Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Значение субпопуляций моноцитов крови и уровня экспрессии на их поверхности активирующих рецепторов врожденного иммунитета в патогенезе неинфекционного системного воспалительного ответа

На правах рукописи

Матвеева Вера Геннадьевна

ЗНАЧЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ МОНОЦИТОВ КРОВИ И УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ НА ИХ ПОВЕРХНОСТИ АКТИВИРУЮЩИХ РЕЦЕПТОРОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА В ПАТОГЕНЕЗЕ НЕИНФЕКЦИОННОГО СИСТЕМНОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА

14.03.03 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

£ 1 НОЯ 2013

005539191

Кемерово - 2013

005539191

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечнососудистых заболеваний» Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Григорьев Евгений Валерьевич

Официальные оппоненты:

Долгих Владимир Терентьевич - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздрава России, кафедра патологической физиологии с курсом клинической патофизиологии, заведующий кафедрой

Лисаченко Геннадий Васильевич- доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия» Минздрава России, кафедра патологической физиологии, заведующий кафедрой

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени академика Е. Н. Мешалкина» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «_»_2013 года в_часов

на заседании диссертационного совета Д 208.035.02 при ГБОУ ВПО КемГМА Минздрава России по адресу: 650029, Кемерово, ул. Ворошилова, 22а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КемГМА Минздрава России

Автореферат разослан « »_• 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Разумов Александр Сергеевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Оперативные вмешательства на сердце с использованием искусственного кровообращения (ИК) и кардиоплегии нередко приводят к запуску патологических процессов, являющихся основой для формирования неинфекционного системного воспалительного ответа (СВО). Наиболее тяжелым проявлением и осложнением СВО является прогрессирующая полиорганная недостаточность (ПОН) с летальностью более 50 % (Бабаев М. А., 2013). Предупреждение и своевременно начатое интенсивное лечение осложнений СВО во многом определяют успех оперативного вмешательства на сердце (Иванов С. В., 2010). Поэтому представляют особую актуальность исследования, связанные с изучением патогенетических особенностей СВО неинфекционной этиологии.

Ведущую роль в формировании СВО играет иммунная система, поскольку развитие вторичного системного повреждения и формирование порочного круга ассоциировано с появлением в кровотоке флогогенных факторов, основными источниками которых являются клетки врожденного иммунитета (Гусев Е. Ю., 2007; Snell А., 2009). В условиях острого повреждения функцию регулятора воспалительного ответа с наиболее активным синтезом провоспалительных цитокинов, протеиназ и АФК выполняют моноциты и макрофаги, при этом они вносят основной вклад в формирование гиперцитокинемии (Черешнев В. А., 2012). Имеются указания на неоднородность популяции моноцитов по морфологическим, фенотипическим и функциональным характеристикам, что обуславливает различную роль субпопуляций в патологических процессах, связанных с воспалением.

Предполагается, что реализация как инфекционной, так и неинфекционной воспалительной реакции происходит с участием активирующих рецепторов врожденного иммунитета, среди которых наиболее значимы TLRs и TREM-1. Функциональные характеристики клетки тесно связаны с экспрессией тех или иных рецепторов на цитоплазматической мембране, поэтому плотность TLRs и TREM-1 на поверхности субпопуляций моноцитов может отражать их провоспалительный потенциал и определять роль в патогенезе СВО.

Степень научной разработанности темы исследования

Исследованию функциональных особенностей субпопуляций моноцитов и их значению в патогенезе заболеваний, связанных с острым и хроническим воспалением, посвящено большое количество работ, в том числе L. Ziegler-Heitbrock, 2007; F. Swirski, 2009; E. Shantsila, 2009; M. Nahrendorf, 2010; O.Y.Kim, 2010; A. Merino, 2011 и др. Однако остаются спорными и неоднозначными способы выделения субпопуляций, что усложняет интерпретацию результатов, полученных разными авторами. Не определено значение моноцитов CD14hlCD16+ в формировании воспалительной реакции, поскольку в литературе рассматривается субпопуляция CD14+CD16+, представляющая собой совокупность клеток CD14hiCD16+ и CD14dímCD16+. Имеются указания на причастность моноцитов CD14+CD16+ к развитию системного воспаления при септических состояниях, но не изучена роль субпопуляций в патогенезе СВО неинфекционного генеза.

Цель исследования: оценить патогенетическую значимость изменений субпопуляционного состава моноцитов и уровня поверхностной экспрессии активирующих рецепторов врожденного иммунитета TLR 2, TLR 4 и TREM-1 в формировании системного воспалительного ответа неинфекционного генеза.

Задачи исследования:

1. Исследовать сывороточную динамику растворимой формы CD14 (sCD14), а также IL-ip, IL-6, TNFa, IL-10, IL-1RA как показателей активации моноцитарно-макрофагальной системы у пациентов с системным воспалительным ответом после операции коронарного шунтирования.

2. В эксперименте in vitro изучить изменение субпопуляционного состава моноцитов при стимуляции липополисахаридом.

3. Изучить особенности динамики субпопуляционного состава моноцитов крови у пациентов с различными вариантами течения системного воспалительного ответа после операции коронарного шунтирования.

4. В эксперименте in vitro исследовать взаимосвязь уровня поверхностной экспрессии рецепторов TLR2, TLR4 и TREM-1 на субпопуляциях моноцитов с активностью синтеза провоспалительных цитокинов.

5. Изучить in vitro особенности изменения функционального состояния моноцитов при воздействии стимуляторов, ассоциированных с инфекционными

s

(липополисахарид), неинфекционными факторами (продукты механического повреждения миокарда), и их комбинации.

6. Изучить динамику уровня поверхностной экспрессии TLR2, TLR4 и TREM-1 на субпопуляциях моноцитов периферической крови у пациентов с различными вариантами течения системного воспалительного ответа после операции коронарного шунтирования.

Научная новизна

Подтвержден факт стимуляции моноцитов у пациентов с системным воспалительным ответом после операции коронарного шунтирования на основании повышения в крови содержания прямых и косвенных маркеров активации моноцитарно-макрофагальной системы.

Установлены общие закономерности динамики субпопуляционного состава при активации моноцитов in vitro и представлен возможный механизм этих изменений.

Впервые описана динамика субпопуляционного состава моноцитов в условиях формирования неинфекционного системного воспалительного ответа и установлены особенности перераспределения субпопуляций в зависимости от тяжести полиорганной недостаточности.

Установлена неоднозначная зависимость цитокинпродуцирующей активности субпопуляций моноцитов от уровня базальной и стимулированной поверхностной экспрессии TLR2, TLR4, TREM-1.

В эксперименте in vitro изучены особенности изолированного и комбинированного влияния продуктов механического повреждения миокарда и эндотоксина на синтез цитокинов моноцитами и поверхностную экспрессию TLR2, TLR4, TREM-1.

Установлено, что у пациентов после операции коронарного шунтирования уровень поверхностной экспрессии TREM-1 на субпопуляции CD14hiCD16+ изменяется в соответствии с тяжестью осложнений системного воспалительного ответа.

Теоретическая значимость работы

Исследование раскрывает особенности работы моноцитарного звена врожденного иммунитета в условиях СВО неинфекционного генеза. Установлено, что субпопуляции CD14hlCD16~ и CD14h'CD16+ активно участвуют в реализации СВО, развивающегося после операций на сердце с использованием искусственного кровообращения.

Практическая значимость работы

Динамическое исследование содержания субпопуляций моноцитов, а также их рецепторного аппарата и функциональной активности позволяет оценивать состояние иммунной системы, что при использовании в клинике даст возможность повысить качество диагностики СВО и прогнозирования его осложнений.

Методология и методы исследования

Выделено два блока исследований: клинический и экспериментальный. Количественное определение аналитов в сыворотке крови пациентов проводилось методом ИФА. Субпопуляционный состав моноцитов, их функциональные и фенотипические характеристики изучались методом проточной лазерной цитофлюориметрии.

Положения, выносимые на защиту

1. Моноциты являются активными участниками в запуске и поддержании системного воспалительного ответа. С учетом фенотипических и функциональных характеристик оптимально выделение трех субпопуляций циркулирующих в крови моноцитов (С014Ь'С016~, СШ4Ь'СВ16+ и С014ЛгаС016+). Субпопуляция С014ь'С01б+ характеризуется выраженной провоспалительной активностью, поскольку экспрессирует на своей поверхности наибольшее количество активирующих рецепторов врожденного иммунитета ТЪЯ2, ТЫ14, Т11ЕМ-1, и отличается активным синтезом провоспалительных цитокинов (ТМ-а при стимуляции липополисахаридом).

2. Активация моноцитов сопровождается изменением субпопуляционного состава за счет снижения содержания моноцитов и пропорционального увеличения СШ4Ь,СВ16+, что может являться результатом дифференцировки одной субпопуляции в другую. Развитие неинфекционного системного воспалительного ответа после операции коронарного шунтирования характеризуется активацией моноцитов с соответствующим перераспределением субпопуляций, коррелирующим с тяжестью полиорганной недостаточности.

3. Сложность процессов формирования стимулированной поверхностной экспрессии ТЬЯб не позволяет однозначно трактовать их динамику у пациентов системным воспалительным ответом. Наиболее информативным показателем для оценки тяжести системного воспалительного ответа после операции

коронарного шунтирования является уровень поверхностной экспрессии ТЯЕМ-1 на субпопуляции С014ЫСШ6+.

Степень достоверности

О достоверности полученных результатов свидетельствуют достаточная выборка пациентов, непосредственное участие соискателя в планировании и выполнении всех этапов клинического и экспериментального исследования, систематизации полученных данных, использование адекватных методов статистического анализа.

Апробация результатов

Материалы диссертации представлены и обсуждены на следующих научных форумах: XIII Всероссийской конференции «Жизнеобеспечение при критических состояниях» (Москва, 2011); научно-практической конференции «Современные стандарты в кардиоанестезиологии. От науки к практике» (Новосибирск, 2011); XIV Всероссийском научном форуме с международным участием им. академика В. И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011); II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012); Объединенном иммунологическом форуме (Нижний Новгород, 2013).

Публикации по теме диссертации

По результатам исследования опубликовано 18 печатных работ, в том числе 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук; 2 статьи в зарубежной печати и 1 патент РФ на изобретение, 1 монография.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 16 рисунками, 24 таблицами. Работа состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материала и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 157 источников, из них 8 отечественных.

Личный вклад автора

Лично автором проведен подбор и анализ литературных данных по теме диссертации, организован забор материала, непосредственное выполнение исследований, планирование и постановка экспериментов, статистическая обработка полученных результатов, их систематизация и анализ, написание

работы. Эксперименты по изучению влияния продуктов повреждения миокарда на моноциты спланированы и проведены совместно с заведующим лабораторией клеточных технологий, канд. мед. наук Головкиным A.C.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

В клинической части проведено обследование 69 пациентов с диагнозом: ишемическая болезнь сердца, стенокардия II-III функционального класса, ХСН I—IIA, которым в плановом порядке была выполнена операция коронарного шунтирования (КШ) в условиях ИК. У обследованных лиц получено добровольное информированное согласие на проведение необходимых для исследования манипуляций. Критерии исключения: сочетанная патология коронарных сосудов и клапанов сердца, острая инфекция и обострение хронической инфекции, наличие злокачественных новообразований, хирургические осложнения во время операции и в послеоперационном периоде.

Ретроспективно все пациенты были разделены на три группы в зависимости от особенностей послеоперационного периода (Таблица 1).

Таблица 1 - Схема распределения пациентов по группам

Критерии 1-я группа с неосложненным СВО (п=31) 2-я группа с СВО и компенсированной ПОН (п=30) 3-я группа с СВО и декомпенсированной ПОН (п=8)

SOFA 0 баллов 1-3 балла 4 и более баллов

APACHE II 0-5 6-11 12 и более

POSSUM 5 Риск летальности 1,2% 10 Риск летальности 4,9% 20 Риск летальности 24,9%

Кол-во критериев СВО 0-2 2 2-4

Баланс жидкости - + +++

Потребность в норадреналине - + +++

Сатурация 02 в нижней полой вене 70 (68-79)% 65 (60-67)% 60 (58-67)%

В основу распределения положена классификация недостаточности органов и систем, предложенная В. В. Чаленко (1998), дополненная

объективными критериями и шкалами. Группы были сопоставимы по полу, особенностям течения ИБС, основным параметрам проведенного ИК, но возраст у пациентов 3-й группы был старше по сравнению с пациентами других групп.

Материалом для исследования служила кровь из периферической вены, взятая до операции, после операции (1-е и 7-е сутки) в пробирки с антикоагулянтом и активатором свертывания. Относительное количество моноцитов в крови определено на гематологическом анализаторе МЕК 6400 Nihon Kohden (Япония). Концентрация цитокинов, sCD14, Hsp70 в сыворотке исследована методом ИФА с использованием анализатора «Униплан» (Россия).

Разделение моноцитов на субпопуляции выполнено на проточном цитометре FACS Calibur BD (США) в программе CellQuestPro по методу, описанному О. Amir (2012). Количественная оценка уровня экспрессии TLR2, TLR4 и TREM-1 на поверхности субпопуляций выполнялась по средней интенсивности флуоресценции (MIF) с использованием значений геометрической средней (Наумова Е.В., 2008).

В экспериментах in vitro проводилась стимуляция цельной крови с последующим изучением уровня внутриклеточной продукции TNFa субпопуляциями моноцитов методом проточной цитофлюориметрии, а также оценка влияния на моноциты продуктов механического повреждения миокарда, эндотоксинов и их сочетания. Изолированные моноциты выделяли методом адгезии на пластике мононуклеаров периферической крови. Моделью продуктов механического повреждения миокарда в эксперименте in vitro служила цитозольная фракция кардиомиоцитов (ЦФК), приготовленная в асептических условиях из биоптата ушка левого предсердия путем механической гомогенизации и последующего фильтрования. Стимуляцию моноцитов проводили 2% ЦФК (содержит 123 мкг/мл ткани ушка предсердия). В качестве эндотоксина использовался LPS в умеренной концентрации 2 нг/мл. Определение содержания цитокинов в культивационной среде выполнено набором СВА (Cytometric Bead Array) Inflammation Kit (BD).

Статистическая обработка результатов проводилась в программе «Statistica 6,0». Попарное сравнение показателей выполнено с помощью теста Вилкоксона для непараметрических данных, проверка значимости различий -по критерию Манна - Уитни. Статистически значимыми считались различия при р<0,05. Данные представлены как медиана (Me), 25% и 75% квартилей (Q1-Q3).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Динамика уровня вСШ4, 1Ь-1р, 1Ь-6, ТМРа, 1Ь-10, 1Ь-11*А в крови пациентов с СВО1 после операции КШ. Активированные моноциты являются основными источниками ряда провоспалительных цитокинов (1Ь-6, 1Ь-1(3, Тора). В 1-е сутки после операции у всех пациентов концентрация 1Ь-6 в крови многократно повышалась по сравнению с показателями до операции (Рисунок 1). В группе пациентов с развившейся в дальнейшем декомпенсированной ПОН (3-я группа) содержание 1Ь-6 в крови было выше, чем с компенсированной формой ПОН (2-я группа). К 7-м суткам после операции у всех пациентов концентрация 1Ь-6 снижалась относительно показателей 1-х суток, но оставалась выше дооперационных значений.

pg;ml

100 50

о

IL-6

TNFa

до операции 1 суткп после операнда

сутки после операции

до операции I сутки после " сутки после операции операции

IL-lp

ЙL

□ 1 группа а 2 группа ■ 3 группа

до операции 1 сутки после операции

сутки после операции

* - р<0,05 по сравнению

с дооперационным периодом

** - р<0,05 по сравнению

с 1-ми сутками после операции

# - р<0,05 между указанными

группами

Рисунок 1 - Концентрация IL-6, TNFa, IL-1J3 в сыворотке крови пациентов, перенесших операцию КШ

Менее выраженные изменения по сравнению с IL-6 зарегистрированы для TNFa и IL-lp (Рисунок 1). Уровень TNFa в 1-е сутки после операции незначительно, но достоверно повышался только у пациентов с СВО без признаков ПОН (1-я группа). В этот период концентрация IL-1Р в крови у пациентов 1-й и 2-й групп увеличивалась менее чем на 17% относительно показателей до операции.

Активированные моноциты участвуют в синтезе IL-10 и IL-IRA. В 1-е сутки после операции у всех пациентов повышалось содержание IL-10 и IL-1RA

по сравнению с дооперационными значениями, при этом концентрация 1Ь-10 в 3-й группе пациентов превышала одноименные показатели других групп (Рисунок 2). На 7-е сутки после операции у пациентов с реализованной ПОН в форме несостоятельности органов и систем (3-я группа) содержание 1Ь-1ЯА в крови было выше, чем у пациентов с СВО без ПОН (1-я группа).

рё/ш1 1Ь-10 □ 1 группа 1Ь-№А ^ ^ ^

* - р<0,05 по сравнению с показателями до операции; ** - р<0,05 по сравнению с 1-ми сутками после операции; # - р<0,05 между указанными группами

Рисунок 2 - Концентрация IL-10, IL-1R.A в крови пациентов, перенесших операцию КШ

Следовательно, в раннем послеоперационном периоде КШ концентрация IL-6 и IL-10 в крови может служить прогностическим маркером осложнений СВО, тогда как в позднем послеоперационном периоде наиболее информативным показателем тяжести ПОН становится IL-IRA.

Прямым показателем активации моноцитов является уровень sCD14 в крови. В 1-е сутки после операции зарегистрировано повышение содержания sCD14 в крови пациентов всех групп (Рисунок 3). На 7-е сутки после операции его концентрация снижалась по сравнению с 1-ми сутками, но оставалась выше дооперационных показателей.

100 80 60 40 20 0

до операции 1 сутки после 7 сутан после операции операции

до операции 1 сутки после 7 сутки после операции операции

нг/мл

SCD14

□ 1 группа

4000 -1

3000

Е2 группа

2000

1000 -

с дооперационным периодом ■ 3 группа ** - р<0,05 по сравнению с 1-ми сутками после операции

до операции 1 сутки после 7 сутки после операции операции

Рисунок 3 - Уровень sCD14 в крови пациентов, перенесших КШ

Таким образом, в 1-е сутки после операции КШ у пациентов с СВО регистрируются признаки активации моноцитов, которые сохраняются до 7-х суток.

Характеристика провоспалительных свойств моноцитов С014ЫСБ16- СБ14ЫСБ16+ и СШ4*тСВ16+. На выделенных субпопуляциях моноцитов (С014ЫС016^, С014ЫС016+ и СЭ14а,тС016") была исследована базальная поверхностная экспрессия активирующих рецепторов врожденного иммунитета Т1Л2, Т1Л4 и Т11ЕМ-1. Моноциты С014ЫСВ16^ имели более высокие значения МШ ТЫ12, ТЬЯ4 и ТКЕМ-1 по сравнению с другими субпопуляциями (Рисунок 4). М1Б ТЬЯ2 на субпопуляциях С014Ь'С016~ и не различалась. Крайне низкая поверхностная экспрессия ТЬЯ4 и ТЯЕМ-1 обнаружена на моноцитах С014*гаС016+.

MIF (усл.ед) 100

- р<0,005 по сравнению с

моноцитами CD 14hiCD 16" ** - р<0,005 по сравнению с моноцитами CD14dimCD16+ CDHhiODIi- nD14hiCDtii+ СГИ4(ИтОП16+

Рисунок 4 - MIF TLR2, TLR4 и TREM-1 на субпопуляциях моноцитов

Изучение внутриклеточной продукции TNFa субпопуляциями моноцитов проводилось при стимуляции LPS. Самый высокий основной и стимулированный синтез TNFa зарегистрирован у моноцитов CD14h'CD16+, что соответствовало наибольшей поверхностной экспрессии TLR2, TLR4, TREM-1 (Рисунок 5).

* -рс0,05 по сравнению с

контролем **- р<0,05 между указанными субпопуляциями

ОП14ЫОПН6-

СП14ЫОП16+ Cni4dimroi6+

Рисунок 5 - Относительное содержание TNFa-позитивных клеток сред! субпопуляций моноцитов

Моноциты CD14hiCD16~ с более низкой экспрессией этих рецепторов продуцировали меньшее количество TNFa по сравнению с CD14h'CD16 . Содержание TNFa-позитивных клеток среди моноцитов CD 14 ,mCD16+ в контрольных и стимулированных образцах составило 0,4%, что обусловлено слабой поверхностной экспрессией TLR4, для которых LPS является лигандом. Следовательно, базальный уровень экспрессии изучаемых рецепторов определяет чувствительность клеток к соответствующему лиганду.

Таким образом, выделенные субпопуляции моноцитов демонстрируют функциональные и фенотипические различия. Преимущественными провоспапительным свойствами обладают моноциты CD14 CD 16 , поскольку экспрессируют на поверхности наибольшее количество TLR2, TLR4, TREM-1 и синтезируют максимальное количество TNFa при стимуляции LPS.

Динамика субпопуляций моноцитов при стимуляции LPS in vitro. В течение 24-часовой стимуляции цельной крови здорового донора LPS происходило увеличение моноцитов CD14h'CD16+ и почти пропорциональное снижение CD14hiCD16" (Рисунок 6). Начальные изменения отмечены через 2 и 4 часа стимуляции, но наиболее выраженная динамика зарегистрирована по окончании суток.

100% 80% 60% 40% 20% 0%

* - р<0,05 по сравнению с одноименными образцами через 4 часа стимуляции ** -р<0,05 между

указанными образцами

, контроль LPS контроль LPS контроль LPS > часа 4 часа 24 часа

■ CDUIiiOnifi- E3C.D141iiC'Dl fi+ QCD1 4ditnCDl fi+

Рисунок 6 - Динамика субпопуляционного состава моноцитов крови в течение 24 часовой стимуляции LPS in vitro

В условиях закрытой экспериментальной системы повышение количества моноцитов CD14hiCD16+ при стимуляции LPS может происходить за счет перехода субпопуляции CD14h,CD16~ в CD14hiCD16+.

Таким образом, активация моноцитов LPS сопровождается увеличением субпопуляции CD14h,CD16+ с характерными провоспалительными свойствами как результата предполагаемой дифференцировки моноцитов CD14h,CD16".

Динамика субпопуляционного состава моноцитов крови у пациентов с различными вариантами течения СВО после операции КШ. В эксперименте использован эндотоксин, но запуск стерильной воспалительной реакции происходит с участием иных трипгерных факторов. Отсутствие объективных клинических и лабораторных признаков инфекции у пациентов позволило считать неинфекционным СВО в раннем послеоперационном периоде КШ.

В 1-е сутки после операции наблюдалось снижение относительного содержания моноцитов CD14hiCD16^ и повышение CD14hlCD16+ по сравнению с уровнем до операции (Рисунок 7). В 3-й группе пациентов с декомпенсированной ПОН содержание моноцитов CD14h,CD16" было ниже, а CD14h'CD16+ выше по сравнению с другими группами. На 7-е сутки после операции содержание моноцитов CD14hlCD16" увеличивалось, a CD14hiCD16+ снижалось относительно показателей 1-х суток.

CD14hiCD16-

100

»J i%L ;i J I

60 4——L—BB—.——IÄ

iir rAi

all

40 30 20 10

CD14hiCD16+ □ 1 группа @ 2 группа ■ 3 группа

HS.

до операции 1 сутки после 7 с\тш после операции операции

до операции 1 сутки после операции

? сутки после операции

* - р<0,04 по сравнению с одноименными показателями до операции; ** - р<0,01 по сравнению с одноименными показателями в 1-е сутки после операции; # - р<0,01 между показателями в указанных группах

Рисунок 7 - Относительное содержание субпопуляций моноцитов в крови пациентов, перенесших операцию КШ

Перераспределение субпопуляционного состава моноцитов в раннем послеоперационном периоде КШ аналогично изменениям, полученным при стимуляции эндотоксином in vitro. Данный факт подтверждает взаимосвязь этих субпопуляций с возможностью дифференцировки моноцитов CD14h'CD16

в CD14h'CD16+ и указывает на общие механизмы реализации септического и стерильного воспалительного ответа.

Наиболее выраженное перераспределение моноцитов CD14hiCD16+ и CD14h'CD16~ происходило у пациентов с осложненным течением СВО в форме декомпенсированной ПОН, поэтому был проведен корреляционный анализ изменения субпопуляционного состава моноцитов и тяжести органной недостаточности.

Обнаружена отрицательная корреляционная связь между оценкой по шкале SOFA и относительным содержанием моноцитов CD14hiCD16" в 1-е сутки после операции (г=Ч),25; р=0,046) и положительная с моноцитами CD 14 CD 16 (1=0,25; р=0,044), что свидетельствует о значимом участии этих субпопуляций в развитии СВО и формировании его осложнений при одновременном влиянии других факторов.

Динамика поверхностной экспрессии TLR2, TLR4, TREM-1 на субпопуляциях моноцитов под влиянием LPS. Тесная связь фенотипа клеток с функциональными характеристиками предполагает соответствие поверхностной экспрессии TREM-1 и TLR2, TLR4 на субпопуляциях моноцитов уровню активированной продукции противовоспалительных цитокинов. Для подтверждения гипотезы были изучены базальный и стимулированный LPS уровень флюоресценции TLR2, TLR4, TREM-1 на субпопуляциях и внутриклеточной продукции TNF а. Ранее было показано, что базальный уровень MIF TLR2, TLR4, TREM-1 определяет чувствительность клеток к соответствующему лиганду.

Результаты стимулированной экспрессии были неоднозначны. Воздействие LPS на протяжении 24 часов приводило к разнонаправленным изменениям MIF изучаемых рецепторов на субпопуляциях моноцитов за исключением TLR2 (Рисунок 8А). Уровень флюоресценции TLR2 равномерно повышался на всех субпопуляциях на ранних этапах активации (первые 4 часа), и снижался к концу суток. Экспрессия TLR4 на моноцитах CD14hiCD16~ увеличивалась до 4 часов стимуляции и снижалась через сутки, а на субпопуляции CD14hiCD16+ отмечалась общая динамика повышения на протяжении 24 часов (Рисунок 8Б).

Схожие с TLR4 изменения интенсивности флюоресценции зарегистриро-ванны у TREM-1: первоначальное повышение с последующим снижением на моноцитах CD14h'CD16~ и прогрессивное увеличение на всем протяжении периода наблюдения (наиболее интенсивно к концу суток) на CD14hlCD16+ (Рисунок 8С).

A.TLR2

В. TLR4

MIF (усл.ед)

SCD14hiCD16-

ICD14hiCD16+ uCD14dimCD16+

С. TREM-1

котггроль LPS контроль LPS 4 часа 24 часа * - p<0,05 по сравнению с одноименными показателями контроля на данное время; --р<0,05 между указанными показателями

Рисунок 8 - Динамика MIF TLR2, TLR4 и TREM-1 на субпопуляциях моноцитов при стимуляции LPS

Через 4 часа стимуляции LPS уровень экспрессии TLR4 и TREM-1 на субпопуляциях моноцитов (Рисунок 8В, С) не соответствовал особенностям внутриклеточного синтеза TNFa (Рисунок 5). Повышение MIF этих рецепторов на моноцитах CD14dlmCD16+ (по сравнению с контролем на данное время) не приводило к увеличению синтеза TNFa (0,4% TNFa-позитивных клеток в контроле и при активации LPS). Эти особенности связаны со сложностью процессов формирования стимулированной поверхностной экспрессии TLR2 и TLR4 (синтез mRNA, интернализация, рециркуляция и деградация этих рецепторов в составе поздних эндолизосом). Тем не менее при стимуляции LPS сохранялась общая динамика увеличения экспрессии TLR2, TLR4, TREM-1 на моноцитах и повышения синтеза TNFa.

Уровень синтеза провоспалительных цитокинов моноцитами при воздействии ЦФК, LPS и их комбинации in vitro. Механически поврежденные ткани миокарда могут являться источником внеклеточного Hsp70 (эндогенного сигнала тревоги и лиганда для TLR2, TLR4), поскольку его содержание в приготовленной ЦФК (10,2 нг/мл) в 100 раз выше концентрации в крови пациентов перед операцией (0,060 (0,029-0,087) нг/мл).

Двенадцатичасовая инкубация изолированных моноцитов с 2% ЦФК приводила к повышению в среде уровня IL-8, IL-6, IL-1J3 и TNFa по сравнению с контролем, что свидетельствует об активирующем эффекте ЦФК на моноциты (Таблица 2).

Таблица 2 - Содержание цитокинов в среде (нг/мл) при изолированном и совместном воздействии LPS и ЦФК на моноциты

Показатель Контроль ЦФК LPS ЦФК и LPS ЦФК + LPS

IL-8 848 (804,8-872,8) 1347,1* (1324,8-1722) 2687,5* (2013,3-3212) 5576* (4369,6-6245,6) 4034,6** (3338,1-4934)

IL-ip 3,2 (3,1-3,3) 5,0* (4,6-9,9) 37,5* (25,6-46) 51* (45-61,2) 42,5** (30,2-55,9)

IL-6 1,7 (1,6-1,9) 12,7* (6,5-15,1) 58* (45,4-68) 110* (90-122,3) 70,7** (51,9-83,1)

TNFa 0,7 (0,7-0,9) 1,4* (1,2-3,0) 21,3* (16-24,6) 32,8* (26,6-39,1) 22,7** (17,2-27,6)

Примечания. * - р<0,02 по сравнению с контролем;

** - р<0,02 по сравнению с комбинированным влиянием ЦФК и LPS.

Воздействие на моноциты LPS и комбинацией LPS с ЦФК (LPS и ЦФК) приводило к увеличению синтеза провоспалительных цитокинов. При совместной стимуляции моноцитов LPS и ЦФК содержание цитокинов в среде было выше (LPS и ЦФК), чем сумма результатов изолированного влияния (ЦФК + LPS), что свидетельствует о потенцировании эффектов.

Уровень поверхностной экспрессии TLR2, TLR4 и TREM-1 на моноцитах при воздействии in vitro ЦФК, LPS и их комбинации. Четырехчасовое воздействие ЦФК не приводило к изменению MIF TLR2, TLR4 и TREM-1 на моноцитах по сравнению с контролем, в то время как LPS вызывал повышение MIF этих рецепторов (Таблица 3). Обобщая полученные результаты и данные литературы, можно заключить, что стимуляция моноцитов

аларминами через Т1Ж2 и ТЬК4 возможна без достоверного изменения их поверхностной экспрессии.

Таблица 3 - MIF (усл. ед.) TLR2, TLR4 и TREM-1 на моноцитах при стимуляции LPS, ЦФК и их комбинации

Показатель Контроль ЦФК LPS ЦФК и LPS

TLR2 23,5 (16,1-29,6) 22,3 (14,5-30,1) 32,0* (18,9-37,0) 34,3*/** (20,4-39,6)

TLR4 11,3 (7,5-15,8) 11,1 (10,7-17,5) 13,6* (10,8-28,3) 13,8* (11,3-28,9)

TREM-1 73,9 (45,9-79,2) 76,5 (43,0-80,2) 101,4* (51,1-114,5) 110,6*/** (55,7-124,8)

Примечания. * — р<0,02 по сравнению с контролем;

** - р<0,02 по сравнению с LPS.

Одновременное присутствие LPS и ЦФК увеличивало MIF TLR2 и TREM-1 на моноцитах сильнее, чем изолированное воздействие той же концентрации LPS, что указывает на синергизм совместного влияния LPS и ЦФК на уровень поверхностной экспрессии TLR2 и TREM-1.

Динамика уровня поверхностной экспрессии TLR2, TLR4 и TREM-1 на субпопуляциях моноцитов в периоперационном периоде КШ. В 1-е сутки после операции достоверное повышение MIF TLR2 происходило только на моноцитах CD14h'CD16+ у пациентов с компенсированной ПОН (2-я группа) (р<0,05). На 7-е сутки после операции у всех пациентов отмечалось снижение MIF TLR2 на субпопуляциях моноцитов по сравнению с показателями до операции и 1-ми сутками после операции (р<0,05).

Не выявлено изменений MIF TLR4 на субпопуляциях моноцитов в раннем послеоперационном периоде. К 7-м суткам после операции на моноцитах CD14hiCD16~ уровень MIF TLR4 уменьшался по сравнению с дооперационными и 1-ми сутками после операции (р<0,05), на других субпопуляциях изменений не зарегистрировано.

В 1-е послеоперационные сутки уровень поверхностной экспрессии TREM-1 наиболее интенсивно увеличивался на моноцитах на CD14h'CD16+ и CD14dimCD16+, о чем свидетельствует повышение MIF (Рисунок 9). При этом MIF TREM-1 у пациентов с декомпенсированной ПОН (3-я группа) на моноцитах CD14h'CD16+ имела тенденцию к более высоким значениям по

сравнению с другими группами. Через неделю после операции в случаях прогрессирования ПОН экспрессия ТЯЕМ-1 на моноцитах С014Ь,С016Г была достоверно выше, чем у пациентов с регрессом проявлений СВО.

MIF (усл.ед) cj)l4hiCD16-150

100

50

..oMi ¿Шл

CD14hiCD16+

MIF CD14dimCD16+

80 60 40 20 -

L'.jSlii.

I Ж

дооперащш 1-е сутки 7-е сутки после после операции операции

MIF

100 150 100 50

- о

до операщш 1 -е сутки 7-е сутки

после после

операции операции

□ 1 группа □ 2 группа ■ 3 группа

* - р<0,05 по сравнению со значениями до

операции для данной группы пациентов ** - р<0,05 по сравнению с 1-ми сутками после операции для данной группы пациентов

# - р<0,05 между указанными показателями

Рисунок 9 - MIF TREM-1 на субпопуляциях моноцитов у пациентов, перенесших операцию КШ

Таким образом, сложность процессов формирования стимулированной поверхностной экспрессии TLRs не позволяет оценивать активность воспалительного ответа организма по их динамике. Для характеристики тяжести СВО в послеоперационном периоде КШ наиболее информативным и стабильным показателем можно считать MIF TREM-1 на субпопуляции CD14hlCD16+.

ВЫВОДЫ

1. Операция коронарного шунтирования приводит к активации моноци-тарно-макрофагального звена врожденного иммунитета, о чем свидетельствует повышение в сыворотке крови концентрации sCD14 и синтезированных с его участием цитокинов (IL-6, IL-lp, IL-10, IL-1RA).

2. Активация моноцитов липополисахаридом in vitro сопровождается прогрессивным увеличением содержания моноцитов CD14WCD16+ и снижением CD14hlCD16", что может являться результатом дифференцировки субпопуляции CD14hiCD16" в CD14hlCD16\

3. На ранних этапах формирования неинфекционного системного воспалительного ответа у пациентов после операции коронарного шунтирования происходит увеличение содержания субпопуляции С014ЫС016+ и уменьшение СВ14Ь'С016", выраженность перераспределения субпопуляций коррелирует с тяжестью полиорганной недостаточности.

4. Базальная поверхностная экспрессия Т1Л2, ТЫ14 и Т11ЕМ-1 на субпопуляциях моноцитов характеризует чувствительность клеток к соответствующему лиганду. Моноциты С014Ь'С016+ обладают преимущественными провоспалительными свойствами, поскольку экспрессируют на поверхности наибольшее количество ТЬЯ2, ТЫ14, ТЯЕМ-1 и синтезируют максимальное количество ЮТа при стимуляции липополисахаридом. Стимулированная липополисахаридом поверхностная экспрессия ТЫ12, ТП14, ТЯЕМ-1 на субпопуляциях моноцитов не соответствует уровню синтеза ЮТа, но имеет общую с ним динамику.

5. Продукты механического повреждения миокарда содержат высокие концентрации НБр70 и могут активировать моноциты с соответствующим увеличением синтеза провоспалительных цитокинов, но, в отличие от эндотоксина, без значимых изменений уровня поверхностной экспрессии ТЫ12, ТЬЯ4 и ШЕМ-1. Совместное воздействие липополисахарида и продуктов механического повреждения миокарда приводит к синергизму продукции провоспалительных цитокинов и поверхностной экспрессии ТЫ12 и ТЯЕМ-1.

6. После операции коронарного шунтирования изменения поверхностной экспрессии ТЯЕМ-1 на субпопуляции СВ14ЫС016+ происходят в соответствии с тяжестью проявлений системного воспалительного ответа: в 1-е сутки экспрессия рецептора повышается, к 7-м суткам снижение показателя происходит только у пациентов с регрессом проявлений системного воспалительного ответа. Поверхностная экспрессия Т1П2 и ТЫ14 не имеет значимой динамики в условиях формирования системного воспалительного ответа у пациентов после операции коронарного шунтирования.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для прогнозирования и оценки тяжести ПОН в раннем послеоперационном периоде КШ целесообразно определять относительное содержание моноцитов С014ЫСВ16" и С014ЫСБ16+. Повышение относительного количества субпопуляции СВ14ыСБ1б+ более 26,3% и снижение С014ыС01б" менее 68,7%

в 1-е сутки после операции является неблагоприятным прогностическим признаком тяжелых осложнений СВО.

2. При оценке прогрессирования ПОН на 7-е сутки после операции рекомендуется исследовать MIF TREM-1 на моноцитах CD14hlCD16+. Уровень MIF TREM-1 выше 56,5 усл. ед. через неделю после операции свидетельствует о тяжелом течении и прогрессировании ПОН.

3. Для прогнозирования и мониторирования СВО и ПОН в послеоперационном периоде КШ следует исследовать концентрацию IL-6, IL-10 и IL-1RA в крови. В 1-е сутки после операции предиктором декомпенсированной ПОН является повышение содержания IL-6 более 78,5 пг/мл и IL-10 более 72,2 пг/мл, на 7-е сутки уровень IL-1RA более 4156 пг/мл указывает на неблагоприятный характер течения ПОН.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в журналах, рекомендованных ВАК

1. Роль триггерного рецептора, экспрессируемого на миелоидных клетках в патогенезе системного воспалительного ответа / В. Г. Матвеева, А. С. Головкин, Е. В. Григорьев и др. // Общая реаниматология. - 2011. - VII; 3 - С. 61-65 (0,63 п.л.).

2. Периоперационная динамика маркеров воспаления у пациентов ишемиче-ской болезнью сердца, подвергшихся коронарному шунтированию / Ю. В. Байракова, Е. Д. Баздырев, В. Г. Матвеева и др. // Цитокины и воспаление. - 2012. - Т. 11, № 1. — С. 55-59 (0,63 п.л.).

3. Субпопуляции моноцитов крови при неосложненном течении периопераци-онного периода коронарного шунтирования / А. С. Головкин, В. Г. Матвеева, И. В. Кудрявцев и др. // Медицинская иммунология. - 2012. - Т. 14, № 4-5. - С. 391-398 (1,0 п.л.).

4. Динамика субпопуляций моноцитов CD14CD16 при неосложненном системном воспалительном ответе в периоперационном периоде коронарного шунтирования / В. Г. Матвеева, А. С. Головкин, И. В. Кудрявцев и др. // Медицинская иммунология. - 2012. - Т. 14. № 4-5. - С. 305-312 (1,0 п.л.).

5. Растворимая форма триггерного рецептора, экспрессируемого на миелоидных клетках (sTREM-1) - потенциальный маркер тяжести системного воспалительного ответа / В. Г. Матвеева, А. С. Головкин, Е. В. Григорьев и др. // Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. - 2012. - Т. 5, № 6. - С. 91-95 (0,63 п.л.).

6. Динамика поверхностной экспрессии триггерного рецептора, экспрессируемого миелоидными клетками-1 (TREM-1) на различных субпопуляциях моноцитов в раннем послеоперационном периоде прямой реваскуляризации миокарда / В. Г. Матвеева, А. С. Головкин, М. Н. Чернова и др. // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2012. -№ 3 (85), ч. 2. - С.116-120 (0,63 п.л.).

7. Цитокиновый дисбаланс при ишемии и реперфузии: вклад сердечного компартмента / А. С. Головкин, В. Г. Матвеева, М. Н. Чернова и др. / Российский иммунологический журнал. - 2012. - Т. 6 (15), № 3. - С. 259-265 (0,88 п.л.).

8. Влияние цитозольной фракции кардиомиоцитов и липополисахарида на функцию моноцитов / В. Г. Матвеева, А. С. Головкин, М. Н. Чернова и др. // Медицинская иммунология. - 2013. - Т. 15, № 5. - С. 439-448 (1,25 п.л.).

Патент

9. Способ ранней диагностики осложненного системного воспалительного ответа у пациентов, оперированных в условиях искусственного кровообращения: патент № 2463606 Рос. Федерация: МПК31 G01N 33/53 / А. С. Головкин, В. Г. Матвеева, Е. В. Григорьев и др.; заявитель и патентообладатель - Учреждение Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний СО РАМН». - № 2011134573/15(051214); заявл. 17.08.2011; опубл. 10.10.2012, Бюл. № 28.

Статьи, опубликованные в рецензируемых журналах

10. Perioperative Dynamics of TLR2, TLR4, and TREM-1 Expression in Monocyte Subpopulations in the Setting of On-Pump Coronary Artery Bypass Surgeiy / A. S. Golovkin, V. G. Matveeva, I. V. Kudryavtsev et al. // ISRN Inflammation. - 2013. -Article ID 817901.-8 p.

11. sTREM-1 as a Prognostic Marker of Postoperative Complications in Cardiac Surgery / A.S. Golovkin, V. G. Matveeva, E. V. Grigoriev et al. // ISRN Inflammation. -2012. - Article ID 38286. - 5 p.

Монография

12. Системный воспалительный ответ в кардиохирургии / Е. А. Великанова, А. С. Головкин, В. Г. Матвеева и др.; под ред. Л. С. Барбараша, Е. В. Григорьева. -Кемерово: Кузбассвузиздат, 2013. -149 с (19,5 п.л.).

Материалы конференций

13. Влияние цитозольной фракции кардиомиоцитов и липополисахарида на функцию моноцитов / В. Г. Матвеева, А. С. Головкин, И. В. Кудрявцев и др. // Российский иммунологический журнал. - 2013. - Т. 7 (16), № 2-3. - С. 131 (0,06 п.л.).

14. Динамика про- и противовоспалительных цитокинов в раннем послеоперационном периоде коронарного шунтирования / А. С. Головкин, В. Г. Матвеева, Е. В. Григорьев и др. // Медицинская иммунология. - 2011. - Т. 13, № 4-5. - С. 486 (0,06 п.л.).

15. Динамика уровня моноцитов при неосложненном течении послеоперационного периода коронарного шунтирования / А. С. Головкин, В. Г. Матвеева, И. В. Кудрявцев и др. // Медицинская иммунология. - 2011. - Т. 13, № 4-5. - С. 484 (0,06 пл.).

16. Матвеева, В. Г. Особенности поверхностной экспрессии активирующих рецепторов врожденного иммунитета на субпопуляциях моноцитов / В. Г. Матвеева, А. С. Головкин, М. Н. Чернова // Медицинский академический журнал. - 2012. -Т. 12, № 3. - С. 87-89 (0,38 п.л.).

17. Механизмы неинфекционного системного воспаления: растворимый триг-герный рецептор, экспрессируемый на миелодных клетках (Т1ШМ-1) / В. Г. Матвеева, А. С. Головкин, Е. В. Григорьев и др. // Сборник материалов XIII Всероссийской конференции «Жизнеобеспечение при критических состояниях». - М., 2011. - С. 52 (0,06 пл.).

18. Особенности экспрессии ПЛ12, Ш14, Т1ШМ-1 на субпопуляциях моноцитов в периоперационном периоде коронарного шунтирования, выполненного в условиях искусственного кровообращения / А. С. Головкин, В. Г. Матвеева, И. В. Кудрявцев и др. // Российский иммунологический журнал. - 2013. - Т. 7 (16), № 2-3. - С. 129

(0,06 п.л.).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

SOFA - Sepsis-related Organ Failure Assessments Score

APACHE II - Acute Physiology And Chronic Health Evaluation

POSSUM - Physiological and Operative Severity Score for the enumeration

of Mortality and Morbidity

LPS - липополисахарид

MIF - средняя интенсивность флюоресценции

СВО - системный воспалительный ответ

ПОН - полиорганная недостаточность

ХСН - хроническая сердечная недостаточность

КШ - коронарное шунтирование

ЦФК - цитозольная фракция кардиомиоцитов

Подписано в печать 08.11.2013. Формат 60><841/1б. Бумага офсетная № 1. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ № 15/13

Адрес издательства и типографии: ООО «Издательство «Кузбассвузиздат». 650043, г. Кемерово, ул. Ермака, 7. Тел. 8 (3842) 58-29-34, т/факс 36-83-77. E-mail: 58293469@mail.ru