Разработка экспресс-тестов для оценки ранних реакций клеточного иммунитета

Кожушный, Андрей Петрович

Диссертации по медицине → Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Разработка экспресс-тестов для оценки ранних реакций клеточного иммунитета

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Кожушный, Андрей Петрович Москва 2010 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.03.09

Автореферат диссертации по медицине на тему Разработка экспресс-тестов для оценки ранних реакций клеточного иммунитета

На правах рукописи

004602313

Кожушный Андрей Петрович

РАЗРАБОТКА ЭКСПРЕСС-ТЕСТОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ РАННИХ РЕАКЦИЙ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА

14.03.09 — клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 О МАП 2010

Москва-2010

004602318

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. почётного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН, г. Москва

Научный руководитель:

- доктор медицинских наук Суслов Анатолий Петрович Официальные оппоненты:

- доктор медицинских наук, профессор Бляхер Мария Сергеевна;

- доктор медицинских наук, профессор Гариб Фируз Юсупович

Ведущая организация:

Центральный НИИ туберкулеза РАМН.

Защита диссертации состоится « 21 » мая 2010 года в _П часов на заседании диссертационного совета Д 001.007.01 в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д.18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (г. Москва, ул. Гамалеи, 18).

Автореферат разослан «20 » апреля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Русакова Екатерина Владимировна

Актуальность проблемы

В последние годы в России и за рубежом наблюдается рост заболеваемости многими инфекционными заболеваниями (вирусные гепатиты, ВИЧ, туберкулез и др.). Полноценный контроль за течением инфекционного заболевания, мониторинг эффективности проводимой терапии (Ершов Ф.И.,

2005, Britten, 2008, Janetzki, 2008), оценка напряженности специфического клеточного иммунитета, индуцированного вакцинами (Schumann 2007, Girard,

2006, Pulendran 2006), невозможны без надежных и доступных для клинической лаборатории тестов, позволяющих оценить функциональное состояние иммунной системы человека. Функциональные клеточные тесты важны для диагностики вирусных и бактериальных инфекций (Peters 2004, Maini 2000, Katial, 2001). Эти тесты широко применяются и для изучения активности врожденного клеточного иммунитета, механизмов его инструктивного (поляризующего) влияния на развитие адаптивного иммунитета (Medzhitov, Janeway, 1997, Palm, Medzhitov, 2009).

В настоящее время активно разрабатываются функциональные тесты для оценки состояния клеточного иммунитета in vitro, позволяющие определять уровень клеточных реакций на антигены или лиганды разной природы. Разработаны такие перспективные современные тесты для оценки функциональной активности клеток иммунной системы как ELISPOT, проточная цитофлуориметрия и ИФА для определения цитокинов (Harari, 2004, Hemandez-Fuentes, 2003, Keilholz, 2006). Однако внедрению этих и других клеточных тестов в широкую клиническую и научно-исследовательскую практику препятствуют их недостатки: трудоемкость, низкая воспроизводимость, сложность применения в условиях клинической лаборатории, высокая стоимость анализа (Jason, 1997, Wallis, 1998).

Практически неизученными остаются ранние антиген-стимулированные реакции врожденного клеточного иммунитета на антигены вируса гепатита В (ВГВ) и ВИЧ, хотя именно такие реакции играют решающую роль в защите организма от этих вирусных инфекций (Rehermann, 2005, Girard, 2006). Недостаточно разработанной остается методология исследования этих реакций в культуральных тестах in vitro с учетом влияния спонтанной продукции цитокинов на антиген-стимулированные реакции и на функциональное состояние клеточного иммунитета в целом (Jason, 2001, Walker, 2002).

Представляется важным разработать надежные и простые культуральные экспресс-тесты in vitro, позволяющие оценивать ранние антиген (АГ)-стимулированные реакции на вирусные АГ в норме и давать количественную характеристику их изменений при развитии вирусной патологии или в ходе вакцинации с учетом влияния спонтанной продукции цитокинов.

Цель работы:

Разработка клеточных экспресс-тестов in vitro в условиях клинической лаборатории для оценки ранних антиген-стимулированных и спонтанных реакций клеточного иммунитета в норме, при вакцинации и при вирусной патологии.

Задачи исследования:

1. Разработать экспресс-тесты in vitro на основе уплотненных (УМК) и разреженных (РМК) микрокультур лейкоцитов периферической крови человека, позволяющие: 1/ в одних и тех же уплотненных микрокультурах последовательно тестировать клеточную миграцию по типу PTMJI и определять продукцию цитокинов; 2/ в разреженных микрокультурах, с тем же количеством клеток как и в УМК, определять продукцию цитокинов.

2. С помощью экспресс-тестов исследовать изменение соотношения уровней спонтанной и антиген/митоген (АГ/МГ) - стимулированной продукции цитокинов в уплотненных и разреженных микрокультурах клеток нормальных лейкоцитов человека в кинетике с 1-го по 18-й час культивирования in vitro.

3. Тестируя в уплотненных микрокультурах PTMJI на поверхностный антиген ВГВ (HBsAg), изучить изменения клеточной миграции (стимуляция или подавление миграции) в разные сроки после вакцинации против гепатита В, при хронических заболеваниях печени и на разных стадиях ВИЧ-инфекции в сравнении со здоровыми донорами.

4. Сравнить в уплотненных микрокультурах уровни спонтанной и HBsAg-стимулированной продукции цитокинов (IL-ip, IL-6, IL-8, TNF-a, IFN-y, IL-2, IL-IRA) в разные сроки вакцинации против гепатита В, а также в разреженных микрокультурах у лиц отвечающих и не отвечающих на вакцинацию против гепатита В, используя разработанные экспресс-тесты.

5. Провести в уплотненных микрокультурах оценку ранних АГ-стимулированных реакций лейкоцитов периферической крови на антигены ВГВ и ВИЧ, определяемых по продукции цитокинов (IL-ip, IL-6, IL-8, TNF-a, IL-1RA), у больных гепатитом В и ВИЧ-инфицированных пациентов.

Научная новизна работы

Разработана и исследована на клинических моделях система клеточных экспресс-тестов, позволяющая количественно определять как раннюю АГ/МГ -стимулированную, так и спонтанную активность лейкоцитов периферической крови человека по параметрам клеточной миграции и продукции цитокинов (IL-lp, IL-6, TNF-a) в стандартных клеточных микрокультурах in vitro.

Впервые обнаружена ранняя антиген- и митоген-стимулированная реакция ЛПК у здоровых не привитых доноров на антигены вируса гепатита В, а также антигены ВИЧ и соникат М. tuberculosis в качестве антигенов сравнения, определяемая по клеточной миграции (подавление или стимуляция

миграции лейкоцитов) и продукции провоспалительных цитокинов (1Ь-6,1Ь-8, ТЫБ-а, 1Ь-1Р).

Впервые дана оценка ранних АГ-стимулированных реакций на НВэАд при вакцинации против гепатита В и обнаружено индуцированное вакциной усиление НВ э А£-сти м у л иро ванно й продукции цитокинов 1Ь-6, 1Ь-8, 1Ь-1р, ЮТ-а и №N-7, после 3-й дозы вакцинации и снижение HBsAg-стимулированной и рост спонтанной продукции этих же цитокинов по сравнению с контрольной группой после 1-й и 2-й доз вакцинации, а также у ранее привитых против ВГВ.

Впервые у пациентов с гепатитом В и ВИЧ-инфекцией при оценке ранних АГ-стимулированных реакций выявлены изменения, важные для иммунопатогенеза этих инфекций, выражающиеся в усилении или снижении продукции цитокинов 1Ь-6, 1Ь-8, 1Ь-1р, ТОТ-а и 1Ь-111А в ответ на гомологичные и гетерологичные антигены ВГВ и ВИЧ.

Практическая значимость работы

1. Проведенное исследование ранних реакций клеточного иммунитета позволило разработать методологию оценки изменений клеточного иммунитета, вызванных вакцинацией или инфекционной патологией, в сравнении с состоянием нормального врожденного иммунитета, что открывает перспективу мониторинга напряженности клеточного иммунитета в клинической практике, возможность применения экспресс-тестов для диагностики инфекционных заболеваний и оценки эффективности вакцинации или противовирусной терапии.

2. Разработанные методические подходы дают возможность проведения более детальных исследований по противовирусной резистентности и состоянию врожденного иммунитета в скрытый период взаимодействия вируса и иммунной системы хозяина.

Внедрение полученных результатов в практику

1. Заявка на патент № 2008138410/049480/ «Способ определения функциональной активности клеточной микрокультуры» от 29.09.2008 в Федеральный институт промышленной собственности.

2. Методические рекомендации «Способ комплексного контроля функциональной активности клеточного иммунитета при вакцинации против гепатита В», методические рекомендации «Использование алгоритма прогнозирования недостаточности иммунного ответа у лиц, вакцинированных против гепатита В, на основе комплексной функциональной оценки реакции клеточного иммунитета», методические рекомендации «Способ оценки напряженности клеточного иммунитета в автоматизированном РТМЛ при ВИЧ-инфекции, осложненной коинфекцией вирусным гепатитом В», утвержденные советом по внедрению научных достижений в практику НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, протокол № 10 от 27.11.09

3. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций для слушателей на кафедре инфектологии медико-профилактического факультета последипломного профессионального образования ММА им. И.М. Сеченова.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на:

«Объединенном иммунологическом Форуме - 2008» в Санкт-Петербурге 30 июня-5 июля 2008г.

VII конференции иммунологов Урала. (Всероссийская конференция «Резервные возможности человека в дискомфортных климатогеографических условиях») 1-7 июля 2009г.

ХШ Всероссийском научном Форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» 8-11 июня 2009г.

Апробация диссертации состоялась 10 марта 2010 г. на научной конференции отдела иммунологии НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработаны клеточные экспресс-тесты, на основе двух типов микрокультур лейкоцитов человека - уплотненных и разреженных, позволяющие в пределах суток определить напряженность антиген- или митоген-стимулированного клеточного иммунитета по изменению клеточной миграции и продукции цитокинов.

2. Разработанные экспресс-тесты и алгоритм комплексного анализа их результатов дают возможность количественно соотнести различия или изменения спонтанной и антиген- или митоген-стимулированной продукции цитокинов в отдельных исследуемых группах пациентов с использованием микрокультур с различной плотностью популяции тестируемых лейкоцитов.

3. Разработанные клеточные экспресс-тесты могут быть использованы для оценки состояния врожденного и адаптивного клеточного иммунитета при вакцинации против гепатита В, оценки различия уровней клеточного ответа (спонтанная и индуцированная продукции цитокинов на HBsAg) у отвечающих и неотвечающих на вакцинацию против гепатита В.

4. Разработанные экспресс-тесты позволяют охарактеризовать спонтанные, антиген- и митоген-стимулированные реакции лейкоцитов, а также оценить изменения соотношения этих реакций в присутствии различных вирусных антигенов в группах пациентов с патологией печени вирусной природы разной степени тяжести, а также при ВИЧ-инфекции.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объём диссертации.

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, состоящего из 155 работ. Диссертация изложена на 198 страниц машинописного текста, включает 45 таблиц и 30 рисунков, 3 приложения.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы и методы.

Были обследованы следующие группы пациентов: контрольная группа (здоровые невакцинированные лица) - 48 человек; привитые против гепатита В в ходе проведения данной работы - 49 человек; ранее привитые против гепатита В (поствакцинальный период свыше 2 лет после введения последней дозы вакцины) - 29 человек; пациенты с хроническими заболеваниями печени (ХЗП) вирусной природы, период заболевания не менее полугода - 54 человека; пациенты из центра трансплантации печени (ЦТП), терминальная стадия заболевания печени вирусной природы, цирроз - 22 человека; ВИЧ-инфицированные (1-2 стадия заболевания - 15 человек).

Вакцинацию против гепатита В взрослых добровольцев проводили по трехдозовой схеме с использованием вакцины «Твинрикс» (производство «Смит Кляйн», Бельгия).

В качестве HBsAg использовали препарат очищенного нативного HBsAg субтипа ау («ИМБИО») - HBsAg ИБ. В качестве HBeAg и HBcAg использовали рекомбинантные антигены HBeAg и HBcAg, предоставленные НПО «Диагностические системы». В работе использовали три вида рекомбинантных антигенов ВИЧ (ЗАО «Биосервис»): gp41, gpl20 и p24(gag). В качестве антигена микобактерий использовали Соникат микобактерий в различных концентрациях, полученного путем ультразвукового разрушения М. tuberculosis.

Для выявления HBsAg в сыворотке использовали следующие тест-системы отечественного и зарубежного производства: «Гепастрип В» (ООО «НИАРМЕДИК ПЛЮС», Россия), «Вектогеп HBs-антиген» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия), Murex HBsAg v.3 («Abbott-Murex», Великобритания). Для определения в сыворотке антител против ВГВ использовали тест-системы производства ЗАО «Вектор-Бест», Россия: «BeicroHBsAg-антитела». Для выявления наличия антител к ВИЧ использовали тест-систему КомбиБест ВИЧ-1,2АГ/АТ (комплект 1) и КомбиБест ВИЧ-1,2 АГ/АТ-стрип (комплект 2) (ЗАО «Вектор-Бест»).

Для определения продукции цитокинов методом ИФА использовали тест-системы компании ЗАО «Вектор-Бест» Новосибирск: «гамма-Интерферон-ИФА-Бест», «альфа-ФНО-ИФА-Бест», «ИЛ-1 бета-ИФА-Бест», «рецепторный

антагонист ИЛ-1-ИФА-Бест», «ИЛ-2-ИФА-Бест», «ИЛ-4-ИФА-Бест», «ИЛ-6-ИФА-Бест», «ИЛ-8-ИФА-Бест», «ИЛ-10-ИФА-Бест», «ИЛ-18-ИФА-Бест».

Базу Данных составляли с помощью программы «Ехе1».

Статистическую обработку результатов и вариационный анализ проводили с помощью программ «СгарЬРас1Рп8т 5.0», «Ехе1». Достоверность полученных результатов определяли с помощью ^критерия Стьюдента.

1. Методики и алгоршпм тестирования ранних реакций лейкоцитов периферической крови человека

Ранее была разработана модификация реакции торможения лейкоцитов (РТМЛ) - скрининговый тест клеточной миграции (СТКМ) (Суслов А.П., 1989), в которой исследуемыми объектами были клеточные микрокультуры, сформированные с помощью устройства «Мигроскрин» в виде плотной клеточной популяции в центре лунок 96-луночного планшета (уплотненные микрокультуры - УМК) (Рис. 1).

| умк |

.isrrffe..

j Забор Hipen, отстаивание, выделение ПГКЧ }

] РМК .|

формирование уплотнен ных^микрокультур : 2.5X10^клеток, инкубация с АГ/МГ. 37ИС , 1-18 часов

формирование разреженных микрокультур 2 ;5 XI клеток. инкубация с: АГ/М Г, 37°С. 1-1S часов

[ Кпеточная миграция |

coop супер ната н тОв

| суперi

сбор натан foe

ис

кос

Продукция цитокиное:

спонтанная

А Г-с тн мутированна я

МГ-с ти мул ироеа иная

Комплексный анализ )

Рис.1. Методика постановки клеточных экспресс-тестов (уплотненных и разреженных микрокультур клеток)

Уплотненные микрокультуры (УМК) были использованы не только для получения результатов РТМЛ, но и для определения в супернагантах этих же микрокультур продукции различных цитокинов. УМК впервые были использованы для исследования ранних, начиная с первого часа культивирования in vitro, клеточных реакций ЛПК человека на вирусные и бактериальные антигены. Альтернативой УМК, которая может быть аналогом in vitro уплотнения клеток при их размещении в лимфоидных органах in vivo, в

настоящей работе послужил другой тип клеточных микрокультур -разреженной (РМК) (Рис. 1). В этом случае в лунку 96-луночного планшета помещали 2,5x104 клеток - столько же, сколько располагается в УМК, но не сконцентрированных в центре лунки, а рассеянных по всему дну лунки. Это количество ЛПК человека примерно на порядок меньше, чем обычно используют при культивировании клеток в клеточных тестах in vitro известных по литературным данным.

Особенностью алгоритма тестирования ЛПК человека являлось совмещение двух методик - клеточной миграции и продукции цитокинов - в одних и тех же УМК и после проведения соответствующих расчетов сопоставлять полученные результаты и проводить комплексный анализ исследуемых реакций. В отличие от УМК, в РМК не было возможности количественно исследовать клеточную миграцию, так что была исследована только продукция цитокинов.

Для комплексного анализа продукции цитокинов в УМК и РМК использовали следующие коэффициенты:

ИС = Кннд/Кср, где ИС - индекс стимуляции, Кннд - среднее значение индуцированной продукции цитокина, К<.р - среднее значение спонтанной продукции цитокина (используется для сравнения спонтанной и индуцированной продукции цитокинов в пределах одной группы).

КИЛ = Кщд]/ Кинд2) где КИЛ - коэффициент индуцированной активности, Кщад1 - среднее значение индуцированной продукции цитокина в группе сравнения, Кнпл2 - среднее значение индуцированной продукции цитокина в контрольной группе.

КСА = Kept/ Кср2, где КСА - коэффициент спонтанной активности, Kcpi — среднее значение спонтанной продукции цитокина в группе сравнения, К<.Р2 -среднее значение спонтанной продукции цитокина в контрольной группе.

КОС = КИА/КСА, где КОС - коэффициент относительной стимуляции (позволяет сравнивать спонтанную и индуцированную продукции цитокинов между разными группами).

2. Кинетика развития антиген/митоген-стимулированной и спонтанной продукции цитокинов в уплотненных и разреженных микрокультурах

Сравнительное исследование продукции цитокинов проводили в УМК и РМК (Рис.2), стимулированных HBsAg в концентрации 5 мкг/мл, митогеном ФГА (25 мкг/мл) и определяли уровень спонтанной продукции цитокинов в среде культивирования в исследуемых микрокультурах (Кср).

И..1Р

и гг и гг гг и я и 1* г« 1» а» а» а» г» 1»

£ £ х х х х х х

¡К.1,.,., |ТТ,.............,,,

|УМК|

|РМК|

и и и Ц Ц Ц и И

8 2 § § х 8 2 * |УМК| |р»к|

»^у

4»М Л* V им

пп яя яя

ц« 1» V ,,

'Р !? и ц 1 § 2 Р РI1 П

1,- Ч

]умк|

|рмк|

« я к к 41 р

» и и 1.1 * пП т нП ы м и (" ЯЙ ИИ ИМ >Я/

■?5 <Й <2 < 1* Iе 1 1 а чЙ 55 <Й <5 1 Г 1 !

га!» -Ф гага га рг;

¡УМ к} |рмк)

аайгягима-

и к л Ж а» !• |> а»

X X X X

и а р Р

X X 2 X

|умк| |РМК|

Рис.2. Продукция цитокинов в уплотненных и разреженных микрокультурах здоровых доноров. Области сравнения на 1-й час выделены сплошным кругом, на 18-й час - пунктиром; цифрами отмечены значения ИС

-при стимуляции HBsAg (5 мкг/мл); I

-при стимуляции ФГА (25 мкг/мл);_1-спонтанная продукция

Были исследованы также реакции ЛПК на НВэАд в концентрациях 1 мкг/мл и 100 нг/мл (результаты представлены в диссертации). При исследовании кинетики НВбА§- и МГ-стимулированной продукции провоспалительных цитокинов (1Ь-1р, 1Ь-6, 1Ь-8, TNF-a, №N-7, 1Ь-2, 1Ь-10) в УМК и РМК, начиная с первого часа культивирования, были получены следующие результаты (Рис. 2): 1/ выраженную НВ5А£-стимулированную продукцию провоспалительных цитокинов можно выявить уже на 1-3 часу, как в УМК, так и в РМК; 2/ продукция провоспалительных цитокинов резко возрастала к 18 часу по сравнению с первыми часами культивирования, при этом в стимулированных РМК абсолютные значения, ИС, и КОС были существенно выше, а спонтанная продукция ниже, чем в УМК; 3/ в УМК была обнаружена высокая спонтанная продукция 1Ь-2, а в РМК АГ/МГ-стимулированная продукция 1Ь-10. При использовании разных концентраций HBsAg было установлено, что его действие на продукцию цитокинов ЛПКЧ имеет дозозависимый, а не пороговый эффект.

Таким образом, микрокультуры УМК и РМК, содержащие небольшое количество культивируемых клеток, можно использовать для изучения самых ранних реакций ЛПК на вирусные антигены. При этом уровень АГ/МГ-стимуляции, в виде продукции цитокинов, был наиболее выражен в 18-часовых микрокультурах, поэтому в дальнейшем мы использовали именно эти микрокультуры как наиболее информативные. РМК, в которых ИС и, соответственно, чувствительность реакции, выше, чем в УМК, может служить перспективной моделью для исследования самых ранних этапов АГ-стимулированной продукции провоспалительных цитокинов. В то же время, для выявления реакции продукции иммунорегуляторных цитокинов в УМК и РМК, возможно, необходимо более длительно культивирование ЛПК.

3. Антиген-стимулированная реакция ЛПК здоровых доноров на антигены разной природы после 18 часовой инкубации в контрольной группе

Была исследована реакция на разные антигены - НВвАд, НВеАд, НВсА§, соникат М.шЬегси1о515 и антигены ВИЧ, тестированная в УМК по продукции цитокинов. Антиген соникат М.Ш.Ьсгси1оз13 был выбран как антиген сравнения по двум причинам: 1/ как антиген не вирусной, а бактериальной природы; 2/ как антиген, против которого возможна сенсибилизация в результате БЦЖ вакцинации. Установлено, что наиболее выраженная реакция продукции провоспалительных цитокинов 1Ь-6, 1Ь-8, ЮТ-а и 11.-1 р, рассчитанная через ИС, развивалась при стимуляции ЛПК здоровых доноров HBsAg и соникатом. АГ-стимулированная реакция продукции цитокинов 1Ь-4 и 1Ь-111А обнаружена в присутствии HBsAg, но не сониката. При реакции на HBeAg, НВсА§ и антигены ВИЧ обнаружено недостоверное увеличение продукции провоспалительных цитокинов. Таким образом, мы наблюдаем избирательную АГ-стимулированную реакцию клеток в УМК на антигены различной природы - вирусной (НВзА§) и бактериальной (соникат М.щЬегси1о515).

4. Исследование клеточной миграции в уплотненных микрокультурах клеток в разных группах.

Средние колебания ИМ в УМК в присутствии НВзАд в исследуемых концентрациях у здоровых лиц были небольшими - в пределах от -4 до 15%.

, "fa».,.h. f;

I i j Т Iг "

. - x < Ь fe S 5 K&l* SS «,< s » i 5 ? i 3 •

as* аз* a si г г e • < <

^ *" ВВП

» fpynw I jl ДО»« [ fr ДО?« | |з дои I

li fl ¥

1 1 X *

| y^j "pj s

I i i * ! ' : • i ' i ♦ ; ; s •

ОППЗ F»^...vf...-...|EB51E£SS]

• J! ?5»г

sa* s ; • •

• : -s

|ВИЧ-ВГС~| |9ИЧ 1-2c~

П 5

Рис.3. Изменение индекса миграции (ИМ) относительно контрольной группы при вакцинации против гепатита В (А), у носителей HBsAg (Б), при гепатите В и коинфекциях (В), у ВИЧ-инфицированных (Г) при стимуляции антигенами ВГВ и ВИЧ, и митогеном ФГА

В качестве положительного контроля для тестирования в УМК реакции миграции в работе был использован митоген ФГА в концентрации 25 мкг/мл. Как правило, ИМ для реакции в УМК на ФГА у здоровых лиц колебался в районе значений между -40% и -50 %.

Были исследованы изменения ИМ в ходе вакцинации взрослых здоровых лиц. Из Рис. 3 А следует, что достоверные изменения ИМ в виде подавления миграции на HBsAg относительно контрольной группы происходят после 2-й и 3-й дозы вакцинации. Наиболее выраженные результаты для обеих групп были получены для концентрации HBsAg 100 нг/мл.

Таким образом, исследуя миграцию в УМК in vitro, и подобрав предварительно оптимальную концентрацию HBsAg-антигена, можно провести мониторинг состояния специфического клеточного иммунитета при вакцинации против гепатита В.

При исследовании клеточной миграции ЛПК у носителей HBsAg в присутствии антигенов ВГВ (HBsAg, HBcAg, HBeAg) в концентрации 1 мкг/мл обнаружена реакция стимуляции миграции. Этот факт может свидетельствовать

об ослаблении клеточного иммунитета против антигенов ВГВ у носителей ИВБАЕ (Рис. 3 Б).

Наиболее выраженное подавление миграции лейкоцитов, как свидетельство наличия специфического клеточного иммунитета по типу реакции ГЗТ, было выявлено у больных и переболевших гепатитом В. В этом случае развивалось подавление миграции в присутствии НВзА§ в концентрации 100 нг/ мл (Рис. 3 В).

У пациентов с ВИЧ -инфекцией в УМК реакция подавления миграции на антигены ВИЧ отсутствовала, и, напротив, развивалась реакция стимуляция миграции на разные антигены в зависимости от стадии развития инфекции. На относительно ранних этапах развития ВИЧ-инфекции (I и II стадии) была отмечена стимуляция миграции лейкоцитов в присутствии антигена gpl20, тогда как на более поздних стадиях (стадии III и IV) - в присутствии антигена p24gag (Рис. 3 Г). Таким образом, реакция стимуляция миграции, которая означает ослабление специфического клеточного иммунитета, в ходе развития ВИЧ инфекции может индуцироваться разными антигенами ВИЧ.

5. Продукция цитокинов при вакцинации против гепатита В

Как было показано выше, HBsAg уже в первые часы культивирования эффективно индуцирует в УМК раннюю продукцию провоспалительных цитокинов, что отражает активное состояние врожденного противовирусного иммунитета. Возникают вопросы: что происходит с этой ранней клеточной реакцией на HBsAg при индукции специфичного иммунного ответа на вакцинацию против гепатита В? Как изменяется спонтанная продукция провоспалительных цитокинов? Усиливается ли антиген-стимулированная составляющая в результате вакцинации по сравнению с исходным уровнем реакции на HBsAg у невакцинированных лиц?

Данные по продукции цитокинов, полученные при вакцинации, представлены на Рис. 4.

Существенным фактом, обнаруженным в ходе вакцинации против гепатита В вакциной Твинрикс, оказалось повышение спонтанной продукции провоспалительных цитокинов после 1-й и 2-й доз вакцинации, а также у ранее привитых лиц в сравнении с контрольной группой. Напротив, после 3-й дозы вакцинации уровень спонтанной продукции провоспалительных цитокинов становился даже ниже, чем в контрольной группе (Рис. 4).

Уровень АГ/МГ-стимулированной реакции, если судить по величине ИС, не повышался параллельно росту спонтанной продукции провоспалительных цитокинов. Из-за высокого уровня спонтанной продукции у вакцинированных лиц после 1-й и 2-й дозы вакцинации ИС снижался по сравнению с контрольной группой. Исключением была только HBsAg-cтимyлиpoвaннaя продукция 1Ь-1р после второй дозы вакцины, когда ИС были несколько выше, чем в контрольной группе, не смотря на повышение спонтанной продукции этого цитокина (Рис. 4).

V V Р Р Ь

¡5 Г» ¡^

ЕЕЭ В Н

ГПчП7

ЕЗ Н Н

и э т

Рис.4. Соотношение спонтанной и АГ/МГ- стимулированной продукции цитокинов в УМК при вакцинации вакциной Твинрикс; Ш!—при стимуляции НВбА§; 1Ш—при стимуляции ФГА; 1__1—спонтанная продукция; кругами выделены области сравнения; цифрами обозначены ИС.

Стимуляция продукции провоспалительных цитокинов АГ или МГ была наиболее выраженной только после 3-й дозы вакцинации, когда спонтанная продукция была незначительной. Наиболее сильная АГ/МГ-стимуляция была выявлена для 1Ь-1р (ИС составил 60 и 111 раз соответственно) (Рис. 4).

При количественном анализе изменений уровней спонтанной и АГ/МГ-стимулированной продукции провоспалительных цитокинов в группах вакцинированных лиц было показано, что КОС после 1-й и 2-й дозы вакцинации и у ранее привитых лиц были существенно (в 2-5 раз) ниже по сравнению с аналогичными реакциями в контрольной группе.

Таким образом, вакцинация против гепатита В вакциной Твинрикс существенно снижала уровень клеточной реакции врожденного иммунитета на действие АГ или МГ по сравнению с уровнем аналогичной реакции в контрольной группе, в основном за счет роста спонтанной продукции провоспалительных цитокинов.

Уровень спонтанной продукции цитокинов ШЧ-у и 111-2 изменялся в основном в сторону увеличения (Рис. 4). НВзА^'-стимулировапную продукцию удалось выявить для ГОЯ-у только после 3-ей дозы вакцинации. Таким образом, в ходе вакцинации против гепатита В активацию клеток ТЫ в исследуемой

нами УМК можно было обнаружить лишь по продукции IFN-y и только в поздние сроки после вакцинации.

Наиболее существенно по сравнению с контрольной группой возрастал уровень спонтанной продукции цитокина IL-IRA у ранее привитых лиц, в результате чего АГУМГ-стимулированная продукция JL-1RA была существенно ниже спонтанной, что указывает на существование механизмов, ограничивающих совокупный потенциал продукции данного цитокина. В то же время, после 3-й дозы вакцинации спонтанная продукция IL-1RA была ниже, чем в контрольной группе, что, проявилось в относительно высоком уровне АГ/МГ-стимуляции этого цитокина (Рис. 4).

В целом, мониторинг клеточных реакций в УМК при вакцинации против гепатита В вакциной Твинрикс позволил установить, что доля АГ/МГ-стимулированной продукции провоспалительных цитокинов у вакцинированных лиц в разные сроки после вакцинации снижается по сравнению с невакцинированными лицами за счет роста их спонтанной продукции. После 3-й дозы вакцинации стимулированные реакции клеточного иммунитета начинают доминировать над спонтанными, что выражается через соотношение спонтанной и индуцированной продукции цитокинов. В этом случае удается четко продемонстрировать HBsAg/МГ-стимулированную продукцию провоспалительных цитокинов и выявить Т-клеточную реакцию адаптивного иммунитета по продукции IFN-y.

6. Различия в продукции цитокинов у отвечающих и иеотвечающих лиц на вакцинацию против гепатита В

В настоящее время интенсивно исследуются причины отсутствия ответа на вакцинацию, возникающего у 5-10% привитых против гепатита В (Kardar, 2002, Jafarzadeh, 2003, Velu, 2008) . Различия в продукции цитокинов у привитых и непривитых против гепатита В были продемонстрированы нами выше (Рис. 4). Для более наглядной демонстрации возможных различий в ранних микрокультурах для этих опытов была выбрана РМК, где были обнаружены наиболее высокие ИС по сравнению с УМК, (Рис. 2).

Для HBsAg-стимулированной продукции IL-ip было продемонстрировано существенное (от 2,5-КЗ,4 раза) превышение уровня реакции, выраженной в ИС, для группы отвечающих по сравнению с группой иеотвечающих лиц (Рис. 5). HBsAg-стимулированная продукция IFN-y в группе отвечающих отличалась пиком на 2-3 час культивирования, отсутствующим в группе иеотвечающих.

Особенно выраженные различия были показаны для IL-10. Уровень продукции IL-10 у отвечающих лиц, определяемый по ИС на 2 часу культивирования в РМК, был в 5-16 раз, а на 3 часу в 33-37 раз выше, чем у иеотвечающих лиц (Рис. 5). К 18 часу различия снижались, и это превышение составило около 3 раз.

11_-1Ь

11--6

• I Р ■ : ! Р ^Р • "ТТ^ ; Тт ; » » • « » ; » » ;2в ; » • * 2 * ! ; « ■ . »

о | ^Т>1 о| рс

I контр г руппа I 1АТ< 10

ЕПЭ

Рис.5. Сравнение ИС у отвечающих и неотвечающих лиц на вакцинацию против гепатита В при стимуляции НВзАз и ФГА

Таким образом, РМК может служить инструментом для определения причин возможного отсутствия выработки анти-НВз антител при вакцинации против гепатита В. Полученные данные указывают на относительно более высокий уровень АГ-стимулированной продукции провоспалительных цитокинов и 1Ь-10 у лиц, отвечающих на вакцинацию против гепатита В, что может отражать более эффективное функционирование иммунной системы в целом у этих реципиентов вакцины.

7. Продукция цитокинов у носителей HBsAg.

В организме у носителей HBsAg существует определенное равновесие между репликацией вируса и защитной клеточной реакцией, сохраняющее относительно стабильное состояние у данных индивидуумов и дающее им возможность не иметь клинически выраженных симптомов гепатита В. АГ-зависимые механизмы этого состояния клеточного иммунитета остаются мало исследованными, особенно в отношении раннего клеточного ответа.

Нами была изучена в УМК ранняя реакция на антигены ВГВ (НВэАд, НВсА£ и НВеА£) у носителей НВзА§ в сравнении с контрольной группой. Было установлено, что продукция провоспалительных цитокинов (1Ь-6, 1Ь-8, 1Ь-1Р) - как спонтанная, так и АГ/МГ-стимулированная в группе носителей HBsAg была существенно ниже, чем в контрольной группе. Значения АГ/МГ-стимулированной продукции снижались независимо от того, в присутствии какого антигена развивается реакция - HBsAg, HBcAg или HBeAg. Несмотря на снижение продукции провоспалительных цитокинов, ИС у носителей НВбА§

были выше при реакции на все антигены ВГВ. Наиболее выраженные различия были показаны при исследовании продукции 111-1Р и 1Ь-6 для антигена HBcAg на 18-м часу (Рис. 6).

(** *»

*А U

u м -ЦВД*-

Ldt

тг ни ш* im ioti гш на аи

ч«сд| |18 <IW»| |3 ч»с«| 118 ч»сов| |4 ч«са| ч«со»| |зч«о} |1вч«со»|

|Коктр, групп«) [нВ»Ад*|

IFN-Y

^МУ

| Контр, г,

¡Ш ¡Ш 1Ш1Ш

fill 1Ш !Ш iiiS

|< ч»са\ jtg 4«co»j |3 ч«сд| |ц часов} ] Контр, групп» | |нВ«Ад»|

1,1

, tt*^ м u '.1а 1.1 ..иИ-1. /яяпп nfln'n

iiil iiil iiii 1Ш

I* «»¿»l fr^] \1S ч«со»)

| Контр, групп« | [нв»Ад*]

Рис.6. Продукция цитокинов у носителей HBsAg; К^й-при стимуляции HBsAg (1 мкг/мл); ШИ-при стимуляции HBeAg (1 мкг/мл); ШЯ-при стимуляции HBcAg (1 мкг/мл); Hi-при стимуляции ФГА (25 мкг/мл); I У-спонтанная продукция; цифрами обозначены индексы стимуляции (ИС)

Продукция иммунорегуляторных цитокинов в УМК была низкой. В результате АГ/МГ-стимулированная продукция цитокинов IFN-y и IL-2 практически не изменялась в опытной группе по сравнению с контрольной, независимо от времени инкубации (Рис. 6).

Таким образом, спонтанная продукция провоспалительных цитокинов у носителей HBsAg существенно снижается по сравнению с контрольной группой, а АГ/МГ-стимулированная продукция, выраженная через ИС, возрастает. В этом отношении HBsAg-стимулированная продукция провоспалительных цитокинов при носительстве HBsAg напоминает таковую продукцию у вакцинированных лиц после 3-й дозы вакцинации против гепатита В. Однако, в отличие от привитых против гепатита В, у носителей HBsAg не было выявлено HBsAg-стимулированного усиления продукции цитокина IFN-y, то есть у них отсутствовала сенсибилизация Т-лимфоцитов, подобная той, что можно наблюдать у трехкратно привитых лиц. В то же время, возрастание ИС по сравнению с контрольной группой может указывать на существенную роль ранних реакций иммунной системы (в виде АГ-стимулированной продукции провоспалительных цитокинов) в поддержании равновесия в защите организма от ВГВ.

8. Продукция цитокинов при вирусных инфекциях, стимулированных HBsAg и антигенами ВИЧ в УМК

Согласно данным литературы у пациентов с хроническими заболеваниями печени (ХЗП), вызванной ВГВ, в значительной мере угнетена АГ-специфическая составляющая клеточного иммунитета (Vingerhoets, 1998, Boni, 2007). Однако ранние реакции клеточного иммунитета остаются малоизученными. Мы пытались обнаружить изменения АГ/МГ-стимулированных ранних реакций клеточного иммунитета и выявить возможное усиление АГ/МГ-стимулированной продукции цитокинов.

При исследовании реакции на HBsAg в группах ЦТП и ХЗП было показано, что уровень спонтанной продукции был низким для цитокинов TNF-а, IL-8, IL-ip, IL-6, a уровень HBsAg-стимулированной продукции цитокинов был на уровне контрольной группы (Рис. 7). Таким образом, в группах ЦТП и ХЗП инфекция не оказала существенного влияния на продукцию провоспалительных цитокинов, стимулированных HBsAg.

tpyn»»\ |ы*н| jutn} jxan) IL-в

fi i i f i fi ] EÏ3 ЕЭ ЕЭ

■

Lii

I S i î fi fi

X X X X

|Кднтр. групп» | [в И M j |цтп | jxanj

î Î î Î i S | i

онтр.груопТ] |ИИЧ| |ЦТП| [xinf

Рис.7. Продукция провоспалительных цитокинов в контрольной группе и при патологиях; Щ-при стимуляции HBsAg (5 мкг/мл); ИВ-при стимуляции ФГА (25 мкг/мл); СШЗ-спонтанная продукция; кругами выделены области сравнения; цифрами обозначены ИС.

Отсутствие усиления HBsAg-cтимyлиpoвaннoй продукции цитокинов может отражать отсутствие каких-либо признаков сенсибилизации организма у пациентов с патологией печени, вызванной ВГВ. Такие данные согласуются с данными литературы, в которых неоднократно были продемонстрированы низкие или отсутствие АГ-стимулированных реакций у пациентов с

хронической инфекцией ВГВ, в отличие от пациентов с острым гепатитом В, когда наличие специфического клеточного иммунитета четко выражено (Vingerhoets, 1998, Boni, 2007, Mogensen, 2001). Данные по продукции цитокинов согласуются с нашими данными по клеточной миграции, в которых наиболее выраженная сенсибилизация против HBsAg была продемонстрирована у пациентов больных и переболевших гепатитом В (см. Рис 3). В то же время при стимуляции ЛПК группы пациентов ЦТП неродственными гетерологичными антигенами ВИЧ (р41, р120, p24gag) было установлено усиление АГ-стимулированной реакции, выраженной через ИС, по сравнению с контрольной группой (Рис. 8).

Увеличение ИС было связано со снижением доли спонтанной продукции цитокинов. Этот неожиданный факт повышенной реактивности на антиген, непосредственно не связанный с гепатитом В, может быть связан с тем, что происходит усиление неспецифической реактивности на различные антигены наряду с включением механизмов негативной регуляции АГ-специфичного клеточного иммунитета (Рис. 8). Механизмы включения реакции на неродственные гетерологичные вирусные антигены при вирусной инфекции были обсуждены недавно в обзорах ( Brehm, Pinto, 2002).

i « ï С îs&c ï

л к я в * Ï; г в » | к о н т p. группа | |ВИЧ| |цтп |

* ! 11

il Si £

|в и ч |

' » I • |"т"|

M ! S * !|s * t f S

|Контр. групп« | [ВИЧ{ |ЦТП |

1.3 1,3

ïа t -» 11.

2.5J,J.T

IKOHTP.ГРУЛ

л7] |ВИЧ| |ИТП|

Рис.8. Продукция про воспалительных цитокинов в контрольной группе и при вирусных патологиях при стимуляции антигенами ВИЧ (в концентрации 1 мкг/мл) и ФГА (25 мкг/мл); кругами выделены области сравнения; цифрами обозначены ИС.

У пациентов с ХЗП нами не было обнаружено специфического усиления реакции на HBsAg, но были также выявлены АГ-стимулированные реакции на неродственные гетерологичные АГ ВИЧ.

Для сравнения важно было сопоставить реакции на эти же АГ (HBsAg и ВИЧ АГ) в группе пациентов с ХЗП и группе ВИЧ-инфицированных, у которых имеет место другой тип иммунодефицитного состояния. Если сравнивать группы с ХЗП и ВИЧ-инфицированных по уровню продукции провоспалительных цитокинов в УМК, то наибольших значений продукция достигала в группе ВИЧ-инфицированных, причем независимо от того, какие антигены были использованы при тестировании - HBsAg, антигены ВИЧ или же митоген ФГА. При этом резко повышалась спонтанная продукция цитокинов у ВИЧ-инфицированных пациентов (Рис. 7-8).

У ВИЧ-инфицированных лиц при стимуляции УМК антигенами ВИЧ gp41 и p24gag значения ИС для продукции провоспалительных цитокинов TNF-a, IL-lß, IL-8 практически не отличались от контрольной группы. Различия были обнаружены только при стимуляции антигеном р41 продукции IL-6, когда ИС снизился примерно в 4 раза (Рис. 8).

В отличие от стимуляции антигенами ВИЧ ЛПК ВИЧ-инфицированных лиц, ранняя продукция TNF-a, IL-8, IL-6, стимулированная HBsAg, практически отсутствовала. Общий рост продукции этих цитокинов на 53-97% был обусловлен увеличением не АГ-стимулированной составляющей, а за счет спонтанной продукции (Рис. 8).

АГ-стимулированную продукцию цитокинов IFN-y, IL-2 и IL-IRA не наблюдали в группах ВИЧ и ДТП при стимуляции антигенами ВИЧ, и в группах ЦТП, ХЗП и ВИЧ при стимуляции HBsAg. В то же время в этих группах было обнаружено существенное усиление стимуляции митогеном ФГА по сравнению с контрольной группой (Рис. 7-8).

Таким образом, у пациентов с ХЗП и ВИЧ-инфицированных пациентов реакция на гомологичные антигены ВГВ и ВИЧ, соответственно, были сравнимы с контрольными. В то же время, реакция на гетерологичные антигены вирусов, не имеющих отношение к данной патологии, либо давала усиление АГ - стимулированной реакции (при стимуляции антигенами ВИЧ в группе ЦТП) или ее снижение (при стимуляции HBsAg в группе ВИЧ-инфицированных). Неожиданным также оказалось усиление продукции иммунорегуляторных цитокинов Т-клетками, стимулированными Т-клеточным митогеном ФГА. Эти парадоксальные и неожиданные результаты, полученный нами с помощью экспресс-теста в УМК, указывают на комплексную реакцию иммунной системы на вирусную инфекцию, что согласуется с данными литературы (Chen, Fraire, 2001, Brehm, Pinto, 2002). Механизмы, параллельно приводящие к активации одних клеточных звеньев и угнетению активности других, требуют дальнейшего изучения и комплексного анализа.

9. Количественное сравнение изменений продукции цитокинов в разных группах обследованных

Было проведено количественное сравнение изменений продукции цитокинов в разных исследуемых группах, используя коэффициенты относительной стимуляции (КОС) (Таб. 1 ).

Сравнивали относительные изменения АГ-стимулированной продукции с учетом изменений спонтанной продукции. В Таб. 1. представлены суммарные данные по комплексному анализу изменения продукции цитокинов групп сравнения по отношению к контрольной группе. Основные результаты комплексного анализа следующие: 1/ доля HBsAg-стимулированной продукции снижается для всех исследуемых провоспалительных цитокинов после 1-й и 2-й (кроме IL-1P) доз вакцинации, а также у ранее привитых лиц и ВИЧ-инфицированных пациентов; 21 увеличение HBsAg-стимулированной составляющей продукции провоспалительных цитокинов было обнаружено после 3-й дозы вакцинации и в группе ЦТП при стимуляции антигенами ВИЧ; 3/ резкое, более чем на порядок, снижение величины КОС наблюдали для HBsAg-стимулированной продукции IL-6 у ранее привитых лиц и у ВИЧ-инфицированных, а также для IFN-y после 3-й дозы вакцинации и у ВИЧ-инфицированных; 4/ выраженное снижение доли HBsAg-стимулированной продукции цитокина IL-IRA наблюдали у ранее привитых против гепатита В и во всех группах с вирусными патологиями; 5/ не было выявлено значительных изменений АГ-стимулированной составляющей по сравнению с контрольной группой в группах ЦТП и ВИЧ против антигенов тех вирусов, носителями которых они являются.

Комплексный анализ показал, что для экспресс-тестов большое значение имеет уровень спонтанной продукции цитокинов, который оказывает большое влияние на АГ-стимулированную составляющую ранней клеточной реакции как при вакцинации, так и при вирусных инфекциях. Возможно, что в экспресс-тестах при малом времени инкубации in vitro клетки, только что выделенные из организма, могут сохранять активность, которую они имели in vivo, что отражается в уровне спонтанной продукции. Между спонтанной составляющей продукции цитокинов, выраженной в процентах, и КОС имеет место отрицательная корреляция (Р<0,001). То есть, чем больше спонтанная составляющая продукции цитокинов, тем меньше АГ-стимулированная составляющая продукции, и наоборот. Эта отрицательная зависимость может означать, что для совокупности спонтанной и АГ-стимулированной продукции цитокинов, прежде всего провоспалительных, по-видимому, имеются балансовые ограничения по уровню максимально достижимых значений.

Таблица 1. Сводная таблица для коэффициенты относительной стимуляции (КОС) при разных стадиях вакцинации и патологиях под действием разных концентраций НВзА§ и Н1УА§

цитокин НВвАв/МГ вакцинация патология ВИЧ АГ/МГ патология

12 3 провакц вакц вакц вакц г ХЗП ЦТП ВИЧ ЦТП ВИЧ

ТЫР-а 5мкг 1 1 Т 1 4 1 т ■ 1 I I Т 4 " 1 Т 1 <—> <—> 1 <-» | | 4 4 4 » 1 р41 т т I4 ч—>

1мкг р 120

ЮОнг p24gag

ФГА ФГА

И-6 5мкг 1 1 <-> 1 4 4 Т 4 1 | <—> 1 4 4 Т 44 4 ~ 44 4 ~ 44 | 4 «-» 44 р41 4 I > Т 4 ~ 4

1мкг р120

ЮОнг p24gag

ФГА ФГА

1Ь-8 5мкг 4 1 Т 4 11*-* 1 1 1 » 1 1 1 ^► 1 > ) - 4 4 » > 1 <—► ► 1 * р41 т т ^ т

1мкг р 120

ЮОнг p24gag

ФГА ФГА

1Ь-1р 5мкг 1 | 1 1 > Т 1 * 1 * 1 > 1 1 1 > 1 + ► 1 Т Т 4 - Т 4 ~ Т 4 р41 т т г 1 >

1мкг р 120

ЮОнг р24еаг

ФГА ФГА

5мкг н.д. || | ~ н-д. 44 4 4 н.д. II I I Н.д. | | | <—> <—> м ► <—» 1 1 * > II т т т р41 1 тт т

1мкг р120

ЮОнг p24gag

ФГА ФГА

1мкг р120

ЮОнг p24gag

ФГА ФГА

1Ы11А 5мкг н.д. ♦-> | | н.д. 1 Т 1 н.д. <-+<-> | Н.д. <-+ т | 4 44 4 | | | 4 4 4 р41 <—» <—> <—>■ <—>

1мкг р120

ЮОнг р24ёай

ФГА ФГА

<-»•— отличий от контрольной группы по КОС практически нет | - снижение КОС относительно контрольной группы более, чем на 20% ||- снижение КОС относительно контрольной группы более чем в 10 раз увеличение КОС относительно контрольной группы более, чем на 20%

Полученные нами данные о росте спонтанной продукции при вирусных инфекциях согласуются с данными литературы. Ранее усиление роста спонтанной продукции наблюдали у больных малярией, сальмонеллезом, туберкулезом, у пациентов с ВИЧ-инфекцией, железодефицитной анемией, дефицитом витамина А, у пациентов с микобакгериальными, сальмонеллезными инфекциями, а также у престарелых лиц (Jason, 1998,2001).

В то же время, спонтанную продукцию обычно не обнаруживают у здоровых индивидуумов (Jason, 2001) или у лиц с различными заболеваниями, такими как аллергическая астма, системная красная волчанка, в активной и неактивной форме, саркоидоз (CTMachony, 1998). У большинства пациентов обнаружен рост спонтанной продукции более, чем для одного вида цитокинов; выявлено влияние спонтанной продукции на АГ-стимулированную продукцию того же цитокина (Walker, 2002).

В целом, полученные нами данные показывают, что в разработанных клеточных микрокультурах — уплотненных и разреженных - можно обнаружить самые ранние ответы ЛПК от здоровых лиц на вирусные антигены - ВГВ или ВИЧ. Данные комплексного анализа показали важность оценки соотношения спонтанной и АГ-стимулированной составляющей для контроля состояния клеточной иммунной системы при вакцинации и вирусных инфекциях. Комплексный анализ ранних реакций клеточного иммунитета позволил более точно дифференцировать нормальные состояния от состояний, модифицированных вакцинацией или инфекцией, указать на возможные пути развития иммунопатологии, определить клеточные механизмы, которые могут послужить ориентирами для подбора наиболее адекватных схем вакцинации или проведения эффективной противовирусной терапии.

ВЫВОДЫ:

1. Разработаны экспресс-тесты для оценки ранних спонтанных и антиген-стимулированных реакций клеточного иммунитета двух типов: 1/ последовательное тестирование клеточной миграции по типу РТМЛ. и продукции цитокинов методом ИФА в одних и тех же уплотненных микрокультурах лейкоцитов периферической крови человека; 2/ определение продукции цитокинов в разреженных микрокультурах лейкоцитов с концентрацией клеток в 5-10 раз меньше, по сравнению со стандартно используемой.

2. С помощью экспресс-тестов в уплотненных и разреженных микрокультурах лейкоцитов здоровых доноров обнаружены реакции врожденного клеточного иммунитета в виде HBsAg-стимулированной продукции провоспалительных цитокинов на 1-18 часу культивирования. К 18-му часу в разреженных микрокультурах уровень реакции на HBsAg возрастает в сотни раз относительно 1-го часа, тогда как в уплотненных микрокультурах он остается без изменений вследствие роста спонтанной продукции цитокинов.

3. С помощью РТМЛ, тестированной в уплотненных микрокультурах, установлено развитие специфического клеточного иммунитета на HBsAg в виде подавления миграции лейкоцитов после 2-й и 3-й доз вакцинации, а также у больных и переболевших гепатитом В, и ослабление клеточного иммунитета, проявляющееся в виде реакции стимуляции миграции лейкоцитов у ВИЧ-инфицированных пациентов на антигены ВИЧ: gpl20 (12 стадии инфекции) и на p24gag (3-4 стадии инфекции).

4. При вакцинации против гепатита В в уплотненных микрокультурах усиление HBsAg-стимулированной продукции цитокинов IL-6, IL-8, IL-lp, TNF-a и IFN-y, индуцированное вакциной, выявлено только после 3-й дозы вакцинации; после 1-й и 2-й доз вакцинаций, как и у ранее привитых лиц, отмечено снижение HBsAg-стимулированной и рост спонтанной продукции этих же цитокинов по сравнению с контрольной группой.

5. Тестирование двух групп ранее привитых лиц (не менее 2-х лет после вакцинации), различающихся по уровню анти-HBs антител, в разреженных микрокультурах, показало, что у отвечающих (>10 МЕ/мл) лиц продукция IL-lp, TNF-a, IL-6 и IL-10 выше, чем у неотвечающих (<10 МЕ/мл) лиц.

6. У пациентов с гепатитом В и ВИЧ-инфекцией оценка ранних АГ-стимулированных реакций в уплотненных микрокультурах выявила изменения по сравнению с контрольной группой, важные для иммунопатогенеза этих инфекций: 1/ усиление АГ-стимулированной продукции провоспалительных цитокинов IL-6, IL-8, IL-ip у носителей HBsAg при реакции на антигены ВГВ и у пациентов с тяжелой формой гепатита В при реакции на неродственные гетерологичные антигены ВИЧ; 1! снижение АГ-стимулированной продукции провоспалительных цитокинов IL-6, IL-8, IL-lp, TNF-a у ВИЧ-инфицированных пациентов при реакции на неродственный гетерологичный антиген ВГВ (HBsAg) и продукции IL-1RA при реакции на HBsAg во всех исследованных группах с вирусной патологией.

Список работ опубликованных но теме диссертации:

1. Гейне М.Д., Кохановская H.A., Кожушный А.П., Симонова И.А., Ольшанский А.Я., Баженов А.И., Годков М.А., Коноплева М.В., Третьяков О.Ю., Семенова E.H., Нагурская Е.В., Нестеренко В.Г., Суслов А.П. Стимуляция миграции лейкоцитов в присутствии p24(gag) как маркер состояния специфического клеточного иммунитета при ВИЧ-инфекции // Российский иммунологический журнал. Тезисы «Объединенного иммунологического Форума - 2008». - Санкт-Петербург. - 30 июня-5 июля 2008г. - Т.2 (11), №2-3. - С.268.

2. Кожушный А.П., Баженов А.И., Зинкин В.Ю., Годков М.А., Зубкин M.JL, Коноплева М.В., Кохановская H.A., Третьяков О.Ю., Эльгорт Д.А., Фельдшерова A.A., Будницкая П.З., Хац Ю.С., Никитина Н.И., Вовк В.А., Семененко Т.А., Суслов А.П. Оценка напряженности клеточного иммунитета против HBsAg вируса гепатита В in vitro по уровню клеточной миграции и продукции цитокинов в микрокультурах мигрирующих лейкоцитов человека // Российский иммунологический журнал. Тезисы «Объединенного иммунологического Форума - 2008». - Санкт-Петербург. -30 июня-5 июля 2008г. - Т.2 (11), №2-3. - С.250.

3. Кожушный А.П., Кохановская H.A., Третьяков О.Ю, Коноплева М.В., Баженов А.И., Годков М.А., Семененко ТА., Зубкин М.Л., Суслов А.Ш/ Антиген-зависимые реакции в мигрирующих микрокулыурах лейкоцитов человека in vitro как маркеры активности клеточного иммунитета. Вестник уральской медицинской академической науки, №2/1, 2009., стр 36-37.

4. Кожушный А.П., Кохановская H.A., Третьяков О.Ю., Коноплева М.В., Суслов А.П.// Динамика развития ранних клеточных иммунных реакций на инфекционные антигены в культуре мигрирующих лейкоцитов in vitro. Вестник уральской медицинской академической науки, №2/1, 2009г., стр 38-40.

5. Суслов А.П., Коноплева М.В., Третьяков О.Ю., Кожушный АЛ. Роль фактора подавления миграции макрофагов (MIF) в формировании системного воспалительного ответа и развития сепсиса. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008. - №5. - С.15-23.

6. Заявка на патент № 2008138410/049480/ «Способ определения функциональной активности клеточной микрокультуры» от 29.09.2008 в Федеральный институт промышленной собственности.

Подписано в печать 19 апреля 2010 г.

Формат 60x90/16

Объём 1,5 п.л.

Тираж 100 экз.

Заказ № 190410296

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт» ИНН/КПП 7728572912X772801001

Адрес: 119333, г. Москва, Университетский проспект, д. 6, кор. 3.

Тел. 740-76-47, 989-15-83.

http://www.шiverprinLru

Оглавление диссертации Кожушный, Андрей Петрович :: 2010 :: Москва

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1 Клеточный иммунитет: виды и значение при вирусных инфекциях.

1.1 Врожденный и адаптивный клеточный иммунитет.

1.2 Общая характеристика иммунных ответов на антигены ВГВ.

1.3 Роль активации клеток и нарушения баланса цитокинов в патогенезе ВИЧ-инфекции.

2 Клеточный иммунитет: методы исследования.

2.1 Общая характеристика методов исследования клеточного иммунитета.

2.2 Автоматизация методов ПММ/РТМЛ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3 Материалы.

3.1 Контингент обследуемых лиц.

3.2 Антигены.

3.3 Используемые тест-системы.

3.4 Дополнительные реагенты.

4 Методы исследования.

4.1 Функциональные клеточные тесты для определения продукции цитокинов и экспрессии маркеров активации клеток in vitro.

4.2 База данных и статистические методы.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

5 Разработка экспресс-тестов in vitro для выявления ранних реакций клеточного иммунитета.

5.1 Алгоритм и методика тестирования реакций в уплотненных микрокультурах (УМК) и разреженных микрокультурах (РМК) лейкоцитов периферической крови человека (ЛПКЧ).

5.2 Кинетика развития антиген/митоген-сттимулированной и спонтанной продукции цитокинов в уплотненных и разреженных микрокультурах клеток

5.3 Антиген-/митоген-стимулированная продукция цитокинов на разные виды антигенов после 18 часовой инкубации (в контрольной группе).

6 Исследование клеточной миграции в уплотненных микрокультурах клеток (УМК) в разных группах.

6.1 Подбор концентраций и кинетика развития реакции клеточной миграции на разные антигены.

6.2 Оценка специфического клеточного иммунитета при вакцинации против гепатита В.

6.3 Ранние реакции клеточного иммунитета у носителей HBsAg.

6.4 Параметры клеточной миграции в группах риска и у больных вирусными инфекциями (ВГВ и ВИЧ).

7 Мониторинг параметров клеточного иммунитета у лиц, вакцинированных против гепатита В и при вирусных патологиях (ВГВ и ВИЧ).

7.1 Мониторинг ранней HBsAg-стимулированной продукции цитокинов при вакцинации против гепатита В.

7.2 Мониторинг параметров клеточного иммунитета у лиц с патологиями печени и ВИЧ-инфицированных лиц.

7.3 Результаты исследований клеточного иммунитета в группах риска и у больных вирусными инфекциями (ВГВ и ВИЧ).

ОБСУЖДЕНИЕ.

8 Методология уплотненных и разреженных микрокультур клеток (УМК и РМК).

9 Параметры врожденного иммунитета при ВГВ инфицировании определяемые в УМК и РМК.

10 Исследование реакций клеточного иммунитета при вакцинации против ВГВ.

11 Исследование реакций клеточного иммунитета при вирусных гепатитах и ВИЧ-инфекции.

Введение диссертации по теме "Клиническая иммунология, аллергология", Кожушный, Андрей Петрович, автореферат

Актуальность проблемы

В последние годы в России и за рубежом наблюдается рост заболеваемости многими инфекционными заболеваниями (вирусные гепатиты, ВИЧ, туберкулез и др.)* Полноценный контроль за течением инфекционного заболевания, мониторинг эффективности проводимой терапии (2, 33, 73, 74), оценка напряженности специфического клеточного иммунитета, индуцированного вакцинами, невозможны без надежных и доступных для клинической лаборатории тестов, позволяющих оценить функциональное состояние иммунной системы человека. Функциональные клеточные тесты важны для диагностики вирусных и бактериальных инфекций (117, 96, 97). Эти тесты широко применяются и для изучения активности врожденного клеточного иммунитета, механизмов его инструктивного (поляризующего) влияния на развитие адаптивного иммунитета (104, 115).

В настоящее время активно разрабатываются функциональные тесты для оценки состояния клеточного иммунитета in vitro, позволяющие определять уровень клеточных реакций на антигены или лиганды разной природы. Разработаны такие перспективные современные тесты для оценки функциональной активности клеток иммунной системы как ELISPOT, проточная цитофлуориметрия и ИФА для определения цитокинов (61, 64, 81). Однако внедрению этих и других клеточных тестов в широкую клиническую и научно-исследовательскую практику препятствуют их недостатки: трудоемкость, низкая воспроизводимость, сложность применения в условиях клинической лаборатории, высокая стоимость анализа (76, 77).

Недостаточно разработанной остается методология исследования этих реакций в культуральных тестах in vitro с учетом влияния спонтанной продукции цитокинов на антиген-стимулированные реакции и на функциональное состояние клеточного иммунитета в целом (76, 77, 143).

Цель работы

Задачи исследования:

1. Разработать экспресс—тесты in vitro на основе уплотненных (УМК) и разреженных (РМК) микрокультур лейкоцитов периферической крови человека, позволяющие: 1/ в одних и тех же уплотненных микрокультурах последовательно тестировать клеточную миграцию по типу PTMJ1 и определять продукцию цитокинов; 2/ в разреженных микрокультурах, с тем же количеством клеток как и в УМК, определять продукцию цитокинов.

3. Тестируя в уплотненных микрокультурах PTMJI на поверхностный антиген ВГВ (HBsAg), изучить изменения клеточной миграции (стимуляция 7 или подавление миграции) в разные сроки после вакцинации против гепатита В, при хронических заболеваниях печени и на разных стадиях ВИЧ-инфекции в сравнении со здоровыми донорами.

4. Сравнить в уплотненных микрокультурах уровни спонтанной и HBsAg-стимулированной продукции цитокинов (IL-ip, IL-6, IL-8, TNF-a, IFN-y, IL-2, IL-1RA) в разные сроки вакцинации против гепатита В, а также в разреженных микрокультурах у лиц отвечающих и не отвечающих на вакцинацию против гепатита В, используя разработанные экспресс-тесты.

5. Провести в уплотненных микрокультурах оценку ранних АГ— стимулированных реакций лейкоцитов периферической крови на антигены ВГВ и ВИЧ, определяемых по продукции цитокинов (IL-ip, IL-6, IL-8, TNF-a, IL-1RA), у больных гепатитом В и ВИЧ-инфицированных пациентов.

Научная новизна работы

Разработана и исследована на клинических моделях система клеточных экспресс—тестов, позволяющая количественно определять как раннюю АГ/МГ -стимулированную, так и спонтанную активность лейкоцитов периферической крови человека по параметрам клеточной миграции и продукции цитокинов (IL-ip, IL-6, TNF-a) в стандартных клеточных микрокультурах in vitro.

Впервые дана оценка ранних АГ-стимулированных реакций на HBsAg при вакцинации против гепатита В и обнаружено индуцированное вакциной усиление HBsAg-стимулированной продукции цитокинов IL-6, IL-8, IL-ip, TNF-a и IFN-y, после 3-й дозы вакцинации и снижение HBsAg— стимулированной и рост спонтанной продукции этих же цитокинов по сравнению с контрольной группой после 1-й и 2-й доз вакцинации, а также у ранее привитых против ВГВ.

Впервые у пациентов с гепатитом В и ВИЧ-инфекцией при оценке ранних АГ-стимулированных реакций выявлены изменения, важные для иммунопатогенеза этих инфекций, выражающиеся в усилении или снижении продукции цитокинов IL-6, IL-8, IL-ip, TNF-a и IL-1RA в ответ на гомологичные и гетерологичные антигены ВГВ и ВИЧ.

Научно-практическая значимость

Внедрение полученных результатов в практику

2. Методические рекомендации «Способ комплексного контроля функциональной активности клеточного иммунитета при вакцинации против гепатита В», методические рекомендации «Использование алгоритма прогнозирования недостаточности иммунного ответа у лиц, вакцинированных против гепатита В, на основе комплексной функциональной оценки реакции клеточного иммунитета», методические рекомендации «Способ оценки напряженности клеточного иммунитета в автоматизированном PTMJI при ВИЧ-инфекции, осложненной коинфекцией вирусным гепатитом В», утвержденные советом по внедрению научных достижений в практику НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, протокол № 10 от 27.11.09 3. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций для слушателей на кафедре инфектологии медико-профилактического факультета последипломного профессионального образования ММА им. И.М. Сеченова.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертационного исследования на тему "Разработка экспресс-тестов для оценки ранних реакций клеточного иммунитета"

ВЫВОДЫ:

1. Разработаны экспресс-тесты для оценки ранних спонтанных и антиген-стимулированных реакций клеточного иммунитета двух типов: 1/ последовательное тестирование клеточной миграции по типу PTMJI и продукции цитокинов методом ИФА в одних и тех же уплотненных микрокультурах лейкоцитов периферической крови человека; 2/ определение продукции цитокинов в разреженных микрокультурах лейкоцитов с концентрацией клеток в 5-10 раз меньше, по сравнению со стандартно используемой.

2. С помощью экспресс—тестов в уплотненных и разреженных микрокультурах лейкоцитов здоровых доноров обнаружены реакции врожденного клеточного иммунитета в виде HBsAg-стимулированной продукции провоспалительных цитокинов на 1-18 часу культивирования. К 18-му часу в разреженных микрокультурах уровень реакции на HBsAg возрастает в сотни раз относительно 1-го часа, тогда как в уплотненных микрокультурах он остается без изменений вследствие роста спонтанной продукции цитокинов.

3. С помощью PTMJI, тестированной в уплотненных микрокультурах, установлено развитие специфического клеточного иммунитета на HBsAg в виде подавления миграции лейкоцитов после 2-й и 3-й доз вакцинации, а также у больных и переболевших гепатитом В, и ослабление клеточного иммунитета, проявляющееся в виде реакции стимуляции миграции лейкоцитов у ВИЧ-инфицированных пациентов на антигены ВИЧ: gpl20 (1-2 стадии инфекции) и на p24gag (3-4 стадии инфекции).

4. При вакцинации против гепатита В в уплотненных микрокультурах усиление HBsAg-стимулированной продукции цитокинов IL-6, IL-8, IL-1(3, TNF-a и IFN-y, индуцированное вакциной, выявлено только после 3-й дозы вакцинации; после 1-й и 2-й доз вакцинаций, как и у ранее привитых лиц, отмечено снижение HBsAg-стимулированной и рост спонтанной продукции этих же цитокинов по сравнению с контрольной группой.

135

5. Тестирование двух групп ранее привитых лиц (не менее 2-х лет после вакцинации), различающихся по уровню анти-HBs антител, в разреженных микрокультурах, показало, что у отвечающих (>10 МЕ/мл) лиц продукция IL-ip, TNF-a, IL-6 и IL-10 выше, чем у неотвечающих (<10 МЕ/мл) лиц.

6. У пациентов с гепатитом В и ВИЧ-инфекцией оценка ранних АГ— стимулированных реакций в уплотненных микрокультурах выявила изменения по сравнению с контрольной группой, важные для иммунопатогенеза этих инфекций: 1/ усиление АГ-стимулированной продукции провоспалительных цитокинов IL-6, IL-8, IL-ip у носителей HBsAg при реакции на антигены ВГВ и у пациентов с тяжелой формой гепатита В при реакции на неродственные гетерологичные антигены ВИЧ; 2/ снижение АГ—стимулированной продукции провоспалительных цитокинов IL-6, IL-8, IL-ip, TNF-a у ВИЧ-инфицированных пациентов при реакции на неродственный гетерологичный антиген ВГВ (HBsAg) и продукции IL-1RA при реакции на HBsAg во всех исследованных группах с вирусной патологией.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В целом, полученные нами данные показывают, что в разработанных нами клеточных микрокультурах — уплотненных и разреженных - можно обнаружить самые ранние ответы ЛПКЧ от здоровых невакцинированных индивидуумов на присутствие вирусных антигенов — ВГВ или ВИЧ. Эти ответы выражаются преимущественно в изменениях клеточной миграции и продукции провоспалительных цитокинов. Использование таких клеточных микрокультур для исследования антиген-стимулированных реакций врожденного иммунитета весьма эффективно, так как индексы стимуляции (ИС) были весьма значительны и достигали увеличения ответа в несколько сотен раз, а результаты высоко достоверны. Использование уплотненных микрокультур позволило отследить параллельно у одних и тех же людей и изменения клеточной миграции в присутствии антигенов вирусов и продукцию цитокинов разного типа. В этих же микрокультурах можно было количественно определить спонтанную продукцию цитокинов и изменения уровня нормальной антиген-стимулированной продукции провоспалительных, иммунорегуляторных и противовоспалительных цитокинов в динамике при вакцинации против гепатита В, а также при патологиях, связанных с инфекциями ВГВ и ВИЧ.

Было проведено количественное сравнение изменений продукции цитокинов в разных исследуемых группах, используя коэффициенты относительной стимуляции (КОС) (Таб. 5).

Были продемонстрированы эффекты вакцинации против гепатита В на состояние врожденного и адоптивного клеточного иммунитета, которые заключались в параллельном развитии позитивной реакции РТМЛ, усиленной продукции провоспалительных цитокинов и появлении продукции IFN-y после третьей вакцинации, а также в существенном снижении уровня антиген-стимулированной реакции продукции цитокинов после первой и второй вакцинации, а также в поствакцинальный период, в основном за счет роста спонтанной продукции этих цитокинов.

132

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Кожушный, Андрей Петрович

1. Галактионов В.Г., Иммунология: Учеб. для студ. вузов. 3-е изд., испр. и доп. - М.: издательский центр «Академия». - 2009. - 528 с.

2. Ершов Ф.И., Интерфероны и их индукторы (от молекул до лекарств). — М.: ГЭОТАР Медиа, 2005. - 368 с.

3. Левицкая А.В., Макось Р.П., Василик Л.В. Реакция торможения миграции лимфоцитов при вирусных гепатитах // Врачебн. дело 1982. - Т.1. -С.114-116

4. Суслов А.П., Головин В.П., Скворцов В.Т., Коронцвит Т.А. Скрининговый тест клеточной миграции из микрокультур in vitro.// Иммунология. . -1989. -№ 1.-С. 73-76

5. Ю.Титов М.Б., Герсун Б. А., Шевченко Л.Ю. Замедленная гиперчувствительность к поверхностному антигену вируса гепатита В. // ЖМЭИ. 1982. - Т. 7. - С.82-85.

6. П.Чередниченко Т.В., Тамарова Л.Д. Клиническое значение реакции торможения миграции лейкоцитов к HBsAg при вирусном гепатите В у детей. // Вопрос.охр. матер. Детства. 1980. - Т. 25. - С. 8-12

7. Alfano М., Poli G. Cytokine and chemokine based control of HIV infection and replication. // Curr Pharm Des. 2001 Jul. - Vol. 7 (11). - P. 993-1013.

8. Altman J.D., Moss P.A., Goulder P.J., Barouch D.H., McHeyzer-Williams M.G., Bell J.I., McMichael A.J., Davis M.M. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. // Science. 1996 Oct 4. - V. 274 (5284). - P. 94-6.

9. Ando K., Guidotti L.G., Wirth S. Class I restricted cytotoxic T lymphocytes are directly cytopathic for their target cells in vivo. // J. Immunol. -1994. V. 152. -P. 3245-3253.

10. Barcellini W., Rizzardi G.P., Borghi M.O., Fain C., Lazzarin A., Meroni P.L. TH1 and TH2 cytokine production by peripheral blood mononuclear cells from HIV-infected patients. // AIDS. 1994 Jun. - V. 8(6). - P.757-62.

11. Baron J.L., Gardiner L., Nishimura S., Shinkai K., Locksley R., Ganem D. Activation of a nonclassical NKT cell subset in a transgenic mouse model of hepatitis В virus infection.// Immunity. 2002. - V. 16. - P.583-594.

12. Becker Y. HIV-1 induced AIDS is an allergy and the allergen is the Shed gpl20~a review, hypothesis, and implications. // Virus Genes. 2004 Apr. -28(3).-319-31.

13. Belardelli F. Role of interferons and other cytokines in the regulation of the immune response. // APMIS. 1995 Mar. - Vol. 103 (3). - P. 161-79.

14. Benhamou Y., Poynard T. Treatment of chronic hepatitis В virus infection in patients co-infected with human immunodeficiency virus. // J Hepatol. 2003. -Vol. 39 Suppl l.-P. SI 94-9.

15. Bertoletti A., Maini MK. Protection or damage: a dual role for the virus-specific cytotoxic T lymphocyte response in hepatitis В and С infection? // Curr Opin Microbiol. 2000 Aug. - Vol. 3 (4). - P. 387-92.

16. Bertoletti A., Gehring AJ. The immune response during hepatitis В virus infection. // J Gen Virol. 2006 Jun. - Vol. 87 (Pt 6). - P. 1439-49.

17. Blander J.M., Medzhitov R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. // Nature 2006 Apr. Vol. 6. № 440 (7085). P. 808-12.

18. Bloemena E., Roos M.T., Van Heijst J.L., Vossen J.M., Schellekens P.T. Whole-blood lymphocyte cultures. // J Immunol Methods. 1989 Sep 1. - Vol. 122 (2).-P. 161-7.

19. Boehm U., Klamp Т., Groot M., Howard J.C. Cellular responses to interferon-gamma. // Annu Rev Immunol. 1997. - Vol. 15. - P. 749-95.

20. Brehm M.A., Pinto A.K. T cell immunodominance and maintenance of memory regulated by unexpectedly cross-reactive pathogens. // Nat Immunol. 2002 Jul.-Vol. 3(7).-P. 627-34.

21. Brenchley J.M., Ruff L.E., Casazza J.P., Koup R.A., Price D.A., Douek D.C. Preferential infection shortens the life span of human immunodeficiency virus-specific CD4+ T cells in vivo. // J Virol. 2006 Jul. - Vol. 80 (14). - P. 6801-9.

22. Calabrese L.H., Zein N., Vassilopoulos D. Safety of antitumour necrosis factor (anti-TNF) therapy in patients with chronic viral infections: hepatitis C, hepatitis B, and HIV infection. // Ann Rheum Dis. 2004 Nov. - Vol. 63 Suppl 2.-P. 18-24.

23. Chedid M.G., Deulofeut H., Yunis D.E., Lara-Marquez M.L., Salazar M., Deulofeut R., Awdeh Z., Alper C.A., Yunis E.J. Defect in Thl-like cells of nonresponders to hepatitis В vaccine. // Hum Immunol. 1997 Nov. — Vol. 58 (l).-P. 42-51.

24. Chen Y., Wei H., Gao В., Hu Z., Zheng S., Tian Z. Activation and function of hepatic NK cells in hepatitis В infection: an under investigated innate immune response.// J. Viral. Hepat. 2005. - V.12. - P.38-45.

25. Chisari F.V., Ferrari C. Hepatitis В virus immunopathogenesis. // Annu. Rev. Immunol. 1995. - V. 13. - P. 29-60.

26. Clausen J.E. Migration inhibition of human leukocytes mixed with phytohemagglutinin-preincubated mononuclear leukocytes. // Acta Allergol. -1975 Nov. Vol. 30(5). - P. 239-49.

27. Clerici M., Sison A.V., Berzofsky J.A., Rakusan T.A., Brandt C.D., Ellaurie M., Villa M., Colie C., Venzon D.J., Sever J.L. Cellular immune factors associated with mother-to-infant transmission of HIV. // AIDS. 1993 Nov. -Vol. 7 (11).-P. 1427-33.

28. Cooper A., Tal G., Lider O., Shaul Y. Cytokine induction by the hepatitis В virus capsid in macrophages is facilitated by membrane heparan sulfate and involves TLR2. // J Immunol. 2005 Sep 1. - Vol. 175(5). - P. 3165-76.

29. Czerkinsky C.C., Nilsson L.A., Nygren H., Ouchterlony O., Tarkowski A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. // J Immunol Methods. 1983 Dec 16. - Vol. 65 (1-2).-P. 109-21.

30. Douek D.C. Disrupting T-cell homeostasis: how HIV-l infection causes disease. // AIDS Rev. 2003 Jul-Sep. -V. 5 (3). -P. 172-7.

31. Geneva-Popova M., Murdjeva M. Study on proinflammatory cytokines (IL-1 beta, IL-6, TNF-alpha) and IL-2 in patients with acute hepatitis B. // Folia Med (Plovdiv). 1999.-Vol. 41(1).-P. 78-81.

32. Gewirtz A.T. Intestinal epithelial toll-like receptors: to protect. And serve? // Curr Pharm Des. -2003- Vol. 9(1). P. 1-5.

33. Ghanekar S.A., Stranford S.A., Ong J.C., Walker J.M., Maino V.C., Levy J.A. Decreased HIV-specific CD4 T cell proliferation in long-term HIV-infected individuals on antiretroviral therapy. // AIDS. 2001 Sep 28. - Vol. 15 (14). -P. 1885-7.

34. Graziosi C., Pantaleo G., Gantt K.R., Fortin J.P., Demarest J.F., Cohen O.J., Sekaly R.P., Fauci A.S. Lack of evidence for the dichotomy of TH1 and TH2 predominance in HIV-infected individuals. // Science. 1994 Jul 8. — Vol. 265 (5169).-P. 248-52.

35. Griffin D.E. Immune responses to RNA-virus infections of the CNS. // Nat Rev Immunol 2003. - Vol. 3(6). - P. 493-502.

36. Guidotti L.G., Chisari F.V. To kill or to cure: options in host defense against viral infection. // Curr Opin Immunol. 1996 Aug. Vol. 8(4). - P. 478-83.

37. Guidotti L.G., Ishikawa Т., Hobbs M.V., Matzke В., Schreiber R., Chisari F.V. Intracellular inactivation of the hepatitis В virus by cytotoxic T lymphocytes.// Immunity. 1996. - V.4. - P.25-36.

38. Guidotti L.G., Chisari F.V. Noncytolytic control of viral infections by the innate and adaptive immune response. // Annu Rev Immunol. 2001. - Vol. 19. -P. 65-91.

39. Guidotti L.G., Chisari F.V. Immunobiology and pathogenesis of viral hepatitis. // Annu Rev Pathol. 2006. - Vol. 1. - P. 23-61.

40. Harari A., Vallelian F., Pantaleo G. Phenotypic heterogeneity of antigen-specific CD4 T cells under different conditions of antigen persistence and antigen load. // Eur J Immunol. 2004 Dec. - Vol. 34 (12). - P. 3525-33.

41. Heimark R.L., Twardzik D.R., Schwartz S.M. Inhibition of endothelial regeneration by type-beta transforming growth factor from platelets. // Science. 1986 Sep 5. - Vol. 233 (4768). - P. 1078-80.

42. Heine H., Lien E. Toll-like receptors and their function in innate and adaptive immunity. // Int Arch Allergy Immunol 2003. - Vol. 130(3). - P. 180-92.

43. Hernandez-Fuentes M.P., Warrens A.N., Lechler R.I. Immunologic monitoring. // Immunol Rev 2003. Dec. - Vol. 196. - P. 247-64.

44. Heydtmann M. Macrophages in hepatitis В and hepatitis С virus infections. // J Virol. 2009 Apr. - Vol. 83 (7). - P. 2796-802.

45. Holm G.H., Gabuzda D. Distinct mechanisms of CD4+ and CD8+ T-cell activation and bystander apoptosis induced by human immunodeficiency virus type 1 virions. // J Virol. 2005 May. - Vol. 79(10). - P. 6299-311.

46. Honorati M.C., Dolzani P., Mariani E., Piacentini A., Lisignoli G., Ferrari C., Facchini A. Epitope specificity of Th0/Th2 CD4+ T-lymphocyte clones induced by vaccination with rHBsAg vaccine. // Gastroenterology. 1997 Jun. - Vol. 112 (6).-P. 2017-27.

47. Huang C.-F., Lin S.-S., Ho Y-C., Chen F.-L., Yang C.-C. The immune response induced by Hepatitis В Virus principal antigens. Cell.molec. Immunol. 2006. -V. 3.-N.2.-P. 97-106.

48. Isogawa M., Robek M.D., Furuichi Y., Chisari F.V. Toll-like receptor signaling inhibits hepatitis В virus replication in vivo. // J Virol. 2005 Jun. — Vol. 79(11).-P. 7269-72.

49. Janetzki S., Cox J.H., Oden N., Ferrari G. Standardization and validation issues of the ELISPOT assay. // Methods Mol Biol. 2005. - Vol. 302. - P. 51-86.

50. Janeway C.A. Jr. Approaching the asymptote? Evolution and revolution in immunology. // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1989. - Vol. 54. Pt. 1. -P. 1:1-13.

51. Jason J., Archibald L.K., Nwanyanwu O.C., Bell M. The effects of iron deficiency on lymphocyte cytokine production and activation: preservation of hepatic iron but not at all cost. // Clin Exp Immunol. 2001 Dec. - Vol. 126 (3).-P. 466-73.

52. Jason J., Archibald L.K., Nwanyanwu O.C. Comparison of serum and cell-specific cytokines in humans. // Clin Diagn Lab Immunol. 2001 Nov. - Vol. 8 (6).-P. 1097-103.

53. Kaisho Т., Akira S. Regulation of dendritic cell function through Toll-like receptors. // Curr Mol Med 2003. - Vol. 3(4). - P.373-85.

54. Kakimi K., Guidotti L.G., Koezuka Y., Chisari F.V. Natural killer T cell activation inhibits hepatitis В virus replication in vivo. //J. Exp. Med. 2000. -V.192. - P.921-930.

55. Keilholz U., Martus P., Scheibenbogen C. Immune monitoring of T-cell responses in cancer vaccine development. // Clin Cancer Res. — 2006 Apr 1. — Vol. 12 (7 Pt 2). P. 2346s-2352s.

56. Kedzierska K., Crowe S.M. Cytokines and HIV-1: interactions and clinical implications. // Antivir Chem Chemother. 2001 May. - Vol. 12 (3). - P. 13350.

57. Lee W. M. , Reed W.D., Mitchell C.G.et al, Cellular and humoral immunity to hepatitis-B surface antigen in active chronic hepatitis.// Br Med J. 1975. -V.29 -P.705-708

58. Lee WM. Hepatitis В virus infection // N. Engl. J. Med. 1997. - Vol. 337 - P. 1733-1745.

59. Li J.R., Gong R.Y., Tian K.L., Wang J., Wang Y.X., Huang H.J. Study on the blood-borne virus co-infection and T lymphocyte subset among intravenous drug users. // World J Gastroenterol. 2007 Apr 28. - Vol. 13(16). - P. 235762.

60. Lieberman J., Shankar P, Manjunath N., Andersson J. Dressed to kill? A review of why antiviral CD8 T lymphocytes fail to prevent progressive immunodeficiency in HIV-1 infection. // Blood. 2001 Sep 15. - Vol. 98 (6). -P. 1667-77.

61. Maciaszek J.W., Parada N.A., Cruikshank W.W., Center D.M., Kornfeld H., Viglianti G.A. IL-16 represses HIV-1 promoter activity. // J Immunol. 1997 Janl.-V. 158(1).-P. 5-8.

62. Maecker H.T., Maino V.C., Picker L.J. Immunofluorescence analysis of T-cell responses in health and disease. // J Clin Immunol. 2000 Nov. - V. 20 (6). -P. 391-9.

63. Maini M.K., Bertoletti A. How can the cellular immune response control hepatitis В virus replication? // J Viral Hepat. 2000 Sep. - V. 7(5). - P. 321-6.

64. Marchetti G., Tincati C., Monforte A., Gori A. The challenge of IL-2 immunotherapy in HIV disease: "no through road" or turning point? // Curr HIV Res. 2008 May. - V. 6(3). - P. 189-99.

65. Marshall J.D., Chehimi J., Gri G., Kostman J.R., Montaner L.J., Trinchieri G. The interleukin-12-mediated pathway of immune events is dysfunctional in human immunodeficiency virus-infected individuals. // Blood. 1999 Aug 1. -V. 94(3).-P.l003-11.

66. Martin C.M., Welge J.A., Shire N.J., Shata M.T., Sherman K.E., Blackard J.T. Cytokine expression during chronic versus occult hepatitis В virus148infection in HIV co-infected individuals. // Cytokine. 2009 Sep. - V. 47(3). -P.194-8.

67. Matthews S.J. Entecavir for the treatment of chronic hepatitis В virus infection. // Clin Ther. 2006 Feb. - V. 28 (2). - P. 184-203.

68. McClary H., Koch R., Chisari F.V., Guidotti L.G. Relative sensitivity of hepatitis В virus and other hepatotropic viruses to the antiviral effects of cytokines. // J Virol. 2000 Mar. - V. 74(5). - P. 2255-64.

69. Medzhitov R. Approaching the asymptote: 20 years later. // Immunity. -2009 Jun 19. V. 30 (6). - P. 766-75.

70. Milich DR, Schodel F, Hughes JL, Jones JE, Peterson DL. The hepatitis В virus core and e antigens elicit different Th cell subsets: antigen structure can affect Th cell phenotype.// J. Virol. 1997. - V.7. - P.2192-2201.

71. Milich D.R., Chen M.K., Hughes J.L., Jones J.E. The secreted hepatitis В precore antigen can modulate the immune response to the nucleocapsid: a mechanism for persistence. // J Immunol. 1998 Feb 15. - V. 160(4). - 201321.

72. Mogensen Т.Н., Paludan S.R. Virus-cell interactions: impact on cytokine production, immune evasion and tumor growth. // Eur Cytokine Netw. 2001 Jul-Sep. - Vol. 12(3). - P. 382-90.

73. Nicole A., Spertini O., Lavanchy D., Frei P.C. Immune response to purified non-A, non-B hepatitis-related antigen demonstrated by leukocyte migration inhibition in patients recovering from the infection.// Infection. — 1986. -V.14 -P.13-16

74. Niederau C., Heintges Т., Haussinger D. Treatment of chronic hepatitis С with a-interferon: an analysis of the literature. // Hepatogastroenterology. — 1996 Nov-Dec. Vol. 43 (12). - P. 1544-56.

75. Nomura L.E., Walker J.M., Maecker H.T. Optimization of whole blood antigen-specific cytokine assays for CD4(+) T cells. // Cytometry. 2000 May 1. - Vol. 40(1).-P. 60-8.

76. Palm N.W., Medzhitov R. Pattern recognition receptors and control of adaptive immunity. // Immunol Rev 2009 Jan. Vol. 227(1). - P. 221-33.

77. Peters M.G., Hann Hw. H., Martin P., Heathcote E.J., Buggisch P. Adefovir dipivoxil alone or in combination with lamivudine in patients with lamivudine-resistant chronic hepatitis B. // Gastroenterology. 2004 Jan. - Vol. 126 (1). -P. 91-101.

78. Rapicetta M., Ferrari С., Levrero M. Viral determinants and host immune responses in the pathogenesis of HBV infection. // J. Med. Virol. 2002. - V. 67.-P. 454-457.

79. Rassa JC, Ross SR. Viruses and Toll-like receptors. // Microbes Infect. -2003 Sep. Vol. 5 (11). - P. 961-8.

80. Ratnam D., Visvanathan K. New concepts in the immunopathogenesis of chronic hepatitis B: the importance of the innate immune response. // Hepatol Int. 2008 May. - Vol. 2. - P. 12-8.

81. Rehermann В., Nascimbeni M. Immunology of hepatitis В virus and hepatitis С virus infection. // Nat Rev Immunol. 2005 Mar. - Vol. 5 (3). - P. 215-29.

82. Roederer M., Dubs J.G., Anderson M.T., Raju P.A., Herzenberg L.A., Herzenberg L.A. CD8 naive T cell counts decrease progressively in HIV-infected adults. // J Clin Invest. 1995 May. - Vol. 95 (5). - P. 2061-6.

83. Rodriguez В., Sethi A.K., Cheruvu V.K., Mackay W., Bosch R.J., Kitahata M. Predictive value of plasma HIV RNA level on rate of CD4 T-cell decline in untreated HIV infection. // JAMA. 2006 Sep 27. - Vol. 296(12). - P. 1498506.

84. Sarzotti M., Robbins D.S., Hoffman P.M. Induction of protective CTL responses in newborn mice by a murine retrovirus. // Science. 1996 Mar 22. -Vol. 271 (5256).-P. 1726-8.

85. Semenzato G. Immunology of interstitial lung diseases: cellular events taking place in the lung of sarcoidosis, hypersensitivity pneumonitis and HTV infection. // Eur Respir J. 1991 Jan. - Vol. 4 (1). - P. 94-102.

86. Sheridan J.F., Aurelian L., Quinn TC. Modulation of virus-specific immunity in vitro by the addition of interleukin-1 and interleukin-2 in patients with the acquired immune deficiency syndrome. // Ann N Y Acad Sci. 1984. -Vol. 437.-P. 530-4.

87. Shubina N.G., Iushchenko Iu.A., Kolontsov A.A. Development of delayed-type hypersensitivity to hog cholera. // Vopr Virusol. 2001. - V.46, №1. - P. 42-44.

88. Sudharshan S., Biswas J. Introduction and immunopathogenesis of acquired immune deficiency syndrome. // Indian J Ophthalmol. 2008 Sep-Oct. — Vol. 56 (5).-P. 357-62.

89. Suni M.A., Picker L.J., Maino V.C. Detection of antigen-specific T cell cytokine expression in whole blood by flow cytometry. // J Immunol Methods. . 1998 Mar 1. - Vol. 212 (1). - P. 89-98.

90. Trinchieri G. Interleukin-12: a cytokine at the interface of inflammation and immunity. // Adv Immunol. 1998. - Vol. 70. - P. 83-243.

91. Ullum H., Gotzsche P.C., Victor J., Dickmeiss E., Skinhoj P., Pedersen B.K. Defective natural immunity: an early manifestation of human immunodeficiency vims infection. // J Exp Med. 1995 Sep 1. -Vol. 182 (3). -P. 789-99.

92. Vingerhoets J., Vanham G., Kestens L., Penne G., Leroux-Roels G., Gigase P. Deficient T-cell responses in non-responders to hepatitis В vaccination: absence of TH1 cytokine production. // Immunol Lett. 1994 Feb. - Vol. 39(2). -P. 163-8.

93. Walker D., Jason J., Wallace K., Slaughter J. Spontaneous cytokine production and its effect on induced production. // Clin Diagn Lab Immunol. 2002 Sep. Vol. 9 (5). - P. 1049-56.

94. Watford W.T., Moriguchi M., Morinobu A., O'Shea J.J. The biology of IL-12: coordinating innate and adaptive immune responses. // Cytokine Growth Factor Rev. 2003 Oct. - Vol. 14 (5). - P. 361-8.

95. Wieland S.F., Guidotti L.G., Chisari F.V. Intrahepatic induction of alpha/beta interferon eliminates viral RNA-containing capsids in hepatitis В virus transgenic mice. // J Virol. 2000 May. - Vol. 74 (9). - P. 4165-73.

96. Wieland S., Thimme R., Purcell R.H., Chisari F.V. Genomic analysis of the host response to hepatitis В virus infection. // Proc Natl Acad Sci USA. — 2004 Apr 27. Vol. 101 (17). - P. 6669-74.

97. Wieland S.F., Chisari F.V. Stealth and cunning: hepatitis В and hepatitis С viruses. // J Virol. 2005 Aug. - Vol. 79 (15). - P. 9369-80.154

98. Waldrop S.L., Davis K.A., Maino V.C., Picker L.J. Normal human CD4+ memory T cells display broad heterogeneity in their activation threshold for cytokine synthesis. // J Immunol. 1998 Nov 15. - Vol. 161 (10). - P. 5284-95.

99. Wu Т., Chen M., Ou S.H., Cheng Т., Zhang J., Xia NS. Immune response induced by a different combined immunization of HBsAg vaccine. // Intervirology. 2007. - Vol. 50 (5). - P. 336-40.

100. Zajac A.J., Blattman J.N., Murali-Krishna K., Sourdive D.J., Suresh M., Altman J.D., Ahmed R. Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function. // J Exp Med. -1998 Dec 21. Vol. 188 (12). — P. 2205-13.

101. Zinkernagel R.M. Immunology taught by viruses. // Science. 1996 Jan 12. -V. 271 (5246).-P. 173-8.

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Разработка экспресс-тестов для оценки ранних реакций клеточного иммунитета

Автореферат диссертации по медицине на тему Разработка экспресс-тестов для оценки ранних реакций клеточного иммунитета

Оглавление диссертации Кожушный, Андрей Петрович :: 2010 :: Москва

Введение диссертации по теме "Клиническая иммунология, аллергология", Кожушный, Андрей Петрович, автореферат

Заключение диссертационного исследования на тему "Разработка экспресс-тестов для оценки ранних реакций клеточного иммунитета"

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Кожушный, Андрей Петрович

Похожие научные работы

Каталог диссертаций