Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Анализ баланса оппозитных цитокинов, ассоциированных с рецепторами врожденного иммунитета, у больных с острыми патологическими состояниями
- Ученая степень
- кандидата медицинских наук
- ВАК РФ
- 14.03.09
Автореферат диссертации по медицине на тему Анализ баланса оппозитных цитокинов, ассоциированных с рецепторами врожденного иммунитета, у больных с острыми патологическими состояниями
На правах рукописи
Греченко Вячеслав Владимирович
АНАЛИЗ БАЛАНСА ОППОЗИТНЫХ ЦНТОКИНОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С РЕЦЕПТОРАМИ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА, У БОЛЬНЫХ С ОСТРЫМИ ПАТОЛОГИЧЕСКИМИ
СОСТОЯНИЯМИ
14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология
Автореферат 4856783
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
- 6 ОКТ 2011
Москва-2011
4856783
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждена высшего профессионального образования "Российский национальны: исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова" Министерств здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор
доктор медадшских шук, профессор
Ковальчук Леонид Васильевич
Козлов Иван Генрихович
Винницкий Леонид Ильич
Ведущая организация:
ФГБУ ГНЦ "Институт иммунологии" ФМБА России
¿с
Защита диссертации состоится «'V-'» с?ит*1>/я 2011 года в /Г на заседали диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адрес; 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО РГМ Росздрава по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1
Автореферат разослан «_»_2011
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент
Кузнецова Татьяна Евгеньевн
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования
На сегодняшний день изучение системы врожденного иммунитета и, в частности, группы То11-подобных рецепторов (TLR) является актуальным и одним из наиболее перспективных направлений современной иммунологии. Известно, что TLR осуществляют распознавание молекулярных паттернов, ассоциированных с различными патогенными микроорганизмами (Pathogen-Associated Molecular Patterns - РАМР), запуская, таким образом, эффекторные механизмы врожденного иммунитета [Bianchi М.Е., 2007]. Активация TLR обуславливает экспрессию множества генов хемокинов и провоспалительных цитокинов. Помимо цитокинов, усиливается экспрессия молекул адгезии, противомикробных пептидов, белков острой фазы воспаления, NO-синтазы, циклооксигеназы. Все это приводит к развитию воспалительной реакции [Ковальчук JI.B., Хорева М.В., Варивода А.С. и др., 2007].
Кроме того, в настоящее время известно, что помимо бактериальных и вирусных компонентов, TLR могут распознавать и эндогенные молекулы, появляющиеся при повреждении тканей, т.е. молекулярные паттерны, ассоциированные с повреждением (Damage-Associated Molecular Patterns -DAMP). За счет этого происходит вовлечение системы врожденного иммунитета в асептическое воспаление, удаление некротических масс и, впоследствии, восстановление поврежденной ткани [Bianchi М.Е., 2007; Piccinini A.M., Midwood K.S, 2010]. Однако, изменение активности TLR, в частности, чрезмерная продукция провоспалительных цитокинов, приводящая к усилению воспалительного ответа, может становиться повреждающим фактором, вовлекаясь тем самым в патогенез основного заболевания [Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода А.С. и др., 2008]. Установлено участие TLR в патогенезе множества воспалительных и аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, сепсис,
системная красная волчанка, атеросклероз и инфаркт миокарда [Piccininiand A.M. et al., 2010; Erridge С., 2010].
Острый деструктивный панкреатит (ОДП) - заболевание, в основе которого лежит повреждение ткани поджелудочной железы, сопровождающееся воспалительной реакцией, приобретающей в той или иной степени системный характер, которая зачастую может приводить к полиорганной недостаточности [Weber С.К., Adler G., 2001; Shen Y. et al., 2011]. Этим объясняется высокий уровень смертности, составляющий более 10% в начальный период заболевания. В таких случаях очень важн, возможность раннего прогноза течения острого деструктивного панкреатита, которая может дать преимущества при лечении заболевания.
В настоящее время имеется достаточно работ, посвященных изучении уровня провоспалительных цитокинов при ОДП. Установлено, что ведущуь роль в патогенезе играют такие провоспалительные цитокины как ИЛ-1, ИЛ 6, ИЛ-8 и ФНОа, именно их гиперпродукция («цитокиновый шторм») н первой неделе заболевания может привести к развитию системно" воспалительной реакции [Novovic S. et al., 2009; Shen Y. et al., 2011]. Пр: этом повышение уровня ИЛ-6 и ИЛ-8 тесно коррелирует с тяжесты заболевания. Известно, что продукция этих цитокинов ассоциирована активацией TLR [Ding J. et al., 2009].
Однако до настоящего времени роль функциональной активности TL] при ОДП изучена недостаточно. Кроме того, не встречается работ п изучению роли соотношения уровней различных провоспалительны цитокинов, а также баланса про- и противовоспалительных цитокинов пр ОДП. По нашему мнению не столько уровень, сколько баланс цитокино может определять направление течения заболевания. Также представляете актуальным изучить возможность терапевтического воздействиз направленного на коррекцию функциональной активности TLR при ОДП.
Цель исследования:
Определить выработку и баланс про- и противовоспалительных цитокинов, продуцируемых мононукпеарными клетками (МНК) периферической крови больных ОДП, под действием лигандов ТЬК, в динамике заболевания, и оценить их прогностическую значимость.
Задачи исследования:
1) Оценить спонтанную и индуцированную лигандами ТЫ12 и ТЫ14 продукцию про- и противовоспалительных цитокинов МНК периферической крови больных ОДП, по сравнению со здоровыми донорами
2) Оценить возможные различия в цитокиновом профиле МНК периферической крови больных ОДП.
3) Разработать метод оценки баланса нескольких цитокинов, продуцируемых МНК периферической крови больных ОДП, в динамике заболевания.
4) Оценить возможность прогноза течения заболевания по уровню и балансу цитокинов, продуцируемых МНК периферической крови больных ОДП, на ранних сроках заболевания.
5) Исследовать возможность терапевтического воздействия, направленного на коррекцию функциональной активности ТЫ1 при ОДП.
Научная новизна работы
Впервые получен профиль спонтанной и индуцированной лигандами ТЬЯ2 и Т1Л14 продукции провоспалительных (ФНОа, ИЛ-6, ИЛ-8) и противовоспалительных (ИЛ-10) цитокинов в культуре МНК периферической крови больных ОДП в динамике заболевания, установлена его связь с течением заболевания. На основе разработанного нами способа оценки баланса цитокинов, продуцируемых МНК периферической крови, сформулированы критерии для оценки прогноза течения ОДП.
В опытах in vitro установлено, что нестероидное противовоспалительное средство лорноксикам подавляет индуцированную лигандами TLR продукцию исследуемых цитокинов. Выявлена возможность коррекции спонтанной и индуцированной лигандами TLR продукции МНК периферической крови больных ОДП провоспалительных цитокинов (преимущественно ФНОа и ИЛ-6) с помощью лорноксикама. Тяжесть течения и исход острого панкреатита зависят от смещения баланса цитокинов, индуцируемых через рецепторы врожденного иммунитета, фармакологическая коррекция позволяет изменять соотношения цитокинов, улучшая течение заболевания.
Практическая значимость работы
Выявленные изменения в соотношении продукции цитокинов на ранних сроках заболевания у больных с различным клиническим течением острого деструктивного панкреатита могут служить прогностическим критерием течения заболевания. Показано, что подавление выработки провоспалительных цитокинов при использовании лорноксикама на ранней стадии улучшает течение заболевания.
Положения, выносимые на защиту:
1. Профиль цитокинов, продуцируемых мононуклеарными клетками периферической крови больных острым деструктивным панкреатитом, коррелирует с клиническим течением заболевания.
2. Баланс между ИЛ-6 и ИЛ-8 может служить прогностически» критерием течения и исхода острого деструктивного панкреатита н ранних сроках заболевания.
3. Коррекция профиля и баланса цитокинов позволяет изменять течени острого деструктивного панкреатита, направляя его в боле благоприятную сторону.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования используются в практической работе хирургического отделения ГКБ № 55 г. Москвы.
Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс студентов, ординаторов и аспирантов кафедр иммунологии и хирургии РНИМУ им. Н.И. Пирогова.
Апробация работы
Диссертация апробирована на совместной научной конференции кафедры иммунологии, кафедры экспериментальной и клинической хирургии и отдела иммунологии ГБОУ ВПО "РНИМУ им Н.И. Пирогова" от 05 апреля 2011 года.
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на научных заседаниях кафедры иммунологии и отдела иммунологии ГБОУ ВПО "РНИМУ им. Н.И. Пирогова" МЗСР РФ, на Международной Пироговской Конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2011г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 6 в журналах, рекомендуемых ВАК Российской Федерации.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 184 источников (11 отечественных и 173 зарубежных). Работа содержит 4 таблицы и 38 рисунков.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Объекты исследования. Для экспериментальных исследований использовали кровь здоровых доноров и больных острым деструктивным панкреатитом. Всем больным ОДП диагноз был поставлен в соответствии с используемыми в клинике диагностическими критериями. Критерием отбора доноров было отсутствие инфекционных и аллергических заболеваний.
Группу I больных ОДП составили больные, находившиеся в стационаре ГКБ № 55 12±3 койко-дней. К этому времени у них наблюдалось рассасывание перипанкреатического инфильтрата, т.е. наблюдался наиболее благоприятный вариант течения острого панкреатита. В данную группу вошли 16 человек в возрасте 20-60 лет: 9 мужчин и 7 женщин.
Группу II больных ОДП составили больные, находившиеся в стационаре 30±10 койко-дней. У них наблюдалось менее благоприятное течение заболевания: асептическое расплавление и секвестрация очагов некроза в ткани поджелудочной железы. В данную группу вошли 14 человек в возрасте 35-60 лет: 8 мужчин и 6 женщин. Кроме того, в этой группе отмечено развитие ряда осложнений в течении ОДП, таких ка ферментативный перитонит и формирование псевдокисты.
Все пациенты получали стандартную терапию, предусмотренную протоколом ведения больных с ОДП. Помимо нее, группе пациентов дополнительно проводилась терапия с использованием нестероидного противовоспалительного средства лорноксикам. Всего, среди набранны: больных, присутствовало 16 человек, получавших дополнительн лорноксикам. Лечение остальных 14 человек проводилось с использовани только стандартной терапии.
Группой сравнения послужила группа здоровых доноров, состоящая и 20 человек в возрасте 20-45 лет: 11 мужчин и 9 женщин. Донорская кров
была любезно предоставлена отделением переливания крови и гравитационной хирургии РДКБ.
Выделение сыворотки. Кровь для получения сыворотки набиралась в пробирки с активатором свертывания и разделительным гелем (олефиновый гель). После центрифугирования и полной ретракции сгустка сыворотку собирали и хранили в течение 2-3 месяцев при температуре -70°С. Концентрацию цитокинов в полученной сыворотке определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА).
Выделение мононуклеарных клеток. Суспензию МНК выделяли из периферической крови обследуемых по методу, основанному на седиментации в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-урографина ("Pharmacia", р=1,077 г/смЗ). Жизнеспособность клеток оценивали с помощью 0,1% раствора трипанового синего. Жизнеспособность клеток после выделения была выше 95%.
МНК культивировали в полной среде RPMI 1640 (НПП «ПанЭко»), содержащей гентамицин (ОАО "Дальхимфарм"), 10% сыворотки эмбрионов коров ("HyClone, Perbio") и 2mM L-глутамина (НПП «ПанЭко»), в течение 24 и 48 часов при 37°С в атмосфере с 5% СОг. Рабочая концентрация клеток составляла 1*106 в мл.
Стимуляция клеток. В качестве лигандов TLR использовали следующие стимуляторы: ЛПС (E.coli 0127: В8, «Sigma») и пептидогликан (Staphylococcus aureus, «Sigma/Fluka») в концентрациях 0,1 мкг/мл и 2,5 мкг/мл, соответственно. Контролем служили МНК, культивируемые в полной среде RPMI 1640. Супернатанты собирались и хранились в течение 23 месяцев при -70°С. Концентрацию цитокинов в полученных супернатантах определяли методом ИФА.
Оценка влияния лорноксикама на выработку цитокинов МНК периферической крови здоровых доноров in vitro. Выработку цитокинов МНК периферической крови здоровых доноров стимулировали лигандами TLR1/2 (ПГ) и TLR4 (ЛПС) в присутствии лорноксикама в концентрациях 10
мкг/мл, 100 мкг/мл и 150 мкг/мл. По окончании культивирования (24часа) МНК осаждали центрифугированием при 400g в течение 15 минут, получали супернатанты и хранили в течение 2-3 месяцев при температуре -70°С.
Определение концентрации цитокинов. Для определения концентрации цитокинов ИЛ-ip, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12 и ФНОа в супернатантах культур клеток и в сыворотках крови использовали коммерческие наборы для иммуноферментнош анализа фирм Biosource и BenderMedSystems. Результаты анализа учитывали спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Оптическую плотность определяли на приборе Anthos 2020. Калибровочная кривая строилась автоматически по результатам, полученным для стандартов, и по ней определяли содержание определяемого цитокина в исследуемых образцах.
Статистическая обработка результатов проводилась статистическими методами с использованием программного пакета StatSoft Statistica 6. Для описания данных, не подчиняющихся нормальному распределению, использовали медиану, а также 25-й и 75-й процентили. Показатели, прошедшие проверку на нормальность описывали как среднее арифметическое ± стандартное отклонение. Для оценки достоверности различий применяли непараметрические критерии Вилкоксона и Манна-Уитни, а также параметрический критерий Стьюдента для связанных и несвязанных совокупностей. Различие средних показателей считалось достоверным, при уровне значимости менее 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение выработки провоспалительных и противовоспалительных цитокинов МНК периферической крови больных ОДП в динамике
На первом этапе исследования у больных острым панкреатитом нами исследовалась продукция провоспалительных цитокинов ФНОа, ИЛ-6 и ИЛ-8, а также противовоспалительного цитокина ИЛ-10 по всей совокупности набранных больных. Поскольку именно эти цитокины по данным литературы
имеют наибольшее значение в патогенезе данного заболевания. Это позволило оценить общую закономерность продукции про- и противовоспалительных цитокинов МНК периферической крови больных ОДП под действием лигандов ТЬЯ. В дальнейшем мы выявили особенности характерные для некоторых больных, на основании которых набранные пациенты были разделены на группы.
В результате выявлено, что у больных ОДП по сравнению с группой здоровых доноров наблюдается повышение индуцированной лигандами Т1Л1, а в некоторых случаях и спонтанной выработки провоспалительных цитокинов ИЛ 6 и ИЛ 8 мононуклеарными клетками. Таким образом, мы можем сказать, что клетки экспрессирующие ТЫ1 у больных ОДП обладают повышенной функциональной активностью, проявляющейся в повышенной продукции провоспалительных цитокинов (ИЛ-6 и ИЛ-8). К 7-14 суткам течения ОДП происходит усиление индукции противовоспалительного цитокина ИЛ-10. Продукция ФНОа достоверно не отличалась от уровня здоровых доноров на протяжении всего исследуемого периода.
Изучение продукции про- и противовоспалительных цитокинов МНК периферической крови больных с разным течением ОДП
При оценке профиля продукции цитокинов МНК периферической крови больных ОДП была выявлена определенная закономерность. В соответствии с которой мы разделили исследуемых на две группы. При анализе клинических данных пациентов было установлено, что в I группе больных наблюдалось более благоприятное течение ОДП с более быстрым выздоровлением (пребывание в стационаре составило в 12±3 койко-дней). Во II группе отмечается более длительное (30±10 койко-дней), менее благоприятное течение заболевания.
Спонтанная продукция ИЛ-6 МНК периферической крови больных II группы достоверно (а=0,05) повышена на 3 сутки заболевания и составила 106 (82-240) пг/мл и 1999 (1225-9120) пг/мл, в I и II группах, соответственно.
В остальные контрольные дни достоверных отличий не выявлено. При исследовании индуцированной лигандами TLR выработки ИЛ-6 МНК периферической крови (Рис. 1) в I группе больных ОДП наблюдается достоверное (а=0,05) повышение этого показателя в 1-е сутки течения заболевания, уровень индуцированной продукции ИЛ-6 здесь составил 13526 (8106-17515) пг/мл и 7787 (5119-7942) пг/мл, в I и II группах соответственно. В динамике к 3-м суткам течения заболевания в I группе пациентов продукция ИЛ-6 достоверно снижается (7899 (6392-9006) пг/мл) относительно больных П группы (15636 (9009-19613) пг/мл) эти различия сохраняются до 7 суток заболевания.
24000 22000 20000 18000 16000 14000
с;
■I 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0
Рисунок 1. Индуцированная ЛПС продукция ИЛ-6 МНК периферической крови больных ОДП I и II групп в динамике. *- различия достоверны, а=0,05
К 14-м суткам наблюдается снижение стимуляции и у больных I группы, к этому времени их продукция ИЛ-6 достигает уровня I групш больных.
При исследовании продукции ИЛ-8 МНК периферической кров] больных ОДП, в I и II группах отмечается разнонаправленная динамик
Медиана; Отрезки: 25%-75%
—1
* — *
......
Г
1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки Группа I —{— Группа II
продукции ИЛ-8. При оценке спонтанной продукции ИЛ-8 МНК (Рис. 2) в начале заболевания (1 сутки) продукция ИЛ-8 в I группе достоверно (а=0,05) повышена относительно показателя больных II группы и составляет 18837 (17804-24486) пг/мл и 3875 (1948-10018) пг/мл, соответственно.
28000 26000 24000 22000 20000 18000 16000 •§ 14000 С 12000 10000 8000 6000 4000 2000 О
Рисунок 2. Спонтанная продукция ИЛ-8 МНК периферической крови больных ОДПI и II групп в динамике. *- различия достоверны, а=0,05
В дальнейшем, к 3-м суткам эта разница уменьшается (статистически она отсутствует на уровне а=0,05), хотя в I группе остается тенденция к сохранению высокого уровня продукции ИЛ-8. На 7 сутки мы видим статистически достоверное (а=0,05) подтверждение этой тенденции: уровень спонтанной и стимулированной продукции ИЛ-8 больных I группы в этот период выше, чем во II группе, составляя 16487 (11624-21775) пг/мл и 8189 (6011-9024) пг/мл, соответственно.
Между 7 и 14 сутками в динамике происходит «перекрест» кривых, уровень продукции ИЛ-8 МНК в исследуемых группах меняется на противоположный. Несмотря на отсутствие статистической достоверности, можно говорить о наличии тенденции к усилению продукции ИЛ-8 во II
Медиана; Отрезки: 25%-75%
1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки -<>- Группа I —У- Группа II
группе и, соответственно, снижению этого показателя в I группе больных ОДП.
Характер динамики профиля индуцированной ЛПС продукции ИЛ-8 МНК периферической крови больных ОДП в I и II группах аналогичен спонтанной продукции этого цитокина.
Продукция ИЛ-10 МНК периферической крови, как спонтанная, так и индуцированная лигандами TLR в 1-е сутки заболевания достоверно выше у больных I группы.
260 240 220 200 180 160 С 140 с 120 100 80 60 40 20 0
Рисунок 3. Индуцированная ЛПС продукция ИЛ-10 МНК периферической крови больных ОДП I и II групп в динамике. *- различия достоверны, а=0,05
К 3 суткам течения ОДП у больных I группы происходит снижени спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-10, в этот период достоверны: различий между больными I и II групп нет. К 7 суткам заболевания в I групп больных, по сравнению со II группой, вновь происходит увеличени продукции ИЛ-10. К 14 суткам к этому же уровню продукции приходят : больные II группы, в этот период достоверных отличий между группами н наблюдается.
Медиана; Отрезки: 25%-75то
\ / .í 1
* Я"1
\ * / : /
/
*
\
1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки •<>: Группа I ЗЁ Группа II
Таким образом, усиление продукции ИЛ-10, по всей видимости, отражает собой переход заболевания в репаративную фазу. Больные I группы, находившиеся в стационаре 12±3 койко-дней, показывают достоверное увеличение продукции ИЛ-10 к 7 суткам, т.е. во второй половине срока заболевания. У больных II группы мы видим сходную тенденцию, но с учетом иного течения болезни: повышение уровня ИЛ-10 наблюдается к 14 суткам заболевания, с учетом сроков пребывания в стационаре (30±10 койко-дней), тоже к середине срока заболевания.
Оценка баланса цитокинов, продуцируемых МНК периферической крови больных с разным течением ОДП в динамике
Большинство работ, посвященных изучению продукции различных цитокинов, как показателей, отражающих активность процесса воспаления и иммунного ответа, оценивает абсолютные значения уровня различных цитокинов. Однако нельзя забывать, что в организме цитокины образуют единую медиаторную сеть, в которой имеет значение не только уровень, но и соотношение различных цитокинов. Зачастую уровень цитокинов может сильно варьировать у различных индивидуумов, не отличающихся по иным показателям. Это может быть связано с полиморфизмом генов цитокинов и регуляторных молекул, участвующих в их продукции. Очевидно, что в таких случаях определение соотношения уровней может дать дополнительные критерии для оценки состояния больных.
Баланс или соотношение взаимосвязанных показателей, математически может определяться различными способами. Нами предложен метод оценки соотношения путем математического нахождения процентной доли одного из исследуемых показателей в общей сумме всех исследуемых показателей. В этом случае получаемый процентный показатель, будет отражать В нашем случае исследуемыми цитокинами были ФНОа, ИЛ-6, ИЛ-8 и ИЛ-10. Исследуя баланс между этими цитокинами, на основе абсолютных значений
мы находили их доли в общей сумме. Например, для ИЛ-6 такой показатель равен;
ИЛ 6 (%) =-ИЛ6(пг/ мл)-* 100%
ФНО а(пг / мч) + ИЛ6{пг / мл) + ИЛ8(ю / ли) + ИЛ 10(иг / мл)
Эти показатели находились на каждом этапе исследования (в 1-14 сутки динамики заболевания) для спонтанной и стимулированной лигандами Т1Л продукции цитокинов МНК исследуемых больных. В дальнейшем проводилось оценка этих показателей: сравнение со здоровыми донорами, а также сравнение в группах больных с благоприятным и неблагоприятным течением ОДП.
Интенсивное увеличение уровня какого-либо цитокина приводит к увеличению его доли в общей выработке, одновременно с этим доля «отстающих» цитокинов уменьшится. Таким образом, можно судить о смещении баланса в сторону цитокинов, чей уровень нарастает более интенсивно.
40 35 30 25 20 15 10 5 0
Рисунок 4. Доля ИЛ-6 в спонтанной продукции исследуемых цитокинов МНК периферической крови больных ОДП I и II групп. *- различия достоверны, а=0,05
Медиана; Отрезки: 2Б%-76%
* 1
*
* * X
1 / N у
Уровень групп! 1 ко1 п гроля ;ч I
/ \ п
ч -I 1
1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки Г п.] Группа I Г»3 Группа II
При сравнении исследуемых групп больных между собой в первую очередь обращает на себя внимание более высокая доля ИЛ-6 в спонтанной продукции цитокинов МНК на 1-7 сутки заболевания (Рис. 4).
При этом если соотнести эти показатели с группой контроля, мы видим, что здесь происходит четкое разделение групп. Показатели больных из I группы в этот период находятся ниже уровня группы контроля - 11,63 (11,09-14,89) %, в то время как показатели II группы достоверно выше (в 3 сутки заболевания) или не отличаются от этого уровня (в 1 и 7 сутки).
Сравнение показателей баланса ИЛ-6 при стимуляции лигандами ТЬЯ также выявляет существенные различия между исследуемыми группами. В 1 сутки заболевания доля ИЛ-6 в I группе достоверно повышена относительно этого показателя II группы, однако к 3 суткам ситуация меняется на противоположную и сохраняется таковой вплоть до 7 суток заболевания. При этом показатели обеих групп существенно выше уровня здоровых доноров на протяжении всего периода течения болезни, что не позволяет нам использовать показатели группы контроля для четкого разделения групп по этому показателю.
Продолжая сравнивать исследуемые группы, мы обнаружили существенные различия в доле выработки ИЛ-8. Доля ИЛ-8 в спонтанной продукции цитокинов МНК больных I группы достоверно выше уровня группы контроля в 1-7 сутки течения ОДП, в то же время этот показатель на 3 сутки достоверно выше, чем во II группе пациентов (Рис. 5).
В этом случае также можно установить критерий разделения групп на основании уровня здоровых доноров - 86,58 (80,99-87,24)%. Соответственно, если при оценке баланса доля ИЛ-8 будет ниже 81%, это может служить основанием менее благоприятного прогноза течения ОДП и более длительного срока госпитализации пациента с риском развития осложнений. Значения показателя выше 87% наоборот дает более благоприятный прогноз течения заболевания.
100 80
60
40 20 0
Рисунок 5. Доля ИЛ-8 в спонтанной продукции исследуемых цитокинов МНК периферической крови больных ОДП I и II групп. *- различия между группами достоверны, а=0,05
Таким образом, мы можем сформулировать диагностический критерий, позволяющий на ранних сроках развития заболевания прогнозировать его дальнейшее течение (Табл. 1).
Таблица 1
Оценка показателей баланса продукции ИЛ-6 и ИЛ-8 в культуре МНК периферической крови для определения прогноза течения ОДП
Доля спонтанной продукции МНК периферической крови Благоприятное течение, низкая вероятность осложнений Неблагоприятное течение, высокая вероятность осложнений
1 сутки ИЛ-6 (%) <11% >11%
3 сутки ИЛ-6 (%) <11% >15%
ИЛ-8 (%) >87% >81%
В 1 сутки доля ИЛ-6 в спонтанной продукции исследуемых цитокинов на уровне 11 % является границей разделения, по которой мы сможем судить о дальнейшем течении заболевания. На 3 сутки течения ОДП можно уточнить сделанные ранее предположения: значение долей ИЛ-6 и ИЛ-8 в
*
УдовУньгру! Я пы пг я" .... I * •-.-г г
«41 ?0|
— '
— —
1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки !'□.] Группа I ЕЗ Группа II
спонтанной продукции цитокинов МНК менее 11% и более 87% соответственно, позволяют предположить дальнейшую положительную динамику ОДП. Повышение доли ИЛ-6 в спонтанной продукции более 15% с одновременным снижением доли ИЛ-8 менее 81% ухудшают прогноз течения болезни.
Влияние лорноксикама на опосредованную TLR 1/2 и TLR 4 выработку про- и противовоспалительных цитокинов in vitro
Одной из задач нашего исследования была оценка возможности коррекции баланса цитокинов, мы обратили внимание на следующий факт: часть исследуемых больных получала в качестве дополнительной терапии нестероидное противовоспалительное средство лорноксикам.
Мы изучили его влияние на продукцию цитокинов МНК периферической крови здоровых доноров под действием лигандов TLR in vitro (Табл. 2). Выявлено, что лорноксикам достоверно ингибирует выработку ФНОа, ИЛ-1 и ИЛ-6 в основном в ответ на ПГ, лиганд TLR1/2. Продукция ИЛ-8, ИЛ-12 и ИЛ-10 в ответ на ПГ и ЛПС подавляется лорноксикамом в равной мере.
Таким образом, лорноксикам достоверно ингибирует in vitro выработку как провоспалительных, так и противовоспалительного цитокина МНК здоровых доноров, опосредованную лигандами TLR1/2 и TLR4. Максимальный ингибирующий эффект лорноксикама на TLR опосредованную выработку цитокинов наблюдался в концентрации 150 мкг/мл. При этом наибольший подавляющий эффект достигается в случае стимуляции выработки цитокинов через TLR1/2.
Значительное снижение уровня провоспалительных цитокинов служит аргументом в пользу выраженного противовоспалительного эффекта лорноксикама и его способности воздействовать не только на метаболизм арахидоновой кислоты, но и на пути трансдукции сигнала через активированные TLR.
Подавление лорноксикамом выработки про- и противовоспалительных цитокинов in vitro
Стимулированная Иигибирование(%)
выработка Лорноксикам Лорноксикам Лорноксикам
(пг/мл) 10 мкг/мл 100 мкг/мл 150 мкг/мл
ФНОа лпс 612±262 не влияет 12,8518,72 33,43129,77
пг 10501581 не влияет 29,71113,27 70,86119,96*
ИЛ-1 лпс 568±305 14,8419,50 не влияет 42,69127,30
пг 2012±533 18,48114,19 65,70±20,37* 85,71 ±5,19*
ИЛ-6 ЛПС 17361443 9,3516,09 4,7613,64 29,4717,29
пг 16241615 13,09+7,09 15,0514,18 50,22126,11*
ИЛ-8 ЛПС 1115314050 7,4115,67 36,50131,44 60,63122,51*
пг 995814316 10,9316,55 43,16128,53 70,63112,67*
ИЛ-10 лпс 84161 не влияет 50,45130,93 80,82118,37*
пг 36123 13,9718,24 18,25114,34 86,9218,88*
ИЛ-12 лпс 4741120 11,6819,99 78,12118,23* 85,11111,08*
пг 3621125 4,5313,47 58,83140,17 91,2215,00*
Данные в таблице представлены в виде М±ст, * - достоверность с уровнем значимости а=0.05
Влияние лорноксикама на продукцию про- и противовоспалительных цитокинов МНК периферической крови пациентов с ОДП в динамике
В результате исследования продукции провоспалительных цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНОа) МНК периферической крови больных ОДП выявлено, что в группе пациентов, получавших лорноксикам, с 3 суток заболевания отмечается достоверно более низкий уровень провоспалительных цитокинов, чем в группе базисной терапии.
Так индуцированная ЛПС продукция ИЛ-6 МНК периферической крови достоверно (а=0,05) ниже в группе, получавшей лорноксикам, на 3 и 7 сутки течения ОДП (Рис. 6).
Медиана; Отрезки: 25'А-75%
-О- Стандартная терапия Лорноксикам
Рисунок 6. Индуцированная ЛПС продукция ИЛ-6 МНК периферической крови больных ОДП при стандартной терапии и терапии с применением лорноксикама. *- различия между группами достоверны, а=0,05
Кроме того, в группе стандартной терапии в динамике наблюдается тенденция к повышению продукции ИЛ-6 МНК периферической крови, в то время как в группе лорноксикама заметна тенденция к снижению этого показателя от исходного уровня. Изменения в продукции ИЛ-8 МНК между
группами стандартной терапии и терапии с применением лорноксикама наблюдаются только при спонтанной продукции. Уровень продукции ИЛ-10 существенно не менялся. Эти данные во многом хорошо коррелируют с результатами, полученными на МНК здоровых доноров in vitro. Отсутствие ингибирующего эффекта в отношении ИЛ-10 можно объяснить исходно низким уровнем его продукции в период применения лорноксикама (1-3 сутки).
Все эти данные коррелируют с результатами, полученными при исследовании уровня цитокинов в сыворотке крови пациентов с острым панкреатитом. (Табл. 3).
Таблица 3
Содержание цитокинов в сыворотках крови больных с острым панкреатитом.
Группа сравнения Медиана (25-75%) Основная группа Медиана (25-75%)
ФНОа (пг/мл) 1 сутки 16,5 (12,4-20,5) 17,3 (9,2-25,4)
6 сутки 17,3 (14,9-19,7) 14,2(11,3-17,2)
ИЛ -6 (пг/мл) 1 сутки 8,2 (6,1-10,3) 313,29* (60,9-565,7)
6 сутки 54,4 (0-108,7) 31,81 (1,01-6,61)
ИЛ-8 (пг/мл) 1 сутки 16,1 (1,2-30,9) 66,7* (54,1-79,4)
6 сутки 38,5 (10,4-66,7) 32,66 (26,3-39,03)
ИЛ-10 (пг/мл) 1 сутки 2,3 (0,63-3,93) 2,2 (0,61-3,79)
6 сутки 0,4 (0,16-0,64) 0,02 (0-0,04)
*- различия между группами достоверны, а=0,05
Сопоставив эти данные с течением заболевания у исследуемы: больных, мы выявили, что в группу лорноксикама вошло большинстве пациентов с более благоприятным течением ОДП. Это также может о( эффективности включения лорноксикама в терапию больных ОДП. Такш образом, применение лорноксикама на начальных этапах развитая ОГ позволяет предотвратить развитие системной воспалительной реакции
выводы
1. Изучение в динамике (1-14 сутки) профиля цитокинов (ФНОа, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10), продуцируемых мононуклеарными клетками периферической крови спонтанно и под влиянием лигандов ТЬЯ, позволило выделить среди исследуемых больных две подгруппы, клинически характеризующиеся различными сроками выздоровления.
2. Более благоприятному течению заболевания, с выздоровлением в течение 12±3 койко-дней, соответствует повышение по сравнению со здоровыми донорами индуцированной лигандами ТЬЯ выработки ИЛ-6 на 1 сутки, которая снижается к 3-м суткам заболевания. Спонтанная и индуцированная выработка ИЛ-8 в этой группе больных повышена и снижается к 14 суткам. Индуцированная лигандами ТЫ1 продукция противовоспалительного цитокина ИЛ-10 повышается к 7 суткам течения заболевания.
3. Менее благоприятное течение заболевания, с выздоровлением в течение 30±10 койко-дней, сопровождается повышением, по сравнению со здоровыми донорами, спонтанной и индуцированной лигандами ТЫ1 выработки ИЛ-6, который возрастает с 3-х суток заболевания и остается высоким на 14 сутки наблюдения. Спонтанная и индуцированная лигандами ТЪЯ продукция ИЛ-8 МНК не отличается от уровня здоровых лиц в начальный период и повышается к 3-м суткам заболевания. Индуцированная лигандами ТЫ?, продукция противовоспалительного цитокина ИЛ-10 повышается к 14 суткам заболевания.
4. У больных с более благоприятным течением заболевания баланс провоспалительных цитокинов смещен в сторону ИЛ-8, в то время как у больных с менее благоприятным течением заболевания наблюдается смещение баланса в сторону ИЛ-6.
5. Изменение баланса спонтанной выработки ИЛ-6 и ИЛ-8 на 1-3 сутки заболевания может служить прогностическим критерием течения и исхода
острого деструктивного панкреатита. Оценка ФНОа не информативна в данной системе.
6. Лорноксикам оказывает подавляющее действие на выработку цитокинов, ассоциированных с TLR. В культуре in vitro наблюдается ингибирование продукции как про-, так и противовоспалительных цитокинов МНК здоровых доноров, стимулированных лигандами TLR2 и TLR4. У больных ОДП, получавших лорноксикам, наблюдается снижение спонтанной и стимулированной лигандами TLR продукции провоспалительных цитокинов МНК периферической крови, преимущественно ФНОа и ИЛ-6.
Практические рекомендации
Предложенный метод оценки баланса цитокинов целесообразно использовать на 1-3 сутки заболевания, для определения прогноза течения ОДП, с целью определения тактики ведения пациентов и подбор; соответствующего метода терапии.
Тяжелым больным ОДП для снижения риска развития системноГ воспалительной реакции в качестве дополнительной терапии рекомендуете: применение нестероидных противовоспалительных средств, в частност) лорноксикама.
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации
1. Хорева М.В., Ковальчук Л.В., Варивода A.C., Греченко В.В., ГорскиГ В.А., Агапов М.А., Леоненко И.В. Влияние ингибитора циклооксигеназ! на опосредованную через TLR2 и TLR4 выработку цитокино: мононуклеарными клетками человека в норме и при остром панкреатите // Российский иммунологический журнал - 2009 -№3-4, 3(12), с 294-302
2. Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Никонова A.C., Греченко В.В., Агапов М.А Индароков В.А., Леоненко И.В., Горский В.А. Корригирующее действи ингибитора циклооксигеназы на функциональное состояни мононуклеарных клеток, экспрессирующих Toll- подобные рецепторы. ,
Журнал Микробиологии, эпидемиологии, иммунологии -2010 -№1, с. 45-50
3. Ковальчук J1.B., Никонова A.C., Хорева М.В., Юдин A.A., Греченко В.В. Кардиоиммунные взаимодействия на основе рецепторов врожденного иммунитета: состояние вопроса, перспективы развития. // Вестник РГМУ -2010-№1,с. 11-18
4. Шуркалин Б.К. Ковальчук Л.В. Агапов М.А. Хорева М.В. Индароков В.А. Ованесян Э.Р. Никонова A.C. Леоненко И.В. Греченко В.В. Горский В.А. Применение нестероидных противовоспалительных препаратов в лечении панкреонекроза // Журнал Хирург - 2010 - с. 5-13
5. Горский В.А. Ковальчук Л.В. Агапов М.А. Хорева М.В. Ованесян Э.Р. Никонова A.C. Греченко В.В. Антимедиаторная терапия в комплексном лечении острого деструктивного панкреатита // Журнал Хирургия — 2010 - №3, с.54-61
6. Горский В.А. Агапов М.А. Ковальчук Л.В. Ованесян Э.Р. Хорева М.В. Никонова A.C. Леоненко И.В. Индароков В.А. Греченко В.В. Синдром системной воспалительной Реакции при остром панкреатите: особенности молекулярной патофизиологии и возможные пути коррекции. // Журнал Клиническая медицина - 2010 - №2, с. 39-44
7. Шуркалин Б.К. Горский В.А. Агапов М.А. Хорева М.В. Ованесян Э.Р. Индароков В.А. Никонова A.C. Греченко В.В. Влияние нестероидных противовоспалительных препаратов на медиаторы воспаления у больных панкреонекрозом. // Журнал Инфекции в хирургии - 2010 - Т. 8, № 2, с. 28-32
8. Баранова Е.Е. Греченко В.В. Хорева М.В. Анализ экспрессии и функциональной активности То11-подобных рецепторов на мононуклеарных клетках у больных острым панкреатитом. // Материалы VI Международной Пироговской Конференции студентов и молодых ученых, 24 марта 2011 г., М. с. 20.
Список сокращений
ИЛ — интерлейкин
ИФА — иммуноферментный анализ
ЛПС — липополисахарид
МНК - мононуклеарные клетки
ОДП - острый деструктивный панкреатит
ПГ - пептидогликан
ФНО - фактор некроза опухоли
TLR (Toll-like receptor) - То11-подобный рецептор
DAMP (Damage-Associated Molecular Patterns) - молекулярные паттерны, ассоциированные с повреждением
Подписано в печать: 13.09.11
Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 801 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru
Оглавление диссертации Греченко, Вячеслав Владимирович :: 2011 :: Москва
Список сокращений.
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. То11-подобные рецепторы, общие сведения.
1.2. Сигнальные пути То11-подобных рецепторов.
1.3. Эндогенные лиганды То11-подобных рецепторов.
1.3.1. Белки теплового шока.
1.3.2. Фибриноген.
1.3.3. Экстра домен А фибронектина.
1.3.4. Гепаран-сульфат.
1.3.5. Гиалуронат.
1.3.6. Белок HMGB1.
1.4. Роль эндогенных лигандов То11-подобных рецепторов в развитии патологии.
1.5. Роль баланса про- и противовоспалительных цитокинов при патологии.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Объекты исследования.
2.2. Клиническая характеристика обследованных больных.
2.3. Реактивы.
2.4. Выделение сыворотки крови.
2.5. Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови человека.
2.6. Культивирование МНК периферической крови человека.
2.7. Оценка влияния лорноксикама на выработку цитокинов МНК периферической крови здоровых доноров in vitro.
2.8. Определение концентрации цитокинов в сыворотках и культуральных супернатантах методом иммуноферментного анализа.
2.9. Статистическая обработка результатов.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Разработка дизайна исследования.
3.2. Изучение выработки про- и противовоспалительных цитокинов МНК периферической крови больных ОДП в динамике.
3.2.1. Оценка спонтанной и индуцированной лигандами ТЬЯ продукции ФНОа МНК здоровых доноров и больных ОДП в динамике.
3.2.2. Оценка спонтанной и индуцированной лигандами ТЫ1 продукции ИЛ-6 МНК здоровых доноров и больных ОДП в динамике.
3.2.3. Оценка спонтанной и индуцированной лигандами ТЬЫ продукции ИЛ-8 МНК здоровых доноров и больных ОДП в динамике.
3.2.4. Оценка спонтанной и индуцированной лигандами ТЫ1 продукции ИЛ-10 МНК здоровых доноров и больных ОДП в динамике.
3.3. Изучение продукции про- и противовоспалительных цитокинов МНК периферической крови больных с различным течением ОДП.
3.3.1. Оценка продукции ИЛ-6 МНК периферической крови больных с разным течением ОДП.
3.3.2. Оценка продукции ИЛ-8 МНК периферической крови больных с разным течением ОДП.
3.3.3. Оценка продукции ИЛ-10 МНК периферической крови больных с разным течением ОДП.
3.4. Оценка баланса цитокинов, продуцируемых МНК периферической крови больных с разным течением ОДП в динамике.
3.4.1 Оценка баланса цитокинов, продуцируемых МНК периферической крови, здоровых доноров.
3.4.2 Оценка баланса цитокинов, продуцируемых МНК периферической крови, у больных I группы в динамике ОДП.
3.4.3 Оценка баланса цитокинов, продуцируемых МНК периферической крови, у больных II группы в динамике ОДП.
3.4.4 Сравнение баланса цитокинов, продуцируемых МНК периферической крови, у больных I и II групп в динамике ОДП.
3.5 Исследование возможности коррекции цитокинового профиля с помощью нестероидного противовоспалительного средства лорноксикам.
3.5.1 Влияние лорноксикама на опосредованную TLR 1/2 и TLR 4 выработку про- и противовоспалительных цитокинов in vitro.
3.5.2 Влияние лорноксикама на продукцию про- и противовоспалительных цитокинов МНК периферической крови пациентов с ОДП в динамике.
Введение диссертации по теме "Клиническая иммунология, аллергология", Греченко, Вячеслав Владимирович, автореферат
Актуальность темы исследования
На сегодняшний день изучение системы врожденного иммунитета и, в частности, группы То11-подобных рецепторов (TLR) является актуальным и одним из наиболее перспективных направлений современной иммунологии. Известно, что TLR осуществляют распознавание молекулярных паттернов, ассоциированных с различными патогенными микроорганизмами (Pathogen-Associated Molecular Patterns - РАМР), запуская, таким образом, эффекторные механизмы врожденного иммунитета [27]. Активация TLR обуславливает экспрессию множества генов хемокинов и провоспалительных цитокинов. Помимо цитокинов, усиливается экспрессия молекул адгезии, противомикробных пептидов^ белков острой фазы воспаления, NO-синтазы, циклооксигеназы. Все это приводит к развитию воспалительной реакции [5].
Кроме того, в настоящее время известно, что помимо бактериальных и вирусных компонентов, TLR могут распознавать и эндогенные молекулы, появляющиеся при повреждении тканей, т.е. молекулярные паттерны, ассоциированные с повреждением (Damage-Associated Molecular Patterns -DAMP). За счет этого происходит вовлечение системы врожденного иммунитета в асептическое воспаление, удаление некротических масс и, впоследствии, восстановление поврежденной ткани [27, 40]. Однако, изменение активности TLR, в частности, чрезмерная продукция провоспалительных цитокинов, приводящая к усилению воспалительного ответа, может становиться повреждающим фактором, вовлекаясь тем самым в патогенез основного заболевания [6]. Установлено участие TLR в патогенезе множества воспалительных и аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, сепсис, системная красная волчанка, атеросклероз и инфаркт миокарда [40, 77].
Острый деструктивный панкреатит (ОДП) - заболевание, в основе которого лежит повреждение ткани поджелудочной железы, сопровождающееся воспалительной реакцией, приобретающей в той или иной степени системный характер, которая зачастую может приводить к полиорганной недостаточности [83, 173]. Этим объясняется высокий уровень смертности, составляющий более 10% в начальный период заболевания. В таких случаях очень важна возможность раннего прогноза течения острого деструктивного панкреатита, которая может дать преимущества при лечении заболевания.
В настоящее время имеется достаточно работ, посвященных изучению уровня провоспалительных цитокинов при ОДП. Установлено, что ведущую роль в патогенезе играют такие провоспалительные цитокины как ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНОа, именно их гиперпродукция («цитокиновый шторм») на первой неделе заболевания может привести к развитию системной воспалительной реакции [83, 100]. При этом повышение уровня ИЛ-6 и ИЛ-8 тесно коррелирует с тяжестью заболевания. Известно, что продукция этих цитокинов ассоциирована с активацией ТЬЯ [51].
Однако до настоящего времени роль функциональной активности ТЬЯ при ОДП изучена недостаточно. Кроме того, не встречается работ по изучению роли соотношения уровней различных провоспалительных цитокинов, а также баланса про- и противовоспалительных цитокинов при ОДП. По нашему мнению не столько уровень, сколько баланс цитокинов может определять направление течения заболевания. Также представляется актуальным изучить возможность терапевтического воздействия, направленного на коррекцию функциональной активности ТЬЯ при ОДП.
Цель исследования:
Определить выработку и баланс про- и противовоспалительных цитокинов, продуцируемых мононуклеарными клетками (МНК) периферической крови больных ОДП, под действием лигандов ТЪЯ, в динамике заболевания, и оценить их прогностическую значимость.
Задачи исследования:
1) Оценить спонтанную и индуцированную лигандами ТЬЯ2 и ТЬЯ4 продукцию про- и противовоспалительных цитокинов МНК периферической крови больных ОДП, по сравнению со здоровыми донорами
2) Оценить возможные различия в цитокиновом профиле МНК периферической крови больных ОДП.
3) Разработать метод оценки баланса нескольких цитокинов, продуцируемых МНК периферической крови больных ОДП, в динамике заболевания.
4) Оценить возможность прогноза течения заболевания по уровню и балансу цитокинов, продуцируемых МНК периферической крови больных ОДП, на ранних сроках заболевания.
5) Исследовать возможность терапевтического воздействия, направленного на коррекцию функциональной активности ТЬЯ при ОДП.
Научная новизна работы.
Впервые получен профиль спонтанной и индуцированной лигандами ТЬЯ2 и ТЬЯ4 продукции провоспалительных (ФНОа, ИЛ-6, ИЛ-8) и противовоспалительных (ИЛ-10) цитокинов в культуре МНК периферической крови больных ОДП в динамике заболевания, установлена его связь с течением заболевания. На основе разработанного нами способа оценки баланса цитокинов, продуцируемых МНК периферической крови, сформулированы критерии для оценки прогноза течения ОДП.
В опытах in vitro установлено, что нестероидное противовоспалительное средство лорноксикам подавляет индуцированную лигандами TLR продукцию исследуемых цитокинов. Выявлена возможность коррекции спонтанной и индуцированной лигандами TLR продукции МНК периферической к ови больных ОДП провоспалительных цитокинов (преимущественно ФНОа и ИЛ-6) с помощью лорноксикама. Тяжесть течения и исход острого панкреатита зависят от смещения баланса цитокинов, индуцируемых через рецепторы врожденного иммунитета, фармакологическая коррекция позволяет изменять соотношения цитокинов, улучшая течение заболевания.
Практическая значимость.
Выявленные изменения в соотношении продукции цитокинов на ранних сроках заболевания у больных с различным клиническим течением острого деструктивного панкреатита могут служить прогностическим критерием течения заболевания. Показано, что подавление выработки провоспалительных цитокинов при использовании лорноксикама на ранней стадии улучшает течение заболевания.
Положения, выносимые на защиту:
1. Профиль цитокинов, продуцируемых мононуклеарными клетками периферической крови больных острым деструктивным панкреатитом, коррелирует с клиническим течением заболевания.
2. Баланс между ИЛ-6 и ИЛ-8 может служить прогностическим критерием течения и исхода острого деструктивного панкреатита на ранних сроках заболевания.
3. Коррекция профиля и баланса цитокинов позволяет изменять течение острого деструктивного панкреатита, направляя его в более благоприятную сторону.
Апробация результатов диссертационной работы
Диссертация апробирована на совместной научной конференции кафедры иммунологии, кафедры экспериментальной и клинической хирургии и отдела иммунологии ГБОУ ВПО "РНИМУ им Н.И. Пирогова" от 05 апреля 2011 года.
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на научных заседаниях кафедры иммунологии и отдела иммунологии ГБОУ ВПО "РНИМУ им. Н.И. Пирогова" МЗСР РФ, на Международной Пироговской Конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2011г.).
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 184 источников (11 отечественных и 173 зарубежных). Работа содержит 4 таблицы и 38 рисунков.
Заключение диссертационного исследования на тему "Анализ баланса оппозитных цитокинов, ассоциированных с рецепторами врожденного иммунитета, у больных с острыми патологическими состояниями"
выводы
1. Изучение в динамике (1-14 сутки) профиля цитокинов (ФНОа, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10), продуцируемых мононуклеарными клетками периферической крови спонтанно и под влиянием лигандов ТЪЯ, позволило выделить среди исследуемых больных две подгруппы, клинически характеризующиеся различными сроками выздоровления.
2. Более благоприятному течению заболевания, с выздоровлением в течение 12±3 койко-дней, соответствует повышение по сравнению со здоровыми донорами индуцированной лигандами ТЬЯ выработки ИЛ-6 на 1 сутки, которая снижается к 3-м суткам заболевания. Спонтанная и индуцированная выработка ИЛ-8 в этой группе больных повышена и снижается к 14 суткам. Индуцированная лигандами ТЬЯ продукция противовоспалительного цитокина ИЛ-10 повышается к 7 суткам течения заболевания.
3. Менее благоприятное течение заболевания, с выздоровлением в течение 30±10 койко-дней, сопровождается повышением, по сравнению со здоровыми донорами, спонтанной и индуцированной лигандами ТЫ1 выработки ИЛ-6, который возрастает с 3-х суток заболевания и остается высоким на 14 сутки наблюдения. Спонтанная и индуцированная лигандами ТЫ1 продукция ИЛ-8 МНК не отличается от уровня здоровых лиц в начальный период и повышается к 3-м суткам заболевания. Индуцированная лигандами ТЪЯ продукция противовоспалительного цитокина ИЛ-10 повышается к 14 суткам заболевания.
4. У больных с более благоприятным течением заболевания баланс провоспалительных цитокинов смещен в сторону ИЛ-8, в то время как у больных с менее благоприятным течением заболевания наблюдается смещение баланса в сторону ИЛ-6.
5. Изменение баланса спонтанной выработки ИЛ-6 и ИЛ-8 на 1-3 сутки заболевания может служить прогностическим критерием течения и исхода острого деструктивного панкреатита. Оценка ФНОа не информативна в данной системе.
6. Лорноксикам оказывает подавляющее действие на выработку цитокинов, ассоциированных с TLR. В культуре in vitro наблюдается ингибирование продукции как про-, так и противовоспалительных цитокинов МНК здоровых доноров, стимулированных лигандами TLR2 и TLR4. У больных ОДП, получавших лорноксикам, наблюдается снижение спонтанной и стимулированной лигандами TLR продукции провоспалительных цитокинов МНК периферической крови, преимущественно ФНОа и ИЛ-6.
Практические рекомендации
Предложенный метод оценки баланса цитокинов целесообразно использовать на 1-3 сутки заболевания, для определения прогноза течения ОДП, с целью определения тактики ведения пациентов и подбора соответствующего метода терапии.
Тяжелым больным ОДП для снижения риска развития системной воспалительной реакции в качестве дополнительной терапии рекомендуется применение нестероидных противовоспалительных средств, в частности лорноксикама.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Греченко, Вячеслав Владимирович
1. Винокурова Л.В., Живаева Н.С., Царегородцева Т.М., Серова Т.И., Цитокиновый статус при хроническом панкреатите алкогольной и билиарной этиологии, Терапевтический архив, 2006, №2, с. 57-60.
2. Винокурова Л.В., Трубицына И.Е., Царегородцева Т.М., Яшина Н.И. и др., Роль нейромедиаторов и цитокинов в патогенезе хронического панкреатита алкогольной этиологии, Терапевтический архив, 2008, №2, с. 78-81.
3. Иммунология (практикум). Под редакцией Л.В. Ковальчука, Г.А. Игнатьевой, Л.В. Ганковской. Москва: «Гэотар-Медиа». 2010.
4. Кетлинский С.А., Симбирцев A.C. Цитокины, СПб ФОЛИАНТ, 2008.
5. Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода A.C., Кондратенко И.В., Грачева Л.А. и др. Рецепторы врожденного иммунитета: подходы к количественной и функциональной оценке То11-подобных рецепторов. Иммунология, 2008, 4, 223-227.
6. Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода A.C., Константинова Е.В., Юдин A.A. и др. Роль рецепторов врожденного иммунитета вразвитии острого инфаркта миокарда. Журн. Микробиологии, 2008,4, 64-68.
7. Охлобыстин А.В., Ивашкин В.Т., Алгоритмы ведения больных острым и хроническим панкреатитом, Consilium-Medicum, 2000, Т.2, №7.
8. Савельев B.C., Филимонов М.И., Бурневич С.З. Вопросы классификации и хирургического лечения при панкреонекрозе. Анналы хирургии. 1999; 4: 34-8.
9. Савельев B.C., Филимонов М.И., Гельфанд Б.Р. и др. Острый панкреатит как проблема ургентной хирургии и интенсивной терапии Consilium-Medicum, 2000, Т.2, №9.
10. Ярилин А.А. Основы иммунологии. Москва: «ГОЭТАР-Медиа», 2010.
11. Abulafia-Lapid R., Elias D., Raz L. et al. T cell proliferative responses of type 1 diabetes patients and healthy individuals to human hsp60 and its peptides. J Autoimmun, 1999, v. 12, pp. 121-129.
12. Agresti A and Bianchi ME. HMGB proteins and gene expression. Curr Opin Genet Dev, 2003, v.13, pp.170-178.
13. Akira S., Takeda K. Toll-like receptor signalling. Nature Reviews Immunology, 2004, vol.4, 499-511.
14. Andersson A., Covacu R., Sunnemarketal D., Pivotal advance: HMGB1 expression in active lesions of human and experimental multiple sclerosis, Journal of Leukocyte Biology, vol. 84, no.5, pp.1248-1255, 2008.
15. Andersson U, Erlandsson-Harris H, Yang H and Tracey KJ. HMGB 1 as a DNA-binding cytokine. J Leukoc Biol, 2002, v.72, pp. 1084-1091.
16. Andersson U, Wang H, Palmblad K. High Mobility Group 1 Protein (HMG-1) Stimulates Proinflammatory Cytokine Synthesis in Human Monocytes. J Exp Med, 2000, v. 192, pp.565-570.
17. Asea A, Rehli M, Kabingu E et al. Novel signal transduction pathway utilized by extracellular hsp70: role of toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4. J Biol Chem, 2002, v.277, pp. 15028-15034.
18. Ashida K, Miyazaki K, Takayama E et al. Characterization of the expression of TLR2 (Toll-like receptor 2) and TLR4 on circulating monocytes in coronary artery disease. J Atheroscler Thromb, 2005, v.12, pp.53-60.
19. Aukrust P, Gullestad L, Ueland T et al. Inflammatory and antiinflammatory cytokines in chronic heart failure: potential therapeuticimplications. Annab of Medicine, 2005, v.37, pp.74-85.
20. Avdiushko M.G., Akira S., Kaplan A.M., Cohen D.A., Inhibition of interleukin-10 signaling in lung dendritic cells by toll-like receptor 4 ligands. Exp Lung Res. 2009;35(l):l-28.
21. Baillie J. Predicting and preventing post-ERCP pancreatitis. Curr Gastroenterol Rep. 2002, 4(2): 112-9.
22. Bang UC, Semb S, Nojgaard C, Bendtsen F. Pharmacological approach to acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 2008 May 21;14(19):2968-76.
23. Basu S, Binder RJ, Ramalingam T, Srivastava PK. CD91 is a common receptor for heat shock proteins gp96, hsp90, hsp70, and calreticulin. Immunity, 2001, v. 14, pp.303-313.
24. Berg S. Hyaluronan turnover in relation to infection and sepsis. J Intern Med, 1997, v.242, pp.73-77.
25. Beutler B., Hoebe H.,Ulevitch R.J. How we detect microbes and respond to them: the Toll-like receptors and their transducers. J.Leukoc.Biol. 2003, 74: 479-485.
26. Bianchi ME. DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about danger. J Leukoc Biol. 2007, 81,1-5.
27. Biffl W, Moore E, Moore F, Peterson V. Interleukin-6 in the injured patient. Ann Surg 1996; 224:647-664.
28. Browning D.D., Diehl W.C., Hsu M., et al., Autocrine regulation of interleukine-8 production in human monocytes // Am J Phisiol Lung Cell Mol Physiol, 2000, vol. 279, p. LI 129-L1136.
29. Campbell I. D., Spitzfaden C., Building proteins with fibronectin type III modules, Structure 2, 1994, 333-337.
30. Chen X, Ji B, Han B, et al. NF-kappaB activation in pancreas induces pancreatic and systemic inflammatory response. Gastroenterology 2002, 122:448-457.
31. Chi H., Barry S.P., Roth R.J. et al. Dynamic regulation of pro- and antiinflammatory cytokines by MAPK phosphatase 1 (MKP-1) in innate immune responses. Proc Natl Acad Sci USA. 2006 14; 103(7): 2274-9.
32. Cole JE, Georgiou E, Monaco C., The expression and functions of tolllike receptors in atherosclerosis. Mediators Inflamm. 2010; ID 393946.
33. Cremer J, Martin M, Redl H, Bahrami S, Abraham C, Graeter T, Haverich A, Schlag G, Borst H-G.
34. Czura CJ and Tracey KJ. Targeting high mobility group box 1 as a late-acting mediator of inflammation. Crit Care Med, 2003, v.31, pp.S46-S50.
35. Darvill AG and Albersheim P. Phytoalexins and their elicitors: a defense against microbial infection in plants. Annu Rev Plant Physiol, 1984, v.35, pp.243-275.
36. Demols A, LeMoine O, Desalle F, Quertinmont E, Van Laethem J-L, Deviere J. CD4+ T cells play an important role in acute experimental pancreatitis in mice. Gastroenterology 2000; 118:582-590.
37. Deviere J, Le Moine O, Van Laethem JL, Eisendrath P, Ghilain A, Severs N, Cohard M. Interleukin 10 reduces the incidence of pancreatitis after therapeutic endoscopic retrograde cholangiopancreatography. Gastroenterology. 2001 Feb;120(2):498-505.
38. Dintilhac A and Bernues J. HMGB1 interacts with many apparently unrelated proteins by recognizing short amino acid sequences. J Biol Chem, 2002, v.277, pp.7021-7028.
39. Drexler S.K., Foxwell B.M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation. Int J Biochem Cell Biol. 2010, 42(4):506-18.
40. D'Souza El-Guindy NB, de Villiers WJ, Doherty DE. Acute alcohol intake impairs lung inflammation by changing pro- and antiinflammatory mediator balance. Alcohol. 2007 Aug;41(5):335-45.
41. Dumot JA, Conwell DL, Zuccaro G Jr, Vargo JJ, Shay SS, Easley KA, Ponsky JL. A randomized, double blind study of interleukin 10 for the prevention of ERCP-induced pancreatitis. Am J Gastroenterol. 2001 Jul;96(7):2098-102.
42. Dvorak H.F., Senger D.R. Dvorak A.M., Regulation of extravascular coagulation by micro vascular permeability, Science, vol.227, no.4690, pp.1059-1061,1985.
43. Erridge C., Endogenous ligands of TLR2 and TLR4: agonists or assistants? Journal of Leukocyte Biology, 2010, vol. 87 no. 6 989-999.
44. Feingold K. R., Funk J. L., Moser A. H., Shigenaga J. K., Rapp J. H., Grunfel, C. Role for circulating lipoproteins in protection from endotoxin toxicity, Infect. Immun. 63, 2041-2046, 1995.
45. Foell D., Wittkowski H., Vogl T., Roth J., S 100 proteins expressed in phagocytes: a novel group of damage-associated molecular pattern molecules, Journal of Leukocyte Biology, vol.81, no.l, pp.28-37, 2007.
46. Frantz S, Kelly RA and Bourcier T. Role of TLR2 in the activation of nuclear factor Kb by oxidative stress in cardiac myocytes. J Biol Chem, 2000, v.276, pp.5197-5203.
47. George J, Wang SS, Sevcsik AM et al. Transforming Growth Factor-ß Initiates Wound Repair in Rat Liver through Induction of the EIIIA-Fibronectin Splice Isoform. Am J Pathol, 2000, v.156, pp.115-124.
48. Giakoustidis A., Mudan S.S., Giakoustidis D. Dissecting the stress activating signaling pathways in acute pancreatitis. Hepatogastroenterology. 2010, 57(99-100): 653-6.
49. Gondokaryono S.P., Ushio H., Niyonsabaetal F., The extra domain A of fibronectin stimulates murine mast cells via Toll-like receptor 4, Journal of Leukocyte Biology, vol. 82, no. 3, pp. 657-665, 2007.
50. Granger J, Remick D. Acute pancreatitis: models, markers, and mediators.Shock. 2005 Dec;24 Suppl 1:45-51.
51. Habich C., Kempe K., van der Zee R., Rümenapf R., Akiyama H., Kolb H., Burkart V., Heat shock protein 60: specific binding of lipopolysaccharide, J. Immunol. 174, 1298-1305, 2005.
52. Hansson GK, Libby P, Schonbeck U et al. Innate and adaptive immunity in the pathogenesis of atheroscierosis. Circ Res, 2002, v.91, pp.281-291.
53. Hartl FU, Hayer-Hartl M. Molecular chaperones in the cytosol: fromnascent chain to folded protein. Science, 2002, v.295, pp. 18521858.
54. Heimberg H, Heremans Y, Jobin C, et al. Inhibition of cytokine-induced NF-kappaB activation by adenovirus-mediated expression of a NF-kappaB super-repressor prevents beta-cell apoptosis. Diabetes 2001;50:2219-2224.
55. Hernández Cruz A, Garcia-Jimenez S, Zucatelli Mendonga R, Petricevich VL. Pro- and anti-inflammatory cytokines release in mice injected with Crotalus durissus terrificus venom. Mediators of Inflammation. 2008; 87: 49-62.
56. Hidehiro Sawa., Takashi Ueda., Yoshifumi Takeyama, Takeo Yasuda, Makoto Shinzeri et al. Role of Toll-like receptor 4 in the pathophysiology of severe acute pancreatitis in mice. Surg.Today,2007,3 7,867-873.
57. Hirata N., Yanagawa Y., Ebihara T., Seya T. et al., Selective synergy in anti-inflammatory cytokine production upon cooperated signaling via TLR4 and TLR2 in murine conventional dendritic cells. Mol Immunol. 2008, 45(10):2734-42.
58. Hollestelle SC, De Vries MR, Van Keulen JK et al. Toll- like receptor 4 is involved in outward arterial remodeling. Circulation, 2004, v. 109, pp.393-398.
59. Hoshino K., Kaisho T., Inabe T. Et al. Differential involvement of IFN-(3 in Toll-like receptor-stimulated dendritic cell activation. Int.Immunol. 2000, 14:1225-1231.
60. Ihrcke NS, Parker W, Reissner KJ and Piatt JL. Regulation of platelet heparanase during inflammation: role of pH and proteinases. J Cell Physiol, 1998, v.175, pp.255-267.
61. Imler J-L., Zheng L. Biology of Toll receptors and their transducers. J.of Leucocyte Biology.2004,75:18-26.
62. Inagaki T., Hoshino M., Hayakawa T. et al. Interleukin-6 is a useful marker for early prediction of the severity of acute pancreatitis, Pancreas. 1997, 14(1): 1-8.
63. Ishii T, Udono H, Ohta H, et al. Isolation of MHC class 1-restricted antigen peptide and its precursors associated with heat shock proteins hsp70, hsp90, and gp96. J Immunol, 1991, v.162, pp.1303-1309.
64. Jaattela M. Heat shock proteins as cellular lifeguards. Ann Med, 1999, v.31, pp.261-271.
65. Jarnagin WR, Rockey DC, Koteliansky VE et al. Expression of variant fibronectins in wound healing: cellular source and biological activity of the EIIIA segment in rat hepatic fibrogenesis. J Cell Biol, 1994, v. 127, pp.2037-2048.
66. Jerin A, Pozar-Lukanovic N, Sojar V, Stanisavljevic D, Paver-Erzen V, Osredkar J. Balance of pro- and anti-inflammatory cytokines in liver surgery. Clin Chem Lab Med. 2003 Jul;41(7):899-903.
67. Johnson G.B., Brunn G.J., Piatt J.L., Cutting edge: an endogenous pathway to systemic inflammatory response syndrome (SIRS)-like reactions through Toll-Like receptor 4, Journal of Immunology, vol. 172, no. l,pp. 20-24, 2004.
68. Johnson GB, Brunn GJ, Kodaira Y, Piatt JL. Receptor-mediated monitoring of tissue well-being via detection of soluble heparan sulfate by Toll-like receptor 4. J Immunol, 2002, v. 168, pp.5233-9.
69. Jun-Li Ding,Yuan Li, Xiang-Yu Zhou, Ling Wang, Bin Zhou et al. Potential role of the TLR signaling pathway in the pathophysiology of acute pancreatitis in mice. Inflamm.Res.,2009, 34(4):430-41.
70. Kainulainen V, Wang H, Schick C and Bernfield M. Syndecans, heparin sulfate proteoglycans, maintain the proteolytic balance of acute wound fluids. J Biol Chem, v. 273, pp.11563-11569.
71. Kaisho T.,Takeuchi O., Kawai T et al. Endotoxin-induced maturation of Myd88-deficient dendritic cells.J.Immunol.2001, 166:5688-5694.
72. Key NS, Piatt JL and Vercellotti GM. Vascular endothelial cell proteoglycans are susceptible to cleavage by neutrophils. Arterioscler Thromb, 1992, v. 12, pp.836-842.
73. Kirschning C.J., Schumann R.R. TLR2: cellular sensor for microbial and endogenous molecular patterns. Curr Top Microbiol Immunol. 2002; 270:121-44.
74. Kita M., Ohmoto Y., Hirai Y. et al. Induction of cytokines in human peripheral blood mononuclear cells by mycoplasmas h Microbiol. Immunol. 1992.Vol.36.P.507-516.
75. Kol A, Sukhova GK, Lichtman AH, Libby P. Chlamydial heat shock protein 60 localizes in human atheroma and regulates macrophage tumor necrosis factor-a and matrix metalloproteinase expression. Circulation, 1998, v.98, pp.300-307.
76. Kusske AM, Rongione AJ, Ashley SW, McFadden DW, Reber HA., Interleukin-10 prevents death in lethal necrotizing pancreatitis in mice. Surgery. 1996; 120(2): 284-8.
77. Lehrer R. I., Barton A., Daher K. A., Harwig S. S. L., Ganz T., Selsted M. E., Interaction of human defensins with Escherichia coli J. Clin. Invest. 84,553-561, 1989.
78. Li Z, Menoret A, Srivastava P. Roles of heat shock proteins in antigen presentation and cross-presentation. Curr Opin Immunol, 2002, v. 14, p.45-51.
79. Liu Z, Shen Y, Cui N, Yang J. Clinical observation of immunity for severe acute pancreatitis. Inflammation. 2011, 34(5):426-31.
80. Lohmander LS, Dahlberg L, Ryd L and Heinegard D. Increased levels of proteoglycan fragment in knee joint fluid after injury. Arthritis Rheum, 1989, v.32, pp.1434-1442.
81. Mäher J.J., DAMPs ramp up drug toxicity, Journal of Clinical Investigation, vol. 119, no. 2, pp. 246-249, 2009.
82. Marshak-Rothstein A. Rifkin I. Immunologically Active Autoantigens: The Role of Toll-Like Receptors in the Development of Chronic Inflammatory Disease. Annu. Rev. Immunol. 2007. 25: 419-41.
83. McCachrenand S.S., Lightner V.A., Expression of human tenascin in synovitis and it's regulation by interleukin-1, Arthritis and Rheumatism, vol.35, no.10, pp.1185-1196, 1992.
84. McKay C., Imrie C.W., Baxter J.N., Mononuclear phagocyte activation and acute pancreatitis. Scand J Gastroenterol Suppl. 1996; 219:32-6.
85. Medzhitov R., Janeway C. Innate immunity. The New England Journal of Medicine, 2000, august, 338-344.
86. Medzhitov R., Preston-Hurlburt P.,Janeway C.A. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature 1997, 388: 394-397.
87. Michelsen KS, Wong MH, Shah PK et al. Lack of Toll-like receptor 4 or myeloid differentiation factor 88 reduces atherosclerosis and alters plaque phenotype in mice deficient in apolipoprotein E. Proc Natl Acad Sei USA, 2004, v. 101, pp. 10679-10684.
88. Midwood K., Sacre S., Piccininietal A.M., Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease, Nature Medicine, vol. 15, no.7, pp.774-780, 2009.
89. Mitchell RM, Byrne MF, Baillie J. Pancreatitis. Lancet 2003; 361:1447-1455.
90. Motzkus D., Schulz-Maronde S., Heitland A., Schulz A., Forssmann W. G., Jübner M., Maronde E. The novel ß-defensin DEFB123 prevents lipopolysaccharide-mediated effects in vitro and in vivo. FASEB J. 20,1701-1702, 2006.
91. Navab M., Hough G. P., Van Lenten B. J., Berliner J. A., Fogelman A. M. Low density lipoproteins transfer bacterial lipopolysaccharides across endothelial monolayers in a biologically active form, J. Clin. Invest. 81, 601-605, 1988.
92. Nham SU. Characteristics of fibrinogen binding to the domain of CD 11c, an a subunit of pi50,95. Biochem Biophys Res Commun, 1999, v. 264, pp.630-634.
93. Noble PW, McKee CM, Cowman M and Shin HS. Hyaluronan fragments activate an NF-icB/lK-Baautoregulatory loop in murine macrophages. J Exp Me, 1996, v.183, pp.2373-2378.
94. Norman J. The role of cytokines in the pathogenesis of acute pancreatitis. Am J Surg 1998;175:76-83.
95. Novovic S., Andersen A.M., Ersboll A.K., Nielsen O.H. et al. Proinflammatory cytokines in alcohol or gallstone induced acute pancreatitis. A prospective study. Journal of Pancreas 2009; 10 (3), 256-261.
96. Ohashi K, Burkart V, Flohe S, Kolb H. Cutting edge: heat shock protein 60 is a putative endogenous ligand of the toll-like receptor-4 complex. Journal of Immunology 2000 Jan 15; 164(2):558-61.
97. Okamura Y, Watari M, Jerud ES et al. The extra domain A of fibronectin activates Toll-like receptor 4. J Biol Chem, 2001, v.276, pp. 10229-33.
98. Opal S, DePalo V. Anti-inflammatory cytokines. Chest 2000; 117:1162-1172.
99. Oragui EE, Nadel S, Kyd P and Levin M. Increased excretion of urinary glycosaminoglycans in meningococcal septicemia and their relationship to proteinuria. Crit Care Med, 2000, v.28, pp.3002-3008.
100. Osman M, Jensen S. Acute pancreatitis: The pathophysiological role of cytokines and integrins. Dig. Surg 1999;16:347-362.
101. Pande H., Thuluvath P. Pharmacological prevention of post-endoscopic retrograde cholangiopancreatography pancreatitis. Drugs. 2003; 63(17):1799-812.
102. Panjwani NN, Popova L, Srivastava PK. Heat shock protein gp96 and hsp70 activate the release of nitric oxide by APCs. J Immunol, 2002, v.168, pp.2997-3003.
103. Park JS, Svetkauskaite D, He Q et al. Involvement of Toll-like receptors 2 and 4 in cellular activation by high mobility group box 1 protein. J Biol Chem, 2004, v.279, pp.7370-7.
104. Perera PY, Mayadas TN, Takeuchi O et al. CD lib/CD 18 acts in concert with CD 14 and Toll-like receptor (TLR) 4 to elicit full lipopolysaccharide and taxol-induciblegene expression. J Immunol, 2001, v.166, pp.574-581.
105. Piccininiand A.M. Midwood K.S. DAMPening Inflammation by Modulating TLR Signalling. Mediators of Inflammation Vol. 2010, Article ID 672395.
106. Piatt JL, Dalmasso AP, Lindman BJ et al. 1991. The role of C5a and Ab in the release of heparan sulfate from endothelial cells. Eur J Immunol, 1991, v.21, pp.2887-2890.
107. Pockley AG. Heat shock protein as regulators of the immune response. Lancet, 2003, v.362, pp.469-476.
108. Res PC, Schear CG, Breedveld FC et al. Synovial fluid T cell reactivity against 65 kD heat shock protein of mycobacteria in early chronic arthritis. Lancet, 1988, v.2, pp.478-480.
109. Rongione AJ, Kusske AM, Reber HA, Ashley SW, McFadden DW. Interleukin-10 reduces circulating levels of serum cytokines in experimental pancreatitis. J Gastrointest Surg. 1997 Mar-Apr;l(2):159-65; discussion 165-6.
110. Saito S, Yamaji N, Yasunaga K et al. The Fibronectin Extra Domain A Activates Matrix Metalloproteinase Gene Expression by an Interleukin-1-dependent Mechanism J Biol Chem, 1999, v.274, pp.30756-30763.
111. Salter D.M., Tenascin is increased in cartilage and synovium from arthritic knees, British Journal of Rheumatology, vol.32, №.9, pp.780786, 1993.
112. Satoh M, Shimoda Y, Maesawa C et al. Activated toll-like receptor 4 in monocytes is associated with heart failure after acute myocardial infarction. International Journal of Cardiology, 2005, v. 31, №.8,1 pp. 180-186
113. Sawa H., Ueda T., Takeyama Y., Yasuda T., Shinzeki M., Nakajima T., t Kuroda Y., Blockade of high mobility group box-1 protein attenuatesexperimental severe acute pancreatitis, World J Gastroenterol 2006 December 21; 12(47): 7666-7670
114. Schenk S., Muser J., Vollmer G., Chiquet-Ehrismann R., Tenascin-C in serum: a questionable tumor marker, International Journal of Cancer,vol.61, no.4, pp.443-449, 1995.
115. Scott D.L., Delamere J.P., Walton K.W., The distribution of fibronectin in the pannus in rheumatoid arthritis, British Journal of Experimental Pathology, vol.62, no.4, pp.362-368, 1981.
116. Shen Y, Cui N, Miao B, Zhao E., Immune dysregulation in patients with severe acute pancreatitis. Inflammation. 2011; 34 (l):36-42.
117. Shishido T, Nozaki N, Yamaguchi S et al. Toll-like receptor-2 modulates ventricular remodeling after myocardial infarction. Circulation, 2003, v. 108, pp.2905-2910.
118. Shmarina G.V., Pukhalsky A.L., Kokarovtseva S.N. et al.,Tumor necrosis factor-alpha/interleukin-10 balance in normal and cystic fibrosis children. Mediators Inflamm. 2001, 10(4): 191-7.
119. Sitrin RG, Pan PM, Srikanth S et al. Fibrinogen activates NF-kB transcription factors in mononuclear phagocytes. J Immunol, 1998, v.161, pp.1462-1470.
120. Slogoff M.I., Ethridge R.T., Rajaraman S., Evers B.M. COX-2 inhibition results in alterations in nuclear factor (NF)-kappaB activation but not cytokine production in acute pancreatitis. J Gastrointest Surg. 2004; 8 (4), 511-519.
121. Smiley ST, King JA, Hancock WW. Fibrinogen stimulates macrophage chemokine secretion through Toll-like receptor 4. J Immunol, 2001, v.67, pp.2887-94.
122. Somersan S, Larsson M, Honteneau JFet al. Primary tumor tissue lysates are enriched in heat shock proteins and induce the maturation of human dendritic cells. J Immunol, 2001, v. 167, pp.4844-4852.
123. Srivastava PK, DeLeo AB, Old LJ. Tumor rejection antigens of chemically induced tumors of inbred mice. Proc Natl Acad Sci USA, 1986, v.83, pp.3407-3411.
124. Srivastava PK, Menoret A, Basu S et al. Heat shock proteins come of age: primitive functions acquire new roles in an adaptive world. Immunity, 1998, v.8, pp.657-665.
125. Srivastava PK. Role of heat shock proteins in innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol, 2002, v.2, pp. 185-194.
126. Stoelben E., Nagel M., Ockert D., Quintel M., Scheibenbogen C., Klein B., Saeger H.D. Clinical significance of cytokines 11-6, 11-8 and C-reactive protein in serum of patients with acute pancreatitis, Ghirurg. 1996, 67(12): 1231-6.
127. Systemic inflammatory response syndrome after cardiac operations. AnnThorac Surg, 1996, 61:1714-1720.
128. Szewezuk MR, Depew WT. Evidence for T lymphocyte reactivity to the 65 kilodalton heat-shock protein of mycobacteria in active Crohn's disease. Clin Invest Med, 1992, v.15, pp.494-505.
129. Tailor P., Tamura T., Kaisho T., Akira S., Ozato K., Induction of an anti-inflammatory cytokine, IL-10, in dendritic cells after toll-like receptor signaling. J Interferon Cytokine Res. 2006, 26(12):893-900.
130. Takeda K., Akira S. Toll-like receptors in innate immunity. International Immunology, 2005; vol.17, №1, 1-14.
131. Takeda K.,Kaisho T., Akira S. Toll-like receptors. Annu.Rev.Immunol. 2003,21:335-376.
132. Taniguchi N., Kawahara K.I., Yoneetal K., High mobility group box chromosomal protein 1 plays a role in the pathogenesis of rheumatoid arthritis as a novel cytokine, Arthritis and Rheumatism,vol.48, no:4, pp.971-981,2003.
133. Taro Kawai, Shizuo Akira. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors Nature immunology, 2010, vol. 11 № 5,373-384.
134. Termeer C, Benedix F, Sleeman J et al. Oligosaccharides of hyaluronan activate dendritic cells via Toll-like receptor 4. J Exp Med, 2002, v. 195, pp.99—111.
135. Termeer C, Hennies J, Voith U et al. 2000. Oligosaccharides of Hyaluronan are potent activators of dendritic cells. J Immunol, 2000, v.165, pp.1863-1870.
136. Tian J., Avalos A.M., Maoetal S.Y., Toll-likereceptor 9 dependent activation by DNA-containing immune complexes is mediated by HMGB1 and RAGE, Nature Immunology, vol.8, no.5, pp. 487-496, 2007.
137. Tissieres A, Mitchell HK, Tracy U. Protein synthesis in salvary glands of Drosophila melanpgaster: relation to chromosome puffs. J Mol Biol, 1974, v.84, pp.389-398.
138. Torre-Amione G, Kapadia S, Benedict C et al. Proinflammatory cytokine levels in patients with depressed left ventricular ejection fraction: a report from the Stadies of Left Ventricular Dysfunction (SOLVD). J Am Coll Cardiol, 1996, v.27, pp.1201-1206.
139. Tsan MF, Gao B. Cytokine function of heat shock proteins. Am J Physiol, 2004, v.286, pp.C739-C744.
140. Tsan MF, Gao B. Heat shock proteins and immune system. J Leukoc Biol. 2009 Jun;85(6):905-10.
141. Tsan Min-Fu, Gao Baochong. Endogenous ligands of Toll-like receptors. Journal of leukocyte Biology. 2004, 76:1-6.
142. Tsung A, Sahai R, Tanaka H, Nakao A, Fink MP, Lotze MT, Yang H, Li J, Tracey KJ, Geller DA, Billiar TR. The nuclear factor HMGB1 mediates hepatic injury after murine liver ischemia-reperfusion. J Exp Med 2005; 201: 1135-1143.
143. Udono H, Srivastava PK. Comparison of tumor-specific immunogenicities of stress-induced proteins gp96, hsp90 and hsp70. J Immunol, 1994, v.152, pp.5398-5403.
144. Ugarova TP, Solovjov DA, Zhang L et al. 1998. Identification of a novel recognition sequence for integrin (xm|32 within the y-chain of fibrinogen. J Biol Chem, 1998, v.273, pp.22519-27.
145. Urbonaviciute V., Furnrohr B.G., Meisteretal S., Induction of inflammatory and immune responses by HMGBl-nucleosome complexes: implications for the pathogenesis of SLE, Journal of Experimental Medicine, vol.205, no.13, pp. 3007-3018, 2008.
146. Urbonaviciute V., Furnrohr B.G., Weberetal C., Factors masking HMGB1 in human serum and plasma, Journal of Leukocyte Biology, vol.81, no. 1, pp. 67-74, 2007.
147. Vabulas RM, Ahmad-Nejad P, da Costa C et al. Endocytosed HSP60s use Toll-like receptor 2 (TLR2) and TLR4 to activate the Toll/interleukin-1 receptor signaling pathway in innate immune cells. J Biol Chem, 2001, v.276, pp.31332-31339.
148. Vabulas RM, Braedel S, Hilf N et al. The endoplasmic reticulum-resident heat shock protein Gp96 activates dendritic cells via the Tolllike receptor 2/4 pathway. J Biol Chem, 2002, v.:277, pp.20847-20853.
149. Walley KR, Lukacs NW, Standiford TJ, Strieter RM, Kunkel SL. Balance of inflammatory cytokines related to severity and mortality of murine sepsis. Infect Immun. 1996 Nov;64(l l):4733-8.
150. Wallin RP, Lundqvist A, More SH et al. Heat-shock proteins as activators of the innate immune system. Trends Immunol, 2002, v.23, pp.130-135.
151. Walzog B, Weinmann P, Jeblonski F et al. A role for ß2 integrins (CD11 /CD 18) in the regulation of cytokine gene expression of polymorphonuclear neutrophils during the inflammatory response. FASEB J, 1999, v. 13, pp.1855-1865.
152. Wang H, Yang H, Czura CJ et al. HMGB1 as a Late Mediator of Lethal Systemic Inflammation. Am J Respir Crit Care Med, 2001, v. 164, pp.1768-1773.
153. Wang H., Bloom O., Zhangetal M., HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice, Science,vol.285, no.5425, pp. 248-251, 1999.
154. Weber C.K., Adler G. From acinar cell damage to systemic inflammatory response: current concepts in pancreatitis. Pancreatology 2001; 1,356-362.
155. Wright, S. D., Ramos, R. A., Tobias, P. S., Ulevitch, R. J., Mathison, J. C. CD 14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS-binding protein Science 249,1431-1433, 1990.
156. Xu Q, Schett G, Perschinka H, Mayr M, Egger G, Oberhollenzer F, Willeit J, Kiechl S, Wick G., Serum soluble heat shock protein 60 is elevated in subjects with atherosclerosis in a general population. Circulation. 2000, 4;102(l):14-20.
157. Xu Q. Role of heat shock proteins in atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2002, v.22, pp.1547-1559.
158. Yanagawa Y., Onoe K., Enhanced IL-10 Production by TLR4- and TLR2-Primed Dendritic Cells upon TLR Restimulation. Journal of immunology 2007, 15;178(10):6173-80.
159. Yasuda T., Ueda T., Takeyama Y., Shinzeki M. et al. Significant increase of serum high-mobility group box chromosomal protein 1 levels in patients with severe acute pancreatitis. Pancreas 2006; 33: 359-363.
160. Yin J., Huang Z., Xia Y. et al. Lornoxicam suppresses recurrent herpetic stromal keratitis through down-regulation of nuclear factor-kB: an experimental study in mice. Molecular Vision, 2009,15,1252-1259.
161. Yu D., Rumore P.M., Liu Q., Steinman C.R., Soluble oligonucleosomal complexes in synovial fluid from inflamed joints, Arthritis and Rheumatism,vol.40, no.4, pp.648-654, 1997.
162. Zhang Z., Schluesener H. J. Mammalian toll-like receptors: from endogenous ligands to tissue regeneration, Cell. Mol. Life Sei,. №. 63, pp. 2901-2907, 2006.2008.