Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Обоснование возможности использования производных хитозана для повышения иммуногенности гриппозных и полиомиелитных вакцин

На правах рукописи

ПЕРЕВЕРЗЕВ Александр Дмитриевич

ОБОСНОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ ХИТОЗАНА ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ПММУНОГЕННОСТИ ГРИППОЗНЫХ И ПОЛИОМИЕЛИТНЫХ ВАКЦИН

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология 03.02.02 - вирусология

2 9 НОЯ 2012

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2012

005055815

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук Маркушин Станислав Георгиевич

доктор медицинских наук Ахматова Нэлли Кимовна

Официальные оппоненты:

Семенова Ирина Борисовна, доктор медицинских наук, ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН, ведущий научный сотрудник лаборатории терапевтических вакцин

Бурцева Елена Ивановна, доктор медицинских наук, ФГБУ «НИИ вирусологии им Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития Россини, заведующая лабораторией этиологии и эпидемиологии гриппа

Ведущая организация: ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» РАМН

Защита диссертации состоится 20 декабря 2012 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН по адресу: 105064, Москва, Малый Казённый пер., д.5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.

Автореферат разослан /3? ноября 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Яковлева И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Инактивированные вирусные вакцины в течение последних 50 лет широко используются в борьбе с вирусными заболеваниями. Однако некоторые из них обладают серьезными недостатками. Так, в частности, гриппозные вакцины являются недостаточно эффективными для лиц пожилого возраста [Gross et al., 1995; Palachi, 1997; Khurana et al., 2012; Kositanont et al., 2012] и не способны защищать от дрейфовых вариантов вируса гриппа [Belshe et al., 2000; De Yong, 2000; Cox et al., 2004]. С другой стороны, инактивированные полиомиелитные вакцины обладают относительно низкой иммуногенностью, и для создания прочного иммунитета против полиомиелита требуется многократная иммунизация.

В настоящее время для повышения эффективности вакцин в экспериментальных и клинических исследованиях применяют адъюванты различного происхождения: минеральные соли (гидроксид или фосфат алюминия и др.); растительные (сапонины - QuilA, QS21); микробные (убитые бактерии, липополисахарид и его производные, CpG-мотивы ДНК) и др. [Kovacs-Nolan et al., 2009; Olafsdottir et al., 2009].

Вследствие токсичности или недостаточной эффективности большинства адъювантов для широкого клинического использования разрешены только соли алюминия и водно-масляная эмульсия MF-59, а в некоторых странах вирусоподобные частицы (VLP — virus-like particles) и иммуностимулирующий комплекс (ISCOM -immunostimulating complex) [Valiante et al., 2003; Baudner et al. 2009]. Зарубежные коммерческие гриппозные вакцины выпускаются лишь с одним адъювантом MF-59, и такие вакцины оказались более иммуногенными при вакцинации пожилых лиц, однако, обладали повышенной реактогенностью [Podda, 2001; Podda, Del Guidici,2003],

В литературе появились сообщения об использовании природного катионного полисахарида — хитозана в качестве мукозо-адгезивного адъюванта для инактивированных гриппозных и некоторых других вакцин, вводимых мукозально [Bacon et al, 2000; Ilium et al., 2001; Thanou et al., 2001; Ilium, 2003; van der Lubben et al.,2003; Kang et al., 2009; Prego et al.,2010]. Хитозан является линейным полимером, состоящим из мономеров D-глюкозамина и N-ацетил-О-глкжозамина, и отличающимся низкой токсичностью, биодеградируемостью и биосовместимостью. В последние годы было показано, что хитозан повышает эффективность инактивированных гриппозных и полиомиелитных вакцин при парентеральном

введении [гасИаго\у е! а1., 2007; СЬепёоп й а1, 2008; ОЬепёоп е1 а1, 2011]. Однако, несмотря на большой интерес к данному полимеру, многие аспекты иммунологической активности хитозана и его практического применения остаются до настоящего времени малоисследованными. Отсутствует информация о сравнительной адъювантной активности различных форм производных хитозана (растворимых, мелкодисперсных и.т.д.), а также о влиянии производных хитозана на врожденные механизмы иммунитета при парентеральной и мукозальной иммунизации инактивированными и живыми вирусными вакцинами.

Цель исследования: изучение адъювантных свойств производных хитозана на модели гриппозных и полиомиелитных вакцин с оценкой молекулярно-клеточных механизмов их действия на эффекторы врожденного и адаптивного иммунитета.

Задачи:

1. Исследовать адъювантные свойства производных хитозана различной химической природы.

2. Изучить влияние производных хитозана на активацию адаптивного иммунитета при иммунизации мышей инактивированными и живыми вирусными вакцинами.

3. Исследовать экспрессию Толл-подобных рецепторов дендритными клетками и спленоцитами мышей в ответ на введение инактивированных и живых вирусных вакцин в комбинации с производными хитозана в качестве адъювантов.

4. Оценить цитокиновый профиль мышей при введении инактивированных и живых вирусных вакцин в комбинации с производными хитозана.

5. Определить особенности иммунофенотипа спленоцитов мышей при иммунизации инактивированными и живыми вирусными вакцинами в комбинации с препаратами хитозана.

Научная новизна работы

Впервые исследовано воздействие высокомолекулярного (ММ 200 1еОа) глютамата хитозония и микро/наночастиц сульфата хитозония при парентеральном и мукозальном методах введения с инактивированными и живыми гриппозными вакцинами на стимуляцию врожденного и адаптивного иммунитета мышей. Установлена возможность повышения иммуногенности инактивированной полиомиелитной вакцины при включении в ее состав производных хитозана в качестве адъювантов.

Показано, что при парентеральном введении производных хитозана в комбинации с инактивированной гриппозной сплит-вакциной происходило усиление активации врожденного и адаптивного иммунитета у мышей, что проявлялось в экспрессии эндосомальных Толл-подобных рецепторов ДК (TLR7, TLR8, TLR9), индукции синтеза цитокинов в крови (IL-12, INF-y, IL-17, IL-ip и IL-5); повышении численности Т (CD3, CD4, CD8, у5Т), В лимфоцитов (CD19, CD5), NK (CD16/32), NKT (CD3/NK), T-reg (CD4/CD25/Foxp3) клеток. Включение в состав полиомиелитных вакцин производных хитозана приводило к увеличению численности CD3, CD8, NK, CD3/NK, CD4/CD25/Foxp3 и у5Т позитивных клеток и ДК с экспрессией эндосомальных TLRs.

Выявлены общие закономерности цитокиного профиля при иммунизации животных инактивированными и живыми гриппозными и инактивированными полиомиелитными вакцинами: резкое повышение IL-12, умеренное повышение IFN-y и снижение TNF-a.

Установлено, что мукозальная иммунизация мышей живой гриппозной вакциной в комбинации с производными хитозана способствовала повышению уровней IgG и slgA в респираторном тракте мышей и препятствовала размножению вирулентного штамма вируса гриппа в легких мышей; увеличивала содержание TLR2 и TLR9-экспрессирующих клеток, а также субпопуляций B1 (CD5) и Т-лимфоцитов (CD3, CD8 и CD4) и NK.

Включение производных хитозана в состав инактивированных гриппозных и полиомиелитных вакцин мобилизует различные звенья врожденного иммунитета, приводя к поляризации иммунного ответа по Thl-типу.

Научно-практическая значимость

Получено положительное решение Федерального Института промышленной собственности РФ на заявку № 2010114819/15 (020894) «Способ повышения иммуногенности холодоадаптированного донора аттенуации для живых гриппозных вакцин» от 14.04. 2010.

Показана целесообразность использования глютамата хитозония и суспензии микро/наночастиц сульфата хитозония для повышения иммуногенности и защитной эффективности инактивированных и живых гриппозных вакцин, активирующих мукозальный и системный иммунитет при парентеральной иммунизации.

Включение в состав инактивированной полиомиелитной вакцины модифицированных препаратов хитозана в качестве адъювантов позволит повысить иммуногенность полиомиелитных вакцин.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выявлена зависимость адъювантных свойств производных хитозана от особенностей их химической природы при наибольшей активности глютамата хитозония и микро/наночастиц сульфата хитозония, которые существенно не различались по адъювантным свойствам при введении с гриппозными и полиомиелитными вакцинами.

2. Введение производных хитозана в состав живых и инактивированных гриппозных вакцин способно повысить их иммуногенность и защитную эффективность. Введение производных хитозана в состав инактивированных полиовакцин повышает их иммуногенность.

3. Производные хитозана в составе вирусных вакцин при иммунизации животных приводят к повышению в крови количества Т и В лимфоцитов, ЫК клеток; уровня провоспалительных (1Ь-1р, 1Ь-6) и регуляторных (НТЯ-у, 1Ь-12, 1Ь-17) цитокинов и снижению ЮТ-а, что устраняет последствия иммуносупрессии, индуцированной вирусными вакцинами, и нейтрализует гиперактивацию иммунной системы при введении живых вакцин.

Апробация материалов диссертации и публикации

Основные материалы диссертационной работы доложены на: Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» (Москва, 2010); IX Конгрессе детских инфекционистов России (Москва, 2010), VII Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (2010), научно-практической конференции молодых учёных НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2011), XIV Всероссийском форуме с международным участием им. академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011), Международной научно-практической конференции «От теории — к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины» (Саратов, 2011), X Латино-американском конгрессе иммунологов (Перу, 2012).

Апробация диссертации состоялась 29 мая 2012 г на совместной конференции Кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ

им. И.М. Сеченова, лаборатории механизмов регуляции иммунитета и лаборатории РНК-содержащих вирусов ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, из них 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, девяти глав собственных исследований, заключения и выводов. Библиография включает 189 источников (68 отечественных и 121 зарубежный). Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, иллюстрирована 3 рисунками и 29 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Препараты. В работе использовали инактивированные гриппозные: сплит-е<ям/ш/а«Ваксигрип» (Sanofi Pasteur, Франция), «Флюарикс» (GlaxoSmithKlein, Нидерланды); субъединичные «Агрипал» и «Агрипал S1» (Novartis vaccines and diagnostics, Италия). В качестве живой холодоадаптированной гриппозной вакцины (ХА ЖГВ) использовали холодоадаптированный штамм

A/KpacHOflap/101/35/59(H2N2) - донор для живых гриппозных вакцин (Патент № 23546995 РФ).

Штаммы вируса гриппа: A: AIVR-116 (H1N1), А/Калифорния/7/2009 (H1N1), A/Brisbane/59/07 (H1N1), A/PR8/34 (H1N1), А/Перт/09/87 (H3N2), А/Краснодар/101/59 (H2N2), А/Утка Пенсильвания/ 10218/84 (H5N2), A/Urugway/l 716/2007 (N3N2).

Полиовирусы и полиовакцины: инактивированная вакцина «Имовакс Полио» (Sanofi-Pasteur, Франция); живая полиовакцина для перорального применения 1,2,3 типов (ФГУ «ПИПВЭ» им. М.П. Чумакова РАМН, Москва); инактивированные штаммы Сэбина вируса полиомиелита 1,2,3 типа (NIBSC, WHO International Laboratory for Biological Standards, Великобритания).

Адъюванты: высокополимерный хитозан («Сонат», Москва, РФ), 300 kDa, степень деацетилирования 85%. Суспензию микро/наночастиц сульфата хитозония (МЧ СХ) получали путем добавления сульфата натрия до конечной концентрации 25 гпМ к 0,1 % раствору ацетата хитозония. Образующуюся суспензию микро/наночастиц СХ концентрировали центрифугированием. Рабочую концентрацию суспензии готовили на 0,2 М фосфатном буфере (pH 7,2) с

добавлением NaCl до физиологической концентрации 0,9%. N-сукциноил хитозония, глютамат-сукцинат хитозония, хлорид хитозония и ограниченно-деполимеризованный глютамат хитозония (предоставлены С.М. Шинкаревым, ГНЦ «ВНИТИ БП» РАСН); реацетилированный хитозан (хитин) и производные хитозана, сделанные на основе хитозана фирмы «Сонат» (предоставлены Г.Г. Кривцовым, ФГБУ «НИИВС им И.И.Мечникова» РАМН).

Экспериментальные животные. Мыши линий СВА, BALB/c и беспородные, весом 12-14 и 16-18 г, из питомника НЦ Биомедицинских технологий РАМН «Андреевка».

Метод определения инфекционной активности вируса гриппа на куриных эмбрионах проводили согласно МУ 3.3.2.1758-03 (Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов).

Иммунизация животных. Мышей вакцинировали в/м, двукратно с интервалом в 21 день, вводя по 0,2 мл препарата, содержащего по 3 мкг каждого компонента вакцины и 0,5% препарата хитозана (в конечной концентрации) или буфера. При мукозальной иммунизации ХА ЖГВ мышам под легким эфирным наркозом в тех же режимах вводили и/н 50 мкл десятикратных разведений вирусного материала, содержащего 0,5% препарата хитозана (в конечной концентрации). При мукозальной иммунизации ИГВ мышам вводили и/н 50 мкл вакцины, содержащей 0,75 мкг белка каждого серотипа и 0,5% препарата хитозана. Через 10 дней после второй иммунизации у мышей брали кровь и затем препарировали, извлекая различные отделы респираторного тракта и легкие.

Анализ специфических ингибирующих гемагглютинацию антител проводили в реакции РТГА по стандартной методике [Kendal A. et al., 1984].

Уровень антител в сыворотках животных определяли при помощи твердофазного метода ИФА [Егоров A.M., и соавт., 1991].

Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) с вирусом гриппа проводили согласно МУ 3.3.2.1758-03. За титр сыворотки принимали предельное разведение, вызывающее полную задержку гемагглютинации.

Мононуклеарные лейкоциты периферической крови доноров (МЛПК) и селезенок мышей (MJI) выделяли с помощью одноступенчатого градиента плотности фиколл-урографина по методу [A. Boyum, 1968].

Дендритные клетки (ДК) получали из МЛПК доноров и МЛ селезенок мышей линии BALB/c по стандартной методике [Чкадуа Г.З. с соавт., 2002]. Культивирование клеток проводили в присутствии факторов роста (GM-CSF и IL-4). Для активации ДК использовали инактивированные гриппозные вакцины (по 50 мкл/мл, содержащих 0,75 мкг белка каждого серотипа) с хитозаном (0,5 %) и TNF-a (20 нг/мл) положительный контроль).

Определение экспрессии поверхностных и эндосомальных маркеров мононуклеарными лейкоцитами и ДК проводили при помощи моноклональных антител («Caltag Laboratories», США) против соответствующих антигенов. Результаты учитывали на проточном цитометре FC-500 («Beckman Culter», США).

Уровень цитокинов определяли:

в супернатантах культур ДК мышей при помощи тест-системы FlowCytomixMouse Thl/Th2 10 plex с использованием шариков, сенсибилизированных моноклональными антителами к цитокинам (GM-CSF, IFN-y, IL-ip, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17, TNF-a), производства BenderMedSystems (Австрия) согласно инструкции производителя с использованием проточного цитометра FC-500 (Beckman Culter, США);

- в сыворотке/плазме мышей методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем фирмы «Biosource» (Австрия) в диапазоне детектируемых концентраций от 1 до 3 пкг/мл.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Excel (Microsoft Corporation, США), интегрированным пакетом статистического анализа Statgraphics Plus v5.0 (Manugistics Group, Inc., США), WinMdi, StatSoft 7.0 (Windows 2007) с применением параметрических (t-критерия Стьюдента) и непараметрических (критерия Вилкоксона) методов сравнения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Сравнительное изучение адъюваитных свойств производных хитозана

Исследована зависимость адъювантных свойств группы производных хитозана от особенностей их химического строения при совместном введении с инактивированными гриппозными (ИГВ) Ваксигрип и Флюарикс вакцинами. Наиболее выраженными адъювантными свойствами характеризовались растворы

глютамата высокомолекулярного (200 Ша) и ограниченно деполимеризованного хитозония (ММ 67кБа), а также суспензия микро/наночастиц реацетилированного хитозана, что подтверждено в двух серологических реакциях - РТГА и ИФА {табл.1).

Таблица 1

Адьювантные свойства производных хитозана при парентеральном введении мышам в комбинации с инактивированными гриппозными вакцинами

Титр сывороточных AT к вирусу гриппа A/Brisbane/59/2007

Модификация хитозана (H1N1);

№ РТГА (M±SD) ИФА (M±SD)

Ваксигрип Флюарикс Ваксигрип Флюарикс

1 М-сукциноил хитозана 74,6± 40,0± 2400± 2000±

(натриевая соль) 48,8 24,0 1131 1697

2 Глютамат-сукцинат хитозония 394± 181,3±

(солевая форма) 203,2 66,6

з Глютамат хитозония (солевая 1237± 960± 38400± 42666±

форма) ММ 67 Ша, ГХ 728* 452* 18101* 14780*

4 Глютамат хитозония (солевая 1413,3± 533,3± 76800± 68266±

форма) ММ 200 Ша, ГХ 97,3* 184,1* 22627* 59119,5*

5 Хлорид хитозония (солевая 213,3± 106,6±

форма) 73,7 37,6

6 Реацетилированный хитозан 480 ± 32000± 38400±

(хитин, микро/наночастицы) 277* 20238* 18101*

7 Вакцина +0,9% р-р натрия 213,3± 90,6± 4800± 4266±

хлорида 73,7 33,3 2262 1847

Примечание. К инактивированным гриппозным вакцинам добавляли равные количества 1% р-ра или 1% суспензии микро/наночастиц производных хитозана. Сыворотку крови исследовании на 10 сут. после 2-кратной внутримышечной иммунизации мышей с интервалом в 21 сут. В скобках -кратность повышения титра антител по сравнению с вакциной без производных хитозана; *- р<0,05 по сравнению с контрольной группой.

Учитывая потенциальную роль хитина в аллергических реакциях [Burton, Zaccone, 2007; Reese et al., 2007], в дальнейших экспериментах суспензия микро/наночастиц реацетилированного хитозана была заменена на другую мелкодисперсную форму - суспензию микро/наночастиц сульфата хитозония (МЧ СХ) {табл.1).

Таблица 2

Изучение адьювантных свойств раствора глютамата хитозония и суспензии микро/нананочастиц сульфата хитозония при парентеральной иммунизации мышей инактивированными гриппозными вакцинами (ИГВ) Ваксигрип и Флюарикс

Вакцины Тигры сывороточных АТ, ингибирующих гемагглютинацию у иммунизированных мышей (РТГА) (ШвО) Титры сывороточных 1§0-АТ у иммунизированных мышей (ИФА) (М±БВ) Тигры секреторных 1{5А-АТ у иммунизированных мышей в легких и различных отделах респираторного тракта*** (ИФА)(М±80)

НШ1* Н3№** Н1Ы1 НЗЫ2 носоглотка трахея легкие

Ваксигрип + 0,5% р-р глютамата хитозония 1493,3± 661,98 (3,5) 2986± 1355 (5,6)* 170666± 41804,6 (7,9)* 682666± 236482 (8)* 33,3± 9,9 (2,5) 20 106,6± 19,7 (3,2)

Ваксигрип + 0,5% сусп.микро/наночастиц сульфата хитозония 1066± 369,5 (2,5) 2133,3± 739 (4)* 42666,6± 14780,2 (2) 170666± 41804 (2) 46,6± 30,5 (3,5) 20 53,3± 23 (1,6)

Ваксигрип + 0,9% р-р натрия хлорида 426,6± 260,5 533± 184,7 21333,3± 7390,6 85333± 19706 13,3±5,7 <10 33,3± 9,9

Флюарикс +0,5% р-р глютамата хитозония 533,3± 234,4 (8)* 2133± 739 (8)* 136533,3± 39413,9(12,8)* 341333± 117779(6,5)* 26,6± 11,5(2,6) 10 <10

Флюарикс+ 0,5% сусп. микро/наночастиц сульфата хитозония 853,3± 322 (12,8)* 1280± 0,0 (4,8)* 52906,6± 20707,6 (4,9)* 682666± 236482 (12,9)* 26,6± 11,5(2,6) 10 26,6±1 1,5 (2,6)

Флюарикс+0,9% р-р натрия хлорида 66,6± 20,7 266,6± 130,2 10666± 3695 52906± 20707 10 <10 20

Контроль(сыворотка неиммунных мышей) <20 <20 346,9 458,2 <10 <10 <10

Примечание. * А/ВпзЬапс/59/2007 (НШ1); ** А/ иги§\уау/1716/2007 (НЗЫ2); *** А1УЯ-116 (НШ1); В скобках - кратность повышения титра антител по сравнению с вакциной без производных хитозана. Достоверным считали не менее чем 4-кратное повышение титра АТ.

2. Повышение иммуногенности инактивированных гриппозных вакцин при использовании производных хитозана

Выбранные производные хитозана - глютамат хитозония (ГХ) и микро/наночастицы сульфата хитозония (МЧ СХ) в составе инактивированных гриппозных вакцин (ИГВ) существенно повышали у мышей титр антител (АТ) к вирусам гриппа А/НШ1 и А/НЗШ в реакциях РТГА и ИФА {табл.2) по сравнению с введением Ваксигрип и Флюарикс без препаратов хитозана. Важнейшим показателем действия вакцин является их протективный эффект, что было изучено по показателям размножения вируса гриппа в легких 2-кратно иммунизированных мышей (табл.3).

У неиммунизированных мышей инфекционная доза, вызывающая размножение вирулентного штамма вируса А/НШ1/Брисбейн/59/2007 в легких, составляла Ю2'0 ЭИД50; у иммунизированных ИГВ Ваксигрип она возрастала до 104'0 ЭИД50. Введение Ваксигрип с ГХ значительно повышало защитный эффект: только инфекционная доза штамма, равная 10б'° ЭИД50, вызывала инфекционный процесс в легких иммунизированных животных. Введение в вакцину суспензии МЧ СХ приводило к еще большему увеличению инфекционной дозы вирулентного штамма, способной вызвать инфекционный процесс.

Таблица 3

Изучение защитного эффекта иммунизации мышей вакциной Ваксигрип в комбинации

с препаратами хитозана

Доза вирулентного штамма Брисбейн/59/2007 (НШ1), ЭИД50/0,05мл Размножение вируса в легких иммунизированных мышей, инфицированных впоследствии интраназально различными разведениями вирулентного штамма А/Брисбейн/59/2007 (НШ1)*

Неиммунизир. мыши (контроль) Ваксигрип + физ. р-р Ваксигрип +0,5% р-р ГХ Ваксигрип + 0,5 % суспензия МЧ СХ

10''° 4/4' 4/4 4/4 2/4

10"° 4/4 4/4 2/4 0/4

105и 4/4 4/4 0/4 0/4

104'° 4/4 2/4 0/4 0/4

10^° 4/4 0/4 0/4 0/4

102'и 2/4 0/4 0/4 0/4

ю'-и 0/4 0/4 0/4 0/4

Примечание. * в знаменателе - количество куриных эмбрионов, инфицированных суспензией легких 2-кратно иммунизированных мышей, в числителе - количество куриных эмбрионов, в которых наблюдали размножение вируса (представлены результаты одного из 4-х опытов).

Таким образом, введение ГХ и МЧ СХ в состав ИГВ значительно повышало их защитную эффективность.

3. Повышение иммуногенности живых гриппозных вакцин при использовании

производных хитозана

Для оценки влияния производных хитозана на защитный эффект живых гриппозных вакцин иммунизацию проводили интраназально 2-кратно холодоадаптированным (ХА) штаммом вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59 (Н2№), являющегося донором аттенуации для живых вакцин. При иммунизации ХА штаммом подавление размножения вирулентного штамма вируса гриппа А/Краснодар/ 101/59 (Н2Ы2) в легких наблюдали только у мышей, иммунизированных дозой Ю6'и ЭИД50 вакцинного вируса (табл.4).

Таблица 4

Влияние глютамата хитозана на защитный эффект при интраназальной иммунизации

мышей холодоадаптированным штаммом-донором А/Краснодар/101/35/59

Дозы ХА штамма-донора А/Краснодар/ 101/35/59 (Н2К2) для и/н иммунизации (ЭИД50/0,05мл) Размножение вирулентного штамма А/Краснодар/ 101/59 (Н2Ы2) в легких мышей, иммунизированных интраназально ХА штаммом-донором А/ Краснодар/ 101/35/59 (Н2Ы2)

иммунизация с ГХ* иммунизация без ГХ*

10ь,и сЮ1* ю1-5

< 10*"

104'и <ю'-и 10^°

10^° <ю'-и

10"'и 10^° 10^

Примечание. Инфекционный титр штамма А/Краснодар/101/59 (Н2№) в легких неиммунизированных мышей равнялся 103 ° ЭИД50. Титрование проводили на куриных эмбрионах, инфицированных суспензией легких 2-кратно иммунизированных мышей. ЭИД50 - 50% эмбриональная инфицирующая доза.

Включение ГХ в состав вакцины приводило к подавлению размножения вирулентного вируса в легких мышей, иммунизированных дозами вакцинного ХА штамма Ю5,0 ЭИД50, Ю4'0 ЭИД50, 103 ° ЭИД50. При этом в РТГА отмечали увеличение образования сывороточных антител, задерживающих гемагглютинацию: к ХА штамму-донору в 4 раза при вакцинации дозой вируса Ю5,0 ЭИД50/0,05 мл и в 8 раз при вакцинации дозой вируса Ю3'0 ЭИД5О/0,05 мл по сравнению с контролем. При исследовании титров противогриппозных антител в ИФА после интраназальной иммунизации установлено, что ГХ в комбинации с ХА живой гриппозной вакциной (ЖГВ) способствовал значительному повышению титров 1§0-АТ в сыворотке крови и sIgA-AT в респираторном тракте мышей. Полученные результаты свидетельствуют о

значительном повышении защитного эффекта и/н вакцинации ЖГВ при введении в вакцинный материал ГХ.

4. Особенности иммунного ответа при иммунизации мышей полиомиелитной вакциной в комбинации с производными хитозана В исследованиях использовали инактивированные формалином штаммы Сэбина полиовируса типов 1, 2 и 3 в комбинации с производными хитозана. Мышей иммунизировали в/м и определяли уровни ^в-АТ в сыворотках крови (табл. 5). Титр 1§0-АТ в сыворотке мышей, иммунизированных полиовирусами 1, 2 и 3 типов составил 2660; 4266 и 10666, соответственно, после двукратной иммунизации, и 10666; 5333 и 17066, соответственно, после трехкратной.

Таблица 5

Титры 1§С-АТ в сыворотках мышей, иммунизированных инактивированными штаммами Сэбина полиовируса (ПВ) типов 1,2,3 в комбинации с производными

хитозана

№ Инактивированный материал для внутримышечной иммунизации мышей Титры 1§0-АТ в сыворотке иммунизированных мышей (ИФА)

двукратная иммунизация трехкратная иммунизация

1. ПВ 1 типа + 0,9% р-р №С1 2660±923,7 10666±3695,3

2. ПВ 1 типа + 0,5% р-р ГХ 85333±29560* (32) 102400±0,0* (9,6)

3. ПВ 1 типа + 0,5 % сусп. МЧ СХ 68266±17083* (23) 70666±53969,3*(6,6)

4. ПВ 2 типа + 0,9% р-р №С1 4266±1847,5 5333±1847,5

5. ПВ 2 типа + 0,5% р-р ГХ 119466±78209,2*(28) 136533±59120,4*(25,5)

6. ПВ 2 типа + 0,5% сусп. МЧ СХ 85333±29560,5* (20) 102400±0,0* (19,2)

7. ПВ 3 типа + 0,9% р-р ЫаС1 10666±3695,5 17066±5396,4

8. ПВ 3 типа+ 0,5% р-р ГХ 85333±29560,1* (8) 273066±118241* (16)

9. ПВ 3 типа + 0,5% сусп. МЧ СХ 42666± 14780,4* (4) 85333±29560,5*(5)

Примечание. В скобках указана кратность повышения титров антител по сравнению с инактивированным полиовирусом без адъюванта. * Достоверным считали повышение титра антител в 4 и более раз.

Введение в состав инактивированного препарата ПВ типов 1,2,3 ГХ повышало титр ^О в 32; 28 и 8 раз, соответственно, после двукратной иммунизации, и в 9,6; 25,6 и 16 раз, соответственно, после трехкратной иммунизации.

Аналогичным образом при введении в состав инактивированного препарата полиовируса типов 1, 2, 3 суспензии МЧ СХ наблюдалось повышение титра сывороточных антител в 25,6, 20 и 4 раза, соответственно, после двукратной иммунизации ив 16, 19,2 и 5 раз, соответственно, после трехкратной иммунизации. Это указывает на выраженный адьювантный эффект производных хитозана в

отношении инактивированных штаммов полиовируса всех типов и подтверждает его эффективность, выявленную ранее на модели инактивированных гриппозных вакцин.

Выявленные адъювантные свойства ГХ и МЧ СХ при введении с инактивированными и живыми вирусными вакцинами при парентеральном и мукозальном методах введения, явились основанием для изучения молекулярно-клеточных механизмов их действия.

5. Молекулярно-клеточные механизмы адъювантного действия хитозана на эффекторы иммунитета

Известно, что первым этапом активации иммунного ответа является распознавание консервативных молекулярных структур микроорганизмов клетками системы врожденного иммунитета с помощью паттерн-распознающих рецепторов, включая семейство сигнальных Толл-подобных рецепторов (ТоН-Пке-гесерЬге - ТЬЯб). Для вирусов - это ТЬЯб 3, 7, 8, 9.

5.1. Экспрессия ТЫ^ под воздействием инактивированных и живых вирусных вакцин в сочетании с производными хитозана

Экспрессия эндосомальных в дендритных клетках человека. Активацию

эндосомальных ТЬЯв 3, 7, 8, 9 под влиянием вирусных антигенов в комбинации с производными хитозана исследовали при действии живых и инактивированных вирусных вакцин в комбинации с ГХ в качестве адъюванта в дендритных клетках (ДК) человека на восьмые сутки инкубации (табл. 6).

Таблица 6

Влияние инактивированных и живых вирусных вакцин в комбинации с глютаматом

хитозония на экспрессию эндосомальных тьяб в ДК человека

№ Препарат % от общего количества анализируемых клеток, (М±80)

ТЬЮ Т1Л17 ТЪК8 ТЬК9

1 ДК+0,9% р-р №С1 14,3±0,73 27,9±0,5 22,4±0,83 8,2±0,7

2 ДК+ГХ 11,73±1,6 24,1±0,5 26,3±1,01 13,5±1,1

3 ДК+Агрипал БЦИГВ) 14,5±1,0 33±2,7 29,1±7,2 15±1,6*

4 ДК+Агрипал 81(ИГВ)+ГХ 17,5±1,0 41,5± 1,5**# 42±1,4**# 31,5±1,5**#

5 ДК+живая ХА ГВ 17,2±1,2 46,6±2,3** 70,5±4,4** 8,1±1,5

6 ДК+ живая ХА ГВ+ГХ 27,3±1,57*# 77,3±3,4**# 74,8±3,6** 33,1±2,5**#

7 ДК+ Имовакс-Полио 13,3±1,2 34,1±2,55* 36,3±1,65* 11,6±1,1

8 ДК+Имовакс-полио+ГХ 18,3±1,85*# 38,4±2,5* 47,5±4,7**# 13,3±1,3*#

9 ДК+ЖПВ 16,4±1,6 50,3±3,17** 61,5±4** 10,6±1,25

10 ДК+ЖПВ +ГХ 25,4±1,9*# 60,3±4,2**# 73,8±3,7**# 30,1±2,54**#

Примечание. Достоверность различий по сравнению с контролем (группа 1): * - р<0,05; **-р<0,01, # - р<0,05 между группами 3 и 4; 5 и 6; 7 и 8. ХА ГВ - холодоадаптированная гриппозная вакцина, ЖПВ - живая полиовакцина, ГХ - глютамат хитозония.

Производные хитозана в разной степени усиливали действие инактивированных и живых гриппозных и полиомиелитных вакцин на экспрессию всех исследуемых эндосомальных ТЪЯб. Наибольший эффект ГХ наблюдали при воздействии живых гриппозных (ЖГВ) и полиомиелитных (ПЖВ) вакцин в отношении ТЬЯ9 (увеличение в 4,1 и 2,8 раз соответственно). Высокая активация ТЬЯ8 при введении в культуру ДК ЖГВ и отсутствие изменения данного показателя под воздействием ГХ позволяет сделать предположение об иммунокорригирующем действии хитозана.

Так как большая часть живых вакцин вводится в организм через слизистые оболочки, вызывая при этом активацию не только местного, но и системного иммунитета, исследовали влияние интраназальной иммунизации на экспрессию ТЬЯб в селезенке мышей.

Экспрессия ТЫ1з спленоиитами мышей при интраназальной иммунизации ЖГВ в комбинаты с производными хитозана.

Установлено, что и/н иммунизация мышей ХА ЖГВ приводила к повышению численности ТЫ*9 позитивных клеток (рис.1).

16-.

14

12 -Г 10 '

шЛ

ТЬЯ2

ТЬЯ4

ТЬЯ9

7 сутки

1 сутки II имм.

7 сутки II имм.

*

шт

Контр иХ/А «Х/А+Хит «Х/А+М

Т1Л2 ТЬЯ4 ТЬЯ9

Контр «Х/А »Х/А+Хит «Х/А+М

Рис.1. Влияние производных хитозана в составе живой гриппозной вакцины на экспрессию ТЬЯ-2, ТЫ1-4 и ТЬЯ-9 спленоцитами мышей.

Примечание. Х/А - холодоадаптированная гриппозная вакцина, Хит - р-р глютамата хитозония, М -суспензия микро/наночастиц сульфата хитозония. *- р<0,05 по сравнению с контрольной группой.

При включении в состав вакцины ГХ или МЧ СХ происходило более существенное (р<0,05) повышение содержания TLR9 и TLR2 -экспрессирующих клеток. Известно, что активация TLR-зависимого сигнального пути приводит к активации ядерного фактора транскрипции NF-кВ и экспрессии генов провоспалительных цитокинов и интерферонов I типа [Engel A., Barton G. 2010].

5.2. Экспрессия цитокинов под воздействием инактивированных и живых i вирусных вакцин в сочетании с производными хитозана

Экспрессия цитокинов в культуре дендритных клеток (ДК) мышей под воздействием ИГВ Ваксигрип в комбинации с производными хитозана.

Введение в культуру незрелых ДК мышей производных хитозана приводило к заметному повышению уровня IFN-y, IL-lß и IL-5 (рис.2), а ИГВ Ваксигрип - IFN-y, IL-lß, TNF-a, IL-6 и IL-10.

уровень цитокинов в культуре ДК мышей.

Примечание В - Ваксигрип, ГХ- глютамат хитозония, М - суспензия микро/наночастиц сульфата хитозония. * - р<0,05 по сравнению с культурой незрелых ДК ( нДК).

Введение ИГВ в комбинации с производными хитозана индуцировало экспрессию более широкого спектра цитокинов: ПТЧ-у, 1Ь-17, 1Ь-1Р, 1Ь-2, 1Ь-5, 1Ь-6 и умеренное снижение 1Ь-4 относительно нДК (Р<0,05). Такой спектр цитокинов, в особенности индукция 1Ь-17 и 1Ь-2, может способствовать синтезу хемокинов с привлечением в очаг воспаления моноцитов и нейтрофилов и дифференцировке Т и В лимфоцитов [КаЫг 8., 2011]. При этом снижение уровня 1Ь-4 также создает оптимальные условия для экспансии и дифференцировки ТЫ клеток. Полученные данные позволяют предположить что одним из молекулярных механизмов адъювантного действия хитозана, является прямое взаимодействие фрагментов хитозана с рецепторами ДК.

Цитокиновый статус мышей при парентеральной иммунизации ИГВ в комбинации с

производными хитозана.

Парентеральное (в/м) введение мышам ИГВ сопровождалось повышением в сыворотке крови мышей №N-7,1Ь-12,1Ь-17, ТОТ-а, 1Ь-5, ТСР-р, 1Ь-6,1Ь-10 (рис. 3).

Рис. 3. Уровень цитокинов в сыворотке крови мышей в динамике при парентеральном введении производных хитозана совместно с ИГВ Ваксигрип.

Ваксигрип в комбинации с производными хитозана индуцировали (Р<0,05) повышение 1Ь-12 (более чем в 10 раз относительно контроля) и умеренное повышение 1Ш-у, 1Ь-17, 1Ь-1|3 и 1Ь-5 (относительно ИГВ), что свидетельствует о выраженной активации клеточных механизмов врожденного иммунитета, определяющих направленность активации адаптивного иммунитета. Важно, что при этом происходило снижение продукции ЮТ-а и ТвР-р (по сравнению с ИГВ). Снижение синтеза ТОТ-а влечет за собой снижение риска системного воспаления. Эти данные могут свидетельствовать о способности хитозана поддерживать цитокиновый баланс и нивелировать вызванную ИГВ чрезмерную активацию иммунной системы. Индукция иитокинов в культуре спленоиитов мышей при интраназальной иммунизации ЖГВ в комбинации с производными хитозана.

Так как в сыворотках мышей, иммунизированных и/н ЖГВ в комбинации с производными хитозана, не было выявлено существенных различий в содержании цитокинов по сравнению с интактными мышами, исследовали уровень стимулированных ФГА цитокинов в культуре спленоцитов мышей через 7 суток после I и II иммунизации (рис.4). ЖГВ на первый срок хоть и повышала уровень многих цитокинов (1Ь-4,1Ь-17,1Ь-1р, 1Ь-2,1Ь-10,1Ь-12) относительно контроля, но уступала ЖГВ в комбинации с производными хитозана в продукции 1Ь-17 (в 4 раза), 1Ь-1р (в 2,4 раза), 1Ь-2 (в 1,25 раза) и И-12 (в 2,5 раза). При этом под воздействием ЖГВ отмечалось существенное повышение уровня ТОТ-а, который является эндогенным пирогеном, участвующим в системном воспалении, подавляющий репликацию вируса, но в то же время, индуцирующий апоптоз клеток и сепсис [Апёпзаш в, е1 а1., 2012].

Повторная иммунизация ЖГВ приводила к чрезмерной активации иммунокомпетентных клеток, судя по максимальным уровням всех исследованных цитокинов (за исключением 1Ь-12 и 1Ь-17, которые были ниже уровня, индуцированного ЖГВ+ГХ).

Введение мышам ЖГВ в комбинации с ГХ и МЧ СХ (рис.4) приводило к повышению (р<0,05) уровня 1Ь-1р, 1Ь-17,1Ь-12,1ПЧ-у и 1Ь-6. Эти цитокины относятся к ТЬ-1 индуцирующим, следовательно, можно предположить, что под действием производных хитозана произойдет поляризация иммунного ответа по ТЬ-1 пути.

Также сочетанное введение вакцины с производными хитозана приводило к снижению ТОТ-а, 1Ь-4 и СМ-СвЕ по сравнению с ЖГВ. Это может свидетельствовать об иммунокорригирующей способности хитозана с регуляцией гиперактивации иммунной системы, вызванной ЖГВ. Таким образом, использование ХА ЖГВ в комбинации с производными хитозана приводит к формированию более сбалансированного иммунного ответа.

А

тег/мл 200 -Г~

175 -} ~

150 Г"

125

100 :

75

50 | "{

25 и

о ш

■ к

ха «ха+гв ха+ма "»гх мч

1§ -I

||>

11ш

ЮТ-а ОМ-СЭР 1Е.-4 ГИ7 П.-1В 11.-2 И.-Ю П.-12

1Ж-у

"'633

Б «к

пкг/млл. 300 ■ 275 -250 ■ 225 | 200 | 175 + 150 125 100 -: 75 | 50

25 |

0 -М

ХА »ХА+ГВ ХА+МЧ =ГХ МЧ 511 315»

I

I

649 527 Г

||| I

1499 424 Г

! 1 268 Г

|—1!-{

I-----

III

пкг/мл 10000 -9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0

ЮТ-п ОМ-СЭР П.-4 П.-17 П.-1Р П.-2 П.-5 П.-10 П.-12

П.-6

Рис. 4. Уровень цитокинов (пкг/мл) в культуре спленоцитов иммунизированных ХА ЖГВ в комбинации с производными хитозана через 7 I иммунизация, Б - II -иммунизация.

Примечание. * - Р<0,05 по сравнению с контролем.

мышеи, сут: А -

5.3. Иммунофенотип лимфоцитов мышей при парентеральной и мукозальной иммунизации инактивированными и живыми вакцинами в комбинации с производными хитозана

Субпопуляиионная структура лимфоцитов мышей при парентеральной иммунизаиии ИГВ в комбинаиии с производными хитозана.

Для выяснения молекулярно-клеточных механизмов действия хитозана на клетки-эффекторы иммунной системы мышей двукратно внутримышечно иммунизировали ИГВ Ваксигрип с производными хитозана и через 1 и 7 суток после каждого введения оценивали иммунофенотип лимфоцитов селезенок (рис.5).

Рис.5. Субпопуляционная структура лимфоцитов селезенок мышей после иммунизации ИГВ с производными хитозана.

Примечание. К - контроль, В - Ваксигрип, ГХ - глютамат хитозана, МЧ - микрочастицы сульфата хитозана.

Вакцина без адъюванта в исследуемые сроки увеличивала численность активированных клеток (МНС II), существенно не влияя на их дифференцировку. В группах с производными хитозана и вакциной (В+ГХ и В+МЧ) на все сроки наблюдения отмечалось повышение (р<0,05) численности CD3, CD4, CD8, CD19, MHCII, NK, CD3/NK, CD5, у5Т, CD4/CD25/Foxp3 (T-reg) позитивных клеток по сравнению с контрольной группой и ИГВ. При этом максимально выраженные изменения были отмечены на 7 сутки второй иммунизации. Обращает на себя внимание постепенное снижение численности NK и NK.T клеток через 7 суток после каждой иммунизации (хотя их численность относительно контроля все же оставалась повышенной), что объясняется угасанием врожденных механизмов иммунитета на эти сроки. В группах с производными хитозана и вакциной (В+ГХ/МЧ) после второй иммунизации отмечалось постепенное снижение численности MHCII-

экспрессирующих клеток по сравнению с ИГВ на фоне возрастания численности популяции Т-регуляторных клеток (CD4/CD25/Foxp3, T-regs), что может свидетельствовать о включении под воздействием хитозана регуляторных механизмов, отвечающих за подавление гиперактивности иммунного ответа.

Илшунофенотип лимфоцитов мышей при интраназалъной иммунизаиии живой гриппозной вакциной (ЖГВ) в комбинации с производными хитозана.

Влияние интраназальной (и/н) иммунизации ХА ЖГВ в комбинации с производными хитозана на динамику иммунофенотипа лимфоцитов селезенки мышей изучено через 1 и 7 сут. после однократного и двукратного введения (рис.6).

И/н введение мышам ХА ЖГВ сопровождалось активацией NK, у8Т клеток на протяжении всего периода наблюдения и повышением (р<0,05) численности клеток, экспрессирующих CD71 (1 и 7 сут) и молекулы МНС II (I-Ak) (7 сут) после второго введения. Однако и/н иммунизация мышей ХА ЖГВ приводила к снижению численности Т-лимфоцитов с маркерами CD3 (в 1,74-1,79 раза), CD8 (2,2-1,5 раза) уже через 7 суток, CD4 (в 1,9-2,1 раза на протяжении всего периода наблюдения) и В1 клеток (через 7 и 1 сут. II иммунизации). Выявленное супрессивное действие ЖГВ нивелировалось с помощью производных хитозана, что свидетельствует об адъювантной и иммунокорригирующей активности этих соединений.

80 70 60 50 40 30 20 10 0

1 сут

Контроль ХА

_____

ш.

—I-г

■ —^

-t

—«

80 70 60 50 40 30 20 10 О

7 сут

ч\\

1ПТ

ЙШ

Л Л А <,Ь Л<0 /Л. A -IT- \ -N

с? ^ -Г 6> 6> ^ ¡5? v^ d^ 1 сут. II имм

Ф >6 с?1 о*' Л Л^ ¿t- c-i4 i"*

<9 (5>n # б5 б5 ^ ^ ¿У б5

7 гит II «мм Контроль

■ ХД ХА+ГХ

ш —•— ХА+МЧ

\\ А А

/\ /й\

/А\

\\ //А 1 А\ // \\ // \\ _

//л \ // \\ !/■ \у

ж W 1 г--

<S>V ^ ^ cPVW #^ ^ # c?% <5>*^VV <5? ^ / ^

Рис.6. Иммунофенотип лимфоцитов селезенок мышей при и/н введении гриппозной холодоадаптированной вакцины в комбинации с производными хитозана.

Иммунофенотип лимфоцитов мышей при парентеральной иммунизации инактивированной полиомиелитной вакциной в комбинации с производными хитозана

Было изучено также влияние производных хитозана в составе полиомиелитных вакцин на иммунофенотип лимфоцитов селезенок мышей. Инактивированный полиовирус 1 типа оказывал несущественное влияние на клеточное звено иммунитета мышей через 7 суток после двукратной иммунизации (рис. 7). При комбинированном введении инактивированного полиовируса совместно с ГХ наблюдалось значительное увеличение субпопуляций МНС II, CD3/NK (NKT), CD25, CD4/CD25/Foxp3 (T-reg), у5Т и CD5 -экспрессирующих клеток (р<0,05).

Парентеральное введение полиовируса в комбинации с МЧ СХ по сравнению с одним полиовирусом значительно повышало численность CD3, CD8, МНС II, CD19, убТ, NK и T-reg клеток (р<0,05).

Иммунизация инактивированной полиомиелитной вакциной Иммовакс Полио приводила к умеренному снижению численности CD3+ Т лимфоцитов, CD8+ CTL и

CD19+ В лимфоцитов (р<0,05), что свидетельствует о супрессирующем влиянии инактивированной полиовакцины на иммунную систему в исследованные сроки. Введение в состав Иммовакс-Полио ГХ или МЧ СХ приводило к увеличению количества CD3, CD8, NK, CD3/NK, CD4/CD25/Foxp3 и убТ -экспрессирующих клеток (р<0,05), что может свидетельствовать об иммунокорригирующем и адъювантных свойствах хитозана.

cd3

cd4

cd8

mhcii

cd19

NK CD3/NK CD25 T-reg

Рис. 7. Субпопуляционная структура лимфоцитов мышей, иммунизированных инактивированным полиовирусом или инактивированной вакциной Иммовакс-Полио в комбинации с препаратами хитозана (7 сутки после II иммунизации). * - Р<0,05 по сравнению с контролем.

ВЫВОДЫ

1. На модели инактивированных гриппозных вакцин установлена высокая адъювантная активность производных хитозана: глютамата хитозония (ММ 200 кОа) и микро/наночастиц сульфата хитозония.

2. Включение производных хитозана в состав инактивированных гриппозных и полиомиелитных вакцин мобилизует различные звенья врожденного иммунитета и, в том числе, активирует эндосомальные рецепторы дендритных клеток (тьяб 3,7,8,9), приводя к поляризации иммунного ответа по ТЫ - типу.

3. На модели ХА штамма - донора аттенуации А/Краснодар/101/35/59 (Н2№) показана принципиальная возможность повышения иммуногенности и защитной эффективности живых гриппозных вакцин (ЖГВ) при включении в состав вакцины производных хитозана в качестве адъювантов.

4. При парентеральной иммунизации мышей гриппозными и полиомиелитными вакцинами в комбинации с производными хитозана обнаружены общие закономерности в формировании цитокинового профиля: повышение уровня

IL-12 и IFN-y, а также снижение TNF-a в сыворотке крови и культуре спленоцитов мышей.

5. Иммунизация живыми и инактивированными вирусными вакцинами в сочетании с производными хитозана сопровождается иммунокорригирующим действием, что выражается в увеличении количества Т и В лимфоцитов, NK клеток, повышении уровня провоспалительных(1Ь-1 р, IL-6) и регуляторных (IL-17, IL-12, IFN-y) цитокинов, а также снижении TNF-a и TGF-P в крови иммунизированных мышей. Данная активность устраняет последствия иммуносупрессии, индуцированной вирусными вакцинами, и нейтрализует гиперактивацию иммунной системы.

6. При парентеральном введении инактивированной гриппозной вакцины с производными хитозана выявлено повышение численности CD3, CD4, CD5, CD8, MHCII, CD3/NK, yST, CD4/CD25/Foxp3 (T-reg) -экспрессирующих эффекторов, которые в наибольшей степени были выражены на 7 сутки второй иммунизации. Введение препаратов инактивированного полиовируса в сочетании с глютаматом хитозония повышает численность клеток с маркерами CD3, CD8, MHCII, CD 19, yST, NK и T-reg.

7. При мукозальной иммунизация живой гриппозной вакциной в комбинации с производными хитозана происходила активация NK, убТ, CD4, CD71, В1-лимфоцитов (CD5) и увеличивалась продукция IgG и slgA в респираторном тракте мышей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 • Переверзев А.Д.. Платонова Е.Ф., Ахматова Н.К., Маркушин С.Г., Гендон Ю.З., Кривцов Г.Г., Акопова И.И., Зверев В.В. Влияние хитозана на цитокиновый статус мышей при иммунизации вакциной Ваксигрип. Цитокины и воспаление. 2010, №3. С 28-32.

2. Переверзев А.Д.. Ахматова Н.К., Маркушин С.Г., Лебединская О.В., Годовалое А.П. Изучение влияния хитозана на продукцию некоторых цитокинов у мышей. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2010, №10, С.62-63.

3. Переверзев А.Д.. Ахматова Н.К., Маркушин С.Г, Лебединская О.В., Годовалов А.П. Сравнительная характеристика действия различных форм препарата хитозан на уровень цитокинов у мышей Материалы YII Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». 2010. С.144-145.

4. Маркушин С.Г., Переверзев А.Д.. Ахматова Н.К., Кривцов Г.Г. Изучение иммунного ответа мышей, иммунизированных интраназально живой гриппозной холодоадаптированной вакциной комбинации с производными хитозана в качестве адъювантов. Российский иммунологический журнал, 2011, Т.5(14), № 3-4, с.233-243.

5. Переверзев А.Д.. Ахматов Э.А., Сорокина Е.В., Маркушин С.Г., Сухно А.С., Хоменков В.Г., Ахматова Н.К. Иммунофенотип и функциональная активность лейкоцитов мышей при иммунизации вакциной ваксигрип в комбинации с хитозаном. Медицинская иммунология. -Т.13, №4-5. С.328-329.

6. Чертов И.В., Сорокина Е.В., Хоменков В.Г., Мурадян А.Г., Ахматов Э.А., Переверзев А.Д. Влияние интраназального метода введения антигенов условно патогенных бактерий на иммунофенотип и функциональную активность клеток лимфоидных органов. Медицинская иммунология. 2011. Т.13, №4-5. С.344.

7. Ахматова Н.К., Переверзев А.Д.. Маркушин С.Г., Лебединская О.В., Ахматов Э.А., Годовалов А.П., Русскова А.Н. Изменение концентрации цитокинов в периферической крови мышей при введении различных форм препарата хитозан. Медицинская иммунология.2011. Т.13, №4-5. С.516.

8. Лебединская Е.А., Ахматова Н.К., Лебединская О.В., Переверзев А.Д., Маркушин С.Г., Годовалов А.П., Ахматов Э.А. Изучение иммунофенотипа лимфоцитов мышей, иммунизированных интраназально живой гриппозной вакциной в комбинации с производными хитозана в качестве адъювантов. Материалы 18-го съезда оториноларинго-логов России, С-Пб, 2011, Т.1, С.80-83.

9. Ахматова Н.К., Маркушин С.Г., Кривцов Г.Г., Акопова И.И., Коптяева И.Б., Переверзев А.Д.. Лотте В.Д., Сухно А.С., Борисова О.В., Гендон Ю.З.. Сравнительное изучение адъювантных свойств препаратов хитозана при парентеральной ммунизации инактивированной гриппозной вакциной. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2011. № 3 (58) с.42-52.

10. Ахматова Н.К., Маркушин С.Г., Ахматов Э.А., Сорокина Е.В., Хоменков В.Г, Сухно А.С., Переверзев А.Д., Зверев В.В. Экспрессия эндоплазматических TLRs в дендритных клетках под воздействием инактивированных и живых вирусных вакцин в сочетании с хитозаном. Российский иммунологический журнал. 2012, Т.6(15), № 2, с.124-131.

11. Ахматова Н.К., Маркушин С.Г., Переверзев А.Д.. Кривцов Г.Г., Ахматов Э.А. Воздействие производных хитозана на дифференцировку и функциональную активность дендритных клеток мышей. 2011. Иммунология. №32, с.292-296.

12. Переверзев А.Д., Шинкарев С.М., Маркушин С.Г., Акопова И.И., Коптяева И.Б., Лисовская К.В., Борисова О.В., Кривцов Г.Г.. Факторы, влияющие на адъювантные свойства производных хитозана при парентеральном введении инактивированных гриппозных вакцин. Эпидемиология и вакцинопрофилактика.2012. №4(65), с.80-86.

13. Akhmatova N.K., Lebedinskaya O.V., Lebedinskaya Е.А., Pereverzev A.D.. Akhmatov E.A., Ilyinikh E.A. The immunophenotype of the mononuclear lymphocytes and the morphology of the lymphoid organs in mice immunized with inactive influenza vaccine combined with chitosane-derived compounds. X Congress of the Latin-American Immunology Association - ALA, May 29 - June 2,2012, Lima, Peru, P. 321-322.

Подписано в печать: 18.11.2012 Объем: 1,0 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 690 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495)363-78-90; www.reglet.ru

Актуальность темы. Инактивированные вирусные вакцины в течение последних 50 лет широко используются в борьбе с вирусными заболеваниями. Однако некоторые из них обладают серьезными недостатками. Так, в частности, гриппозные вакцины являются недостаточно эффективными для лиц пожилого возраста [102, 149, 128, 133] и не способны защищать от дрейфовых вариантов вируса гриппа [77, 92, 178]. С другой стороны, инактивированные полиомиелитные вакцины обладают относительно низкой иммуногенностью, и для создания прочного иммунитета против полиомиелита требуется многократная иммунизация.

В настоящее время для повышения эффективности вакцин в экспериментальных и клинических исследованиях применяют адъюванты различного происхождения: минеральные соли (гидроксид или фосфат алюминия и др.); растительные (сапонины - QuilA, QS21); микробные (убитые бактерии, липополисахарид и его производные, CpG-мотивы ДНК) и др. [132, 148].

Вследствие токсичности или недостаточной эффективности большинства адъювантов для широкого клинического использования разрешены только соли алюминия и водно-масляная эмульсия MF-59, а в некоторых странах вирусоподоб-¿и, ные частицы (VLP - virus-like particles) и иммуностимулирующий комплекс ,

1 f •> 1 ' КУ""'1 ' N , /I • 1 > v\ * ' < V ' " !>1 (ISCOM - immunostimulating complex) [180, 76]. Зарубежные коммерческие грип- ь позные вакцины выпускаются лишь с одним адъювантом MF-59, и такие вакцины оказались более иммуногенными при вакцинации пожилых лиц, однако, обладали повышенной реактогенностью [72, 112].

В литературе появились сообщения об использовании природного катионно-го полисахарида - хитозана в качестве мукозо-адгезивного адъюванта для инакти-вированных гриппозных и некоторых других вакцин, вводимых мукозально [72, 112, 113, 115, 183, 175, 175, 124, 155]. Хитозан является линейным полимером, состоящим из мономеров D-глюкозамина и М-ацетил-Б-глюкозамина, и отличающимся низкой токсичностью, биодеградируемостью и биосовместимостью. В последние годы было показано, что хитозан повышает эффективность инактивиро-ванных гриппозных и полиомиелитных вакцин при парентеральном введении [189, 99, 100]. Однако, несмотря на большой интерес к данному полимеру, многие аспекты иммунологической активности хитозана и его практического применения остаются до настоящего времени малоисследованными. Отсутствует информация о сравнительной адъювантной активности различных форм производных хитозана (растворимых, мелкодисперсных и.т.д.), а также о влиянии производных хитозана на врожденные механизмы иммунитета при парентеральной и мукозальной иммунизации инактивированными и живыми вирусными вакцинами.

Цель исследования: изучение адъювантных свойств производных хитозана на модели гриппозных и полиомиелитных вакцин с оценкой молекулярно-клеточ-ных механизмов их действия на эффекторы врожденного и адаптивного иммунитета.

Задачи исследования:

1. Исследовать адъювантные свойства производных хитозана различной химической природы.

2. Изучить влияние производных хитозана на активацию адаптивного иммунитета при иммунизации мышей инактивированными и живыми вирусными вакцинами.

3. Исследовать экспрессию Толл-подобных рецепторов дендритными клетками и спленоцитами мышей в ответ на введение инактивированных и живых вирусных вакцин в комбинации с производными хитозана в качестве адъювантов. , 4. Оценить цитокиновый профиль мышей при введении инактивированных и живых вирусных вакцин в комбинации с производными хитозана.

5. Определить особенности иммунофенотипа спленоцитов мышей при иммунизации инактивированными и живыми вирусными вакцинами в комбинации с препаратами хитозана.

Научная новизна работы

Впервые исследовано воздействие высокомолекулярного (ММ 200 Ша) глю-тамата хитозония и микро/наночастиц сульфата хитозония при парентеральном и мукозальном методах введения с инактивированными и живыми гриппозными вакцинами на стимуляцию врожденного и адаптивного иммунитета мышей. Установлена возможность повышения иммуногенности инактивированной полиомиелит-ной вакцины при включении в ее состав производных хитозана в качестве адъювантов.

Показано, что при парентеральном введении производных хитозана в комбинации с инактивированной гриппозной сплит-вакциной происходило усиление активации врожденного и адаптивного иммунитета у мышей, что проявлялось в экспрессии эндосомальных Толл-подобных рецепторов ДК (TLR7, TLR8, TLR9), индукции синтеза цитокинов в крови IL-12, INF-y, IL-17, IL-ip и IL-5; повышении численности Т (CD3, CD4, CD8, у5Т), В лимфоцитов (CD19, CD5), NK (CD16/32), NKT (CD3/NK), T-reg (CD4/CD25/Foxp3) клеток. Включение в состав полиомие-литных вакцин производных хитозана приводило к увеличению численности CD3, CD8, NK, CD3/NK, CD4/CD25/Foxp3 и yST позитивных клеток и ДК с экспрессией эндосомальных TLRs.

Выявлены общие закономерности цитокиного профиля при иммунизации животных инактивированными и живыми гриппозными и инактивированными по-лиомиелитными вакцинами: резкое повышение IL-12, умеренное повышение IFN-y и снижение TNF-a.

Установлено, что мукозальная иммунизация мышей живой гриппозной вакциной в комбинации с производными хитозана способствовала повышению уровней IgG и slgA в респираторном тракте мышей и препятствовала размножению вирулентного штамма вируса гриппа в легких мышей; увеличивала содержание TLR2 и t ' 1

ТЬЮ-экспрессирующих клеток, а также субпопуляций B1 (CD5) и Т-лимфоцитов (CD3, CD 8 и CD4) и NK.

Включение производных хитозана в состав инакгивированных гриппозных и полиомиелитных вакцин мобилизует различные звенья врожденного иммунитета, приводя к поляризации иммунного ответа по Thl-типу.

Научно-практическая значимость

Получено положительное решение Федерального Института промышленной собственности РФ на заявку № 2010114819/15 (020894) «Способ повышения имму-ногенности холодоадаптированного донора аттенуации для живых гриппозных вакцин» от 14.04.2010.

Показана целесообразность использования глютамата хитозония и суспензии микро/наночастиц сульфата хитозония для повышения иммуногенности и защитной эффективности инактивированных и живых гриппозных вакцин, активирующих мукозальный и системный иммунитет, при парентеральной иммунизации.

Включение в состав инакгивированной полиомиелитной вакцины модифицированных препаратов хитозана в качестве адъювантов, позволит повысить им-муногенность и защитную эффективность полиомиелитных вакцин.

Внедрение результатов исследования в практику

Материалы диссертационной работы включены в научно-экспериментальную работу лабораторий генетики РНК-содержащих вирусов и механизмов регуляции иммунитета ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова» РАМН. Результаты исследований используются в циклах лекций курса «Вакцинопрофилак-тика» ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выявлена зависимость адъювантных свойств производных хитозана от особенностей их химической природы при наибольшей активности глютамата хито-зония и микро/наночастиц сульфата хитозония, которые существенно не различались по адъювантным свойствам при введении с гриппозными и полиомиелитными вакцинами.

2. Введение производных хитозана в состав живых и инактивированных гриппозных вакцин способно повысить их иммуногенность и защитную эффективность. Введение производных хитозана в состав инактивированных полиовакцин повышает их иммуногенность.

3. Производные хитозана в составе вирусных вакцин при иммунизации животных приводят к повышению в крови количества Т и В лимфоцитов, клеток; уровня провоспалительных (1Ь-1р, 11.-6) и регуляторных (№N-7,1Ь-12,1Ь-17) цито-кинов и снижению Т№-а, что устраняет последствия иммуносупрессии, индуцированной вирусными вакцинами, и нейтрализует гиперактивацию иммунной системы при введении живых вакцин.

Апробация материалов диссертации и публикации

Основные материалы диссертационной работы доложены на: Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы»(Москва, 2010); IX Конгрессе детских инфекционистов России (Москва, 2010), VII Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (2010), научно-практической конференции молодых учёных НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2011), XIV Всероссийском форуме с международным участием им. академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011), Международной научно-практической конференции «От теории - к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины» (Саратов, 2011), X Латино-американском конгрессе иммунологов (Перу, 2012).

Апробация диссертации состоялась 29 мая 2012 г на совместной конференции Кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, лаборатории механизмов регуляции иммунитета и лаборатории генетики РНК-содержащих вирусов ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, из них 5

1,1 л статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, девяти глав собственных исследований, заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 189 источников, из которых 68 отечественных работ. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, иллюстрирована 3 рисунками и 29 таблицами.

выводы

1. На модели инактивированиых гриппозных вакцин установлена высокая адъ-ювантная активность производных хитозана: глютамата хитозония (ММ 200 kDa) и микро/наночастиц сульфата хитозония.

2. Включение производных хитозана в состав инактивированиых гриппозных и полиомиелитных вакцин мобилизует различные звенья врожденного иммунитета и, в том числе, активирует эндосомальные рецепторы дендритных клеток (TLRs 3,7,8,9), приводя к поляризации иммунного ответа по Thl- типу.

3. На модели ХА штамма - донора атгенуации А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) показана принципиальная возможность повышения иммуногенности и защитной эффективности живых гриппозных вакцин (ЖГВ) при включении в состав вакцины производных хитозана в качестве адъювантов.

4. При парентеральной иммунизации мышей гриппозными и полиомиелитными вакцинами в комбинации с производными хитозана обнаружены общие закономерности в формировании цитокинового профиля: повышение уровня IL-12 и IFN-y, а также снижение TNF-a в сыворотке крови и культуре спленоцитов мы ' , < W't, I I1'!1 1 i

ШеЙ. ' '

5. Иммунизация живыми и инактивированными вирусными вакцинами в сочетании с производными хитозана сопровождается иммунокорригирующим действием, что выражается в увеличении количества Т и В лимфоцитов, NK клеток, повышении уровня провоспалительных(1Ь-1р, IL-6) и регуляторных (IL-17, IL-12, IFN-y) цитокинов, а также снижении TNF-a и TGF-р в крови иммунизированных мышей. Данная активность устраняет последствия иммуносупрессии, индуцированной вирусными вакцинами, и нейтрализует гиперактивацию иммунной системы.

6. При парентеральном введении инактивированной гриппозной вакцины с производными хитозана выявлено повышение численности CD3, CD4, CD5, CD8, MHCII, CD3/NK, убТ, CD4/CD25/Foxp3 (T-reg) -экспрессирующих эффекторов, которые в наибольшей степени были выражены на 7 сутки второй иммунизации. Введение препаратов инактивированного полиовируса в сочетании с глютаматом хитозония повышает численность клеток с маркерами CD3, CD 8, MHCII, CD 19, yST, NK и T-reg.

7. При мукозальной иммунизация живой гриппозной вакциной в комбинации с производными хитозана происходила активация NK, у8Т CD4, CD71, В1-лимфоцитов (CD5) и увеличивалась продукция IgG и slgA в респираторном тракте мышей.