Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Внутриклеточное содержание белков теплового шока 70 КДА и его взаимосвязь с продукцией активных форм кислорода в нейтрофилах человека при старении

На правах рукописи

Бойко Анна Александровна

ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 КДА И ЕГО ВЗАИМОСВЯЗЬ С ПРОДУКЦИЕЙ АКТИВНЫХ ФОРМ

КИСЛОРОДА В НЕЙТРОФИЛАХ ЧЕЛОВЕКА ПРИ СТАРЕНИИ

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

12 ФЕВ 2015

Москва 2015

005558843

005558843

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Коваленко Елена Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор медицинский наук, профессор, Пинегин Борис Владимирович

ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, заведующий лабораторией клинической иммунологии

доктор биологических наук, профессор, Евгеньев Михаил Борисович

ФГБУ Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, заведующий лабораторией молекулярных механизмов биологической адаптации

Ведущая организация: ФГБУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН

Защита диссертации состоится « »_2015 г. в « » часов на

заседании диссертационного совета Д 208.072.05 на базе Государственного бюджетного образовательного учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке и на сайте http://rsmu.ru ГБОУ ВПО «РНИМУ им. Н.И.Пирогова» Минздрава России Автореферат разослан « »_2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета:

Кандидат медицинских наук, доцент Кузнецова Татьяна Евгеньевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования

В настоящее время старение рассматривается как сложный биологический процесс, который протекает на фоне разнообразных молекулярных и функциональных изменений в организме. Самая известная из теорий, объясняющих причины старения, утверждает, что чрезмерное образование свободных радикалов, особенно активных форм кислорода (АФК), совместно с нарушением защитной системы клеток от клеточного стресса, способствует старению организма [Нагшап, 1956]. С одной стороны, АФК осуществляют элиминацию патогена и клиренс поврежденных тканей, а, с другой стороны, интенсивная продукция АФК усугубляет воспалительные реакции, оказывая повреждающее влияние не только на мишени, но и на собственные ткани организма.

Один из механизмов, обеспечивающих защиту клеток от неблагоприятных последствий действия АФК, связан с участием высоко консервативных белков теплового шока семейства 70 кДа (Н8Р70). Белки ШР70 обладают широким спектром шаперонных функций и способствуют нормальному протеканию многих внутриклеточных процессов. Они обеспечивают устойчивость клеток к стрессу, участвуя в процессах дезагрегации, репарации и элиминации поврежденных в условиях стресса белков. Нарушение Н8Р70-опосредованных механизмов, связанных с поддержанием белкового гомеостаза, может быть одним из факторов, ускоряющих старение.

Нейтрофилы, клетки врожденной иммунной системы, представляют важный источник АФК в организме и могут играть значительную роль в процессе старения. Известно, что нейтрофилы прямо или косвенно участвуют в патогенезе многих заболеваний, связанных с возрастом. В нейтрофилах, несмотря на их низкую биосинтетическую активность, как и во всех эукариотических клетках, экспрессируются белки Н8Р70. В то же время, работ, в которых бы изучались особенности экспрессии и роль Н8Р70 в функционировании нейтрофилов, мало. Нет информации о возрастных

изменениях, связанных с уровнем внутриклеточных ШР70 в нейтрофилах. До сих пор не ясно, участвуют ли Н8Р70 в регуляции процессов продукции АФК нейтрофилами.

Таким образом, актуальным является изучение в рамках одной работы вопросов, связанных с возрастными изменениями экспрессии Н8Р70 и генерации АФК в популяции нейтрофилов, а также анализ взаимосвязи внутриклеточного уровня Н8Р70 с продукцией АФК. Немаловажным также представляется оценка способности нейтрофилов продуцировать внеклеточные формы Н8Р70, играющие важную иммунорегуляторную роль.

Изучение этих вопросов может способствовать более глубокому пониманию процесса старения, а также позволить сформулировать стратегию коррекции патологических состояний, ассоциированных с возрастом, в которых нейтрофилы играют существенную роль.

Цель исследования — изучение возрастных особенностей внутриклеточного содержания Н8Р70 и динамики стресс-индуцированных изменений уровня Н8Р70, а также анализ взаимосвязи этих изменений с продукцией АФК в нейтрофилах человека. Задачи исследования:

1. Проанализировать содержание Н8Р70 в нейтрофилах человека в трех возрастных группах: молодые, пожилые и долгожители.

2. Исследовать динамику изменения внутриклеточного уровня Н8Р70 в нейтрофилах в ответ на тепловой шок и выявить факторы, влияющие на эту динамику.

3. Сравнить динамику изменения внутриклеточного содержания Н8Р70 в нейтрофилах в ответ на тепловой шок в разных возрастных группах.

4. Оценить спонтанную и индуцированную продукцию АФК в нейтрофилах в разных возрастных группах.

5. Изучить взаимосвязь содержания Н8Р70 и продукции АФК, а также ее возрастные особенности.

Научная новизна

В представленном исследовании выявлен и охарактеризован параметр Н8Р70 (ДН8Р70Тп[), который с возрастом достоверно увеличивается. Этот параметр, рассчитанный как разница между первоначальным и зарегистрированным после теплового шока уровнями внутриклеточных Н8Р70, имеет функциональную значимость, поскольку указывает на количество Н8Р70, взаимодействующего с субстратом в клетке.

В данной работе впервые проведен многопараметрический анализ взаимосвязи продукции АФК и содержания НБР70 в нейтрофилах в разных возрастных группах. Продемонстрировано, что эта взаимосвязь имеет характерные отличия в указанных группах.

Получены данные о том, что в нейтрофилах в условиях клеточного стресса реализуется высвобождение во внеклеточную среду не только Нзр70, но и Нзс70. Впервые продемонстрирована вовлеченность в процесс стресс-индуцируемой секреции НБР70 в нейтрофилах эндосомальных лизосом.

Научно-практическая значимость работы

В ходе работы накоплена база данных, включающая показатели продукции АФК и уровня внутриклеточных белков Н8Р70, а также корреляционную оценку их взаимосвязи в разных возрастных группах (молодые, пожилые и долгожители). На основе накопленных данных могут быть разработаны алгоритмы мониторинга течения процесса старения.

Положительная корреляция между внутриклеточным уровнем Н8Р70 и индуцированной продукцией АФК, выявленная в группе пожилых доноров, позволяет сделать предположение об участии Н8Р70 в поддержании адекватной реакции нейтрофилов на стимуляцию патогеном. Лабораторное тестирование взаимосвязи продукции АФК и экспрессии Н8Р70 нейтрофилами может дать важную информацию о физиологическом статусе пожилых пациентов и об их принадлежности к той или иной группе риска, что позволит выбрать адекватную профилактическую терапию для коррекции состояния организма.

Обнаружен и охарактеризован параметр AIISP70Tnb значение которого с возрастом в нейтрофилах достоверно увеличивается. Параметр AHSP70TLLb отражающий конформационные изменения этих белков в клетке, может иметь важное практическое значение для мониторинга тяжести протекания заболеваний, связанных с процессом накопления поврежденных и агрегированных белков, а также для оценки эффективности профилактических действий и лечения этих заболеваний.

Исследование было поддержано грантом РФФИ («Мой первый грант» №1204-31578 в 2012-2013 гг.)

Основные положения, выносимые на защиту

1. В нейтрофилах человека не обнаружено достоверных возрастных изменений во внутриклеточном содержании HSP70 в отсутствие клеточного стресса, однако доля этого белка, изменяющего конформацию в условиях гипертермии, косвенно указывающая на количество шаперонов семейства HSP70, взаимодействующих в клетке с поврежденными белками, возрастает при старении.

2. Между определенными параметрами внутриклеточного уровня HSP70 и продукции АФК в человеческих нейтрофилах существует взаимосвязь, в то же время характер этой взаимосвязи отличается в разных возрастных группах.

3. В нейтрофилах в условиях гипертермии реализуется активный механизм высвобождения во внеклеточную среду как Hsp70, так и Hsc70.

Степень достоверности и апробация работы: Достоверность полученных результатов обеспечена использованием в работе комплекса методологических подходов: современных высокочувствительных молекулярно-биологических, биохимических и иммунологических методов исследования, подробным учетом и тщательной оценкой результатов, использованием адекватных методов статистической обработки данных, сопоставления результатов, полученных разными методами.

Материалы диссертации были представлены на научной конференции «VII научная конференция иммунологов Урала» (Архангельск, 2009 г.); на 2-м

Европейском конгрессе по иммунологии (Берлин, 2009 г.); на XXIII Международной зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2011 г.); на VII Европейском конгрессе «Healthy and active ageing for all Europeans — II» (Болонья, 2011 г.); на 5-м международном конгрессе «Stress Response in Biology and Medicine» (Квебек, 2011 г.); на 3-м Европейском конгрессе по иммунологии (Глазго, 2012 г.); на Международной конференции EMBO «The Biology of Molecular Chaperons: from molecules, organelles and cells to misfolding diseases» (Санта-Маргарита ди Пула, 2013 г.); на 20-м мировом конгрессе по геронтологии «IAGG 2013» (Сеул, 2013 г.); на 15-м международном иммунологическом конгрессе (Милан, 2013 г.); на объединенном иммунологическом форуме (Нижний Новгород, 2013 г.); на международной конференции «Cell death: aging, metabolism and ramifications for therapeutics and drug development» (Сингапур, 2013 г.); на Международной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 55-летию Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и 80-летию со дня рождения акад. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2014 г.).

Апробация диссертации состоялась 16 декабря 2014 г. на заседании отдела иммунологии ИБХ РАН.

Публикации

По теме диссертационного исследования опубликованы 23 печатные работы. Из них 10 публикаций в научных рецензируемых и рекомендованных ВАК РФ журналах, а также 13 публикаций в материалах научных конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из следующих глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Список литературы содержит 273 наименования, из них 10 отечественных и 263 зарубежных источника. Работа изложена на 135 страницах, иллюстрирована 21 рисунком и 3 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение нейтрофилов из периферической крови и подготовка образцов

Периферическую кровь доноров получали в Российском геронтологическом научно-клиническом центре. В корреляционный анализ были включены данные от 65 добровольцев. Группу молодых составили 26 доноров в возрасте от 20 до 59 лет (медиана 30.5 лет, 13 мужчин, 13 женщин); группу пожилых доноров составили 24 добровольца в возрасте 60-89 лет (медиана 73.5 года, 9 мужчин, 15 женщин); в группу долгожителей вошло 15 доноров в возрасте 90 лет и старше (медиана 91 год, 7 мужчин, 8 женщин). Процедуру выделения нейтрофилов проводили по методике градиентного разделения клеток с использованием коммерческой среды Polymorphprep (Axis-Shield, Швеция) в соответствии с рекомендациями производителя.

Оценка жизнеспособности нейтрофилов

Выделенные нейтрофилы окрашивали трипановым синим, доля живых нейтрофилов составляла не менее 95%. Процентное содержание некрозных и апоптозных клеток в образцах нейтрофилов определяли методом проточной цитометрии с использованием ДНК-специфичного флуоресцентного красителя PI.

Проточная цитофлуориметрия

В работе использовали цитофлуориметр FACSCalibur (BD Biosciences, США). Нейтрофилы определяли по морфологическим параметрам на диаграмме переднего малоуглового (FS) и бокового (SS) светорассеяния и по окрашиванию антителами CD 14 либо CD66b. Метод проточной цитометрии использовали для оценки в нейтрофилах внутриклеточного уровня HSP70, поверхностной локализации HSP70, внутриклеточной продукции АФК, поверхностной экспрессии маркеров дегрануляции.

Вестерн-блот анализ внутриклеточного содержания HSP70

Нейтрофилы (2-5 млн) лизировали, проводили фракционирование белков в условиях денатурирующего электрофореза и перенос на нитроцеллюлозную

мембрану. Окрашивание антителами проводили в соотвествии с протоколом (http://www.cellsignal.com). Результат анализировали с помощью программы ImageJ 1.3 8х (Wayne Rasband, NIH, США).

Измерение продукции АФК с помощью люминол-зависимой хемилюминесценции

Для индукции окислительного взрыва нейтрофилы стимулировали опсонизированным зимозаном А. Уровень хемилюминесценции в образцах измеряли на хемилюминометре 3603 (Dialog Joint Venture, Moscow) и регистрировали максимальное число импульсов в минуту (ерш) в образце в течение 30 мин.

Измерение транскрипционной активности генов HSP70 в нейтрофилах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (qRT-PCR)

Экспрессию генов оценивали в интактных, а также подвергнутых гипертермии образцах. Тотальную РНК для каждого образца выделяли из 6x106 нейтрофилов с использованием TRIzol-реагента в соответствии с инструкцией производителя. После нормализации концентрации РНК проводили процедуру обратной транскрипции. Реакцию амплификации проводили на приборе LightCycler480 (Roche Diagnostics, Германия). Каждую точку для амплификации вносили в триплетах.

Оценка внеклеточного уровня HSP70 методом ИФА

В работе использовали два типа наборов: для определения циркулирующих Hsp70 (Enzo Life Sciences, США) и Hsc70 (StressMarq, Канада). Измерение оптической плотности образцов проводили на фотометре Multiscan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны 450 нм (референсной длине волны 620 нм).

Статистическая обработка данных

Анализ данных проводили в программе SigmaPlot (Systat Software Inc.). Использовали параметрические t-тесты для сравнения независимых выборок при нормальном распределении данных, непараметрический тест Манна-Уитни (£/-test), если данные представляли собой ненормальное распределение. Для

проведения корреляционного анализа использовали метод ранговой корреляции Спирмена. Достоверными считались различия между группами при р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Внутриклеточное содержание Н8Р70 в интактных нейтрофилах в разных возрастных группах

Было оценено содержание 118Р70 в нейтрофилах в трех возрастных группах добровольцев: молодые, пожилые и долгожители.

Детекция внутриклеточных Н8Р70 была проведена методом проточной цитометрии с использованием методики пермеабилизации клеток тритоном X-100. Иммунофлуоресцентное окрашивание проводилось с помощью антител ВИМ-22, специфичных к консервативному участку белков семейства НБР70, распознающих как индуцированный Нзр70, так и конститутивный Нэс70 белки.

Наблюдалась тенденция к снижению значения медианы исходного содержания Н8Р70 (Н8Р70базальный) в нейтрофилах с возрастом, однако не было выявлено достоверных возрастных изменений этого параметра (Рис. 1).

Рис. 1. Внутриклеточное содержание ШР70 (ШР70базшь,,ь,й) в нейтрофилах, измеренное в разных возрастных группах методом проточной цитометрии с помощью антител ВЯМ-22. Здесь и далее отмечены и даны значения медианы в каждой группе.

2. Динамика изменения уровня Н8Р70 в нейтрофилах под действием теплового шока

Эффективность работы репарационной системы, к которой относятся белки Н8Р70, опосредована способностью клеток реагировать на стресс. Поэтому была проанализирована способность нейтрофилов индуцировать синтез ШР70 в ответ на классический индуктор синтеза этих белков - тепловой шок (ТШ), как модель клеточного стресса.

Р 20

<3>

Л

I 10

' 12.8

I

г

0 8.3б

г>

ю

2.1. Транскрипционная активность генов белков HSP70 в нейтрофилах под действием теплового шока

Транскрипционная активность генов семейства HSP70 в ответ на гипертермию была оценена как для индуцируемого гена HSPA1B, так и для конститутивного гена HSPA8. Для сравнения было использовано две модели гипертермии ш vitro: 40°С, 40 мин и 43°С,10 мин.

Индукция синтеза мРНК исследуемых генов происходила в режиме проведения ТШ 43 °С, 10 мин и практически отсутствовала при режиме термообработки 40°С, 40 мин (Рис. 2А, Б). Индукция происходила как для генов HSPA1B, так и для HSPA8.

Таким образом, для большинства последующих экспериментов был выбран режим ТШ 43°С, 10 мин. Было выяснено, что такие условия проведения тепловой обработки существенно не влияют на жизнеспособность нейтрофилов.

cl ■ S

О 0.5

в.

5 „„

40°С. 40 МИД

—О—HSPAI —HSPA8

Время, ч

П.».« i

о" 0.0

43°С. 10 мин

Время, ч

Рис. 2. Транскрипционная активность генов белков Н5Р70 в нейтрофилах под действием гипертермии. Индукция синтеза мРНК генов НЗРА1 и НЗРА8 под действием ТШ в режиме 40°С, 40 мин (А) и 43°С, 10 мин (Б). Уровень мРНК нормировали по содержанию Ь-актина. Представленные на рисунках (А, Б) данные получены в рамках одного эксперимента с нейтрофилами донора 22 лет.

2.2. Анализ динамики внутриклеточного уровня Н8Р70 в нейтрофилах под действием теплового шока

Уровень Н8Р70 был определен методом проточной цитометрии в интактных клетках и сразу после тепловой обработки. Последующие измерения были

проведены в более поздние сроки в течение нескольких часов после окончания ТШ.

Как правило, сразу после проведения ТШ в нейтрофилах внутриклеточный уровень НБР70 значительно возрастал по сравнению с исходным уровнем. В течение 15-30 мин после завершения термического воздействия наблюдалась фаза снижения этого уровня (типичные кривые двухфазной динамики представлены на Рис. ЗА). На более поздних сроках после проведения ТШ не удалось выявить значительного увеличения внутриклеточного содержания Н8Р70 в нейтрофилах (Рис. ЗБ).

N

10 12 14 16

Время, мин

Время, ч

Рис. 3. Динамика внутриклеточного уровня ШР70 в нейтрофилах в ответ на ТШ. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток проводили с помощью антител В11М-22. Измерение уровня Н8Р70 проводили до ТШ (точка 0 мин), сразу после окончания ТШ (точка 10 мин) и через 15-60 мин (А) или в течение нескольких часов после окончания ТШ (Б). Представлены результаты опытов с клетками от разных доноров.

Оставалась невыясненной природа двухфазной динамики внутриклеточного уровня Н8Р70 в нейтрофилах, зарегистрированной с помощью проточной цитометрии, связанной с быстрым действием ТШ.

3. Анализ двухфазной динамики внутриклеточного уровня Н8Р70 в нейтрофилах под действием теплового шока

В серии экспериментов было выявлено, что снижение температуры воздействия приводит к значительному меньшему возрастанию уровня ШР70 по сравнению с инкубацией при 43°С, 10 мин (Рис. 4).

■ё- S ю

л 3

Рис. 4. Изменение внутриклеточного уровня Н8Р70 в условиях проведения ТШ при 43°С 10 мин (1), 42°С 10 мин (2), 42°С 40 мин (3); стрелками 1, 2 и 3 обозначено окончание ТШ.

0 10 20 30 40 50 60 70 КО 'XI 100 ПО 120 130 Время, мин

Предварительная инкубация нейтрофилов с циклогексимидом не приводила к ингибированию фазы увеличения детектируемых внутриклеточных HSP70 после тепловой обработки (Рис. 5). Эти данные указывают на то, что увеличение уровня HSP70 сразу после проведения ТШ не связано с синтезом белка de novo.

Рис. 5. Влияние ингибитора белкового синтеза циклогексимида (100 мкМ, 30 мин) на внутриклеточный уровень HSP70, оцененный методом проточной цитометрии. Идентификацию HSP70 проводили с помощью

моноклональных антител BRM-22. Представлены репрезентативные данные одного из двух независимых экспериментов.

4

r а

-И1ПЖП1ЫС клеши

циююгсксимид

"" 0 to 10 JO 40 SO

Время, мин

С помощью антител, специфичных либо к Hsp70, либо к Hsc70, было выяснено, что вклад в зарегистрированный методом проточной цитометрии двухфазный профиль динамики вносили как конститутивный, так и индуцируемый белки HSP70 (Рис. 6).

Поскольку было выяснено, что увеличение уровня HSP70 после ТШ не было ассоциировано с синтезом белка de novo, далее было предположено, что это увеличение может быть связано с изменением молекулярной конформации молекулы HSP70. Внутриклеточное содержание HSP70 было проанализировано

с помощью панели из шести моноклональных антител к НБР70, полученных нами ранее (Рис. 7А, Б).

------* Hsp70

Время, мин

Рис. 6. Внутриклеточный уровень HSP70 в нейтрофилах до и после ТШ, оцененный методом проточной цитометрии. Идентификацию белка проводили с помощью моноклональных антител к индуцируемому белку Hsp70 (C92F3A-5) и конститутивному белку Hsc70 (1В5), а также антител, распознающих консервативный участок HSP70 (BRM-22).

S

— 6G2 ••»'2BS

ЗС5

I 20 3U 40 50 КО 7(1

Времн, мин

10 20 30 4О 50 60

Время, мин

Рис. 7. Анализ взаимодействия антител из гибридом с Н8Р70, оцененный методом проточной цитометрии. А. Внутриклеточный уровень Н8Р70 в нейтрофилах до и после ТШ, измеренный с использованием антител к М-концевому участку Н8Р70 (клоны 6С2, 2Е5, ЗС5). Б. Внутриклеточный уровень Н8Р70 в нейтрофилах, измеренный с использованием антител к С-концевому участку молекулы (клоны 2Е4, 2Е11, 2РЗ). Приведены типичные кривые, полученные в трех независимых экспериментах.

Антитела клеточных клонов гибридом 2Е4, 2Е11, 2РЗ обладают специфичностью к консервативным эпитопам субстрат-связывающего СООН-терминального домена Н8Р70. Антитела гибридом 602, 2Е5, ЗС5 специфичны к участку молекулы Нвр70 консервативного МН2-терминального домена с АТФ-азной активностью. С помощью антител 602, 2Е5, ЗС5 не удалось выявить фазу увеличения внутриклеточного уровня Н8Р70 сразу после окончания ТШ (Рис. 7А), в то же время антитела 2Е4, 2Е11, 2ЕЗ позволили это увеличение зарегистрировать (Рис. 7Б).

Таким образом, повышение внутриклеточного уровня Н8Р70, вызванное ТШ, связано с изменением конформации белков и усилением доступности для антител эпитопов субстрат-связывающего домена, что, по-видимому, обусловлено частичной диссоциацией субстрата из комплекса с ШР70. С этой точки зрения данный параметр косвенно может указывать на количество белков Н8Р70, взаимодействующих с измененными белками, нуждающимися в стабилизации белками-шаперонами.

В пользу сделанного нами заключения о конформационных изменениях белков Н8Р70 указывает тот факт, что двукратное воздействие на клетки ТШ не изменяло характер двухфазной динамики внутриклеточного уровня Н8Р70.

4. Воздействие гипертермии на уровень Н8Р70 в нейтрофилах в разных возрастных группах

Было произведено сравнение уровня ШР70 после воздействия ТШ в разных возрастных группах. Аналогично уровню Н8Р706азальный, уровень белка, зарегистрированный сразу после окончания ТШ (Н8Р70Тш) достоверно не отличался между молодыми, пожилыми донорами и долгожителями (Рис. 8А). В то же время, параметр, который рассчитывался в виде разницы между Н8Р70Тш и Н8Р70базальный (АН8Р70ТШ) для каждого донора, с возрастом достоверно увеличивался (Рис. 8Б).

1

] 20.2

Рис. 8. Изменение уровня Н8Р70 в нейтрофилах под действием ТШ в разных возрастных группах. А. Уровень Н8Р70, измеренный сразу после окончания ТШ (Н8Р70тш) Б. Увеличение уровня Н8Р70 (ДН8Р70тш), которое рассчитывали как разницу между Н8Р70тш и Н8Р70базальный- Здесь и далее звездочками помечены достоверные отличия между группами (р < 0.05).

Таким образом, параметр ЛН8Р70тш, который, как мы предполагаем, косвенно указывает на количество ШР70, взаимодействующего с нарушенными белками-субстратами, связан с процессом старения.

5. Высвобождение Н8Р70 из нейтрофилов во внеклеточное пространство

В модели клеточного стресса с использованием ТШ методом проточной цитометрии была зарегистрирована поверхностная экспрессия белков Н8Р70 при окрашивании клеток поликлональными антителами к Н8Р70 (Рис. 9).

■ Контроль □ ТШ

Рис. 9. Поверхностная экспрессия ШР70 на нейтрофилах,

зарегистрированная методом проточной цитометрии. Окрашивание нейтрофилов проводили с помощью поликлональных антител к _ Н8Р70.

Эксперименты

Содержание внеклеточных Н8Р70 было измерено в культуральной среде нейтрофилов с помощью иммуноферментного анализа с использованием двух коммерческих тест-систем для определения конститутивного (Нбс70) (Рис. 10А) и индуцируемого (Н5р70) (Рис. 10Б) белков семейства Н8Р70. Анализу подвергались образцы надосадочной жидкости, полученной от интактных, а также подвергнутых тепловой обработке нейтрофилов сразу после ТШ и через 60 мин после его окончания.

Так как в течение анализируемого периода времени жизнеспособность нейтрофилов практически не изменялась, присутствие внеклеточных белков Н8Р70 в клеточном надосадке не являлось следствием пассивного высвобождения исследуемых белков из некротических нейтрофилов.

Рис. 10. Содержание Н5Р70 в культуральной среде интактных и подвергнутых тепловой обработке нейтрофилов, измеренное с помощью иммуноферментного анализа. А. Уровень содержания Шс70 в культуральной среде нейтрофилов. Б. Уровень содержания Нзр70 в культуральной среде нейтрофилов. В качестве контроля была использована полная среда для культивирования нейтрофилов.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что в нейтрофилах в условиях клеточного стресса реализуется высвобождение как конститутивного, так и индуцируемого белков Н8Р70.

6. Анализ механизмов, регулирующих высвобождение Н8Р70 во внеклеточное пространство из нейтрофилов

Чтобы выяснить, сопровождается ли процесс дегрануляции нейтрофилов стресс-индуцированным высвобождением ГОР70 в нашей модели клеточного стресса, было проведено окрашивание плазматической мембраны интактных клеток и клеток, подвергнутых ТШ, антителами к маркерными белкам азурофильных (СОбЗ) и специфических (СОббЬ) гранул, а также лизосом.

Было выяснено, что воздействие ТШ не сопряжено с дегрануляцией азурофильных и специфических гранул, в то время как ТШ индуцировал выброс лизосом, следствием которого являлось увеличение экспрессии на поверхности плазматической мембраны маркера лизосомального мембрано-ассоциированого белка (ЬАМР1, или СО 107а) (Рис. НА, Б). Такой эффект наблюдался на клетках, составляющих 10-13% от всех анализируемых нейтрофилов.

Контроль тш

■ Контроль

■ fKILP

CD107a-PE-Cy5 (LAMP1)

10 10 10 10 10

Рис. 11. Поверхностное окрашивание мебраны нейтрофилов антителами к LAMP1. Окрашивание проводили на интактных и подвергнутых ТШ (А) или активированных fMLP (Б) нейтрофилах.

7. Спонтанная и индуцированная продукция АФК в разных возрастных группах

Исходный (т.е. спонтанный) преимущественно внеклеточный уровень продукции АФК, измеренный с помощью метода люминол-зависимой хемилюминесценции JI3X (АФКдзх спот), в группах как пожилых людей, так и долгожителей был значительно выше, чем уровень АФКдзх спонт в группе молодых доноров (Рис. 12А). Спонтанная продукция внутриклеточных АФК, зарегистрированная с помощью проточной цитометрии с использованием проникающего флуоресцентного зонда DCFH-DA (АФКОСР СПОнт), также была значительно выше в группе пожилых доноров (Рис. 12Б), однако, в группе долгожителей уровень A®KDCf спонт оказался сходным с аналогичным параметром в группе молодых доноров.

Также были проанализированы возрастные изменения индуцированной (опсонизированной зимозаном) продукции АФК нейтрофилами (АФКдзх инд)-Никаких достоверных отличий значений медиан АФКЛЗХ Инд между группами долгожителей и молодых доноров найдено не было; в то же время, уровень АФКдзх инд в группе пожилых был значительно ниже по сравнению с группой молодых доноров (Рис. 12В).

в

3©

ч ; 4

х 5

= £ ,

3 £>

о Б

- - о

• • • •

■ •

• 1.16 • 1 • 1.6 »—

1- 0.41 •

1 ь •

! •

20-59 60-89 90 и старше

О ' 2000

>> .

4 3

-а 3 1500

о 3 10000 0 1 1 0 • 5 1000

11099 г- • 5 2423 Г | 3813 Г и = 3 Ё 500

X 0

20-59 60-89 90 и старше

Рис. 12. Сравнительный анализ продукции АФК нейтрофилами в разных возрастных группах. А. Спонтанная продукция АФК, зарегистрированная методом ЛЗХ (АФКлзх спонт)- В. Спонтанная внутриклеточная продукция АФК, измеренная методом проточной цитометрии с использованием ОСРН-ОА (АФК0Сг окжг). С. Индуцированная опсонизированным зимозаном продукция АФК (АФКЛзх инд)

Таким образом, анализ возрастных изменений продукции АФК в нейтрофилах человека выявил, что функциональный ответ нейтрофилов (индуцированная продукция АФК на патоген) в группе долгожителей достоверно не отличался от молодых доноров в отличие от группы пожилых, у которых такой ответ был снижен относительно контрольной группы. Спонтанная внеклеточная продукция АФК с возрастом увеличивалась. В то же время спонтанная внутриклеточная продукция АФК в группе долгожителей не отличалась от уровня этого параметра в группе молодых, а в группе пожилых значения указанного параметра были достоверно выше.

8. Анализ взаимосвязи между продукцией АФК и содержанием Н8Р70 в нейтрофилах в разных возрастных группах

Для того чтобы выяснить, есть ли связь между продукцией АФК и уровнем внутриклеточных Н8Р70 в нейтрофилах, был проведен корреляционный анализ между параметрами Н8Р70 и АФК, рассматриваемых в исследовании, в разных возрастных группах добровольцев (Таблица 1).

Таблица 1. Корреляцинный анализ взаимосвязи между параметрами АФК и Н5Р70 в нейтрофилах в разных возрастных группах. Представлены коэффициенты корреляций при значениях р< 0.05.

Параметр 1 Молодые Пожилые Долгожители Параметр 2

Н^РУОбазальный АФКосб спонт

- 0.634 АФКлЗХ спонг

0.615 АФКдзх инд

Н8Р70тш - 0.610 АФКоС! спонт

-0.719 АФКдзх спонт

0.692 АФКдзх ИНД

ДШР70тш - 0.626 АФКоси спонт

- 0.671 АФКдзх спонг

0.560 АФКдзх инд

Несколько достоверных корреляций между определенными параметрами АФК и Н8Р70 были выявлены во всех возрастных группах. Однако в разных возрастных группах корреляции не повторялись и носили как положительный, так и отрицательный характер. В частности, отрицательные корреляции,

которые были обнаружены в группе молодых доноров, не сохранялись в более старшем возрасте.

Пожилые доноры образовали единственную возрастную группу, где были обнаружены положительные корреляции между параметрами АФК и HSP70. Уровень АФКЛзх „ид положительно коррелировал со всеми анализируемыми в работе показателями HSP70 (Н8Р70базальный, HSP70Tm, AHSP70toi). Учитывая то, что в этой группе в целом уровень стимулированной продукции АФК (АФКЛЗХ

инд) снижался, можно предположить участие HSP70 в поддержании более яркой иммунной реакции и адекватного уровня продукции АФК на патоген в нейтрофилах.

В группе долгожителей, в которой индуцированная продукция АФК не изменялась по сравнению с группой молодых доноров, взаимосвязь между АФКЛзх „„л и параметрами HSP70 отсутствовала, как и в группе молодых добровольцев.

В группе долгожителей спонтанная продукция АФК (как A®KDCf споит, так и АФКлзх споит) отрицательно коррелировала с параметром AHSP70Tnh который, как было ранее показано, зависит от возраста и достигает максимальных значений в группе долгожителей, отражая уровень белка, задействованного во взаимодействиях с белками, нуждающимися в помощи шаперонов.

ВЫВОДЫ

1. В нейтрофилах человека не обнаружено достоверных возрастных изменений в общем внутриклеточном содержании HSP70. В то же время, разница между уровнем HSP70 после теплового шока и исходным внутриклеточным уровнем HSP70 увеличивается с возрастом.

2. Индуцированное тепловым шоком кратковременное возрастание внутриклеточного уровня HSP70 в нейтрофилах, измеренного методом проточной цитометрии, не связано с синтезом белка de novo, а обусловлено временными конформационными изменениями белка, сопровождающимися

усилением доступности эпитопов субстрат-связывающего домена к специфичным антителам.

3. Вызванные тепловым шоком изменения внутриклеточного уровня ШР70 характерны для конститутивного (Нзс70) и индуцированного (НБр70) белков семейства ШР70.

4. В нейтрофилах в условиях гипертермии реализуется активный механизм высвобождения во внеклеточную среду как Нзр70, так и Нзс70, сопряженный с процессом дегрануляции лизосом.

5. В группе пожилых доноров спонтанная внутриклеточная и внеклеточная продукция АФК в нейтрофилах увеличивается, а индуцированная -уменьшается по сравнению с молодыми. В группе долгожителей величины спонтанной внутриклеточной и индуцированной продукции АФК ниже, чем в группе пожилых, и достоверно не отличаются от аналогичных параметров, определенных в группе молодых добровольцев.

6. С помощью корреляционного анализа в группе пожилых доноров выявлена положительная взаимосвязь внутриклеточного уровня Н8Р70 и индуцированной продукции АФК в нейтрофилах, аналогичная взаимосвязь отсутствует в группах молодых добровольцев и долгожителей. Указанное различие между группами пожилых доноров и долгожителей может быть связано с высоким риском смертности в пожилом возрасте до 90 лет.

Практические рекомендации

Корреляционный анализ показателей внутриклеточного уровня ШР70 до и после гипертермии с показателями продукции АФК рекомендован для измерения в группе пожилых пациентов с целью прогностической оценки течения процесса старения.

Для оценки физиологического статуса пожилых пациентов рекомендовано включить в лабораторное тестирование уровень индуцированной продукции АФК в этой группе.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Бойко A.A. О возрастных изменениях ответа лейкоцитов человека на тепловой стресс / Л.М. Каневский, A.A. Бойко, Е.И. Коваленко и др. // Омский научный вестник. - 2007. -№ 3 (61) - С. 26-28.

2. Бойко A.A. Активные формы кислорода и белки теплового шока 70 кДа в старении человека и активном долголетии / Е.И. Коваленко, Л.М. Каневский, Бойко A.A. и др. // Сибирский медицинский журнал. - 2008. - Т. 23, № 3 - С. 99.

3. Бойко A.A. Взаимосвязь продукции активных форм кислорода и экспрессии белков теплового шока 70 кДа в нейтрофилах долгожителей / Е.И. Коваленко, A.A. Бойко, A.M. Сапожников и др. // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2009. - № 2/1 (24)-С. 257-258.

4. Воуко A.A. Relationship between ROS production and HSP70 expression in human neutrophils in elderly age / E.I. Kovalenko, A.A. Воуко, M.A. Grechikhina et al. // Eur. J. Immunol. 2nd European Congress of Immunology. Berlin.- 2009. - V. 39, Supp. 1 - P. 93.

5. Бойко A.A. Анализ экспрессии белков теплового шока 70 кДа и продукции активных форм кислорода в нейтрофилах долгожителей / Е.И. Коваленко, A.A. Бойко, М.В. Гречихина и др. // Материалы международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова, Сборник тезисов. - 2009. - Т. 1 - С. 238-239.

6. Бойко A.A. Особенности продукции активных форм кислорода в нейтрофилах и лимфоцитах человека при действии разобщителя дыхательной цепи митохондрий / A.A. Бойко, Т.Е. Колабкина, Е.И. Коваленко и др. // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2010. - № 2/1 (29) - С.17.

7. Бойко A.A. Эффекты внеклеточного пула белков теплового шока в популяциях лимфоидных клеток / A.M. Сапожников, A.A. Бойко, A.B. Клинкова и др. // Иммунология. -2011. - Т. 32, № 5 - С. 244-248.

8. Бойко A.A. Изменения содержания разных форм белков теплового шока 70 кДа в нейтрофилах человека под действием теплового шока / A.A. Бойко, A.M. Сапожников, Е.И. Коваленко // Медицинская иммунология. - 2011. - Т. 13, № 4-5 - С. 306-307.

9. Бойко A.A. Использование метода проточной цитометрии для анализа взаимосвязи экспрессии и локализации БТШ70 с физиологическими процессами в лимфоидных клетках / Е.И. Коваленко, A.A. Бойко, A.M. Сапожников и др. // Сборник статей 2-ой международной школы по практической проточной цитометрии. Москва. - 2011. - С. 51-56.

10. Бойко A.A. Особенности экспрессии HSP70 под действием теплового шока и продукции АФК в нейтрофилах человека / A.A. Бойко, М.А. Гречихина, Е.И. Коваленко и др. // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXIII Международной зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва. - 2011. - С. 104.

11. Воуко A.A. Particular features of innate immunity of centenarians. Aging clinical and experimental research / A.A. Boyko, M.V. Grechikhina, E.I. Kovalenko et al. // VII European Congress "Healthy and active ageing for all Europeans - II", Bologna, Italy. - 2011. - Vol. 23, Suppl. № 1 - Abstract 0.07.4.

12. Воуко А.А. Relationship of HSP70 level under heat shock conditions and production of reactive oxygen species in human neutrophils in different age / A.A. Boyko, G.V. Lutsenko, E.I. Kovalenko et.al. // Book of abstracts 5th International Congress on Stress Response in Biology and Medicine. Quebec, Canada. -2011. - P. 231.

13. Бойко A.A. Анализ механизмов неклассического пути секреции БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток / А.В. Зяблицин, А.А. Бойко, A.M. Сапожников и др. // Иммунология. -

2012. - № 1 - С. 49-50.

14. Бойко А.А. Формирование внеклеточного пула БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток / A.M. Сапожников, А.В. Зяблицин, А.А. Бойко и др. // Иммунология. - 2012. - № 1 -С. 20-23.

15. Boyko А.А. Hsp70 and Hsc70 dynamics in human neutrophils under heat shock conditions / A.A. Boyko, A.M. Sapozhnikov, E.I. Kovalenko // Immunology. - 2012. - 137 (Suppl. 1) - P. 200201.

16. Boyko A.A. Hsp70 is involved in different immune processes / M.A. Streltsova, A.A. Boyko, E.I. Kovalenko et al. // Immunology. - 2012. - 137 (Suppl. 1) - P. 254.

17. Boyko A.A. Age-dependent relationships between reactive oxygen species and HSP70 in human neutrophils under cell stress conditions / E.I. Kovalenko, A.A. Boyko, A.M. Sapozhnikov et al. // Book of abstracts Conference of international cell death society "Cell death: aging, metabolism and ramifications for therapeutics and drug development". Singapore. - 2012. - P. 56.

18. Boyko A.A. Different anti-HSP70 antibodies detect different dynamics of intracellular HSP70 content in heat shocked human neutrophils / A.A. Boyko, A.M. Sapozhnikov, E.I. Kovalenko et al. // Book of abstracts 15th International congress of immunology. Milan, Italy. -

2013.-P. 214.

19. Бойко A.A. Динамика содержания конститутивной и индуцированной форм белков теплового шока 70 кДа в нейтрофилах человека в условиях теплового шока. А.А. Бойко, Е.И. Коваленко // Российский иммунологический журнал, Материалы Объединенного иммунологического форума. Нижний Новгород. - 2013. - Т. 7(16), № 2-3 - С. 129.

20. Boyko А.А. Age-dependent changes in relationship between ROS and Hsp70 in cell stress response of human neutrophils / E.I. Kovalenko, A.A. Boyko, A.M. Sapozhnikov et al. // Abstract book EMBO conference "The Biology of Molecular Chaperons: from molecules, organelles and cells to misfolding diseases". Santa Margherita di Pula, Italy. - 2013. - Poster 56.

21. Бойко A.A. Изменение уровня белков теплового шока семейства 70 кДа в нейтрофилах человека под действием теплового шока / А.А. Бойко, A.M. Сапожников, Е.И. Коваленко и др. // Биоорганическая химия. - 2014. - Т. 40, № 5 - С. 528-540.

22. Бойко А.А. Содержание HSP70 и анализ его взаимосвязи с продукцией АФК в нейтрофилах человека в разные возрастных группах / А.А. Бойко, М.В. Гречихина, Е.И. Коваленко и др. // Материалы международной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 55-летию Института биоорганической химии им. Академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук и 80-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова. Спецвыпуск № 1 ActaNaturae. -

2014.-С.17.

23. Boyko А.А. ROS production, HSP70 levels and their relationship in neutrophils: effects of age / E.I. Kovalenko, A.A.Boyko, A. M. Sapozhnikov et al. // Oncotarget. - 2014,- V. 5, № 23. -P. 11800-11812.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Шс70 - конститутивный белок ЖР70

Шр70 - индуцируемый белок НБР70

Н8Р70 — семейство белков теплового шока 70 кДа

Н8Р70базалы.ый -содержание Н8Р70 в интактных нейтрофилах

Н8Р70тш - уровень Н8Р70, зарегистрированный сразу после окончания ТШ

ДН8Р70Тш - параметр, который рассчитывается в виде разницы между Н8Р70тш

И Н8Р70базальный

АФК — активные формы кислорода

АФКоср споит - спонтанный внутриклеточный уровень АФК в неактивированных нейтрофилах, измеренный с помощью флуоресцентного зонда ОСРН-ОА

АФКдзх спонт — спонтанный уровень АФК в неактивированных нейтрофилах, измеренный с помощью метода ЛЗХ

АФКдзх иид — индуцированная опсонизированным зимозаном продукция АФК нейтрофилами, измеренная с помощью метода ЛЗХ ЛЗХ - люминол-зависимая хемилюминесценция ТШ - тепловой шок

Автор выражает благодарность своему научному руководителю Е.И. Коваленко и заведующему лабораторией клеточных взаимодействий ИБХ РАН A.M. Сапожникову за всестороннюю поддержку, помощь в организации исследования, обсуждение результатов; сотруднику Российского геронтологического научно-клинического центра ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова, д.м.н, профессору В.Ф. Семенкову за сотрудничество во время работы над диссертацией, за помощь в подборе добровольцев для исследуемых групп, за ценные методические рекомендации; ведущему научному сотруднику д.б.н. Т.Л. Ажикиной за предоставление возможности выполнения части экспериментальной работы в лаборатории структуры и функций генов человека ИБХ РАН.

Заказ № 52-а/01/2015 Подписано в печать 20.01.2015 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:zak@cfr.ru