Анализ экспрессии генов при пролиферативных заболеваниях молочной железы.

Троценко, Иван Дмитриевич

Диссертации по медицине → Онкология

Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Анализ экспрессии генов при пролиферативных заболеваниях молочной железы.

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Троценко, Иван Дмитриевич Москва 2012 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.01.12

Автореферат диссертации по медицине на тему Анализ экспрессии генов при пролиферативных заболеваниях молочной железы.

На правах рукописи

Троценко Иван Дмитриевич

АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ПРИ ПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

14.01.12-он кология

1 1 ОПТ 2012

Москва-2012

005053213

Работа выполнена в ФГБОУ Российский университет дружбы народов (ректор -доктор физ-мат. наук, профессор, академик РАО В.М. Филиппов) и ФГБУ Российский научный центр рентгенорадиологии Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (директор - д.м.н., профессор, член-корреспондент РАМН, В.А.Солодкий.)

Научный руководитель

Доктор медицинских наук, профессор Н.В. Харченко Научный консультант

Доктор медицинских наук, профессор В.К. Боженко

Официальные оппоненты:

Член-корр. РАМН, профессор Ашрафян Лев Андреевич

Руководитель лаборатории комбинированных методов лечения гинекологических заболеваний хирургического отдела

Доктор медицинских наук Бабкина Ирина Валентиновна

ведущий научный сотрудник лаборатории клинической биохимии РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН

Ведущая организация: ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «_»_2012 года на заседании Диссертационного

совета при ФГБУ Российский научный центр рентгенорадиологии Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (117997, г. Москва, ул. Профсоюзная, д. 86)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российский университет дружбы народов и ФГБУ Российский научный центр рентгенорадиологии Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Автореферат разослан «_»_

2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Доктор медицинских наук, профессор

З.С. Цаллагова

Актуальность проблемы

Рак молочной железы (РМЖ) в настоящее время является наиболее распространенным онкологическим заболеванием в женской популяции, составляя 20,5% от всех онкологических заболеваний (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2011). Одновременно достаточно высокими, до 70%, являются показатели выявляемое™ заболевания на ранних (I-II) стадиях, что позволяет использовать менее токсичные программы лечения (Харченко В.П., Рожкова Н.И., 2010). С другой стороны, излишне щадящая тактика в отношении онкологических больных связана с риском рецидивирования заболевания.

Выбор тактики лечения при раке молочной железы определяется сочетанием факторов, описывающих такие особенности опухоли как размер образования, наличие метастазов в регионарные лифоузлы, степень злокачественности, пролиферативная активность, оцениваемая по уровню экспрессии белка Ki67 (Jalava Р., et al., 2006) и т.д (А. Goldhirsch, W. С. Wood, 2009). При этом, однозначными показаниями для адьювантной химиотерапии принято считать большой размер опухоли (Т>5 см), более 4 метастазов в регионарные лимфоузлы (N2-N3), высокая степень злокачественности (G3) и высокая пролиферативная активность (экспрессия KÍ67 более 30%), минимальные значения по данным критериям (Т<2 см, N0, Gl, Ki67<15%) представляют собой относительные показания для адьювантной гормонотерапии. Однако при размере опухоли от 2.1 до 5 см, наличии метастазов в 13 регионарных лимфоузлах (N1), 2 степени злокачественности (G2), экспрессии KÍ67 16-30%енобходимость назначения адьювантной химиотерапии является недоказанной. Таким образом, использование «классических» факторов прогноза не всегда позволяет адекватно выделить группу высокого риска рецидивирования.

В многочисленных исследованиях сказано, что исследование экспрессии одного или комплекса генов в ткани опухоли имеет независимое прогностическое значение (Chang, 2007, Cobliegh, 2005, Esteva, 2005, Gianni, 2005, Habel, 2006, Mina, 2006, Paik, 2004, и Paik, 2006). В частности, эксперты конференции StGallen 2011 признают, что использование профиля экспрессии генов OncotypeDX™, в основе которого лежит оценка экспрессии мРНК 16 генов, участвующих в процессах пролиферации, апоптоза и клеточной дифференцировки, адекватно отражает биологическую гетерогенность рака молочной железы и может применяться для определения прогноза заболевания и рекомендации назначения химиотерапии (Gnant М., 2011). Таким образом, выявление закономерностей экспрессии генов, участвующих в процессах пролиферации, апоптоза, клеточной дифференцировки и межклеточных взаимодействий в ткани доброкачественных и злокачественных образований может дать новые, более достоверные факторы прогноза и повысить эффективность дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных образований молочной железы.

Цель работы

Исследовать экспрессию комплекса генов, участвующих в процессах пролиферации, апоптоза, клеточной дифференцировки и межклеточных взаимодействий в морфологически неизмененной ткани молочной железы при фиброаденоме и инвазивном раке молочной железы, и определить взаимосвязь их

экспрессии с клинико-морфологическими характеристиками доброкачественных и злокачественных опухолей.

Задачи исследования

• Провести сравнительный анализ экспрессии генов в неизмененной ткани и при раке молочной железы

• Провести сравнительный анализ экспрессии генов в неизмененной ткани и при фиброаденоме молочной железы

• Провести сравнительный анализ экспрессии генов в образцах рака молочной железы в зависимости от клинико-морфологических характеристик опухоли

Научная новизна

Количественно определена экспрессия мРНК 17 генов маркеров пролиферации, апоптоза, клеточной дифференцировки и межклеточных взаимодействий в неизмененной ткани молочной железы, в ткани фиброаденомы и рака молочной железы на различных стадиях заболевания. Изучена взаимосвязь относительного содержания мРНК исследуемых генов в ткани опухоли молочной железы с основными клинико-морфологическими особенностями опухоли. Впервые оценена связь уровня экспрессии генов в морфологически неизмененной ткани с морфологическими особенностями рака молочных желез. Получены статистически значимые отличия экспрессии исследуемых генов в зависимости от типа опухоли, а также в зависимости от клинико-морфологических характеристик рака молочной железы. На основании определения и сравнения уровня экспрессии мРНК рецептора прогестерона PGR в ткани рака молочной железы разработан алгоритм, позволяющий выявлять опухоли, имеющие неблагоприятные молекулярно-биологические характеристики.

Научно-практическая значимость

В результате проведенного исследования оценена клиническая значимость и информативность определения уровня экспрессии мРНК комплекса генов в ткани фиброаденомы молочной железы и ткани рака молочной железы. Разработан алгоритм определения изменения направления экспрессии мРНК рецептора прогестерона PGR при раке молочной железы как дополнительный диагностический критерий в комплексной диагностики потенциально более злокачественных опухолей.

Положения, выносимые на защиту

1. Экспрессия активаторов пролиферации, ингибиторов апоптоза, клеточных рецепторов и генов межклеточных взаимодействий в образцах инвазивного рака молочной железы значительно повышена по сравнению с морфологически неизмененной тканью и фиброаденомой.

2. В образцах инвазивного РМЖ при большом размере опухоли, наличии регионарных и отдаленных метастазов повышена экспрессия активаторов пролиферации, ингибиторов апоптоза и генов межклеточных взаимодействий.

3. Активность процессов пролиферации и апоптоза в морфологически неизмененной ткани связана с уровнем экспрессии рецепторов стероидных гормонов и HER2/neu опухоли при раке молочной железы.

4. Сравнительная индивидуальная оценка экспрессии генов в образцах опухоли и морфологически неизмененной ткани дает дополнительную информацию для выявления потенциально более злокачественных опухолей.

Апробация материалов диссертации.

Материалы диссертации были доложены: на II Междисциплинарном форуме «Медицина молочной железы: на стыке специальностей», Москва в 2012 году; Worldwide Innovative Networking in personalized cancer medicine (WIN) 2012, Париж. Апробация работы прошла в ФГУ Российском научном центре рентгенорадиологии Росмедтехнологий 09 апреля 2012 года.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 4 в журналах, рецензируемых ВАК.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 105 страницах и состоит из введения, трех глав, а также выводов и списка литературы. Указатель литературы содержит ссылки на 12 отечественных и 220 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и 14 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика обследованных пациентов.

Исследован уровень экспрессии 21 гена в 190 образцах ткани молочной железы, из них 57 образцов рака молочной железы (РМЖ), 38 образцов фиброаденомы (ФА) молочной железы и 95 образцов морфологически неизмененной ткани. Средний возраст больных ФА составил 33,1±10,6 лет, средний размер опухоли 3,2±2,9 см3. В 65% опухоль локализовалась в верхне-наружном квадранте молочной железы.

Средний возраст больных РМЖ составил 57,1±11 лет. В 63,1% (36 из 57 случаев) гистологически опухоль была представлена инфильтративным протоковым раком, в 19,2% (11 из 57) - инфильтративным дольковым, в 8,7% (10 из 57) наблюдались прочие формы (муцинозный рак и др.). В 75,3% (43 из 57 случаев) размер опухоли не превышал 5 см, в 10,5% (11 из 57) наблюдалось распространение опухоли на кожу молочной железы, грудную стенку, инфильтративные отечные формы (Т4). Регионарные метастазы (N1 - N3) наблюдались в 46,6% (26 из 57 случаев), отдаленные (на момент операции) в 7,1% (4 из 57). Опухоли I, II и III степени злокачественности встречались в 14% (8 из 57), 56,1% (32 из 57) и 29,9% (17 из 57), соответственно. Экспрессия рецепторов эстрогена наблюдалась в 66,7% (38 из 57), прогестерона в 63,2% (36 из 57), гиперэкспрессия НЕ112/пеи (3+) в 14% (8 из 57), амплификация с-егЬВ2 в 29,2% (9 из 32 случаев).

Все пациентки проходили обследование и получали лечение в хирургических отделениях ФГБУ «РНЦРР» Минздравсоцразвития в период с ноября 2009 по июль 2011 года. Гистологические заключения давались в соответствии с гистологической

классификацией опухолей молочной железы (ВОЗ, 2003г.) (F.A. Tavassoli, P. Devilee "Pathology and Genetics of Tumours of the Breast and Female Genital Organs". - IARC, Lyon.- 2003: 432). Оценка степени злокачественности рака молочной железы давалась в соответствие с критериями Elston-Ellis (Eiston C.W., Ellis I.O. "Pathological prognostic factors in breast cancer. I. The value of histological grade in breast cancer: experience from a large study with long-term follow-up."- Histopathology.- 1991. - v.19.-№5.-p.403^10.).

Для иммуногистохимического (ИГХ) определения экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона использовались антитела (NCL-L-ER-6F11, NCL-L-PGR-312, Leica, Великобритания). Для ИГХ определения экспрессии онкобелка С-егЬВ2 использованы моноклональные мышиные антитела NCL-L-CB11 производства фирмы Leica, Великобритания. Результаты иммуногистохимических реакций экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона оценивались полуколичественным способом (Allred D.C., et al., 1998). Оценка экспрессии онкобелка С-егЬВ2 выполнялась согласно рекомендациям А. С. Wolff и соавт. 2007.

Анализ уровня экспрессии генов проводился на основании количественного измерения мРНК методом ПЦР с обратной транскрипцией. Для каждого образца анализировалась экспрессия 21 гена (17 функциональных генов и 5 референсных). Для удобства интерпретации результатов функциональные гены были объединены в 5 групп: гены -маркеры пролиферации (KI67, STK15, CCNB1) и ингибитор пролиферации PTEN, гены ингибиторы апоптоза (BIRC5, BCL2, BAG1, TERT) и активаторы апоптоза(&4Д NDRG1), гены клеточной дифференцировки: рецептор эстрогена ESR, рецептор прогестерона PGR, рецептор эпидермального фактора роста С-егЬВ2 и его гомолог GRB7, а также маммаглобин MGB1, и гены межклеточных взаимодействий (ММР11, CTSL2). В качестве референсных использовали гены GUS В, В2М, ABL, HPRT и ТВР.

Забор исследуемого материала для молекулярно-генетического анализа проводился сразу после операции по поводу рака молочной железы или фиброаденомы. После получения ткани она немедленно помещалась в стабилизирующий раствор (EverFresh RNA, «Клоноген», Россия) и хранилась при -70°С. В каждом случае одновременно производился забор морфологически неизмененной ткани молочной железы. Выделение РНК проводили согласно инструкции с помощью наборов реагентов для выделения РНК RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, USA). Реакции обратной транскрипции и ПЦР ставили, используя наборы и оборудование НПО «ДНК Технология» согласно протоколу производителя. Уровень экспрессии мРНК измеряли в относительных единицах, определяемых методом сравнения индикаторных циклов (Ср).

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием методов непараметрического и параметрического анализа. Различие групп полагали статистически значимым при Р<0,05. Обработку полученных результатов проводили в программном пакете Statistica 6.0 (StatSoft, USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сравнительная оценка экспрессии генов в образцах морфологически неизмененной ткани, фиброаденомы и рака молочной железы.

I. Анализ изменения экспрессии генов в зависимости от типа ткани.

1.1. Сравнение морфологически неизмененной ткани (МНТ) и ткани рака молочной железы (РМЖ)

При сравнительном анализе экспрессии 17 генов в морфологически неизмененной ткани и образцах инвазивного РМЖ был выявлен ряд достоверных отличий. В таблице 1 представлены значения экспрессии генов, для которых отличия статистически значимы.

Таблица 1. Уровни экспрессии генов в образцах морфологически неизмененной ткани (МНТ) и при раке молочной железы (РМЖ). Статистически значимые отличия отмечены *.

Ген п - МНТ п - РМЖ Среднее - МНТ Среднее - РМЖ Р

KI67 57 57 16,24 115,34 0,000001*

STK1S 57 57 52,29 230,16 0,000011*

CCNB1 57 57 11,03 54,45 0,000004*

PTEN 57 57 10,95 7,31 0,000314*

BCL2 57 57 65,00 38,99 0,008238*

NDRG1 57 57 490,11 175,43 0,000012*

BIRCS 57 57 24,29 113,66 0,000086*

ESR 57 57 170,86 375,36 0,002346*

PRG 57 57 1953,76 4241,21 0,013229*

GRB7 57 57 394,06 1991,66 0,027666*

MGB1 57 57 23351,24 91731,80 0,012923*

ММР11 57 57 25,94 237,78 0,000062*

р*- отличия меньше 0,05

Для генов-маркеров пролиферации (KI67, CCNB1, STK15) отмечено значительное повышение уровня экспрессии в образцах РМЖ по сравнению с неизмененной тканью. Для опухолевого супрессора PTEN получены достоверно более высокий уровень экспрессии в МНТ по сравнению с РМЖ. Таким образом, для ткани РМЖ характерно значительное повышение пролиферативной активности по сравнению с МНТ.

При определении экспрессии генов контроля апоптоза для ингибитора апоптоза BCL2 отмечено снижение экспрессии в образцах РМЖ по сравнению с МНТ. Для генов, участвующих в регуляции внешнего пути апоптоза (BIRC5 и NDRG1), наблюдается повышение экспрессии ингибитора апоптоза BIRC5 и снижение уровня экспрессии активатора каспаз NDRG1 при РМЖ по сравнению с МНТ. Разнонаправленность изменения экспрессии генов контролирующих апоптоз может свидетельствовать о дискоординации процессов апоптоза при РМЖ.

При анализе экспрессии генов клеточной дифференцировки отмечено статистически значимое повышение экспрессии мРНК ESR, PGR, GRB7 и MGB1 при РМЖ.

При анализе генов, включенных в кластер межклеточных взаимодействий, достоверные отличия получены для ММР11, матриксной металлопротеиназы, разрушающей межклеточный матрикс. Ее экспрессия существенно повышена при инвазивном РМЖ, что может быть связано с повышенной протеолитической активностью клеток опухоли.

Таким образом, клетки рака молочной железы отличаются повышенной пролиферативной и протеолитической активностью по сравнению с морфологически неизмененной тканью молочной железы. Кроме того, в целом в образцах РМЖ снижена экспрессия активаторов апоптоза и повышен уровень экспрессии рецепторов стероидных гормонов.

1.2 Анализ изменения экспрессии генов в ткани фиброаденомы молочной железы.

При сравнительном анализе экспрессии генов в образцах морфологически неизмененной ткани и фиброаденомы статистически значимых отличий экспрессии для генов-маркеров пролиферации и апоптоза получено не было, за исключением активатора апоптоза ВАХ, экспрессия которого была снижена в образцах ФА (Таблица 2). В группе генов клеточной дифференцировки в образцах ФА по сравнению с МНТ была повышена экспрессия ЕБ7?, С-егЬВ2 и МСВ1, а также матриксной металлопротеиназа ММР11.

Таблица 2. Уровни экспрессии генов в образцах неизмененной ткани и при фиброаденоме ФА

| Ген | п - МНТ п - ФА Среднее МНТ ¡Среднее ФА Р

ВАХ | 38 38 21,63 11,52 0,031106*

| 38 38 58,41 592,22 0,001124*

| С-егЬВ2 I 38 38 23,38 63,70 0,108310

| МСВ1 | 38 38 5695,54 | 24790,50 0,092220

| ММР11 ! 38 38 3,36 13,74 0,092982

Отсутствие статистически значимых отличий экспрессии генов-маркеров пролиферации и апоптоза в образцах МНТ и ФА может свидетельствовать о сохранении баланса этих процессов в ткани фиброаденомы, а одновременное повышение экспрессии мРНК рецепторов эстрогена, С-егЬВ2 и ММР11 отличает ФА от морфологически неизмененной ткани.

1.3 Сравнение экспрессии генов в ткани фиброаденомы и рака молочной железы.

Поиск молекулярных отличий доброкачественных и злокачественных новообразований представляет клинический интерес, т.к. морфологическая картина не всегда дает исчерпывающую информацию.

В образцах РМЖ по сравнению с ФА был отмечен значительно более высокий уровень экспрессии маркеров пролиферации (К167, БТК15 и ССЫВ1) и ингибитора апоптоза В1ЯС5. Одновременно в образцах ФА экспрессия ингибитора пролиферации РТЕЫ и активатора апоптоза ИПКС1 была выше, а экспрессия матриксной

металлопротеиназы ММР11, наоборот, ниже по сравнению с образцами РМЖ. В таблице 3 приведены данные только для генов, экспрессия которых в образцах отличается статистически значимо или имеет выраженную тенденцию.

Таблица 3. Сравнение уровня экспрессии генов в образцах ткани фиброаденомы и рака молочной железы.

Ген п ФА п РМЖ Среднее ФА Среднее РМЖ Р

К167 38 57 22,45 115,34 0,006858*

БТК15 38 57 52,70 230,16 0,050340

СС1\В1 38 | 57 14,08 54,45 0,060180

РТЕМ 38 | 57 11,70 7,31 0,003554*

N01101 38 I 57 342,06 175,43 0,037029*

ВШС5 38 56 16,79 113,66 0,052468

ММР11 38 57 16,83 237,78 0,051963

Таким образом, в образцах РМЖ наблюдается значительно более высокий уровень пролиферативной, антиапоптотической и протеолитической активности по сравнению с ФА при отсутствии статистически значимых отличий экспрессии рецепторов стероидных гормонов и эпидермального фактора роста (С-егЬВ2).

Как уже ранее отмечалось, активность процессов пролиферации и апоптоза в клетках ФА сравнима с морфологически неизмененной тканью. При этом повышенная активность экспрессии рецепторов экстрогена и С-егЬВ2 отличает ФА от неизмененной ткани. При сравнении ФА и РМЖ наблюдаются значительные отличия экспрессии маркеров пролиферации и апоптоза. Данные результаты могут свидетельствовать о различной природе механизмов контроля пролиферации и апоптоза в клетках фиброаденомы и рака молочной железы, чем, вероятно, и объясняются различия в морфологических проявлениях ФА и РМЖ. Отсутствие статистически значимых отличий экспрессии рецепторов стероидных гормонов и эпидермального фактора роста в образцах ФА и РМЖ на фоне значительного повышения пролиферативной активности в клетках злокачественной опухоли косвенно может указывать на фундаментальное свойство автономности опухолевого роста - отсутствие необходимости во внешних стимулах для поддержания высокого уровня пролиферации.

На рисунках 1 и 2 представлены сравнительные уровни экспрессии маркеров пролиферации (К167, 8ТК15 и ССКВ1) и апоптоза (ингибитора апоптоза В1ЯС5 и проапоптотического ЫОГЮ1) в различных типах исследованной ткани (морфологически неизмененная ткань, фиброаденома, инвазивный рак молочной железы).

ЕН К167

-т- АиНа{ЗТК15)

^ ССНВ1 (осМпВ1)

Рисунок 1. Сравнение уровня экспрессии генов пролиферации (К167, АиИХА, ССЫВ1) в зависимости от типа ткани

Меап; ОТизЬэг: Меап±0,95*8Е

Рисунок 2. Сравнение уровня экспрессии генов контроля апоптоза (N01101 и В1ЯС5) в зависимости от типа ткани

3. Анализ экспрессии генов в зависимости от морфологических характеристик ткани в образцах рака молочной железы.

Увеличение размеров опухоли, появление или увеличение количества лимфогенных или появление гематогенных метастазов также может характеризоваться различными закономерностями экспрессии генов, описание которых может стать дополнительным диагностическим инструментом и позволит проводить более прецизионную оценку биологических свойств ткани опухоли.

3.1 Анализ экспрессии генов в зависимости от размеров опухоли

При сравнении уровня экспрессии исследуемых генов в образцах тканей РМЖ относительно размеров опухолевого узла по данным морфологического исследования наибольшее количество статистически значимых отличий экспрессии наблюдается при сравнении групп Т1 - Т2 (таблица 4).

Таблица 4. Отличия уровня экспрессии генов в зависимости от размеров опухоли в образцах РМЖ.

Ген п-Т1 п-Т2 Среднее Т1 Среднее Т2 Р

STK15 17 18 115,2 382,87 0,007009*

CCNB1 17 18 29,2 82,46 0,016579*

PTEN 17 18 7,8 5,51 0,014793*

BCL2 17 18 45,6 27,16 0,060804

BIRCS 17 18 56,1 151,79 0,003388*

MGB1 17 18 184654,0 51119,70 0,102752

При увеличении размеров опухоли отмечается статистически значимое повышение экспрессии генов маркеров пролиферации БТК15 и ССЫВ1, снижение экспрессии опухолевого супрессора РТЕЫ. Для генов кластера апоптоза характерно повышение экспрессии ВШС5 и снижение экспрессии ВС12. Экспрессия маммаглобина МСВ1 была снижена в опухолях Т2. Таким образом, увеличение размеров опухоли сопровождается повышением пролиферативной и антиапоптотической активности. На рисунке 3 представлен график, отражающий динамику изменения экспрессии маммглобина в зависимости от размера опухоли.

2.4Е5 ,

2 3 4 ~ Mean

"Т" Mean±0,95'SE Т (размер)

Рисунок 3. Изменение экспрессии маммаглобина (MGB) в зависимости от размера опухоли.

На графике видно, что изменение экспрессии маммаглобина обратно пропорционально увеличению размеров опухоли. Интересно, что закономерность нарушается для образцов Т4, экспрессия MGB в которых сравнима с образцами Т2; вероятным объяснением являются различные критерии классификации, применяемые для стадирования образцов Т1 - ТЗ и образцов Т4.

3.2 Анализ экспрессии генов в зависимости от наличия метастатических лимфоузлов и отдаленных метастазов (N и М по классификации TNM)

Был проведен анализ экспрессии генов в образцах РМЖ в зависимости от наличия метастазов в регионарные лимфоузлы (N) и отдаленных метастазов (М). Получены достоверные отличия экспрессии CCNB1, ВАХ, BIRC5, CTSL2, ММР11, С-егЬВ2 при сравнении уровня экспрессии генов между образцами N0 (отсутствуют метастазы в регионарных лимфоузлах) и образцами N2 (метастазы в 4-9 регионарных лимфоузлов) (таблица 5). Аналогично получены отличия уровня экспрессии KI 67, CTSL2, BIRC5 при сравнении образцов МО и М1 (таблица 6).

В образцах N2 повышена экспрессия маркера пролиферации CCNB1 по сравнению с N0, ингибитора каспаз BIRC5, проапоптотического гена ВАХ, рецептора эридермального фактора роста С-егЬВ2, а также протеолитических ферментов ММР11 и CTSL2.

Таблица 5. Отличия экспрессии генов в образцах РМЖ зависимости от наличия/отсутствия лимфогенных метастазов

Ген \ n-NO n-N2 Среднее N0 Среднее N2 Р

CCNB1 | 31 8 43,4 96,01 0,050648

ВАХ 1 31 8 21,1 31,99 0,043132*

BJRC5 і 31 8 85,1 246,41 0,020292*

С-егЪВ2 1 31 8 37,7 109,09 0,079520

ММР11 ! 31 8 169,9 440,78 0,088813

CTSL2 ! 31 8 23,9 137,06 0,041970*

В образцах М1 по сравнению с МО была повышена экспрессия маркера клеточной пролиферации К167 и ингибитора апоптоза ВШС5, а также протеиназы катепсина СТБЬ2. Таким образом, опухоли при наличии лимфогенных или гематогенных метастазов отличаются повышенной экспрессией маркеров пролиферации и ингибиторов апоптоза, а также повышением активности генов (ММР11 и СТБЬ2), участвующих в процессах ремоделирования матрикса (таблица 6).

Таблица 6. Отличия экспрессии генов в образцах РМЖ зависимости от наличия/отсутствия гематогенных метастазов

Ген п - МО | п - М1 | Среднее МО Среднее Ml р

| KI67 53 | 4 | 104,87 254,07 I 0,004816*

| BIRC5 52 | 4 96,07 | 342,33 0,001441*

CTSL2 53 | 4 | 23,38 232,86 0,000328*

Согласно результатам ранее проведенного анализа пролиферативная и протеолитическая активность в злокачественной опухоли в целом выше по сравнению с морфологически неизмененной тканью. Прогрессирование заболевания (увеличении

размеров опухоли, наличии лимфогенных и гематогенных метастазов) сопровождается дальнейшим повышением пролиферативной и протеолитической активности клеток на фоне снижения апоптоза.

3.3 Анализ экспрессии генов в ткани РМЖ в зависимости от степени злокачественности, статуса рецепторов стероидных гормонов и эпидермального фактора роста HER2/neu.

Степень злокачественности, экспрессия рецепторов стероидных гормонов и эпидермального фактора роста HER2/neu в настоящее время являются критериями для молекулярного фенотипирования рака молочной железы, поэтому определение закономерностей экспрессии генов, участвующих в процессах пролиферации, апоптоза и т.д. является интересным.

3.3.1 Анализ экспрессии генов в ткани РМЖ в зависимости от степени злокачественности

Наибольшие отличия были получены при сравнении экспрессии генов в образцах первой (G1) и третьей (G3) степени злокачественности. В образцах G3 была повышена экспрессия генов маркеров пролиферации STK15 и CCNB1, а также экспрессия катепсина CTSL2. Экспрессия С-егЬВ2 и его гомолога GRB7 также была повышена в этой группе, а экспрессия ESR, PGR и MGB1 наоборот, снижена (Таблица

7).

Таблица 7. Экспрессия генов в образцах РМЖ зависимости от степени злокачественности опухоли

| Ген n G1 n G3 і Среднее G1 Среднее G3 | Р

| STK1S 23 9 150,9 371,50 0,056505

| CCNB1 23 і 9 34,6 55,51 | 0,062933

| PRC 23 9 4347,9 951,11 | 0,068085

\ С-егЬВ2 23 9 17,7 84,25 | 0,004652*

\ GRB7 23 | 9 577,8 4837,16 | 0,041629*

| MGB1 23 9 187572,2 17533,47 | 0,013123*

1 CTSL2 23 9 16,0 37,13 | 0,020145*

Повышение степени злокачественности на молекулярном уровне сопровождается повышением пролиферативной и протеолитической активности на фоне повышенной экспрессии мРНК рецепторов эпидермального фактора роста С-егЬВ2 и его гомолога GRB7, опосредующих пролиферативные сигналы. При этом экспрессия маркеров дифференцировки (PGR и MGB) снижена в образцах G3. Для циклина В (CCNB1) и маммаглобина (MGB) характерно антибатное изменение экспрессии с ростом степени злокпчественности, что проиллюстрировано на рисунках 4 и 5, соответственно.

100

CD 80 С

3, 60

I »

Рисунок 4. Изменение экспрессии мРНК циклина В (CCNB1) в опухолях различной степени злокачественности (G1-G3).

ЗЕ5 2.5Е5 2Е5 § 1.5Е5 1Е5 50000 0

Рисунок 5. Изменение экспрессии мРНК маммаглобина (MGB1) в опухолях различной степени злокачественности (G1-G3).

3.3.2 Анализ экспрессии генов в ткани РМЖ в зависимости от статуса рецепторов стероидных гормонов и HER2/neu по данным ИГХ исследования

При сравнительном анализе экспрессии в зависимости от статуса рецепторов стероидных гормонов по данным ИГХ в эстроген-позитивных опухолях повышена экспрессия ингибиторов апоптоза BCL2 и BAG, кроме того, в РЭ+ опухолях снижена экспрессия мРНК эпидермального фактора роста и его гомолога GRB7, а также катепсина CTSL2 (Таблица 8). Снижение экспрессии мРНК С-егЬВ2 и GRB7 в этой группе может указывать на антагонизм экспрессии рецепторов эстрогена и эпидермального фактора роста.

степень злокачественности

Таблица 8. Уровни экспрессии генов в образцах РМЖ в зависимости от статуса рецепторов эстрогена по данным ИГХ

Ген n РЭ- n РЭ+ Среднее РЭ- Среднее РЭ+ P

BCL2 11 26 20,9 47,8 0,014204*

BAG 11 26 2,9 6,5 0,055183

ESR 11 26 44,1 475,7 0,003644*

PRG 11 26 1372,2 4857,9 0,058054

C-erbB2 11 26 67,3 19,0 0,019363*

GRB7 11 26 3945,0 598,8 0,062202

CTSL2 11 26 36,0 17,2 0,026759*

Сравнительный анализ экспрессии генов в прогестерон-позитивных и прогестерон-негативных опухолях показал, что в ПР+ опухолях снижена экспрессия ингибитора апоптоза TERT (12,6 относительных единиц в ПР+ по сравнению с 73,0 o.e. в ПР-; Р=0,0279) и матриксной металлопротеиназы ММР11 (136,5 o.e. по сравнению с 277,5 o.e.; Р=0,0896). Также в опухолях с положительным статусом рецепторов стероидных гормонов (РЭ+/РП+) статистически значимо повышена экспрессия мРНК ESR и PGR (Р<0,05).

В целом, при сравнительной оценке экспрессии генов в группах рецептор позитивных и негативных опухолей статистически значимых отличий экспрессии генов-маркеров пролиферации и апоптоза не получено, однако активность генов межклеточных взаимодействий (ММР11 и CTSL2) была выше в рецептор-негативных опухолях. При сравнительном анализе экспрессии генов в образцах с минимальным (1+) и максимальным (3+) по данным ИГХ уровнем экспрессии HER2/neu в образцах 3+ статистически значимые отличия получены только для мРНК С-егЬВ2 (93,3 o.e. при HER2/neu 3+ по сравнению с 12,2 о.е при HER2/neu 1+; Р=0,00008) и его гомолога GRB7 (1872,1 o.e. при HER2/neu 3+ по сравнению с 370,3 о.е при HER2/neu 1+; Р=0,000002), экспрессия которых выше в образцах 3+.

Таким образом, в отличие от таких факторов прогноза как размер опухоли, наличие лимфогенных/гематогенных метастазов и степень злокачественности, где изменение пролиферативной и апоптотической активности опухоли было вполне объяснимым, при сравнительном анализе экспрессии генов в зависимости от статуса рецепторов стероидных гормонов и HER2/neu не получено статистически значимых отличий по уровню экспрессии генов-маркеров пролиферации и апоптоза. Эти результаты могут косвенно быть следствием феномена пролиферативнойт автономности опухоли. В тоже время, с учетом роли рецепторов стероидных гормонов и HER2/neu в процессах пролиферации и апоптоза в нормальной ткани молочной железы, мы провели сравнительную оценку экспрессии генов в МНТ в зависимости от ИГХ статуса рецепторов стероидных гормонов и HER2/neu в опухоли.

4. Анализ экспрессии генов в морфологически неизмененной ткани в зависимости от статуса стероидных гормонов и НЕ1*2/пеи в образцах РМЖ по данным ИГХ

Мы провели анализ уровня экспрессии генов в морфологически неизмененной ткани молочной железы в зависимости от уровня экспрессии рецепторов в ткани опухоли. Были обнаружены достоверные отличия экспрессии генов в неизмененной ткани при сравнении таких фенотипических характеристик опухоли как статус рецепторов стероидных гормонов и НЕП2/пеи. Если опухоль по данным ИГХ экспрессирует рецепторы эстрогена, в морфологически неизмененной ткани наблюдается более низкий уровень пролиферативной активности: снижение экспрессии маркеров пролиферации К167, БТК15 и ССМВ1 при отсутствии достоверных отличий в уровне экспрессии мРНК самих рецепторов (Таблица 9).

Таблица 9. Анализ экспрессии генов в морфологически неизмененной ткани в зависимости от уровня рецепторов стероидных гормонов в ткани рака молочной железы по данным иммуногистохимического исследования.

Ген пРЭ- п РЭ+ Среднее РЭ- Среднее РЭ+ Р

KI67 \ 19 38 29,31 10,92 0,003994*

| STK15 \ 19 38 86,26 37,72 0,024436*

| CCNB1 \ 19 38 16,38 8,73 0,003210*

Аналогичная картина наблюдается в неизмененной ткани при прогестерон-позитивном по данным ИГХ фенотипе опухоли: снижение экспрессии КІ67, БТК15, ССЫВ1, ингибитора апоптоза ВШС5, а также С-егЬВ2 и его гомолога СКВ7 (Таблица 10).

Таблица 10. Анализ экспрессии генов в морфологически неизмененной ткани в зависимости от уровня рецепторов стероидных гормонов в ткани рака молочной железы по данным иммуногистохимического исследования.

Ген пРП- п РП+ Среднее РП- Среднее РП+ Р

КГ 67 21 36 25,18 12,31 0,043056*

STK15 21 36 84,22 36,21 0,022675*

CCNB1 21 36 14,57 9,36 0,044246*

BIRCS 20 35 44,86 13,36 0,016630*

С-егЬВ2 21 36 42,63 18,93 0,073629

GRB7 21 36 585,18 282,78 0,016074*

Анализ экспрессии генов в морфологически неизмененной ткани относительно интенсивности окрашивания клеток опухоли антителами к HER2/neu проводился в группах +1 и +3. В группе +3 повышена экспрессия ингибитора пролиферации PTEN (17,9 o.e. при HER2/neu+3 по сравнению с 10,7 o.e. HER2/neu+l; Р=0,0257) и активатора каспаз NDRG1 (1116,07 o.e. при HER2/neu+3 по сравнению с 441,82 o.e. HER2/neu+l; Р=0,0011). Экспрессия мРНК самого с-егЬВ2 (75,2 o.e. при HER2/neu+3 по сравнению с 16,2 o.e. HER2/neu+l; Р=0,0145) и его гомолога GRB7 (870,4 o.e. при

HER2/neu+3 по сравнению с 292,9 o.e. HER2/neu+l; Р=0,009) также была повышена в группе HER2/neu+3. А экспрессия маммаглобина была, наоборот, снижена в этой группе (8949,7 o.e. при HER2/neu+3 по сравнению с 28807,2 o.e. HER2/neu+l; Р=0,1019).

Согласно полученным результатам активность генов-маркеров пролиферации и ингибиторов апоптоза в морфологически неизмененной ткани ниже в случае рецептор-положительного фенотипа опухоли. А в случае HER2/neu -положительного фенотипа опухоли (3+) в окружающей ткани наблюдается повышение активности ингибиторов пролиферации.

Полученные отличия экспрессии генов пролиферации и апоптоза в морфологически неизмененной ткани позволяют предположить, что экспрессия рецепторов стероидных гормонов и эпидермального фактора роста является важной фенотипической особенностью не только самой опухоли, но и ткани молочной железы в целом, а наблюдаемые изменения экспрессии в морфологически неизмененной ткани являются проявлением системного характера онкологического заболевания. Отсутствие достоверных отличий экспрессии мРНК ESR и PGR в исследуемых группах, а также то, что в 79% (45 из 57 случаев) женщины в исследуемых группах находились в постменопаузе, свидетельствует о том, что данные отличия экспрессии не являются следствием влияния менструального цикла.

Таким образом, исследование экспрессии генов в морфологически неизмененной ткани при раке молочной железы может дать дополнительную информацию в оценке пролиферативной и апоптотической активности как самой опухоли, так и системного влияния опухоли на организм.

5. Анализ экспрессии генов маркеров пролиферации и апоптоза в зависимости от изменения уровня экспрессии мРНК рецепторов прогестерона в ткани опухоли

В настоящем исследовании мы обнаружили, что при сравнительной индивидуальной оценке экспрессии мРНК в клетках рака молочной железы уровень экспрессии всех 17 генов может как снижаться, так и повышаться относительно значений в морфологически неизмененной ткани, что может указывать на отличия молекулярно-биологических характеристик опухолей. Мы сравнили уровни экспрессии профиля генов в группах пациентов, у которых уровень экспрессии мРНК рецептора прогестерона в ткани опухоли был выше или ниже по сравнению с его экспрессией в нормальной ткани.

В качестве маркера активности пролиферации и апоптоза была выбрана экспрессия мРНК рецептора прогестерона PGR.

В 30% случаев, когда по результатам иммуногистохимической оценки опухоль считается прогестерон-позитивной, экспрессия мРНК рецептора прогестерона PGR в ней ниже по сравнению с уровнем экспрессии в образце морфологически неизмененной ткани, полученной у этого же пациента, аналогичная ситуация наблюдается и в случае прогестерон-негативных опухолей (рисунок 6).

Изменения направления экспрессии Изменения направления экспрессии

мРНК PGR в прогестерон-позитивных мРНК PGR в прогестерон-негативных

по данным ИГХ опухолях по данным ИГХ опухолях

28У ^ШШмШк | ч Повышение ^gtfSffi \ 29% Повышение

экспрессии мРНК PGR п% J ш Снижение экспрессии '^ЙННШШЙЩг mPHKPGR ^^МЦУ экспрессии мИНККак j к Снижение экспрессии

А Б

Рисунок 6. Отличия экспрессии мРНК PGR в прогестерон-позитивных (А) и прогестерон-негативных (Б) опухолях по данным ИГХ.

Мы также сравнили уровень экспрессии генов пролиферации и апоптоза в зависимости от направленности изменения экспрессии мРНК рецепторов прогестерона в образцах рака молочной железы I—II стадии. В случае повышения экспрессии мРНК рецепторов прогестерона в ткани РМЖ по сравнению с неизмененной тканью отмечено статистически значимое снижение экспрессии маркеров пролиферации KI67, CCNB1, ингибиторов апоптоза BIRC5 и TERT в клетках опухоли. Экспрессия ингибитора апоптоза BCL2 повышена в PGR+ образцах (таблица 11).

Таблица 11. Сравнительный анализ экспрессии генов в образцах РМЖ 1-ІI стадии в зависимости от уровня экспрессии рецепторов прогестерона, оцениваемого по данным ОТ-ПЦР.

п PGR+ п PGR- Среднее PGR+ Среднее PGR- Р

KI67 20 17 56,4 155,97 0,00037*

STK15 20 17 120,6 327,17 0,03347*

CCNB1 20 17 27,5 60,11 0,00511*

BCL2 20 17 50,1 27,64 0,02675*

BIRC5 20 17 50,1 131,13 0,00081*

TERT 16 12 11,8 48,94 0,08021

Таким образом, относительная оценка экспрессии мРНК рецепторов прогестерона PGR с учетом изменения направления его экспрессии относительно значений в морфологически неизмененной ткани обеспечивает выделение опухолей с неблагоприятным молекулярным фенотипом (высокая пролиферативная/низкая апоптотическая активность) среди образцов рака молочной железы I-II стадии.

Выводы

1. В образцах рака молочной железы выявлено статистически значимое повышение экспрессии активаторов пролиферации KI67, STK15, CCNB1 и ингибитора апоптоза BIRC5\ снижение экспрессии ингибиторов пролиферации PTEN и NDRG1. А также повышение экспрессии рецепторов ESR, PGR, GRB7 и матриксной металлопротеиназы ММР11.

2. В образцах фиброаденомы по сравнению с морфологически неизмененной тканью снижена экспрессия активатора апоптоза ВАХ, повышена экспрессия мРНК рецепторов ESR и С-егЬВ2, а также матриксной металлопротеиназы ММР11.

3. В образцах инвазивного рака молочной железы по сравнению с образцами фиброаденомы статистически значимо повышена экспрессия мРНК маркеров пролиферации KI67, STK15 и CCNB1, ингибитора апоптоза BIRC5 и матриксной металлопротеиназы ММР11, снижена экспрессия ингибиторов пролиферации PTEN hNDRGI.

4. В образцах инвазивного рака молочной железы большего размера, при наличии регионарных и гематогенных метастазов повышена экспрессия генов-маркеров пролиферации, ингибиторов апоптоза, а также генов ММР11 и CTSL2. Увеличение степени злокачественности РМЖ сопровождается повышением экспрессии STK15, CCNB1 рецептора эпидермального фактора роста с-егЬВ2, GRB7 и протеолитически активного CTSL2 и снижением экспрессии PGR и маммаглобина MGB1.

5. Активность процессов пролиферации и апоптоза в морфологически неизмененной ткани связана с уровнем экспрессии рецепторов эстрогена, прогестерона и HER2/neu в ткани опухоли при раке молочной железы.

6. Сравнительная оценка уровня экспрессии мРНК рецептора прогестерона PGR в опухоли и морфологически неизмененной ткани может дать дополнительную информацию для выделения опухолей с неблагоприятными молекулярно-биологическими характеристиками при раке молочной железы I-II стадии.

Практические рекомендации

1. Определение уровня экспрессии мРНК генов-маркеров пролиферации (KI67, STK15, CCNB1, PTEN), апоптоза (BIRC5, BCL2, NDRG1), клеточной дифференцировки (ESR, PGR, GRB7, MGB1) межклеточных взаимодействий (ММР11, CTSL2) в ткани опухоли может быть использовано в качестве дополнительного метода в диагностике рака молочной железы.

2. Оценка изменения уровня экспрессии мРНК рецептора прогестерона (PGR) в ткани опухоли относительно морфологически неизмененной ткани целесообразно для выявления «неблагоприятного» молекулярного фенотипа опухоли при раке молочной железы.

Приложение. Список исследованных генов с кратким описанием их функции

Кластер Ген Функция

Пролиферация KI67 Маркер клеточной пролиферации. Экспрессируется в фазы Gl, S, G2, М и не экспрессируется в GO.

STK15 (AURKA) Кодирует серин-треонин киназу 6, участвующую в регуляции формирования веретена деления.

CCNB1 Кодирует белок цикли В1 семейства циклинов, контролирующих смену фаз клеточного цикла. Активация комплекса циклин B-Cdk2 необходима для перехода фаз G2/M.

PTEN Кодирует белок с фосфотазной активностью, фосфорелирующий молекулярные мищени пролиферативного каскада Akt/PKB, чем и объясняются его антипролиферативные свойства как опухолевого супрессора.

Апоптоз BCL2 Кодируемый белок обладает антиапоптотической активностью. Образуя комплекс с белком BAG, блокирует выделение цитохрома С из межмембранного пространства митохондрии.

БАХ Белок этого гена положительно регулирует высвобождение цитохрома С и по сути является антагонистом BCL2 и BAG.

BAG Коактиватор BCL2, обладающий антиапоптотическими свойствами.

NDRG1 Кодирует белок, необходимый для р53 опосредованной активации каспаз, чем и объясняются его выраженные проапоптотические свойства.

BIRC5 Кодирует белок семейства ингибиторов апоптоза, непосредственно ингибирующий каспазы - мощный ингибитор апоптоза.

TERT Кодирует обратную транскриптазу теломеразы, фермент, необходимый для репликации концевых (теломерных) фрагментов хромосом.

Клеточная дифференцировка ESR Кодирует рецептор эстрогена альфа.

PGR Кодирует рецептор прогестерона А.

c-erbB2 Кодирует рецептор эпидермального фактора роста ШЮ.!пеи.

GRB7 Кодирует белок, активирующий рецепторы семейства эпидермального фактора роста при связывании с лигандами.

MGB1 Кодирует белок маммаглобин.

Межклеточные взаимодействия MMP11 Кодирует матриксную металлопротеиназу, участвующую в разрушении межклеточного матрикса.

CTSL2 Кодирует белок катепсин с высокой пептидазной активностью.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кудинова Е.А., Бурменская О.В., Боженко В.К., Васкевич Е.Ф., Непша О.С., Мельникова Н.В., Троценко И.Д., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т. Экспрессия маркеров апоптоза при раке молочной железы// Технологии живых систем, 2011, Т. 8, №7, Стр. 40-44.

2. Боженко В.К., Рожкова Н.И, Кудинова Е.А., Троценко И.Д. Профиль экспрессии генов как фактор прогноза при раке молочной железы. Вестник РНЦРР, 2011, Т. 11, URL http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/vl l/papers/bozh2_vl l.htm

3. Боженко В.К., Харченко Н.В., Запиров Г.М., Кудинова Е.А., Троценко И.Д. Профиль экспрессии генов как фактор прогноза при пролиферативных заболеваниях органов репродуктивной системы.// Вестник РНЦРР, 2012, Т. 12, URL http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/vl2/papers/trots_vl2.htm

4. Троценко И.Д., Рожкова Н.В., Харченко Н.В., Кудинова Е.А., Запиров Г.М., Боженко В.К.Оценка связи экспрессии рецепторов стероидных гормонов методом ОТ-ПЦР с уровнем пролиферации и апоптоза в ткани рака молочной железы./ЛЗестник РНЦРР, 2012, Т. 12, URL http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/vl2/papers/trotsl_vl2.htm

5. Солодкий В.А., Харченко Н.В..Боженко В.К., Запиров Г.М., Васкевич E.H., Троценко И.Д. Роль определения мРНК маммаглобина в крови при диагностике рака молочной железы.// Материалы II Междисциплинарного форума "Медицина молочной железы: на стыке специальностей", 2012, с 56

6. Bozhenko V.K., Rozhkova N.I., Kudinova Е.А., Vaskevich E. N., Bliznyukov O.P., Trotsenko I.D. Mammaglobin expression as a marker for early breast cancer.//Annals of oncology, 2012, V.23 (supl. 5), v 17.

Список сокращений

ИГХ - иммуногистохимическое исследование МНТ - морфологически неизмененная ткань мРНК - матричная РНК

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией РМЖ - инвазивный рак молочной железы РП - белок-рецептор прогестерона РЭ - белок-рецептор эстрогена ФА - фиброаденома

o.e. - относительные единицы экспрессии

Заказ № 54-А/09/2012 Подписано в печать 19.09.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru ; е-таИ izak@cfr.ru

Оглавление диссертации Троценко, Иван Дмитриевич :: 2012 :: Москва

Список сокращений.

Актуальность темы.

1. Анализ факторов прогноза при раке молочной железы.

1.1 "Классические" факторы прогноза.

1.2 Молекулярно-биологическая классификация рака молочной железы.

1.3 Изменение экспрессии генов при раке молочной железы.

1.3.1 Изменение экспрессии некоторых генов адгезии и миграции при пролиферативных заболеваниях МЖ.

1.3.2 Изменение экспрессии некоторых генов пролиферации и дифференцировки при пролиферативных заболевания МЖ.

1.3.3 Изменение экспрессии некоторых генов, участующих в реакциях метаболизма стероидных гормонов.

1.3.4 Изменение эксперссии некоторых генов супрессоров/активаторов опухолевого роста и регуляторы клеточного цикла.

1.3.5 Изменение экспрессии некоторых генов при активации ангиогенеза.

1.4 Профили экспрессии генов как прогностический маркер РМЖ.

1.4.1 Системы определения профиля экспрессии генов на основе ОТ-ПЦР.

1.4.2 Системы определения профиля экспрессии генов на основе технологии микрочипов.

Введение диссертации по теме "Онкология", Троценко, Иван Дмитриевич, автореферат

Актуальность темы

Рак молочной железы (РМЖ) в настоящее время является наиболее распространенным онкологическим заболеванием в женской популяции, составляя 20,5% от всех онкологических заболеваний [4]. Одновременно достаточно высокими, до 70%, являются показатели выявляемое™ заболевания на ранних (1-П) стадиях [7, 10], что позволяет использовать менее токсичные программы лечения [12]. С другой стороны, излишне щадящая тактика в отношении онкологических больных связана с риском рецидивирования заболевания [9].

Выбор тактики лечения при раке молочной железы определяется сочетанием факторов, описывающих такие особенности опухоли как размер образования, наличие метастазов в регионарные лимфоузлы, степень злокачественности, пролиферативная активность, оцениваемая по уровню экспрессии белка К167 [2, 5] и т.д. При этом, однозначными показаниями для адьювантной химиотерапии принято считать большой размер опухоли (Т>5 см), более 4 метастазов в регионарные лимфоузлы (М2-№), высокая степень злокачественности (ОЗ) и высокая пролиферативная активность (экспрессия Кл67 более 30%), минимальные значения по данным критериям (Т<2 см, N0, С1, Кл67<15%) представляют собой относительные показания для адьювантной гормонотерапии [8]. Однако при размере опухоли от 2.1 до 5 см, наличии метастазов в 1-3 регионарных лимфоузлах (N1), 2 степени злокачественности (02), экспрессии Кл67 16-30% необходимость назначения адьювантной химиотерапии является недоказанной. Таким образом, использование «классических» факторов прогноза не всегда позволяет адекватно выделить группу высокого риска рецидивирования.

В многочисленных исследованиях сказано, что исследование экспрессии одного или комплекса генов в ткани опухоли имеет независимое прогностическое значение [3, 6]. В частности, эксперты конференции 81Са11еп

2011 признают, что использование профиля экспрессии генов Опсо1уреБХ™, в основе которого лежит оценка экспрессии мРНК 16 генов, участвующих в процессах пролиферации, апоптоза и клеточной дифференцировки, адекватно отражает биологическую гетерогенность рака молочной железы и может применяться для определения прогноза заболевания и рекомендации назначения химиотерапии. Таким образом, выявление закономерностей экспрессии генов, участвующих в процессах пролиферации, апоптоза, клеточной дифференцировки и межклеточных взаимодействий в ткани доброкачественных и злокачественных образований может дать новые, более достоверные факторы прогноза и повысить эффективность дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных образований молочной железы.

Цель работы

Исследовать экспрессию комплекса генов, участвующих в процессах пролиферации, апоптоза, клеточной дифференцировки и межклеточных взаимодействий в морфологически неизмененной ткани молочной железы, при фиброаденоме и инвазивном раке молочной железы, и определить взаимосвязь их экспрессии с клинико-морфологическими характеристиками доброкачественных и злокачественных опухолей.

Задачи исследования

• Провести сравнительный анализ экспрессии генов в неизмененной ткани и при раке молочной железы

• Провести сравнительный анализ экспрессии генов в неизмененной ткани и при фиброаденоме молочной железы

Научная новизна

Научно-практическая значимость

Положения, выносимые на защиту

1. Экспрессия активаторов пролиферации, ингибиторов апоптоза, клеточных рецепторов и генов межклеточных взаимодействий в образцах инвазивного 7 рака молочной железы значительно повышена по сравнению с морфологически неизмененной тканью и фиброаденомой.

Апробация материалов диссертации.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 4 в журналах, рецензируемых ВАК.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 131 страницах и состоит из введения, трех глав, а также выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Указатель литературы содержит ссылки на 12 отечественных и 220 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и 14 рисунками.

Заключение диссертационного исследования на тему "Анализ экспрессии генов при пролиферативных заболеваниях молочной железы."

Выводы

1. В образцах рака молочной железы выявлено статистически значимое повышение экспрессии активаторов пролиферации KI67, STK15, CCNB1 и ингибитора апоптоза BIRC5; снижение экспрессии ингибиторов пролиферации PTEN и NDRG1. А также повышение экспрессии рецепторов ESR, PGR, GRB7 и матриксной металлопротеиназы ММР11.

4. В образцах инвазивного рака молочной железы большего размера, при наличии регионарных и гематогенных метастазов повышена экспрессия генов-маркеров пролиферации, ингибиторов апоптоза, а также генов ММР11 и CTSL2. Увеличение степени злокачественности РМЖ сопровождается повышением экспрессии STK15, CCNB1 рецептора эпидермального фактора роста c-erbB2, GRB7 и протеолитически активного CTSL2 и снижением экспрессии PGR и маммаглобина MGB1.

Практические рекомендации

1. Определение уровня экспрессии мРНК генов-маркеров пролиферации (К/67, STK15, CCNB1, PTEN), апоптоза (BIRC5, BCL2, NDRG1), клеточной дифференцировки {ESR, PGR, GRB7, MGB1) межклеточных взаимодействий {ММР11, CTSL2) в ткани опухоли может быть использовано в качестве дополнительного метода в диагностике рака молочной железы.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2012 года, Троценко, Иван Дмитриевич

1. Ашрафян Jl.А., Овчинникова O.A. Роль метаболического синдрома в патогенезе рака молочной железы и возможности его коррекции// Врач-аспирант, 2012, Т. 50, №. 1.2, С. 343-350.

2. Берштейн Л.М., Семиглазов В.Ф. Подтипы рака молочной железы и их гормонально-метаболическое "обеспечение": прикладной аспект// Вопросы онкологии, 2011, Т. 57, №. 5, С. 559-566.

3. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Статистика злокачественныхновообразований в России и странах СНГ// Вестник РОНЦ им. Блохина H.H. РАМН, 2009, Т. 22, №. 3 (прил 1), С. 34.

4. Мельников Д.Ю. Оптимизация лечения и диагностики больных раком молочной железы в условиях новой медикоорганизационной формы оказания специализированной помощи// Вопросы онкологии,2010, Т. 56, №.5, С. 603-608.

5. Рожкова Н.И., Боженко В.К. Современные технологии скрининга рака молочной железы// Вопросы онкологии, 2009, Т. 55, №. 4, С. 495500.

6. Рожкова Н.И., Решетцова Г.В., Прокопенко С.П. Радиология в маммологии тезисный обзор материалов европейского конгресса радиологов 2010// Вестник РНЦРР, 2010, Т. 10, ШЬ: http://vestnik.rncrr.rU/vestnik/v 1О/рарегз/гогЪ 12\ 10.htm.

7. Семиглазов В.Ф. Стратегии лечения рака молочной железы на основе определения биологического подтипа// Вопросы онкологии,2011, №. 57, С. 542-552.

8. Семиглазов В.Ф. Стратегические и практические подходы к решению проблемы рака молочной железы// Вопросы онкологии, 2012, V. 58, С. 148-152.

9. Семикопенко В.А. Современное состояние диагностики заболеваний молочной железы// Медицинская визуализация, 2011, Т. 6, С. 92-102.

10. Харченко В.П., Кешелава В.В., Шуинова Е.А. Возможности сочетанной лучевой терапии в лечении больных местно-распространённым раком молочной железы// Вестник РНЦРР, 2002, Т. 5, URL: http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/v5/papers/harche3v5.htm.

11. Харченко В.П., Рожковой Н.И. Маммалогия: национальное руководство// ГЭОТАР-Медиа, 2009, С. 56.

12. Ach R.A., Floore A., Curry В. et al. Robust interlaboratory reproducibility of a gene expression signature measurement consistent with the needs of new generation of diagnostic tools// BMC Genomics, 2007,V. 8, P 56-64.

13. Addisson A.F. Microarray Technology and Cancer Gene Profiling. Springer Science+Business Media, 2007, P. 25-37.

14. Altieri D.C. Molecular cloning of effector cell protease receptor-1, anovel cell surface receptor for the protease factor Xa// J. Biol. Chem., 1994, V. 269, P. 3139-3142.

15. Altieri D.C. Splicing of effector cell protease receptor-1 mRNA is modulated by an unusual retained intron// Biochemistry, 1994, V. 33, P. 13848-13855.

16. Altieri D.C., Marchisio P.C. BIRC5 apoptosis: An interloper between cell death and cell proliferation in cancer// Lab Invest., 1999, V. 79, P. 13271333.

17. Ambrosini G., Adida C., Altieri D.C. A novel anti-apoptosis gene, BIRC5, expressed in cancer and lymphoma// Nat. Med., 1997, V. 3, P. 917— 921.

18. Andre C., Hampe A., Lachaume P., Martin E., Wang X.P., Manus V., Hu W.X., Galibert F. Sequence analysis of two genomic regions containing the KIT and the FMS receptor tyrosine kinase genes// Genomics, 1997, V. 39, P. 216-26.

19. Antonsson B., Montessuit S., Sanchez B., Martinou J.C. Bax is present as a high molecular weight oligomer/complex in the mitochondrial membrane of apoptotic cells// J. Biol. Chem., 2001, V. 276, P. 11615-11623.

20. Ayers M., Symmans W.F., Stec J. et al. Gene expression profiles predict complete pathologic response to neoadjuvant paclitaxel and fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide chemotherapy in breast cancer// J. Clin. Oncol., 2004, V. 22, P 523-527.

21. Aziza N. Survivin and Caspase-3 Expression in Breast Cancer:

22. Correlation With Prognostic Parameters, Proliferation, Angiogenesis, and Outcome// Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology, 2008, V. 16, P.113-120.

23. Bar-Sela G., Kuten A., Ben-Eliezer S., Gov-Ari E., Ben-Izhak O. Expression of HER2 and C-KIT in nasopharyngeal carcinoma: implications for a new therapeutic approach// Mod. Pathol., 2003, V. 16, P. 1035-1040.

24. Bassik M.C., Scorrano L., Oakes S.A., Pozzan T., Korsmeyer S.J. Phosphorylation of BCL-2 regulates ER Ca(2+) homeostasis and apoptosis// EMBO J., 2004, V. 23, P. 1207-1216.

25. Bertone P., Stole V., Royce T.E. et al. Global identification of human transcribed sequences with genome tiling arrays// Science, 2004, V. 306, P. 2242-2246.

26. Bingle L., Brown N.J., Lewis C.E. The role of tumour-associated macrophages in tumour progression: implications for new anticancer therapies// J. Pathol., 2002, V. 196, P. 254 265.

27. Bogaerts J., Cardoso F., Buyse M. et al. TRANSBIG Consortium. Gene signature evaluation as a prognostic tool: Challenges in the design of the MIND ACT trial//Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, V. 3, P. 540-551.

28. Brenton J.D., Carey L.A., Ahmed A.A. et al. Molecular classification and molecular forecasting of breast cancer: ready for clinical application?.// J. Clin. Oncol., 2005, V. 23, P. 7350-7360.

29. Buggy Y., Maguire T.M., Mc Dermott E., Hill A.D., O'Higgins N., Duffy M.J. Ets2 transcription factor in normal and neoplastic human breast tissue// Eur. J. Cancer, 2006, V. 42, P. 485-491.

30. Burdette J.E., Jeruss J.S., Kurley S.J., Lee E.I., Woodruff T.K. Activin A mediates growth inhibition and cell cycle arrest through Smads in human breast cancer cells// Cancer Res., 2005, V. 65, P. 7968-7975.

31. Bustin S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays// Journal of Molecular Endocrinology, 2000, V. 25, P. 169-193.

32. Buyse M., Loi S., van't Veer L. et al. Validation and clinical utility of a 70-gene prognostic signature for women with node-negative breast cancer// J. Natl. Cancer Inst., 2006, V. 98, V. 17, P. 1183-1192.

33. Buyse M., Loi S., van't Veer L. et al. Validation and clinical utility of a 70-gene prognostic signature for women with node-negative breast cancer// J. Natl. Cancer Inst., 2006, V. 98, P. 1183-1192.

34. Chang J.C., Makris A., Gutierrez M.C. et al. Gene expression patterns in formalin-fixed, paraffin-embedded core biopsies predict docetaxel chemosensitivity in breast cancer patients// Breast Cancer Res. Treat., 2007, V. 25, № 18S, P. 538.

35. Cheng C.W., Yu J.C., Wang H.W., Huang C.S., Shieh J.C., Fu Y.P., Chang C.W., Wu P.E., Shen C.Y. The clinical implications of MMP-11 and CK-20 expression in human breast cancer// Clin. Chim. Acta, 2010, V. 411, P. 234-41.

36. Chopper S.D. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications // Academic Press MA, 1990, P. 65.

37. Chu E.C., Tarnawski A.S. PTEN regulatory functions in tumor suppression and cell biology// Med. Sci. Monit., 2004, V. 10, P. 235-241.

38. Cobleigh M.A., Tabesh B., Bitterman P. et al. Tumor gene expression and prognosis in breast cancer patients with 10 or more positive lymph nodes// Clin. Cancer Res., 2005, V. 11, P. 8623-31.

39. Coussens L., Werb Z. Inflammatory cells and cancer: think different!// J. Exp. Med., 2001, V. 193, P. F23-F26.

40. Cronin M., Pho M., Dutta D. et al. Measurement of gene expression in archival paraffin-embedded tissues: development and performance of a 92-gene reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay// Am. J. Pathol., 2004, V. 164, V. 1,P. 35-42.

41. Cuconati A., Mukherjee C., Perez D., White E. DNA damage response and MCL-1 destruction initiate apoptosis in adenovirus-infected cells// Genes Dev., 2003, V. 17, P. 2922-2932.

42. Cunha G. Role of mesenchymal-epithelial interactions in normal and abnormal development of the mammary gland and prostate// Cancer, 1994, V. 74, P. 1030-1044.

43. Curran S., Dundas S.R., Buxton J., Leeman M.F., Ramsay R., Murray G.I. Matrix metalloproteinase/tissue inhibitors of matrix metalloproteinasephenotype identifies poor prognosis colorectal cancers// Clin. Cancer Res., 2004, V. 10, P. 8229-8234.

44. De Graffenried L.A., Fulcher L., Friedrichs W.E., Griinwald V., Ray R.B., Hidalgo M. Reduced PTEN expression in breast cancer cells confers susceptibility to inhibitors of the PI3 kinase/Akt pathway// Ann. Oncol., 2004, V. 15, P. 1510-1516.

45. Deng W.H., Wu Y.Y., Yang L., Tang W.Q., Wang S. Expression of estrogen sulfotransferase (EST) gene and bridging integrator protein-1 (BIN1) gene and their significance in breast tissues// Ai Zheng, 2004, V. 23, P. 1302-1305.

46. Depowski P.L., Rosenthal S.I., Ross J.S. Loss of expression of the PTEN gene protein product is associated with poor outcome in breast cancer// Mod. Pathol., 2001, V. 14, P. 672-676.

47. Desmedt C., Piette F., Loi S. et al. Strong time dependence of the 76-gene prognostic signature for nodenegative breast cancer patients in the TRANSBIG multicenter independent validation series// Clin. Cancer Res., 2007, V. 13, P. 3207-3214.

48. Diaz L.K., Cryns V.L., Symmans W.F. et al. Triple negative breast carcinoma and the basal phenotype: from expression profiling to clinical practice// Adv. Anat. Pathol., 2007, V. 14, P. 419-430.

49. Dignam J.J., Dukic V., Anderson S.J. et al. Hazard of recurrence and adjuvant treatment effects over time in lymph node-negative breast cancer// Breast Cancer Res. Treat., 2009, V. 116, P. 595-602.

50. Distelhorst C.W., Shore G.C. Bcl-2 and calcium: controversy beneath the surface// Oncogene, 2004, V. 23, P. 2875-2880.

51. Dooley S., Seib T., Engel M., Theisinger B., Janz H., Piontek K., Zang K.D., Welter C. Isolation and characterization of the human genomic locus coding for the putative metastasis control gene nm23-Hl// Hum. Genet., 1994, V. 93, P. 63-66.

52. Dowsett M., Dunbier A.K. Emerging biomarkers and new understanding of traditional markers in personalized therapy for breast cancer// Clin. Cancer Res., 2008, V. 14, P. 8019-8026.

53. Duffy M.J., Maguire T.M., Hill A., McDermott E., O'Higgins N. Metalloproteinases: role in breast carcinogenesis, invasion and metastasis//

54. Breast Cancer Res., 2000, V. 2, P. 252-257.

55. E. SHARKAWY, S. LABIB. Mammaglobin: A novel tumor marker for breast cancer// Turkish Journal of Cancer, 2007, V. 37, P. 545-551.

56. Eagos J.M. The Biochemistry of Cell Signalling// Springer Science+Business Media, 2001, P. 242.

57. Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group(EBCTCG) Effects of chemotherapy and hormonal therapy for early breast cancer on recurrence and 15-year survival: an overview of the randomised trials// Lancet, 2005, V 365, V. 9472, P 4567-4573.

58. Eifel P., Axelson J.A., Costa J. et al. National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: adjuvant therapy for breast cancer// J. Natl. Cancer. Inst., 2001, V. 93, P. 979-989.

59. Esch F.S., Shimasaki S., Mercado M. et al. Structural characterization of follistatin: a novel follicle-stimulating hormone release-inhibiting polypeptide from the gonad// Mol. Endocrinol., 1987, V. 1, P. 849-855.

60. Esteban J., Baker J., Cronin M. et al. Tumor gene expression and prognosis in breast cancer: multi-gene RT-PCR assay of paraffin-embedded tissue// Prog. Proc. Am. Soc. Clin. Ocol., 2003, V. 22, P. 850.

61. Esteva F.J., Sahin A.A., Cristofanilli M. et a. Prognostic role of a multigene reverse transcriptase-PCR assay in patients with node-negative breast cancer not receiving adjuvant systemic therapy// Clin. Cancer Res., 2005, V. 11, P. 3290-3297.

62. Esteva F.J., Sahin A.A., Cristofanilli M. et al. Prognostic role of a multigene reverse transcriptase-PCR assay in patients with node-negative breast cancer not receiving adjuvant systemic therapy// Clin. Cancer Res., 2005, V. 11, P. 3315-3319.

63. Fadare O., Tavassoli F.A. The phenotypic spectrum of basal-like breast cancers: a critical appraisal// Adv. Anat. Pathol., 2007, V. 14, P. 358-373.

64. Foekens J.A., Atkins D., Zhang Y. et al. Multicenter validation of a gene expression-based prognostic signature in lymph node-negative primary breast cancer// J. Clin. Oncol., 2006, V. 24, P. 3741-3748.

65. Foekens J.A., Atkins D., Zhang Y. et al. Multicenter validation of a gene expression-based prognostic signature in lymph node-negative primary breast cancer// Clin. Oncol., 2006, V. 24, P. 1665-1671.

66. Forget M.A., Desrosiers R.R., Beliveau R. Physiological roles of matrix metalloproteinases: implications for tumor growth and metastasis// Can. J. Physiol. Pharm., 1999, V. 77, P. 465-480.

67. Fulford L.G., Reis-Filho J.S., Ryder K. et al. Basal-like grade III invasive ductal carcinoma of the breast: patterns of metastasis and long-term survival// Breast Cancer Res., 2007, V. 9, P. R4.

68. Garber K. Genomic medicine. Gene expression tests foretell breast cancer's future// Science, 2004, V. 303, P. 1754-1755.

69. Gentle A.F., McBrien N.A. High-resolution semi-quantitative real-time PCR without the use of a standard curve// BioTechniques, 2001, V. 31, P. 502-508.

70. Geyer F.C., Reis-Filho J.S. Microarray-based gene expression profiling as clinical tool for breast cancer management: are we there yet?// Int. J. Surg. Pathol., 2009, V. 17, P. 285-302.

71. Ghysdael J., Boureux A. The Ets family of transcriptional regulators Yaniv B. Ghysdael J. eds// Oncogenes as Transcriptional Regulators, 1997, V. 5, P. 29-89.

72. Gianni L., Zambetti M., Clark K. et al. Gene expression profiles in paraffin-embedded core biopsy tissue predict response to chemotherapy in women with locally advanced breast cancer// J. Clin. Oncol., 2005, V. 23, P. 7265-7277.

73. Gibson P.C., Cooper K. CD117(KIT): a diverse protein with selective applications in surgical pathology// Adv. Anat. Pathol., 2002, V. 9, P. 65-69.

74. Glas A.M., Floore A., Delahaye L.J. et al. Converting a breast cancer microarray signature into a highthroughput diagnostic test// BMC Genomics, 2006, V. 7, P. 278.

75. Glatt H., Engelke C.E., Pabel U. et al. Sulfotransferases: genetics and role in toxicology// Toxicol. Lett., 2009, V. 112, P. 341-348.

76. Goetz M.P., Knox S.K., Suman V.J. et al. The impact of cytochrome P450 2D6 metabolism in women receiving adjuvant tamoxifen// Breast Cancer Res. Treat., 2007, V. 101, P. 113-121.

77. Goetz M.P., Rae J.M., Suman V.J. et al. Pharmacogenetics of tamoxifen biotransformation is associated with clinical outcomes of efficacy and hot flashes// J. Clin. Oncol., 2005, V. 23, P. 9312-9318.

78. Goetz M.P., Suman V.J., Ingle J.N. et al. A two-gene expression ratio of homeobox 13 and interleukin-17B receptor for prediction of recurrence and survival in women receiving adjuvant tamoxifen// Clin. Cancer Res., 2006, V. 12, P. 2080-2087.

79. Goldhirsch A., J. N. Ingle, R. D. Gelber, A. S. Coates, B. Thurlimann,

80. H.-J. Senn, & Panel members. Thresholds for therapies: highlights of the St Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2009// Annals of Oncology, V. 20, 2009, C. 1319-1329.

81. Gong Y., Yan K., Lin F. et al. Determination of oestrogen-receptor status and ERBB2 status of breast carcinoma: Agene-expression profiling study// Lancet Oncol, 2007, V. 8, P. 3234-3239.

82. Guy C.T., Muthuswamy S.K., Cardiff R.D., Soriano P., Muller W.J. Activation of the c-Src tyrosine kinase is required for the induction of mammary tumors in transgenic mice// Genes Dev., 1994, V. 8, P. 23-32.

83. Habel L.A., Shak S., Jacobs M.K. et al. A population-based study of tumor gene expression and risk of breast cancer death among lymph node-negative patients// Breast Cancer Res, 2006, V. 8, № 3, P. R25.

84. Hanahan D., Weinberg R.A. The hallmarks of cancer// Cell, 2000, V. 100, P. 57-70.

85. Hao L.S., Wang G., Qian K., Luo T., Li X.J., Wu X.T. HIF-lalpha expression and relationship involving tumor cell proliferation and angiogenesis in human breast carcinoma// Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban, 2007, V. 38, P. 60-3.

86. Harrison C.A., Gray P.C., Vale W.W., Robertson M.D. Antagonists of activin signaling: mechanisms and potential biological applications// Trends Endocrinol. Metab., 2005, V. 16, P. 73-78.

87. Hashimoto O., Tsuchida K., Ushiro Y., Hosoi Y., Hoshi N., Sugino H., Hasegawa Y. cDNA cloning and expression of human activin betaE subunit// Mol. Cell Endocrinol., 2002, V. 194, P. 117-122.

88. Herrnring C., Reimer T., Jeschke U., Makovitzky J., Kriiger K., Gerber B., Kabelitz D., Friese K. Expression of the apoptosis-inducing ligands FasL and TRAIL in malignant and benign human breast tumors// Histochem. Cell Biol., 2000, V. 113, P. 189-94.

89. Hill J.J., Davies M.V., Pearson A.A., Wang J.H., Hewick R.M., Wolfman N.M., Qiu Y. The myostatin propeptide and the follistatin-related gene are inhibitory binding proteins of myostatin in normal serum// J. Biol. Chem., 2002, V. 277, P. 40735-40741.

90. Hines S.J., Organ C., Kornstein M.J., Krystal G.W. Coexpression of the c-kit and stem cell factor genes in breast cancer// Cell Growth Differ., 1995, V. 6, P. 769-779.

91. Hockenbery D.M., Oltvai Z.N., Yin X-M., Milliman C.L., Korsmeyer

92. S.J. Bcl-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis// Cell, 1993, V. 75, P. 241-52.

93. Holmes K.R., Owain L.I., Thomas A.M. Vascular endothelial growth factor receptor-2: Structure, function, intracellular signalling and therapeutic inhibition"// Cellular Signalling, 2007, V. 19, P. 2003-2012.

94. Huang S., Van Arsdail M., Tedjarati S. et al. Contributions of stromal metalloproteinase-9 to angiogenesisand growth of human ovarian carcinoma in mice// J. Natl. Cancer Inst., 2002, V. 94, P. 1134 1142.

95. Huret T.A. Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology// Jean-Loup., 2008, P 45.

96. Ioakim-Liossi A., Markopoulos C., Karakitsos P., Safioleas M., Gogas J., Vaiopoulos G. p53 protein expression in benign and malignant breast lesions// Acta Cytol., 1998, V. 42, P. 918-922.

97. Ioannidis J.P. Is molecular profiling ready for use in clinical decision making?// The Oncologist, 2007, V. 12, P 523.

98. Jemal A., Siegel R., Ward E. et al. Cancer statistics 2007// CA Cancer J. Clin., 2007, V. 57, № 1, P. 43-66.

99. Jeruss J.S., Kurley S.J., Lee E.I., Woodruff T.K. Activin A mediates growth inhibition and cell cycle arrest through Smads in human breast cancer cells// Cancer Res., 2005, V. 65, P. 7968-7975.

100. Jin Y., Desta Z., Stearns V. et al. CYP2D6 genotype, antidepressant use, and tamoxifen metabolism during adjuvant breast cancer treatment// J. Natl. Cancer Inst., 2005, V. 97, № 1, P. 30-39.

101. Julie D., He L., Dakang X.U., Jun-Ping L.U. Transcriptional Regulation of Telomerase Activity. Roles of the the Ets Transcription Factor Family// Annals of the New York Academy of Sciences, 2007, V. 1114, P. 36-47.

102. Kappes H., Goemann C., Bamberger A.M., Loning T., MildeLangosch K. PTEN expression in breast and endometrial cancer: correlations with steroid hormone receptor status// Pathobiology, 2001, V. 69, P. 136-42.

103. Kim C., Taniyama Y., Paik S. A population-based study of tumor gene expression and risk of breast cancer death among lymph node-negativepatients// Breast Cancer Res., 2006, V. 8, P. R25.

104. Kluck R.M., Bossy-Wetzel E., Green D.R., Newmeyer D.D. The release of cytochrome c from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis// Science, 1997, V. 275, P. 1132-1136.

105. Komatsu Y., Scott G., Nagy A., Kaartinen V., Mishina Y. BMP type I receptor ALK2 is essential for proper patterning at late gastrulation during mouse embryogenesis// Dev. Dyn., 2007, V. 236, P. 512-517.

106. Kondi-Pafiti A., Arkadopoulos N., Gennatas C., Michalaki V., Frangou-Plegmenou M., Chatzipantelis P. Expression of c-kit in common benign and malignant breast lesions// Tumori, 2010, V. 96, P. 978-984.

107. Koutselini H., Malliri A., Field J.K., Spandidos D.A. p53 expression in cytologic specimens from benign and malignant breast lesions// Anticancer Res., 1991, V. 11, P. 1415-1419.

108. Krneta J., Kroll J., Alves F. et al. Dissociation of angiogenesis and tumorigenesis in follistatin- and activin-expressing tumors// Cancer Res., 2006, V. 66, P. 5686-5695.

109. Laakso M., Loman N., Borg A. et al. Cytokeratin 5/14-positive breast cancer: true basal phenotype confined to BRCA1 tumors// Mod. Pathol., 2005, V. 18, P. 1321-1328.

110. Lam M, Dubyak G, Chen L, Nunez G, Miesfeld RL, Distelhorst CW. Evidence that BCL-2 represses apoptosis by regulating endoplasmic reticulum-associated Ca2+ fluxes// Proc Natl Acad Sci USA, V. 91, 1994, C.6569-73.

111. Laura J. van't Veer, Hongyue Dai, Marc J. van de Vijver et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer// Nature, 2002, V. 415, P. 530-536.

112. Lee S.J., Mcpherron A.C. Regulation of myostatin activity and muscle growth// Proc Natl. Acad. Sci., 2001, V. 98, P. 9306-9311.

113. Li B.J., Zhu Z.H. Expression correlation of Ki67 to P53,VEGF,and C-erbB-2 genes in breast cancer and their clinical significances// Ai Zheng., 2004, V. 23, P. 1176-1179.

114. Liedtke C., Mazouni C., Hess K.R., et al. Response to neoadjuvant therapy and long-term survival in patients with triple-negative breast cancer// J. Clin. Oncol., 2008, V. 26, P. 1275-1281.

115. Liu Q.Y., Niranjan B., Gomes P., Gomm J.J., Davies D., Coombes R.C., Buluwela L. Activins and inhibins in endocrine and other tumors// Endocr. Rev., 2001, V. 22, P. 836-858.

116. Liu Q.Y., Niranjan B., Gomes P., Gomm J.J., Davies D., Coombes R.C., Buluwela L. Inhibitory effects of activin on the growth and morpholgenesis of primary and transformed mammary epithelial cells// Cancer Res., 2003, V. 63, P. 3783-3790.

117. Liu Q.Y., Niranjan B., Gomes P., Gomm J.J., Davies D., Coombes R.C., Buluwela L. Inhibitory effects of activin on the growth and morpholgenesis of primary and transformed mammary epithelial cells//

118. Cancer Res., 1996, V. 56, P. 1155-1163.

119. Liu R., Wang X. The prognostic role of a gene signature from tumorigenic breast-cancer cells// N. Engl. J. Med., 2007, V. 356, P. 452-458.

120. Lyman G.H., Cosier L.E., Kuderer N.M. et al. Impact of a 21-gene RT-PCR assay on treatment decisions in early-stage breast cancer: An economic analysis based on prognostic and predictive validation studies// Cancer, 2007, V. 109, P. 117.

121. Ma X.J., Hilsenbeck S.G., Wang W. et al. The HOXB13:IL17BR expression index is a prognostic factor in early-stage breast cancer// J. Clin. Oncol., 2006, V. 24, P 4783-4789.

122. Ma X.J., Wang Z., Ryan P.D. et al. A two-gene expression ratio predicts clinical outcome in breast cancer patients treated with tamoxifen// Cancer Cell, 2004, V. 5, P. 607-616.

123. Mackay I.M., Arden E.K., Nitsche A. Real-time PCR in virology// Nucleic Acids Research, 2002, V. 30, P. 1292-1305.

124. Biol., 2011, V. 49, P. 341-7.

125. Mao X.Y., Fan C.F., Wei J., Liu C., Zheng H.C., Yao F., Jin F. Increased N-myc downstream-regulated gene 1 expression is associated with breast atypia-to-carcinoma progression// Tumour Biol, 2011, V. 32, P. 12711276.

126. Maskos U., Southern E.M. Oligonucleotide hybridizations on glass supports: a novel linker for oligonucleotide synthesis and hybridization properties of oligonucleotides synthesised in situ// Nucleic Acids Res., 1992, V. 20, P. 1679-1684.

127. Mc Donnell T.J., Deane N., Piatt F.M. et al. Bcl-2-immunoglobulin transgenic .mice demonstrate extended B cell survival and follicular lymphoproliferation// Cell, 1989, V. 57, P. 79-88.

128. Mc Donnell T.J., Troncoso P., Brisbay S.M. et al. Expression of theprotooncogene bcl-2 in the prostate and its association with emergence of androgen-independent prostate cancer// Cancer Res, 1992, V. 52, P. 69406944.

129. Melody A. Cobleigh et al. Tumor Gene Expression and Prognosis in Breast Cancer Patients with 10 or More Positive Lymph Nodes// Clin. Cancer Res., 2005, V. 11, P. 3456-3465.

130. Millikan R.C., Newman B., Tse C.K., et al. Epidemiology of basal-like breast cancer// Breast Cancer Res. Treat., 2008, V. 109, P. 123-139.

131. Mina L., Soule S.E., Badve S. et al. Predicting response to primary chemotherapy: gene expression profiling of paraffin-embedded core biopsy tissue// Breast Cancer Res. Treat., 2006, V. 563, P. 5376.

132. Moinfar F. Is 'basal-like' carcinoma of the breast a distinct clinicopathological entity? A critical review with cautionary notes// Pathobiology, 2008, V. 75, P. 119-131.

133. Nagai M.A., Gerhard R, Fregnani J.H., Nonogaki S, Rierger R.B., Netto M.M., Soares F.A. Prognostic value of NDRG1 and SPARC protein expression in breast cancer patients// Breast Cancer Res. Treat., 2011, V. 126, P. 1-14.

134. Nagase H., Visse R., Murphy G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs// Cardiovasc. Res., 2006, V. 69, P. 562-573.

135. Nielsen T.O, Hsu F.D, Jensen K. et al. Ki67 index, HER2 status, and prognosis of patients with luminal B breast cancer// J. Natl. Cancer Inst, 2009, V. 101, P. 736-750.

136. O'Malley B.W. A life-long search for the molecular pathways of steroid hormone action// Mol. Endocrinol, 2005, V. 19, P. 1402-1411.

137. Olivotto I.A, Bajdik C.D, Ravdin P.M., Speers C.H, Coldman A.J,

138. Norris B.D., Davis G.J., Chia S.K., Gelmon K.A. Population-based validation of the prognostic model ADJUVANT! for early breast cancer// J. Clin. Oncol., 2007, V. 20, № 23(suppl. 12), P. 2716-2725.

139. Oltvai Z.N., Korsmeyer S.J. Checkpoints of dueling dimers foil death wishes// Cell, 1994, V. 79, P. 189-192.

140. Page-McCaw A., Ewaid A.J., Werb Z. Matrix metalloproteinases and the regulation of tissue remodelling// Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2007, V. 8, P. 211-233.

141. Paik S., Shak S., Tang G. et al. A multi gene assay to predict recurrence of tamoxifen-treated, node-negative breast cancer// N. Engl. J. Med., 2004, V. 351, P. 2817-2826.

142. Paik S., Tang G., Shak S. et al. Gene expression and benefit of chemotherapy in women with nodenegative estrogen receptor-positive breast cancer// J. Clin. Oncol., 2006, V. 24, P. 3726-3734.

143. Parker J.S., Mullins M., Cheang M.C. et al. Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes// J. Clin. Oncol., 2009, V. 27, P. 1160-1167.

144. Pathak T.B., Bashyal R., Pun C.B., Shrestha S., Bastola S., Neupane S., Poudel B.R. Estrogen and progesterone receptor expression in breast carcinoma// Journal of Pathology of Nepal, 2000, V. 1, P. 100-103.

145. Peihong S., Perry F. Expression of nm23, MMP-2, TIMP-2 in breast neoplasm in Zhengzhou Center Hospital, China// Ethiop. Med. J., 2007, V. 45, P. 79-83.

146. Perez D., White E. TNF-alpha signals apoptosis through a Bid-dependent conformational change in Bax that is inhibited by E1B 19KII Mol. Cell, 2000, V. 6, P. 53-63.

147. Phipps A.I., Buist D.S., Malone K.E., et al. Reproductive history and risk of three breast cancer subtypes defined by three biomarkers// Cancer Causes Control, 2011 V. 22, P. 399-405.

148. Phipps A.I., Chlebowski R.T., Prentice R. et al. Body size, physica activity, and risk of triple-negative and estrogen receptor-positive breas cancer// Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 2011, V. 20, P. 454-463.

149. Qian Y.M., Sun X.J., Tong M.H., Li X.P., Richa J., Song W.C. Targeted disruption of the mouse estrogen sulfotransferase gene reveals a role of estrogen metabolism in intracrine and paracrine estrogen regulation//

150. Endocrinology, 2001, V. 142, P. 5342-5350.

151. Radisky D., Hagios C., Bissell M. Tumors are unique organs defined by abnormal signaling and context// Semin. Cancer Biol., 2001, V. 11, P. 8795.

152. Ranade K.J., Nerurkar A.V., Phulpagar M.D., Shirsat N.V. Expression of survivin and p53 proteins and their correlation with hormone receptor status in Indian breast cancer patients// Indian J. Med. Sci., 2009, V. 63, P. 481-490.

153. Ratcliffe P.J. From erythropoietin to oxygen: hypoxia-inducible factor hydroxylases and the hypoxia signal pathway// Blood Purif., 2003, V. 20, P. 445-450.

154. Ravdin P.M., Siminoff L.A., Davis G.J., Mercer M.B., Hewlett J., Gerson N., Parker H.L. Computer program to assist in making decisions about adjuvant therapy for women with early breast cancer// J. Clin. Oncol., 2001, V. 19, №4, P. 980-991.

155. Reis F.M., Cobellis L., Tameirao L.C., Anania G., Luisi S., Silva I.S., Gioffre W., Di Blasio A.M., Petraglia F. Serum and tissue expression of activin A in postmenopausal women with breast cancer// J. Clin. Endocrino Metab, 2002, V. 87, P. 2277-2282.

156. Reis F.M., Luisi S., Carneiro M.M., Cobellis L., Federico M., Camargos A.F., Petraglia F. Activin, inhibin and the human breast// Mol. Cell Endocrinol., 2004, V. 15, P. 77-82.

157. Ridds E.A. Microarray Bioinformatics // Cambridge University Press,2003, P 154.

158. Risbridger G.P., Schmitt J.F., Robertson D.M. Activins and inhibins in endocrine and other tumors// Endocr. Rev., 2001, V. 22, P. 836-858.

159. Ronnov-Jessen L., Peterson O., Bissell M. Cellular changes involved in the conversion of normal to malignant breast: importance of the stromal reaction// Physiol. Rev., 1996, V. 76, P. 69-125.

160. Rouzier R., Pusztai L., Delaloge S. et al. Nomograms to predict pathologic complete response and metastasis-free survival after preoperative chemotherapy for breast cancer// J. Clin. Oncol., 2005, V. 23, P. 903.

161. Ryan B.M, O'Donovan N., Browne B., O'Shea C., Crown J., Hill A.D., McDermott E., O'Higgins N., Duffy M.J. Expression of survivin and its splice variants survivin-2B and survivin-DeltaEx3 in breast cancer// Br. J. Cancer, 2005, V. 17, № 92, P. 120-124.

162. Sah N.K., Khan Z., Khan G.J., Bisen P.S. Structural, functional and therapeutic biology of survivin// Cancer Lett., 2006, V. 244, P. 164-171.

163. Schmittgen T.D., Zakrajsek B.A., Mills A.G., Gorn V., Singer M.J., Reed M.W. Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction tostudy mRNA decay: comparison of endpoint and real-time methods// Anal. Biochem., 2000, V. 258, P. 194-204.

164. Schneider B.P., Winer E.P., Foulkes W.D. et al. Triple-negative breast cancer: risk factors to potential targets// Clin. Cancer Res., 2008, V. 14, P. 8010-8018.

165. Schneider L., Branchini G., Cericatto R., Capp E., Brum I.S. Gene and protein expression of p53 and p21 in fibroadenomas and adjacent normal mammary tissue// Endocrine, 2009, V. 35, P. 118-122.

166. Schneyer A., Schoen A., Quigg A., Sidis Y. Differential binding and neutralization of activins A and B by follistatin and follistatin like-3 (FSTL-3/FSRP/FLRG)// Endocrinology, 2003, V. 144, P. 1671-1674.

167. Schor S., Schor A. Phenotypic and genetic alterations in mammary stroma: implications for tumour progression// Breast Cancer Res., 2001, V. 3, P. 373-379.

168. Scorrano L., Oakes S.A., Opferman J.T. et al. BAX and BAK regulation of endoplasmic reticulum Ca2+: a control point for apoptosis// Science, 2003, V. 300, P. 135-139.

169. Semenza G.L., Rue E.A., Iyer N.V., Pang M.G., Kearns W.G. Assignment of the hypoxia-inducible factor 1 alpha gene to a region ofconserved synteny on mouse chromosome 12 and human chromosome 14q// Genomics, 1996, V. 34, P. 437^39.

170. Shalon D., Smith S.J., Brown P.O. A DNA microarray system for analyzing complex DNA samples using two-color fluorescent probe hybridization// Genome Res, 1996, V. 6, P. 56-62.

171. Sheau Y.H. et al. Interference of BAD (Bc!-xL/Bcl-2-Associated Death Promoter)-Induced Apoptosis in Mammalian Cells by 14-3-3 Isoforms and P11//Molecular Endocrinology, 1997, V. 11, P. 1858-1867.

172. Sofia G., Markus R., Yidong C., Sujatha P., Lao H. S. Estrogen Receptor Status in Breast Cancer Is Associated with Remarkably Distinct Gene Expression Patterns// Cancer Res., 2001, V. 61, P. 5979-5984.

173. Sommer K.W., Schamberger C.J., Schmidt G.E, Sasgary S., Cerni C. Inhibitor of apoptosis protein (IAP) BIRC5 is upregulated by oncogenic c-H-Ras// Oncogene, 2003, V. 22, P. 4266-4280.

174. Song J.J., Lee Y.J. Differential cleavage of Mstl by caspase-7/-3 is responsible for TRAIL-induced activation of the МАРК superfamily// Cell Signal., 2008, V. 20, P. 892-906.

175. Soonmyung P., Shak S. et al. A Multigene Assay to Predict Recurrence of Tamoxifen-Treated, Node-Negative Breast Cancer// N. Engl. J. Med., 2004, V. 351, P. 2817-2826.

176. Sorlie Т., Perou C.M., Tibshirani R. et al. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications//

177. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, V. 98, P. 10869-10874.

178. Sorlie T., Tibshirani R., Parker J. et al. Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, V. 100, P. 8418-8423.

179. Sotiriou C, Wirapati P, Loi S et al. Gene expression profiling in breast cancer: understanding the molecular basis of histologic grade to improve prognosis// J. Natl. Cancer Inst., 2006, V. 98, P. 262-272.

180. Sotiriou C., Piccart M.J. Taking gene-expression profiling to the clinic: when will molecular signatures become relevant to patient care?// Nat. Rev. Cancer, 2007, V. 7, P. 545-553.

181. Sotiriou C., Pusztai L. Gene-expression signatures in breast cancer// N Engl J Med, V. 360, 2009, P. 790-800.

182. Sparano J.A. TAILORx: Trial assigning individualized options for treatment (Rx)// Clin. Breast Cancer, 2006, V. 7, P. 32.

183. Stamenkovic I. Matrix metalloproteinases in tumor invasion and metastasis// Semin. Cancer Biol., 2000, V. 10, P. 415-433.

184. Sun T., Groepman P. Biological Functions of the Genes in the Mammaprint Breast Cancer Profile Reflect the Hallmarks of Cancer// Biomarker Insights, 2010, V. 5, P. 643-654.

185. Tang G., Shak S., Paik S., Anderson S.J., Costantino J.P., Geyer C.E.Jr., Mamounas E.P., Wickerham D.L., Wolmark N. Comparison of the prognostic and predictive utilities of the 21-gene Recurrence Score assay and

186. Adjuvant! for women with node-negative, ER-positive breast cancer: results from NSABP B-14 and NSABP B-20// Breast Cancer Res Treat, 2011, V. 437, P. 3254-3252.

187. Tlsty T. Stromal cells can contribute oncogenic signals// Cancer Biol, 2001, V. 11, P. 97-104.

188. Torn Hirota et al. Aurora-A and an Interacting Activator, the LIM Protein Ajuba, Are Required for Mitotic Commitment in Human Cells// Cell, 2003, V. 114, P. 585-598.

189. Wagner P., Wang B., Clark E. et al. Microtubule Associated Protein (MAP)-Tau: A novel mediator of paclitaxel sensitivity in vitro and in vivo// Cell Cycle, 2005, V. 4, P. 647-667.

190. Wang T., Brown M.J. mRNA quantification by real-time TaqMan polymerase chain reaction: validation and comparation with RNase protection// Anal Biochem., 1999, V. 269, P. 657-673.

191. Wang Y., Klijn J.G., Zhang Y. et al. Gene-expression profiles to predict distant metastasis of lymph-node-negative primary breast cancer// Lancet, 2005, V. 365, P. 775.

192. Wang Z., Dahiya S., Provencher H. et al. The prognostic biomarkers HOXB13, IL17BR, and CHDH are regulated by estrogen in breast cancer// Clin. Cancer Res., 2007, V. 13, P. 77-83.

193. Warren M.P. A comparative review of the risks and benefits of hormone replacement therapy regimens// Am. J. Obstet. Gynecol., 2004, V. 190, P.1141-1167.

194. Weigelt B., Horlings H.M., Kreike B. et al. Refinement of breast cancer classification by molecular characterization of histological special types// Pathol., 2008, V. 216, P. 141-150.

195. Weinshilboum R.M., Otterness D.M., Aksoy I.A. et al. Sulfation and sulfotransferases 1: Sulfotransferase molecular biology: cDNAs and genes// FASEB J., 1997, V. 11, P. 3-14.

196. Wilsson S., Gustafsson J.A. Biological role of estrogen and estrogenreceptors// Crit. Rev. Biochem Mol. Biol., 2002, V. 37, P. 1-28.

197. Wirapati P., Sotiriou C., Kunkel S. et al. Meta-analysis of gene expression profiles in breast cancer: toward a unified understanding of breast cancer subtyping and prognosis signatures// Breast Cancer Res., 2008, V. 10, P. R35.

198. Xue K.X. Molecular genetic and epigenetic mechanisms of hepatocarcinogenesis// Ai Zheng, 2005, V. 24, P. 757-768.

199. Yager J.D., Davidson N.E. Estrogen carcinogenesis in breast cancer// N. Engl. J. Med., 2006, V. 354, P. 270-282.

200. Yang J., Liu X., Bhalla K. et al. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked// Science, 1997, V. 275, P. 1129-1132.

201. Yared M.A., Middleton L.P., Meric F., Cristofanilli M., Sahin A.A. Expression of c-kit proto-oncogene product in breast tissue// Breast J., 2004,1. V. 10, P. 323-327.

202. Yu B., Sun X., Shen H.Y., Gao F., Fan Y.M., Sun Z.J. Expression of the apoptosis-related genes BCL-2 and BAD in human breast carcinoma and their associated relationship with chemosensitivity// J. Exp. Clin. Cancer. Res., 2010, V. 7, P. 107.

203. Yu J.X., Sieuwerts A.M., Zhang Y. et al. Pathway analysis of gene signatures predicting metastasis of node-negative primary breast cancer// BMC Cancer, 2007, V. 7, P. 7453.