Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Анализ иммуномодулирующих эффектов белков теплового шока 70 кДа

На правах рукописи

Пономарёв Александр Дмитриевич

АНАЛИЗ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ ЭФФЕКТОВ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 КДА

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА-2005

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и ЮАОвчинникова РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук,

А.М.Сапожников

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Л.АЗахарова

доктор медицинских наук, профессор М.А.Стенина

Ведущая организация: Московский НИИ вакцин и сывороток

им. И.И.Мечникова РАМН

Защита состоится 2005 г. в часов на заседании

диссертационного совета при НИИФХМ МЗ РФ по адресу: 119435 г. Москва, Ул. М. Пироговская, д. 1А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИФХМ МЗ РФ

Автореферат разослан 2005 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.б.н. Л.Л.Васильева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Семейство белков теплового шока (БТШ) состоит из большой группы высококонсервативных протеинов, интенсивно экспрессирующихся в клетках под действием разнообразных стрессирующих факторов и способствующих выживанию клеток в неблагоприятных условиях. Защитное действие БТШ обусловлено их протективными свойствами, направленными на сохранение нормальной конформации и функциональной активности внутриклеточных протеинов, предотвращение их денатурации и агрегации. Все изученные функции БТШ реализуются во внутриклеточном пространстве, однако в настоящее время существует много свидетельств о локализации этих протеинов на клеточной поверхности. Поверхностная локализация БТШ зарегистрирована у инфицированных, трансформированных и апоптозных лимфоцитов. Причины и механизмы транслокации БТШ на клеточную поверхность пока не изучены, однако известно, что поверхностные БТШ обладают иммуномодулирующими свойствами. В частности, было продемонстрировано, что БТШ, экспонированные на клеточной поверхности, активируют цитотоксические эффекторы иммунной системы. Наряду с явлением необычной локализации БТШ на плазматической мембране, в настоящее время установлено, что БТШ могут находиться вне клеток в виде растворимого пула, попадающего в том числе и в кровоток. Было также обнаружено, что экзогенные, внеклеточные БТШ способны взаимодействовать с клетками и проникать во внутриклеточное пространство. Причем такие интернализованные БТШ сохраняют свои протективные функции и защищают клетки от гибели. В связи с этим очевидно, что наряду с внутриклеточными и поверхностными БТШ, внеклеточная форма этих протеинов также может оказывать влияние на функционирование иммунной системы. В настоящее время интенсивно изучается иммуномодулирующее действие экзогенных БТШ в связи с обнаружением у этих протеинов уникальных адъювантных и иммуностимулирующих свойств. Установлено, что один из механизмов иммуномодулирующих эффектов внеклеточных БТШ связан с активацией этими молекулами антигенпредставляющих клеток. В то же время, анализ описанных эффектов БТШ указывает на то, что зарегистрированные иммуномодулирующие свойства экзогенных БТШ могут быть связаны с действием

этих протеинов не только на антигенпредставляющие клетки, но и на популяции лимфоцитов. Таким образом, накопленные в последнее время данные свидетельствуют о том, что молекулы БТШ участвуют во многих иммунных процессах, связанных с функционированием популяций иммунокомпетентных клеток разных типов. Однако в настоящее время эта тематика остается малоизученной. В настоящей работе были проведены исследования иммуномодулирующих эффектов БТШ, реализующихся на уровне популяций клеток иммунной системы. Основное внимание уделялось главному представителю большого семейства БТШ, протеинам с молекулярной массой 70 кДа (БТШ70).

Цель исследования. Целью работы является исследование иммуномодулирующих функций основного представителя семейства белков теплового шока - БТШ70; анализ зависимости экспрессии БТШ70 клетками иммунной системы от стрессирующих факторов, в частности в модели окислительного стресса; изучение влияния БТШ70 на продукцию перекисных форм кислорода иммунокомпетснтными клетками в процессе «кислородного взрыва».

Задачи исследования. (1) Получение высокоочищенных охарактеризованных препаратов БТШ70 для их последующего использования в экспериментах с экзогенными БТШ70. (2) Исследование влияния различных стрессирующих факторов на экспрессию БТШ70 лимфоидными клетками. (3) Анализ взаимосвязи окислительного стресса с экспрессией БТШ70 лимфоидными клетками (4) Анализ взаимосвязи процесса «кислородного взрыва» с экспрессией БТШ70 у клеток лимфоидных тканей мыши и у фагоцитов периферической крови человека. (5) Анализ модуляции «кислородного взрыва» экзогенными БТШ70. (6) Поиск подходов к использованию продуцируемых лимфоидными клетками БТШ70 в противоопухолевой терапии.

Научная новизна. Все основные результаты данного исследования обладают высокой степенью научной новизны. В частности, впервые было охарактеризовано модулирующее действие экзогенных БТШ70 на продукцию активных форм кислорода различными клетками иммунной системы. Высокой степенью новизны обладают также зарегистрированное действие гормонов стресса на экспрессию БТШ70 и продукцию АФК клетками лимфоидных органов. Впервые

описаны эффекты поликатионов, связанные с влиянием на синтез БТШ и продукцию АФК в лимфоидных клетках. К результатам особой новизны можно отнести обнаруженный феномен снижения содержания БТШ70 в клетках иммунной системы на начальном этапе их реакции на различные стрессирующие факторы. Новизной обладают также результаты, свидетельствующие о возможности использования секретируемых опухолевыми клетками БТШ70 для создания противоопухолевых вакцин.

Практическая значимость. Белки теплового шока обладают уникальными иммуностимулирующими и адъювантными свойствами, которые позволяют создавать на основе БТШ эффективные противоопухолевые и противоинфекционные вакцины. Кроме этого, иммунизация экспериментальных животных препаратами БТШ позволяет предотвратить патологические аутоиммунные реакции. Известно также, что появление в сыворотке крови БТШ и антител к ним является характерным диагностическим признаком определенных этапов развития ряда патологий. Все это свидетельствует о значительных потенциальных возможностях применения БТШ в клинической практике. Очевидно, что для реализации таких возможностей необходимо изучение процессов взаимодействия БТШ с иммунной системой. Исходя из этого, данная работа, посвященная исследованию иммуномодулирующих эффектов БТШ, обладает существенной практической значимостью. Можно предположить, что направленный контроль экзоцитоза БТШ лимфоидными клетками может служить основой для разработки нового подхода к проблеме иммунорегуляции. В то же время, обнаруженные корреляции между продукцией перекисных форм кислорода и экспрессией БТШ у иммунокомпетентных клеток открывают новые возможности для терапевтического вмешательства в воспалительные процессы.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XIV зимней международная научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002г.), на шестой международной иммунологической летней школе им. Дж. Хэмфри (Пущино, 2002), на VI чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва -Пущино, 2002г.), на шестой научной конференции с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2002), на 7-ом

региональном конгрессе Азии/Океании по геронтологии (Токио, 2003г.), на Всероссийской конференции «Человек и лекарство» (Москва, 2004г.), на VIII Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург 2004г.), на XVII зимней молодежной научной школе "Переспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2005г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы (глава 1, 2, 3, 4 и 5), материалов и методов (глава 6), результатов исследований и обсуждения (глава 7), выводов и списка литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 29 рисунков, 2 таблицы. Список литературы включает 235 источников, из которых 224 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. В экспериментах использовали самок мышей инбредных линий C57BL и BALB/c из питомника экспериментальных животных (ФИБХ РАН, г. Пущино, МО) в возрасте 8-12 недель и исходной массой 16-18 грамм.

Приготовление клеточных суспензий. Суспензии клеток лимфоидных органов мыши получали общепринятым способом. Для удаления эритроцитов использовался раствор Бройля. Жизнеспособность клеток в суспензии, оцененная с помощью раствора трипанового синего составляла в разных экспериментах 9598%.

Выделение клеток из периферической крови доноров. Нейтрофилы изолировали из периферической крови доноров центрифугированием на двойном градиенте плотности фиколл-верографина. Степень обогащения полученных клеточных фракций гранулоцитами и мононуклеарами оценивали с помощью проточной цитометрии. Этот анализ свидетельствовал о том, что во всех экспериментах суспензия изолированных нейтрофилов имела 96-98% чистоты.

Жизнеспособность выделенных клеток, определяемая по окрашиванию трипановым синим, составляла не менее 98%.

Клеточные культуры. Клетки лимфоидных органов мыши и линий лимфоцитов культивировались в 24-луночных планшетах ("Nunc", США) и в культуральных флаконах (25 см2, 75 см2 и 162 см2 фирмы "Costar", США) в питательной среде RPMI 1640 ("Sigma", США), содержащей 5% фетальной сыворотки (FCS), 20 мМ HEPES, 0,2% NaHCOj, 50 мкг/мл гентамицина (все фирмы "Sigma") в 5% С02 при 37°С.

Моноклональные антитела. В исследованиях использовались моноклональные антитела к БТШ70 фирмы "Sigma" (клон BRM-22, специфичный как к конститутивным, так и индуцибельным БТШ70) и фирмы "StressGen" к конститутивной (клон SPA815) и индуцируемой (клон SPA810) формам БТШ70. В качестве вторых антител к этим антителам использовались Fab фрагменты кроличьих анти-IgG мыши антител, конъюгированные с ФИТЦ или с R-фикоэритрин, оба фирмы "Sigma".

Тепловой шок В части экспериментов, для активации генов белков теплового шока, мы применяли тепловой шок. Для этого клеточные суспензии подвергались термической обработке на водяной бане (42°С в течение 10 мин) с последующим периодом восстановления 1 час 37°С. Такая обработка не приводила к гибели клеток, что было установлено с помощью их окрашивания трипановым синим.

Регистрация внеклеточной продукции АФК. Продукцию нейтрофилами активных форм кислорода оценивали с помощью анализа их люминол-зависимой хемилюминесценции на хемилюминометре 3603 ("Диалог" , Москва ). На первом этапе измерений в течение 90-100 мин регистрировали хемилюминесцепцию, вызываемую процессом адгезии клеток к пластику. После этого, для индукции выброса клетками АФК, в образцы добавляли стандартный субстрат для фагоцитоза - опсонизированный зимозан и регистрировали кинетику хемилюминесцентного ответа («дыхательный взрыв»).

Цитофлуориметрический анализ клеток. Анализ морфологических характеристик клеток и уровня экспрессии на их поверхности БТШ проводился на приборе EPICS XL (Coulter Corporation, USA). Окрашивание образцов проводилось

по стандартной методике. Оценку внутриклеточного содержания БТШ проводили после предварительной обработки фиксированных (0,5% раствором параформальдегида в PBS в течение 30 минут) клеток детергентом Тритон Х-100 (в течение 5 мин при 4°С) и последующего их окрашивания первыми и вторыми антителами. Количественную оценку уровня экспрессии БТШ проводили по изменению средней интенсивности флуоресценции клеток в образцах, обработанных анти-БТШ антителами, по сравнению со свечением контрольных (обработанных контрольными антителами, соответствующего изотипа и концентрации) клеток. Относительный уровень экспрессии вычисляли по формуле: Mean(HSP)-Mean(Control).

Цитофлуориметрический анализ апоптоза. Цитофлуориметрическая регистрация процентного содержания аноптозных клеток в образцах лимфоцитов проводилась с использованием ДНК-специфичного флуоресцентного красителя пропидийиодида (PI). Для этого образцы фиксировались в охлажденном 70% растворе этанола (30 - 60 мин.), с последующим двукратным отмыванием, и переводились для измерения в раствор PBS, содержащий 1 мкг/мл PI и 50 Ед/мл РНК-азы А. В одном образце анализировалось не менее 5x103 клеток.

Измерение внутриклеточного уровня АФК. Для определения количества перекисных форм кислорода внутри клетки мы использовали 5-(and-6)-carboxy-2',7- dichlorodihydrofluorescein diacetate (C-400, "Molecular probes"). Клетки с 10 мкМ С-400 инкубировались при 37°С 20 минут, затем образцы измерялись на приборе EPICS XL (Coulter Corporation, USA).

Статистическая обработка результатов иитометрических измерений. Стагистический анализ проводился, используя t-критерий Стьюдента, с помощью встроенного пакета статистических программ "WinMdi" для обработки гистограмм, полученных во время цитофлуориметрического анализа.

Получение кондиционированного супернатанта клеточных культур и анализ содержания в нем БТШ70. Супернатант, полученный в результате инкубирования клеток в бессывороточной среде, дополнительно очищали от примесей путем фильтрации через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Затем супернатант лиофилизировали, растворяли в деионизованной воде (в количестве 1/20 первоначального объема). Далее проводили диализ в буфере. Полученный

концентрированный супернатант использовали для Вестерн-блот анализа в количестве 20 мкл на лунку. Вестерн-блот анализ проводили по стандартной методике.

Аффинное выделение БТШ70 из биологических образцов. Аффинное выделение БТШ70 из приготовленных образцов осуществляли на колонке с АТФ-агарозой. Это подход основан на способности молекул БТШ70 к прочному связыванию с молекулами АТФ (Welch, Feramisco, 1985).

Экзогенные БТШ70. В ряде экспериментов использовали рекомбинантные БТШ70 человека (StressGen, Канада). Концентрация этих протеинов варьировала в разных опытах от 1 до 10 мкг/мл. В качестве контроля в этих опытах использовали такие же дозы раствора человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) в RPMI.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение БТШ70 методом аффинной хроматографии

БТШ70 для проведения ряда последующих экспериментов получали методом аффинной хроматографии на АТФ-агарозе (Welch, Feramisco, 1985). В составе БТШ70 имеется АТФ-связывающий сайт, обладающий очень высокой аффинностью к АТФ. Это свойство БТШ70 используется для получения препаратов белка. На рис. 1 приведен ДСН-ПААГ электрофорез и иммуноблотинг материала, полученного из печени и почек мыши. Полученные образцы были достаточной чистоты. При окрашивании геля красителем кумасси голубым определяется одна полоса в районе 70 кДа. Причем на картине иммуноблотинга можно различить две полосы, соответствующие конститутивной (73 кДа) и индуцибельной (71 кДа) формам БТШ70.

Феномен интернализации экзогенных БТШ70

Белки теплового шока, находящиеся в клеточном микроокружении, активно поглощаются клетками. Чтобы доказать это, мы использовали БТШ70, меченные флюоресцентной меткой фикоеритрином, в концентрации 10 мкг/мл. Инкубация происходила при 4°С и 37°С в течении часа, с последующей отмывкой несвязавшихся молекул. Оказалось, что при 37°С БТШ70 активно

интернализируются. Напротив, при 4°С, когда клетка не активна, БТШ70 не проникают в клетку (Рис 2).

кДа маркеры А(э/форез) Б(блот)

97

67 - * г - -;

43

Рис. 1. А - репрезентативная иллюстрация ДСН-ПААГ электрофореза образцов материала, полученного на АТФ-агарозе (мажорная полоса в области 70 кДа) Б - типичный результат иммуноблотинга фракции 70 кДа образцов

а а

х ¡1

I!

Инторналиэация Б1Ш70, меченных фихоеретрииом клетками костного мозга мыши

л

и <

Щ

ГП п *

Интернализация БТШ70, меченных фикоеротрииом сплвноцитами мыши

контроль

БТШ 0

БТШ 37

I50

1 40 ®

I 30

1 20 з

£ ю

-- -ь -

—-- —

пт Г"Л

БТШ О

БТШ 37

Рис. 2. Интернализация БТШ70-фикоеритрин клетками костного мозга и спленоцитами мыши. Инкубация шла при 0 и 37°С в течение 1 часа, с последующими отмывками.

Влияние БТШ70 на продукцию акт ивных форм кислорода

Использованный в нашей работе подход к анализу продукции клетками активных форм кислорода (АФК) по уровню их люминол-зависимой хемилюминесценции позволяет регистрировать кинетику интенсивности выхода данных молекул из клеток в окружающую среду. Типичная для такого подхода временная диаграмма, регистрируемая для нейтрофилов и макрофагов, содержит начальную область повышенного уровня хемилюминесценции, связанного с выбросом клетками АФК в процессе их адгезии к подложке, и последующий пик хемилюминесценции («дыхательный взрыв»), появляющийся после внесения в образцы фагоцитируемого субстрата, в качестве которого как правило используют опсонизированный зимозан. В результате проведенных экспериментов мы обнаружили, что преинкубация нейтрофилов в течение 30 мин при 37°С с экзогенными БТШ70 (с их последующей отмывкой) приводит к существенному снижению амплитуды «дыхательного взрыва», обусловленного внесением зимозана (рис. 3).

о --------

3 5 7 11 32 58 79 81 84 88 95 106 115 117 120 123 135 140 145 Время (мин.)

Рис. 3. Хемилюминесцентный анализ влияния обработки нейтрофилов человека экзогенными БТШ70 на «дыхательный взрыв» этих клеток под действием опсонизированного зимозана. Перед началом измерений опытные образцы были проинкубированы с 5 мкг/мл рекомбинантных БТШ70 человека в течение 30 мин при 37°С с их последующей отмывкой. Контролем служили образцы, обработанные 5 мкг/мл БСА) или проинкубированные в отсутствии экзогенных протеинов.

Указанное супрессирующее влияние экзогенных БТШ70 на продукцию АФК нейтрофилами было более выраженным при внесении этих протеинов в образцы непосредственно перед началом регистрации хемилюминесценции, без последующего отмывания клеток от экзогенных БТШ70. В этих условиях продукция АФК в образцах с БТШ70 была достоверно ниже контроля на протяжении всего периода измерений, а амплитуда «дыхательного взрыва» уменьшалась под действием внесенных БТШ70 в 3-5 раз (рис. 4). Мы объясняем зарегистрированный эффект экзогенных БТШ70 способностью данных протеинов ингибировать активность ключевого фермента «дыхательного взрыва» - NADP-оксидазы, катализирующей образование супероксид-радикала и обеспечивающей усиленную генерацию АФК фагоцитами во время процессов адгезии и фагоцитоза (Maiidonneau-Parmi et al., 1988). Известно, что NADP-оксидаза локализуется на плазматической мембране и имеет домены, экспонированные на клеточной поверхности (Droge W. et al, 2002). Можно предположить, что взаимодействие экзогенных БТШ70 именно с этими доменами приводит к подавлению продукции нейтрофилами АФК.

Рис. 4. Хемилюминесцентный анализ влияния экзогенных БТШ70 на кинетику продукции АФК нейтрофилами человека. 5 мкг/мл рекомбинантных БТШ70 присутствовали в опытных образцах на протяжении всего периода измерений. В контрольные образцы вносили БСА до конечной концентрации 5 мкг/мл или эквивалентный объем PBS. «Дыхательный взрыв» нейтрофилов индуцировали внесением в образцы опсонизированного зимозана на 100 минуте.

Одним из подтверждений такого предположения явились результаты другой серии наших опытов, где в образцы с нейтрофилами вносилась не растворимая форма БТШ70, а фиксированные клетки, экспрессирующие данные протеины на своей поверхности. Микроскопический анализ показал, что фиксированные клетки контактировали с нейтрофилами, но во время измерений это не сопровождалось их фагоцитозом. Т.е. в данных экспериментах выполнялось условие взаимодействия экзогенных БТШ70 только с поверхностью нейтрофилов. Появление БТШ70 на клетках после их фиксации параформальдегидом было обнаружено в наших предварительных исследованиях. В данной работе в качестве носителей экзогенных БТШ70 в образцы добавлялись фиксированные тимоциты мыши в соотношении 1:1 и 2:1 с числом живых нейтрофилов. Присутствие БТШ70 на этих клетках контролировалось с помощью проточной цитометрии. Контролем к этим образцам служил уровень «дыхательного взрыва» нейтрофилов в пробах с добавлением живых тимоцитов, не экспрессирующих на своей поверхности БТШ70. Полученные результаты хемилюминесцентного анализа свидетельствуют о том, что индуцированная зимозаном продукция АФК нейтрофилами достоверно уменьшается под действием фиксированных тимоцитов, и лишь незначительно снижается в присутствии живых тимоцитов. Выраженность данного эффекта усиливалась при увеличении количества вносимых в образец тимоцитов. Мы связываем зарегистрированную в этих опытах супрессию «дыхательного взрыва» с контактным взаимодействием БТШ фиксированных клеток с экспонированными на поверхности нейтрофилов доменами НАДФ-оксидазы.

Изложенные выше результаты продемонстрировали влияние экзогенных БТШ70 на продукцию АФК фагоцитирующими клетками. Очевидно, что подобным влиянием на процессы генерации АФК могут обладать и эндогенные БТШ70, синтезируемые клетками в ответ на гипертермию или другие стрессирующие воздействия. Мы провели проверку влияния повышенного содержания в нейтрофилах эндогенных БТШ70 на амплитуду «дыхательного взрыва», используя гипертермический стресс данных клеток для усиления уровня экспрессии генов БТШ. С этой целью образцы с нейтрофилами инкубировались в течение 10 мин при 42°С и после периода восстановления (1 час при 37'С) проводился хемилюминесцентный анализ продукции АФК, индуцированной зимозаном.

Контрольные образцы не подвергались гипертермии и находились до измерений при 37°С. Полученные данные свидетельствовали о том, что указанная гипертермическая обработка фагоцитов приводила к существенному снижению амплитуды «дыхательного взрыва» по сравнению с контролем (рис. 7). Следовательно, активация генов БТШ и соответственное увеличение содержания этих протеинов в нейтрофилах ингибирует процесс усиленной продукции АФК при фагоцитозе.

Рис. 7. Влияние гипертермической активации экспрессии БТШ у нейтрофилов на амплитуду их «дыхательного взрыва» под действием опсонизированного зимозана.

Таким образом, результаты проведенных исследований демонстрируют тесную взаимосвязь процессов генерации АФК нейтрофилами с универсальной протективной системой белков теплового шока. Регулирующим действием на уровень продукции нейтрофилами АФК обладают как экзогенные, так и внутриклеточные БТШ70. Присутствие данных протеинов в межклеточном пространстве и повышенная экспрессия эндогенных БТШ70 нейтрофилами подавляют индуцированную фагоцитозом продукцию АФК этими клетками. Зарегистрированные эффекты указывают на существенную роль БТШ70 в иммунных процессах, сопровождающихся генерацией АФК.

Влияние АФК на экспрессию БТШ70

Далее в наших исследованиях мы проанализировали как меняется уровень экспрессии эндогенных белков теплового шока 70 кДа в клетках при кислородном взрыве. В качестве стимуляторов кислородного взрыва использовались липополисахарид (LPS) и форбол 12-миристат 13-ацетат (РМА). Выяснилось, что оба эти стимулятора кислородного взрыва являются индукторами экспресии БТШ70, причем повышенный уровень экспрессии белков теплового шока 70 кДа уже определялся через 2 часа инкубации (Рис. 8). В следующей серии экспериментов мы проследили как меняется уровень конститутивных БТШ70 под влиянием индуктора ЛПС с течением времени, начиная с момента внесения ЛПС (Рис. 9). Оказалось, что через 30-60 минут после внесения ЛПС уровень конститутивных БТШ70 в клетках костного мозга мыши значительно снижается, возвращаясь к норме через 2-3 часа. Зарегистрированное падение уровня экспрессии БТШ70 в данной модели можно объяснить окислительной модификацией белков теплового шока с последующей их деградацией в протеосомах. Факт окислительной модификации белков теплового шока был продемонстрирован ранее (Castegna et al., 2002). Однако мы предполагаем, что в наших экспериментах падения уровня БТШ70 на начальной стадии реакции клеток на стрессирующее воздействие связано с выбросом этих протеинов в межклеточное пространство.

контроль ЛПС ом*

Рис. 8. Экспрессия БТШ70 на поверхности и внутри клеток костного мозга мыши под действием индукторов кислородного взрыва: ЛПС и ФМА.

Рис. 9. Кинетика содержания конститутивного БТШ70 в клетках костного мозга мыши под влиянием ЛПС.

Влияние гормонов стресса на продукцию АФК и экспрессию БТШ70

Экспрессия БТШ в различных тканях организма наблюдается не только при прямых воздействиях неблагоприятных факторов на эти ткани, но и под действием эндокринных сигналов, продуцируемых при стрессе всего организма (Welch, 1992; Feder, Hofmann, 1999). Известно, что стресс существенно влияет на активность иммунной системы, однако в литературе не охарактеризована возможная взаимосвязь этого влияния с модуляцией синтеза БТШ в лимфоидной ткани С целью проверки возможного влияния медиаторов стресса на интенсивность синтеза лимфоцитами БТШ70 и продукцию АФК мы проанализировали реакцию клеток костного мозга мышей линии C57BL/6 на действие адреналина и дексаметазона.

Как оказалось, адреналин почти полностью отменяет продукцию АФК клетками костного мозга мышей в ответ на ЛПС. Аналогичная супрессия «кислородного взрыва» зарегистрирована и в реакции нейтрофилов человека на внесение стафилокока и зимозана (Рис 10)

Рис. 10. Адреналин подавляет «кислородный взрыв» у нейтрофилов человека.

В отдельной серии экспериментов с клетками костного мозга мыши мы обнаружили, что адреналин снижает также и содержание внутриклеточных АФК. Дексаметазон, в отличие от адреналина, не оказывает заметного влияния на уровень перекисных форм кислорода в клетке. В этой же модели было зарегистрировано, что внутриклеточная концентрация БТШ70 под влиянием гормонов стресса первоначально падает (1 час инкубации). Тогда как при более длительной инкубации (21 час), мы наблюдаем стимуляцию синтеза БТШ70 под влиянием адреналина. Дексаметазон угнетает синтез вышеуказанных протеинов, причем чем больше время инкубации, тем выраженнее снижение уровня экспрессии БТШ70 (Рис. 11). Стимулирующее действие катехоламинов на экспрессию БТШ70 описано для клеток ряда тканей различных организмов (Feder, Hofmann, 1999) и для иммунных клеток моллюсков (Lactose et al., 2001), однако в литературе нет сведений о снижении внутриклеточного содержания БТШ под влиянием катехоламинов. Мы связываем такой эффект адреналина с выбросом этих протеинов в межклеточное пространство под действием стресса. Снижение уровня БТШ70 под влиянием дексаметазона можно объяснить свойством стероидных гормонов ингибировать синтез протеинов.

Рис. 11. Клетки костного мозга мыши Balb/c инкубировались с липополисахаридом, ФМА, адреналином, дексаметазоном и их комбинацией. Одновременно оценивались внутриклеточные АФК через 1 час, внутриклеточное содержение БТШ70 через 1 и 21 час инкубации. БТШ70 выявлялись моноклональными антителами BRM22 ("Sigma") на проточном цитофлюориметре.

Влияние на внутриклеточное содержание АФК и БТШ70 индукторов окислительного стресса Далее в нашей работе мы проанализировали изменение внутриклеточного содержания АФК и БТШ70 у человеческих гранулоцитов под действием индукторов «кислородного взрыва» - стафилококка и инактивированной аутологичной сыворотки. Как и ожидалось, стафилококк вызывал продукцию АФК, но одновременно с этим, в острой фазе (1 час) происходило падение уровня БТШ70. Те же самые изменения, только с меньшей амплитудой, мы наблюдали и в опытах с инактивированной сывороткой. Аутосыворотка после термической обработки содержит денатурированные и частично агрегированные белки, вызывающие при фагоцитозе продукцию АФК. При этом, аутосыворотка является более слабым раздражителем, чем стафилококк. Прогрев нейтрофилов до 42°С 10 мин. не оказал влияния на уровень внутриклеточных АФК, но, классически, индуцировал синтез БТШ70. В то же время, предварительный тепловой шок фагоцитов с последующей их стимуляцией стафилококком и аутосывороткой не отменял зарегистрированное возрастание АФК и падение внутриклеточных БТШ70. Более того, падение экспрессии БТШ70 в этом случае было более отчетливым (Рис.12). Таким образом, на различные стимулы, вызывающие «кислородный взрыв» в фагоцитах, кроме отсроченной стимуляции экспресии БТШ70 мы обнаружили кратковременное падение уровня БТШ70 во время острой фазы реакции клеток, связанной с синтезом АФК. И величина падения экспрессии БТШ70 прямо коррелирует с уровнем генерации перекисных форм кислорода. Падение экспрессии БТШ70 при повышении уровня перекисных форм кислорода описано и в работах других исследователей. Например, воздействие некоторых токсичных веществ на сердечную мышцу вызывает увеличение уровня продукции АФК и падение экспрессии БТШ70 (8киа й а1., 1999). Хотя по другим многочисленным работам известно, что возрастание уровня АФК стимулирует синтез БТШ.

Рис. 12. Человеческие гранулоциты инкубировались с живым стафилококком золотистым и аутосывороткой. Через 1 час инкубации оценивались уровень внутриклеточных АФК и БТШ70. Во второй части экспериментов использовался предварительный тепловой шок-42°С 10 мин. Представлены данные одного из трех репрезентативных экспериментов.

АФК, БТШ70 и старение

В следующей серии экспериментов мы попытались установить связь между белками теплового шока, активными формами кислорода и старением. Для этого мы брали пары пациентов, среднего и преклонного возраста. Лимфоциты и нейтрофилы выделяли из цельной крови. Оказалось, что с возрастом внутриклеточное содержание АФК увеличивается, как в лимфоцитах, так и в нейтрофилах. Причем этот повышенный уровень АФК у пожилых пациентов сохранялся и при стимуляции золотистым стафилококком (Рис. 13). Возможно это связано с падением резервных возможностей антиоксидантной системы клетки. О возрастании уровня оксидантов в клетке с возрастом говорится в некоторых работах (Ртке1 Т. е! а1., 2000). В то же время, по белкам теплового шока 70кДа, наблюдается прямо противоположная картина. Относительное внутриклеточное содержание БТШ70 с возрастом уменьшается. Как в лимфоцитах, так и в гранулоцитах (Рис. 14). То есть падают резервные возможности клетки, уменьшается ее антистрессовая устойчивость. На том же рисунке можно заметить, что клетки молодого пациента реагируют на тепловой шок более выраженным

повышением экспрессии БТШ70. Тогда как у пожилых пациентов тепловой шок более слабо активирует синтез белкоз теплового шока.

Рис. 13. Внутриклеточное содержание АФК в лимфоцитах и нейтрофилах у пациентов 28 и 77 лет. Без стимулов (контроль) и со стафилококком золотистым.

Рис. 14. Внутриклеточное содержание БТШ70 у лимфоцитов и гранулоцитов в разных возрастных группах. «42» - клетки были подвергнутые тепловому шоку 42°С 10 мин., 1 час восстановления 37°С.

Наши данные согласуются с работами других авторов. Следовательно, можно говорить о том, что с возрастом уменьшается внутриклеточный пул белков

теплового шока, падают резервные возможности клетки, и как следствие, повышается фоновый уровень АФК.

Влияние поликатионов на продукцию АФК и БТШ70

В части наших наших экспериментов мы использовали поликатионы -полилизин и хитозан. Оказалось, что эти полимерные соединения резко увеличивают содержание перекисных форм кислорода в клетке. Причем происходит это во многих типах клеток: клетках костного мозга, перитонеальных макрофагах, спленоцитах. Выяснилось также, что уровень АФК прямо пропорционален дозе полилизина. Чем больше концентрация поликатиона, тем интенсивнее генерация АФК. При часовой инкубации, доза 60 мкл/мл 0,01% полилизина уже является токсичной. А при дозе 300 мкл/мл гибель клеток составляет 100%. В то же время, в отличие от внутриклеточного уровня перекисных форм кислорода, внеклеточная продукция АФК прогрессивно падала под действием полилизина. Возможно, это связано с тем, что полилизин, связываясь с клеточной поверхностью, препятствует выходу АФК из клетки наружу.

Далее мы проанализировали изменение экспрессии БТШ70 внутри и на поверхности клеток в этой модели. Выяснилось, что внутриклеточный уровень БТШ70 под влиянием полилизина резко падает. То есть, резкое возрастание уровня внутриклеточных перекисных форм кислорода сопровождается сильным же падением уровня БТШ70. В противоположность этому, на клеточной поверхности наблюдалось некоторое возрастание уровня БТШ70 под влиянием полилизина. Таким образом, первой, острой реакцией на возрастание уровня АФК в клетке при воздействии поликатионов (а так же ЛПС, стафилококка) является падение уровня БТШ. Тогда как отсроченной реакцией (6-24 часа) является индукция экспрессии БТШ.

Возможные подходы к созданию противоопухолевых вакцин на основе секретируемых БТШ70

В настоящее время в экспериментальной и клинической иммунологии проявляется повышенный интерес к созданию вакцин на основе БТШ. Это связано

с тем, что у БТШ были выявлены уникальные адъювантные и иммуностимулирующие свойства. Все описанные в литературе противоопухолевые эффекты были получены с помощью препаратов БТШ, выделенных из разрушенных опухолевых клеток. Это связано с тем, что БТШ являются внутриклеточными протеинами. В то же время литературные данные и наши результаты свидетельствуют о способности клеток секретировать БТШ в межклеточное пространство. Ранее мы обнаружили, что в супернатанте культуры клеток мышиной лимфомы EL-4 присутствуют БТШ70, экспрессирующиеся на цитоплазматической мембране этих клеток. Очевидно, что препараты, основанные на использовании комплексов БТШ с поверхностными антигенами опухолевых клеток, могут быть более эффективными для противоопухолевой иммунотерапии по сравнению с препаратами, полученными из разрушенных клеток. В связи с этим, в данной работе мы провели исследование возможности использования БТШ70, содержащихся в супернатанте культуры клеток лимфомы EL-4 для вакцинации животных в модели перевиваемой опухоли.

Первая часть данного исследования была направлена на тестирование содержания БТШ70 в препаратах супернатанта клеток EL-4, предназначенных для иммунизации мышей. Электрофорез всех используемых образцов супернатанта в полиакриламидном геле выявлял мажорную фракцию протеинов с относительной молекулярной массой 70 кДа. С помощью иммуноблоттинга было установлено, что эта фракция содержит БТШ70. Приготовленные препараты использовались для иммунизации мышей в последующих экспериментах. На втором этапе исследования была проведена иммунизация животных различными дозами препаратов, последующая инъекция опухолевых клеток и наблюдение за ростом опухоли и продолжительностью жизни опытных мышей.

В результате этих экспериментов было установлено, что проведенная иммунизация заметно снижает рост опухоли, а в некоторых случаях рост опухоли полностью предотвращался. Существенно, что эффект вакцинации был наиболее выраженным в группе животных, получивших максимальную дозу препарата. Так, средняя продолжительность жизни мышей в контрольной группе составила после прививания опухоли около тридцати дней. Группа животных, проиммунизированная 5 мкг препарата имела достоверно более высокую среднюю

продолжительность жизни (около 50 дней). Половина же третьей группы мышей, получивших максимальную дозу препарата (50 мкг), прожила более 50 дней, а остальная часть этой группы характеризовалась отсутствием опухолеобразования. В дополнение к наблюдениям за ростом опухоли и продолжительностью жизни животных, погибших мышей подвергали вскрытию. У мышей, получавших препарат, отмечалось отсутствие видимых метастазов в печени и легких и очагов инфильтрации подкожной жировой клетчатки, наблюдаемых у всех контрольных животных. Протективный эффект вакцинации испытываемыми препаратами супернатанта был долговременным. Об этом свидетельствовала повторная прививка опухоли БЬ-4 трем животным, полностью защищенным данными препаратами от опухолеобразования в описанных выше экспериментах. Указанным мышам была проведена инъекция по 106 клеток БЬ-4 через 4 месяца после их иммунизации. Наблюдения за этой группой на протяжении последующих двух месяцев не выявило появления опухоли ни у одного из животных, в то время как в контрольной группе опухоль видимых размеров обнаружилась как и обычно, примерно через две недели, а спустя месяц все мыши контрольной группы погибли. Таким образом, проведенное исследование подтвердило наше предположение о возможности разработки противоопухолевых препаратов на основе БТШ, секретируемых опухолевыми клетками.

Выводы

1. Экзогенные БТШ70 обладают модулирующим действием на продукцию АФК клетками иммунной системы. В модели «кислородного взрыва» при воздействии опсонизированного зимозана на человеческие лейкоциты, экзогенные БТШ70 существенно снижают амплитуду дыхательного взрыва. Гипертермическая активация генов БТШ70 (тепловой шок) также снижает амплитуду «кислородного взрыва».

2. «Кислородный взрыв», индуцированный ЛПС и ФМА в клетках костного мозга вызывает увеличение экспрессии БТШ70 через 4-24 часа. В более ранний период -через 30-60 минут от начала «кислородного взрыва» уровень БТШ70 в клетке падает.

3. Гормоны стресса влияют на аплитуду «дыхательного взрыва» и экспрессию БТШ70 в иммунокомпетентных клетках. Адреналин угнетает продукцию АФК. При этом, внутриклеточная экспрессия БТШ70 вначале (1 час) падает, а на более поздних сроках (4-21 час) возрастает. Дексаметазон в этой же модели не оказывает влияния на уровень внутриклеточных перекисных форм кислорода, но ингибирует синтез БТШ70.

4. Воздействие на лейкоциты периферической крови человека стафилококками также приводит к падению на начальной фазе ответа внутриклеточного содержания БТШ70, сопровождающего рост продукции АФК.

5. В ходе старения в человеческих лейкоцитах возрастает уровень внутриклеточных АФК и уменьшается внутриклеточная экспрессия БТШ70.

6. Поликатионы стимулируют синтез внутриклеточных АФК и снижают содержание БТШ70 в клетках костного мозга.

7. БТШ70, секретируемые опухолевыми клетками, демонстрируют противоопухолевую активность, что свидетельствует о возможности создания на их основе противоопухолевых вакцин.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Тарасенко Т.Н., Пономарёв А.Д., Сапожников A.M. "Простая модель индуцированной транслокации внутриклеточных белков теплового шока на поверхность тимоцитов мыши". Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии. Тезисы докладов и стендовых сообщений, М., 2002, с. 105.

2. Сапожников A.M., Гусарова ГА., Тарасенко Т.Н., Пономарёв А.Д., Баев Д.В., Мурашко ДА. "Феномен локализации белков теплового шока на клеточной поверхности и в межклеточном пространстве: возможные механизмы и функции в популяциях лимфоидных клеток". Тезисы докл. VI чтений, посв. памяти акад. Ю.А. Овчинникова, 25 ноября - 2 декабря 2002, Москва-Пущино, с. 68.

3. Ponomarev A.D., Gusarova G.A., Moiseeva E.V., Sapozhnikov A.M. "Anti-cancer effect of vaccination with HSP70 released from tumor cells: a model of EL4 lymphoma". 6th John Humphrey advanced summer programme and lecture series in immunology. Pushchino. September 15-22. Abstracts, 2002, p. 112-113.

4. Пономарев А.Д., Гусарова Г.А., Моисеева Е.В., Сапожников A.M. "Вакцинация белками теплового шока 70, секретируемыми клетками лимфомы EL4 in vitro, подавляет развитие этой опухоли in vivo". Медицинская иммунология, 2002, т. 4, N 2, с. 306.

5. Гусарова ГА., Тарасенко Т.Н., Пономарев А.Д., Луценко Г.В., Сапожников А.М. "Взаимодействие белков теплового шока 70 с поверхностью лимфоидных клеток". Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. Сборник трудов, 2002, т. И, с. 42.

6. Пономарев А.Д., Гусарова ГА., Тарасенко Т.Н., Мурашко Д.А., Сапожников A.M. "Активация перитонеальных макрофагов мыши препаратами белков теплового шока 70".

Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. Сборник трудов, 2002, т. II, с. 115.

7. Тарасенко Т.Н., Гусарова ГА, Пономарев А.Д., Мурашко Д.А., Сапожников A.M. "Анализ экспрессии белков теплового шока 70 в процессе апоптоза тимоцитов". Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. Сборник трудов, 2002, т. И, с. 156.

8. Пономарёв А.Д., Гусарова ГА, Моисеева Е.В., Сапожников А.М. "Разработка нового подхода к созданию противоопухолевых вакцин на основе белков теплового шока". Аллергия, астма и клиническая иммунология, 2002, N 3, с. 3-8.

9. Баев Д.В., Пономарёв А.Д., Тарасенко Т.Н., Сапожников А.М. "Исследование процесса апоптоза лимфоидных клеток in vitro с использованием методов математического моделирования". Медицинская иммунология, 2003, т. 5, N 3-4, с. 190191.

10. Гусарова Г.А., Тарасенко Т.Н., Пономарёв А.Д., Мурашко Д.А., Сапожников A.M. "Феномен интернализации экзогенных белков теплового шока 70 кДа лимфоидными клетками". Медицинская иммунология, 2003, т. 5, N 3-4, с. 199.

11. Semenkov V.F., Sapoghnikov A.M., Ponomarev A.D. Heat-shock genes as supressors of the induced by autologous serum oxidative metabolism of human's phagocytes of different age. 7th Asia/Oceania Regional Congress of Gerontology, Tokyo, Japan, 2003, p. 58.

12. Сапожников A.M., Тарасенко Т.Н., Пономарёв А.Д., Гусарова Г.А., Мурашко Д.А., Петров Р.В. "Адреналин-опосредованная активация экспрессии белков теплового шока 70 кДа в популяции тимоцитов". ДАН, 2003, т. 392, N 2, с. 277-279.

13. Сапожников A.M., Тарасенко Т.Н., Пономарёв А.Д., Гусарова Г.А., Мурашко Д.А. "Анализ изменения экспрессии белков теплового шока 70 кДа в процессе апоптоза тимоцитов". Иммунология, 2004, т. 25, N 3, с. 135-142.

14. Сапожников А.М., Коваленко Е.И., Пономарев А.Д., Мурашко Д.А., Власкин П.А. "Роль белков теплового шока в функционировании иммунной системы". Тезисы докладов и стендовых сообщений VII чтений, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова, Москва, 4-7 октября 2004, с. 69-70.

15. Пономарёв А.Д., Семенков В.Ф., Сапожников A.M. "Экзогенные белки теплового шока 70 кДа ингибируют продукцию активных форм кислорода фагоцитами". «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», VIII Всероссийский научный форум с международным участием, 27-30 сентября 2004, Медицинская иммунология, т. 6, N 3-5, с. 153-480, с. 246-247.

16. Алекперов Э.А., Пономарев А.Д., Сапожников A.M. "Активация лимфоидных клеток сопровождается снижением внутриклеточного содержания БТШ70". XVII зимняя молодежная научная школа "Переспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 7-10 февраля 2005, с. 73.

Принято к исполнению 10/02/2005 Исполнено 11/02/2005

Заказ № 597 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095) 318-40-68 www.autoreferat.ru

/Г

/ f..

( Jll'l

I » 0£B 2kl.".V.

1188

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Семейство белков теплового шока (БТШ) состоит из большой группы высококонсервативных протеинов, интенсивно эксирессирующихся в клетках под действием разнообразных стрессирующих факторов и способствующих выживанию клеток в неблагоприятных условиях. Защитное действие БТШ обусловлено их протективными свойствами, направленными на сохранение нормальной конформации и функциональной активности внутриклеточных протеинов, предотвращение их денатурации и агрегации. Все изученные функции БТШ реализуются во внутриклеточном пространстве, однако в настоящее время существует много свидетельств о локализации этих протеинов на клеточной поверхности. Поверхностная локализация БТШ зарегистрирована у инфицированных, трансформированных и апоптозных лимфоцитов. Причины и механизмы транслокации БТШ на клеточную поверхность пока не изучены, однако известно, что поверхностные БТШ обладают иммуномодулирующими свойствами. В частности, было продемонстрировано, что БТШ, экспонированные на клеточной поверхности, активируют цитотоксические эффекторы иммунной системы. Наряду с явлением необычной локализации БТШ на плазматической мембране, в настоящее время установлено, что БТШ могут находиться вне клеток в виде растворимого пула, попадающего в том числе и в кровоток. Было также обнаружено, что экзогенные, внеклеточные БТШ способны взаимодействовать с клетками и проникать во внутриклеточное пространство. Причем такие интернализованпые БТШ сохраняют свои протективные функции и защищают клетки от гибели. В связи с этим очевидно, что наряду с внутриклеточными и поверхностными БТШ, внеклеточная форма этих протеинов также может оказывать влияние на функционирование иммунной системы. В настоящее время интенсивно изучается иммуномодулирующее действие экзогенных БТШ в связи с обнаружением у этих протеинов уникальных адъювантных и иммуностимулирующих свойств. Установлено, что один из механизмов иммуномодулирующих эффектов внеклеточных БТШ связан с активацией этими молекулами антигенпредставляющих клеток. В то же время, анализ описанных эффектов БТШ указывает на то, что зарегистрированные иммуномодулирующие свойства экзогенных БТШ могут быть связаны с действием этих протеинов не только па антигенпредставляющие клетки, но и на популяции лимфоцитов. Таким образом, накопленные в последнее время данные свидетельствуют о том, что молекулы БТШ участвуют во многих иммунных процессах, связанных с функционированием популяций иммунокомпетентных клеток разных типов. Однако в настоящее время эта тематика остается малоизученной. В настоящей работе были проведены исследования иммуномодулирующих эффектов БТШ, реализующихся на уровне популяций клеток иммунной системы. Основное внимание уделялось главному представителю большого семейства БТШ, протеинам с молекулярной массой 70 кДа (БТШ70).

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью работы является исследование иммуномодулирующих функций основного представителя семейства белков теплового шока - БТШ70; анализ зависимости экспрессии БТШ70 клетками иммунной системы от стрессирующих факторов, в частности в модели окислительного стресса; изучение влияния БТШ70 на продукцию перекисных форм кислорода иммунокомпетентными клетками в процессе «кислородного взрыва».

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Получение высокоочищенных охарактеризованных препаратов БТШ70 для их последующего использования в экспериментах с экзогенными БТШ70.

2. Исследование влияния различных стрессирующих факторов на экспрессию БТШ70 лимфоидными клетками.

3. Анализ взаимосвязи окислительного стресса с экспрессией БТШ70 лимфоидными клетками

4. Анализ взаимосвязи процесса «кислородного взрыва» с экспрессией БТШ70 у клеток лимфоидных тканей мыши и у фагоцитов периферической крови человека.

5. Анализ модуляции «кислородного взрыва» экзогенными БТШ70.

6. Поиск подходов к использованию продуцируемых лимфоидными клетками БТШ70 в противоопухолевой терапии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Все основные результаты данного исследования обладают высокой степенью научной новизны. В частности, впервые было охарактеризовано модулирующее действие экзогенных БТШ70 па продукцию активных форм кислорода различными клетками иммунной системы. Высокой степенью новизны обладают также зарегистрированное действие гормонов стресса на экспрессию БТШ70 и продукцию АФК клетками лимфоидных органов. Впервые описаны эффекты поликатионов, связанные с влиянием на синтез БТШ и продукцию АФК в лимфоидных клетках. К результатам особой новизны можно отнести обнаруженный феномен снижения содержания БТШ70 в клетках иммунной системы на начальном этапе их реакции на I различные стрессирующие факторы. Новизной обладают также результаты, свидетельствующие о возможности использования секретируемых опухолевыми клетками БТШ70 для создания противоопухолевых вакцин. s

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Белки теплового шока обладают уникальными иммуностимулирующими и адъювантными свойствами, которые позволяют создавать на основе БТШ эффективные противоопухолевые и противоинфекционные вакцины. Кроме этого, иммунизация экспериментальных животных препаратами БТШ позволяет предотвратить патологические аутоиммунные реакции. Известно также, что появление в сыворотке крови БТШ и антител к ним является характерным диагностическим признаком определенных этапов развития ряда патологий. Все это свидетельствует о значительных потенциальных возможностях применения БТШ в клинической практике. Очевидно, что для реализации таких возможностей необходимо изучение процессов взаимодействия БТШ с иммунной системой. Исходя из этого, данная работа, посвященная исследованию иммуномодулирующих эффектов БТШ, обладает существенной практической значимостью. Можно предположить, что направленный контроль экзоцитоза БТШ лимфоидными клетками может служить основой для разработки нового подхода к проблеме иммунорегуляции. В то же время, обнаруженные корреляции между продукцией перекисных форм кислорода и экспрессией БТШ у иммунокомпетентных клеток открывают новые возможности для терапевтического вмешательства в воспалительные процессы.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации были представлены на XIV зимней международная научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002), на шестой международной иммунологической летней школе им. Дж. Хэмфри (Пущино, 2002), на VI чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва - Пущино, 2002), на шестой научной конференции с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2002), на 7-ом региональном конгрессе Азии/Океании по геронтологии (Токио, 2003), на Всероссийской конференции «Человек и лекарство» (Москва, 2004), на VIII Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург 2004), на XVII зимней молодежной научной школе "Переспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2005).

ПУБЛИКАЦИИ По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы (глава 1, 2, 3, 4 и 5), материалов и методов (глава 6), результатов исследований и обсуждения (глава 7), выводов и списка литературы. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста, содержит 29 рисунков, 2 таблицы. Список литературы включает 208 источник, из которых 204 иностранных.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Выводы

1. Экзогенные БТШ70 обладают модулирующим действием на продукцию АФК клетками иммунной системы. В модели «кислородного взрыва» при воздействии опсонизированного зимозана па человеческие лейкоциты, экзогенные БТШ70 существенно снижают амплитуду дыхательного взрыва. Гипертермическая активация генов БТШ70 (тепловой шок) также снижает амплитуду «кислородного взрыва».

2. «Кислородный взрыв», индуцированный ЛПС и ФМА в клетках костного мозга вызывает увеличение экспрессии БТШ70 через 4-24 часа. В более ранний период - через 30-60 минут от начала «кислородного взрыва» уровень БТШ70 в клетке падает.

3. Гормоны стресса влияют на аплитуду «дыхательного взрыва» и экспрессию БТШ70 в иммунокомпетептпых клетках. Адреналин угнетает продукцию АФК. При этом, внутриклеточная экспрессия БТШ70 вначале (1 час) надает, а на более поздних сроках (4-21 час) возрастает. Дексаметазон в этой же модели пе оказывает влияния на уровень внутриклеточных перекисных форм кислорода, но ингибирует синтез БТШ70.

4. Воздействие на лейкоциты периферической крови человека стафилококками также приводит к падению на начальной фазе ответа внутриклеточного содержания БТШ70, сопровождающего рост продукции АФК.

5. В ходе старения в человеческих лейкоцитах возрастает уровень внутриклеточных АФК и уменьшается внутриклеточная экспрессия БТШ70.

6. Поликатионы стимулируют синтез внутриклеточных АФК и снижают содержание БТШ70 в клетках костного мозга.

7. БТШ70, секретируемые опухолевыми клетками, демонстрируют противоопухолевую активность, что свидетельствует о возможности создания на их основе противоопухолевых вакцин.