Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Анализ и стандартизация нового лекарственного препарата с анксиолитическим действием ГБ-115

На правах рукописи

Клумова Варвара Сергеевна

Анализ и стандартизация нового лекарственного препарата с анксиолитическим действием ГБ-115

14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

15 мдр тг

Москва-2012

005013861

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

кандидат фармацевтических наук Грушевская Любовь Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор, профессор кафедры фармацевтической и токсикологической химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России

Прокофьева Вера Ивановна

кандидат фармацевтических наук, заместитель начальника Испытательного центра экспертизы качества лекарственных средств ФГБУ «НЦЭСМП» Минздравсоцразвития России Нечаева Екатерина Борисовна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук

Защита диссертации состоится «18» апреля 2012 г. в часов

на заседании Диссертационного совета Д 208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России по адресу: 119991, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 1,НИЦ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России по адресу: 117997, г. Москва, Нахимовский проспект, 49.

Автореферат разослан «¿¿Р» <0 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор фармацевтических наук, профессор

Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Анксиолитики занимают особое положение среди современных психотропных препаратов в связи с оригинальной и широкой фармакологической активностью и чрезвычайной распространенностью.

Препараты с анксиолитическим действием широко используются не только в психиатрии, но и в других областях медицины, в том числе амбулаторно здоровыми людьми при эпизодических психологических трудностях, в конфликтных и экстремальных ситуациях. Их применяют в психиатрии, неврологии, хирургии, акушерстве, клинике внутренних болезней, педиатрии, дерматологии и т.д. Анксиолитики (транквилизаторы) также применяются и при лечении алкоголизма. Однако при назначении с этой целью препаратов бензодиазепинового ряда, может возникнуть бензодиазепиновая зависимость, сменяющая алкогольную. Этот факт находит свое объяснение в вовлеченности ГАМК-А- бензодиазепинового рецепторного комплекса в механизме формирования алкогольной зависимости. Поэтому поиск новых лекарственных средств с анксиолитическим действием, не являющихся лигандами к данному рецепторному комплексу, достаточно актуален.

В НИИ Фармакологии РАМН был синтезирован новый лекарственный препарат пептидной структуры с анксиолитическим действием - ГБ-115. В ходе исследований была изучена фармакологическая активность нового препарата. Установлено, что ГБ-115 является антагонистом ССК-2 рецепторов, обладает свойствами селективного анксиолитика с принципиально новым механизмом действия - модулирующим влиянием на функциональную активность холецистокининовой системы. Препарат не обладает гипноседативным, миорелаксирующим и амнезирующим эффектами. Выявлена антиалкогольная активность ГБ-115 на стадии развившейся физической зависимости. Показано, что препарат не потенцирует действие этанола.

Для внедрения препарата в медицинскую практику, наряду с фармакологическими испытаниями, необходимо разработать методы контроля его качества и стандартизации, и на их основе - нормативную документацию на

субстанцию и твердую дозированную лекарственную форму - таблетки дозировкой 1 мг.

Цель исследований. Целью настоящей работы являлось изучение физико-химических свойств, спектральных и хроматографических характеристик, разработка методик фармацевтического анализа и научно-обоснованных норм качества, а также создание нормативной документации на субстанцию и лекарственную форму ГБ-115. Задачи исследований

• изучить физические, химические и физико-химические свойства, определить фармакопейные показатели качества субстанции и лекарственной формы ГБ-115;

• изучить спектральные характеристики образцов субстанции ГБ-115 методами УФ-, ИК-, ЯМР'Н-спектроскопии, оценить возможность использования этих методов для подтверждения структуры и идентификации субстанции и в лекарственной форме;

• изучить хроматографическое поведение ГБ-115 и промежуточных продуктов его синтеза с помощью тонкослойной (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), разработать методики определения посторонних примесей в субстанции и лекарственной форме ГБ-115; определить содержание остаточных растворителей в субстанции с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ);

• разработать методики количественного определения ГБ-115 в субстанции и лекарственной форме;

• изучить стабильность субстанции и лекарственной формы препарата в процессе хранения в естественных условиях и методом «ускоренного старения», а также под действием различных внешних факторов;

• установить нормы качества субстанции и твердой дозированной лекарственной формы ГБ-115.

Научная новизна. Изучены физико-химические свойства нового оригинального анксиолитика ГБ-115, а также его спектральные характеристики с использованием методов УФ-, ИК-, ЯМР'Н-спектроскопии.

Исследована хроматографическая подвижность ГБ-115 и возможных примесей методом тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии, выбраны оптимальные условия хроматографирования, позволяющие добиться разделения ГБ-115 и примесей.

Показано, что применение метода кислотно-основного титрования в неводных растворителях для количественного определения субстанции ГБ-115 затруднено. Удовлетворительных результатов удалось добиться при применении для количественного определения ГБ-115 в субстанции метода определения общего азота по Къельдалю.

Впервые изучена стабильность субстанции под действием солнечного света, 90% относительной влажности воздуха, окислителей, разбавленных растворов кислот и щелочей. Показано, что препарат устойчив к. условиям повышенной влажности, а также к действию разбавленных растворов неорганических кислот, и неустойчив к действию солнечного света и разбавленных растворов щелочей.

Изучены физико-химические свойства, спектральные характеристики и хроматографическая подвижность твердой дозированной лекарственной формы ГБ-115, определены основные фармакопейные показатели ее качества.

Изучена стабильность субстанции и лекарственной формы ГБ-115 при хранении методом «ускоренного старения» и в естественных условиях, установлены их сроки годности.

Практическая значимость работы. Разработаны методики аналитического контроля субстанции и твердой дозированной лекарственной формы ГБ-115, установлены научно-обоснованные нормы качества. Разработанные методики внедрены в опытно-технологическом отделе НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН для анализа субстанции и твердой дозированной лекарственной формы ГБ-115.

Оформлены проекты ФСП на субстанцию и таблетки ГБ-115, 1 мг.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, апрель 2010) и на 5-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, июнь 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах, Перечня рекомендованного ВАК.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с плановой темой № гос. per. 01.2.006.06602 «Экспериментальное изучение механизмов развития алкоголизма и наркоманий, разработка средств и методов рациональной фармакотерапии» НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН. Базой проведения исследований являлась аналитическая группа опытно-технологического отдела НИИ фармакологии РАМН.

Личный вклад автора. Экспериментальные исследования выполнены автором лично. Изучены физико-химические свойства, разработаны и валидированы методики фармацевтического анализа субстанции и лекарственной формы ГБ-115. Проведена статистическая обработка полученных результатов. Установлены научно обоснованные нормы качества изучаемого лекарственного препарата и разработаны проекты ФСП.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта специальности фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Основные положения, выносимые на защиту: • Экспериментальное обоснование возможности использования физико-химических свойств и спектральных характеристик образцов субстанции и лекарственной формы ГБ-115 в контроле их качества;

• Результаты хроматографического анализа ГБ-115 и вероятных технологических примесей в субстанции и лекарственной форме методом обращено-фазовой ВЭЖХ;

• Экпериментальное обоснование выбора метода Къельдаля для количественного определения ГБ-115 в субстанции и методов УФ-СФМ и ВЭЖХ для количественного анализа таблеток ГБ-115;

• Методики качественного и количественного анализа ГБ-115 в субстанции и лекарственной форме и их валидационные характеристики;

• Оценка стабильности субстанции и лекарственной формы ГБ-115 под действием факторов окружающей среды, 90% относительной влажности воздуха, разбавленных растворов кислот и щелочей и результаты определения сроков годности методом «ускоренного старения» и при хранении в естественных условиях.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «объекты и методы исследования», " двух глав экспериментальных исследований, списка литературы и двух приложений. Работа изложена на 189 страницах машинописного текста, содержит 44 таблицы и 30 рисунков. Библиография включает 153 источника, из них 102 отечественных.

Объектами исследований являлись образцы субстанции нового оригинального анксиолитика ГБ-115, исходный продукт его синтеза -фенилгексановая кислота (ФПС) и промежуточные продукты его синтеза- N(6-фенилгексаноил)глицин (ФГГ), Ь-триптофана хлорогидрат (ТХ), ГБ-111, а также твердая дозированная лекарственная форма - таблетки 1 мг.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

С25Н3оМ40:

'25Пзо1^из

Мм 434,52

Рис.1 Структурная формула ГБ-115

В процессе исследований были использованы методы ИК-, УФ-, ЯМР'Н-спектроскопии, тонкослойной хроматографии (ТСХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), газожидкостной хроматографии (ГХ), титриметрические методы анализа.

Изучение физико-химических свойств и спектральных характеристик

субстанции ГБ-115

Определение внешнего вида, растворимости, цветности, потери в массе при высушивании, температуры плавления образцов субстанции ГБ-115 проводили по методикам ГФ XII издания, часть 1.

По внешнему виду все образцы субстанций ГБ-115 представляли собой белый или белый с желтоватым или кремоватым оттенком кристаллический порошок, очень легко растворимый в диметилформамиде, легко растворимый в ледяной уксусной и муравьиной кислотах, мало растворимый в этаноле, очень мало растворимый в ацетонитриле, практически нерастворимый в воде.

Поскольку субстанция ГБ-115 практически не растворима в воде, для оценки показателей качества «Прозрачность» и «Цветность» были приготовлены 0,5% растворы субстанций в этиловом спирте. Приготовленные растворы были прозрачными или по мутности не превышали эталон I, а по показателю «Цветность» - бесцветными или по цветности не превышали эталон йУб.

Значение удельного вращения образцов ГБ-115 лежало в интервале от -9 до -9,90 0 (5% растворы в диметилформамиде). Предварительно высушенные до постоянной массы образцы препарата плавились в интервале 177,5-182,5 °С в пределах 1-2 °С, с видимым разложением. Потеря в массе всех образцов ГБ-115 не превышала 0,5 %.

УФ - спектры 0,004% раствора образцов препарата в спирте этиловом 95% в области длин волн от 250 до 350 нм имели два максимума поглощения при длинах волн 282±2 нм, 290±2 нм (рис.2).

260.0 248.В 200.0 320.3 350.0 WAVELENG1H [na]

Рис. 2. УФ-спектр раствора ГБ-115 в этаноле 95% (0,004%)

В ИК-спектре (КВг, см"1) присутствуют следующие характеристические полосы поглощения (см "'): 3402 - свободная NH2-rpynna, ассоциированные NH-группы обнаруживаются в виде широкой диффузной полосы с максимумами при 3360 и 3197, валентные колебания протона в С-Н-группах наблюдаются при 2927-2852, интенсивные полосы поглощения при 1672 и 1625 соответствуют валентным колебаниям С=0 амидных карбонилов. Характерная для индольного цикла полоса обнаруживается при 1505 (С=С связи). Полосы при 1420 и 1350 соответствуют колебаниям C-N- связей (полоса Амид II), валентные колебания связи C-N в амидах (амид III) проявляются при 1240 и 1201. Полоса при 738 соотносится с орто-замещением в бензольном кольце, интенсивная полоса 697 принадлежит деформационным колебаниям связи N-H (в RNH2). ИК-спектры всех образцов субстанции были практически идентичны.

В спектрах ПМР образцов субстанции ГБ-115, снятых в растворе диметилсульфоксида - d6 (ДМСО-dó) с концентрацией растворов 2% (эталон измерений химических сдвигов - тетраметилсилан (ТМС)) присутствовали сигналы всех фрагментов молекулы. Характерными являются следующие полосы (м.д.): 1,24 (2Н, м. СН2Ц); 1,51 (4Н, м, СН2Ц, СН2Ц); 2,08 (2Н,т, СН2Ц); 2,53 (2Н, т, СН2Ц); 2,94 и 3,15 (2Н, два д. д. СН2Р Тгр); 3,55 и 3,75 (2Н, два д. д., СН2 Gly); 4,45 (1Н, м, СНаТгр); 6,90-7,35 и 7,55 (9Н, м, АгН); 7,11 и 7,43 (2Н, два с NH2); 7,18 (1Н, с, СН = Тгр); 7,93 (1Н, д, NH Тгр), 8,02 (1Н, т, NH Gly); 10,81 (1Н, с, NH" Тгр). ПМР-спектры всех образцов субстанции были практически идентичны.

На основании проведенных исследований было сделано заключение о возможности использования метода УФ-, ИК и ПМР-спектроскопии для идентификации ГБ-115.

Хроматографические методы в анализе субстанции ГБ-115

Хроматографическая подвижность ГБ-115 и его вероятных технологических примесей была изучена с помощью методов ТСХ и ВЭЖХ.

Анализ методом ТСХ проводили на пластинках Kiesilgel 60 F254 (Merk) в системе хлороформ: этанол: ледяная уксусная кислота: вода в соотношении (30: 10: 0,3: 0,5). Обнаружение полученных зон адсорбции проводили в камере, насыщенной парами йода и под УФ-светом с длиной волны 254 нм.

Параметры разделения и пределы обнаружения ГБ-115 и веществ-свидетелей технологических примесей представлены в таблице 1.

При определении посторонних примесей в серийных образцах субстанции ГБ-115 на хроматографическую пластинку наносили 20 мкл (100 мкг) раствора субстанции в этиловом спирте. Для оценки содержания примесей рядом наносили растворы свидетелей вероятных технологических примесей в этиловом спирте в количестве, эквивалентном 80 мкг (ФГГ) и 20 мкг (остальные примеси). В указанных условиях примесей в образцах субстанции обнаружено не было.

Таблица 1

Параметры разделения и пределы обнаружения ГБ-115 и веществ-свидетелей

Соединение Значение Rf Предел обнаружения, мкг Коэффициент

УФ-свет Пары йода разделения (т])*

ТХ(1) 0,27 2 2 —

ФГГ (2) 0,47 25 25 П(1 и 2) = 3,2

ГБ-111 (3) 0,60 1,5 1,5 т|(2 и 3) = 2,3

ГБ-115 (4) 0,64 1 1 ti(3 и 4) = 0,55

ФГК (5) 0,87 18 18 г)(4 и 5) = 3,4

'рассчитывается как отношение разности величин Rf соседних зон адсорбции, умноженной на длину пробега системы растворителей (мм) к половине суммы длины продольного сечения соседних зон адсорбции (мм)

Разработку методики ВЭЖХ проводили на жидкостных хроматографах LC-10AT (Shimadzu, Япония) и Golden System (Beckman, США) со спектрофотометрическими детекторами с переменной длиной волны на колонке 250 х 4,6 мм, заполненной сорбентом Qg с размером частиц 5 мкм (Luna CiS(2),

РЬепотепех). Элюирование проводили в изократическом режиме, температура колонки комнатная, аналитическая длина волны 215 нм, пробы растворяли в подвижной фазе.

Оптимальное разделение ГБ-115 и примесей наблюдалось в подвижной фазе ацетонитрил - вода (рН 3,15, Н3Р04) в соотношении 400:450. В выбранных условиях относительные времена удерживания ТХ, ФГГ, ФГК и ГБ-111 составляли: 0,23; 0,80; 1,62 и 2,83 соответственно. Хроматограмма модельной смеси представлена на рис. 3.

Содержание посторонних примесей рассчитывали относительно раствора РСО ГБ-115 с концентрацией 0,01 мг/мл.

I } I 4 I « I I I и и й и Я -1 '.I 7т ¡I-

34 Ж

Рис. 3. Хроматограмма модельного раствора ГБ-115 (1 мг/мл) и примесей (1 - ТХ, 2 - ФГГ, 3 - ГБ-115,4 - ФГК, 5 - ГБ-111, по 0,01 мг/мл каждого соединения).

Для проверки пригодности готовили раствор ГБ-115 и ФГК с

концентрацией каждого соединения 0,1 мг/мл. Пригодность хромато графической системы оценивали по следующим параметрам: коэффициент разделения между пиками ГБ-115 и ФГК составляет не менее 5; значение коэффициента асимметрии пика ГБ-115 (0) не более 1,5; число теоретических тарелок (И) не менее 8000 и составило 8388, относительное стандартное отклонение результатов отдельных измерений площадей пиков ГБ-115 не должно превышать 2%.

С помощью разработанной методики в субстанции ГБ-115 было обнаружено до пяти индивидуальных примесей в образце (табл. 2).

Содержание индивидуальной примеси во всех образцах ГБ-115 не превышало 0,23 %, а суммарное содержание примесей не превышало 0,6%.

С помощью метода добавок было показано, что примесь с относительным временем удерживания 0,80 является примесью ФГГ.

Таблица 2

Содержание посторонних примесей в образцах субстанции ГБ-115

Номер серии Содержание и относительные времена удерживания примесей (%) Сумма примесей (%)

W =0,80 to™ =0,85 toTi 1)32 tor>=l)41 t„T.=l,32 tori=l,84 tOT.=l,92

06-01-09 0,23 0,05 0,17 - - 0,05 0,07 0,57

07-03-09 - 0,13 - 0,11 - - - 0,24

08-03-09 - 0,19 - 0,15 - - 0,34

09-04-09 0,06 0,04 0,05 - - - - 0,15

10-05-09 0,05 0,03 0,05 - - - - 0,13

Метод ГЖХ в анализе субстанции ГБ-115

Исследование проводилось на газовом хроматографе Chrom 5 с пламенно-ионизационным детектором (Чехословакия), на стеклянной набивной колонке длинной 2,4 м и внутренним диаметром 3 мм, сорбент - 15% ПЭГ 1500 на Chromaten N-AW-DMCS (0,200 - 0,250 мм). Скорость потока газа носителя (азота) 50 мл\мин, скорость потока водорода 50 мл\мин, скорость потока воздуха 500 мл\мин, температура испарителя - 120°С, температура детектора -120°С, температура термостата программируемая, с повышением от 70 до 120°С в течение 15 мин. Указанные условия позволяли разделить этанол, ацетон, этилацетат, изопропиловый спирт и н-бутанол. В качестве внутреннего стандарта при приготовлении проб использовали н-бутанол. В образцах субстанции ГБ-115 остаточных растворителей обнаружено не было.

Количественное определение ГБ-115 в субстанции

Количественное определение ГБ-115 проводили методом Къельдаля по методике ГФ XII с добавлением металлического селена и растертой смеси калия сульфата и меди сульфата (в соотношении 10:1) в качестве катализаторов. Содержание ГБ-115 в образцах субстанции находилось в пределах от 98,72 до 99,84%. Результаты анализа представлены в таблице 3.

Поскольку метод определения общего азота по Къельдалю является достаточно длительным и трудоемким для рутинного анализа, нами были предприняты попытки разработки методик количественного определения субстанции ГБ-115 с помощью методов УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ, с

использованием рабочего стандартного образца (PCO). В качестве PCO был выбран один из исследованных образцов ГБ-115.

Таблица 3

Результаты количественного определения образцов субстанции ГБ-115

№ серии 06-01-09 07-03-09 08-03-09 09-04-09 10-05-09

Количественное содержание, % 99,15 98,87 99,22 99,37 99,8

Метрологические характеристики (п=5, Р=95) S=0,37 SXcp=0.17 ДХ=0,44 £=0,44% S=0,26 ДХ=0,3 £=0,3% S=0,41 ^хср=0Д8 ДХ=0,47 £=0,47% S=0,32 SXcp=0.14 ДХ=0,37 £=0,37% S=0,3 SXcp=0,13 ДХ=0,34 £ =0,34%

В УФ-спектрах PCO ГБ-115 в этиловом спирте 95% в диапазоне длин волн от 230 до 350 нм наблюдалось два максимума поглощения при 282±2 нм и 290±2 нм, при этом наиболее выраженным являлся максимум при 282 нм. Эта длина волны и была выбрана в качестве аналитической.

Линейная зависимость величины оптической плотности от концентрации растворов ГБ-115 в спирте этиловом 95% наблюдалась в интервале от 0,02 до 0,06 мг/мл, коэффициент корреляции 0,999 (рис. 4). При концентрации 0,05 мг/мл оптическая плотность составляла около 0,65, эта концентрация была выбрана рабочей.

v = 13,589* + 0,0032

ноицсмтрщия мгДи

Рис. 4. Линейная зависимость оптической плотности ГБ-115 от концентрации (282 нм) На модельных растворах PCO ГБ-115 с концентрацией от 0,04 до 0,06

мг/мл было показано, что относительная ошибка однократного определения

количественного содержания ГБ-115 не превышала 2% (табл. 4).

Содержание ГБ-115 в серийных образцах субстанции, определенное с

помощью метода УФ-спектрофотометрии, составило от 98,7 до 102%,

относительная ошибка определения не превышала 2%.

Таблица 4

Результаты количественного определения PCO ГБ-115 в модельных растворах _методом УФ-спектрофотометрии_

Взято Найдено Абсолютная Относительная Найдено Метрологические

ГБ-115, г ГБ-115, г ошибка, г ошибка, % ГБ-115 характеристики

Cm,) (ш2) (d= Шг-тО X=(dxl00/m,) (в % от тО (Р=95%, п=9)

0,0202 0,0198 -0,0004 1,98 98,02 X =99,60 S = 1,06 Sx = 0,35 АХ = 0,97 £ = 0,98%

0,0213 0,0211 -0,0002 0,94 99,06

0,0224 0,0224 0 0 100,00

0,0239 0,0237 -0,0002 0,84 99,16

0,0251 0,0250 -0,0001 0,40 99,60

0,0264 0,0269 +0,0005 1,89 101,89

0,0275 0,0275 0 0 100,00

0,0288 0,0285 -0,0003 1,04 98,96

0,0307 0,0306 -0,0001 0,33 99,67

Разработку методики количественного определения ГБ-115 методом

ВЭЖХ проводили в условиях определения посторонних примесей в субстанции

ГБ-115, что гарантировало специфичность методики. Аналитическая длина

волны (282 нм) соответствовала положению специфического максимума УФ-

спектров растворов ГБ-115 в подвижной фазе (рис. 5).

1. е.

в. о. в.

-а.

200.0 240.0 280.0 328.0 350.0 WAVELENGTH [л«1

Рис. 5. УФ-спектр раствора ГБ-115 (0,05 мг/мл) в подвижной фазе.

Линейная зависимость площади пика от концентрации растворов ГБ-115 наблюдалась в пределах интервала от 0,01 до 0,8 мг/мл (коэффициент корреляции 0,999) (рис. 6). Исходя из полученных данных, нами была выбрана рабочая концентрация растворов - 0,1 мг/мл.

Определение точности и сходимости результатов было проведено на модельных растворах РСО ГБ-115 с концентрацией от 0,08 до 0,12 мг/мл. В качестве стандартного раствора использовали раствор РСО ГБ-115 с концентрацией 0,1 мг/мл. Результаты исследований представлены в табл. 5.

Как видно по полученным данным, относительная ошибка однократного количественного определения ГБ-115 в субстанции не превышает 2,5%.

Рис. 6. Линейная зависимость площади пика ГБ-115 от концентрации в диапазоне от 0,01 до 0,8 мг/мл

По разработанной методике были проанализированы серийные образцы

субстанции ГБ-115. Содержание ГБ-115 в субстанции составляло от 99,5 до 102,0% при относительной ошибке определения, не превышающей 2%.

Таким образом, нами была подтверждена возможность проведения количественного анализа субстанции ГБ-115 с помощью методов УФ-СФМ и ВЭЖХ. Несмотря на то, что относительная ошибка определения методики УФ-СФМ ниже, чем относительная ошибка методики ВЭЖХ, в качестве основной была выбрана методика ВЭЖХ из-за ее специфичности и универсальности, позволяющей проводить качественный и количественный анализ в одних и тех же условиях. Однако следует отметить, что применением методов УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ для количественного анализа субстанции ГБ-115 возможно лишь при наличии стандартного образца.

Таблица 5

Результаты количественного определения ГБ-115 в модельных растворах _методом ВЭЖХ_

Взято ГБ- Найдено Абсолютная Относительная Найдено Метрологические

115, г ГБ-115, г ошибка, г ошибка, % ГБ-115 характеристики

(т,) (Щ) (с!= т2-т,) X = (В % ОТ ГП1) (Р=95%, п=9)

(<М00/т,)

0,0198 0,0202 +0,0004 2,02 102,02 X = 100,67 5 = 1,76 =0,59 АХ = 1,35 £ = 1,35%

0,0215 0,0210 -0,0005 2,33 97,67

0,0229 0,0234 +0,0005 2,18 101,18

0,0236 0,0239 +0,0003 1,27 101,27

0,0251 0,0255 +0,0004 1,59 101,59

0,0271 0,0272 +0,0001 0,34 100,34

0,0274 0,0276 +0,0002 0,73 100,73

0,0289 0,0283 -0,0006 2,08 97,92

0,0302 0,0309 +0,0007 2,33 102,33

Изучение стабильности и установление сроков годности субстанции ГБ-115

Показано, что при хранении в условиях 90% относительной влажности субстанция практически не поглощает влагу, при этом качество субстанции по показателям «Внешний вид» и «Посторонние примеси» по сравнению с исходными образцами не изменяется. Субстанция ГБ-115 не гигроскопична и устойчива к действию 90% относительной влажности.

Изучение фотолитической стабильности субстанции было проведено в условиях, обеспечивающих воздействие на испытуемые образцы прямого солнечного света. Пробы были отобраны по истечении 60 дней экспозиции и оценены по показателям «Внешний вид» и «Посторонние примеси» методом ВЭЖХ. Субстанция ГБ-115 приобрела светло-коричневый цвет. На хроматограммах испытуемого раствора было обнаружено более двадцати неидентифицированных примесей (суммарное содержание около 3,6%), в их числе примесь ФГГ в содержании 0,07%. Субстанция ГБ-115 неустойчива к действию солнечного света, что необходимо учитывать при ее хранении.

Устойчивость ГБ-115 к окислителям изучали при воздействии на субстанцию ГБ-115 3 % растворов водорода пероксида. В испытуемом растворе после двух месяцев хранения наблюдалось незначительное увеличение содержания посторонних примесей. Суммарное содержание примесей в испытуемом образце составляло около 0,52%, а в контрольном - около 0,38%.

Таким образом, молекула ГБ-115 относительно устойчива к процессу окисления в условиях эксперимента.

Стабильность ГБ-115 была также изучена в 0,1 М растворах соляной кислоты и натрия гидроксида, пробы хранили при комнатной температуре в течение 1,2 недель, 1 и 2 месяцев.

Показано, что после 2 месяцев в 0,1 М растворе НС1 хроматографическая чистота ГБ-115 не изменялась, и появления дополнительных примесей не наблюдалось. Тогда как в 0,1 М №ОН дополнительные примеси начали появляться уже через неделю, что указывало на неустойчивость ГБ-115 к щелочному гидролизу. Через 2 месяца суммарное содержание примесей составило около 6,5%.

Установление сроков годности субстанции ГБ-115 было проведено методом «ускоренного старения» при температуре 60°С. Показано, что качество образцов субстанции ГБ-115 после хранения методом «ускоренного старения» в течение срока, эквивалентного 2 годам хранения в естественных условиях, по всем показателям практически не изменилось. Установлен предварительный срок годности для субстанции ГБ-115 - 2 года.

На основании результатов проведенных анализов были установлены нормы качества на субстанцию ГБ-115 (табл. 6).

Таблица б

Нормы качества субстанции ГБ-115_

ПОКАЗАТЕЛИ МЕТОДЫ НОРМЫ

Описание Визуальный Белый или белый с желтоватым или кремоватым оттенком кристаллический порошок без запаха

Растворимость ГФ XII, вып. 1, с. 92 Очень легко растворим в диметилформамиде, легко растворим в муравьиной и уксусной кислотах, мало растворим в этаноле и изопропиловом спирте, практически нерастворим в воде.

Подлинность ИК-спектроскопия Полосы поглощения в ИК-спектре препарата должны совпадать с полосами поглощения прилагаемого рисунка.

УФ-спектроскопия 0,05% раствор в спирте этиловом 95% в области длин волн от 250 до 350 нм должен иметь максимумы поглощения при 282±2нм и 290±2 нм

Температура плавления ГФ XII, вып. 1, с. 29 От 177,0 до 182,0 "С

Прозрачность раствора ГФ XII, вып. 1, с. 98 Прозрачный или не более эталонного раствора I (5 % раствор в этаноле)

Цветность раствора ГФ XII, вып. 1, с. 93 Бесцветный или не более GY6 (5 % раствор в этаноле)

Удельное вращение ГФ XII, вып. 1, с. 54 От -8,5 до -10,5° (5% раствор в хлороформе)

Посторонние примеси ВЭЖХ Единичной примеси не более 0,5%. Суммарное содержание примесей не более 1%

Потеря в массе при высушивании ГФ XI, вып. 1, с. 176 Не более 0,5%

Сульфатная зола и тяжелые металлы ГФ XII, вып. 1, с. 115, с. 121 Не более 0,1% Не более 0,001%

Микробиологическая чистота ГФ XII, часть 1, с. 162 Категория 2.2

Количественное определение Метод Къельдаля ГФХИ вып. 1, с.101 От 99 до 101%

Упаковка В соответствии с ФСП

Маркировка В соответствии с ФСП

Хранение В защищенном от света месте, при температуре не выше + 30°С

Срок годности 2 года

Анализ и стандартизация твердой дозированной лекарственной формы ГБ-115

Твердая дозированная лекарственная форма ГБ-115 - таблетки дозировкой 1 мг со средней массой 102 мг. Внешний вид - таблетки белого или почти белого цвета плоскоцилиндрической формы. Отклонения от средней массы образцов таблеток ГБ-115 не превышало установленных ГФ XI норм: ± 7,5 %. Время распадаемости не превышало 5 минут, что также соответствовало нормам, установленным ГФ XI (вып. 2. стр. 154).

Определение показателя «Посторонние примеси» в таблетках ГБ-115

Определение показателя «Посторонние примеси» в таблетках ГБ-115 проводили методом ВЭЖХ в условиях, подобранных для субстанции ГБ-115.

На хроматограммах извлечений из плацебо в указанных условиях были обнаружены пики со временами удерживания около 1,5 - 2,5 мин

Анализ модельной смеси таблеток ГБ-115 и свидетелей известных примесей показал, что в выбранных условиях хроматографирования не наблюдается разделения ТХ и пиков извлечения из плацебо (рис. 7). Однако поскольку ни в одном из образцов субстанции этой примеси обнаружено не было, мы сочли возможным ее содержание в таблетках не определять.

Рис. 7. Хроматограмма извлечения из таблеток ГБ-115 (концентрация 1 мг/мл) в смеси с примесями (концентрация каждого соединения 0,01 мг/мл): 1 -пики извлечения из плацебо, 2 - ФГГ, 3 - ГБ-115,4 - ФГК, 5 - ГБ-111

В указанных условиях был проведен анализ образцов лекарственной формы ГБ-115. Содержание единичной примеси оценивали путем сравнения площадей примесей и раствора РСО ГБ-115 с концентрацией 0,01 мг/мл (1% от

концентрации ГБ-115 в испытуемом растворе). В образцах таблеток ГБ-115 было обнаружено до трех примесей, в их числе примесь с относительным временем удерживания 0,8 (ФГГ). Содержание единичной примеси не превышало 0,44%, суммарное содержание примесей составляло не более 0,72%.

Проверку пригодности хроматографической системы проводили также как и при анализе субстанции.

Количественное определение ГБ-115 в таблетках Разработку методики количественного определения ГБ-115 в таблетках с помощью УФ-СФМ проводили на модельных смесях ГБ-115 и плацебо (извлечения в спирте этиловом 95%) при аналитической длине волны 282 нм, рабочая концентрации 0,05 мг/мл.

Для проверки точности и сходимости методики готовили модельные смеси субстанции ГБ-115 и плацебо с концентрацией ГБ-115 0,05 мг/мл ± 20% (от 0,04 до 0,06 мг/мл) (табл. 7). Содержание плацебо в растворах эквивалентно содержанию в таблетке. Концентрация раствора PCO ГБ-115 - 0,05 мг/мл.

Таблица 7

Результаты количественного определения ГБ-115 в модельных смесях _ (УФ-спектрофотометрия)__

Взято ГБ- Найдено Абсолютная Относительная Найдено Метрологические

115, г (mi) ГБ-115, г ошибка, г ошибка, % ГБ-115 характеристики

(т2) (d= mr-mi) X = (dxl00/m,) (в % от mi) (Р=95%, п=9)

0,0399 0,0402 0,0003 0,75 100,75 Хср.= 100,66% S = 0,67 Sxcp-0,22 АХ =0,50 S- 0,5%

0,0426 0,0432 0,0006 1,4 101,41

0,0452 0,0458 0,0006 1,3 101,3

0.0478 0,0483 0,0005 1 101,05

0,0499 0,0504 0,0005 1 101

0,0523 0,0525 0,0002 0,38 100,4

0,0550 0,0554 0,0004 0,73 100,7

0.0574 0,0570 -0,0004 0,7 99,3

0,0604 0,0604 0 0 100

По разработанной методике были проанализированы серийные образцы

таблеток. Содержание ГБ-115 в серийных образцах таблеток составляло от 0,9887 до 1,0142 мг в таблетке. Относительная ошибка не превышала 1,7%.

В качестве альтернативного метода количественного определения ГБ-115 в таблетках нами был выбран метод ВЭЖХ.

Анализ проводили в тех же условиях, что и определение посторонних примесей, за исключением аналитической длины волны, которая составила 282

нм. При этой длине волны поглощения электромагнитного излучения извлечением из плацебо практически не наблюдалось.

На модельных смесях ГБ-115 и плацебо (содержание эквивалентно содержанию в таблетке) с концентрацией ГБ-115 0,1 мг/мл ± 20% (от 0,08 до 0,12 мг/мл) было показано, что относительная ошибка единичного определения не превышает 1,6% (таблица 8).

По разработанной методике были проанализированы серийные образцы ГБ-115, содержание ГБ-115 в лекарственной форме при определении методом ВЭЖХ составляло от 0,9930 до 1,0130 мг в таблетке.

Таблица 8

Результаты количественного определения ГБ-115 в модельных смесях (ВЭЖХ)

Взято Найдено Абсолютна Относительная Найдено Метрологически

ГБ-115, г ГБ-115, г я ошибка, г ошибка, % ГБ-115 е характеристики

(mi) (т2) (с!= Шг-тО Х = (ёх100/т,) (в % ОТ nil) (Р=95%, п=9)

0,0082 0,00826 +0,00006 0,73 100,73 Хср=99,97% Б=0,86 8хср=0,29 АХ =0,66 £= 0,66

0,0085 0,00843 -0,00007 0,82 99,18

0,0090 0,00899 -0,00001 0,11 99,89

0,0096 0,00955 -0,00005 0,52 100,52

0,0099 0,00994 +0,00004 0,40 100,40

0,0105 0,01043 -0,00007 0,67 99,33

0,0111 0,01093 -0,00017 1,53 98,47

0,0118 0,01196 +0,00016 1,36 101,36

0,0121 0,01208 -0,00002 0,17 99,83

Определение показателя «Однородность дозирования» таблеток ГБ-115

Определение однородности дозирования таблеток ГБ-115 было проведено с помощью метода УФ-спектрофотометрии в условиях количественного определения. Отклонения в однородности дозирования ГБ-115 не превышали установленных ГФ XI норм (не более ± 15%).

Определение показателя «Растворение» таблеток ГБ-115 Субстанция ГБ-115 нерастворима в воде и 0,1М растворах хлористоводородной кислоты, в качестве среды растворения использовали 0,5% раствор натрия лаурилсульфата в воде. Анализ проводили на приборе «лопастная мешалка», при 50 оборотах в минуту, объем среды растворения -500 мл, температура 37±0,5 °С. Количественное определение ГБ-115 проводили методом ВЭЖХ. Из-за низкой дозировки ГБ-115 чувствительность методики количественного определения при длине волны 282 нм была недостаточной, в качестве аналитической была выбрана длина волны 230 нм.

Линейная зависимость площади пика растворов ГБ-115 в 0,5% растворе натрия лаурилсульфата от концентрации наблюдалась в интервале от 0,001 до 0,05 мг/мл (коэффициент корреляции 0,9998), рабочая концентрация 0,01 мг/мл. На модельных смесях ГБ-115 и плацебо с концентрацией ГБ-115 от 0,008 до 0,012 мг/мл показано, что относительная ошибка определения не превышает 1,6%.

При определении показателя «Растворение» серийных образцов таблеток ГБ-115 в указанных условиях за 45 минут из таблеток высвобождалось более 75% ГБ-115 (рис. 8), что соответствует нормам ГФ СССР XI издания.

Рис. 8. Кинетика высвобождения ГБ-115 из таблеток

Установление сроков годности твердой дозированной лекарственной

формы ГБ-115

Стабильность таблеток при хранении была изучена методом «ускоренного старения» при 60 °С в течение срока, эквивалентного 2 годам хранения в естественных условиях. Качество таблеток по всем показателям по истечении срока хранения не изменилось, установлен предварительный срок годности таблеток - 2 года.

В результате проведенных исследований разработаны предварительные нормы качества таблеток ГБ-115 (табл. 9),

Таблица 9

Нормы качества таблеток ГБ-115_

Показатели Метод испытания Нормы

Описание Визуально Таблетки белого или почти белого цвета плоскоцилиндрической формы

Подлинность УФ-спектрофотометрия УФ-спектр поглощения испытуемого раствора в области длин волн от 230 до 300 нм должен соответствовать УФ-спектру поглощения раствора PCO ГБ-115

ВЭЖХ Время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора должно совпадать со временем удерживания пика ГБ-115 на хроматограмме раствора PCO

Средняя масса ГФ XI, вып.2, с. 154 От 101,9 мг до 103,4 мг (102 мг±7,5%)

Отклонение от средней массы ГФ XI, вып.2, с. 154 18/20: ± 7,5%; 2/20: ± 15%

Распадаемость ГФХ1, вып.2, с. 154 Не более 15 мин

Однородность дозирования УФ-спектрофотометрия 10/10: ±15% или 28/30: ±15%, 0/30: более чем ±25%

Посторонние примеси ВЭЖХ Единичной примеси: не более 0,5%; Сумма примесей: не более 1%

Микробиологическая чистота ГФ XII, часть 1, с.160 Категория ЗА

Растворение ГФ XI, вып.2, с. 154 и ОФС 42-0003-04,ВЭЖХ Не менее 75% за 45 минут

Количественное определение ВЭЖХ от 0,9930 мг до 1,0130 мг (0,102±7,5%)

Срок годности 2 года

ВЫВОДЫ

1. Изучены физико-химические свойства и спектральные характеристики фармакопейных образцов субстанции ГБ-115 методами Ж-, УФ- и ПМР-спектроскопии. Показана возможность использования этих методов для контроля качества субстанции ГБ-115.

2. Изучена хроматографическая подвижность ГБ-115, исходного (ФГК) и промежуточных (ТХ, ФГТ и ГБ-111) продуктов синтеза методами тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Показано преимущество более селективного и чувствительного метода ВЭЖХ при определении содержания посторонних примесей в субстанции ГБ-115.

3. Проведены исследования по разработке способа количественного определения субстанции ГБ-115 с помощью химических и инструментальных методов анализа. Показана возможность применения метода определения

общего азота по Къельдалю, а также методов УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ для количественного определения ГБ-115 в субстанции.

4. Определены основные фармакопейные показатели качества твердой дозированной лекарственной формы (таблеток) ГБ-115. Изучена хроматографическая подвижность препарата с помощью метода ВЭЖХ. Показана возможность применения метода ВЭЖХ для анализа посторонних примесей, количественного определения и определения однородности дозирования таблеток ГБ-115.

5. Разработана методика определения показателя «Растворение» таблеток ГБ-115 в среде 0,5% раствора натрия лаурилсульфата. Установлено, что за 45 минут из таблеток высвобождалось более 75% ГБ-115.

6. Изучена стабильность субстанции и таблеток ГБ-115 под действием факторов окружающей среды. Показано, что субстанция ГБ-115 не гигроскопична, относительно устойчива к окислению, но неустойчива к действию солнечного света и к щелочному гидролизу. Таблетки ГБ-115 неустойчивы к условиям повышенной влажности и действию солнечного света.

7. В результате изучения стабильности при хранении субстанции и таблеток ГБ-115 методом «ускоренного хранения» определены предварительные сроки их годности - 2 года.

8. Установлены нормы качества субстанции и твердой дозированной лекарственной формы ГБ-115. На основании проведенных исследований составлены проекты фармакопейных статей предприятия на субстанцию и твердую дозированную лекарственную форму ГБ-115.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Клумова B.C., Грушевская Л.Н., Авдюнина Н.И., Пятин Б.М. Разработка методик анализа субстанции нового анксиолитика пептидной структуры // Тезисы докладов XVII Российского Национального конгресса «Человек и лекарство» - Москва, 2010 . с. 637

2. Клумова B.C., Грушевская JI.H., Авдюнина Н.И., Пятин Б.М. Изучение хроматографического поведения препарата ГБ-115// Тез. докл.5-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» Москва, 2010, с. 49-50

3. Клумова B.C., Грушевская JI.H., Авдюнина Н.И., Пятин Б.М., Сергеева М.С., Гаевая Л.М., Дуденкова М.Е. Изучение физико-химических свойств и разработка методик анализа субстанции нового оригинального анксиолитического средства ГБ-115// Химико-фармацевтический журнал, 2011, т. 45, № 10, стр. 53-56

4. Клумова B.C., Грушевская Л.Н., Авдюнина Н.И., Пятин Б.М., Гаевая Л.М., Сергеева М.С., Дуденкова М.Е., Алексеев К.В., Блынская Е.В., Тихонова Н.В., Турчинская К.Г. Разработка методик анализа твердой дозированной лекарственной формы ГБ-115// Химико-фармацевтический журнал, 2011, т. 45, №12, стр. 27-31

5. Клумова B.C., Грушевская Л.Н., Авдюнина Н.И., Пятин Б.М., Сергеева М.С., Иванов А.И. Анализ субстанции нового анксиолитика// Журнал Фармация, 2012, №1, с. 6-8

Подписано в печать: 27.02.2012 Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 55 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Страстной бульвар, д. 6, стр. 1 (495) 978-43-34; www.reglet.ru