Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Обоснование использования и оценка эффективности рекомбинантного интерлейкина-2 в лечении больных с гнойно-хирургической патологией

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ГУ НИИ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

АГЕЕВ НИКОЛАЙ ЛЕОНИДОВИЧ

- 8 :;:оп т

ОБОСНОВАНИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ И ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 В ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХ С ГНОЙНО-ХИРУРГИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИЕЙ

14.00.36 — Аллергология и иммунология 14.00.27 —Хирургия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск — 2002 г.

Работа выполнена в ГУ НИИ клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научные руководители: доктор медицинских наук A.A. Останин доктор медицинских наук, профессор С.Г. Штофин

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук В.В. Абрамов доктор медицинских наук, профессор А. И. Шевела

Ведущее учреждение: Государственный научный центр РФ — Институт иммунологии Министерства здравоохранения России

Защита состоится «16» мая 2002 г. в 14С0 час на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИКИ СО РАМН

Автореферат разослан «_»_

2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Соискатель

О.Т. Кудаева

H.JI. Агеев

Ъ, о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Гнойно-септические заболевания и послеоперационные инфекционные осложнения у больных хирургического профиля, для обозначения которых часто используют термин «хирургическая инфекция», представляют сферу исключительного внимания дня хирургов самых разных специальностей. Социальная значимость проблемы связана со значительным удельным весом гнойно-септических заболеваний в структуре хирургической патологии и высоким уровнем летальности больных, особенно, с генерализованными и тяжелыми формами хирургических инфекций [Савельев B.C., 1990; Федоров В. Д., 1991; Rangel-Frausto M.S., et al., 1995; Linde-Zwirble W.T., et al., 1999]. В процессе поиска эффективных методов лечения гнойно-септических заболеваний стало ясно, что сложившаяся ситуация во многом обусловлена недостаточным пониманием особенностей патогенеза хирургических инфекций, причин неэффективности механизмов иммунной защиты и роли иммунокомпетентных клеток в инициации и регуляции воспалительной реакции. Очевидно, что для решения данной проблемы необходимы координированные усилия не только хирургов и врачей-реаниматологов, но также и иммунологов, патофизиологов, молекулярных биологов и других специалистов.

Возбудителем хирургических инфекций является, как правило, сапрофитная флора, патогенность которой проявляется на фоне ослабления иммунологической реактивности. При этом возбудитель инфекции выступает в роли триггера, а основу патогенеза гнойно-септических заболеваний составляют индуцированные патогеном реакции врожденного и приобретенного иммунитета [Bone R.C., 1991; Heumann D. & Glauser М.Р., 1994]. При этом доминирующую роль играют механизмы естественной резистентности, которые являются компонентами воспаления. Важно отметить, что ответная реакция со стороны клеток иммунной системы носит двухфазный характер. Первая фаза сопряжена с продукцией провоспали-тельных цитокинов (ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-8, ИЛ-12, и др.), участвующих в инициации и организации воспалительного ответа. Вторая —■ обусловлена выбросом противовоспалительных медиаторов (реценторный антагонист ИЛ-1 [ИЛ1-РА], ИЛ-10, ТРФ-ß, растворимые рецепторы ФНО-а, и др.) и направлена на ограничение воспаления [Bone R.C., 1996, 1997].

До недавнего времени считалось, что развитие органных дисфункций, как основной причины летального исхода при тяжелых и генерализованных формах хирургической инфекции, связано исключительно с избыточной продукцией эндогенных медиаторов воспаления. Однако иммунотерапев-

тические стратегии, направленные на подавление активности провоспали-тельных цитокинов, не принесли ожидаемого успеха [Nasraway S.A., 1999]. С другой стороны, стало очевидным, что выраженность иммунодепрессии у больных с гнойно-хирургической патологией ассоциируется с тяжестью полиорганной недостаточности (ПОН) и неблагоприятным исходом. Учитывая известную иммуносупрессорную активность противовоспалительных медиаторов [Ahmad S., et al., 1997; Wolk К., et al., 1999; Choudhry M.A., et al., 1999; Akdis C.A., 2001], этот факт позволил предположить, что причиной иммунной недостаточности может являться несбалансированное развитие фазы противовоспалительного ответа, что соответственно может служить основанием для использования цитокинов с иммуностимулирующей активностью в комплексном лечении больных с гнойно-хирургической патологией (ГХП).

Среди цитокинов, которые в настоящее время находятся на пути активного внедрения р хирургическую практику, в частности, для профилактики и лечения гнойно-септических заболеваний, интерлейкин-2 вызывает особый интерес. Как известно, ИЛ-2 обладает широким спектром иммуностимулирующей активности, протестирует апоптоз Т-лимфоцитов и, видимо, опосредованно через усиление эндогенной продукции интер-феронов восстанавливает функциональную активность клеток моноци-тарно-макрофагального ряда [Кетлинский С.А., и др., 1992; Черных Е.Р. и др., 2001; Lucey D.R, et al., 1996].

Применение ИЛ-2 с целью коррекции иммунодепрессии при тяжелых и генерализованных формах хирургической инфекции было впервые предложено и запатентовано в Германии [Nitsche D., 1989]. В России ре-комбинантный ИЛ-2, разрешенный Фармкомитетом к клиническому использованию, появился в 1995 г. и получил коммерческое название «Рон-колейкин» (номер государственной регистрации Р № 000122/01-2000; производство ООО «Биотех», С-Пб). Однако его активное внедрение в клиническую практику тормозится опасениями возможной эскалации воспалительной реакции на фоне проведения иммуностимулирующей терапии. Кроме того, вопрос об эффективности Ронколейкина в лечении хирургических инфекций с позиций доказательной медицины (evidence-based medicine) в настоящее время остается нерешенным. Все вышесказанное определило цель и задачи исследования. ;

Цель исследования

На основе изучения механизмов формирования иммунной недостаточности на этапах манифестации и прогрессии синдрома системного воспа-

лительного ответа обосновать целесообразность использования и оценить эффективность рекомбинантного интерлейкина-2 в комплексном лечении больных с гнойно-хирургической патологией.

Задачи исследования

1. Оценить характер и выраженность иммунных нарушений у хирургических больных с гнойно-септическими заболеваниями и осложнениями на различных этапах клинической манифестации и прогрессии синдрома системного воспалительного ответа.

2. На основе комплексного анализа сывороточной концентрации и соотношения про- и противовоспалительных цитокинов (ФНО-а, ИЛ-8, ИЛ-4, ИЛ1-РА), а также биологической (воспалительной и супрессорной) активности сыворотки крови больных оценить состояние баланса цито-кин-опосредованных системных реакций в зависимости от характера течения и степени тяжести хирургической инфекции.

3. Разработать протокол клинических исследований и провести рандомизированные, двойные-слепые, плацебо-контролируемые испытания Ронколейкина в комплексном лечении больных с гнойно-хирургической патологией.

4. На основе анализа результатов проведенных испытаний оценить клиническую, иммунокорригирующую и детоксикационную эффективность Ронколейкина в комплексном лечении гнойно-септических заболеваний.

Научная новизна

Впервые показано, что у больных с ГХП клиническая манифестация и утяжеление синдрома системного воспалительного ответа сопряжено с прогрессирующим нарастанием иммунодепрессии, которая в максимальной степени выражена у больных с полиоргашюй недостаточностью и характеризуется угнетением митогенной реактивности иммунокомпетентных клеток, увеличением гибели лимфоцитов и нейтрофилов через механизм апоптоза, а также снижением уровня экспрессии НЬД-БЯ молекул на моноцитах.

В результате комплексной оценки уровня цитокинов в сыворотке крови (ФНО-а, ИЛ-8, ИЛ-4 и ИЛ1-РА), соотношения про- и противовоспалительных медиаторов (ФНО-о/ИЛ1-РА), а также биологической (воспалительной и супрессорной) активности сыворотки получены новые данные, свидетельствующие о преобладании у больных с ГХП иммуносупрессор-ной активности, обусловленной смещением цитокинового баланса в сторону противовоспалительных медиаторов (ИЛ1-РА, ИЛ-4). Установлено, что нарушение цитокинового баланса в сторону преобладания активности противовоспалительных медиаторов является важным механизмом фор-

мирования иммунной недостаточности у больных с ГХП, поскольку развитие наиболее тяжелых, сочетанных Т-клеточных дисфункций ассоциируется с усилением иммуносупрессорного потенциала сывороточных факторов. Полученные результаты научно обосновывают целесообразность проведения иммунокоррекции, направленной на ослабление супрес-сорного действия противовоспалительных медиаторов и смещение баланса в сторону цитокинов с иммуностимулирующей активностью.

Практическая значимость

Практическая ценность работы заключается, прежде всего, в улучшении результатов комплексного лечения хирургических больных с гнойно-септическими заболеваниями и осложнениями, за счет использования Ронко-лейкина — отечественного, фармакопейного препарата рекомбинантного ИЛ-2 человека. Впервые клиническая эффективность, иммунокорригирую-щее и детоксикационное действие Ронколейкина в лечении больных с ГХП доказаны в дизайне рандомизированных, двойных-слепых, плацебо-конт-ролируемых испытаний. Проведенные клинические исследования позволили разработать пособие для врачей, а также методические рекомендации, представленные для утверждения в Министерство здравоохранения РФ в соответствии с решением Ученого совета ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН (протокол № 7 от 25 декабря 2001 г.). В методических рекомендациях не только обобщен опыт практического использования Ронколейкина, но и рассматриваются вопросы патогенетического обоснования применения цитокинов, предлагается протокол проведения, показания и противопоказания к использованию цитокинотерапии при лечении гнойно-септических заболеваний.

Большое практическое значение проведенных исследований заключается также в том, что впервые в качестве интегральных параметров баланса про- и противовоспалительных медиаторов предложено использовать показатели воспалительной и супрессорной активности сыворотки. При этом доказано, что разработанный подход действительно отражает состояние цитокинового баланса у больных с ГХП

Практические результаты работы, представленные в форме пособия для врачей и методических рекомендаций МЗ РФ, могут быть тиражированы местными органами здравоохранения и использованы для инструктивных писем по лечению больных с гнойно-хирургической патологией для хирургов различных специальностей, врачей-реаниматологов, клинических иммунологов; оптимизации учебного процесса, чтении лекций и проведении практических занятий по теме «Иммунопатогенез и цитокинотерапия гнойно-септических заболеваний и осложнений в хирургической практике». 4

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Биологическая (воспалительная и супрессорная) активность сыворотки крови является интегральным показателем, отражающим баланс про-и противовоспалительных цитокинов и медиаторов у больных с ГХП.

2. Нарастание тяжести иммунной недостаточности у больных с ГХП на фоне клинической манифестации и прогрессии системной воспалительной реакции является следствием изменения цитокинового баланса в сторону преобладания противовоспалительных медиаторов.

3. Использование рекомбинантного ИЛ-2 человека (препарата Ронко-лейкин) в программе комплексного лечения хирургических больных с гной-ио-септическими заболеваниями и осложнениями является патогенетически обоснованным и характеризуется достоверным клиническим эффектом.

Объем н структура диссертации

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и практических рекомендаций. Материал изложен на 110 страницах машинописного текста, включающего 19 таблиц и 11 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 262 литературных источника, в том числе, 180 иностранных.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: VIII, IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001—2002); Белорусской научно-практической конференции «Современная фармакотерапия: цитокины» (Минск, 2001); Всероссийской научной конференции «Клинические перспективы в инфектологии» (Санкт-Петербург, 2001); научно-практических конференциях врачей (Новосибирск, 2000— 2001); учебно-методической конференции «Актуальные проблемы клинической иммунологии» (Барнаул, 2002); научно-практических конференциях Муниципальной клинической больницы № 1 (Новосибирск, 2000—2001).

Апробация работы состоялась на расширенном семинаре Института клинической иммунологии СО РАМН 26 марта 2002 года. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 1 статья в центральной печати и 2 статьи в региональной печати, подготовлены пособие для врачей и методические рекомендации МЗ РФ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика больных, Результаты, представленные в работе, получены при исследовании 100 больных (56/44% мужчин и женщин, средний возраст 44,6 ± 1,7 лет) с гнойно-септическими заболеваниями и осложнениями (из них: 56 пациентов с острой хирургической патологией органов брюшной полости (гангренозный аппендицит, язвенная болезнь желудка или 12-перстной кишки с перфорацией, острая кишечная непроходимость, гангренозный холецистит, острый панкреатит, панкреонекроз, внутрибрюшные абсцессы и т.д.); 33 больных с раневой инфекцией (абсцессы, флегмоны); 11 пациентов с гнойно-деструктивными заболеваниями бронхо-легочного аппарата и средостения (абсцедирующая пневмония, пиопневмоторакс, медиастенит).

Среди наиболее тяжелых осложнений разлитой гнойный перитонит был зарегистрирован у 55,5% (31/56) больных с острыми воспалительными заболеваниями органов брюшной полости. В 68% случаев (68/100 больных) течение основного заболевания осложнялось развитием сепсиса, который определяли в соответствии с рекомендациями Чикагской согласительной конференции ACCP/SCCM [Bone R.C., et al., 1992] по двум критериям: 1) наличие очага инфекции и 2) клиническая манифестация синдрома системного воспалительного ответа (ССВО). Степень тяжести больных определяли по международным шкалам APACHE-II и SAPS. В целом по группе средний балл по АРАСНЕ-И составил 6,2 ± 0,4, а по шкале SAPS — 8,5 ± 0,4 баллов, что позволяло прогнозировать вероятную летальность на уровне 14,7 ± 1,2% (в подгруппах больных с сепсисом (п = 68) и с тяжелым сепсисом (п = 18) уровень прогнозируемой летальности варьировал от 17 до 25 %).

Клинические исследования по оценке эффективности Ронколейкина в комплексном лечении больных с ГХП проводились по разработанному протоколу в дизайне рандомизированных, двойных-слепых, плацебо-контро-лируемых клинических испытаний. Курс цитокинотерапии включал две подкожные инъекции Ронколейкина (по 500 000 Ед, 1 раз/день, с интервалом в 3 дня), либо плацебо (идентичный препарат, который в своем составе содержит только наполнитель и стабилизатор в отсутствии рИЛ-2). Основным критерием эффективности Ронколейкина являлось отсутствие летального исхода в течение 28 дней после окончания цитокинотерапии. Дополнительными критериями служила коррекция иммунодепрессии и регрессия эндотоксикоза в течение 3—5 дней после окончания лечения Ронколейки-ном. По разработанному протоколу было пролечено 50 больных в основной клинической группе и 50 человек в группе-плацебо. Исследуемые группы,

сформированные на основе критериев включения/исключения, были однородны по полу и возрасту больных, по локализации первичного очага инфекции, по структуре клинических синдромов сепсиса, по степени тяжести больных и уровню прогнозируемой летальности.

Клинико-лабораторное обследование проводилось по стандартным схемам с оценкой объективного состояния больного и общепринятых лабораторных показателей. По результатам общего анализа крови рассчитывались интегральные показатели интоксикации: абсолютный лимфоци-тоз (AJ1) и лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) по сокращенной формуле. Определение у больных степени выраженности эндотоксикоза проводилось по совокупности клинико-лабораторных данных на основе схемы, предложенной Рябцевым В.Г. (1990).

Иммунологические исследования. Для разных целей из венозной цельной или гепаринизированной крови выделяли стандартными методами лей-ковзвесь, сыворотку, мононуклеарные клетки (МНК). МНК в концентрации 0,1х106/лунку культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах в полной культуральной среде RPMI-1640 (Sigma) при 37°С в С02-ин-кубаторе. Для стимуляции клеток использовали конканавалин А (КонА, 15 мкг/мл, Sigma). Интенсивность пролиферации оценивали через 72 ч по включению 3Н-тимидина(1 цКю/лунку), добавленного за 18 ч до окончания культивирования. В культурах МНК оценивали также интенсивность спонтанной и КонА-индуцированной продукции ИЛ-2 (через 48 ч в биотесте, используя лимфобластные клетки здоровых доноров (п = 2-3), активированные фитогемагглютинином в течение 6 сут).

Методом проточной цитофлюориметрии (FACS, Becton Dickinson), используя соответствующие моноклональпые антитела (ЗАО «Сорбент-сервис», Москва), определяли содержание различных субпопуляций лимфоцитов (CD3", CD4+ и С08+Т-лимфоцитов, С020ьВ-лимфоцигоп), а также относительное количество моноцитов, высоко экспрессирующих HLA-DR антигены, и средний уровень экспрессии (mean fluorescence, MF) HLA-DR-мо-лекул на моноцитах.

Методом проточной цитофлюориметрии определяли также процентное содержание апоптотических клеток (лимфоцитов, нейтрофилов, моноцитов), которые вследствие фрагментации ДНК формируют характерный гиподиплоидный пик при окрашивании пропидиум иодидом (Sigma, 50 мкг/мл). Уровень апоптоза оценивали среди свежевыделенных клеток лейковзвеси, а также среди лимфоцитов, культивированных in vitro в течение 24 ч в безмитогенной среде (спонтанный апоптоз) или при стимуляции КонА (активационно-индуцированный апоптоз).

Наличие в сыворотке больных иммуносупрессорной активности определяли по степени снижения КонА-индуцированной пролиферации МНК доноров (п = 2-3) в присутствии 10% интактной сыворотки больных (опыт) в сравнении с уровнем митогенного ответа в присутствии 10% интактной сыворотки доноров (контроль). Полученные результаты выражали в виде индекса супрессорной активности (ИСА), рассчитанного по следующей формуле: ИСА - О : К. О суммарной активности эндогенных медиаторов воспаления в сыворотке больных судили по величине индекса воспалительной активности (ИВА). Сущность метода заключается в том, что в лейковзвеси здоровых доноров (п = 2-3), инкубированной в течение 45 мин с интактной сывороткой больных (опыт) или доноров (контроль) в объемном соотношении 1 : 1 определяют активность нейтрофилов по продукции перекиси водорода (Н202). ИВА высчитывали по формуле: ИВА - СИ К.

Концентрацию цитокинов (ФНО-а, ИЛ-8, ИЛ-4, ИЛ1-РА) в сыворотке крови определяли с помощью иммуноферментного анализа (тест-системы производства ООО «Цитокин», г. Санкт-Петербург). При проведении иммунологических исследований группу сравнения составили 75 доноров крови, представленных лицами обоего пола в возрасте от 18 до 50 лет.

Математическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной , и непараметрической статистики с использованием программы «STATISTICA 5,0». Для расчета биостатистических показателей использовали рекомендации McQuay H.J. & Moore R.A. (1997).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка исходного состояния иммунитета (табл. 1) показала наличие у больных с ГХП лабораторных признаков вторичного иммунодефицита в виде: достоверного снижения относительного количества HLA-DR-позитивных моноцитов и уровня экспрессии на них HLA-DR-молекул; интенсивности спонтанной и митоген-индуцированной пролиферации и продукции ИЛ-2; усиления апоптоза свежевыделенных лимфоцитов и нейтрофилов, а также уровня спонтанного и активационно-индуциро-ванного апоптоза лимфоцитов в культуре in vitro.

Таблица 1

Сравнительная оценка показателей иммунитета у больных с ГХП

Показатель Доноры Больные

1 2 3

HLA-DRh!ghMOHouHTbi (%) 44 ±2,0 (30 — 58) 28 ±1,0 **

Уровень экспрессии HLA-DR на моноцитах (MF) 291 ±32 (190 — -403) 129 ± 10 **

1 2 3

Пролиферация (имп/мин): Спонтанная КонА-индуцированная 2430 ±215 (1550 — 2980) 58330 ± 3990 (24000 — 71640) 1750 ±66 ** 26540 ±2030 **

Продукция ИЛ-2 (Ед/мл): Спонтанная КонА-индуцированная 4,4 ± 0,8 (0 — 8) 75 ± 3 (66 — 89) 0,8 ±0,1 ** 43 ±5 **

Аноптоз лимфоцитов (%): Спонтанный КонА-индуцированный 6,5 ±0,6(4,5 — 8,5) 9,4 ± 1,2 (5 — 12) 14,8 ± 1,1 ** 17,2 ± 1,0 **

Апоптоз лимфоцитов (%): 4 ±0,6 (2—10) 11,6 ± 1,0 **

Апоптоз нейтрофилов (%): 7,5 ±1,0(2 —18) 20 ±2,1 **

Примечания: ** — ри < 0,01, достоверность различий показателей больных (п = 98) с группой здоровых доноров (п = 13-75) (р[; — непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). Данные представлены в виде М ± Б.Е. В скобках — диапазон нормативных значений.

Следует отметить, что значительная часть обследованных больных характеризовалась наиболее глубокими изменениями показателей иммунитета, т.е. такими изменениями, при которых регистрируемые параметры выходили за установленную границу нормативного диапазона. Так, например, абсолютная лимфопения (<1,44 х 109/л), низкое содержание СОЗ+Т-клеток (<0,94 х 109/л), угнетение митогенной реактивности (<24000 имп/мин) обнаруживались у 47, 42 и 50% больных соответственно. Критическое снижение КонА-индуцированной продукции ИЛ-2 (<66 Ед/мл) и количества НЬЛ-ОЯ-позитивных моноцитов (<30%) регистрировались соответственно в 86 и 65% случаев. Высокий уровень апоптоза нейтрофилов (>18%) и лимфоцитов (>10%) выявлялся у 45 — 50% пациентов.

Нарастание иммунодепрессии ассоциировалось с тяжестью гнойно-септического процесса, поскольку у больных с клинической манифестацией ССВО (особенно, в случае развития ПОН) регистрировалось достоверное снижение уровня экспрессии НЬЛ-БЯ молекул на моноцитах, угнетение митогенной реактивности клеток, а также усиление апоптоза лимфоцитов и нейтрофилов по сравнению с пациентами, у которых не обнаруживались клинико-лабораторные признаки системной воспалительной реакции.

Сопряженность иммунодепрессии с манифестацией и прогрессией ССВО позволила предположить, что иммунная недостаточность во многом является следствием несбалансированного развития системного противовоспалительного ответа, индуцированного медиаторами воспаления. Для проверки этого предположения на следующем этапе работы планировалось оценить баланс про- и противовоспалительных медиаторов и опре-

делить возможную взаимозависимость между изменениями цитокинового баланса с выраженностью иммуносупрессии.

Учитывая, синергизм и плеотропность действия цитокинов [Кетлинский С.А., и др., 1992; Черных Е.Р. и др., 2001], а также существенное влияние на их активность аллельного полиморфизма генов [Mira J-P., et al., 1999], для лабораторной диагностики баланса между оппозитными группами медиаторов была апробирована оценка биологической (воспалительной и супрессорной) активности сыворотки крови.

Сравнительный анализ биоактивности сыворотки здоровых доноров и больных с ГХП показал, что у пациентов (68% из которых характеризовались клиническими проявлениями системного воспалительного ответа) средние значения ИВА сохранялись на уровне нормы, и их сыворотки отличались выраженной супрессорной активностью (табл. 2).

Таблица 2

Биологическая активность и концентрация цитокинов в сыворотке крови здоровых доноров и больных с ГХП

Доноры Больные М± SE (п)

Показатель M±SE(n) Доверительный диапазон

ИСА (расч.ед.) 0,95 + 0,04 (21) 0,8—1,05 0,75 ± 0,03 ** (98)

ИВА (расч. ед.) 1,57 ± 0,09 (46) 1,04 — 2,0 1,42 ±0,07 (98)

ФНО-а (пкг/мл) 39 ±8 (10) 20 — 58 97 ± 10** (49)

ИЛ-8 (пкг/мл) 29 + 10 (10) 0 — 42 44 + 27 (49)

ИЛ-4 (пкг/мл) 46 ± 17 (10) 0—80 64 + 8 (49)

ИЛ 1-РА (пкг/мл) 220 + 57 (10) 0 — 270 1312 ± 136** (49)

ШП-РА/ФНО-а 6+1,8 (10) 2—10 19,2 + 3,0 ** (49)

Примечания: Доверительный диапазон для ИСА/ИВА и для цитокинов включает соответственно 50% и 90% донорской выборки. ** — ри < 0,01, достовер-. ность различий показателей больных но сравнению с донорами.

При измерении сывороточного уровня цитокинов было установлено, что в целом по группе больных определяется достоверное увеличение концентрации как ФНО-о, так и рецепторного антагониста ИЛ-1. Однако более чем 3-кратное увеличение соотношения ШП-РА/ФНО-о: у больных с ГХП по сравнению с донорами свидетельствовало о смещении цитокинового баланса преимущественно в сторону противовоспалительных медиаторов.

Несмотря на выявленное в целом по группе больных преобладание супрессорной активности анализ индивидуальных значений ИСА/ИВА позволил раз-

делить пациентов на 4 подгруппы (табл. 3). В первой подгруппе (п= 15) воспалительная активность была максимальной и при этом совсем не обнаруживалась супрессорная активность. Сыворотки больных второй подгруппы (п = 45), напротив, характеризовались наличием выраженной супрессорной и отсутствием воспалительной активности. В третьей подгруппе (п = 9) в сыворотках больных одновременно обнаруживались и воспалительная, и супрессорная активности. В четвертой подгруппе (п = 29) биоактивность сыворотки больных на момент обследования сохранялась в грагапдах нормативного диапазона.

Таблица 3

Концентрация цптокинов у больных с различной биоактивностыо

сыворотки

Показатель Подгруппа № 1 (ИВА>2,0 и ИСА>0,8) Подгруппа № 2 (ИСА<0,8 и ИВЛ<2,0) Подгруппа № 3 (ИВА>2,0 и ИСЛ<0,8) Подгруппа №4 (ИВА<2,0 и ИСА>0,8)

ИСА (расч.ед.) 1,05+0,04 0,47 ± 0,03 0,57 ± 0,08 1,07 ±0,03

ИВА (расч. ед.) 2,38 + 0,07 0,92 ±0,05 2,38 ±0,17 1,40 ±0,07

ФНО-о( (икг/мл) 99 ±27 100 ± 16 93 ±34 94 ± 19

ИЛ-4 (пкг/мл) 22 + 14 78 ± 10 * 87 ±31 56 ± 14

ИЛ1-РА(пкг/мл) 1374 +419 1600 ±206 * 1372 ±302 812 ±228

ИЛ 1 -РА/ФНО-а 13 ±3,3 25 ± 5,9" 26 ± 9,4 10,2 ±2,2

ФНО-оЛШ-4 11,4 ±4,0* 4,2 ± 2,6 * 10,2 ±7,2 5,9 ±3,0

Примечания: * и # — Ри < 0,01 отмечены достоверные различия концентрации цитокинов у больных с доминирующей супрессорной активностью по сравнению с больными с доминирующей воспалительной и с нормальным уровнем биоактивности сыворотки, соответственно.

Сравнительная оценка сывороточного уровня цитокинов показала, что в подгруппе 2 у больных с доминирующей супрессорной активностью концентрация ИЛ-4 и ИЛ1-РА была достоверно вьнпе, чем у больных с доминирующей воспалительной активностью (подгруппа 1) или с нормальным уровнем биоактивности сыворотки (подгруппа 4), соответственно. При этом только у больных с выраженной супрессорной активностью сыворотки, которая обнаруживалась либо в изолированном (подгруппа 2), либо в смешанном варианте (подгруппа 3), регистрировалось значительное увеличение соотношения ИЛ1 -РА/ФПО-о; свидетельствующее о смещении цито-кинового баланса в сторону противовоспалительных медиаторов.

В отличие от рецепторного антагониста ИЛ-1 концентрация ФНО-а достоверно не различалась в зависимости от варианта биоактивности сыворотки.

Поэтому проявление воспалительной активности сывороток у больных 1 подгруппы ассоциировалось не столько с повышением абсолютного уровня ФНО-о; сколько с достоверным увеличением соотношения ФНО/ИЛ-4.

Выявленная сопряженность изменений биоактивности сыворотки крови с концентрацией и/или соотношением про- и противовоспалительных медиаторов подтверждает адекватность использования показателей су-прессорной и воспалительной активности в качестве интегральных параметров, отражающих состояния цитокинового баланса у больных с ГХП.

Проведенный корреляционный анализ показал, что величина ИВА и ИСА у больных с хирургической инфекцией находятся в прямой корреляционной зависимости (rs= 0,28; р<0,01). Концентрация ФНО-аи ИЛ1-РА в сыворотке крови больных также была тесно взаимосвязана (rs=0,42; р<0,01), при этом уровень ФНО-а ассоциировался со степенью тяжести больных, оцениваемой по шкалам APACHE-II (rs = 0,52; р<0,01) или SAPS (rs= 0,36; р<0,05), тогда как ИЛ1-РА — с величиной СОЭ (rs= 0,52; р<0,01) и некоторыми биохимическими показателями (концентрацией креатинина (rs = 0,65; р<0,01) и мочевины (rs = 0,35; р<0,05) в плазме крови).

Клиническая манифестация и профессия ССВО сопровождалась появлением и достоверным усилением супрессорной активности, а также увеличением (с 35,5 до 70,6%, Ртмф= 0,01) доли пациентов с доминирующей супрессорной активностью сыворотки. Поскольку концентрация ФНО-а и ИЛ1-РА у больных с различной выраженностью системной воспалительной реакции достоверно не отличалась, можно полагать, что оценка биологической активности сыворотки крови более адекватно отражает тяжесть инфекционного процесса, чем определение содержания отдельных цитокинов.

Чтобы оценить вклад противовоспалительных медиаторов в развитие иммунных дисфункций, был проведен сравнительный анализ параметров иммунитета в группах больных, оппозитных по уровню супрессорной активности сыворотки.

Таблица 4

Сравнительная характеристика иммунных нарушений у больных с различной выраженностью супрессорной активности сыворотки

Показатель Группы больных с ГХП

ИСА > 0,8 (п = 44) ИСА < 0,8 (п = 54)

1 2 3

ИСА (расч.ед.) 1,07 + 0,02 0,48 + 0,03 **

ШИ-РА/ФНО-а 11,2± 1,8 25,1 +4,9 **

СОЗ'Т-клетки (х 10%) 1,22 ±0,09 1,06 ±0,09*

1 2 3

Экспрессия HLA-DR на моноцитах (MF) 150+ 14 116 ± 8 *

КонА-пролиферация (имп/мип) 33320 + 3310 21020 + 2280 **

ИВконА 19,4 ± 1,9 13,4 ± 1,4**

Апонтоз лимфоцитов (%):

Спонтанный 12+ 1,0 17+ 1,7 *

КонА-индуцированный 15 ± 1,3 19+ 1,5 *

Примечания: * и ** —ри < 0,05 и < 0,01 соответственно

Из данных таблицы 4 видно, что у больных с выраженной супрессор-ной активностью (ИСЛ < 0,8расч. ед.) средние значения абсолютного количества СОЗ+Т-лимфоцитов, экспрессии HLA-DR молекул на моноцитах, КонА-индуцированиой пролиферации были достоверно ниже, а уровень спонтанного и активационно-индуцированного апоптоза лимфоцитов — достоверно выше, чем у пациентов оппозитной группы. Кроме того, анализ частоты развития абсолютной Т-лимфопении и митогенной ареактив-ности Т-клеток в их изолированном виде и в комбинированном варианте показал, что более тяжелые, сочетанные иммунные нарушения регистрировались в 2,7 раза чаще именно у больных с выраженной супрессорной активностью сыворотки (43 vs 16%, Рх2 = 0,004). Следовательно, появление и нарастание супрессорной активности в сыворотке крови, обусловленное действием противовоспалительных медиаторов, ассоциируются с развитием более выраженных иммунных дисфункций у больных с ГХП. Полученные данные обосновывают целесообразность проведения имму-нокорригирующей терапии, направленной на ослабление супрессорного действия эндогенных противовоспалительных медиаторов и смещение баланса в сторону цитокинов с иммуностимулирующей активностью.

С этой целью было предложено использовать рекомбинантный ИЛ-2 человека (препарат Ронколейкин) Включение Ронколейкина в программу комплексного лечения больных с ГХП сопровождалось клиническим улучшением в 74% случаев (табл. 5), что проявлялось 2-кратным снижением среднего балла по шкалам APACHE-II и SAPS. У 68% больных регистрировалось также ослабление степени тяжести эндотоксикоза в виде обрыва лихорадки, нормализации гемодинамики, достоверного снижения лейкоцитоза, лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ), увеличения относительного и абсолютного количества лимфоцитов, улучшения биохимических показателей крови (табл. 6).

Таблица 5

Эффективность иммунотерапии Ронколейкином

«Плацебо» «Ронколейкин»

п = 50 п = 50

Клинический эффект:

Улучшение 32% 74% 0,0001

Без эффекта 42% 18%

Ухудшение 26% 8%

Детоксикационнын эффект:

Улучшение 48% 68% 0,04

Без эффекта 34% 24%

Ухудшение 18 % 8%

Иммумокорригирующий эффект: N=24 14=26

Улучшение 8% 61,5%

Без эффекта 50% 31 % 0,0001

Ухудшение 42 % 7,5 %

В целом по группе:

Прогнозируемая летальность 14,9 ±1,7 14,5 ± 1,8

Фактическая летальность 12% 2% 0,05

Подгруппа с сепсисом: N=33 N=35

Прогнозируемая летальность 17,1 ±2,1 17,3 ±2,1

Фактическая летальность 18% 3% 0,04

Подгруппа с тяжелым сепсисом: N=9 N=9

Прогнозируемая летальность 25,4 ±2,5 24,7 ± 2,3

Фактическая летальность 44,5 % 11 % 0,14

В группе-плацебо клинический эффект обнаруживался достоверно реже— только в 32% случаев (Р^2 = 0,000!), тогда как у остальных пациентов либо вообще не отмечалось заметной клинической динамики, либо она была отрицательной. При оценке лабораторных показателей в целом по группе регистрировалось умеренное снижение среднего бала по шкале SAPS, лейкоцитоза и ЛИИ, а также увеличение относительного количества лимфоцитов.

Цитокинотерапия Ронколейкином характеризовалась не только де-токсикационным эффектом, но и выраженным иммунокорригирующим действием. Из данных таблицы 5 видно, что у 61,5% больных основной клинической группы очень быстро, т.е. уже через 3—4 дня после завершения иммунотерапии, происходила коррекция измененных показателей иммунитета. В то же время, в группе-плацебо в большинстве случаев при повторном иммунологическом обследовании регистрировалось или

отсутствие какой-либо динамики (у 50% больных), или дальнейшее снижение параметров иммунитета (у 42% больных).

Таблица б

Динамика лабораторных показателей при проведении иммунотерапии

Показатель «Плацебо» (п - 50) «Ропколейкин» (п 50)

До лечения После лечения До лечения После лечения

APACHE II 6,2 ± 0,5 5,4 ± 0,5 6,3 ± 0,6 3,1 ±0,4 **

SAPS 8,5 ± 0,5 6,8 ± 0,6 * 8,4 ± 0,6 4,5 ±0,4 **

Лейкоцитоз (х 1 0'7л) 11,4 ± 1,0 9,4 ± 0,6 * 12,6± 1,0 8,8 ±0,5 **

Лимфоциты (%) 13,5 ± 1,3 21,5 ± 1,3 ** 12,8 ± 1,0 21,7 ± 1,2 **

Лимфоциты (х105/л) 1,7 ±0,2 1,8 ±0,1 1,4 ±0,1 1,8 ±0,1 **

ЛИИ (расч. ед.) 5,8 ±0,6 3,6 ±0,6** 7,2 ±1,1 3,2 ±0,4 **

Общий белок (г/л) 62 ± 1,5 65 ± 1,3 63 ± 1,5 68 ± 1,4 **

О. Билирубин (мкмоль/л) 16,5 ±3,8 17,2 ±5,6 13,5 ± 1,0 10 ±0,5 **

Примечания: * — ри < 0,05; ** — р1; < 0,01; достоверность различий показателей до и после проведения иммунотерапии в оппозитных подгруппах больных

Иммунокорригирующий эффект цитокинотерапии особенно четко проявлялся при сравнении больных из оппозитных подгрупп с исходно сниженными параметрами иммунитета, т.е. с абсолютной Т-лимфопенией и низкой ми-тогенной реактивностью Т-клеток (табл. 7). Видно, что только на фоне применения Ронколейкина, но не препарата-плацебо у больных происходит достоверное увеличение абсолютного количества основных субпопуляций Т-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8'Т-клеток). Отмечается положительная динамика не только количественных, но и функциональных параметров. При этом регистрируется достоверное усиление пролиферативного ответа Т-кле-ток на митоген, а также 2-кратное снижение уровня спонтанного и активаци-онно-индуцированного апоптоза лимфоцитов в культуре in vitro.

Таблица 7

Динамика показателей иммунитета при проведении иммунотерапии у больных с комбинированными Т-клсточными дисфункциями

Показатель «Плацебо» п = 15 «Ронколейкин» п= 15

До лечения После лечения До лечения После лечения

1 2 3 4 5

СОЗ-Тклетки (х107л) 0,50 ± 0,04 0,63 ±0,14 0,50 ± 0,05 1,17 ±0,2 **

СП4-Тклетки(хЮ"/л) 0,30 ± 0,02 0,24 ± 0,07 0,31 ±0,03 0,72 ±0,1 **

CDS-Тклетки (хЮ'/л) 0,18 ±0,02 0,15 ±0,08 0,16 ±0,01 0,47 ±0,1 **

1 2 3 4 5

КонА-пролиферация (имп/мин) 11620 ± 1730 14220± 2190 14200±1650 31720± 3980 **

Апоптоз лимфоцитов(%) Спонтанный КонА-индуцированный 16,5 ±2,7 18,8 ±2,0 17,5 ±3,7 23,1 ±4,2 16,3 ±1,8 19,0 ±2,1 7,1 ±0,9** 10,9 ± 1,7 **

Примечания: ** •— ри < 0,01; достоверность различий показателей до и после проведения цитокинотерапии

В итоге, при практически равных значениях прогнозируемой летальности фактическая 28-суточная летальность в группе-плацебо составила 12% (табл. 5), тогда как использование Ронколейкина позволило снизить уровень летальности больных в целом по группе до 2% (Рх2 = 0,05), в том числе в подгруппе больных с хирургическим сепсисом с 18 до 3% (РТМф = 0,04) и в подгруппе больных с тяжелым сепсисом, осложненным развитием полиорганных дисфункций, с 44,5 до 11% (Ртмф = 0,14).

Высокая эффективность Ронколейкина в комплексном лечении больных с ГХП подтверждается также результатами биостатистического анализа. Из представленных в таблице 8 показателей наиболее демонстративным является ЧБНЛ, который в целом по группе оказался равным 10, а для больных с хирургическим сепсисом или с тяжелым сепсисом 6,6 и 3,0 соответственно, что свидетельствует о значительно более высокой эффективности Ронколейкина при лечении пациентов с тяжелыми и генерализованными формами хирургической инфекции.

В заключении необходимо еще раз подчеркнуть, что основой патогенеза гнойно-септических заболеваний и осложнений является запуск ци-токинового каскада. Именно поэтому воздействия, направленные на регуляцию баланса про- и противовоспалительных медиаторов, рассматриваются в настоящее время в качестве новых терапевтических стратегий в лечении гнойно-хирургической патологии.

Таблица 8

Биостатистические показатели эф( активности Ронколейкина

Показатель Ронколейкин Плацебо

1 2 3

Размер группы, п 50 50

Число умерших больных, п 1 6

Риск летального исхода 0,02 (2 %) 0,12(12%)

Относительный риск (ОР) 0,16

1 2 | 3

Снижение относительного риска (СОР) 0,84 (84 %)

Снижение абсолютного риска (САР) 0,1(10%)

ЧБНЛ (95% ДИ)

В целом но группе 10,0(4,5 — 50)

В подгруппе больных с сепсисом 6,6(3,1 —25)

В подгруппе больных с тяжелым сепсисом 3,0(1,5 — 20)

Примечания:

Относительный риск (ОР) — отношение частоты изучаемого исхода в группе лечения к его частоте в группе контроля. Значения ОР от 0 до 1 соответствуют снижению риска, более 1 — его увеличению. ОР равный 1 означает отсутствие эффекта.

Снижение относительного риска (СОР) Значения СОР более 50% всегда соответствуют клинически значимому эффекту, от 25 до 50% — очень часто соответствуют клинически значимому эффекту.

Снижение абсолютного риска (САР) — разница в частоте изучаемых исходов между группами контроля и вмешательства.

ЧБНЛ — число больных, которых необходимо лечить определенным методом в течение определенного времени, чтобы достичь определенного эффекта или предотвратить неблагоприятный исход у одного больного (в скобках 95% доверительный интервал).

В этой связи, полученные нами данные, имеют большое значение, поскольку теоретически обосновывают необходимость включения в программу комплексного лечения больных с ГХП иммунокорригирующей терапии, направленной на ослабление иммуносупрессорного действия эндогенных противовоспалительных медиаторов и смещение баланса в сторону цито-кинов с иммуностимулирующей активностью. Адекватность предлагаемого подхода подтверждается результатами проведенных клинических испытаний, которые с позиций доказательной медицины свидетельствуют, что включение рИЛ-2 человека (препарата Ронколейкин) в программу комплексного лечения больных с гнойно-хирургической патологией характеризуется быстрым детоксикационным и иммунокорригирующим действием и позволяет значительно повысить эффективность проводимой терапии.

ВЫВОДЫ

1. Нарастание иммунной недостаточности на фоне развития и прогрессии синдрома системного воспалительного ответа у больных с гнойно-хирургической патологией, обусловленное смещением цитокинового баланса в сторону противовоспалительных медиаторов, является патогенети-

ческим обоснованием включения в комплексную программу лечения хирургических инфекций цитокинов с иммуностимулирующей активностью.

2. Клиническая манифестация и утяжеление синдрома системного воспалительного ответа у больных с ГХП сопровождается нарастанием иммунной недостаточности, что проявляется более выраженным снижением уровня экспрессии HLA-DR молекул на моноцитах, пролифератив-ной активности мононуклеарных клеток в КонА-стимулированных культурах и усилением апоптоза лимфоцитов и нейтрофилов, чем у пациентов без признаков системного воспаления.

3. Изменение биологической активности сыворотки крови у больных с ГХП обусловлено изменением уровня и соотношения медиаторов с про- и противовоспалительной активностью, о чем свидетельствует достоверное увеличение концентрации ИЛ-4 и ИЛ-1РА, а также отношения ИЛ-1РА/ФНО-а у больных с доминирующей супрессорной активностью сыворотки и увеличение индекса соотношения ФНО-о/ИЛ-4 у пациентов с преобладающей воспалительной активностью сыворотки.

4. Развитие и профессия синдрома системного воспалительного ответа ассоциируется со смещением цитокинового баланса в сторону доминирования противовоспалительных медиаторов, что проявляется достоверным увеличением средних значений индекса супрессорной активности сыворотки и доли пациентов с выраженной иммуносупрессорной активностью по сравнению со здоровыми донорами и пациентами без клинических проявлений системного воспаления.

5. Применение рекомбинантного ИЛ-2 человека (препарата Ронко-лейкин) в комплексном лечении больных с ГХП характеризуется клинически значимым эффектом, что по сравнению с препаратом-плацебо проявляется достоверным снижением тяжести состояния больного по шкалам АРАСНЕ-И и SAPS, регрессией эндотоксикоза, коррекцией иммуноде-прессии и уменьшением уровня 28-суточной летальности, в том числе, у больных с хирургическим сепсисом.

6. Включение Ронколейкина в программу лечения больных с ГХП не приводит к эскалации системной воспалительной реакции, поскольку на фоне иммуностимулирующей терапии ослабление супрессорной активности не сопровождается нарастанием воспалительной активности сыворотки крови и усилением клинико-лабораторных проявлений системного воспалительного ответа.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Чудакова В.А., Шамрай H.A., Марамыгина Т.М., Осташевский P.A., Кузнецов В.Е., Попов В.Б., Николаев В.Ю., Агеев Н.Л., Бачурина К.С. Новые методики лечения сепсиса и их обоснование. // Сборник научно-практических работ по материалам МКБ № 1 «Актуальные вопросы медицины. Том 4».— Новосибирск, 2000.— С. 61—63.

2. Чудакова В.А., Шамрай H.A., Кузнецов В.Е., Попов В.Б., Николаев В.Ю., Агеев Н.Л.. Бачурина К.С. Редкое осложнение желчнокаменной болезни // там же.— С. 165—166.

3. Тихонова М.А., Овечкин A.B., Агеев Н.Л., Стрельцова Е.И., Лепли-на О.Ю., Черных Е.Р., Останин A.A. Биологическая активность сыворотки крови больных с хирургическим сепсисом // Мед. иммунология,—2001,—Т. 3, № 2,—С. 153—154.

4. Леплина О.Ю., Агеев Н.Л., Овечкин A.B., Захарова Н.Ф., Стрельцова Е.И., Черных Е.Р., Останин A.A. Характеристика иммунных нарушетш у больных с гаойно-хирургической патологией // там же.— С. 197—198.

5. Агеев Н.Л., Шамрай H.A., Овечкин A.B., Захарова Н.Ф., Стрельцова Е.И., Леплина О.Ю., Черных Е.Р., Останин A.A. Ронколейкин в лечении больных с гнойно-хирургической патологией: предварительные результаты рандомизированных, двойных-слепых, плацебо-контроли-руемых клинических испытаний // там же.— С. 301.

6. Чудакова В.А., Шамрай H.A., Осташевский P.A., Марамыгина Т.М., Кузнецов В.Е., Попов В.Б., Николаев В.Ю., Агеев Н.Л., Бачурина К.С. Сепсис — как решаемая проблема // Актуальные вопросы современной медицины.— Новосибирск, 2001.— С. 271—272.

7. Агеев Н.Л.. Шамрай H.A., Леплина О.Ю., Черных Е.Р., Останин A.A. Клиническая и иммунокорригирующая эффективность ронколейкина при лечении хирургических инфекций. II Сборник научно-практических работ по материалам МКБ № 1 «Актуальные вопросы медицины. Том 5».— Новосибирск, 2001.— С. 74—75.

8. Леплина О.Ю., Агеев Н.Л., Тихонова М.А., Шамрай H.A., Черных Е.Р., Останин A.A. Особенности иммунного статуса у больных с гнойно-хирургической патологией // там же.— С. 76—77

9. Останин A.A., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Агеев Н.Л., Стрельцова Е.И., Овечкин A.B., Черных Е.Р. Иммунологическая оценка синдрома системного противовоспалительного ответа у больных с хирургическим сепсисом // Клиническая иммунология в практическом здравоохранении.— Барнаул, 2002.— С. 18—29.

10. Останин A.A., Агеев H.JL, Зайнутдинов Ю.Г., Стрельцова Е.И., Овсч-кин A.B., Шустова И.К., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Черных Е.Р. Эффективность цитокинотерапии рекомбинантным интерлейкином-2 при лечении больных с хирургическим сепсисом // там же.— С. 30—41.

11. Останин A.A., Зайнутдинов Ю.Г., Стрельцова Е.И., Овечкин A.B., Агеев Н.Л., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Черных Е.Р. Хирургический сепсис. II. Эффективность иммунотерапии рекомбинантным интерлейкином-2 // Вест. Хирургии.— 2002.— № 4. (принята в печать)

12. Останин A.A., Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Овечкин A.B., Агеев Н.Л., Захарова Н.Ф., Стрельцова Е.И. Применение рекомбинантного шггерлейкина-2 человека «Ронколейкина» в лечении хирургических больных с гнойно-септическими заболеваниями и осложнениями// Методические рекомендации МЗ РФ, Новосибирск, 2001.—24 с.

13. Останин A.A., Черных Е.Р., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Овечкин A.B., Агеев Н.Л.. Захарова Н.Ф., Стрельцова Е.И. Эффективность цитокинотерапии Ронколейкином в комплексном лечении хирургической инфекции // Пособие для врачей, Новосибирск, 2001.— 29 с.

Подписано в печать 10.04.2002. Формат бумаги 60x84/16 Бумага офсетная. Печать Riso. Гарнитура Times New Roman Cyr. Уч.-изд. л. 1,1. Усл. п. л. 1,2. Тираж 10Q. Заказ №«¿QO 630102, г. Новосибирск, ул. Нижегородская, 6, СибАГС

i ь