Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Анальгетическая актвиность новых лигандов протон-чувствительных ионных каналов

На правах рукописи

ООЗОбаа(г

ЛИТАСОВА Елена Викторовна

АНАЛЬГЕТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НОВЫХ ЛИГАНДОВ ПРОТОН-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2007

003068577

Работа выполнена в Отделе нейрофармакологии им. С.В.Аничкова ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург (директор - академик РАМН Ткаченко Борис Иванович).

Научный руководитель:

доктор биологических наук Левон Борисович Пиотровский

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, Эдуард Петрович Зацепин

доктор биологических наук, Анатолий Иванович Бислобоков

Ведущее учреждение:

Российская Военно-Медицинская Академия им С.М.Кирова.

Защита диссертации состоится г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д 208.030.01 ФГУН Института токсикологии ФМБА России по адресу: 193019, Санкт-Петербург, ул. Бехтерева, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГУН Института Токсикологии ФМБА России.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук

Т.Н. Саватеева-Любимова.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Неотъемлемым компонентом многих патологических состояний является боль, которая не только тяжело переносится сама по себе, но и, несомненно, ухудшает течение основного заболевания. Можно без преувеличения утверждать, что проблема борьбы с болью занимает одно из центральных мест в современной медицине и является актуальной проблемой фармакологических исследований. В настоящее время эта проблема интенсивно изучается, что характеризуется чрезвычайно быстрым появлением новых данных, концепций, теорий. Сейчас уже можно довольно детально представить морфофункциональную, нейрофизиологическую и нейрохимическую организацию различных звеньев и процессов формирования и регуляции болевой чувствительности [Прощаев К.И. и др., 2006].

Анапьгетические препараты используются для подавления боли и являются одной из важнейших групп лекарственных веществ. В зависимости от механизма действия они подразделяются на два класса: наркотические и ненаркотические. Наркотические анальгетики обладают более выраженным эффектом, но вызывают лекарственную зависимость - наркоманию. Ненаркотические не вызывают привыкания, но имеют более слабый анальгетический эффект и весьма часто оказывают негативные побочные действия на ЖКТ, вызывают заболевания крови. При длительном применении ненаркотических анальгетиков возникают различные формы поражения печени и почек [Бурбелло А.Т. и др., 2004] Очевидно, что круг применяемых на данный момент анапьгетических средств явно недостаточен, необходимо пополнять арсенал лекарств, имеющихся в наличии, для того чтобы иметь набор препаратов выбора. Разработка новых анапьгетических препаратов является одной из важных и неотложных задач современной фармакологии и химии лекарственных веществ.

При болезнях, сопряженных с хронической болью, таких как воспаление, сердечная ишемия, опухолевый рост, обычно возникает ацидоз тканей. Известно, что ацидоз тканей сопряжен с активацией протон-чувствительных ионных каналов {ASICs (Acid Sensing Ion Channels)} [Krishtal O.A. et.al., 1981]. Они широко распространены как в центральной, так и в периферической нервной системе. Функции этих каналов до сих пор не изучены до конца, однако их связь с болью не вызывает сомнения, так как практически любые метаболические нарушения, также как и повреждения, приводят к закислению тканей [Mamet J., 2002]. Поэтому протон-чувствительные ионные каналы представляются новой мишенью для терапии боли. В связи с этим поиск соединений, действующих на эти каналы, чрезвычайно актуален и может привести к созданию новой группы анальгетиков. Цель исследования.

Целью работы явился поиск новых соединений, обладающих анальгетической активностью, механизм действия которых связан с влиянием на протон-чувствительные ионные каналы.

Задачи исследования.

1. Выявить особенности пространственного строения известных пептидных лигандов-модуляторов ASICs.

2. Построить трехмерную модель лигандов-модуляторов ASICs.

3. На основании предложенной модели синтезировать непептидные лиганды ASICs.

4. Определить анальгетическую активность новых соединений.

5. Установить зависимость связи структура-активность в ряду полученных соединений.

Научная новизна работы.

Впервые синтезированы два ряда новых соединений, являющихся лигандами протон-чувствительных ионных каналов и проявляющих анальгетическую активность, что указывает на возможность создания группы ненаркотических анальгетиков с новым механизмом действия.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Определена структура и построена трехмерная модель фармакофора лигандов протон-чувствительных ионных каналов.

2. Синтезированные соединения, содержащие гуанидиновую группировку, оказывают модулирующее действие на функционирование протон-чувствительных ионных каналов.

3 Лиганды-модуляторы протон-чувствительных ионных каналов проявляют

анальгетическую активность в экспериментах in vivo. 4. На основе лигандов-модуляторов протон-чувствительных ионных каналов

возможно создание новой группы ненаркотических анальгетиков. Научно-практическое значение работы.

Полученные данные расширяют представление о связи протон-чувствительных ионных каналов и болевых ощущений. Результаты работы свидетельствуют о перспективности непептидных модуляторов протон-чувствительных ионных каналов в качестве соединений-прототипов для создания высокоэффективных анальгетиков и могут быть использованы для разработки новой группы анальгетических препаратов класса ненаркотических анальгетиков. Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на VII региональном конгрессе европейского союза нейропсихофармакологов (Москва, 2005), Юбилейной конференции молодых ученых ГУ НИИЭМ РАМН (С-Пб, 2005), Научной конференции «Современные тенденции в органическом синтезе и проблемы химического образования» (С-Пб, 2005). Работа поддержана грантом INTAS 01-0651. Публикации.

По теме диссертации опубликовано 4 научных работы (из них две статьи в рецензируемых журналах). Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований и обсуждение,

выводы, список цитируемой литературы и приложение. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 27 рисунками и 28 таблицами. Библиографический список использованной литературы содержит 204 источника, из них 178 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные

Опыты in vivo проведены на 425 мышах-самцах линии DBA/2 весом 18-20 г. Животных получали из селекционной станции Рапполово (С.-Петербург). Мыши размещались по 10 особей в стандартных клетках и привыкали к условиям лаборатории в течение минимум 1 недели. Получали неограниченный доступ к пище (гранулированный корм) и воде в виварии с регулируемым световым режимом (12 ч свет с 8 ч утра / 12 ч темнота), температурой 22 1°С и влажностью 60%.

Вещества

Исследуемые соединения перед опытом растворяли в дистиллированной воде или (в случае плохой растворимости) в 1% растворе диметилсульфоксида и вводили внутримышечно (в мышцы бедра) в объеме 0.05 мл/10 г веса животного за 15 мин до введения уксусной кислоты. Контрольным группам животных внутримышечно вводили изотонический раствор NaCl или 1% раствор диметилсульфоксида в том же объеме.

Метод химического раздражения брюшины ("Writhing" test).

Метод химического раздражения брюшины (тест "корчей") заключается во внутрибрюшинном введении уксусной кислоты в концентрации 1% в объёме 0.1 мл/10 г веса животного. Регистрируют количество специфических ноцицептивных ответов типа "корчи", возникающих в ответ на введение химического раздражающего агента и проявляющихся характерными потягиваниями. Анальгетическое действие определяют по уменьшению количества "корчей" за период регистрации данной поведенческой реакции

Препараты вводят внутримышечно за 15 минут до введения кислоты. Контрольным группам вводят изотонический раствор.

Эффект препаратов был первоначально исследован в дозе 100 мг/кг и, при наличии достоверного анальгетического эффекта в этой дозе, проводилось изучение зависимости доза - анальгетический эффект с подсчётом среднеэффективной дозы (ЕД50)

Количественную оценку степени анальгезии осуществляли с помощью градуального критерия. В процессе обработки данные по анальгезии рассчитывались индивидуально для каждого животного экспериментальной группы, что позволяло получить параметры вариабельности в экспериментальной выборке. С помощью непараметрического однофакторного дисперсионного анализа (Kruskal-Wallis Test - Nonparametric ANOVA) выявлялась достоверность влияния фактора дозы исследуемого препарата. С помощью регрессионного анализа рассчитывалась средняя эффективная доза

(ЕДзо).

Компьютерное моделирование и конформационный анализ.

Конформационный анализ проводили с помощью программ HyperChem 6.0 (поле Amber) и PCModel (поле ММ2). Во всех случаях расчеты проводились при постоянной диэлектрической проницаемости £=78 (вода). С помощью опций "compute"-"QSAR properties"-"log Р" пакета HyperChem 6.0 рассчитана величина коэффициента распределения октанол/вода изучаемых веществ (clog Р).

Химический синтез

При синтезе соединений использовали следующие методы органической химии: ацилирование и амидирование, в том числе методом активированных эфиров, гуанидирование и каталитическое восстановление.

Спектры ПМР снимали на спектрофотометре "Bruker АМ-500". Рабочая частота для *Н 500 МГц, растворители: CDC13, D20 , DMSO, фосфатный буфер-D20.

ТСХ проводилось в системах: ХМУ [СНС13:МеОН:АсОН (9:1:0.1)], БУВА [Ви0Н:Ас0Н:Н20:ЕЮАс (4:1:1:1)], 2-БАМ [2-BuOH:NH4OH (5%) (5:2)], ЭГ [ЕЮАс:гексан (9:1)] на пластинах "Sorbfil UV-254": тип сорбента -силикагель СТХ-1А, зернение 5-17 мкм, толщина слоя 110 мкм, связующее -силиказоль, тип подложки - ПЭТ-Э.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Дизайн соединений, обладающих фармакологической активностью.

В настоящее время поиск новых лекарственных соединений осуществляют по следующим стадиям: выбор биологической мишени; теоретический анализ строения соединений, взаимодействующих с выбранной мишенью, с целью выявления основных фармакофорных групп и их пространственного расположения {in silico); синтез соединений: исследования активности новых соединений в опытах in vitro и in vivo (см. рис. 1).

Рис 1. Схема дизайна соединений, обладающих фармакологической активностью. В данном случае в качестве мишени выбраны протон-чувствительные ионные каналы для получения соединений, обладающих анальгетической активностью.

Прохождение этих стадий позволяет выделить соединение-прототип с заданной фармакологической активностью. В работе, как уже указывалось выше, в качестве мишени были выбраны протон-чувствительные ионные каналы - ASICs.

На основании данных о структуре и свойствах известных пептидных лигандов ASICs был проведен структурный и теоретический конформационный анализы, что позволило выделить основные фармакофорные группы, определяющие активность этих соединений, и предложить модель трехмерной структуры фармакофора.

Структурный анализ

Анализ литературных данных по структуре и активности различных пептидных лигандов ASICs показал, что ключевым фрагментом структуры молекул лигандов, определяющим активность, является плоская положительно заряженная (рКа=12.5) гуанидиновая группа аргинина. На С- и N- концах пептида должны быть липофильные аминокислоты. Для проявления активности необходима амидная группа на С-конце пептида, любая другая группа, а более всего карбоксильная, приводит к снижению активности. Появление в молекуле отрицательного заряда приводит к резкому снижению активности. Кроме того, во втором положении тетрапептида желательно наличие неразветвленной аминокислоты (см. рис. 2).

н3н—сн—с—м—сн—с—и—сн—с—н—сн—с—нн, I II II II Н CHj н сн3

I

СН;

I

СНз

£0б1н

Рис 2. Схема структуры фармакофора ASICs (на примере FMRFa.)

Теоретический конформационный анализ

Для проведения теоретического конформационного анализа и построения трехмерной модели лигандов ASICs в качестве основных объектов исследования были выбраны пептиды FMRFa и FnLRFa - агонисты, FLRFa -частичный агонист и FKRFa - антагонист протон-чувствительных ионных каналов.

Теоретический конформационный анализ позволил выделить определенные закономерности трехмерного строения пептидных лигандов ASICs.

Рис 3. Основные особенности трехмерного строения фармакофора ASICs на примере FVlRFa ([- гуанидиновая группа, 2 алкильная цепь аргининового остатка, 3 - липофнльное облако).

Результаты расчетов показали, что для всех пептидов наиболее энергетически выгодная конфирмация по энергии отличается от следующей более чем, на 0,5 кКал/моль.

Во всех наиболее энергетически выгодных кпн фор маниях исследуемых пептидов оба остатка фенилаланина (в первом и четвертом положении) и остаток аминокислоты во втором положении образуют липофнльное облако, из которого выступает положительно заряженная гуанидиновая группа аргинина, которая (как было сказано выше) является необходимой для проявления фармакологической активности (см.рис.3).

Агонистическая активность исследуемых соединений меняется в зависимости от вытянутости алкильной цепочки. У антагониста алкильная цепочка (расстояние от гуанилиновой группы до аминпого азота) наиболее длинная и свободная (6.30 А), а у агониста более «сжатая»: FMRFai (5.48 А), FnLRFa (5.19 А) и FLRFa (5.54 А) (см.рис.З).

Однако при анализе строения антагониста FKRFa нельзя говорить только о преимуществе прострааетвеиного расположения аргинивовой цепочки, главным отличием его структуры, конечно же, является положительный заряд аминогруппы лизина, входящего в состав молекулы, и не позволяющий создать плотную упаковку липофильного облака. Такая «раскидистая» структура, вероятно, мешает раскрытию канала (см. рис. 4).

Тт

Q §

Рис. 4. Наиболее энергетически выгодная конфирмация РКЯЬ'а.

Предлагаемая модель лигандов А 8К а

На основании данных по структурному и конфирмационному анализу была предложена модель строения лигандов протон-чувствительных ионных каналов, которая может быть схематически представлена следующим образом: положительно заряженная гуанидиновая группа аргинина, выступающая из липофильиого облака, образованного липофилъяыми заместителями (см. рис. 5).

Рис. 5. Схематическая модель строения молекул лигандов ASICs.

Химический синтез

На основании предложенной модели было синтезировано два ряда новых соединении: соединения I ряда - производные аргинина, т.к. использование аргинина, в качестве ключевого соединения для синтеза, является наиболее простым и быстрым способом введения в молекулу гуанидиноиой Группы, и соединения II ряда - гуанидированны6 производные арил-íü-аминокарбоновых кислот (см. рис.6).

R—НИ —CH —СО—НН—R

R

Соединения I ряда

Соединения II ряда

Рис. 6. Схемы структур предполагаемых непептидных лигандов ASICs, (R - различные ацильные заместители, R - различные амиды, п - число метальных групп)

Соединения I ряда можно условно разделить на пять подгрупп, отличающихся липофильностью заместителя на С-конце молекулы: амиды (соед. 1-6), бензиламиды (соед. 7, 8), анилиды (соед. 9-12), нафтиламиды (соед. 13-20), и замещенные анилиды (соед. 21-22). В пределах этих подгрупп синтезированные соединения содержат, в свою очередь, различные ацильные заместители HaN-коице (см. табл. 1).

Таблица 1. Гидрохлориды замещенных амидов -ациларгинина.

№ иэм R R

1 2052 PhCO- -H

2 2050 PhCHiCO- -11

3 2051 PhC.H2CH2CO- -II

4 2054 PhCO(CH2)2CO- -H

5 2053 PhCONH(CH2)2CO- -H

6 2060 t-BuOCOMHCH2CH(Ph)CH2CO- -H

7 2074 H- -CHrPh

8 2066 PhCO- -CH2-Ph

9 2073 H- -Ph

10 2080 PhCH2CO- -Ph

11 2079 PhCO(CH2)2CO- -Ph

12 2081 t-BuOCONHCH2CH(Ph)CH2CO- -Ph

13 2039 PhCO- -2-C10Hs

14 2036 PhCH2CO- -2-CioHs

15 2037 Ph(CH2)2CO- -2-СюНя

16 2047 PhCO(CH2)2CO- -2-СюН8

17 2048 PhCONH(CH2)2CO- -2-C10H8

18 2049 PhCHjOCONHtCH.fcCO- -2-CioHj

19 2065 Ph(CH2)2CONH(CH2bCO- -2-СюНя

20 2061 t-BuOCONHCH2CH(Ph)CH2CO- -2-C10IIs

21 2067 PhCO- -p-PhN02

22 2068 PhCO- -p-PhNH2

Схема синтеза соединений I ряда.

зга + н2м—сн—соон (<^Нг)з

нн

I.

г=

г— мн——соон + I!

г—N

I

г—т ^ын

• г—нн—сн—со—|дн—I!

N0: -

(^Нг),

г-н

I— кк^

" 000—^ —1

N02 + НгМ—СН—СО—NN—I? ' (СНг)э NN

I

НгН''

1*—ИН-СН-СО-ЫШ*-(СНг)з NN

Л

НгЫ''

Соединения II ряда, гуанидированные производные Ы-замещенных амидов арил-со-аминокарбоновых кислот, по химической структуре можно разделить на две подгруппы по длине алкильной цепочки - 3 или 5 метиленовых групп с одинаковым варьированием заместителей при амидном атоме азота (нафтил-, о-, м- и и-нитро- и -аминоанилиды). В первую подгруппу входят соединения 1, 3-7, во вторую - соединения 2, 8-13. Отдельную серию неацильных производных составляют соединения 14 и 15, в которых амидная группа заменена вторичной аминогруппой.

Таблица 2. Соединения II ряда.

№ ИЭМ Я п

1 2089 С,оН7-ШС(0)- 3

2 2087 С10Н7-ШС(О)- 5

3 2075 2-М02С6Н4ШС0- 3

4 2077 2-Ш2СбН4ШСО- 3

5 2076 3-М02СбН4>ЩС0- 3

6 2078 3-МЬСйН4№1СО- 3

7 2100 4-М02С6Н4МНС0- 3

8 2063 2-М02С6Н4ШС0- 5

№ ИЭМ Л п

9 2072 г-ЫНгСбЩМНСО- 5

10 2064 3-Ш2С6Н4ЫНСО- 5

11 2071 3-ЫН2С6Н4ЫПСО- 5

12 2082 4-Ш2С6Н4ЫНСО- 5

13 2083 4-МН2С6Н4ШСО- 5

14 2055 2-Ы02,4-Ы02СйН,>Ш- 2

15 2101 С,оН7^Н- 2

п - количество СН2 групп

HjN—(CHi)s—С—" О

Схема синтеза соединении !! ряда. \о.

■f— ОН+ Ib.N—С /) ^ » HiN—)СН,)и—С—НО- ■■( Л

SOj

о

Hi\— C=NH + HlN—(CHjIn—C^HN-f —

S—(I IJ

(— NH-ll'IW"'—г »4

Л

HnN

,NOi

: iin v.;

л /-у/ rV

с— №.[СШ-С— UN-f /% —-* c—NH-(CHi)n—c——( }

J I V--/ J I ^

I{афтиламиды (соед. 1 и 2, см. табл.2) и нсацильиые производные гуанидйна (соед. 14 и 15, см. табл.2) получали по аналогичной схеме.

Фармаколотческие нсуледпиашт.

Исследования соединений I ряда сначала проводились т \-itro на изолированных нейронах ёпийайьных заднекорешковых и тригеминальных ганглиев крыс. Результаты этих исследований приведены на рис, 7.

1 ^

а> >

S £

Р1 _

140 120 -too -во 60 40

FMRFa

Й

■t Р) <» о) |ч ф ю к

г-г-г- С"? П Т Ш LD

ООО О О О О о

f4 СЧ CM CN CM CN <М <ГЧ

wg'i'UlM Щ]

ц> Щ UJ ООО«

« rj OJ о

Рис, 7. Влияние соединений I ряда на изменение амплитуды амилорид-чувствительного протон-активируемOft» тока (Д1, %)

Из полученных данных видно, что пептид FMRFa. агонист ASICs, увеличивает амплитуду амилорид-чувсгви гельиого протон-актив иру ем ого тока,

а практически все новые соединения снижают амплитуду тока. Поскольку РМКРа проявляет алгогениые свойства, то можно было ожидать, что синтезированные вещества имеют тенденций к проявлению аналы етических свойств.

Исследования анальгетической активности синтезированных соединений проводились с использованием методики «корчи».

Полученные результаты показали* что на этой модели большинство соединений I ряда в дозе 100 мг/кг оказывали анальгетическое действие. Результаты фармакологических испытаний приведены на рис. 8.

£

£ "Н &

»

ьп-

* 40%

Й

4 ¿11-<

¡Хйй

X

* Д-,

г1]!1]

X

1 1-

1 §

о ^ О; ~ ..о г,) г-- и: - I, - со к-

оооооооооооо ООО

(ч <ч яч

иэм

Рис. 8. Аналы етическзя активность соединений 1 ряда (100 мг/кг, мыши, контроль физ, раствор) (* р <0.01. ** р< 0.001, # р <0.0001. АК'ОУА).

При этом наблюдалась прямая зависимость анальгетического эффекта от величины ли лоф иль но ста молекулы, а именно, все незамещенные амиды (соед. ИЭМ-2&50, ИЭМ-2054, ИЭМ-2060) практически не оказывали влияния на болевую чувствительность, анилиды (соед. ИЭМ-2079, ИЭМ-2080, ИЭМ-20 81, ИЭМ-205Я) и нафтиламиды (соед. ИЭМ-2036, ИЭМ-2037, ИЭМ-2039, ИЗМ-2047, ИЗМ-2048. ИЭМ-2049. ИЭМ-2061, ИЭМ-2065) показали достоверный анальгетический эффект.

Для более детального изучения связи структур а-активность были отобраны три группы соединений с регулярным изменением структуры по С-конпу: амид, анилид, нафтиламид, а заместитель на М-конце фиксирован в каждом ряду: производные фениам и но м ас л яшо й, бензоилпропиновой и

фенилуксуеной кислот (см. рис. 9), Замещенные амиды в этих группах проявляли выраженное аналы етическое действие.

1 2 3

#

Рис. 9. Сравнительная анальгетическая активность амидов, анилидов и наф-тиламицов производных фенилам ином асляной (I), бензоилпропио-новой (2) и фенилуксусной кислот (3) (100 мг/кг, мыши, контроль -физ. раствор) (* р <0.01, ** р < 0.001, # р < 0.0001, ANOVA).

Li двух группах наблюдается прямая зависимость силы анальгетического действия от липофильности молекулы. В то время, как в ряду производных фенилуксусной кислоты примой зависимости нет: нафтиламид ИЭМ-2036 менее активен, чем анилид ИЭМ-2080.

Для количественной оценки связи структура-активность этих соединений были рассчитаны величины показателя липофильности молекулы коэффициента распределения октанол/вода - clog Р. При анализе зависимости изменения амплитуды входящего тока от clog Р (см. рис J OA) видно, что в каждом ряду наблюдается пропорциональность изменения амплитуды тока от clog Р, однако анализ зависимости анальгетической активности от clogP (см рис. ЮЬ) показал, что соединенна ИЭМ-2080 проявляет анальгетический эффект немного ниже, чем можно было бы ожидать при такой липофильности. а соединение ИЭМ-2036 вообще выбивается из общей картины.

Рис. 10. Зависимость амплитуды тока и аналит ического действия от лиПОфильности молекул (В - производное фенилуксуской кислоты, • - производные бензоилпропионовой кислоты, А - производные 4-амиио-2-фенилмасляной кислоты).

На основании этих данных можно сделать вывод, что наблюдаемые в опытах tn viva отклонения пропорциональности аффекта от липофияьности вызваны не эффективностью взаимодействия вещества с мишенью, а способностью вещества достигать мишень.

Проведение конформациоиного анализа нафтиламидов из этих грех рядов соединений (см. рис. 11) показало, что соединение ИЭМ-2036 имеет наиболее компактную упаковку молекулы. В отличие от соединений ИЭМ-2047 и ИЭМ-2061, у которых липофильное облако расположено в стороне от аргшшновой цепочки, у соединения ИЭМ-203 6 липофильное облако экранирует гуанилиновую группировку, что может сказаться на распределении вещесгна в организме. Вероятно, именно это свойство молёкулы определяет меньшую анальгетическую активность соединения ИЭМ-2036 по сравнению с соединениями ИЭМ-2047 и ИЭМ-2061.

Рис. 11. Наиболее энергетически выгодные конформацйй наф типами до в I ряда.

Таким образом, использование расчетных методов теоретического конформанионного анализа позволило объяснить кажущееся на первый взгляд аномальным изменение активности изученных соединений.

Исследование знальгетиче с кого действия соединений 11 ряда показало, что на модели «корчи» в дозе 100 Мг/кг большинство соединений проявляют анальгетический эффект. Результаты фармакологических испытаний приведены на рис. 12. Помимо 15 гуанидированных производных в эксперименте были проверены два соединения, содержащие на конце молекулы свободную аминогруппу - ИЭМ-2086 и ИЭМ-2088, представляющие собой негуанидированные производные нафтиламина с 3 и 5 метиленовыма группами в алкильной цепи, соответственно (см, схему).

£

£ » л

X

<

3

1.....«

.11

X *

л л

I1

(Л г- X а> о СП

^ о со

о о а а г- 5

л Я ^ « « (N1

Л о

О тог см

Рис. 12. Анальгетическая активность соединений и ряда (¡00 мг/кг, мыши, контроль - физ. раствор) (* р < 0.0!, ** р < 0,001,

/¿р< 0.0001,АМ)УА).

1 - (СН3)3; 2 - (СНД,; 3 -{-СН^Н-); 4 М^-К При оценке аналы етического эффекта соединений 11 ряда отмечены следующие закономерности: наибольший анальгетический эффект оказывают неацильные гуанидины (соединения ИЭМ-2055, ИЭМ-2101). В ряду Ы-нафтил-амидов -гуанидинкарбоновых кислот (соединения ИЭМ-2089, ИЭМ-2087) наблюдается зависимость эффекта от длины алкильной цепи: более короткая цепь - более выраженный анальгетический эффект. В случае м- и п-замещенных фенилов соединения с аминогруппой в ароматическом кольце (соединения ИЭМ-2071, ИЭМ-2078, ИЭМ-2083) оказывают анальгетический

эффект больший (хотя не намного), чем такие же нитрозамещенные (соединения ИЭМ-2076, ИЭМ-2064, ИЭМ-2082), причем независимо от длины цепи. А в случае о- замещенных фенилов анальгетический эффект соединений с нитрогруппой в ароматическом кольце (ИЭМ-2075, ИЭМ-2063) намного превосходит эффект аминосоединений (ИЭМ-2077, ИЭМ-2072).

Необходимо подчеркнуть, что обязательное присутствие в молекуле гуанидиновой группы подтверждается тем, что в эксперименте с негуанидированными производными (соединения ИЭМ-2086, ИЭМ-2088) наблюдался выраженный седативный эффект. Вероятно, это объясняется тем, что негуанидированные соединения проникают через ГЭБ и оказывают центральное действие.

Таким образом, в результате работы получено два ряда новых соединений, обладающих заметной анальгетической активностью.

Заключение

Установленное ранее участие ASICs в ноцицепции позволяет рассматривать эти каналы как одну из возможных мишеней для создания новой группы анальгетических препаратов. Протон-чувствительные ионные каналы принципиально отличаются от других каналов тем, что они открываются не под действием каких-либо лигандов, а лишь при изменении рН среды. Формально агонистом этих каналов является протон Тем не менее, функции этих каналов можно регулировать пептидами типа FMRFa через модуляторный сайт. Лиганд-модулятор связывается с узнающим сайтом канала в закрытом состоянии, а затем при открытии канала при закислении среды изменяет амплитуду тока и характеристики десенситизации канала.

Анализ структурных требований к подобным пептидам и рациональный подход к дизайну новых соединений позволил получить ряд соединений-прототипов непептидной природы, проявляющих выраженное анальгетическое действие.

Для девяти из исследованных веществ, а именно для ИЭМ-2036, ИЭМ-2047, ИЭМ-2055, ИЭМ-2061, ИЭМ-2063, ИЭМ-2075, И.ЭМ-2079, ИЭМ-2080. ИЭМ-2101 сред неэффективная доза ниже, чем у анальгина и парацетамола (см, рис, 14).

Рис. 14. Среднеэффективная доза некоторых из синтезированных соединений и ереднеэфф активные дозы препаратов сравнения анальгину н парацетамола в методике «корчи».

Более детальное изучение этих соединений и дальнейшая оптимизация их структур позволит создать новые аналыетическиё препараты, механизм действия которых будет связан с регуляцией АЗ 1С5.

ВЫВОДЫ

5. Показана возможность создания новой группы ненаркотических анальгетиков - модуляторов протон-чувствительных ионных каналов.

2. Предложена трехмерная структура лигандов протон-чувствительных ионных каналов с использованием методов конформационкого анализа.

3. На основании предложенной структуры синтезированы два новых ряда соединений - замещенные амиды М-апил аргинина и К-ар и л амиды огуанидннокарбоповых кислот, проявляющих аналитическую активность.

4. Соединения ИГ)М-2036, ИЭМ-2037, ИЭМ-2047, ИЭМ-2055, ИЭМ-2061, ИЭМ-2063, ИЭМ-2075, ИЭМ-2079. ИЭМ-2080; :ИЭМ-20(& ИЭМ-2083,

100.

ИЭМ-2101 по силе действия превосходят препараты сравнения анальгин и ацетоаминофен и могут представлять интерес как потенциальные анальгетики.

5. Выраженность анальгетического действия определяется общей липофильностью молекулы, формой липофильного облака и расстоянием между положительно заряженной гуанидиновой группой и липофильной частью молекулы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Е.В.Литасова, М.А.Думпис, С.В.Куликов, Л.Б.Пиотровский, О.А.Крышталь Поиск непептидных блокаторов протон-чувствительных ионных каналов. // Вестник ВолГМУ. - 2005 - 4(16). - С.19-22.

2. Е.В.Литасова, М.А.Думпис, С.В.Куликов, Л.Б.Пиотровский, Н.А.Паткина Изучение анальгетического действия замещенных амидов N-ацилированного аргинина на модели «корчи» (writing test) у мышей. // Бюллетень Волгоградского Научного Центра РАМН - 2005. - вып. 3-4. - С.3-7.

3. Piotrovsky L.B , Litasova E.V., Dumpis M.A., Kulikov S.V., Krishtal O.A. New nonpeptide ASIC's ligands in experiments "in vitro" // European Neurophycho-pharmacology, v.15, Supp. 2/2005, s.190

4. Литасова E.B., Думпис M.A., Куликов C.B., Пиотровский Л.Б. Синтез и биологическая активность непептидных лигандов протон-активируемых каналов // В материалах Научной конференции «Современные тенденции в органическом синтезе и проблемы химического образования», Санкт-Петербург, 2005, с.290.

Формат 60X84 1/8, Объем Уел печ л 2,0 Тираж 100 экз Зак 0352 Бесплатно Подписано к печати 03.04 07 Отпечатано с готового оригинал-макета Типография ООО «Петроград» СПб, Невский пр 142/1

Боль является неотъемлемым компонентом ряда патологических состояний. Общепризнан определяющий вклад фактора боли в этиологии и патогенезе травматического шока, который в отдельных случаях приводит к смерти. Болевые ощущения не только тяжело переносятся сами по себе, но и ухудшают течение основного заболевания. Не будет преувеличением утверждать, что проблема борьбы с болью занимает одно из центральных мест в современной биологии и медицине. В настоящее время она переживает период интенсивного изучения. Боль является важной социальной проблемой. Конгресс США объявил 2001-2010гг. декадой контроля над болью и науки о боли. По всему миру проводятся масштабные исследования этой проблемы общечеловеческой значимости. Все это свидетельствует о большой значимости болеутоляющих средств - анальгетиков, для практической медицины. Анальгетические препараты являются одной из важнейших групп лекарственных веществ. В настоящее время для подавления боли используют анальгетические препараты, которые подразделяют на два класса в зависимости от механизма действия: наркотические и ненаркотические. Наркотические анальгетики обладают более выраженным и специфическим эффектом, но вызывают лекарственную зависимость - наркоманию. Ненаркотические не вызывают привыкания, но имеют более слабый анальгетический эффект, и весьма часто оказывают негативное влияние на органы, участвующие в процессах метаболизма. Очевидно, что круг применяемых на данный момент анальгетических средств явно недостаточен, кроме того, многие анальгетики обладают целым рядом побочных эффектов, поэтому необходимо пополнять арсенал анальгетических препаратов, расширяя список выбора для практического врача.

Сейчас уже можно довольно детально представить морфофункциональную, нейрофизиологическую и нейрохимическую организацию различных звеньев и процессов формирования и регуляции болевой чувствительности [Прощаев К.И. и др, 2006]. Болевые ощущения воспринимаются специальными рецепторами, которые получили название «ноцицепторы». Ноцицепторы представляют собой окончания древовидно разветвленных афферентных волокон, расположенных в коже, мышцах, суставных капсулах, надкостнице, внутренних органах и т. п. Ноцицептивными раздражителями могут быть механические, термические и химические воздействия. Нередко причиной боли является патологический процесс (например, воспаление) [Харкевич 1987]. Воспаление, сердечная ишемия, опухолевый рост, как правило, сопряжены с хронической болью, и обычно сопровождаются ацидозом ткани. Известно, что ацидоз тканей приводит к активации протон-чувствительных ионных каналов (ASICs - Acid Sensing Ion Channel's). Открытие протон-чувствительных ионных каналов и методов их регуляции внеклеточным рН явилось огромным шагом вперед в борьбе с болью [Krishtal О.А., et.al., 1981, Waldmann 1997А].

Известны эндогенные вещества, которые, воздействуя на ноцицепторы, способны вызвать болевые ощущения, например природный тетрапептид FMRFa. Последний, и некоторые родственные ему пептиды широко представлены в организмах беспозвоночных и являются модуляторами токов, протекающих через протон-чувствительные ионные каналы [Askwith 2000]. Учитывая то, что практически любые метаболические нарушения, равно как и повреждения, ведут к закислению тканей, вопрос о все еще неясной связи протон-чувствительных каналов с ноцицепцией становится все более интригующим. Можно предположить, что лиганды-модуляторы протон-чувствительных ионных каналов будут проявлять анальгетическое действие. В связи с этим вызывает интерес разработка методов синтеза и изучение механизмов действия веществ, влияющих на протон-чувствительные ионные каналы. Однако применение аналогов FMRFa пептидной природы затрудняет изучение биологических свойств новых соединений вследствие энзиматической лабильности пептидов в организме. Синтез непептидных аналогов FMRFa, модуляторов ASICs, предоставляет возможность обнаружения соединений, обладающих анальгетическими свойствами и устойчивых в организме при патофизиологических значениях рН.

С этой точки зрения проблема поиска новых анальгетических препаратов является одной из важных и неотложных задач современной фармакологии и химии лекарственных веществ. Цель исследования.

Целью работы явился поиск новых соединений, обладающих анальгетической активностью, механизм действия которых связан с влиянием на протон-чувствительные ионные каналы.

Задачи исследования.

1. Выявить особенности пространственного строения известных пептидных лигандов-модуляторовАБЮз.

2. Построить трехмерную модель лигандов-модуляторов ASICs.

3. На основании предложенной модели синтезировать непептидные лиганды ASICs.

4. Определить анальгетическую активность новых соединений.

5. Установить зависимость связи структура-активность в ряду полученных соединений.

Научная новизна работы.

Впервые синтезированы два ряда новых соединений, являющихся лигандами протон-чувствительных ионных каналов и проявляющих анальгетическую активность, что указывает на возможность создания группы ненаркотических анальгетиков с новым механизмом действия. Основные положения, выносимые на защиту.

1 Определена структура и построена трехмерная модель фармакофора лигандов протон-чувствительных ионных каналов. 2. Синтезированные соединения, содержащие гуанидиновую группировку, оказывают модулирующее действие на функционирование протон-чувствительных ионных каналов.

3. Лиганды-модуляторы протон-чувствительных ионных каналов проявляют анальгетическую активность в экспериментах in vivo.

4. На основе лигандов-модуляторов протон-чувствительных ионных каналов возможно создание новой группы ненаркотических анальгетиков.

Научно-практическое значение работы.

Полученные данные расширяют представление о связи протон-чувствительных ионных каналов и болевых ощущений. Результаты работы свидетельствуют о перспективности непептидных модуляторов протон-чувствительных ионых каналов в качестве соединений-прототипов для создания новых высокоэффективных анальгетиков и могут быть использованы для разработки новой группы анальгетических препаратов класса ненаркотических анальгетиков. Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на VII региональном конгрессе европейского союза нейропсихофармакологов (Москва, 2005), Юбилейной конференции молодых ученых ГУ НИИЭМ РАМН (Санкт-Петербург, 2005), Научной конференции «Современные тенденции в органическом синтезе и проблемы химического образования» (Санкт-Петербург, 2005). Работа поддержана грантом INTAS 01 -0651. Публикации.

По теме диссертации опубликовано 4 научных работы (из них две статьи в рецензируемых журналах). Структура и объем диссертации.

выводы

1. Показана возможность создания новой группы ненаркотических анальгетиков - модуляторов протон-чувствительных ионных каналов.

2. Предложена трехмерная структура лигандов протон-чувствительных ионных каналов с использованием методов конформационного анализа .

3. На основании предложенной структуры синтезированны два новых ряда соединений - замещенные амиды N-ациларгинина и N-ариламиды оэ-гуанидинокарбоновых кислот, большинство из которых проявляют анальгетическую активность.

4. Соединения ИЭМ-2036, ИЭМ-2037, ИЭМ-2047, ИЭМ-2055, ИЭМ-2061, ИЭМ-2063, ИЭМ-2075, ИЭМ-2079, ИЭМ-2080, ИЭМ-2081, ИЭМ-2083, ИЭМ-2101 по силе действия превосходят препараты сравнения анальгин и ацетоаминофен и могут представлять интерес как потенциальные анальгетики.

5. Выраженность анальгетического действия определяется общей липофильностью молекулы, формой липофильного облака и расстоянием между положительно заряженной гуанидиновой группой и липофильной частью молекулы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что всего лишь одно из тысяч и десятков тысяч веществ, попадающих на исследования по биологической активности, проходит весь путь от разработки до внедрения в клиническую практику. Уже давно установлено, что скрининг на целом организме является трудоемкой и весьма дорогостоящей процедурой. Поэтому оптимальным является рациональный подход.

На сегодняшний день уже сложились основные требования к рациональному дизайну лекарственных веществ. Он включает в себя следующие стадии: выбор биологической мишени; анализ ее трехмерной структуры, подбор in silico комплементарных этой мишени лигандов (докинг) с последующим их синтезом и анализом фармакологической активности в опытах in vitro и in vivo.

Результатом этих исследований является создание соединения-прототипа (lead compound), обладающего выраженной специфичностью действия. Дальнейшая оптимизация структуры этого соединения-прототипа сводится к улучшению его токсикологических, фармакокинетических и других характеристик, что и позволяет подойти в конце пути к лекарственному препарату.

В данной работе в качестве мишени были выбраны протон-чувствительные ионные каналы. Установленное ранее участие ASICs в ноцицепции позволяет рассматривать эти каналы как одну из возможных мишеней для создания новой группы анальгетических препаратов.

Проблема, возникающая при подборе соединений, взаимодействующих с этой мишенью, заключается в том, что до сих пор не известна трехмерная структура этих каналов, что делает невозможным процедуру докинга. Поэтому в работе был использован химико-фармакологический подход, заключающийся в моделировании узнающего (связывающего) сайта по комплементарным к нему лигандам.

Протон-чувствительные ионные каналы принципиально отличаются от других каналов тем, что они открываются не под действием каких-либо лигандов, а лишь при изменении рН среды. Однако функционирование этих каналов можно регулировать через модуляторный сайт связывания пептидов типа FMRFa. Лиганд-модулятор связывается с узнающим сайтом канала в закрытом состоянии, а затем при открытии канала при закислении среды изменяет свойства канала: как по амплитуде возникающего тока, так и характеристики его десенситизации. Поэтому именно этот модуляторный сайт и был выбран в качестве основной мишени (см. схему). in синтез in in silico vitro VIVO соединения с желаемой фармакологической активностью

Схема дизайна соединений обладающих фармакологической активностью. В данном случае в качестве мишени выбраны протон-чувствительные ионные каналы для получения соединений обладающих анальгетической активностью.

Проведенный компьютерный конформационный анализ известных пептидных лигандов этих каналов позволил определить структуру фармакофора модуляторного сайта протон-чувствительных ионных каналов и построить трехмерную модель лигандов. На основании построенной модели синтезированы два ряда соединений. Проведенные первичные фармакологические тесты in vitro и in vivo показали правильность выбранного подхода. Синтезированные соединения, содержащие гуанидиновую группировку, оказывают модулирующее действие на функционирование протон-чувствительных ионных каналов. Лиганды-модуляторы протон-чувствительных ионных каналов проявляют анальгетическую активность в экспериментах in vivo. Анализ структурных требований к подобным пептидам и рациональный подход к дизайну новых соединений позволил получить ряд соединений-прототипов непептидной природы, проявляющих выраженное анальгетическое действие. Соединения обоих рядов проявляют

101