Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Аллельный полиморфизм генов транспортных белков (ТАР1/2) и генов белков теплового шока (HSP-70) при заболеваниях суставного аппарата

На правах рукописи

2 5ь: ■

ШЕВЧЕНКО Алла Владимировна

Аллельный полиморфизм генов транспортных белков (ТАР1/2) и генов белков теплового шока (Н8Р-70) при заболеваниях суставного аппарата.

14.00.36-Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск- 2002

Работа выполнена в ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск

доктор медицинских наук, Член-корр. РАМН, профессор В.И.Коненков

доктор биологических наук, Рубцов Н.Б.

доктор медицинских наук, профессор Нестерова И.В.

Российский государственный медицинский университет МЗ РФ

Защита диссертации состоится « -/¡> » и 2002г. в -/О ^

часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 в ГУ НИИ клинической имунологии СО РАМН по адресу: 63009^, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г.Новосибирск.

Автореферат разослан /Л. ОЗ_2002г.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

Ученый секретарь

диссертационного совета кандидат биологических наук

• ■ Ж/шГб'Л^ Кудаева0Т"

Ет.зз, о,

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы.

На ранних этапах развития болезни, как правило, отсутствует ее четкая клиническая картина. В связи с этим особое внимание в последнее время уделяется проблемам генодиагностики, позволяющей выявлять пациентов с высокой степенью вероятности развития болезни при воздействии этиологических факторов. Получены данные о том, что целый ряд заболеваний человека ассоциирован с наличием в его геноме тех или иных аллельных вариантов HLA-генов, продукты которых принимают непосредственное участие в реализации взаимодействий иммунокомпетентных клеток, ключевыми моментами которых являются процессы распознавания и элиминации чужеродных или собственных антигенов (Зарецкая Ю.М.,1983, Коненков В.И.,1999).

Наряду с поиском генетических маркеров предрасположенности к заболеванию и анализом механизмов, объясняющих природу молекулярных взаимодействий при патологии, большое внимание в последнее время уделяется триггерной роли патогенов различной природы в индукции аутоиммунитета. Особенную значимость приобретает исследование генетической обусловленности патологии (Хаитов P.M., Алексеев А.П., 1998,1999), в том числе вызванной инфекционными возбудителями.

Инфекционные агенты могут длительно персистировать в инфицированном организме, вызывая хронические воспалительные, прогрессирующие деструктивные и пролиферативные процессы (Rasin S., 1998). Показано, что у различных индивидов существуют выраженные отличия к восприимчивости той или иной инфекции. В ряде случаев инфекция не ограничивается местным воспалением, а сочетается с поражением внутренних органов. Такие возбудители, как Chlamidia trachomatis к Mycoplasma hominis, являясь внутриклеточными паразитами, могут принимать участие в формировании воспалительных процессов в. суставах (Colbert R.A.,2000, Campbell D.J.,2000). Один из механизмов, через которые реализуются подобные отличия, связывают с полиморфизмом генов HLA, через продукты которых внутриклеточная инфекция индуцирует ГЗТ ответ, связанный с Thl и продуцируемыми ими цитокинами (Romani L.,1997). Особенную роль в этом отношении приобретают новые малоизученные полиморфные гены HLA- региона П (ТАР) и Ш (HSP70) классов, продукты которых принимают непосредственное участие в тонких молекулярных механизмах процессинга и презентации внутриклеточной инфекции.

В процессе распознавания, С. trachomatis и M.hominis, являясь внутриклеточными паразитами, подвергаются внутриклеточному

процессингу, в котором участвуют белковые продукты генов ТАР1 и ТАР2 (transporter associated with processing), связывающие и транспортирующие эндогенные пептиды в эндоплазмаггический ретикулум (Donn R.P.,1994, Elliot Т., 1997, Reits Е.А.,2000). Показано, что на характер формирования противоинфекционного иммунного ответа могут оказывать влияние различия в структуре ТАР1 и ТАР2, обусловленные их полиморфизмом (Marusina К, 1996). Кроме того, в иммунном ответе на инфекционные антигены важную роль играют белковые продукты полиморфных генов белков теплового шока (HSP-Heat Shock Protein) (Zugel U.1999), выполняющих функции молекулярных шаперонов при сборке или деградации белков и, одновременно, участвующих в процессинге антигена.

Цель исследования.

Проведение комплексного анализа ассоциированности аллелъных вариантов генов ТАР1 и ТАР2, HSP70-1, HSP70-2 и HSP70-НОМ с предрасположенностью к развитию ревматоидного артрита, болезни Рейтера и реактивного артрита, протекающих на фоне внутриклеточного инфицирования С. trachomatis и M.hominis.

Задачи исследования.

1. Исследовать аллельный полиморфизм генов ТАР1 и ТАР2 среди здоровых жителей Сибири европеоидного происхождения в сопоставлении с группами больных хламидийными и микоплазменными уретритами, больных реактивными артритами, болезнью Рейтера и ревматоидным артритом.

2. Исследовать распределение частот аллелей генов HSP70-1, HSP70-2, HSP 70-НОМ среди здоровых жителей Сибири европеоидного происхождения в сопоставлении с группами больных хламидийными и микоплазменными уретритами, больных реактивными артритами, болезнью Рейтера и ревматоидным артритом.

3. Исследовать характер совместного наследования аллельных вариантов генов ТАР1 и ТАР2, HSP70-1, HSP70-2 и HSP70-HOM с группами аллелей гена HLA-DRB1 и особенности распределения антигена HLA-B27 среди здоровых жителей Сибири европеоидного происхождения и больных хламидийными и микоплазменными уретритами, больных реактивными артритами, болезнью Рейтера и ревматоидным артритом.

4. Определить прогностическую значимость изолированного и совместного выявления аллельных вариантов генов ТАР1 и ТАР2, HSP70-1, HSP70-2 и HSP70-HOM, HLA-DRB1 и HLA-B27 в индукции перехода местного воспалительного процесса, вызванного Chlamidia trachomatis и

?

Mycoplasma hominis, в процесс развития экстрагенитальных проявлений в форме суставных синдромов.

Научная новизна работы.

Впервые методами гибридизации ДНК со смешанными сиквенс-специфичными праймерами (SSP-sequence specific probe), амплификации полиморфных фрагментов с использованием специфических олигонуклеотидов (ARMS-amplification refractory mutation system), Nested-PCR («гнездовой» ПЦР), рестриюгным анализом

амплифицированных фрагментов (RFLP restriction fragment length polymorphism) с использованием рестриктаз AsuCII и AccBSI, Pst I и Ncol проведен анализ характера распределения аллельных вариантов генов ТАР1 и ТАР2, нуклеотидов в полиморфных сайтах регуляторнош региона HSP70-1, кодирующих регионов HSP70-2 и HSP70-HOM среди европеоидного населения Сибири и установлены закономерности их совместного наследования с вариантами «классических» HLA- генов I (HLA-B27) и II (HLA-DRB1) классов.

Впервые в данной популяции установлен различный характер ассоциированности аллельных вариантов генов ТАР1 и ТАР2, HSP70-1, HSP70-2 и HSP7D-HOM с наличием предрасположенности и резистентности к возникновению как местных воспалительных процессов в форме вызванных Chlamidia trachomatis и Mycoplasma hominis уретритов, так и к развитию экстрагенитальных осложнений инфекционного процесса в виде реактивных артритов, болезни Рейтера и ревматоидного артрита.

Впервые показано, что, в отличие от инфекционного процесса, индуцированного М. hominis, на формирование генетической предрасположенности к развитию суставного синдрома на фоне инфицирования С. trachomatis наиболее существенное влияние оказывает полиморфизм генов HLADRB1, ТАР и HSP70.

Показано, что спектр формирования патологического процесса в. ответ на инфицирование Chlamidia trachomatis и Mycoplasma hominis в диапазоне от локального уретрита, до развития системных суставных синдромов различной тяжести, определяется не столько самим возбудителем, сколько вариантом индуцированного иммунного ответа, находящегося под контролем сложного комплекса генов иммунного ответа, в состав которого входят не только «классические» HLA гены I и П классов, но и гены процессинга антигенного материала возбудителей внутриклеточных инфекций.

ч

Практическая значимость работы.

Отработаны и опубликованы методические условия для достоверного анализа полиморфизма генов ТАР1 и ТАР2, HSP70-1, HSP70-2 и HSP70-HOM с использованием методов SSP, ARMS, Nested-PCR и PCR-RFLP с использованием отечественной приборной и реактивной базы.

В результате проведенного исследования впервые установлен характер распределения аллельных генов ТАР1 и ТАР2, HSP70-1, HSP70-

2 и HSP70-HÖM среди европеоидного населения Сибири, что может быть использовано, как для сравнительной этногенетической характеристики данной популяции, так и для разработки новых иммуногенетических методов прогноза и раннего диагноза многих социально-значимых болезней.

Установленные различия в частоте распределения аллельных вариантов этих генов и их межлокусных комбинаций с широко используемыми в артрологии вариантами HLA генов DR4 и В27 могут явиться основой для разработки дополнительных лабораторных критериев раннего дифференциального диагноза и прогноза заболеваний суставов с различными вариантами клинического течения (реактивных артритов, болезни Рейтера и ревматоидного артрита). Положенияг выносимые на защиту.

1. Характер распределения аллельных вариантов генов ТАР1 и ТАР2, HSP70-1, HSP70-2 и HSP70-HOM и их совместного носительства с вариантами HLA- генов I (HLA-B27) и П (HLA-DRB1) классов среди пациентов с уретритами, индуцированными С. trachomatis и M.homittis, и пациентов с реактивными артритами, спондиллоартритом и ревматоидным артритом, протекающими на фоне этих инфекций, отличается от характеристик, установленных для популяции практически здорового населения Сибири европеоидного происхождения.

2. Аллельные варианты генов ТАР1 и ТАР2, HSP70-1, HSP70-2 и HSP70-НОМ, белковые продукты которых связывают и транспортируют эндогенные пептиды в эндоплазматический ретикулум и выступают в роли молекулярных шаперонов при сборке или деградации внутриклеточных белков, оказывают существенное влияние на характер иммунного ответа к Chlamidia trachomatis и Mycoplasma hominis и связанного с ним формирования локального или экстрагенитально го патологического процесса.

3 .Инфицирование С. trachomatis и М. hominis является пусковым моментом для развития целого ряда патологических процессов, как локального, так и системного характера, при формировании которых одним из механизмов генетической предрасположенности можегг являться

индивидуальный набор аллельных вариантов генов ТАР1 и ТАР2, HSP70-1, HSP70-2, HSP70-HOM, HLA-B27 и HLA-DRB1, содержащийся в генотипе инфицируемого индивида. Апробация работы.

Полученные результаты были доложены и обсуждены на 10°" Интернациональном конгрессе иммунологов,( New Delli, 1998); на 13ой Конференции Европейской Федерации иммуногенетиков (1999); на 2-й съезде иммунологов России, (Сочи 1999); 5-ой отчетной сессии ИКИ СО РАМН. "Иммунная система: функционирование в норме, при экстремальных экологических воздействиях, при иммунопатологии" (Новосибирск, 2000); на 3-ей Всероссийской научно практической конференции: "Генодиагностика в современной медицине"( Москва, 2000); на Объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН "Новые медицинские технологии"(Новосибирск, 2000); 11 ом Интернациональном конгрессе иммунологов (Stockholm, Sweden, 2001); на научно-практической конференции «Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике .ДНК диагностика в медицине.»(Новосибирск, 2001.);

Апробация работы состоялась на расширенном семинаре Института Клинической Иммунологии СО РАМН 16 апреля 2002 г. Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ. Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста. В ее состав входят введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результаты исследования, изложенные в 3 главах, обсуждение результатов, выводы, список литературы. Диссертация иллюстрирована 5 рисунками, 37 таблицами. Список литературы состоит из 221 источника, из которых 19 отечественных авторов. Материалы и методы.

Обследовано 492 человека, из которых 100 практически здоровых лиц, 64 . больных ревматоидным артритом (РА), 49 больных болезнью Рейтера (БР), 65 больных реактивным артритом (РеА), 214 человек с локальной урогенитальной инфекцией, протекающей в форме хронических уретритов. Группы больных РА, БР, РеА были сформированы из пациентов европеоидного происхождения отделения аутоиммунных заболеваний Клиники иммунопатологии ГУ ИКИ СО РАМН. Все пациенты прошли полное клиническое обследование и соответствовали критериям Американской ассоциации ревматологов, группы не включали кровных родственников. Все обследуемые пациенты с РА, БР, РеА и контрольная группа были протипированы по HLA антигенам I (В локус)

и П ( DRB1 локус) классов, обследованы методами PCR- анализа на наличие урогенитальныхинфекций (C.trachomatis uM.hominis).

Для анализа полиморфизма генов ТАР1, ТАР2, HSP7O-l,HSP70-2, HSP7CI-HOM, DRB1 использовалась геномная ДНК из цельной венозной крови, выделенная по методу (Greene, E.D.,1993). Генотипирование HLA DRB1 проводилось методом сиквенс-специфичных праймеров (SSP--sequence specific probe) с определением 13 специфичностей гена DRB1 с использованием коммерческих наборов фирмы "DNA-техиология", Москва. Для типировани использовали термоцюслер "Терцик МС2" этой же фирмы.

Определение диморфизма генов ТАР1 и ТАР2 проводилось методом ARMS (amplification refractory mutation system) ( Jackson D.G., Capra J.t)..-1993.) Анализировались 4 аллельных варианта TAP1 и S аллельных вариантов ТАР2 генов. Аллели каждого гена определялись исходя из полученных полиморфных позиций по схеме, предложенной Povis,1993. Для анализа полиморфизма HSP-70 генов использовались методы сиквенс-специфичных праймеров (SSP~sequence specific probe) , рестрикгный анализ PCR продуктов (RFLP- restriction fragment lenght polymorphism) с использованием эндонукпеаз рестрикции AsuCI, AccBS ltPstIy Ncol. Анализировали полиморфизм некодирующего региона HSP70-1 гена в позициях (-110), (+120), (+190), полиморфизм кодирующих регионов HSP70-2 гена в позиции 1267, HSP70-HQM гена в позиции 2437. В работе использовались эндонуклеазы рестрикции и TagI полимераза производства СибЭнзим, Новосибирск. Все праймеры были синтезированы в НПО "Вектор Новосибирск, Кольцово.

Дня диагностики Chlamidia trachomatis и Mycoplasma hominis в обследуемых группах и среди здоровых использовались PCR тест-системы, разработанные в Институте биоорганической химии СО РАН, Новосибирск и апробированные в Институте клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск (Рар В. А, 1998).

Анализ различий частот исследуемых признаков и относительного риска заболевания проводился точным методом Фишера с корректирующей поправкой Йетса, с использованием авторских программ ИКИ СО РАМН для генетико-сгатистического анализа (Прокофьев В.Ф.,1998).

РезультяТыиобсуждения.

Глав» 1. Сравнительный анализ распределения аллельных вариантов генов ТАР 1/ТАР2 среди здоровых лиц, больных реактивными артритами, болезнью Рейтера и ревлйтоидным артритом.

Частота встречаемости комбинаций аллелей генов ТАР 1, ТАР2 и критерий относительного риска (RR) развития исследуемых болезней

fi

суставов приведен в таблице 1. Показано, что наибольшее число достоверных позитивных и негативных ассоциаций с болезнями суставов выявлено для сочетаний аллелей гена ТАР1. Среди комбинаций аллелей гена ТАР2 в сравниваемых группах установлено лишь более чем двукратное снижение часты встречаемости АА среди пациентов с болезнью Рейтера.

Таблица!. Анализ частот аллельных вариантов TAPI и ТАР2 генов среди

Здоровые РА БР РеА

% % RR % RR % RR

TAPI

А/А 35,0 45,6 1,52 60,5 2.77" 46,0 1,54

АЛ) 20,0 8,7 -2,60" 11,6 -1,90 3,2 -7.63-

B/D 4,4 5,3 1Д9 7,0 1,61 15,9 4,06"

ТАР2

А/А 31,9 25 0 1-1,40 |16,7 I -2,79" I 21,8 -1,6В

комбинациям, показавшим достоверные различия между пациентами с РА, БР, РеА и здоровыми. Цветом выделены достоверные риски развития патологии.

Поскольку TAPI и ТАР2 гены кодируют продукты, являющиеся субъединицами одного белка, то целесообразно было рассмотреть ассоциированность сочетаний аллелей генов ТАР1/ТАР2 с различными болезнями суставного аппарата. Сравнительный анализ частот встречаемости ТАР1ЛГАР2 генотипов выявил как общие закономерности для всей группы анализируемых заболеваний, так и индивидуальные особенности в распределении генетических признаков предрасположенности и резистентности к отдельным нозологическим формам (Таблица 2). Так, частота встречаемости ТАР1/ТАР2 генотипов А/С и А/Н однонаправлено повышена у пациентов с ревматоидным артритом и болезнью Рейтера, тогда как частота встречаемости комбинации аллелей В/С повышена только среди больных реактивными артритами. Сходные закономерности установлены и для других сочетаний аллелей генов ТАР1/ТАР2.

Наметившаяся в побледнев время'тенденция к росту числа инфекций, передающихся половым путем (ИПГШ), в частности хламвдиоза и микоплазмоза, явилась толчком к изучению молекулярных основ предрасположенности к развитию этих заболеваний. Хорошо известно, что наряду с латентным течением или носительством, когда инфицированные лица остаются клинически здоровыми, в ряде случаев инфекция не ограничивается местным воспалением урогениталий, а

7

сочетается с поражением внутренних органов, чаще всего суставов, глаз, мышц, периферической нервной системы, печени ( Rasin S., 1998). Таблица2.Анализ частот совместной встречаемости ТАР1/ТАР2 среди

TAPI/TAP2 здоровые РА БР РеА

% % RR % RR % RR

А/С 9,5 23,1 2,85* 26,8 3,48* 15,1 1,69

А/Н U 9,6 8,83» 9,8 8,97* 3,8 3,25

В/С 3,6 0 -4,51 0 -3,56 13,2 4,11*

В/Е 0 1,9 4,92 7,3 15,36* 0

С/В 5,9 15,4 2,87* 9,8 1,71 15,1 2,81

С/С 11,9 5,8 -2,21 2,4 -5,41 1,9 -7,03*

D/B 16,7 7,7 -2,40 2,4 -8,00* 3,8 -5,10*

D/C 2,4 5,8 2,51 7,3 3,24 ИЗ 5,23*

А/А/А/С 1Д 7,7 6,92 17,1 17,09** 3,8 3,25

А/А/В/В 1Д 3,8 3,32 9,8 8,97* 5,7 4,98

A/D/A/B 8Д 3,8 -2,27 2,4 -3,64 0 -10,35*

B/D/A/C 0 0 0 7,5 15,36»

Примечание. *Т<0,05,**-Р<0,01

Несмотря на имевшееся мнение об отсутствии естественной резистентности к хламидийной, микоплазменной и ряду других урогенитальных инфекций, данные, основанные на результатах обследования половых партнеров, свидетельствуют о разной чувствительности людей к развитию этих заболеваний, выраженности их воспалительных проявлений и чувствительности к проводимой терапии.

Исходя из этого был исследован полиморфизм ТАР 1/ТАР2 генов среди пациентов с уретритами и среди пациентов с экстрагенитальными проявлениями инфекции и степень их ассоциированности с воспалительными заболеваниями хламидийной и микоплазменной природы. При хламидийной инфекции в группах со всеми анализируемыми патологиями распределение частот определенных аллельных вариантов ТАР генов достоверно отличалось от такового в контрольной группе (таблица 3).

Как следует из приведенных результатов, аллельный вариант А/С ТАР1 гена ни разу не выявлен в значительной по объему контрольной группе практически здоровых лиц и среди пациентов с болезнью Рейтера. Наряду с этим среди пациентов с РА, он выявляется у каждого третьего, а у пациентов с реактивными артритами у каждого пятого индивида. Достоверные отклонения в частоте встречаемости ряда других аллельных вариантов этих генов установлены и среди пациентов с другими формами суставного синдрома, протекающего на фоне хронического инфекционного процесса

Таблица 3. Анализ частот аллельных вариантов TAPI и ТАР2 генов

Контроль РА БР РеА

% % RR % RR % RR

TAPI

А/С 0 37,5 14,24* 0 21,4 7,00

А 45,5 87,5 8,40* 88,9 9.60* 85,7 7,20*

С 45,5 43,8 -1,07 0 -16,08* 28,6 -2,08

ТАР2

А/А 45,5 20,0 -3,33 0 -16,08* 35,7 -1,50

В 18,2 46,7 3,94 66,7 9,00* 35,7 2,50

Примечание. * - р < 0,05

Таким образом, нами показана ассоциированность полиморфизма генов TAPI и ТАР2 с развитием различных патологических процессов в суставах, причем характер ассоциированности трех патологий носит скорее присущий для каждого заболевания специфический характер, хотя установлены и общие фенотипические характеристики ассоциированности с заболеваниями. При отягощении патологии суставов хламидийной инфекцией характер ассоциированности с определенным полиморфизмом гена не повторял таковые при не осложненном инфекционном заболевании, и при заболеваниях суставов без сопутствующей внутриклеточной инфекции.

Глава 2. Сравнительный анализ полиморфизма генов НБР70 среди здоровых лиц, больных реактивными артритами, болезнью Рейтера и ревматоидным артритом.

Ассоциированность ревматоидного артрита среди европеоидов с некоторыми аллелями гена НЬА ОЯВ1 является хорошо установленным фактом. Детальный анализ роли специфических мотивов НЬА Б1Ш1 молекулы позволил выявить, что они являются связывающими для семейства белков теплового шока 70 Ш (1ир70), структура которых кодируется полиморфными генами НБР70, расположенными в НЬА комплексе. Показано, что специфические взаимодействия между белковыми продуктами аллелей генов ШР70 и НЬА ВКВ1*04 могут способствовать развитию РА.Исходя из этого, была проанализирована взаимосвязь между полиморфизмом некодирующих регионов ШР70-1 и кодирующих регионов НБР70-2, НБР70-НОМ генов с патологией суставов. Поскольку номенклатура для этой группы генов в настоящее время не принята, а исследователями используется собственное обозначение аллельных вариантов генов, то в таблицах и их описании будут указаны нуклеотиды в изучаемых полиморфных сайтах. Анализ частот определенных аллельных вариантов ГОР70 генов в группах с

о

патологиями суставов выявил генетические компоненты с повышенным риском развития патологии (таблица 4).Для больных РА и БР показаны достоверные различия со здоровыми в частотах нуклеотидов в позиции (110) промоторного региона, для больных БР и РеА - в позиции (+120) некодирующего региона ШР70-1 гена.

Одной из гипотез, объясняющих механизмы развития патологических процессов при инфицировании, является предположение об антигенной мимикрии, согласно которой срыв естественной толерантности к собственным антигенам происходит за счет общих антигенных детерминант клеток эукариот и прокариот. Белки теплового шока человека семейства НБР70 обладают очень высоким, уровнем межвидовой гомологии первичных структур с большинством внутриклеточных инфекций.

Таблица 4.Анализ частот нуклеотидов в полиморфных позициях НБР70-1

Здоровые РА БР РеА

% % ИЯ % КИ %

Н8Р70-1(-110)

А/А 26,0 9,8 -3,22** 10,6 -2,95* 32,8 1,39

С/С 19,0 32,8 2,08* 34,0 2Д0* 10,9 -1,91

А 81,0 67,2 -2,08* 65,9 -2,20* 73,4 1,91 '

С 74,0 90,2 ЗД2** 89,4 2,95* 91,5 1,39

НБР70-1(+120) ' г-

ТЯ 75,0 75,4 1,02 91,5 3,58* 93,8 5,00**

Т/С 25,0 22,9 -1г12 8,5 -3,58* 4,7 -6,78***

С 25,0 24,6 -1,02 8,5 -3,58* 6,3 -5,00**

Примечание. *-р<0,05 *»-р<0,01 ***-р<0,001

Мы рассмотрели влияние полиморфизма генов белков теплового шока семейства Н8Р70 на развитие уретритов, вызванных МАоот/яй и С.&арЬотай$ и на развитие патологии суставов у инфицированных хламйдйями и мшсоплазмами. Анализ частот нуклеотидов в полиморфных позициях (+120), (+190) ШР70-1 гена, аллельных вариантов ШР70-2 и ШР70-НОМ выявил существенные отклонения в частоте их встречаемое™ среди пациентов с наличием специфических уретритов. (Таблица 5). Было показано, что полиморфизм трех генов 1ВР70 в исследуемых нуклеотидных позициях и их сочетания не являются значимыми для перерастания локального воспалительного процесса в воспалительный процесс суставов у пациентов с микоплазменной инфекцией. Иная картона наблюдается у пациентов с хламидийной инфекцией и одновременным поражением суставов (Таблица 6).

ш

Таблица 5. Анализ частот нуклеотидов в полиморфных позициях Н8Р70 генов в фенотипе пациентов с не осложненными уретритами._

Результат РСЯ-теста на налдаиеМАсмя/лм Результат РСЯ-теста на наличиеС.(гаско)псМз

Отрицателен Положителен Отрицателен положителен

% % ЯЯ % % ЯЯ

>Р70-1(+120) г; С Г' и--

Т 72,5 81,2 1,63 70,4 ли- 84,2 2Д4*

С 27,5 18,8 -1,63 29,6 ...... 15Д -2Д4*

27,5 18,8 -1,63 29,6 г.;.:,. 15,8 - ,-. -2Д4*

>Р70-2 4

О 13,7 20,8 1,65 12,9 27,4 2,53*

А 58,8 49,5 -1,46 61,1 41,1 -2Д6**

86,3 79Д -1,65 87,0 72,6 -24»3*

¡Р70-НОМ

Г 43,1 68,3 2,84** 48,1 63 Д 1,85

г» 43,1 22,8 -2,57** 40,7 28,4 Л,73

56,9 30,7 -2,98** 51,8 36,8 -1,85

Примечание. *-р<0,05 **-р<0,0

Таблица 6. Частоты нуклеотидов в полиморфных позициях некодирующего региона НЭР70-1 гена у пациентов с патологией суставов, отягощенных хламидиозом.

Здоровые РА БР РеА

% % ЯЯ % ЛЯ % ЯЯ.

Н8Р70-1(-110)

А/А 47,1 7,7 -10,67* 22Д .3,11 21,4 -ЗД6

С/С 0 38,5 22,65** 22Д 11,67 21,4 10,65

А 100 61,5 -22,65** 77,8 -11,67 78,6 -10,65

С 52,9 92,3 10,67* 77,8 3,11 78,6 3,26

Н8Р70-1(+120)

Т/Т 70,6 84,6 2,29 88,9 ,3,33 100 12,76*

Т/С 29,4 15,4 -2Д9 11,1 -3,33 0 -12,76*

с 29,4 15,4 -2,29 11,1 -3,33 0 -12,76*

Нзр70-1(+190)

с/с 47,1 23,1 -2,96 33,3 -1,78 7,1 -11,56*

в 52,9 76,9 2,96 66,7 1,78 92,9 11,56*

Примечание. * - р < 0,05 ** - р < 0,01

Таким образом, показано, что для формирования

предрасположенности к развитию ревматоидного артрита наибольшее

значение имеет полиморфизм НБР70-1 гена в позиции (-110)

и

регуляторного региона. Значения относительного риска значительно увеличиваются при отягощении заболевания хламидийной инфекцией. Вклад аллельных вариантов гена Н8Р70 в предрасположенность к развитию болезни Рейтера носит несколько иной характер. С одной стороны, характер ассоциированности нуклеотидов в позиции ШР70-1(-110) аналогичен таковому в группе больных ревматоидным артритом, с другой стороны, при отягощении заболевания хламидийной инфекцией взаимосвязи с полиморфизмом в данном сайте не наблюдается. Кроме того, свой вклад в развитие патологии вносит полиморфизм в позиции ШР70-1(+120). Наличие в фенотипе Н8Р70-2А/ ШР70-НОМТ и ШР70-2А/ НБР70-НОМС, а также фенотип Н8Р70-20/0/ ШР70-НОШУС значительно усиливает резистентность к данному заболеванию.

Интересно то, что включение в фенотип Н8Р70-2А/НБР70-НОМТ при хламидийной инфекции, наоборот, усиливает риск развития БР, хотя для развития локальной хламидийной инфекции наличие данного сочетания нуклеотидов в указанных позициях не значимо. Ассоциированность полиморфизма ШР70 генов с развитием РеА частично повторяет характер ассоциаций полиморфных нуклеотидов генов в группе с БР. Отличительной особенностью этой патологии является более выраженная ассоциированность с полиморфизмом исследуемой группы генов при отягощении хламидийной инфекцией. Причем^ при Т/Т в позиции (+120) ШР70-1 гена наблюдается значимая однонаправленность формирования значений относительных рисков при РеА и хламидийной инфекции, а при РеА , отягощенной хламидиозом, значения относительного риска существенно возрастают.

Глава 3. Сравнительный анализ распределения генов НЬА среди здоровых лиц, больных локальными формами хламидиоза и микоплазмоза, больных реактивными артритами, болезнью Рейтера и ревматоидным артритом.

Достоверные ассоциации с НЬА-антигенами обнаружены главным образом для неинфекционных болезней. Интенсивные поиски подобных ассоциаций с инфекционными заболеваниями выявили, что у человека предрасположенность и иммунный ответ к некоторым вирусам, бактериальным и паразитическим болезням контролируется генами, связанными с НЬА-комплексом. Учитывая, что хламидии и микоплазмы потенциальные триггеры воспалительных процессов в суставах, мы проанализировали, является ли антиген В27 и какие либо из специфичностей НЬА БКВ1 гена протекторами либо провокаторами перерастания локального воспалительного процесса в развитие воспалительных процессов суставов. Нами выявлено повышение ■ НЬА ОИВ1 *02(15) у лиц с хламидиозом, больных РеА и снижение частоты

НЬА ОЛВ1* 03(17) у лиц с микоплазмозом, больных РА, что, возможно, указывает на определенную чувствительность данного генотипа к развитою заболевания при инфицировании.

В целом показано, что в исследуемой субпопуляции

сохраняется общая направленность по распределению частот специфичностей НЬА 01Ш1 гена в группах с патологиями суставного аппарата. Риск развития РА возрастает у носителей специфичности НЬА *04 в фенотипе, в то время как специфичность НЬА ОЯВ1* 02(15) является протективной. У носителей специфичности НЬА БИВ 1*11 одновременно повышен риск развития РеА и БР. Частота НЬА Б1Ш1*03(17) снижена в группе больных РеА. Частота антигена НЬА В27 повышена в группе больных БР и РеА

Учитывая, что рассмотренные нами патологии являются мультифакториальными заболеваниями, и вклад определенных аллельных вариантов отдельных генов в заболевания был показан выше, мы рассмотрели ассоциированность генотипов, объединяющих разные локусы, к развитию патологий. Учитывая вышесказанное, был проведен анализ частот аллелей ТАР и НБР70 генов, показавших относительный и достоверный риск развития патологий, среди позитивных по НЬА1ЖВ1*04 в группе больных РА; НЬА1ЖВ1*05(11) и В27 позитивных, частоты которых были достоверно увеличены у больных БР и РеА. При этом следует сразу отметить, что неравновесного сцепления между ТАР и Н8Р70 с НЬА1ЖВ1 *04,*1 Г и В27 нами выявлено не было.

Было показано влияние генов процессинга ТАР1/ТАР2 и ШР70-1, ШР70-2, ШР70-НОМ наряду с классическими генами презентации на участие в формировании заболеваний патологий суставов аутоиммунной и инфекционно-воспалительной природы, причем характер ассоциированности с тремя анализируемыми патологиями носил скорее индивидуальный характер для каждой нозологии, несмотря на имеющиеся общие черты. Полученные результаты расширяют представления об ассоциированности генов НЬА комплекса и могут лечь в основу разработки дополнительных диагностических критериев патологий суставного аппарата.

Полученные данные свидетельствуют о том, что наряду с аллельными вариантами генов презентации I и П классов, полиморфизм генов процессинга может во многом определять эффективность развития иммунного ответа и определенным образом влиять на развитие воспалительных процессов.

1. Выявлено преобладание частоты отдельных аллельных вариантов генов ТАР1 и ТАР2, Н8Р70-1, Н8Р70-2 и ШР70-НОМ в популяции

п

практически здоровых лиц над другими, характер их распределения может считаться впервые проанализированным для популяции жителей Сибири европеоидного происхождения.

2. Достоверно измененные частоты некоторых нуклеотидов в полиморфных сайтах 5'некодирующего региона HSP70-1 гена и кодирующих регионах HSP70-2 и HSP70-HC5M генов среди лиц с не осложненными уретритами, вызванными C.trachomatis и M.hominis, могут рассматриваться в качестве генетических признаков предрасположенности или резистентности к развитию этих внутриклеточных инфекционных заболеваний.

3. Аллельный вариант TAPIA является генетическим признаком предрасположенности к развитию реактивного артрита, болезни Рейтера и ревматоидного артрита у пациентов, инфицированных C.trachomatis. Ряд других аллельных вариантов этого гена являются индивидуальными признаками предрасположенности и резистентности к развитию заболеваний суставов различной природы.

4. Наличие определенных нуклеотидов в полиморфных сайтах регуляторного региона HSP70-1 гена и кодирующих регионах HSP70-2, HSP70-HOM генов в фенотипе пациентов, инфицированных C.trachomatis и M.hominis, является дополнительными генетическими признаками предрасположенности или резистентности к развитию суставного синдрома инфекционно- воспалительного или аутоиммунного характера.

5. Сравнительный анализ характера распределения групп аллельных вариантов некоторых HLA генов I и II классов, ассоциированных с развитием суставной патологии, показал повышенную частоту встречаемости специфичности гена DRB1*05 (11) и подтвердил повышенную частоту антигена В27 среди пациентов с реактивными артритами, Болезнью Рейтера; увеличение варианта DRB1 *04 и снижение частоты DRB1 *02 (15) среди больных ревматоидным артритом. Снижение частоты встречаемости специфичности DRB1*03 (17) среди пациентов с реактивными артритами свидетельствует против концепции о наличии аутоиммунного компонента в их патогенезе.

6. Выявленные закономерности совместной встречаемости в генотипе аллельных вариантов генов ТАР1, ТАР2; нуклеотидов в полиморфных позициях 5чнекодирующего региона HSP70-1 гена и кодирующих регионах HSP70-2 и HSP70-HOM генов с вариантами некоторых HLA генов I и П классов, ассоциированных с развитием суставной патологии, показал наличие межлокусных ассоциаций в генетическом HLA-комплексе, участвующем в формировании генетической предрасположенности к развитию суставного синдрома, индуцированного наличием очагов хронической внутриклеточной инфекции.

7. Аялельные варианты генов, белковые продукты которых принимают участие в процессинге антигенного материала возбудителей внутриклеточных инфекций С. trachomatis и M.hominis, совместно с другими генами HLA-комплекса, могут рассматриваться в качестве генов, ассоциированных с предрасположенностью и резистентностью к развитию хронического инфекционного процесса, и связанных с его наличием заболеваний суставов различного характера, а выраженные различия в частоте встречаемости аллелей этих генов и их комбинаций среди здоровых и больных лиц, могут явиться основой для разработки иммуногенетических критериев раннего дифференциального диагноза и прогноза болезней суставов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1.Konenkov V.l., Sartakova M.L., Golovanova O.V., Shevchenko A.V.The TAPI and TAP2 Polymorphism in Patients with Mycoplasma Hominis infection. 10th Intern. Congr. of Immunology - New Delli, 1998, s. 1, p. 404.

2.Konenkov V.l., Sartakova M.L„.Prokofiev V.F, Shevchenko A.V, Golovanova O.V. Allelic frequenies and disequilibrium between TAPI and DRB1 genes in Caucasian population of West Siberia in Russia . Human Immunology. - 1999. - Vol.60. - Suppl. . - P. 44: Abstr. Of 13A Conference of European Federation for Immunogenetics.

3.Голованова O.B., Шевченко A.B, Прокофьев В.Ф., Сартакова M.JI, Коненков В.И.. Распространенность и неравномерное сцепление TAPI, ТАР2 и DR-B1 в популяции кавказоидного населения Западной Сибири // Матер. II съезда иммунологов России.-1999,- Т.4, № 1.-С. 97

4.Сартакова М.Л., Коненков В.Й., Шевченко A.B., Голованова О.В.,Коненкова Л.П., Зонова Е.В., Королев М.А. Ассоциированность полиморфизма генов TAPI/ ТАР2 с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, сочетающимися с поражением суставов. Терапевт. Архив, 1999, т. 71, № И, с. 41-45

5. Коненков В.И., Шевченко A.B., Голованова О.В., Орлов Н.Б. Диагностическое обоснование выбора стратегии терапии смешанной урогенитальной инфекции. IV Сибирская междисциплинарная научно-практическая конференция "Хламидийные и вирусные инфекции -перспективы лечения в XXI веке". 1999.

6.Шевченко A.B., Голованова О.В., Коненков В.И. Анализ диморфизма генов HSP70-2 у больных хламидиозом и микоплазмозом. Иммунная система: функционирование в норме, при экстремальных экологических воздействиях, при иммунопатологии: Мат. 5-й отчетной сессии ИКИ СО РАМН, Новосибирск, 2000, с. 21-23.

7.Голованова О.В., Шевченко A.B., Коненков В.И. Молекулярный полиморфизм генов HLA-DRB1, -DPB1 МНС II класса в популяции

is

европеоидов, проживающих на территории Западно-Сибирского региона Матер. Ш съезда иммунологов и аллергологов СНГ: Аллергология и иммунология,-2000,-Т. 1,№2.-С. 193.

8.Сартакова М.Л., Коненков В.И., Голованова О.В., Шевченко А.В., Лопес-Ларреа К., Гонзалес-Роцез С., Ламажаа А.М., Донгак Л.Г., Кара-Монгуш С.И. Изучение наиболее часто встречающихся аллелей гена HLA-B27 у тувинцев и русских жителей Западной Сибири . Генетика.-2000.-Т.36,-№5,-С.710-713

9.М.А Королев, В.И. Коненков, Шевченко А.В., Н.Б. Орлов, В.Ф.Прокофьев, Е.В. Зонова, Л.П. Коненкова Иммуногенепгическая гетерогенность артропатий ассоциированных с хронической урогенитальной инфекцией. Медицинская иммунология. 2000. Т.2. №1. С. 83-88.

10. В.А. Рар, Т.Г. Максимова, О.В. Голованова, А.В.Шевченко, Н.Б. Орлов, О.В. Морозова. "Использование внутреннего контроля ПЦР для определения ингибиторов и для оценки уровня инфицированности." Объединенная научная сессия СО РАН и СО РАМН "Новые медицинские технологии". Новосибирск. 2000.

ll.Shevchenko A.V, Konenkov V.I Analysis of the association of heat shock protein HSP70-1 gene polymorphism with development of Chlamidia and Mycoplasma infections. Scandinavian J of Imm, v54, s.l, 2001,pi 12/ 11 th International Congress of Immunology.Stockholm, Sweden, 2001 !2.Konenkov V.I., Prokofjev V.F., A.V.Shevchenko, Golovanova O.V., Smolnikova M.V. Polymorphism of Immune Response Genes as a Factor for Predisposition to Development of Disease. Russian J of Immunology.-2001.-V.6, N2, p. 123-130.

1 З.Коненков В.И., Прокофьев В.Ф., Шевченко A.B., Голованова О.В., Короткова И.Ю. Клиническое значение генотипирования HLA комплекса. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. Научно-практическая конференция «ДНК диагностика в медицине.», Новосибирск: Изд. Дом «Манускрипт», 2001 .-С.27-34.

14. Шевченко А.В.,Коненков В.И., Коненкова Л.П., Зонова Е.В., Королев М.А. Анализ полиморфизма генов белков теплового шока (HSP70-2 и HSP70-HOM ) с развитием ревматоидного артрита и болезнью Рейтера. // Медицинская Иммунология, ТЗ №4,с 551-556.2001

15.Голованова О.В., Шевченко А.В., Прокофьев В.Ф., Коненков В.И. Молекулярный полиморфизм генов HLA- DRB1 , -DPB1 в популяции европеоидного происхождения, проживающей в Западно-Сибирском регионе. Иммунология.-2002. 1 .-С.29-31.

Подписано в печать 06.05.2002 Заказ №69 Бумага офсетная,

Формат 60x84 1/16 80 гр/м2

Печ.л. 1 Тираж 100

Отпечатано на полиграфическом участке издательского отдела Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН 630090, Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5

Актуальность проблемы.

На ранних этапах развития болезни, как правило, отсутствует ее четкая клиническая картина. Для врача очевидна необходимость максимально ранней диагностики, способствующей наиболее эффективной терапии и предотвращению развития хронических форм заболевания и его осложнений. В связи с этим, особое внимание в последнее время уделяется проблемам генодиагностики, позволяющей выявлять пациентов с высокой степенью вероятности развития болезни при воздействии этиологических факторов. Получены данные о том, что целый ряд заболеваний человека ассоциирован с наличием в его геноме тех или иных аллельных вариантов HLA-генов, продукты которых принимают непосредственное участие в реализации взаимодействий иммунокомпетентных клеток, ключевыми моментами которых являются процессы распознавания и элиминации чужеродных или собственных антигенов (8,9). В настоящее время доказана ассоциированность определенных вариантов HLA-DR4 с РА (21,54,83), и HLA-B27 с болезнью Рейтера и с реактивным артритом (74,75). Однако не оставляет сомнения мультифакториальность данных заболеваний, включающая как ряд внутренних, так и внешних факторов. В связи с широким внедрением в практику методов ДНК- типирования, актуальным становится уточнение степени и характера ассоциированности патологий человека с вновь выявляемыми полиморфными генами HLA-региона и использования их в качестве специфических маркеров прогноза заболеваний. Наряду с поиском генетических маркеров предрасположенности к заболеванию и анализом механизмов, объясняющих природу молекулярных взаимодействий при патологии, большое внимание в последнее время уделяется триггерной роли патогенов различной природы в индукции патологических процессов аутоиммунной и инфекционно-воспалительной природы. Особенную значимость приобретает исследование генетической обусловленности патологии (15,16,17), в том числе вызванной инфекционными возбудителями. Роль различных инфекционных агентов в патологических процессах суставов до сих пор дискутируется (35,44,64,96,173,210).

Внутриклеточные инфекции индуцируют в организме все виды иммунных реакций: специфический гуморальный и клеточный иммунный ответ и неспецифический иммуностимулирующий и иммуносупрессирующий эффект (80). В тоже время инфекционные агенты могут длительно персистировать в инфицированном организме, вызывая хронические инфекции и прогрессирующие деструктивные и пролиферативные процессы (161). Показано, что у различных индивидов существуют выраженные отличия к восприимчивости той или иной инфекции (133). В ряде случаев инфекция не ограничивается местным воспалением, а сочетается с поражением внутренних органов. Такие возбудители, как Chlamidia trachomatis и Mycoplasma hominis, являясь внутриклеточными паразитами, могут принимать участие в формировании воспалительных процессов в суставах (46,52,67,69). Один из механизмов, через которые реализуются подобные отличия, связывают с полиморфизмом генов HLA , через продукты которых внутриклеточная инфекция индуцирует ГЗТ ответ, связанный с ТЫ и продуцируемыми ими цитокинами (11,128). В тоже время, самая ранняя стадия клинического пост-инфекционного артрита редко поддается наглядному анализу, так как пациенты обычно не наблюдаются в первые дни начала воспаления (96), что делает ценным прогнозирование течения локального воспалительного процесса, вызванного урогенитальной инфекцией. Особенную роль в этом отношении приобретают малоизученные полиморфные гены HLA- региона, продукты которых принимают непосредственное участие в тонких молекулярных механизмах процессинга и презентации антигена. Существуют многочисленные гипотезы, объясняющие механизмы инфекционно-воспалительных и аутоиммунных заболеваний, таких, как РА, БР, РеА, включая молекулярную мимикрию, иммунный ответ на артритогенные пептиды, сложные иммунные взаимодействия, генетическую предрасположенность к заболеванию (96). Однако, при анализе причин развития патологии, необходим комплексный подход, рассматривающий вклад отдельных триггерных механизмов и их возможные взаимодействия.

Учитывая, что С. trachomatis и M.hominis являются внутриклеточными паразитами, при элиминации из организма они подвергаются внутриклеточному процессингу, в котором участвуют белки переносчики ТАР1 и ТАР2 (transporter associated with processing), связывающие и транспортирующие эндогенные пептиды в эндоплазматический ретикулум (ЭР) (59,60,132). ТАР белки осуществляют АТФ зависимый перенос, причем белки ТАР1 и ТАР2 взаимодействуют с пептидами избирательно. Показано, что на характер формирования противоинфекционного иммунного ответа могут оказывать влияние различия в структуре ТАР1 и ТАР2, обусловленные генетическим полиморфизмом (105,117).

Центральную роль в иммунном ответе при инфицировании и, возможно, в аутоиммунном ответе в последнее время отводится белкам теплового шока (hsp) (63,147,167), выполняющих роль молекулярных шаперонов при сборке или деградации белков и, одновременно, участвующих в процессинге антигена. Особенная роль белков этого семейства подчеркивается тем, что они принимают участие как в нормальной клеточной физиологии в качестве молекулярных шаперонов, так и в стрессовых условиях, обеспечивая адаптационную и стрессовую толерантность. Накопленные данные о высоком филогенетическом консерватизме белков теплового шока между видами (61,76,145,199) сочетаются с данными о полиморфности кодирующих их генов (170,220). Полиморфизм может быть ассоциирован с различиями в клеточном ответе на стрессовую стимуляцию, включая инфекционные процессы и различные патологические состояния. Ряд авторов указывает на независимый вклад определенных аллельных вариантов генов в развитие заболевания, другие склонны считать, что подобная ассоциированность с патологией обусловлена неравновесным сцеплением с классическими HLA-генами (66,208). Одной из причин таких разногласий могут являться как этнические особенности исследуемых групп, так и недостаточная изученность ассоциированности указанных генов в сочетании с другими генами HLA-комплекса с определенными патологиями (63,147,167).

Цель исследования.

Проведение комплексного анализа ассоциированности аллельных вариантов генов ТАР1 и ТАР2, HSP70-1, HSP70-2 и HSP70-HOM с предрасположенностью к развитию ревматоидного артрита, болезни Рейтера и реактивного артрита, протекающих на фоне внутриклеточного инфицирования С. trachomatis и M.hominis. Задачи исследования.

1. Исследовать аллельный полиморфизм генов ТАР1 и ТАР2 среди здоровых жителей Сибири европеоидного происхождения в сопоставлении с группами больных хламидийными и микоплазменными уретритами, больных реактивными артритами, болезнью Рейтера и ревматоидным артритом.

2. Исследовать распределение частот аллелей генов HSP70-1, HSP70-2, HSP70-HOM среди здоровых жителей Сибири европеоидного происхождения в сопоставлении с группами больных хламидийными и микоплазменными уретритами, больных реактивными артритами, болезнью Рейтера и ревматоидным артритом.

3. Исследовать характер совместного наследования аллельных вариантов генов ТАР1 и ТАР2, HSP70-1, HSP70-2 и HSP70-HQM с труппами аллелей гена HLA-DRB1 и особенности распределения антигена HLA-B27 среди здоровых жителей Сибири европеоидного происхождения и больных хламидийными и микоплазменными уретритами, больных реактивными артритами, болезнью Рейтера и ревматоидным артритом.

4. Определить прогностическую значимость изолированного и совместного выявления аллельных вариантов генов ТАР1 и ТАР2, HSP70-1, HSP70-2 и HSP70-HOM, HLA-DRB1 и HLA-B27 в индукции перехода локального воспалительного процесса, вызванного Chlamidia trachomatis и Mycoplasma hominis, в процесс развития экстрагенитальных проявлений в форме суставных синдромов. Научная новизна работы.

Впервые методами гибридизации ДНК со смешанными сиквенс-специфичными праймерами (SSP-sequence specific probe), амплификации полиморфных фрагментов с использованием специфических олигонуклеотидов (ARMS-amplification refractory mutation system), Nested-PCR, рестриктным анализом амплифицированных фрагментов (RFLP-restriction fragment length polymorphism) с использованием рестриктаз AsuCII и AccBSI, PstI и Ncol проведен анализ характера распределения аллельных вариантов генов ТАР1 и ТАР2, HSP70-1, HSP70-2 и HSP70-HOM среди европеоидного населения Сибири и установлены закономерности их совместного наследования с вариантами «классических» HLA- генов I (HLA-В27) и II (HLA-DRB1) классов.

Впервые в данной популяции установлен различный характер ассоциированности аллельных вариантов генов ТАР1 и ТАР2, HSP70-1, HSP70-2 и HSP70-HOM с наличием предрасположенности и резистентности к возникновению как местных воспалительных процессов в форме вызванных Chlamidia trachomatis и Mycoplasma hominis уретритов, так и к развитию экстрагенитальных осложнений инфекционного процесса в виде реактивных артритов, болезни Рейтера и ревматоидного артрита.

Впервые показано, что, в отличие от инфекционного процесса, индуцированного M.hominis, на формирование генетической предрасположенности к развитию суставного синдрома на фоне инфицирования С. trachomatis наиболее существенное влияние оказывают аллельные варианты генов HLADRB1, ТАР и HSP70.

Высказана и обоснована гипотеза о том, что спектр формирования патологического процесса в ответ на инфицирование Chlamidia trachomatis и Mycoplasma hominis, в диапазоне от локального уретрита до развития системных суставных синдромов различной тяжести, определяется не столько самим возбудителем, сколько вариантом индуцированного иммунного ответа, находящегося под контролем сложного комплекса генов иммунного ответа, в состав которого входят не только «классические» HLA гены различных классов, но и гены процессинга антигенного материала возбудителей внутриклеточных инфекций. Практическая значимость работы.

Отработаны и опубликованы методические условия для достоверного анализа полиморфизма генов ТАР1 и ТАР2, HSP70-1, HSP70-2 и HSP70-НОМ с использованием методов ARMS, Nested-PCR и PCR-RFLP с использованием отечественной приборной и реактивной базы.

В результате проведенного исследования впервые проведен анализ распределения аллельных генов ТАР1 и ТАР2, HSP70-1, HSP70-2 и HSP70-НОМ среди европеоидного населения Сибири, что может быть использовано, как для сравнительной этногенетической характеристики данной популяции, так и для разработки новых иммуногенетических методов прогноза и раннего диагноза многих социально-значимых болезней.

Установленные различия в частоте распределения аллельных вариантов этих генов и их межлокусных комбинаций с широко используемыми в артрологии вариантами HLA генов DR4 и В27, могут явиться основой для разработки дополнительных лабораторных критериев раннего дифференциального диагноза и прогноза заболеваний суставов с различными вариантами клинического течения (реактивных артритов, болезни Рейтера и ревматоидного артрита).

Положения, выносимые на защиту.

1. Характер распределения аллельных вариантов генов ТАР1 и ТАР2, HSP70-1, HSP70-2 и HSP70-HOM и степень их совместного наследования с вариантами HLA- генов I (HLA-B27) и II (HLA-DRB1) классов среди пациентов с уретритами, индуцированными С. trachomatis и М. hominis, и пациентов с реактивными артритами, болезнью Рейтера и ревматоидным артритом, протекающими на фоне этих инфекций, отличается от таковых для популяции практически здорового населения Сибири европеоидного происхождения.

2. Белковые продукты аллельных вариантов генов ТАР1 и ТАР2, HSP70-1, HSP70-2 и HSP70-HOM, связывающие и транспортирующие эндогенные пептиды в эндоплазматический ретикулум и выступающих в роли молекулярных шаперонов при сборке или деградации внутриклеточных белков, оказывают существенное влияние на характер иммунного ответа к Chlamidia trachomatis и Mycoplasma hominis и, связанного с ним, формирования локального или экстрагенитального патологического процесса.

3. Инфицирование С. trachomatis и М. hominis является пусковым моментом для развития целого ряда патологических процессов, как локального, так и системного характера, при формировании которых одним из механизмов генетической предрасположенности может являться индивидуальный набор аллельных вариантов генов ТАР 1 и ТАР2, HSP70-1, HSP70-2, HSP70-HOM, HLA-B27 и HLA-DRB1, содержащийся в генотипе инфицируемого индивида.

Часть I. Литературный обзор.

Выводы

1. Выявлено преобладание частоты отдельных аллельных вариантов генов ТАР1 и ТАР2, HSP70-1, HSP70-2 и HSP70-HOM в популяции практически здоровых лиц над другими, характер их распределения может считаться впервые проанализированным для популяции жителей Сибири европеоидного происхождения.

2. Достоверно измененные частоты некоторых нуклеотидов в полиморфных сайтах 5'некодирующего региона HSP70-1 гена и кодирующих регионах HSP70-2 и HSP70-HOM генов среди лиц с не осложненными уретритами, вызванными С.trachomatis и M.hominis, могут рассматриваться в качестве генетических признаков предрасположенности или резистентности к развитию этих внутриклеточных инфекционных заболеваний.

3. Аллельный вариант ТАР1А является генетическим признаком предрасположенности к развитию реактивного артрита, болезни Рейтера и ревматоидного артрита у пациентов, инфицированных С. trachomatis. Ряд других аллельных вариантов этого гена являются индивидуальными признаками предрасположенности и резистентности к развитию заболеваний суставов различной природы.

4. Наличие определенных нуклеотидов в полиморфных сайтах регуляторного региона HSP70-1 гена и кодирующих регионах HSP70-2, HSP70-HOM генов в генотипе пациентов, инфицированных С. trachomatis и M.hominis, является дополнительными генетическими признаками предрасположенности или резистентности к развитию суставного синдрома инфекционно- воспалительного или аутоиммунного характера.

5. Сравнительный анализ характера распределения групп аллельных вариантов некоторых HLA генов I и II классов, ассоциированных с развитием суставной патологии, показал повышенную частоту встречаемости специфичности гена DRB1 *05 (11) и подтвердил повышенную частоту антигена В27 среди пациентов с реактивными артритами, Болезнью Рейтера; увеличение варианта DRB1*04 и снижение частоты DRB1*02 (15) среди больных ревматоидным артритом. Снижение частоты встречаемости специфичности DRB1 *03 (17) среди пациентов с реактивными артритами свидетельствует против концепции о наличии аутоиммунного компонента в их патогенезе.

6. Выявленные закономерности совместной встречаемости в генотипе аллельных вариантов генов ТАР1, ТАР2; нуклеотидов в полиморфных позициях 5"некодирующего региона HSP70-1 гена и кодирующих регионах HSP70-2 и HSP70-HOM генов с вариантами некоторых HLA генов I и II классов, ассоциированных с развитием суставной патологии, показал наличие межлокусных ассоциаций в генетическом HLA- комплексе, участвующем в формировании генетической предрасположенности к развитию суставного синдрома, индуцированного наличием очагов хронической внутриклеточной инфекции.

7. Аллельные варианты генов, белковые продукты которых принимают участие в процессинге антигенного материала возбудителей внутриклеточных инфекций С.trachomatis и M.hominis, совместно с другими генами HLA-комплекса, могут рассматриваться в качестве генов, ассоциированных с предрасположенностью и резистентностью к развитию хронического инфекционного процесса и связанных с его наличием заболеваний суставов различного характера, а выраженные различия в частоте встречаемости аллелей этих генов и их комбинаций среди здоровых и больных лиц могут явиться основой для разработки иммуногенетических критериев раннего дифференциального диагноза и прогноза болезней суставов.