аликвоты которых в объеме 2 мл вводили во внутреннюю среду животных-реципиентов Через 12 ч после этого от звезд-реципиентов получали образцы ЦЖ с клетками с последующим использованием клеток и бесклеточной ЦЖ в соответствующих экспериментах

Метод оценки локального гемолиза in vitro. Предактивацию звезд-доноров проводили на модели переноса за 3 и 12 ч инъекцией 2 мл 0,4% суспензии зимозана Контрольное животное получало равный объем ФМВ Через 3 ч после переноса ЦЖ от звезд-реципиентов выделяли целомоциты для изучения цитотоксических свойств суммарного пула целомоцитов и/или отдельных фракций целомоцитов, для которого был разработан новый метод оценки гемолитической активности (ГА), являющийся безгелевой модификацией реакции локального гемолиза по Н К Ерне в 24-луночном планшете с фотографированием и последующим подсчетом числа зон гемолиза Оценку уровней ГА суммарного пула целомоцитов и их фракций через 1,5, 3, 4,5 и 12 ч проводили методом спектрофотометрии НЖ звезды-реципиента in vitro Результат ГА выражали в единицах ОП при длине волны Х,=405нм

Оценка влияния цитокинов человека на свойства клеточных фракций A.rubens. Целомоциты различных фракций были переведены в ФМВ в лунки 24-луночного планшета для культивирования с добавлением рекомбинантных цитокинов человека IL-la, СЗа, IFNy (25 пг/мл, 10 пг/мл и 100 пг/мл, соответственно) Эффект влияния иммуномедиаторов на цитотоксические свойства субпопуляций целомоцитов оценивали методом учета числа зон гемолиза в слое ЭЧ в условиях т vitro через 18 ч инкубации при температуре t~+5°C Параллельно проводили измерение уровня ОП НЖ методом спектрофотометрии при длине волны А.=405нм Все надосадки были собраны, освобождены от клеток и заморожены при t—20°С до проведения ИФА на предмет поиска цитокиноподобных факторов

Аллогенная реакция целомоцитов A.rubens. Выделенные описанным выше способом целомоциты отмывали р-ром Дальбекко без Са2+ и Mg2+ при подведенной осмотичности Клеточную суспензию одной из звезд (по 30 млн/мл) вносили в ПКС в объеме 2,5 мл с добавлением 40 мкг/мл митомицина С (Serva), инкубировали 2 ч при t~10°C Клетки-мишени {мишени) отмывали избытком того же р-ра Дальбекко Клетки-эффекторы (эффекторы) переводили в ПКС и в объеме 100 мкл вносили в лунки 96-луночного плоскодонного планшета для культивирования (по 200 тыс/лунку) с добавлением 100 или 200 тыс мишеней Положительным контролем служили мишени по 200 или 100 тыс/лунку, в качестве отрицательного контроля использовали смесь

целомоцитов одного животного до и после обработки митомицином С по 200 тыс/лунку Контролем эффекторов служили целомоциты каждой звезды (200 тыс/лунку) без добавления мишеней Смешанные культуры выдерживали при t~5°C с 3-4% уровнем С02 в течение 24 и 96 ч По завершении инкубации оценивали уровни МТТ-теста в клетках и наличие NO в надосадках культур по описанным выше методикам Для визуализации эффектов распознавания аллогенных клеток при комплексообразовании была предпринята модификация цитотоксического теста для иглокожих, по которой мишени окрашивали нейтральным красным Через 3, 6 и 9 ч инкубации культуры клеток были сфотографированы на малом и большом увеличении бинокуляра

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью пакетов лицензионных программ Excel, STATISTICA 5 0 Результаты экспериментов выражали как среднее ± ошибка среднего Для статистической обработки и определения различий между независимыми группами нормально распределенных данных использовали t критерия Стьюдента и Z-критерия Во всех экспериментах различие между контролем и опытом считалось статистически достоверным только для р<0,05

Основные результаты исследований и их обсуждение Фракционирование клеток. Применение ступенчатого градиента диатризоата натрия позволило получить отдельные фракции клеток, различающиеся по морфо-функциональным свойствам (синтетическая активность и, возможно, степень зрелости) Типирование полученных фракций по морфологии позволило подтвердить литературные данные о существовании как минимум трех субпопуляций целомоцитов, которые были обозначены как лимфоцитоподобные клетки, агранулярные амебоциты и гранулярные амебоциты в соответствии с терминологией, сложившейся в последние годы

Оценка метаболической активности целомоцитов A.rubens. На всех сроках эксперимента в МТТ-тесте за исключением точки 12 ч достоверного от контроля отличия по активности редуктаз целомоцитов интактных животных выявлено не было Повышение уровня активности редуктаз в МТТ-тесте на сроке 72 ч при митогенной стимуляции косвенно подтверждает предположение о существовании различных функциональных состояний клеток-предшественников в циркуляции in vivo (табл 1) Полученные по МТТ-тесту и по включению 3H-Td данные указывают, что продолжительность клеточного цикла целомоцитов A.rubens составляет не менее 96 ч, что проявляется при воздействии разных митогенов При этом ЛМ являлся единственным среди использованных митогенов, способным активировать метаболический ответ целомоцитов на всех сроках инкубации с высокой степенью достоверности

Уровень продукции N0 при митогенной стимуляции. На ранних сроках инкубации целомоцитов интактных животных (12 и 24 ч) ни один из использованных митогенов не приводил к повышению уровня содержания N0 в надосадках клеточных культур, однако на более поздних сроках инкубации (72, 96 и 120 ч) повышение уровня N0 в надосадках целомоцитов носит высоко достоверный характер Под действием ФГА через 120 ч инкубации продукция N0 целомоцитами интактных животных в 2,7 раза превышает контрольные значения (р<0,001)

Таблица 1

Оценка показателей МТТ-теста целомоцитов интактных животных через 72 ч инкубации в присутствии митогенов, Х±з, ед.ОП при 595 нм, число набл. по каждой точке - ие менее 12_

Митоген Концентрация митогена (мкг в 1 мл) / Разведение JIM

25 / цельный 12,5 /1 2 6,25 / 1 4 3,125/1 8

контроль 0,086±0,005

ФГА 0,117±0,005*** 0,111±0,005** 0,111±0,007** 0,107±0,005**

КонА 0,110±0,010* 0,113±0,004*** 0,110±0,005** 0,108±0,005**

ЛМ 0,128±0,007*** 0,121±0,006*** 0,113±0,006** 0,111±0,006**

Примечание здесь и далее JIM вносили в культуры в объеме 20 мкл в виде цельного препарата или указанного разведения * - различия с контролем по t критерию Стьюдента достоверны при р<0,05, ** - при р<0,01, *** - при р<0,001

Рис.1. Накопление стабильных форм NO в надосадках культур целомоцитов без митогенной стимуляции (контроль) По оси абсцисс: срок наблюдения, ч. По оси ординат: значения ОП при 530 нм 1 - целомоциты предстимулированных зимозаном животных; 2 - целомоциты интактных животных Число наблюдений по каждой точке - не менее 24 ** - различия между кривыми на каждом сроке наблюдения достоверны по критерию t Стьюдента при р<0,01, *** - при р<0,001

Установлено, что предактивированные зимозаном целомоциты морских звезд in vivo продуцировали повышенные концентрации NO на всех сроках культивирования при взаимодействии со всеми используемыми митогенами Представленные результаты свидетельствуют о способности целомоцитов к продукции NO в ответ на митогенную или антигенную стимуляции Важно отметить, что уровни NO в надосадках на всех сроках инкубации целомоцитов предстимулированных животных достоверно превышали таковые в культурах интактных животных (рис 1)

0,18п

0.04-1-.-----.-.-

О 12 24 48 72 96 120 ч

Оценка пролиферативной активности целомоцитов A.rubens по включению 3H-Td in vitro. Для циркулирующих целомоцитов характерен низкий уровень включения 3H-Td Некоторое повышение включения метки отмечено на сроках 96 и 120 ч культивирования в присутствии ФГА и JIM (табл 2) Однако выраженного пролиферативного ответа нефракционированных целомоцитов в ответ на стандартные митогены не выявлено На основании полученных результатов по включению 3H-Td также можно предполагать, что либо уровень пролиферации всех клеток низкий, либо пролиферирует одна из популяций клеток, либо основная пролиферация протекает вне циркуляции, а в циркуляции удается определить лишь ее завершающие этапы

Таблица 2

Динамика включения ЗН-Тс1 культурами нефракционированных целомоцитов А.гиЬепв в присутствии разных митогенов, Х±в, срш/Индекс Стимуляции (ИС), п>6 по каждой точке. __

Срок, ч ФГА (25 мкг/мл) КонА (25 мкг/мл) ЛМ (цельный) контроль

24 363+33/1,01 357+34/1,00 335133/0,93 358 +35/1,00

48 497135/7,/0 510160 /1,13 513159/1,13 453+81/7,00

72 363±65/0,90 327127/0,81 405184/1,00 404192/7,00

96 378+79*//, 322146/1,13 369161*//,.29 286138//,00

120 406+79*//,31 382+89/1,23 345+108//,11 310+3911,00

После фракционирования целомоцитов А.гиЬет в градиенте плотности уровень включения 3Н-Тй оказался ниже, чем в культурах нефракцинированных клеток При этом не выявлено различий в уровне включения метки как между нестимулированными и стимулированными Кон А культурами, так и между фракциями (табл 3)

Таблица 3

Динамика включения 3Н-тимидина клетками фракций целомоцитов A.rubens в присутствии КонА, 72 ч, Xls, cpm/ИС, n>6. __

стимуляция Фракция 1 Фракция 2 Фракция 3

без митогена 140120/7,00 161114/7,00 178142/7,00

КонА 155132/7,10 173120//,11 169124/0,7«

Оценка наличия аллогенного распознавания у A.rubens in vitro.

Активация лимфоцитоподобных клеток и агранулоцитов при взаимодействии с чужеродными клетками на первом этапе капсулообразования предшествует последующей миграции и активации гранулярных амебоцитов. Уже через 3 ч эффекторы, взаимодействуя друг с другом и активно перемещаясь по дну лунки, стремятся изолировать аллогенные мишени После 6 ч совместной инкубации уже все окрашенные мишени находятся в окружении эффекторов, плотность которых продолжает возрастать Срок формирования капсулы составляет около 9 ч, внутри которой отчетливо выявляются локальные

скопления окрашенных мишеней при отсутствии дальнейших изменений до окончания срока наблюдения (36 ч) При этом установлено практически полное отсутствие красителя нейтрального красного в среде инкубации, что подчеркивает функциональное значение капсулы в изоляции чужеродного материала

Выявление цитокиноподобной активности в условиях смешанной культуры целомоцитов А. гиЬет Приведенные в табл 4 данные свидетельствуют, что на сроке 24 ч в аллогенных культурах содержание Т№а-подобных- в 1,48 раза, а ШЫу-подобных цитокинов в 2,28 раза было выше, чем в контролях, в то время как через 96 ч присутствия всех указанных молекул не выявлено Присутствие 1Ь-1(3 выявлено только на сроке 24 ч инкубации в аутологичной культуре Обнаружение молекул, реагирующих с антителами к ЮТа во всех культурах за исключением аутологичной, позволяет предполагать как сам факт наличия структурного аналога этой молекулы у А гиЬет, так и возможность регуляторных влияний Т№а- и ГРМ-у- подобных молекул при аллогенном распознавании

Таблица 4

Определение цитокиноподобных факторов в смешанной культуре целомоцитов на сроках 24 и 96 ч, Х±в, пг/мл, число наблюдений по каждой точке - не менее 16. _ _ _ ___

Культура целомоцитов Т№а ГРИу

через 24 ч через 96 ч через 24 ч через 96 ч

Эффекторы, 200тыс/лунку 5,06±0,04 5,06±0,04 5,39±0,08 3,17±0,05

Мишени, ЮОтыс/лунку 2,88±0,04 0 6,67±0,10 0

Мишени, 200тыс/лунку 5,23±0,08 0 6,48±0,10 0

Аллогенная культура (1 1) 7,78±0Д2 0 0 0

Аллогенная культура (2 1) 3,23±0,05 0 15,18±0,23 5,39±0,08

Аутологичная культура, 200 тыс/лунку 0 0 11,19±0, 7 5,39±0,08

Анализ цитотоксической активности целомоцитов А. гиЬет. С

использованием модели переноса впервые было показано, что выраженный гемолиз ЭЧ происходит в зоне клеточных агрегатов, а цитотоксический эффект связан с формированием агрегатов целомоцитов в центре зон гемолиза, что может наглядно свидетельствовать о существовании механизмов межклеточной кооперации у иглокожих Уже через 3 ч после переноса ЦЖ возрастает число циркулирующих целомоцитов (от 0,097±0,041 до 0,35+0,11) Модель переноса также позволила на основании оценки ОП среды установить, что только образцы бесклеточной ЦЖ животных, предстимулированных за 12, но не за 3 ч до переноса, индуцируют цитотоксическую активность циркулирующих клеток реципиентов в отношении ЭЧ, подтверждая тем самым гипотезу об участии

цитокинолодобных молекул иглокожих в регуляции защитных реакций. Покачано, что ЦЖ интактных А.гиЬепь не обладает цитотоксичностью для ЭЧ ( габл.5). На всех сроках наблюдений ГА целомоцитов опытной и контрольной групп достоверно превышала соответствующий уровень влияния ЦЖ реципиентов и в отрицательном контроле. Другой задачей было сравнение вклада клеточных и ^моральных факторов в развитие цитотоксичееких реакций иглокожих (рис.2). Перенос ЦЖ от нредети мутированного ЛПС животного повышает ГА ЦЖ реципиента, а перенос ЦЖ от предстимулированного зимозалом животного, наоборот повышает клеточную цигогоксичность реципиента. Следовательно, клеточные и гуморальные факторы защиты запускаются разными типами антигенов.

Таблица 5

Динамика гемолиза ЭЧ целомойнтами и ЦЖ реципиентов, активированных ЦЖ от доноров, предстимулиро ванных зимозаном за 12 ч до переноса, Х+я, ел- ОП при 405 им, число наблюдений мо каждой точке -не менее 6.

Срок, Целомоциты реципиентов ЦЖ реципиентов ФМВ+ЭЧ

ч опыт контроль опыт контроль

1,5 0,39±0,18Z 0,15±0,03 0,06±0,00 0,08:10,00 0,08+0,01

3 0,50±0,18 0,29±0,06 0,01+0,01 0,16=0,04 0,09±0,01

4,5 0,40±0,12 0,30±0,07 0,1 1±0,01 0,17±0,04 0,10^0,0!

12 0,60±0,13 0,59±0,13 0,16+0,03 0,34±0,08 0,13±0,00

Примечание: опыт - перенос ЦЖ от доноров, предстимулированных зимозаном, контроль - перенос ЦЖ от доноров, получивших равный объем ФМВ. Достоверность различий оценивали между опытом и контролем на каждом сроке наблюдения.

Ник.2. Уровень гемолиза >4 целомоцитами и ЦЖ реципиентов, активированных 11Ж доноров,

" предстимулированных l mi-ЛПС

за12 ч до перенося. По оси абсцисс: Í - целомоциты я з опытного реципиента, 2 - целом опиты контрольного реципиента, ос 3 - ЦЖ опытного реципиента,

4 - ЦЖ контрольного реципиента, 05 ? - ЭЧ и ФМВ, По оси ординат: значение ОП при 405 нм, X±s. Число наблюдений но каждой гонке panno 12.

Оценка способности целомоцитов взаимодействию с лектинамн in vitro. Из приведённых в табл. 6 результатов следует, что почти псе использован!®^ яектины вызывали достоверный прирост уровня продукции NO цсломоцитами по сравнению с таковым в контроле, однако ни для одного

. . .

- - TÍ

■ Éft ■ ' j

■ '■ - V

т т И

н ж т ■ h

.' [V ■ ■ паи WhtyCaiftW

из использованных пектинов не выявлено влияния на активность редуктаз (по МТТ-тесту), что может указывать на существование разных путей внутриклеточной сигнализации Повышенные по сравнению с контролем показатели уровня N0 в надосадках культур наиболее выраженными были для лектинов сои (0,123±0,001) и арахиса (0,137±0,002) по сравнению с отрицательным контролем (0,089±0,001)

Таблица 6

Оценка влияния лектинов на активность редуктаз и продукцию NO целомоцитами A.rubetts, X±s, п>15, ед. ОП. __

Лектин Лиганд Уровень NO МТТ-тест

лектин сои, SBA NAcDGal 0,123±0,001*** 0,069±0,004

лектин улитки, НРА NAcaDGal 0,116±0,002*** 0,070±0,002

лектин арахиса,PNA ßDGal 0,137±0,002*** 0,071±0,003

лектин гороха, PSA aDMan 0,113±0,001*** 0,060±0,001

лектин бузины черной, SNA aNAcNANA(2—>6) Gal/NAcGal 0,095±0,001* 0,073±0,003

лектин лимской фасоли, LBA NAcDGal 0,093±0,001 0,073±0,004

контроль (ФМВ) 0,089±0,001 0,074±0,004

Примечание: все лектины использовали в финальной концентрации 25 мкг/мл

Анализ лигандной специфичности лектинов указывает, что наибольший уровень ответа связан с углеводными группировками, несущими галактозу в терминальном положении Связывание углеводного компонента лектинами и последующая кластеризация рецепторов обеспечивают усиление синтеза N0, но не сопровождаются усилением метаболической активности, в том числе активности митохондриальных редуктаз

Цитокиноподобные факторы А. гиЬет. Выявление цитокиноподобной активности в условиях смешанной культуры целомоцитов, цитотоксическом тесте, изучении пролиферативной активности потребовало проверки предположения о возможности выявления цитокинов беспозвоночных с применением моноюгональных антител к цитокинам позвоночных животных, что было реализовано в работе на примере 1Ь-1-, ТОТ а-, ШМу-подобных и других факторов Обобщенные результаты исследований приведены на рис 3 Ответ активированных ЛПС целомоцитов морских звезд продукцией цитокинов, подобных 1Ь-1Р и Т№а аналогичен таковому при бактериальной стимуляции макрофагов млекопитающих С учетом выявления нами того факта, что уровни продукции подобных Т№а факторов не превышают 50 пг/мл, что гораздо ниже, чем уровни продукции целомоцитами А.тЬет 1Ь-1р-подобных факторов, сопоставимых с таковыми в культурах мононуклеаров млекопитающих, а также того, что стимуляция целомоцитов А.гиЬет Кон А и лимфоцитарным митогеном приводит к более высоким уровням ТЫРа-

II

3D 330 2D ZD 13) ЮО Я) О -S3

12 24 48 72 36 12D

III

IV

-•-(ГА -■-КонА

36л 32 2В 24 20 1& 128 4 Ol

-i-КЬнА -A- ютгра%

12 24 48 72 96 120

12 24 48 72 96 120

12] 10 8 6

2 О

V

VI

1 KJA

У JM

-д- шри

я>

40 30 20 10 О

12 24 48 72 96 120

(ЧГА)

(Kirf)

(JM

-Д- (юпргпь)

12 24 48 72 96 120

Рис. 3. Количественное определение цитокиноподобных факторов A.rubens в надосадках культур целомоцитов интактных (I, III, V) или предстимулированных ЛПС (II,IV,VI) животных при митогенной стимуляции.

По оси абсцисс срок наблюдения, ч, по оси ординат концентрация, пг/мл Рис I и II - IL-ip-подобные факторы, рис III и IV - TNFa-подобные факторы, рис V и VI - IFNy-подобные факторы Число наблюдений по каждой точке - не менее 6

подобных факторов даже на фоне предстимуляции животных суспензией зимозана, можно предполагать синергизм действия TNFa и IL-lp цитокинов морской звезды

Обнаружение перекрестной реактивности молекул, подобных IL-ip, IFNy и TNFa, с цитокинами млекопитающих позволяет ставить вопрос об их универсальности с учетом сохранения их биологических свойств на протяжении миллионов лет эволюции Результаты показывают, что моноклональные антитела к цитокинам человека связывают некие детерминанты в надосадках культур целомоцитов морской звезды Это, а также функциональное сходство факторов с цитокинами позвоночных, позволяет предполагать наличие у иглокожих соответствующих цитокиноподобных факторов, опосредующих реакции врожденного иммунитета Продукция цитокиноподобных факторов, возможно, является более древним механизмом и может запускаться различными факторами, в том числе молекулами лею иновой природы Важной представляется находка молекулы, обладающей перекрестной реактивностью с IFNy человека (рис 3) Известно, что воспроизведение биологического эффекта различными молекулами может быть обусловлено не только гомологией их происхождения, но и сходством их пространственной структуры Показанный перекрестный эффект цитокинов, обеспечивающий распознавание антителами может быть обусловлен тем, что через некую аминокислотную последовательность цитокиноподобный фактор беспозвоночного воспроизводит пространственно сходную структуру с цитокином млекопитающего, не имеющие при этом гомологии нуклеотидных последовательностей их генов Тогда можно говорить о том, что определенный регуляторный паттерн определяет совокупность ответных реакций клетки вне зависимости от уровня организации животного и наличия у него соответствующих цитокинов

ВЫВОДЫ

1 Целомоциты A.rubens являются основным эффекторным звеном врожденного иммунитета иглокожих, распознают широкий спектр лигандов, растворимые и корпускулярные антигены и формируют разные виды ответа на них в условиях т vitro

2 Целомоциты отвечают продукцией N0 при антигенной, митогенной и аллогенной стимуляции Циркулирующие клетки трех выделенных фракций обладают слабой способностью к спонтанному и митоген-индуцированному включению 3Н-тимидина

3 Разработан новый метод оценки цитотоксических реакций иглокожих, представляющий собой безгелевую модификацию реакции локального гемолиза Метод пригоден для исследования цитотоксических реакций разных групп беспозвоночных

4 Аллогенные взаимодействия целомоцитов in vitro приводят к формированию клеточных агрегатов вокруг чужеродного материала в течение 9-24 ч и сопряжены с продукцией цитокиноподобных молекул

5 Выявлено свойство бесклеточной целомической жидкости A.rubens переносить факторы, повышающие цитотоксическую активность Предстимуляция животных-доноров корпускулярным зимозаном приводит к усилению цитотоксических свойств целомоцитов в отношении эритроцитов человека, а предстимуляция растворимым ЛПС - к усилению гемолитической активности целомической жидкости животных-реципиентов

6 На роль регуляторов реакций врожденного иммунитета иглокожих могут претендовать цитокиноподобные молекулы морской звезды A.rubens, взаимодействующие с моноклональными антителами против IFNy, IL-1 и TNF а человека Рекомбинантные цитокины человека оказывают влияние на цитотоксическую активность целомоцитов A.rubens

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: Статьи:

1 Кудрявцев И В , Дьячков И.С., Казаков А А, Канайкин Д П, Харазова А Д , Полевщиков А В Гуморальные реакции врожденного иммунитета морской звезды Asterias rubens //Журн эвол биохим физиол -2005-Т41,№1 -С 23-28

2 Кудрявцев И В , Дьячков И.С, Казаков А А, Канайкин Д П, Харазова А Д , Полевщиков А В Клеточные реакции врожденного иммунитета морской звезды Asterias rubens // Журн эвол биохим физиол - 2005 - Т 41, №2 - С 107-113

3 Кудрявцев И В , Дьячков И.С., Харазова А Д , Полевщиков А В Поиск признаков иммунологической памяти в защитных реакциях морской звезды Asterias rubens /7 Вестник СПбГУ Серия 3 - 2005 - Вып 3 - С 61-67

4 Полевщиков А В, Кудрявцев И В , Дьячков И.С., Харазова А Д Теория тканевого параллелизма в сравнительной иммунологии//ВестникСПбГУ СерияЗ - 2005 - вып 3 -С 68-74

5 Кудрявцев И В , Дьячков И С., Полевщиков А В Каскад комплемента новые функции и возможности терапии // Известия высших учебных заведений Северо-Кавказский регион Серия естественные науки- 2006 - С 46-48

6 Дьячков И С., Кудрявцев И В Сухачев А Н Изучение механизмов межклеточной кооперации в реакциях врожденного иммунитета иглокожих // Вестник уральской медицинской академической науки - 2006 - №3-1 (14) - С 57-60

7 Кудрявцев И В Могиленко Д А, Дьячков И.С., Сухачев А Н Исследование функциональной активности различных фракций циркулирующих клеток иглокожих // Вестник уральской медицинской академической науки - 2006 - №3-1 (14) - С 117-120

8 Дьячков И С., Кудрявцев И В Анализ эффективности и механизмов кооперации клеточных реакций врожденного иммунитета иглокожих // Российский иммунологический журнал - 2007 - Т 1(10), №1 - С 34-40

9 Дьячков И.С., Кудрявцев И В , Харазова А Д, Полевщиков А В Изучение механизмов клеточных защитных реакций беломорской морокой звезды Asterias rubens И Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Европейского Севера Сборник материалов IV(XXVII) Международной конф - 2005 - Т 1 - С 135-137

10 Кудрявцев ИВ, Дьячков И.С., Харазова АД Полевщиков А В Изменение параметров защитных реакций морской звезды Asterias rubens на протяжении летнего сезона наблюдений// Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Европейского Севера - Вологда, 2005 Изд-во ВГПУ - Ч 1 - С 226-229

11 Кудрявцев ИВ, Дьячков И.С., Харазова АД Полевщиков А В Защитные реакции иглокожих как модель для исследования реакций врожденного иммунитета// Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Европейского Севера - Вологда, 2005 Изд-во ВГПУ - Ч 2 - С 67-69

12 Рябов В Б , Дьячков И.С., Кудрявцев И В , Полевщиков А В , Дольникова Г А, Киташов А В , Кондратьева И А Динамика иммунного ответа морской звезды Asterias rubens после введения бактерий // Труды ББС МГУ им Н А Перцова - 2006 - Т 10 - С 180-187

Тезисы докладов

13 Дьячков И.С., Кудрявцев ИВ, Харазова АД, Полевщиков А В Адаптация метода митоген-индуцированной пролиферации лимфоцитов для целомоцитов морской звезды Asterias rubens II Тез докл VI научной сессии МБС СПбГУ - 2005 - С 78-79

14 Дьячков И.С., Кудрявцев И В, Харазова А Д, Полевщиков А В Оценка пролиферативной и метаболической активности целомоцитов Asterias rubens m vitro в ответ на митогенную стимуляцию // Тез докл VI научной сессии морской биологической станции Санкт-Петербургского государственного университета - 2005 - С 79-81

15 Кудрявцев И В, Дьячков И С., Рябов В Б , Харазова А Д, Полевщиков А В Влияние повторного введения эритроцитов человека на динамику защитных факторов морской звезды Asterias rubens // Тез докл VI научной сессии МБС СПбГУ - 2005 - С 84-85

16 Кудрявцев И В , Дьячков И.С., Рябов В Б, Харазова А Д, Полевщиков А В Влияние различных антигенов на динамику клеточных и гуморальных защитных факторов морской звезды Asterias rubens 11 Тез докл VI научной сессии МБС СПбГУ - 2005 - С 85-86

17 Кудрявцев И В , Дьячков И.С, Канайкин Д П, Харазова А Д, Полевщиков А В Оценка сезонных влияний на параметры защитных реакций морской звезды Asterias rubens // Тез докл VI научной сессии морской биологической станции Санкт-Петербургского государственного университета - 2005 - С 86-87

18 Дьячков И.С Прояиферативная и метаболическая активность целомоцитов Asterias rubens m vitro в ответ на митогенную стимуляцию // Сборник материалов конф-ции "Физиология и медицина" - СПб, 2005 - С 37

19 Дьячков И.С., Кудрявцев И В , Полевщиков А В Ранние этапы эволюции врожденного иммунитета анализ роли цитокинов и комплемента // Цитокины и воспаление - 2005 - Т 4, № 2 - С 84-85

20 Дьячков И С., Кудрявцев И В, Полевщиков А В Активация целомоцитов морской звезды Asterias rubens ш vitro в ответ на митогенную стимуляцию // Научные труды I Съезда физиологов СНГ - Москва, Медицина-Здоровье, 2005 - Т 1 - С ПО

21 Кудрявцев ИВ, Дьячков И.С., Полевщиков А В Оценка специфичности защитных реакций морской звезды Asterias rubens // Научные труды I Съезда физиологов СНГ -Москва, Медицина-Здоровье, 2005 - Т1-С110-111

22 Дьячков И С, Кудрявцев И В, Полевщиков А В Изучение роли целомоцитов в реализации защитных реакций морских звезд Asterias rubens //Имм Урала -2005 -№4 -С 9-10

23 Кудрявцев И В , Дьячков И.С., Полевщиков А В Поиск признаков иммунологической памяти и оценка специфичности защитных реакций иглокожих // Имм Урала - 2005 - №4 -С 10-11

24 Кудрявцев ИВ , Могиленко ДА, Дьячков И.С., Харазова АД Полевщиков А В Анализ эффективности клеточных реакций врожденного иммунитета и механизмов их кооперации у иглокожих // Тез докл VII научной сессии морской биологической станции Санкт-Петербургского государственного университета - 2006 - С 92-95

25 Кудрявцев ИВ , Могиленко ДА, Дьячков ИС, Харазова АД Полевщиков А В Влияние лектинов на продукцию активных форм кислорода целомоцитов Asterias rubens в условиях in vitro // Тез докл VII научной сессии морской биологической станции Санкт-Петербургского государственного университета - 2006 - С 97-98

26 Могиленко ДА, Кудрявцев ИВ, Дьячков И.С, Харазова АД Полевщиков А В Выделение нового члена семейства а2-макроглобулина у морской звезды Asterias rubens //

Тез докл VII научной сессии морской биологической станции Санкт-Петербургского государственного университета - 2006 - С 99-101

27 Дьячков И.С., Кудрявцев И В, Полевщиков А В Цитотоксические реакции врожденного иммунитета эволюционный анализ//Мед иммунол - 2006 -Т 8,№2-3 -С 136-137

28 Кудрявцев И В , Дьячков И.С., Полевщиков А В Продукция активных форм кислорода сравнительно-иммунологический анализ // Мед иммунол - 2006 - Т 8, №2-3 - С 150

29 Полевщиков А В, Дьячков И.С., Кудрявцев И В Перспективы использования сравнительно-иммунологического подхода для анализа актуальных проблем фундаментальной иммунологии // Мед иммунол - 2006 - Т 8, №2-3 - С 168

30 Дьячков И.С., Кудрявцев И В , Полевщиков А В Новый метод оценки цитотоксичности in vitro // Russian J Immunol - 2006 - Vol 9, Suppl 3 - P 168-169

31 Кудрявцев ИВ, Дьячков ИС, Сухачев АН, Полевщиков А В Характеристика ответных реакций целомоцитов морской звезды при алпогенном взаимодействии m vitro участи цитокинов // Российский аллергологический журнал - 2007 - № 3, Прил 1 - С 18

32 Кудрявцев И В , Могиленко Д А, Дьячков И.С., Сухачев А Н , Полевщиков А В Морфо-функциональный анализ циркулирующих клеток иглокожих // Российский аллергологический журнал - 2007 - № 3, Прил 1 - С 26

33 Дьячков И С , Кудрявцев И В , Сухачев А Н, Полевщиков А В Стратегия ответных реакций целомоцитов морской звезды Asterias rubens при аллогенном взаимодействии в условиях m vitro // Медицинская иммунология - 2007 - Т 9, № 2-3 - С 136-137

34 Кудрявцев И В , Дьячков И.С, Могиленко Д А, Сухачев А Н , Полевщиков А В Структурно-функциональный анализ циркулирующих фагоцитов иглокожих // Медицинская иммунология - 2007 - Т 9, № 2-3 - С 147

Подписано в печать 05 09 07 Формат 60*84 1/16 Бумага офсетная Печать офсетная Печ л 1,0 Тираж 100 экз Заказ 79

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства СПбГЭТУ "ЛЭТИ"

Издательство СПбГЭТУ "ЛЭТИ" 197376, С -Петербург, ул Проф Попова, 5

Актуальность проблемы. Решение фундаментальных проблем иммунологии связанно с изучением процесса становления иммунной системы, поиском молекулярных и клеточных основ реакций врожденного и приобретенного иммунитета позвоночных и сравнительно-иммунологическим анализом процесса эволюции функций иммунной системы.

Традиционно в иммунологических исследованиях особое внимание уделяется изучению защитных реакций наиболее продвинутых форм животных, к которым, в первую очередь, относятся млекопитающие. Однако единственный путь, который позволяет выявить причины возникновения, изучить процесс становления отдельных элементов иммунной системы и понимания характера их взаимосвязи и перейти к пониманию всего явления иммунной защиты в целом, - это обращение к филогенетически более древним формам жизни. В результате поиска примитивных форм реакций приобретенного иммунитета, характерными чертами которого у позвоночных животных являются специфичность и память, основанные на распознающих молекулах иммуноглобулинового суперсемейства, накопились данные не только о наличии механизмов реаранжировки генов поверхностных рецепторов для различных лигандов [122; 169], но и о сходстве процессов перестройки некоторых групп генов (семейства скавенджер-рецепторов и То11-подобных белков) с иммуноглобулиновыми генами позвоночных животных [123; 124]. Вместе с этим до сих пор весьма дискутабельным остаётся вопрос о наличии иммунологической памяти у беспозвоночных животных, обладающих только врождённым иммунитетом [8; 92].

Реакции врождённого иммунитета отличаются немедленной активацией клеток-эффекторов [59], основаны на распознающих молекулах, закрепленных в геноме, реаранжировка которых не является необходимой, а также характеризуются отсутствием клонального размножения вовлеченных в ответ однотипных клеток. При этом распознавание идет за счет высоко консервативных паттернов, представления о которых были сформулированы в середине 1990-х годов Ч. Дженуэем и Р. Меджитовым, что вывело сравнительно-иммунологические исследования на принципиально новый уровень и оказались исключительно плодотворными [5].

Для врожденного иммунитета характерно принципиальное решение проблемы распознавания "свое" - "чужое". Эволюция привела к сохранению паттернов распознавания как "несвоего", так и "своего". Эта древняя, но далеко не примитивная система детектирования "несвоего" является базовой и в противоинфекционном иммунитете позвоночных [5]. Сохранение в эволюции живого высококонсервативных элементов микроорганизмов (РАМР-элементы) обусловило закрепление в геноме макроорганизма распознающих их высокоаффинных рецепторов - PRR (скавенджер-рецепторы, лектины, TLR, ЛПС- и маннозо-связывающие белки и др.), которые играют центральную роль как в активации врождённого иммунитета (фагоцитоз, инкапсуляция, процесс формирования узелков, адгезии циркулирующих клеток) [24; 123].

Работы по защитным реакциям иглокожих проводятся на различных представителях классов морских звезд, ежей и голотурий (одиночные исследования проводились на офиурах и морских лилиях). Иглокожие рано отделились от магистрального пути эволюции данной группы, образовав архаичный высоко специализированный тип, представители которого обладают полностью сформированной вторичной полостью тела и находятся в основании всего древа DEUTEROSTOMIA, к которому относятся и позвоночные. Поэтому их иммунную систему гипотетически можно рассматривать в качестве предковой по отношению к иммунной системе эволюционно более продвинутых форм [1; 9].

Клеточным типом, давшим начало внутренней мезенхимальной среде организма и всем группам циркулирующих клеток, мог быть блуждающий амебоцит, который независимо многократно появлялся у первично- и вторичноротых животных, на что указывали еще И.И.Мечников и акад. А.А.Заварзин [3; 10]. Дискуссионным остается вопрос о наличии прямых филогенетических связей между блуждающими амебоцитами низших многоклеточных и лимфоцитами вторичноротых животных [9].

Хотя изучение защитных механизмов иглокожих и является весьма перспективным направлением с точки зрения их родственных связей с хордовыми, однако данные об этих механизмах остаются весьма фрагментарными. Многочисленные исследования особенностей защитных реакций иглокожих касались механизмов трансплантационного иммунитета, однако и эти исследования остались незавершенными, а результаты не стали однозначными. Гораздо более тонкие молекулярно-генетические исследования были связаны с поиском компонентов комплемента [8; 146150], цитокиноподобных факторов у иглокожих [20-27] однако в настоящее время число работ в этом направлении сократилось, хотя вопрос о функциональной активности выявленных цитокиноподобных молекул иглокожих остался.

Тем не менее, ряд важных с иммунологической точки зрения вопросов, касающихся организации защитных реакций иглокожих, остается неясным. К их числу относятся аспекты регуляции их защитных реакций, в частности, механизмов цитотоксических реакций, отличающихся высокой эффективностью и обеспечивающих выживание группы на протяжении миллионов лет эволюции. Важным представляется изучение перекрестной реактивности медиаторных молекул млекопитающих и регуляторных молекул иглокожих A. rubens в отношении их влияния на показатели клеточных реакций.

Цель работы: анализ механизмов клеточных реакций врождённого иммунитета иглокожих

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Сравнение синтетических и пролиферативных свойств популяций целомоцитов морской звезды Asterias rubens;

2. Разработка метода оценки цитотоксичности клеточных защитных реакций иглокожих;

3. Оценка параметров аллогенных реакций иглокожих in vitro;

4. Поиск примитивных медиаторных сигналов, необходимых для реализации реакций врождённого иммунитета иглокожих.

Научная новизна работы. Впервые разработана модель оценки цитотоксических реакций иглокожих, представляющая собой безгелевую модификацию реакции локального гемолиза. Впервые оценена временная динамика продукции оксида азота N0 целомоцитами иглокожих на фоне митогенной и антигенной стимуляции. Экспериментально доказана способность целомоцитов иглокожих к распознаванию растворимых и корпускулярных антигенов и различный характер ответа на эти антигены. Подтверждена способность иглокожих к аллогенному распознаванию и проведена морфологическая характеристика процесса. Впервые получены данные о влиянии иммуноактивных молекул человека на свойства целомоцитов иглокожих и о временной динамике продукции цитокиноподобных молекул иглокожих в ответ на антигенную и митогенную стимуляции.

Научно-практическая значимость. Разработанный метод оценки цитотоксичности может быть использован при изучении защитных реакций представителей разных таксонов беспозвоночных животных. Полученные экспериментальные доказательства влияния цитокинов человека на функции целомоцитов иглокожих свидетельствуют о большей эволюционной древности цитокинов IL-1, TNFa, IFNy, чем считалось ранее. Накопленный материал существенно дополняет данные о ранних этапах эволюции иммунной системы и может быть использован в педагогическом процессе в рамках лекционных курсов по общей и сравнительной иммунологии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработан новый метод оценки цитотоксичности циркулирующих клеток беспозвоночных. Фракции целомоцитов морской звезды A.rubens различаются по цитотоксической активности в отношении эритроцитов человека.

2. Циркулирующие целомоциты иглокожих слабо включают 3Н-тимидин, отвечают изменением активности редуктаз и продукции N0 на антигенную и митогенную стимуляцию и в условиях смешанной культуры. В ответ на корпускулярный зимозан или растворимый ЛПС A.rubens развивают разные формы цитотоксичности.

3. В основе регуляции защитных реакций морской звезды A.rubens лежат медиаторные сигналы, связанные с цитокиноподобными молекулами, обеспечивающих межклеточную кооперацию.

4. В целомической жидкости и надосадках клеточных культур целомоцитов иглокожих содержатся факторы, которые обладают перекрёстной реактивностью с цитокинами IL-1, TNFa и IFNy человека. Рекомбинантные цитокины человека оказывают влияние на цитотоксическую активность целомоцитов A.rubens.

Реализация работы. По теме работы опубликовано 34 работы, в том числе 1 обзор литературы и 11 оригинальных статей.

Личный вклад в проведение исследования. Личный вклад автора в выполненную работу включает самостоятельное проведение большинства исследований, разработку и адаптацию ряда методов исследования, а также интерпретацию полученных результатов. Вклад остальных соавторов ограничивается помощью в постановке и освоении новых методов исследования, сбором экспериментальных животных в их среде обитания, а также предоставлением в распоряжение автора ряда реактивов.

Апробация работы. Материалы работы были доложены и обсуждены на VI и VII сессиях морской биологической станции СПбГУ (2005, 2006гг.), на конференции молодых ученых "Физиология и медицина" (Санкт-Петербург, 2005 г.), на 1-м Съезде физиологов СНГ (Москва, 2005 г.), на конференции "Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов европейского Севера" (Вологда, 2005 г.), на летней школе "Current Trends in

Comparative Immunology" (Санкт-Петербург, 2005 г.), на заседаниях общества иммунологов (март 2005 и апрель 2006 г.), на юбилейной конференции молодых ученых, посвященной 110-летию основания Института экспериментальной медицины (2005 г.), на Российской научно-практической конференции "Иммунология и педиатрия" (Санкт-Петербург, 2005 г.), на Российской научно-практической конференции "Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия" (Курск, 2006 г.), на X и XI Российской конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2006, 2007 гг.), на 1-м симпозиуме "Клуб профессиональных иммунологов" (Анталья, 2006 г.), на научно-практической конференции молодых ученых, посвященной памяти Н.Н.Кеворкова (Пермь, 2006 г.). Диссертационная работа была апробирована на заседании научной конференции отдела иммунологии ГУ НИИЭМ РАМН 8 мая 2007 г.

Структура и объем работы. Работа изложена на 136 страницах текста и состоит из обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов, их обсуждения и выводов. Работа проиллюстрирована 25 рисунками и фотографиями и 28 таблицами. Библиографический указатель содержит 172 источника, в том числе 11 работ отечественных авторов и 161 - зарубежных.

120 ВЫВОДЫ

1. Целомоциты A.rubens являются основным эффекторным звеном врожденного иммунитета иглокожих, распознают широкий спектр лигандов, растворимые и корпускулярные антигены и формируют разные виды ответа на них в условиях in vitro.

2. Целомоциты отвечают продукцией N0 при антигенной, митогенной и аллогенной стимуляции. Циркулирующие клетки трех выделенных фракций обладают слабой способностью к спонтанному и митоген-индуцированному включению 3Н-тимидина.

3. Разработан новый метод оценки цитотоксических реакций иглокожих, представляющий собой безгелевую модификацию реакции локального гемолиза. Метод пригоден для исследования цитотоксических реакций разных групп беспозвоночных.

4. Аллогенные взаимодействия целомоцитов in vitro приводят к формированию клеточных агрегатов вокруг чужеродного материала в течение 9-24 ч и сопряжены с продукцией цитокиноподобных молекул.

5. Выявлено свойство бесклеточной целомической жидкости A.rubens переносить факторы, повышающие цитотоксическую активность. Предстимуляция животных-доноров корпускулярным зимозаном приводит к усилению цитотоксических свойств целомоцитов в отношении эритроцитов человека, а предстимуляция растворимым ЛПС - к усилению гемолитической активности целомической жидкости животных-реципиентов.

6. На роль регуляторов реакций врожденного иммунитета иглокожих могут претендовать цитокиноподобные молекулы морской звезды A.rubens, взаимодействующие с моноклональными антителами против IFNy, IL-1 и TNFa человека. Рекомбинантные цитокины человека оказывают влияние на цитотоксическую активность целомоцитов A.rubens.

121