Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Продукция и эффекты внеклеточных БТШ70 в популяциях иммунокомпетентных клеток

□034 73113

На правах рукописи

Алекперов Эмин Акифович

ПРОДУКЦИЯ И ЭФФЕКТЫ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ БТШ70 В ПОПУЛЯЦИЯХ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК

14.00.36 - аллергология и иммунология

- 8 ОН Г 2009

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2009

003479113

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор A.M. Сапожников

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор H.A. Константинова

доктор медицинских наук, И. В. Лядова

Ведущая организация: ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Защита состоится_ 2009 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.072.05 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1.

Автореферат разослан « »_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук, доцент Т.Е. Кузнецова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Белками теплового шока (БТШ) называют обширную группу клеточных протеинов, синтез которых значительно возрастает при клеточном стрессе. БТШ присутствуют во всех клетках и организмах, изученных на сегодняшний день, и обладают очень высоким уровнем гомологии в широком спектре охарактеризованных организмов, что свидетельствует о консервативности этих протеинов. Наряду с консервативностью структуры БТШ, разнообразие стрессирующих факторов, вызывающих индукцию экспрессии белков теплового шока, говорит об универсальности этого клеточного ответа на стресс. Важно отметить, что БТШ присутствуют в клетках, как в условиях стресса, так и в нормальных физиологических условиях, участвуя во многих внутриклеточных процессах. Длительное время считалось, что БТШ являются только внутриклеточными протеинами. Этому представлению соответствовало отсутствие в структуре молекул БТШ сигнальной последовательности необходимой для их секреции по классическому пути. Однако в дальнейшем присутствие БТШ было обнаружено в культуральной жидкости различных клеточных линий, а также в сыворотке крови ряда млекопитающих. Кроме того, появились данные об альтернативных путях высвобождения белков из клеток разных типов. Изучение возможных функций внеклеточных форм БТШ показало, что эти протеины обладают уникальными иммуномодулирующими свойствами. Использование препаратов БТШ в экспериментальных моделях позволяет направленно и эффективно усиливать иммунный ответ на опухолевые антигены и различные патогены, или наоборот, подавлять нежелательные аутоиммунные реакции. Известно также, что экзогенные БТШ способны взаимодействовать с клеточной поверхностью и проникать в клетки. Причем интернализованные БТШ сохраняют свои протективные функции и защищают клетки от гибели. В связи с этим очевидно, что наряду с внутриклеточными БТШ, внеклеточная форма этих протеинов также может оказывать влияние на функционирование организма. В настоящее время причины и механизмы продукции БТШ в межклеточное пространство практически не изучены. Очень мало известно и о механизмах иммуномодулирующих эффектов внеклеточной формы БТШ.

Цель исследования. Целью данной работы является анализ характеристик и механизмов формирования внеклеточного пула БТШ с молекулярной массой 70 кДа (БТШ70) в популяциях лимфоидных клеток и исследование иммуномодулирующих эффектов внеклеточных БТШ70.

Задачи исследования. (1) Изучение феномена и характеристик продукции внеклеточных БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток различного типа. (2) Анализ механизмов экзоцитоза БТШ70 лимфоидными клетками. (3) Исследование влияния процесса апоптоза лимфоидных клеток на формирование внеклеточного пула БТШ70. (4) Изучение влияние стрессирующих факторов на экзоцитоз БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток. (5) Анализ иммуномодулирующих эффектов внеклеточного пула БТШ70.

Научная новизна. Проблема взаимодействия БТШ70 с иммунной системой привлекает интерес исследователей более двух десятилетий. Однако к настоящему времени достаточно полно охарактеризована лишь роль эндогенных и экзогенных БТШ70 в функционировании антигенпредставляющих клеток. В отличие от этого вовлеченность внеклеточных БТШ70 в процессы, протекающие в популяциях лимфоидных клеток, находится на самой начальной стадии изучения. К наименее охарактеризованным относятся вопросы, связанные с механизмами формирования внеклеточного пула БТШ70 в популяциях лимфоцитов. Поэтому все основные результаты данного исследования обладают высокой степенью научной новизны. В частности, был осуществлён комплексный анализ механизмов секреции БТШ70 для клеток лимфоидного происхождения: было охарактеризовано влияние ингибиторов аппарат Гольджи-зависимой секреции протеинов на экзоцитоз БТШ70, а также ингибиторов эндолизосомального и рафт-зависимого путей экзоцитоза. Была проверена возможность высвобождения данного протеина в составе экзосом. Впервые было продемонстрировано, что апоптоз лимфоидных клеток сопровождается увеличением пула внеклеточной формы БТШ70. Кроме того, был выявлен парадоксальный эффект снижения концентрации внутриклеточных БТШ70 на начальных этапах реакции лимфоцитов на стрессирующие воздействия, что указывает на ранее неохарактеризованный стресс-индуцированный выброс цитоплазматических БТШ70 в окружающую среду.

Практическая значимость. Белки теплового шока обладают уникальными иммуностимулирующими и адъювантными свойствами, которые позволяют создавать на основе БТШ эффективные противоопухолевые и противоинфекционные вакцины. В настоящее время проводятся клинические испытания некоторых разновидностей таких вакцин. В то же время, иммунизация экспериментальных животных препаратами БТШ70 позволяет предотвратить патологические аутоиммунные реакции. Известно также, что появление в сыворотке крови БТШ70 и антител к ним является характерным диагностическим признаком определенных этапов развития ряда патологий. Все это свидетельствует о значительных потенциальных возможностях применения БТШ70 в клинической практике. Очевидно, что для реализации таких возможностей необходимо изучение процессов формирования внеклеточной формы данных протеинов и механизмов их взаимодействия с иммунной системой. Исходя из этого, данная работа, посвященная исследованию явления экзоцитоза БТШ70 и роли их внеклеточной формы в функционировании лимфоидных клеток, обладает существенной практической значимостью. Значительный интерес для возможного практического применения имеют полученные в работе данные о секреции БТШ70 лимфоцитами. Они проливают свет на источник циркулирующего в организме сывороточного пула БТШ70, обладающего выраженным влиянием на развитие иммунных реакций. Можно предположить, что направленный контроль экзоцитоза БТШ70 лимфоидными клетками может служить основой для разработки нового подхода к проблеме иммунорегуляции. Кроме того, полученные результаты свидетельствуют об информативности анализа уровня циркулирующей внеклеточной формы БТШ70 в качестве дополнительной физиологической характеристики организма и, в частности, иммунной системы.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на 17-ой - 20-ой международных зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005-2008); на седьмой и восьмой международной иммунологической летней школе им. Дж. Хэмфри (Москва, 2005, 2007); на десятой и одиннадцатой научных конференциях с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006, 2007); на конференции - VIII чтения, посвященные памяти акад. Ю.А.Овчинникова (Москва, 2006); на 5-ом международном конгрессе по аутоиммунитету (Италия, 2006); на

втором мировом конгрессе по стрессу (Венгрия, 2007); на 51-ой научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» (Москва, 2008); на 2-ой международной конференции «Современные информационные и телемедицинские технологии для здравоохранения» (Минск, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы (главы 1, 2, 3, 4, 5 и 6), экспериментальной части (главы 7 и 8), выводов и списка литературы. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков, 3 таблицы. Список литературы включает 132 источника, из которых 127 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Жнвотные. В экспериментах использовали самок мышей инбредных линий C57BL/6, СВА и Balb/c, полученных из питомника экспериментальных животных "Столбовая" в возрасте 8-12 недель и исходной массой 18-20 грамм.

Клеточные линии. В работе использовались следующие клеточные линии: EL-4, CTLL-2, Daudi. Клетки линии EL-4 культивировались в 6- и 24-луночных планшетах ("Nunk", США), а также в культуральных флаконах (50 см2, 200 см2 и 600 см2 фирмы "Costar", США) в питательной среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной сыворотки (FCS), 20 mM HEPES, 0,2% NaHC03, 50 мкг/мл гентамицина (все фирмы "Sigma", США) в 5% С02 при 37°С. Исходная концентрация для них составляла 2х105 кл./мл, пересев проводили через 2 суток, при этом клетки нарастали до 1-1,5х10б/мл. Клетки линии-Daudi вели в культуральных флаконах (50 см2 и 200 см2 "Costar", США) в питательной среде RPMI 1640, содержащей 10% FCS, 1 мМ пирувата натрия, 20 mM HEPES, 0,2% NaHC03, 50 мкг/мл гентамицина (все фирмы "Sigma", США) в 5% СОг при 37°С. Исходная концентрация для них составляла 1,5-2х105 кл./мл, пересев проводили через 3 суток, при этом клетки нарастали до 1-1,5х106/мл. Клетки линии CTLL-2 вели в культуральных флаконах (50 см2 и 200 см2 "Costar", США) в питательной среде RPMI 1640, содержащей 10% FCS, 100 ед/мл ИЛ-2, 10 мкМ Р-меркаптоэтанола, 20 mM HEPES, 0,2% NaHC03, 50 мкг/мл

гентамицина (все фирмы "Sigma", США) в 5% С02 при 37°С. Исходная концентрация для них составляла 2х105 кл./мл, пересев проводили через 3 суток, при этом клетки нарастали до 1-1,5х106/мл. Определение количества и жизнеспособности клеток проводилось с помощью гемоцитометра с использованием витального красителя трипанового синего.

Приготовление клеточных суспензий. Суспензии клеток лимфоидных органов получали общепринятым способом от мышей, забитых методом цервикальной дислокации. Суспензии готовили на полной питательной среде. Полученные суспензии клеток фильтровали через металлическое ситечко из нержавеющей стали для удаления агрегатов клеток. Для удаления эритроцитов производили гемолиз: исходную суспензию переводили в осадок (4°С, 200 g, 10 мин), затем клетки ресуспендировали в 5 мл раствора Бройля (на 100 мл дистиллированной воды 0,83 г. NH4C1 и доводили рН до 7,2 трис-оксиметил-аминометаном). Через 5 минут доводили объем до 10 мл полной средой и центрифугировали при комнатной температуре 7 мин. После этого проводили трёхкратную отмывку клеток описанным выше способом и использовали в дальнейшем согласно схемам экспериментов.

Получение митоген-активированных Т-лимфоцитов. В ряде экспериментов клетки тимуса и селезенки активировали с помощью КонА ("Sigma", США) с целью получения активированных Т-лимфоцитов (КонА-бласты). Активирование проводилось в течение 48-72 часов при концентрации КонА 2,5 мкг/мл. После активации клетки отмывались с помощью а-метилмонозида для элиминации КонА. Для дальнейшего культивирования клеток применяли полную питательную среду (ППС): RPMI 1640, содержащую 10% FCS, 2 мМ L-глутамина, 20 mM HEPES, 0,2% NaHC03, 50 мкг/мл гентамицина (все фирмы "Sigma", США). Определение количества клеток и их жизнеспособности определяли с использованием гемоцитометра и трипанового синего. Популяцию периодически обогащали живыми клетками, пропуская через градиент фиколла, таким образом, освобождаясь от некротических и апоптозных клеток. Для получения кондиционированного супернатанта активированных Т-лимфоцитов использовали 10 дневную культуру Т-бластов. Клетки после двух отмывок в фосфатном буфере инкубировались при концентрации 5х106/мл в бессывороточной среде RPMI 1640 24 часа.

Анализ содержания БТШ70 в супепнатанте клеток. Супернатант для анализа получали после культивирования клеток EL-4, Daudi, CTLL-2 и КонА-активированных Т-лимфоцитов при начальной концентрации 106/мл в RPMI 1640 без сыворотки. Время эксперимента менялось в зависимости от задач, но было не менее 2 и не более 24 часов. Ингибиторы секреции белков вносились в клеточную культуру на стадии замены полной питательной среды ее бессывороточным аналогом. Количество апоптозных и некрозных клеток после инкубирования в бессывороточной среде с ингибиторами и без не отличалось от стандартных условий культивирования. Образцы супернатанта дополнительно очищали от дебриса путем центрифугирования при lOxlO3 g. Затем супернатант диализировали против дистиллированной воды (рН 9) в течение ночи при температуре +4°С, измеряли концентрацию белка и образцы лиофилизировали. Полученные образцы концентрированного супернатанта использовали для Вестерн-блот анализа в количестве 10-50 мкг на дорожку. Вестерн-блот-анализ проводили по стандартной методике.

Цитофлуорометрический анализ апоптоза. Цитофлуорометрическая регистрация процентного содержания апоптозных клеток в образцах лимфоцитов проводилась с помощью анализа внутриклеточного содержания ДНК с использованием ДНК-специфичного флуоресцентного красителя пропидийиодида (PI). Для этого образцы фиксировались в охлажденном 70% растворе этанола (30-60 мин), с последующим двукратным отмыванием, и переводились для измерения в. раствор PBS, содержащий 1 мкг/мл PI и 50 ед/мл РНК-азы А (все фирмы "Sigma", США). Такая обработка клеток приводила к нивелированию морфологических различий между пулами живых и апоптозных клеток, поэтому подсчет количества клеток, анализируемых в одном образце (не менее 5х103), проводился по всей популяции, включающей как живые, так и погибшие клетки.

Измерение внутриклеточного уровня АФК. Для определения количества перекисных форм кислорода внутри клетки использовали 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (С-400, "Molecular probes", США). Клетки с 10 мкМ С-400 инкубировались при 37°С 20 минут, затем образцы анализировались на проточном цитофлуориметре (EPICS XL, "Coulter Corporation", США).

Выделение БТШ70 с помощью аффинной хроматографии. В работе использовался стандартно используемый протокол с незначительными

модификациями. Колонка с АТФ-агарозой ("Sigma", США) перед опытом последовательно промывалась 1 М NaCl, далее 5 мМ АТФ в растворе А (20-25 шМ Tris-HCl, 1 шМ MgCl2, рН 7,5) и затем раствором А без АТФ. В анализируемую пробу белка добавляли Tris-HCl до 20-25 мМ, Тритон Х-100 до 0,1%, MgCl2 до 1 мМ, рН 7,5. После двукратного пропускания белкового раствора через колонку и инкубации колонки с белковым раствором в течение 20-40 минут при комнатной температуре для более эффективного связывания, колонку промывали раствором А, содержащим 0,1% Тритона Х-100 (2 объема колонки). Далее колонку промывали раствором А (3-4 объемами) и двумя объемами раствора А, дополненным 0,5М NaCl. Затем, после промывания 1 объемом раствора А для удаления избытков соли, производили элюцию БТШ70 раствором А (2-5 объемов колонки), содержащем 5 мМ АТФ. На каждом этапе выход количества белка контролировали по оптическому поглощению образца на длине волны 280 нм.

Экзогенные БТШ. В экспериментах по изучению взаимодействия экзогенного пула БТШ70 с клеточной поверхностью использовалась биотинилированная форма рекомбинантного БТШ70 (рБТШ70) человека ("StressGen", Канада). Клетки (концентрация 500х103 на образец) инкубировались в PBS, содержащем 2% FCS и 10 мкг/мл биотинилированных рБТШ70, при 4°С в течение 15, 30 и 60 минут в присутствии 0,05% азида натрия для ингибирования всех АТФ зависимых процессов и предотвращения эндоцитоза. Для оценки интенсивности процесса интернализации экзогенных БТШ70 клетки инкубировались в ППС, дополненной 5% FCS и содержащей 10 мкг/мл биотинилированного белка, в стандартных условиях при 37°С и 5% С02 в течение 3-4 часов. Далее, после двукратной отмывки для удаления несвязавшегося реагента, клетки окрашивались в течение 30 минут конъюгатом стрептовидин-ФИТЦ. Количественную оценку уровня связывания и интернализации БТШ70 проводили методом проточной цитофлуориметрии. При проверке протективных свойств экзогенного пула БТШ70 использовался рекомбинантный белок ("StressGen", Канада) в диапазоне концентраций от 1 до 10 мкг/мл.

Цнтофлуопиметпический анализ морфологии клеток и экспрессии белков теплового шока. Анализ морфологических характеристик клеток (размер - переднее малоугловое светорассеяние - FS, гранулярность - боковое светорассеяние - SS) и уровня экспрессии БТШ70 проводился на приборе EPICS XL (Coulter Coiporation,

США). Окрашивание образцов проводилось по стандартной методике. Эта процедура включала перевод клеток из питательной среды в PBS, содержащий 0,05% NaN3 и 1% FCS, инкубацию клеточной суспензии с первыми антителами (30-60 минут при +4°С). Затем клетки дважды отмывали и инкубировали со вторыми, флуоресцентно меченными антителами (20-40 мин.), после чего проводили заключительную двукратную отмывку и измерение образцов. Оценку внутриклеточного содержания БТШ70 проводили после префиксации клеток 2% раствором параформальдегида в присутствии 0,5% Тритона Х-100 в течение 30 минут при комнатной температуре и последующего окрашивания антителами с использованием PBS, дополненным \% FCS и 0,1% Тритона Х-100. Анализ распределения клеток по интенсивности флуоресценции проводился после измерения в каждом образце не менее 5х103 клеток в "окне", соответствующем по характеристикам светорассеяния жизнеспособным клеткам. Уровень экспрессии оценивали по изменению средней интенсивности флуоресценции (Mean) клеток в образцах, обработанных антителами к соответствующему антигену по сравнению со свечением контрольных клеток (обработанных контрольными антителами, соответствующего изотипа и концентрации, не обладающими специфичностью в отношении исследуемых протеинов). Относительный уровень экспрессии вычисляли по формуле: Mean (опыт) - Mean (контроль).

Моноклональные антитела. В исследованиях использовались моноклональные антитела к БТШ70 фирмы "Sigma" (клон BRM-22, специфичный как к конститутивным, так и индуцируемым БТШ70) и фирмы "StressGen" к конститутивной (клон SPA815) и индуцируемой (клон SPA810) формам БТШ70. В некоторых экспериментах в качестве контрольных использовались моноклональные антитела к Р-актину (клон АС-15, "Sigma"). В качестве вторых антител использовались Fab фрагменты кроличьих антител aHTH-IgG-мыши, конъюгированные с ФИТЦ или с R-фикоэритрином (оба фирмы "Sigma"). Кроме того, для сканирующей конфокальной микроскопии с качестве вторых антител использовались овечьи антитела aHTH-IgG-мыши с флуорохромом Alexa Fluor 488 ("Invitrogen", США).

Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия Клетки окрашивали по стандартной методике с использованием PI и вторых антител, конъюгированных с

флуорохромом Alexa Fluor 488. Затем суспензию клеток в капле специальной полимеризующейся гелеобразной среды, сохраняющей морфологию клеток и предохраняющей флуорохром от выгорания ("Biomeda", США) наносили на предметное стекло, накрывали покровным стеклом и оставляли в темноте до проведения анализа. Анализ приготовленных препаратов проводился на сканирующем конфокальном микроскопе Nikon Eclipse ТЕ2000 ("Nikon Corporation", Япония). Для возбуждения красителей использовались лазеры, излучающие на длинах волн 488 нм и 543 нм. Анализ флюоресценции проводился с помощью детекторов на 515/30 нм и 605/75 нм. Обработка результатов осуществлялась в программе EZ-C1 FreeViewer ("Nikon Corporation", Япония).

Выделение экзосом. Экзосомы выделяли из кондиционированного супернатанта, полученного после стандартного культивирования клеток EL-4 и Daudi при начальной концентрации 106/мл в течение 24-48 часов. При этом полная питательная среда, используемая для культивирования, предварительно освобождалась от экзосом (с помощью процедур центрифугирования, описанных ниже), которые могли в неё попасть из фетальной сыворотки. Для выделения экзосом супернатант последовательно центрифугировали при 200 g (10 минут) и 20x10* g (30 минут). На этих этапах осадок выбрасывался. Экзосомы получали при центрифугировании супернатанта на 100x103 g (60-90 минут). Осадок, содержащий экзосомы, отмывали 2 раза в большом объеме PBS, осаждали и ресуспендировали в 50-200 мкл PBS содержащем 0,05% NaN3. Выделение проводилось на ультрацентрифуге L8-80M на роторах SW28 или SW50.1 ("Beckman Coulter Inc.", США) в зависимости от объёмов образца.

Статистическая обработка экспериментальных данных. Статистический анализ проводился с использованием t-критерия Стьюдента, с помощью встроенного пакета статистических программ "WinMDI" и "Elite" для обработки полученных гистограмм. Значения стандартных ошибок (SE) вычислялись по формуле: SE = SD / -¡N , где N - число событий в данной статистической выборке.

и

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Присутствие БТШ70 в супериатанте культур различных клеточных линий

В первой серии экспериментов было проведено тестирование присутствия БТШ70 в образцах кондиционированного супернатанта, полученных из культур клеток лимфом EL-4, CTLL-2 и Daudi. Проверка показала, что 24 часовая инкубация EL-4 в плотном клеточном монослое, обеспечивающем себя аутокринными факторами выживания и роста, в отсутствии фетальной сыворотки не приводила к снижению жизнеспособности клеток. Т.е. данные условия не вызывали появления примеси некротических клеток, высвобождение содержимого которых могло бы исказить результаты тестирования. Аналогичные результаты были получены и для клеток линий Daudi и CTLL-2.

Вестерн-блот анализ содержания БТШ70 обнаружил присутствие этих протеинов (рис. 1) в кондиционированном супериатанте всех проверенных культур. В экспериментах с клетками линии CTLL-2 было обнаружено очень низкое содержание БТШ70 по сравнению с двумя другими линиями. Во всех случаях появление белков БТШ70 во внеклеточном пространстве нельзя объяснить выходом из разрушенных клеток, т.к. окрашивание образцов антителами клона АС-15 ("Sigma", США) не выявило р-актина, широко используемого в качестве маркера некроза (что подтвердилось в нашем положительном контроле некроза).

К+ CTLL-2 Daudi EL-4

БТШ70 - тшт

(i-актин Щ0Ш

Рис. 1. Результаты иммуноблоттинга образцов кондиционированного супернатанта культуры клеток EL-4, Daudi и CTLL-2 для определения содержания БТШ70. К+ - положительный контроль (лизат клеток линии EL-4) Представлены репрезентативные результаты серии из 3-х экспериментов.

Анализ состава секретируемого БТШ70, проведенного с использованием

моноклональных антител к индуцируемой и конститутивной формам этого протеина,

позволил установить, что основной составляющей внеклеточного пула БТШ70 в

наших моделях является конститутивная изоформа данного протеина. Этот факт

12

представляет несомненный интерес, поскольку в литературе присутствуют сведения лишь о содержании индуцируемой формы БТШ70 в супернатанте клеточных культур и в циркулирующем сывороточном пуле данного протеина. Полученные результаты позволяют предположить, что экзоцитоз БТШ70 в сообществах лимфоидных клеток является нормальным физиологическим процессом, протекающим в том числе в отсутствии стресса или гибели клеток.

2,5

о 2

1

•i 1,5

S

£ ¡3 1

о

о ^ 0.5

О

CTLL-2 Daudi EL-4

Рис. 2. Результаты определения скорости продукции БТШ70 клетками линий EL-4, Daudi и CTLL-2. Белок выделялся с помощью АТФ-агарозы, а его концентрация определялась с помощью Bio-Rad Protein Assay ("Bio-Rad", США).

Внеклеточный пул БТШ70 в культуре КонА-активированных Т-лнмфоцитов

мыши

Большинство существующих фактов, подтверждающих явление секреции БТШ70, было получено в экспериментах с опухолевыми линиями клеток. Мы предположили, что внеклеточные БТШ70 продуцируются не только опухолевыми лимфоидными клетками, но и нетрансформированными активированными лимфоцитами. Для экспериментальной проверки данного предположения в нашей работе была использована 10 дневная культура КонА-активированных Т-лимфоцитов селезенки мыши.

Электрофорез в ПААГ обнаруживал в приготовленных образцах мажорную фракцию с молекулярной массой около 70 кДа (рис. 3, А), а Вестерн-блот достоверно выявлял присутствие в ней БТШ70 (рис. 3, Б). Важно отметить, что присутствие в супернатанте БТШ70 не было обусловлено артефактом - пассивным выходом этих внутриклеточных протеинов из возможной примеси разрушенных некротических

клеток. Это можно видеть из сравнения электрофореграммы клеточного лизата и супернатанта.

205 кДа

116 «Да

97,4 кДа

66 кДа 45 кДа 29 кДа

Рис. 3. Результаты Вестерн-блот анализа содержания БТШ70 в образцах супернатанта культуры активированных Т-лимфоцитов мыши. А - маркеры молекулярной массы. Б - электрофорез образца супернатанта. В - окрашивание блота фракции 70 кДа из образца супернатанта моноклональными антителами к БТШ70. Г -электрофорез надосадка суспензии активированных Т-лимфоцитов, разрушенных замораживанием-оттаиванием.

Влияние ингибиторов классического экзоцитоза протеинов на интенсивность секреции БТШ70 в культуре клеток лимфомы ЕЬ-4

В следующей серии экспериментов была проведена проверка влияния ингибиторов классического пути секреции, моненсина и брефелдина А, на содержание внеклеточных БТШ70 в супернатанте культуры клеток лимфомы ЕЬ-4 с помощью Вестерн-блот анализа. Оказалось, что в нашей модели они не только не препятствовали экзоцитозу БТШ70 клетками ЕЬ-4, но и в случае брефелдина А значительно стимулировали этот процесс (рис. 4). Эти данные свидетельствуют, прежде всего, о неклассическом, аппарат Гольджи-независимом пути экзоцитоза БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток. В то же время, факт усиления интенсивности секреции БТШ70 под действием использованных ингибиторов может быть связан с индуцированным этим воздействием клеточным стрессом. Действительно, блокирование транспорта белков от ЭПР к аппарату Гольджи, которое осуществляет брефелдин А, прекращает помимо экзоцитоза доставку протеинов в различные органеллы, что несомненно может инициировать ответную

реакцию клеточного сообщества, включающую выброс БТШ70 во внеклеточное пространство для помощи наиболее пострадавшим клеткам. В случае же моненсина блокируется не весь внутриклеточный белковый транспорт, а только экзоцитоз и перенос протеинов на клеточную поверхность, что является менее повреждающим воздействием, объясняющим не столь выраженное усиление секреции БТШ70 в нашей модели, по сравнению с брефелдином А.

3

н ш о

о Ц

О I

о 5;

5 £

о еа

0) 5

3,5 3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

1

1

т

-1 —

3 о х н О

«Г

ч1

Рис. 4. Вестерн-блот анализ содержания внеклеточных БТШ70 в супернатанте культуры клеток лимфомы ЕЬ-4, проинкубированных 24 часа. Контроль -супернатант клеточной культуры, проинкубированной без добавления ингибиторов секреции.

Участие липидных рафтов в экзоцитозе БТШ70

Литературные и полученные нами данные указывают на локализацию БТШ70

на клеточной поверхности. Поэтому в качестве одного из возможных неклассических

механизмов экзоцитоза нами был проверен путь, связанный с липидными рафтами

плазматических мембран. Для анализа указанного пути секреции БТШ70 мы

использовали метод разрушения рафтов с применением метил-Р-циклодекстрин

(который разрушает рафты, вымывая из них холестерин) в концентрации 10 мМ.

Результаты Вестерн-блот анализа образцов супернатанта свидетельствовали, что

происходит незначительное, но достоверное увеличении концентрации БТШ70 в

культуральной среде. Оказалось, что в нашей модели метил-|3-циклодекстрин не

только не препятствовал экзоцитозу БТШ70 в культуре клеток ЕЬ-4, но и

15

стимулировал этот процесс (рис. 4). Таким образом, полученные результаты продемонстрировали, что ассоциация БТШ70 с липидпыми рафтами, зарегистрированная и описанная целым рядом исследователей, не связана с механизмами экзоцитоза данных протеинов в популяциях лимфоидных клеток.

Возможность экзоцитоза БТШ70 через эндолизосомальный путь

В ряде работ, для некоторых типов клеток нелимфоидного типа была продемонстрирована возможность секреции БТШ70 через эндолизосомальный путь. С целью проверки такого механизма секреции БТШ70 в популяциях лимфоцитов, мы блокировали указанный путь экзоцитоза протеинов в культуре клеток линии EL-4 с помощью 4,4'-diisothiocyanostilbene-2,2'-disulphonic acid (DIDS), который является специфическим ингибитором хлорных каналов.

В проведенных экспериментах мы не наблюдали какого-либо достоверного влияния DIDS на концентрацию внеклеточной формы БТШ70 в используемой модели (рис. 5). Следовательно, в культуре клеток линии EL-4 выход этих белков в межклеточное пространство осуществляется в обход эндолизосомального пути.

1

т 111 1фл

контроль DIDS

Рис. 5. Вестерн-блот анализ содержания внеклеточных БТШ70 в супернатанте культуры клеток лимфомы ЕЬ-4, проинкубированных 24 часа в присутствии рабочей дозы ингибитора эндолизосомально пути секреции протеинов (БГОЗ). Контроль -супернатант клеточной культуры, проинкубированной без добавления ОНЖ

Анализ экзосом, выделенных из супернатанта культуры клеток ЕЬ-4

В настоящее время в литературе существуют достоверные данные о

высвобождении БТШ70 в окружающую среду клетками различных типов в составе

16

продуцируемых ими экзосом. В связи с этим, мы проверили возможность такого пути экзоцитоза БТШ70 для клеток линии ЕЬ-4. Экзосомы выделялись в соответствии с описанной ранее методикой. Анализ полученных образцов проводился с помощью Вестерн-блотинга.

Проведенный Вестерн-блот анализ образцов выделенных экзосом отчетливо выявил содержание в них БТШ70 (рис. 6). Таким образом, продукция экзосом является одним из механизмов выхода данного протеина во внеклеточное пространство в культуре лимфоидных клеток.

А Б В Г Д

180 кДа * ,, _

ЩЯ

94 кДа мр '

67 кДа ¡у§

43 кДа

Рис. 6. Электрофорез (А-В) в ПААГ и иммуноблотинг (Г, Д) препарата экзосом, выделенных из кондиционированной питательной среды культуры клеток ЕЬ-4. А - маркер молекулярных масс. Б - лизат клеток линии ЕЬ-4, полученный замораживание и оттаиванием. В - экзосомы, выделенные из супернтанта культуры клеток ЕЬ-4. Г - положительный контроль на присутствие БТШ70, в качестве которого использовался лизат клеточной массы лимфомы ЕЬ-4. Д - экзосомы.

Процесс апоптоза и секреция БТШ70

Хорошо известно, что жизнедеятельность любых клеточных сообществ, в том числе и лимфоидных тканей, сопровождается программированной клеточной гибелью определенной части популяции, т.е. процессом апоптоза. Учитывая это обстоятельство и полученные ранее в нашей лаборатории данные, указывающие на существовании взаимосвязи апоптоза лимфоцитов с интенсивностью экзоцитоза БТШ70, мы проанализировали влияние процесса спонтанного апоптоза на формирование внеклеточного пула БТШ70 в модели культуры клеток ЕЬ-4.

С этой целью мы провели исследование взаимосвязи между содержанием апоптозных клеток и концентрацией внеклеточного пула БТШ70 в образцах культуры клеток ЕЬ-4, полученных после различных сроков их инкубации, характеризующихся

разным соотношением живых и погибших клеток. Полученные данные свидетельствовали о том, что в используемой модели существует прямая корреляция между интенсивностью программированной клеточной гибели и размером внеклеточного пула БТШ70 (рис 7).

о о

X

ш

О X

<и н

X

<и

X

(Ц

3 о

X

ь О

2,5 2 1,5 1

0,5 О

Я2 = 0,9783 ^

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Доля апоптозных клеток, %

Рис. 7. Зависимость концентрации внеклеточных БТШ70 в культуральной жидкости от доли апоптозных клеток в культуре лимфомы ЕЬ-4. Клетки культивировались в плотном клеточном монослое в бессывороточной среде.

Установленная закономерность явилась основой для построения математической модели взаимосвязи процесса апоптоза и формированием внеклеточного пула БТШ70. При создании алгоритма данной модели мы исходили из двух очевидных начальных условий: (1) в стационарных условиях эксперимента скорость пролиферации клеток значительно выше скорости их гибели (что соответствует росту клеточной популяции); (2) в стационарных условиях эксперимента, в культуре клеток, существует динамическое равновесие между продукцией внеклеточной формы БТШ70 и потреблением (интернализацией) этого протеина.

Первому начальному условию соответствует следующее уравнение:

с1С

<11

— р ССС1 где постоянная составляющая скорости ухода клеток в

апоптоз, Р - константа скорости уменьшения доли апоптозных клеток. Решая данное уравнение, мы получим следующий результат: С = 0>е

А

а

Для математической формализации второго начального условия мы, на основании экспериментальных данных (рис. 7), определяем скорость выхода БТШ70 в межклеточное пространство в прямопропорциональной зависимости от содержания в культуре апоптозных клеток. При этом скорость интернализации БТШ70 мы, по очевидным соображениям, принимаем пропорциональной концентрации внеклеточной формы белка. В итоге, если обозначить концентрацию БТШ70 в культуральной жидкости, как А?, мы приходим к следующему уравнению:

— = те-т

(Ц ГДе ^ ~ константа интенсивности процесса апоптоза, а о -

постоянная составляющая скорости, характеризующая процесс интернализации БТШ70.

Проведя замену С, а также учитывая тот факт, что в начале срока инкубации, белка в среде не было (т.е. МО) = 0), после решения уравнения мы получаем следующий результат:

ад д-а д-а ад

Однако следует учесть, что во время замены среды на бессывороточную из культуры адгезионных клеток ЕЬ-4 удалялись апоптозные клетки на последних стадиях апоптоза (они не прикреплены к подложке). Таким образом, образуется временной сдвиг в процессе выхода и интернализации БТШ70. Тогда уравнение перепишется следующим образом:

дг- [ ^о + е-««-Ф)+Ж_

ад д-а д-а ад

Полученный результат согласуется с экспериментальными данными (параметры подбирались исходя из экспериментальных данных), отображёнными на рисунке 8. Таким образом, нами показана возможность выхода белков теплового шока массой 70 кДа в межклеточное пространство в результате апоптоза лимфоидных клеток. Однако, вероятнее всего, это не единственная и не основная причина появления БТШ70 в межклеточной среде. Т.е. в нашей модели продукция внеклеточного пула БТШ70 может быть связана не только со сбрасыванием этих

протеинов с поверхности апоптозных клеток, но и с активным экзоцитозом БТШ70 живыми клетками.

о 5

о

с; (0

0) о с X 4

>з; £

I 0) В ф ь га 3

о со.

о ^

0 1 X са о 2

н £ Г-»

О О 3

X о н н 1

113

X

5 0

- Расчитано -Померяно

О 2 4 6 8 10 12 14 Время, часы

Рис. 8. Сопоставление рассчитанной и измеренной концентрации внеклеточной формы БТШ70 в культуре клеток ЕЬ-4. Клетки культивировались в плотном клеточном монослое в бессывороточной среде.

Активация лимфоидных клеток сопровождается снижением внутриклеточного

содержания БТШ70

В описанных выше экспериментах было установлено, что внеклеточная форма БТШ70 продуцируется в культуре КонА-активированных лимфоцитов. В представляемой части исследования мы проанализировали влияние процесса активации на внутриклеточное содержание БТШ70 и на экзоцитоз этих протеинов в культуре клеток костного мозга мыши. В качестве активирующих агентов в опытах использовали бактериальный липополисахарид (ЛПС) и синтетический форболмиристатацетат (ФМА).

В результате анализа кинетики изменения уровня цитоплазматических БТШ70 было обнаружено, что указанные активирующие стимулы вызывают снижение внутриклеточного содержания этих протеинов на начальном этапе процесса активации (через 1 час после внесения ЛПС или ФМА) и значительно усиливают экспрессию БТШ70 клетками костного мозга при увеличении сроков инкубации до 16 - 24 часов. Двухчасовая активация этих клеток указанными реагентами также приводила к росту, однако, менее выраженному, внутриклеточного содержания БТШ70. Эти результаты свидетельствовали о двухфазном характере исследуемой кинетики, что получило подтверждение при более подробном анализе изучаемого процесса. В модели ЛПС активации клеток костного мозга было обнаружено, что этот

процесс характеризуется по внутриклеточному содержанию БТШ70 двумя этапами: начальным, соответствующим снижению уровня внутриклеточных БТШ70, и вторым, соответствующим росту и пологому участку на данной временной зависимости (рис. 9). Хорошо известно, что указанные активирующие факторы являются индукторами клеточного стресса. Однако вместо ожидаемого увеличения уровня экспрессии БТШ70 сразу после предъявления этих стимулов, в нашей модели было зарегистрировано достоверное уменьшение количества БТШ70 в клетках костного мозга, проинкубированных в течение 1 часа с ЛПС или ФМА. Можно предположить, что зарегистрированное снижение содержания БТШ70 в клетках костного мозга на начальном этапе их реакции на ЛПС и ФМА связано с выбросом этих протеинов в межклеточное пространство с целью защиты всего клеточного сообщества от повреждающего действия стресса.

контроль

60

120

Время, мин

210

Рис. 9. Изменение содержания БТШ70 в клетках костного мозга мыши под влиянием ЛПС. Анализ проводился с помощью проточной цитофлюорометрии; по оси абсцисс - время в минутах после внесения ЛПС (20 мкг/мл).

Для проверки предположения о выбросе БТШ70 во внеклеточное пространство был проведён Вестерн-блот анализ содержания БТШ70 в супернатанте культур клеток костного мозга, проинкубированных в присутствии и отсутствии ЛПС. Результаты такого анализа свидетельствуют о более высоком содержании БТШ70 в образцах супернатанта, полученных из клеточных культур, активированных ЛПС. Таким образом, Вестерн-блот анализ подтвердил наше предположение о возможности стресс-индуцированного выброса БТШ70 в межклеточное пространство.

Влияние перекиси водорода на внутриклеточное содержание БТШ70

С целью дальнейшего изучения влияния стрессирующих факторов на формирование внеклеточного пула БТШ70 следующая серия наших экспериментов была посвящена анализу данного процесса в модели физиологически адекватного окислительного стресса с использованием перекиси водорода и культуры клеток лимфомы ЕЬ-4. Как и в предыдущих опытах с активацией клеток костного мозга ЛПС, было обнаружено, что воздействие перекиси водорода на клетки линии ЕЬ-4 характеризуется кратковременным снижением концентрации внутриклеточного БТШ70 (Рис. 10). Причем здесь тоже можно выделить два этапа: начальный, соответствующий снижению уровня внутриклеточных БТШ70, и второй, соответствующий росту и пологому участку на данной временной зависимости. Результаты Вестерн-блот анализ подтвердили данные проточной цитофлюорометрии.

140 к 130 | 120 110

о

с 100

m

JL 80 70 60

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 Время, мин

Рис. 10. Влияние перекиси водорода на внутриклеточное содержание БТШ70 в культуре клеток лимфомы EL-4. В точке «0» минут перекись водорода была внесена в клеточную культуру до конечной концентрации 250 мкМ Н202.

Влияние БТШ70 на продукцию перекисных форм кислорода

Хорошо известно, что в популяциях иммунокомпетентных клеток окислительный стресс, обусловленный образованием в ходе биохимических реакций активных форм кислорода (АФК), сопутствует многим физиологическим процессам. В частности, усиленная продукция АФК сопровождает процессы фагоцитоза и клеточной активации. Одним из механизмов защиты внутриклеточных структур от

повреждающего действия АФК является интенсификация синтеза протективных БТШ, индуцируемая окислительным стрессом. Продемонстрировано, что БТШ70 способны подавлять продукцию внеклеточной формы АФК нейтрофилами в процессе фагоцитоза, опосредующую так называемый «кислородный взрыв» фагоцитов. Эти данные и наши результаты, изложенные выше, свидетельствуют о взаимосвязи продукции АФК и синтеза БТШ70 в популяциях иммунокомпетентных клеток. Для анализа указанной взаимосвязи мы провели исследование влияния экзогенных БТШ70 на внутриклеточную концентрацию АФК в культуре клеток костного мозга, характеризующихся активным кислород-зависимым метаболизмом - источником внутриклеточных кислородных радикалов.

Полученные результаты подтвердили наше предположение о влиянии экзогенных БТШ70 (имитирующих эндогенный внеклеточный пул этих протеинов) на интенсивность продукции клетками костного мозга внутриклеточных АФК. Оказалось, что присутствие в культуре этих клеток 10 мкг/мл рекомбинантных БТШ70 снижают концентрацию внутриклеточных БТШ70 более, чем на 35 %. Механизмы данного эффекта нуждаются в дополнительных исследованиях, но можно предположить, что они связаны с описанным в литературе супрессирующим действием БТШ70 на ферменты, катализирующие образование в клетках активных форм кислорода. Наряду с этим, зарегистрированное ингибирующее продукцию АФК действие внеклеточной формы БТШ70 может являться одним из механизмов описанного в ряде работ противодействия данных протеинов развитию апоптоза в клеточных культурах.

Взаимодействие БТШ70 с клеточной поверхностью и интернализация этих протеинов различными типами лимфоидных клеток

В следующей серии экспериментов мы проанализировали взаимодействие внеклеточного пула БТШ70 с различными лимфоидными клетками. В опытах использовали свежевыделенные тимоциты, спленоциты, клетки лимфатических узлов и костного мозга мышей С57ВЬ/б, а также Кон-А-активированные Т-лимфоциты этих мышей (10-суточная культура) и клетки лимфомы ЕЬ-4. В качестве внеклеточной формы БТШ70 использовали биотинилированные рекомбинантные БТШ70 человека ("ЗСгеввСеп", Канада).

Оказалось, что экзогенные БТШ70 быстро связываются с поверхностью всех использованных типов клеток. Это было установлено с помощью цитофлуориметрического анализа клеток после их инкубации в течение 15, 30 и 60 мин в присутствии 10 мкг/мл биотинилированных БТШ70 (для предотвращения возможной интернализации или сбрасывания адсорбированных протеинов инкубацию проводили при 4°С в присутствии 0,05% азида натрия) и последующего окрашивание клеток конъюгатом стрептавидин-ФИТЦ. Достоверное присутствие экзогенных БТШ70 на клеточной поверхности наблюдалось уже через 15 минут инкубации, однако максимальное количество молекул этих протеинов накапливалось на клетках за 60 мин инкубации. Мы зарегистрировали существенные различия в связывании экзогенных БТШ70 некоторыми типами использованных лимфоцитов. Так, максимальным уровнем адсорбции этих молекул характеризовались КонА-активированные Т-лимфоциты, в то время как со свежевыделенными клетками лимфатических узлов связывалось минимальное количество экзогенных БТШ70. Интенсивность взаимодействия внеклеточных БТШ70 с поверхностью остальных типов исследуемых клеток занимала промежуточное положение. Зарегистрированные различия в связывании экзогенных БТШ70 указанными разновидностями лимфоидных клеток могут быть обусловлены как геометрическими, так и физико-химическими характеристиками их поверхности, однако мы не исключаем зависимость уровня встраивания экзогенных БТШ70 в плазматическую мембрану от каких-либо внутриклеточных характеристик используемых клеток-мишеней. На это указывает существенно сниженная по сравнению с другими лимфоцитами интенсивность связывания внеклеточных БТШ70 с клетками лимфатических узлов, имеющих поверхностные свойства аналогичные таковым у спленоцитов.

Наряду с этим, были проведены опыты с культивированием клеток в присутствии 10 мкг/мл рекомбинантных биотинилированных БТШ70 в нормальных физиологических условиях, не препятствующих эндоцитозу. С помощью цитофлуориметрического анализа в этих экспериментах было обнаружено, что биотинилированные БТШ70 выявляются во внутриклеточном пространстве, что свидетельствует об интернализации данными клетками экзогенных БТШ70. Таким образом, наши результаты свидетельствуют о возможности поглощения лимфоцитами из окружающей среды внеклеточного пула БТШ70.

Протективный эффект экзогенных БТШ70 в культурах лимфоидных клеток

Как было показано выше, БТШ70 не только связываются с клеточной поверхностью, но также подвергаются интернализации различными типами клеток иммунной системы. С целью анализа последствий указанной интернализации внеклеточных БТШ70 мы провели специальную серию экспериментов. В опытах с 10-дневными Кон-А-бластами было обнаружено, что 12-часовое присутствие в культуре активированных Т-лимфоцитов экзогенных БТШ70 (1 мкг/мл) достоверно снижает уровень спонтанного апоптоза в данной модели. Так, процентное содержание апоптозных клеток в культурах, обработанных БТШ70, было в среднем на 12% ниже, чем в контроле.

Результаты, полученные в описанных экспериментах, подтверждают наше предположение о взаимодействии внеклеточного пула БТШ70 с Т-лимфоцитами.. Наши данные позволяют предположить, что продемонстрированные в ряде работ иммуностимулирующие функции экзогенных БТШ70 связаны не только с активацией антигенпредставляющих клеток, но и с влиянием этих протеинов на Т-клеточное звено иммунной системы. Наряду с этим можно предположить, что обнаруженные в сыворотке крови в норме и при патологии эндогенные БТШ70 также обладают иммуномодулирующим эффектом, оказывая действие на различные популяции Т-лимфоцитов.

ВЫВОДЫ

1. Лимфоидные клетки различного происхождения способны секретировать БТШ70 во внеклеточное пространство. Интенсивность продукции этих протеинов разными типами клеток существенно различается.

2. Секреция БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток осуществляется по неклассическому, аппарат Гольджи независимому механизму.

3. Один из механизмов секреции БТШ70 лимфоидными клетками связан с продукцией экзосом.

4. Формирование внеклеточного пула БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток происходит, в частности, процессе апоптоза лимфоцитов.

5. Воздействие стрессирующих факторов на лимфоидные клетки приводит к усиленному выбросу цитоплазматических БТШ70 в окружающую среду на первых этапах клеточной реакции на стресс.

6. Внеклеточные БТШ70 интернализуются различными типами лимфоидных клеток и препятствуют развитию процесса апоптоза лимфоцитов. Один из механизмов указанного протективного эффекта связан с ингибирующим действием БТШ70 на продукцию клетками активных форм кислорода.

Практические рекомендации

При проведении измерений содержания БТШ70 в биологических образцах в исследовательской и диагностической практике следует учитывать, что многие типы клеток способны секретировать эти протеины в межклеточное пространство. Поэтому для получения корректных данных, соответствующих уровню общей продукции БТШ70 в анализируемых образцах, необходимо тестирование как внутриклеточной, так и внеклеточной форм данного белка.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Алекперов Э.А.. Пономарев А.Д., Сапожников A.M. Активация лимфоидных клеток сопровождается снижением внутриклеточного содержания БТШ70. Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии. Тезисы докладов и стендовых сообщений. М., 2005, с. 73.

2. Murashko D.A., Alekperov Е.А.. Sapozhnikov A.M., Epinephrine influence on intracellular level of hsp70 in mouse lymphoid cells. 7lh John Humphrey advanced summer programme in immunology. The interaction between immunology and medicine. Abstracts. September 6-9, 2005, Moscow, p. 32.

3. Алекперов Э.А.. Пономарев А.Д., Шустова O.A., Сапожников A.M. Использование флуоресцентного зонда BODIPY-FL-ATP для цитометрического анализа экспрессии БТШ70 на клеточной поверхности. Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии. Тезисы докладов и стендовых сообщений. М., 2006, с. 71.

4. Алекперов Э.А.. Шустова О.А., Сапожников A.M. ЛПС- и ФМА-индуцированное изменение содержания БТШ70 в лимфоидных клетках. Медицинская иммунология, 2006, Том 8, №2, с. 114.

5. Сапожников A.M., Мурашко Д.А., Алекперов Э.А.. Апполонова М.В., Шустова О.А. Феномен секреции БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток. Тезисы докл. и стенд, сообщ. Vin чтений, поев, памяти акад. Ю.А.Овчинникова, 25 - 27 октября 2006 г., Москва, с. 10.

6. Semenkov V.F., Sapozhnikov A.M., Karandashov V.I., Shustova O.A., Alekperov E.A. A possible involvement of reactive oxygen species in onset of autoimmune diseases in old age. Autoimmunity reviews. Abstracts of 5th International Congress on Autoimmunity. Sorrento, Italy, November 29 - December 3, 2006, p. 346-347.

7. Алекперов Э.А.. Пономарев А.Д., Сапожников A.M. Снижение уровня внутриклеточного БТШ70 в модели окислительного стресса клеток линии EL-4. Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии. Тезисы докладов и стендовых сообщений. М., 2007, с. 57.

8. Алекперов Э.А.. Шустова О.А., Сапожников A.M. Изменение содержания БТШ70 в клетках лимфомы EL-4 условиях окислительного стресса. Медицинская иммунология, 2007, Том 9, №2-3, с. 113-114.

9. Sapozhnikov A.M., Kovalenko E.I., Murashko D.A., Alekperov E.A.. Shustova O.A. Relationship between apoptosis and HSP70 expression in lymphocytes exposed to stress mediators. Book of Abstracts. 2ni World Conference of Stress. Budapest, Hungary, 2007, p. 83.

10. Alekperov E.A.. Shustova O.A. Boyko A.A., Zyablitsin A.V., Sapozhnikov A.M. Alteration of HSP70 content in EL-4 cells exposed to oxidative stress. 8th John Humphrey advanced summer programme in immunology. Immunology and viral infection. Abstracts, September 10-14, 2007, Moscow, p. 4.

11. Алекперов Э.А.. Пономарёв А.Д., Шустова О.А., Сапожников A.M. Использование флуоресцентного зонда BODIPY-FL-ATP для цитометрического анализа экспрессии БТШ70 на клеточной поверхности. Труды 51-й научной конференции МФТИ. Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук. Часть IV. Молекулярная и биологическая физика. Москва - Долгопрудный, 2008, с. 221-222.

12. Алекперов Э.А.. Зяблицин А.В., Шустова О.А., Бойко А.А., Сапожников A.M. Анализ процесса секреции БТШ70 в модели окислительного стресса клеток лимфомы EL-4. Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии. Тезисы докладов и стендовых сообщений. М., 2008, с. 113.

13. Сапожников A.M., Алекперов Э.А.. Шустова О.А., Бойко А.А., Зяблицин А.В. Секреция БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток. Российский иммунологический журнал, 2008, т. 2 (11), №2-3, с. 135.

14. Алекперов Э.А.. Бойко А.А., Шустова О.А., Клинкова А.В., Зяблицин А.В., Сапожников A.M. Взаимодействие экзогенных БТШ70 с клетками иммунной системы. Сибирский медицинский журнал, 2008, т. 23, №3, с. 80-83.

15. Семенков В., Карандашов В., Луцан Н., Алекперов Э.А.. Сапожникво А. Влияние аутологичной сыворотки на продукцию активных фаорм кислорода фагоцитами человека в различном возрасте. П международная конференция «Современные информационные и телемедицинские технологии для здравоохранения». Материалы конференции. Минск, Беларусь, 2008, с. 136-140.

16. Алекперов Э.А., Бойко А.А., Зяблицин А.В., Луцан Н.И., Сапожников A.M. Формирование и эффекты внеклеточного пула БТШ70 в популяциях лимфоцитов. Вестник Уральской медицинской академической науки, 2009, № 2/1 (24), с. 12-13.

Отпечатано в типографии ООО «Гипрософт» г. Москва, Ленинский пр-т, Д.37А Тираж 100 экз.

Актуальность проблемы Белками теплового шока (БТШ) называют обширную группу клеточных протеинов, синтез которых значительно возрастает при клеточном стрессе. БТШ присутствуют во всех клетках и организмах, изученных на сегодняшний день, и обладают очень высоким уровнем гомологии в широком спектре охарактеризованных организмов, что свидетельствует о консервативности этих протеинов. Наряду с консервативностью структуры БТШ, разнообразие стрессирующих факторов, вызывающих индукцию экспрессии белков теплового шока, говорит об универсальности этого клеточного ответа на стресс. Важно отметить, что БТШ присутствуют в клетках, как в условиях стресса, так и в нормальных физиологических условиях, участвуя во многих внутриклеточных процессах [1]. Длительное время считалось, что БТШ являются только внутриклеточными протеинами.Этому представлению соответствовало отсутствие в структуре молекул БТШ сигнальной последовательности необходимой для их секреции по классическому пути. Однако в дальнейшем присутствие БТШ было обнаружено в культуральной жидкости различных клеточных линий, а также в сыворотке крови ряда млекопитающих. Кроме того, появились данные об альтернативных путях высвобождения белков из клеток разных типов.Изучение возможных функций внеклеточных форм БТШ показало, что эти протеины обладают уникальными иммуномодулирующими свойствами [2, 3, 4]. Использование препаратов БТШ в экспериментальных моделях позволяет направленно и эффективно усиливать иммунный ответ на опухолевые антигены и различные патогены, или наоборот, подавлять нежелательные аутоиммунные реакции. Известно также, что экзогенные БТШ способны взаимодействовать с клеточной поверхностью и проникать в клетки. Причём интернализованные БТШ сохраняют свои протективные функции и защищают клетки от гибели. В связи с этим очевидно, что наряду с внутриклеточными БТШ, внеклеточная форма этих протеинов также может оказывать влияние на функционирование организма. В настоящее время причины и механизмы продукции БТШ в межклеточное пространство практически не изучены. Очень мало известно и о механизмах иммуномодулирующих эффектов внеклеточной формы БТШ. Цель исследования Целью данной работы является анализ характеристик и механизмов формирования внеклеточного пула БТШ с молекулярной массой 70 кДа (БТШ70) в популяциях лимфоидных клеток и исследование иммуномодулирующих эффектов внеклеточных БТШ70.Задачи исследования 1. Изучение феномена и характеристик продукции внеклеточных БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток различного типа.2. Анализ механизмов экзоцитоза БТШ70 лимфоидными клетками.3. Исследование влияния процесса апоптоза лимфоидных клеток на формирование внеклеточного пула БТШ70.4. Изучение влияние стрессирующих факторов на экзоцитоз БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток.5. Анализ иммуномодулирующих эффектов внеклеточного пула БТШ70.Научная новизна Проблема взаимодействия БТШ70 с иммунной системой привлекает интерес исследователей более двух десятилетий. Однако к настоящему времени достаточно полно охарактеризована лишь роль эндогенных и экзогенных БТШ70 в функционировании антигенпредставляющих клеток. В отличие от этого вовлеченность внеклеточных БТШ70 в процессы, б протекающие в популяциях лимфоидных клеток, находится на самой начальной стадии изучения. К наименее охарактеризованным относятся вопросы, связанные с механизмами формирования внеклеточного пула БТШ70 в популяциях лимфоцитов. Поэтому все основные результаты данного исследования обладают высокой степенью научной новизны. В частности, был осуществлён комплексный анализ механизмов секреции БТШ70 для клеток лимфоидного происхождения: было охарактеризовано влияние ингибиторов аппарат Гольджи-зависимой секреции протеинов на экзоцитоз БТШ70, а также ингибиторов эндолизосомального и рафтзависимого путей экзоцитоза. Была проверена возможность высвобождения данного протеина в составе экзосом. Впервые было продемонстрировано, что апоптоз лимфоидных клеток сопровождается увеличением пула внеклеточной формы БТШ70. Кроме того, был выявлен парадоксальный эффект снижения концентрации внутриклеточных БТШ70 на начальных этапах реакции лимфоцитов на стрессирующие воздействия, что указывает на ранее ^охарактеризованный стресс-индуцированный выброс цитоплазматических БТШ70 в окружающую среду.Практическая значимость работы Белки теплового шока обладают уникальными иммуностимулирующими и адъювантными свойствами, которые позволяют создавать на основе БТШ эффективные противоопухолевые и противоинфекционные вакцины. В настоящее время проводятся клинические испытания некоторых разновидностей таких вакцин. В то же время, иммунизация экспериментальных животных препаратами БТШ70 позволяет предотвратить патологические аутоиммунные реакции. Известно также, что появление в сыворотке крови БТШ70 и антител к ним является характерным диагностическим признаком определенных этапов развития ряда патологий.Все это свидетельствует о значительных потенциальных возможностях применения БТШ70 в клинической практике. Очевидно, что для реализации таких возможностей необходимо изучение процессов формирования внеклеточной формы данных протеинов и механизмов их взаимодействия с иммунной системой. Исходя из этого, данная работа, посвященная исследованию явления экзоцитоза БТШ70 и роли их внеклеточной формы в функционировании лимфоидных клеток, обладает существенной практической значимостью. Значительный интерес для возможного практического применения имеют полученные в работе данные о секреции БТШ70 лимфоцитами. Они проливают свет на источник циркулирующего в организме сывороточного пула БТШ70, обладающего выраженным влиянием на развитие иммунных реакций. Можно предположить, что направленный контроль экзоцитоза БТШ70 лимфоидными клетками может служить основой для разработки нового подхода к проблеме иммунорегуляции.Кроме того, полученные результаты свидетельствуют об информативности анализа уровня циркулирующей внеклеточной формы БТШ70 в качестве дополнительной физиологической характеристики организма и, в частности, иммунной системы.Апробация работы Материалы диссертации представлены на 17-ой - 20-ой международных зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005-2008); на седьмой и восьмой международной иммунологической летней школе им. Дж. Хэмфри (Москва, 2005, 2007); на десятой и одиннадцатой научных конференциях с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006, 2007); на конференции - VIII чтения, посвященные памяти акад. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006); на 5-ом международном конгрессе по аутоиммунитету (Италия, 2006); на втором мировом конгрессе по стрессу (Венгрия, 2007); на 51-ой научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» (Москва, 2008); на 2-ой международной конференции «Современные информационные и телемедицинские технологии для здравоохранения» (Минск, 2008).Публикации По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ.Структура и объём диссертации Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы (главы 1, 2, 3, 4, 5 и 6), экспериментальной части (главы 7 и 8), выводов и списка литературы. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков, 3 таблицы. Список литературы включает 132 источника, из которых 127 иностранных.ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

выводы

1. Лимфоидные клетки различного происхождения способны секретировать БТШ70 во внеклеточное пространство. Интенсивность продукции этих протеинов разными типами клеток существенно различается.

2. Секреция БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток осуществляется по неклассическому, аппарат Гольджи независимому механизму.

3. Один из механизмов секреции БТШ70 лимфоидными клетками связан с продукцией экзосом.

4. Формирование внеклеточного пула БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток происходит, в частности, процессе апоптоза лимфоцитов.

5. Воздействие стрессирующих факторов на лимфоидные клетки приводит к усиленному выбросу цитоплазматических БТШ70 в окружающую среду на первых этапах клеточной реакции на стресс.

6. Внеклеточные БТШ70 интернализуются различными типами лимфоидных клеток и препятствуют развитию процесса апоптоза лимфоцитов. Один из механизмов указанного протективного эффекта связан с ингибирующим действием БТШ70 на продукцию клетками активных форм кислорода.

Практические рекомендации

При проведении измерений содержания БТШ70 в биологических образцах в исследовательской и диагностической практике следует учитывать, что многие типы клеток способны секретировать эти протеины в межклеточное пространство. Поэтому для получения корректных данных, соответствующих уровню общей продукции БТШ70 в анализируемых образцах, необходимо тестирование как внутриклеточной, так и внеклеточной форм данного белка.