Автореферат и диссертация по медицине (14.00.06) на тему:Аффинные сорбенты для лечения сердечно-сосудистых заболеваний

На правах рукописи

ПОКРОВСКИЙ СЕРГЕЙ НИКОЛАЕВИЧ

АФФИННЫЕ СОРБЕНТЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.

14.00.06. - Кардиология 03.00.04. - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА-2004

Работа выполнена в группе Аффинных сорбентов для медицины Отдела клеточной биологии НИИ Экспериментальной кардиологии Российского Кардиологического Научно - Производственного Комплекса МЗ и СР РФ .

Официальные оппоненты:

Академик РАМН,

доктор медицинских наук,

профессор Рафаэль Гегамович Оганов

Академик РАМН,

доктор медицинских наук,

профессор Юрий Михайлович Лопухин

Член-корреспондент РАН, академик РАМН,

доктор биологических наук,

профессор Всеволод Арсеньевич Ткачук

Ведущая организация:

НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН.

Защита состоится 18 января 2005 года в 13-30 на заседании диссертационного совета Д 208.073.02 при РК НПК МЗ и CP РФ по присуждению ученой степени доктора наук (Москва, 121552, 3-я Черепковская ул., д.15а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РК НПК МЗ и CP РФ.

Автореферат разослан " 18 " декабря 2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук,

Т.Ю. Полевая

200-4- k

k н сз

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

История вопроса и актуальность проблемы. Появление и накопление в крови человека различных патогенных веществ приводит к возникновению и развитию многих заболеваний. Такими компонентами могут быть: аутоантитела, циркулирующие иммунные комплексы, атерогенные липопротеиды, эндогенные и экзогенные токсины, прионы, вирусы, и микроорганизмы. Их полное удаление или снижение концентрации, как правило, дает положительный клинический эффект. В частности, одной из задач терапии атеросклероза, связанного с нарушением липидного обмена, является снижение концентрации атерогенных апоВюо-содержащих липопротеидов в крови пациента. Основное направление терапии при аутоиммунных заболеваниях - удаление патогенных аутоантител или антигенов.

Традиционным подходом к лечению, в тех ситуациях, когда необходимо снизить концентрацию тех или иных веществ, является лекарственная терапия. Однако, в ряде случаев, она имеет ограничения в применении. Кроме того, для некоторых патологий лекарства, эффективно снижающие концентрацию патогенов в крови, отсутствуют. Поэтому поиск и разработка новых эффективных способов снижения концентрации патогенных веществ в крови больных с использованием методов биохимии, иммунологии, молекулярной биологии и биотехнологии до сих пор остается актуальной задачей.

70-80-е годы прошлого века ознаменовались серьезными успехами в изучении молекулярно-клеточных механизмов возникновения и развития атеросклероза. Было накоплено большое количество данных эпидемиологических исследований, которые подтвердили «липидную гипотезу» возникновения атеросклероза, впервые сформулированную в 1913 году Аничковым H.H. и Халатовым С.Н. Сегодня известно, что концентрация общего холестерина (ОХС) и холестерина атерогенных липопротеидов низкой плотности (ХС-ЛНП) имеет прямую зависимость со смертностью от сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и с количеством осложнений атеросклероза в виде инфарктов и инсультов. Существуют наследственные заболевания, которые приводят к раннему развитию атеросклероза - семейная гиперхолестеринемия (СГХС), которая может рассматриваться как созданная природой модель атеросклероза. В начале 80-х юдов были открыты молекулярные и генетические механизмы возникновения СГХС На типа [Golstein, Braun et al., 1982, 1983] Подтверждение липидной гипотезы привело к созданию новых гиполипидемических препаратов, которые в большинстве случаев позволяют успешно контролировать уровень липидов. Причем как в США, так и в Европе, прослеживается тенденция постоянного ужесточения «целевых» уровней ОХС и ХС-ЛНП, которых необходимо достигать при первичной и при вторичной профилактике атеросклероза. Например, в 2004 году в США целевой уровень ХС-ЛНП для больных ишемической болезнью сердца (ИБС) снижен до 70 мг/дл (дополнение к ATP III, 2004). Однако возникают ситуации, когда даже агрессивная гиполипидемическая лекарственная терапия не достаточно эффективна или прием лекарств связан с осложнениями, т.е. речь идет о больных, резистентных к лекарственной терапии. К таким больным

РОС НШИОИАЛЬНАЯ С ИЬЛ ИОТЕКА С Петербург

относят: СГХС - гомозиготные и некоторые гетерозиготные формы, часть больных первичной и вторичной птперлипидемией; детей; беременных женщин и др В этом случае встает вопрос о применении дополнительных подходов к коррекции нарушений липидного обмена, которыми являются различные экстракорпоральные методы лечения. Возможность использования плазмообмена для лечения больных СГХС была впервые показана De Gennes [De Gennes et al., 1967]. Впоследствии Thompson G.L. добился хороших результатов в лечении больных гомозиготной СГХС при помощи плазмообмена [Thompson et al., 1975, 1980, 1985].

Именно попытки лечения СГХС, в частности СГХС IIa типа, стали причиной быстрого развития эктракорпоральных методов. Дефицит функционально активных рецепторов, вызванный мутацией, приводит к накоплению липопротеидов низкой плотности (ЛНП) в плазме крови больных СГХС практически с момента рождения. Медикаментозная терапия для этих пациентов малоэффективна.

Экстракорпоральные процедуры удаления ЛНП для такой категории больных можно рассматривав как лечение выбора. Для длительного, систематического снижения уровня ЛНП в организме пациента необходимы методы, позволяющие селективно удалять атерогенные липопротеиды при минимальном воздействии на системы гомеостаза. Одним из решений этой задачи стал метод, получивший название ЛНП аферез*, в котором для связывания ЛНП использовался сорбент с поликлональными антителами (ПкАт) к ЛНП [Stoffel, 1981]. Впоследствии, термин ЛНП аферез стал употребляться по отношению ко всем экстракорпоральным методам, используемым для снижения концентрации ЛНП, а термин терапевтический аферез объединил все методы экстракорпоральной терапии.

Основная особенность селективных методов терапевтического афереза заключается в непрерывной обработке плазмы или крови пациента Для этого, как правило, используются сорбционные колонки, которые связывают патогены плазмы или крови и удаляют их из кровотока. Если связывание компонентов плазмы с колонкой происходит за счет физико-химического взаимодействия, метод называется селективным (удаляются все вещества плазмы с похожими физико-химическими свойствами) Если связывание с колонкой происходит по типу высокоспецифичного белок - белкового взаимодействия типа: антиген-антитело, фермент-субстрат, рецептор - агонист и т.д; метод является специфичным и позволяет удалять вполне определенные компоненты плазмы. Как правило, для одного больного используются две сорбционные колонки, через одну проходит плазма и она насыщается, после чего ток плазмы переключается на вторую колонку, а первая в это время регенерируется и может быть повторно использована в той же процедуре. Таким образом, во время одной процедуры афереза может проводиться несколько хроматографических циклов, что придает системе практически неограниченную сорбционную емкость (рис 1). Эффективность процедуры будет зависеть от времени ее проведения и объема плазмы, прошедшей через колонки. Данная работа посвящена разработке и характеристике высокоспецифичных аффинных сорбентов для процедур терапевтического афереза больным ССЗ резистентным к другим видам терапии

Аферез - удаление (греческий)

Накоплено немало примеров успешного применения сорбционных методов терапевтического афереза: для лечения сердечно-сосудистых и аутоиммунных заболеваний,

печеночной недостаточности в акушерстве и гинекологии, при трансплантации органов, в дерматологии, онкологии,

ревматологии, при острой

интоксикации и инфекции организма [Лопухин и др., 1975, 1977, 1985]. В результате становления и развития этого направления медицины, dano очевидным, что разработка высокоспецифичных сорбентов для клинического применения, которые могут быть успешно, безопасно и эффективно использованы для очистки крови, является актуальной проблемой биохимии. Учитывая многообразие показаний к применению сорбционной терапии, создание новых поколений высокоспецифичных сорбентов имеет большое научно-практическое значение.

Цель и задачи работы. Цель настоящей работы - создать новое поколение высокоспецифичных аффинных сорбентов для экстракорпорального удаления из крови человека патогенных веществ и исследовать особенности их применения при лечении больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями, резистеншых к лекарственной терапии.

Экспериментальные задачи:

1 Синтезировать, характеризовать и апробировать в клинике сорбент с моноспецифическими ПкАт барана против ЛНП человека. Исследовать эффективность и безопасность использования такого сорбента в процедурах ЛНП афереза.

2. Получить и характеризовать панель моноклональных антител (МкАт) против ЛНП человека. Показать принципиальную возможность использования МкАт для синтеза иммуносорбентов с целью их применения в терапевтическом аферезе.

3. Создать in vitro модель ЛНП афереза и с помощью такой модели исследовать его эффективность на органной и клеточной культурах аорты человека.

4. Сравнить различные типы сорбентов для ЛНП афереза. Изучить особенности их взаимодействия с плазмой крови человека.

5. Исследовать связь липопротеида(а) [Лп(а)] с наличием и тяжестью атеросклеротических поражений артерий различных локализаций.

аппарат адсорбции - десорбции

Рис.1. Схема процедуры терапевтического афереза с исполыованием иммуносорбционных колонок.

6. Синтезировать, характеризовать и провести клинические испытания иммуносорбента для специфического удаления из плазмы крови человека Лп(а). Изучить возможность и эффективность использования такого сорбента для лечения больных ИБС с повышенным содержанием Лп(а).

7 Изучить возможность и особенности синтеза аффинных сорбентов с иммобилизованными антигенами на примере сорбента с ЛНП человека.

8 Синтезировать, характеризовать и показать принципиальную возможность использования иммуносорбента для удаления патогенных аутоантител из крови больных дилатационной кардиомиопатией при Ig аферезе.

9 Разработать технологию создания колонок с аффинными сорбентами для процедур терапевтического афереза.

Научная новизна. Создано новое направление в отечественной биохимии и биотехнологии: «Аффинные сорбенты для медицины», которое в настоящее время успешно развивается. Впервые в стране разработаны и внедрены в клиническую практику аффинные сорбенты для лечения больных с нарушениями липидного обмена и ДКМП, резистентных к лекарственной терапии. Все сорбенты, представленные в работе, созданы впервые в России, а сорбенты для: ЛНП афереза с МкАт, Лп(а) афереза и ЛНП сорбент получены впервые в мире и не имеют аналогов. Разработаны подходы к созданию высокоспецифичных аффинных сорбентов для процедур терапевтического афереза. Определены основные принципы, позволяющие синтезировать сорбенты с заданными свойствами для лечения различных патологий. Сорбенты для ЛНП, Лп(а) и Ig афереза успешно апробированы в клинике и разрешены к клиническому применению в России и за рубежом.

На примере больных с: СГХС Па типа; гиперлипидемиями, устойчивыми к лекарствам; ИБС и повышенным уровием Лп(а); ИБС и аутоантителами к ЛНП; ДКМП с высоким титром аутоантител к (31-адренорецептору - показана возможность эффективного удаления как патогенных антигенов[ЛНП и Лп(а)], так и антител (анти-ЛНП и анти-IgG) с помощью высокоспецифичных аффинных сорбентов.

Использование аффинных сорбентов открыло новые возможности исследования т vivo вопросов участия различных компонентов крови человека (антигены и/или антитела) в патогенезе различных заболеваний. Проведение процедур Лп(а) афереза позволило продемонстрировать агерогенность Лп(а) и открыло новые перспективы изучения различных аспектов метаболизма частиц Лп(а) гп vivo, что было невозможно ранее.

Получены новые данные о клинической эффективности изолированного высокоспецифичного удаления Лп(а) у больных ИБС с повышенным уровнем ЛпСа) и нормальным ХС-ЛНП и ОХС. Внедрение Лп(а) афереза позволило получить первые прямые доказательства участия частиц Лп(а) в формировании и развитии этеросклеротических поражений коронарных артерий.

Испытания колонок ЛНП сорбента позволили впервые получить экспериментальные данные о наличии в крови некоторых больных ИБС фракции

иммуноглобулинов класса G, имеющих сродство к ЛНП, что может свидетельствовать о вкладе аутоиммунных процессов в патогенез атеросклероза.

Практическая значимость работы. Все сорбенты, описанные в работе, успешно прошли клинические испытания. Колонки на основе сорбентов с ПкАт и МкАт к ЛНП зарегистрированы МЗ СССР и разрешены к широкому применению в медицинской практике. Создана и внедрена в практику современная уникальная технология производства колонок с аффинными сорбентами, соответствующая правилам GMP (Good Manufacturing Practice). Впервые на территории бывшего СССР создан продукт, разработка и производство которого, соответствуют международным требованиям, предъявляемым к Системе качества (получен сертификат ISO 9001). Колонкам «ЛНП Липопак»®, «Лп(а) Липопак»® и «Ig Адсопак»® присвоен «СЕ mark», что открывает возможность их использования без ограничений в странах Европейского сообщества. Созданные в результате настоящей работы колонки были апробированы и используются для лечения тяжелых рефрактерных к другим способам терапии больных с нарушениями липидного обмена в клиниках России, Германии, США, Японии, Англии, Италии, Болгарии, Чехии, Турции, ОАЕ и Китая под зарегистрированными торговыми марками. «LDL Lipopak»®, «Lp(a) Lipopak»® и «Ig Adsopak»®.npH длительном использовании колонок с сорбентами для ЛНП афереза удалось продемонстрировать возможность не только стабилизации, но и обратного развития (регрессии) коронарного атеросклероза у больных СПХС. Доказано улучшение состояния больных тяжелыми формами атеросклероза при длительном курсе афереза липидов.

Показано, что Лп(а) может быть использован как биохимический маркер возникновения атеросклероза. Данные о концентрации Лп(а) в крови пациента могут в ряде случаев облегчить диагностику нарушений липидного обмена.

Использование колонок «Ig Адсопак»® в процедурах Ig афереза для лечения больных с тяжелыми формами ДКМП открыло новые перспективы ее лечения

На основе антител, полученных в ходе выполнения работы разработан целый ряд иммунохимических методов количественного определения концентрации различных компонентов крови, таких как: аполипопротеинВюо - турбодиметрия; Лп(а) -радиальная иммунодиффузия и иммуноферментный анализ (ИФА); антитела человека против иммуноглобулинов барана и/или мыши - ИФА; суммарной фракции IgG-турбодиметрия. Все перечисленные методы успешно используются для определения концентрации указанных веществ в образцах крови человека.

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась 18 ноября 2003 года на заседании Ученого Совета института Экспериментальной кардиологии РК НПК МЗ и CP РФ. Основные результаты были представлены и обсуждены на следующих отечественных и международных Симпозиумах, Конференциях и Конгрессах: Международной конференции по профилактической кардиологии (Москва 1985); Всесоюзной конференции по «Диагностике и лечению атеросклероза» (Томск 1985); Симпозиуме «Липопротеиды и атеросклероз» (Санкт-Петербург 1995); 4,9,11

конференциях Московского Общества гемафереза (Москва 1996, 2001,2003); 1 Всероссийской конференции по проблемам атеросклероза (Москва 1999); II Конгрессе ассоциации кардиологов СНГ, (Бишкек 1999); Симпозиуме «Экспериментальные и клинические проблемы атеросклероза» ассоциации кардиологов СНГ (Москва 2000); 2-ой международной научно-практической конференции «Наука и образование в XXI веке», (Москва 2001); научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической медицины» (Москва, 2001); первом объединенного конгрессе «Актуальные проблемы экстракорпорального очищения крови, нефрологии и гемафереза» (Москва, 2002), 8 Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва 2002); Российском национальном конгрессе кардиологов, (Санкг-Пегербург,

2002); Конференции «Терапевтический аферез - итоги и перспективы» (Санкт-Петербург 2003); 4 Международной конференции «Актуальные аспекты очищения крови в интенсивной терапии» (Москва 2004); Симпозиуме «Immune and Metabolic Aspects of Therapeutic Blood Purification System» (Трондхейм 1985); 5, 10,11,12,13,14 Конгрессах European Society for Haemapheresis (Кельн 1987, Вена 1995, Дижон 1997, Мальмо 1999, Рива дел Гарда 2001, Прага 2003 ), 33, 18 Конгрессах American Society for Artificial Internal Organs (Нью-Йорк 1987, Монреаль 1991); 6,7,9 Dresden Lipid Symposium (Дрезден 1988,1991,1997); 17,18,22 Конгрессах European Society for Artificial Organs (Болонья 1990, Вена 1991, 1995); Собрании American Apheresis Society (Сан-Франциско 1990); IX,X,XI,XII,XIII International Symposium on Atherosclerosis (Чикаго 1991, Монреаль 1994, Париж 1997, Стокгольм 2000, Киото

2003); 18 Конгрессе International Society for Artificial Organs (Монреаль 1991); 5 Конгрессе French Hemapheresis Society (Лион 1992); Конференции Lipids in Medicine (Болонья 1992), 59, 62, 64, 73, 74 Конгрессах European Atherosclerosis Society (Ницца 1992, Иерусалим 1993, Утрехт 1995, Зальцбург 2002); 2 International Lp(a) Conference (Новый Орлеан 1992); 2,5 Int. Symposium Multiple Risk Factors in Cardiological Disease (Осака 1992, Венеция, 1999); International Congress on Heart Disease (Вашингтон 1999), Congreso Int.de Atherosclerosis (Гавана 2000); Int. Conference for Apheresis (Киото 1996, Саарбрукен 1999, Нэшвилл 2003), 4 International Symposium: Treatment of the Severe Dislipoproteinemia in the Prevention of Coronary Heart Disease (Мюнхен 1992); XIII,XIV Int. Symposium on Drugs Affecting Lipid Metabolism (Флоренция 1998, НьюЙорк 2001); 2,3,4,5,6,9 Конгрессах World Apheresis Association (Оттава 1988, Амстердам 1990, Саппоро 1992, Хьюстон 1994, Флоренция 1996, Париж 2002, Майями

2004).

По теме работы опубликовано 96 печатных работ (60 статей), из них 63 в зарубежных журналах и изданиях. Получено авторское свидетельство СССР, а также патенты Германии и России.

Структура работы. Диссертация состоит из восьми разделов: введения; обзора литературы, посвященного сорбционным технологиям в лечении сердечнососудистых заболеваний; материалов и методов исследования; результатов и их обсуждения; заключения; 10 выводов, приложений и списка цитированной литературы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 1. Иммуносорбенты для ЛНП афереза.

К моменту начала нашей работы - в декабре 1982 года, в Германии была предпринята первая попытка селективного удаления in vivo апоВюо-содержащих липопротеидов на сорбенте с иммобилизованными антителами к ЛНП [Stoffel et ai., 1981], однако все вопросы, касающиеся создания сорбентов для процедур терапевтического афереза, оставались открытыми. Необходимо было не просто разработать условия и синтезировать сорбент, специфически связывающий заданный компонент крови, а обеспечить эффективность и безопасность его использования в экстракорпоральной процедуре.

Нами была предложена принципиальная схема создания иммуносорбционных колонок для терапевтического афереза. Она включает стдию выделения и очистки патогенного компонента из крови человека (I), использование его в качестве антигена для иммунизации животных, в крови которых продуцируются антитела (И), выделение и очистку антител (III), синтез на их основе специфического биосовместимого сорбента (IV) и приготовление колонок с сорбентом, готовых к клиническому применению (V) (рис 2).

Необходимые методические подходы были впервые отработаны на примере сорбента с ПкАт д ля ЛНП афереза.

Специфические требования, были учтены нами уже при выполнении I этапа -стадии выделения антигена. Для эффективного связывания апоВ-содержащих липопротеидов из плазмы крови человека, необходимо было получить антитела против наиболее распространенных и консервативных для всей гетерогенной популяции частиц ЛНП антигенных

детерминант (эгштопов) апобелка В100. Кроме того, антитела должны были узнавать эпитопы,

экспонированные на поверхности нативной частицы ЛНП.

Использование в качестве антигена препарата апоВ100 могло привести к образованию

«артефактных» антител,

неспособных взаимодействовать с нативными частицами ЛНП. Поэтому требовалось разработать

| Кровь человека__

I Очистка (!)

Антиген

Иммунизация (II)

Животные доноры

Очистка (110

Антитела

Иммобилизация (IV)

Гель сорбента

I Заполнение и промывке (V)

Колонки

Рис. 2. Основные стадии получения колонок с аффинными сорбентами для терапевтического афереза

метод получения максимально гетерогенного иммунохимически и высокоочищенного (не содержащего примеси других липопротеидов и белков плазмы крови) препарата ЛНП

ЛНП выделяли из плазмы крови больных ИБС, полученной после проведения процедур плазмафереза В результате последовательного ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте плотности нейтральной соли ЫаВг отделяли фракцию, флотирующую в интервале плотности от 1,019 до 1,063 г/см3, что соответствует граничным значениям плотности флотации нативных частиц ЛНП Для повышения чистоты препарата полученную фракцию рецентрифугировали через слой буфера с плотностью 1,050 г/см3 При анализе чистоты и физико-химических свойств выделенного препарата ЛНП несколькими независимыми методами было показано, что полученный высокоочищенный препарат ЛНП плазмы крови человека не содержит примесей других липопротеидов и белков крови человека (рис.3).

гт

старт

<•> 84ЯКД 670 КД

т «лкд

^ ш 30ЛКД

" * 20.1 КД

<* 144КД

12 3

а

старт

флотация

г

Рис.3. Характеристика препарата ЛНП (1,019-1,051) г/см1) плазмы крови человека.

(а) Электрофореграмма в денатурирующих условиях Линейный градиент 7-15% ПААГ, 1% SDS, в лунку внесено 25-30 мкг белка 1- ЛНП, 2- плазма крови человека, 3- белки-маркеры, (б) Электрофореграмма в 0,5% геле агарозы 1 - плазма крови человека, 2 - ЛНП, (в) Электронная микрофотография выделенного препарата, (г) Результаты аналитического упьтрацентрифугирования Скорость вращения ротора 34000 об/мин, плотность pacmeopumew (NaBr) - 1,063 г/см3, температура 2(f С Снимки сделаны через 100 мин и 180 мин после достижения максимальной скорости вращения ротора

Такой препарат был использован в дальнейшем в качестве антигена для иммунизации животных при получении ПкАт и МкАт к ЛНП, а также для изготовления ЛНП агарозы.

Иммуносорбент с ПкАт к ЛНП. ПкАт к ЛНП выделяли из сыворотки крови животных (баранов), после их иммунизации ЛНП. Выделение и очистку ПкАт проводили методом аффинной хроматографии на иммобилизованном антигене - ЛНП агарозе Чистота и специфичность выделенного препарата антител была подтверждена несколькими методами. Методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях было показано, что препарат ПкАт содержит два мажорных белковых компонента, которые соответствуют тяжелым и легким цепям молекулы IgG (рис 4а.) Методами двойной радиальной иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза в геле агарозы была доказана моноспецифичность полученных антител в отношении апоВ-содержащих липопротеидов (рис 4 б,в). Таким образом, было показано, что полученные антитела к ЛНП являются высокоочшценным препаратом иммуноглобулинов G, моноспецифичных к ЛНП человека.

Рис.4. Характеристика препарата ПкАт барана к ЛНП человека, выделенных методом аффинной хроматографии на ЛНП агарозе.

(а) Электрофореграмма в денатурирующих условиях Линейный градиент 10-22% ПААГ, гель содержит 1% SDS, в лунки внесена по 30 мкг белка. (1) - смесь белков-маркеров, (2) -ПкАт к ЛНП

(б) Результаты радиальной иммунодиффузии В лунки внесены (1) - ФБ, (2) - препарат ЛНП (1,019-1,050 г/см3), (3) - делипидированная плазма крови человека, (4) - плазма крови человека, (5) - препарат ЛОНП (1,0061,019 г/см3), (6) - препарат ЛВП (1,0631,121 г/см3).

(в) Иммуноэлектрофореграмма в 0,5% геле агарозы. В лунки внесено • (1) - 1 мкл плазмы крови человека, (2) - 15 мкг

белка ЛНП (1,019-1,050 г/см3); в дорожке - ПкАт к ЛНП в концентрации I мг/мл

Полученный высокоочшценный препарат моноспецифичных ПкАт барана против ЛНП человека, был в дальнейшем использован как лиганд при синтезе иммуносорбента для ЛНП афереза. В качестве матрицы использовали агарозу, активацию проводили с помощью BtCN. Иммунохимическим анализом было показано, что иммуносорбент, полученный при иммобилизации ПкАт к ЛНП, обладает высокой специфичностью к ЛНП человека и практически не связывает другие компоненты плазмы крови человека Бьыо определено оптимальное количество иммобилизованных антител (5-6 мг/мл геля), обеспечивающее максимальную сорбционную емкость в

94кД ЩЩЦр

67кД т 43кД

ЗОкД 20кД

*т

1 2 а

количество иммобилизованных антител (5-6 мг/мл геля), обеспечивающее максимальную сорбционную емкость в условиях использования сорбента в клинике При выборе условий регенерации сорбента мы учитывали, что она должна быть максимально полной, не приводить к инактивации иммобилизованных антител и не использовать токсических реагентов, так как эти факторы сказываются на сорбционной емкости и количестве хроматографических циклов эффективной работы сорбента. В результате были подобраны оптимальные регенерирующие буферные растворы.

Выбранные параметры использования сорбента с ПкАт к ЛНП были тестированы в условиях его многократного применения. При определении сорбционной емкости в ряду хроматографий было показано, что в течение первых 20 циклов сорбции-десорбции сорбционная емкость практически не меняется, а к 70 хроматографии уменьшается не более чем на 20 %. Таким образом, удалось разработать методику получения регенерируемого сорбента для многократного применения.

Иммуносорбент с моноклональными антителами к ЛНП. Учитывая, что техника выделения МкАт позволяет получать препаративные количества антител с заданной специфичностью, перспективы их использования в качестве лигандов при приготовлении иммуносорбентов весьма обширны В то же время в мировой литературе не было данных об использовании сорбентов с МкАт в экстракорпоральных процедурах. Такая попытка предпринята нами впервые. Была получена панель из 14 гибридных клонов, способных синтезировать МкАт против ЛНП. Среди исследованных клонов восемь продуцировали антитела класса ^М, 6-класса Методом иммуноблотинга было показано, что МкАт всех

исследованных клонов взаимодействуют с молекулой белка апоВюо- Все исследуемые МкАт имели высокие константы связывания с ЛНП в растворе. Полученные МкАт были использованы в качестве инструмента для иммунохимического картирования экспонированной части молекулы белка апоВюо в составе частицы ЛНП, 4 из 6 исследованных МкАт обладали уникальной эпитопной специфичностью Антитело 8й4 взаимодействовало с эпитопом, ответственным за связывание ЛНП с молекулой ЛНП рецептора (табл. 1).

На основе полученных антител были синтезированы образцы иммуносорбентов, ЛНП-связывающую активность которых определяли после инкубации их как с очищенным препаратом ЛНП, так и с плазмой крови человека. Первоначально предполагалось, что необходимо получить несколько (3-5) типов МкАт, которые взаимодействуют с разными антигенными детерминантами, и их смесь использовать для приготовления иммуносорбента Сорбенты после иммобилизации МкАт на полисахаридную матрицу обладали высокой специфичностью по отношению к ЛНП, что было подтверждено при исследовании элюата с сорбента после хроматографии плазмы. Определение сорбционной емкости МкАт-агарозы показало, что часть сорбентов с МкАт класса 1^0 даже при иммобилизации лишь одного МкАт имеют сорбционную емкость сравнимую с емкостью сорбента с ПкАт (табл. 1) Различия в ЛНП связывающей активности полученных сорбентов могут быть связаны как со специфичностью антител различных клонов, так и с возможной частичной

денатурацией молекул антител при иммобилизации. МкАт, обладающие наибольшей ЛНП связывающей активностью после иммобилизации, были отобраны для последующей работы. В результате подбора условий иммобилизации, концентрации лиганда, условий регенерации - нам удалось синтезировать сорбент с МкАг, обеспечивающий более эффективное удаление ЛНП в условиях экстракорпоральной процедуры, чем сорбент с ПкАт.

Вопрос о возможности получения сорбентов на основе МкАт для клинического применения остается открытым, пока не решена проблема получения и очистки препаративных количеств МкАт. При подборе оптимального метода очистки было проведено сравнение различных методов аффинной хроматографии на ЛНП-агарозе, белокА сорбенте, сорбенте с иммобилизованными ПкАт барана к мыши, а также ионообменной хроматографии. Помимо производительности этих методов, мы исследовали антиген связывающую активность полученных антител Было показано, что оптимальным методом очистки препаративных количеств антител является ионообменная хроматография.

Таким образом на примере МкАт к ЛНП мы показали принципиальную возможность использования МкАт для синтеза регенерируемых сорбентов, способных эффективно удалять антиген из плазмы крови человека.

Таблица 1. Характеристика монокпоналъных антител к ЛНП.

Гибридома Изотип Константа связывания (М-1) Эпитопная специфичность Сорбционная емкость (мг белка ЛНП / мл геля)

Ш1 10 6x10 ? 4,5±0,2

2Н4 1йМ 9 х 108 уникальная

268 1еО 2 х 108 9

307 1вМ 8 к 109 уникальная 0,6 + 0,1

ЗН8 1йМ 8x10® 7 -

4А4 1йМ 8х109 уникальная -

4Н8 1ёО 1 хЮ9 как у 804 2,1 ±0,3

5В11 1вМ ЗхЮ9 уникальная 2,9 + 0.1

5С2 1йМ 2x109 7 -

5И8 1е01 5х 10 уникальная 3,5 + 0,3

7Е6 1йМ 2 х 109 похожая на 5В11 -

804 9 1 X 10 уникальная 6,6 ± 0,5

9С7 1вМ 5х 108 похожая на 4А4 -

12010 180 4 х 10* 7 5,9 + 0,5

ПкАт 1ев поливалентная 5,8 ± 0,4

Константы связывания МкАт с ЛНП определяли методом РИА, используя ' ЛНП Приведены средние значения I мл геля иммуносорбента содержит 5,0x0,5 мг антител Инкубацию образцов иммуносорбентов с плазмой крови человека проводили при комнатной температуре Данные приведены как среднее ± 51) по-5 измерениям

Таким образом, получена и охарактеризована панель МкАт против ЛНП человека, с помощью этих антител проведено картирование эпитопов, экспонированных на поверхности частицы ЛНП участков молекулы апоВюо- Синтезирован сорбент с МкАт к ЛНП. Показана принципиальная возможность использования одного МкАт для синтеза иммуносорбентов с высокой сорбционной емкостью. Сформулированы основные подходы к созданию сорбентов на основе МкАт для клинического применения. Доказана эффективность и безопасность использования данного сорбента в клинической практике.

Доказательство эффективности ЛНП афереза в опытах in vitro. Можно было предположить, что снижение уровня ЛНП в крови больных атеросклерозом в результате ЛНП афереза способно влиять на липидные отложения в сосудистой стенке. Однако данные о влиянии ЛНП афереза на развитие атеросклероза in vivo, а также на содержание липидов в атеросклеротической бляшке, на момент начала нашей работы в литературе отсутствовали. Поэтому мы использовали органную и клеточную культуры аорты человека, позволяющие изучать проявления атеросклероза у человека in vitro [Тертов и др., 1983] Опыты проводили на модели короткоживущей органной культуры, выделенной как из пораженных атеросклерозом, так и неизмененных участков аорты человека. Культуральную среду, в которую была помещена органная культура, пропускали в замкнутом контуре через колонку с иммуносорбентом. Было обнаружено достоверное, по сравнению с контролем, снижение в ткани с атеросклеротической бляшкой концентрации эфиров холестерина (ЭХС), свободного холестерина (СвХС) и триглицеридов (ТГ). Было показано, что ЛНП аферез in vitro приводит к значительному снижению содержания липидов в пораженной атеросклерозом ткани аорты человека и практически не влияет на их концентрацию в неизмененных участках сосудов. Результаты опытов представлены на рисунке 5.

Рис 5. Динамика

содержания липидов в органной культуре

атеросклеротической бляшки аорты человека при моделировании ЛНП

афереза. Перфузию т vilro куптуральной среды, в которой находились образцы органной культуры через колонку с иммуносорбентом, проводили в течение 16 часов, после чего ткани

культивировались еще в течение 12 часов без перфузии В контрольном опыте использовали кочонку с альбумин-агарозой Данные представлены как среднее + т из 3-5 определений в четырех независимых опытах * -р<0,05 по сравнению с контролем

Создана модель ЛНП афереза in vitro, с помощью которой показано снижение концентрации липидов в пораженных атеросклерозом участках аорты человека. Показана принципиальная возможность регрессии (обратного развития) атеросклеротических бляшек в коронарных артериях больных СГХС после длительного курса ЛНП афереза с использованием колонок «ЛНП Липопак»® и «Иммунолипосорбер МкАт».

Сравнение сорбентов для ЛНП афереза. Использование ПкАт или МкАт против ЛНП и инертной матрицы позволяет получить высокоспецифичные иммуносорбенты. Однако известен целый ряд соединений, например: 1епарин, декстрансульфат, поливиниловый спирт, полиакрилат, олигосахариды и др., которые обладают сродством к ЛНП и могут быть использованы в качестве лиганда при синтезе сорбентов для ЛНП афереза. Было проведено сравнение всех доступных сорбентов для ЛНП афереза.

В опытах in vitro проводили сравнение специфичности и сорбционной емкости сорбентов, применяемых в настоящее время для ЛНП афереза: иммуносорбентов с ПкАт и МкАт к ЛНП, гепарин-агарозы, декстрансульфат целлюлозы. Были использованы образцы сорбентов, любезно предоставленные их производителями: образцы сорбентов с ПкАт и МкАт к ЛНП («ЛНП Липопак»®, «Иммунолипосорбер МкАт», НПФ «ПОКАРД», Россия, и «LDL TheraSorb»®, «Miltenyi Biotec», Германия); гепарин-ссфароза (ЭП МБП РКНПК МЗ РФ): декстрансульфат-целлюлоза («Liposorber»®, «Капека», Япония), полиакрилат «DALI»® («Fresenius», Германия).

Сравнение проводили в условиях in vitro, имитирующих процедуру ЛНП афереза. Большая часть параметров экстракорпоральной процедуры обусловлена физиологическими особенностями человеческого организма. Скорость тока плазмы через колонку зависит от кровотока пациента и составляет, в среднем, 20-40 мл/мин, объем колонки (не более 400-500 мл) лимитирован допустимым экстракорпоральным объемом крови. Объем обработанной плазмы ограничен временем проведения процедуры (3-5 часов). Время одной хроматографии не может быть меньше 40 мин, так как это минимальное время, необходимое для регенерации колонки объемом 400 мл. И, наконец, плазма крови пациента, согласно показаниям к процедуре ЛНП афереза содержит > 250 мг/дл общего холестерина, но по мере проведения процедуры, концентрация ОХС должна быть снижена до уровня <100 мг/дл. При проведении стендовых экспериментов мы учитывали все особенности проведения процедуры.

Было показано, что все сорбенты эффективно удаляют апоВ содержащие липопротеиды из плазмы. Уровень холестерина ЛНП + ЛОНП снижается, в среднем, на 88%, суммарного холестерина - на 75%, триглицеридов - на 36%, апоВюо - на 75%. Небольшое снижение ХС-ЛВП, наблюдаемое во всех случаях, статистически незначимо и связано с потерей суммарного белка в результате эффекта разведения. Для определения специфичности сорбентов сравнивали состав элюатов, полученных после хроматографии плазмы крови человека. Известно, что в состав частиц JIHII входит 20-22% белка и 40-45% холестерина и его эфиров, поэтому отношение белок/холестерин в чистом препарате ЛНП, не содержащем примесей других белков,

тем больше в них содержание примесей других белков плазмы Отношение белок/холестерин в элюатах, полученных после хроматографии плазмы на иммуносорбентах действительно близко к величине 0,5 соответствующей чистому препарату ЛНП В то время как элюаты с гепарин-агарозы и декстрансульфат-целлюлозы имеют высокие значения такого отношения (рис 6) Это свидетельствует о высоком вкладе неспецифической сорбции при хроматографии плазмы на этих сорбентах.

о х

5

ю

п п п

Гепарин ДС

ПкАт

МкАт

ЛНП

Рис. 6. Отношение бепок/ОХС в элюатах с различных сорбентов для ЛНП афереза, содержащих в качестве лиганда• гепарин, декстрансулъфат (ДС), ПкАт и МкАт. Препарат ЛНП — положительный контроль. Данные представлены как среднее ± ЗО для 5 определений

Элюаты с различных сорбентов были исследованы методами электрофореза в денатурирующих условиях и иммуноэлектрофореза Из анализа соответствующих сканограмм следует, что лишь 8% от суммарного количества белка элюата с декстрансульфат-целлюлозы и 15% белка элюата с гепарин сорбента соответствуют молекулярной массе белка ЛНП (рис 7, а) Результаты иммуноэлектрофореза также демонстрируют высокий вклад неспецифической сорбции белков плазмы в случаях использования ионнообменных сорбентов. В отличие от элюатов, полученных с

Рис. 7 Характеристика элюатов с различных сорбентов, для ЛНП афереза. (а) Электрофореграмма в градиенте 7-15% ПААГ, 1% ££>£, в лунки внесено по 30 мкг белка элюатов с: иммуносорбента с МкАт (1), иммуносорбента с ПкАт (2), ДС-целлюлозы (3), гепарин-агарозы (4),-препарат ЛНП (5), (1,019-1,050г/см3), (б) Иммуноэлектрофорез в 0,5% геле агарозы В лунки 2,3,4,5 - внесено по 15 мкг белка элюатов и ЛНП, в лунку 1-1 мкл плазмы крови человека, в лунку б -15 мкг белка ЛНП (1,019 -1,050 г/см1). В дорожки - (а) ПкАт к ЛНП в концентрации (1 мг/мл), (б) антисыворотка к белкам сыворотки крови человека в разведении 1-4

иммуносорбентов, элюаты с гепарин-агарозы и декстрансульфат-целлюлозы содержат несколько антигенов, взаимодействующих с антисывороткой к сыворотке человеческого донора и не взаимодействующих с антителами к ЛНП (рис.7, б).

Значительные отличия в специфичности сорбентов были обнаружены при исследовании связывания факторов свертывания крови, фибронектина, фибриногена и антитромбина III. Гепарин-агароза удаляет из плазмы 24% фибриногена, 63% антитромбина III, практически полностью - фибронектин, а также V и IX факторы свертывания. Декстрансульфат-целлюлоза также полностью связывает V и IX факторы, концентрация фибронектина снижается на 65%, фибриногена - на 24%. В отличие от гепарин-сефарозы и декстрансульфат-целлюлозы, концентрация факторов свертывания практически не меняется при пропускании плазмы через колонки с иммуносорбентами (Табл. 2).

Таблица 2. Связывание белков плазмы крови сорбентами для ЛНП афереju (in vitro).

До хроматографии После хроматографии

Гепарин дс ПкАт МкАт

Фибронектин (мг/мл) 0,46±0,09 0 0,17±0,06** 0,38±0,07* 0,38±0,08*

Фибриноген (мг/мл) 2,51±0,19 1,92±0,19** 1,23±0,28 2,43±0,42 2.23-10,14

Антитромбин Ш (%) 144 54 101 121 119

С-белок (%) 88 86 97 89 88

Фактор V (%) 95±22 2±1 3±1 97±17 94±26

Фактор VII (%) 108±13 98=Ы9* 132±8*** 105±22 109±20

Фактор VIII (%) 117=28 32-125 69±16 103=1-18 114=ЫЗ

Фактор IX (%) 100Ü0 3±1 1 6±2 106±16 101=fcl8

* Различия не достоверны, ** р^0,001, *** р<0,025 Данные приведены как среднее ± Ж для 5 независимых опытов

В целом, сравнение специфичности и сорбционной емкости различных сорбентов, используемых для ЛНП афереза показывает, что сорбенты с лигандами, имеющими физико-химическое сродство к ЛНП, имеют невысокую специфичность, но не уступают иммуносорбентам в сорбционной емкости. Это, на наш взгляд, ограничивает их применение в клинике. Известно, что больные СГХС нуждаются в длительном, в ряде случаев пожизненном лечении ЛНП аферезом. В этом случае использование низкоспецифичных сорбентов будет приводить к систематическому удалению из крови важных, жизненно необходимых веществ. Длительное применение сорбентов на основе антител, обладающих строгой специфичностью, позволяет проводить длительный (более 18 лет) курс процедур ЛНП афереза безопасно для пациента.

Новым этапом развития сорбционных технологий для ЛНП афереза стало создание сорбентов, пригодных для перфузии цельной крови. Существенным преимуществом ЛНП афереза с использованием гемосорбентов является отсутствие стадии плазмасепарации, что упрощает и удешевляет процедуру. Первой системой для гемосорбции, применяемой в клинике были колонки, содержащие сорбент с полиакрилатом, и получившие название «DALI»® (Direct Adsorbtion and Lipoprotein

для гемоперфузии фирма «Капека» недавно разработала колонки с декстрансульфат-целлюлозой «Liposorber D»®, которые в настоящее время проходят клинические испытания. Мы провели сравнение сорбентов, а также сорбента, на основе полиакрилата, разработанного учеными Японии (LDL-45), и созданного нами иммуносорбента для перфузии цельной крови («ЛНП-300») Результаты тестирования сорбционной емкости гемосорбентов, в условиях, приближенных к проведению клинических процедур, приведенные на рис 8,6 показывают, что все исследуемые гемосорбенты обладают соизмеримой сорбционной емкостью, уступающей, однако, иммуносорбенту с ПкАт для плазмасорбции («ЛНП Липопак»®) Для исследования специфичности различных гемосорбентов мы изучали белковый состав элюатов методом вертикального электрофореза в денатурирующих условиях (рис 8, а) Анализ сканограмм свидетельствует, что минимальной специфичностью обладает гемосорбент с декстрансульфатом («Liposorber D»®) и «DALI»®, тогда как «ЛНП-300» сорбирует преимущественно апоВюо-

а б

ч, %

- , ' /г ,, , ''

1 2 3 4 5

15

10

X

I

3 0

Рис.8. Сравнение специфичности и сорбционной емкости различных сорбентов для ЛНП афереза, пригодных для перфузии цельной крови. (1) - «Liposorber D»® (2) - LDL-45 (3) -«DALI»®, (4) - «ЛНП-300», (5)-«ЛНП Липопак»®, (а) Электрофореграмма элюатов с различных сорбентов в градиенте 4-12% ПААГ с 1% SDS, (б) сорбционная емкость сорбентов, выраженная в количестве ОХС, связавшегося с 1 мл гечя сорбента Хроматографию проводи чи в усчовиях насыщения сорбентов, 1 мл сорбента инкубировали с 10 mi тазмы крови больных ИБС, концентрация ОХС в плазме -400 мг/дп Данные представлены как среднее ± SD из 5 независимых измерений

Клинические результаты использования иммуносорбентов в процедуре ЛНП афереза. Клинические испытания колонок с сорбентом на основе ПкАт к ЛНП («ЛНП Липопак»®) были начаты в лаборатории гемодиализа и плазмафереза Института клинической кардиологии им А.ЛМясникова в 1983 году, а спустя 3 года начались клинические испытания колонок с моноклональным сорбентом Процедуры иммуносорбции проводили 24 пациентам с СГХС, в возрасте от 7 до 57 лет, в том числе 4 - с гомозиготной формой, 16 -с гетерозиготной и 4 - с ненаследственной

формой ГХ. 19 больных перенесли инфаркт миокарда. Все пациенты имели исходно очень высокий уровень холестерина (380-1000 мг/дл) устойчивый к действию гиполипидемической лекарственной терапии. У всех взрослых пациентов были выявлены стенозы коронарных артерий, у 7 - наружные отложения холестерина в виде ксантом. Процедуры ЛНП афереза проводили с интервалом от 7 до 21 дня. За одну процедуру удаляли от 2 до 8 г холестерина, при этом удавалось достичь снижения уровня холестерина в плазме на 80%. Результаты изменения параметров липидного спектра в результате проведения процедур ЛНП афереза с использованием колонок «ЛНП Липопак»® приведены в таблице 3 После 2-4 лет лечения ЛНП аферезом у всех пациентов отмечали улучшение самочувствия, уменьшение приступов стенокардии, регрессию ксантом, а также стабилизацию и даже регрессию атероскле-ротических поражений в нескольких сегментах коронарных артерий (табл 4).

Таблица 3. Результаты ЛНП афереза па колонках «ЛНП Липопак»® и «Иммунолипосорбер МкАт»._____

Пациенты

ЛНП Липопак® Иммунолипосорбер МкАт

Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4

(гетерозиготная (гомозиготная (гетерозиготная (гомозиготная

СГХС) СГХС) СГХС) СГХС)

ОХС, мг/дл

До 445±41 518 ±65 307 ±83 551 +52

После 189 ± 23 242 + 9 122 ±61 254 ± 33

ХС-ЛНП, мг/дл

До 357 + 21 448 ± 61 255 + 83 500 ±48

После 145 ± 18 203 + 55 102 ±55 223 ± 28

ХС-ЛВП, мг/дл

До 39+14 32 + 8 35 + 15 22 + 4

После 41 ± 10 38 + 2 45 + 11 26 + 4

ОХС/ХС-ЛВП, мг/дл

До 11 ±3 16 ± 8 9 ± 5 25 ±13

После 5 ± 2 6 ± 5 3 + 6 10 + 7

Результаты представлены как среднее ±5й по 10 процедурам

Таблица 4. Результаты повторных коронароангиографий после лечения больных ЛНП аферезом с использование иммуносорбентов.

Продолжительность лечения 2-4 года 17 лет

Общее количество исследуемых сегментов коронарных артерий 23 100% 17 100%

Регрессия 7 31% 8 47%

Без изменений 21 52% 6 35%

Прогрессия 4 17% 3 17%

Новые стенозы 0 0% 0 0%

Систематическое удаление ЛНП на иммуносорбционных колонках «ЛНП Липопак»®, не ведет к каким либо негативным нарушениям и отклонениям даже у пациентов, лечение которых было начато в раннем детском возрасте. В настояшее время мы имеем 18-летний опыт лечения больных с СГХС IIa шпа [Konovalov et al, 2002]. Показано, что ЛНП аферез с использованием иммуносорбентов является безопасным и результативным методом лечения гомозиготных и гетерозиготных больных. Принципиальным является то, что длительный курс ЛНП афереза крайне тяжелых больных семейной гиперхолестеринемией позволил не только остановить и стабилизировать процесс формирования атеросклеротических поражений в коронарных артериях (не отмечено образования новых стенозов за 18 лет наблюдения), но добиться регрессии имеющихся атеросклеротических бляшек. Эти результаты получены у той категории больных, которые обычно погибают во 2-3 декадах жизни от осложнений атеросклероза.

Практика использования колонок с иммуносорбентом, описанным в данной работе («ЛНП Липопак»®) насчитывает в настоящее время более 30 пациентов в России и более 80 в других странах Полученные результаты доказывают, что использование иммуносорбентов в ЛНП аферезе позволяет получить эффект в лечении СГХС, недостижимый при использовании других методов.

Глава 2. Иммуносообент для Лп(а> афереза.

Синтез сорбента с ПкАт к Лп(а). Лп(а), как новый антиген крови человека, был открыт в 1963 году [Berg, 1963]. Лп(а) представляет собой ЛНП подобную частицу, в состав которой входит одна молекула апобелка(а), ковалентно связанная дисульфидной связью с молекулой апобелка Bj00. Позже было показано, что апо(а) состоит из повторяющихся доменов, первичная структура которых имеет 98% гомологию с IV кринглем молекулы плазминогена [Мс Lean, 1987] Таким образом возникла гипотеза о том, что частица Лп(а) может играть роль мостика между образованием атеросклеротической бляшки согласно липидной гипотезе и тромбообразованием. В 1986 году мы, впервые в стране, начали систематическое изучение Лп(а). В результате этой работы были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов Лп(а) [Афанасьева и др., 1992], получены антитела против Лп(а) человека [Адамова и др., 1990], разработаны методы количественного определения Лп(а) в крови человека [Афанасьева и др. 1995] Показано, что концентрация Лп(а) в крови больных взаимосвязана с наличием и тяжестью атеросклеротических поражений коронарных артерий (рис 9, а,б) [Ежов и др., 2000], наличием поражений сонных артерий (рис 9, в) [Варакин и др , 1993], тяжестью каротидного атеросклероза (рис 9, г) [Бритарева и др., 2002], а также с образованием рестенозов в аутовенозных шунтах после операции реваскуляризации миокарда (рис 9, д,е) [Ильина и др., 1999]. Полученные нами данные подтверждают гипотезу об атерогенности частиц Лп(а) и позволяют рассматривать Лп(а) как независимый фактор риска и биохимический маркер атеросклероза.

в.

28 -80 Лп(и), иг/до

без окклюгий

Д. е.

Рис 9. Лп(а) и атеросклероз. Взаимосвязь между уровнем Лп(а) наличием (а) и тяжестью (б) атеросклеротических поражений коронарных артерий начичием (в) и тяжестью (г) атеросклероза сонных артерии наличием (е) и степенью (д) окклюзии аутовенозных шунтов после операции реваскуляризации миокарда

До настоящего времени не создано лекарственных средств, способных эффективно снижать концентрацию Лп(а) в крови человека. Поэтому удаление Лп(а) из кровотока в экстракорпоральных процедурах - единственный способ коррекции уровня этого липопротеида Как апоВ,оо содержащий липопротеид, Лп(а), вместе с ЛНП, частично удаляется в процедурах ЛНП афереза. Вместе с тем, существует категория больных ИСБ у которых нормальный уровень ОХС и ХС-ЛНП, либо ХС-ЛНП может быть успешно снижен с помощью лекарств, а Лп(а) повышен. Таким больным не может быть показан ЛНП аферез, а возможность корректировать уровень Лп(а) отсутствует. Нами была предпринята попытка создания специфического сорбента, позволяющего эффективно удалять Лп(а) из плазмы крови таких пациентов, не затрагивая другие липопротеиды и компоненты крови.

При создании анти-Лп(а) сорбента мы использовали опыт синтеза сорбентов для ЛНП афереза. При выделении антигена, также как и в случае ЛНП, нашей задачей было получение очищенного препарата Лп(а), свободного от примеси других липопротеидов и белков плазмы. Частица Лп(а) содержит два белка - аноВюо и апо(а), ковален гно связанные дисульфидной связью. В качестве антигена можно было использовать белок апо(а), либо частицу Лп(а). Однако обнаруженные нами различия в иммунохимическом поведении выделенного апо(а) и апо(а), входящего в состав нативной частицы Лп(а), позволили нам сделать вывод о целесообразности использования в качестве антигена препарата Лп(а), а не апо(а). Был разработан оригинальный двухстадийный метод выделения Лп(а), включающий выделение с помощью ультрацентрифугирования липидной фракции, флотирующей в интервале плотности 1,063-1,090 г/см3, и гель-фильтрацию. При анализе выделенного препарата Лп(а) было показано, что молекулярная масса его белковой части соответствует комплексу апо(а)- апоВш (рис 10, а), а частица в целом имеет характерную для Лп(а) пре-р-электрофоретическую подвижность (рис 10, б).

После иммунизации животных выделенным препаратом Лп(а) была получена биспецифичная сыворотка, содержащая антитела против как апо(а), так и апоВюо. Антитела к апоВ!9о удаляли с помощью аффинной хроматографии на ЛНП-агарозе. Таким образом, получали моноспецифическую антисыворотку барана против Лп(а) человека, из которой в дальнейшем, аффинной хроматографией на Лп(а)-агарозе, выделяли моноспецифические ПкАт к Лп(а). Чистоту препарата антител контролировали методами вертикально: о электрофореза в ПААГ, двойной радиальной иммунодиффузии и иммуноферментным анализом. Было показано, что полученные антитела представляет собой высокоочищенную фракцию содержащую

специфические антитела к Лп(а). Сорбент с моноспецифическими ПкАт к Лп(а) был синтезирован по методике, разработанной нами ранее для анти-ЛНП сорбентов. Было показано, что полученный сорбент строго специфичен к Лп(а) и не обладает способностью взаимодействовать с ЛНП и другими компонентами плазмы крови человека.

Старт

-«— аро(а)-В100

Р

__ аро(а) "Ре-Р

*»>• „_ В100 а

12 3 +

а б

Рис 10. Характеристика препарата Лп(а), выделенного ультрацентрифугированием в ступенчатом градиенте плотности ТчаВг (1,063-1,090 г/см3) с последующей гель-фильтрацией (а) - вертикальный электрофорез в 4% ПААГ в денатурирующих условиях 1 - Лп(а), 2- Лп(а), обработанный ЯН-реагснтом, (б) горизонтальный электрофорез в 0,5% геле агарозы 1 - Лп(а); 2- ЛИП; 3 - ЛВП; 4- ЛОНП.

Специфический Лп(а) аферез - новый подход к экстракорпоральной коррекции повышенного уровня Лп(а). Ограниченные клинические испытания сорбента с ПкАт к Лп(а) в экстракорпоральных процедурах были начаты в Институте клинической кардиологии им А Л Мясникова в конце 1990 года

В исследование были включены больные, удовлетворяющие следующим критериям' уровень Лп(а) в плазме более 70 мг/дл, нормальный уровень ОХС, ХС-ЛНП и ХС-ЛВП, наличие ангиографически подтвержденного коронарного атеросклероза, отсутствие других, кроме Лп(а), факторов риска ИБС, согласие больного на участие в клинических испытаниях Было отобрано 3 пациента в возрасте 39, 51 и 52 лет, страдающие ИБС и стенокардией, имеющие трехсосудистое поражение коронарных артерий Процедуры Лп(а) афереза проводили еженедельно, для определения эффективности и специфичности сорбции на первых процедурах проводили измерение концентрации Лп(а) и ОХС, и апоВшо после колонки Было показано, что Лп(а) удаляется практически полностью (88% от исходного уровня) Наблюдалось незначительное снижение концентрации ОХС и апоВ10о , что соответствует количеству апоВюо и ОХС, входящих в состав Лп(а) (рис 11) Больным, находящимся на программном Лп(а) аферезе, было проведено в среднем около 300 процедур в течение 18-24 месяцев, снижение Лп(а) и других компонентов крови на процедурах Лп(а) афереза приведены в табл 5

Во время проведения процедур Лп(а) афереза не было обнаружено существенных изменений в уровне ОХС, ХС-ЛНП, ХС-ЛВП и триглицеридов. Было достоверно установлено, что длительное удаление липопротеида(а) не оказывает какого-либо влияния на углеводный, жировой и белковый обмены, системы кроветворения и функцию печени

100

200

150

100 S

О X

о

За период

клинического наблюдения состояние больных, получающих лечение Лп(а)

аферезом, улучшилось. Количество приступов стенокардии уменьшилось в 2-6 раз, возросла толерантность к физической нагрузке. Данные повторной коро-нарографии продемонстрировали отсутствие прогрессии и

достоверную

регрессию существующих атеросклеротических бляшек у 2 из 3 пациентов. В 1992 год} созданные нами колонки «Лп(а) Липопак»® начали успешно применять в клиниках Германии и Англии для лечения пациентов с изолированно повышенным уровнем Лп(а) и тяжелыми формами ИБС (Straube et al., 1996; Thompson et al., 1994; Ulrich, et al., 1998, Baumbauer, et al., 2003). К настоящему времени максимальная продолжительность проведения процедур Лп(а) афереза в Германии составляет более

1 2 3 4 5

Объем обработанной плазмы (л)

>- Лп(а) "до" -В- ОХС "до"

»—Лп(а) "после" -В- ОХС "после"

Puc.ll. Динамика уровня Лп(а) и ОХС на процедуре Лп(а) афереза. Пациент 3 Е

Таблица S. Уровень компонентов крови до и после процедуры Лп(а) афереза.

ЛН. З.Е. Ф.И

До После До После До После

Лп(а) Mi/дл 10Cta=6 27*3 120±16 28±2 90±6 13±6

ОХС мг/дл 240±40 192±4 194±4 148±4 228±9 160*5

ТГ чг/дл 81±8 45±4 180±20 108±20 230±13 72±5

ХС-ЛНП Mi/дл 192±5 148±8 132^6 108±6 144±5 120-14

ХС-ЛВП мг/дл 36±4 30±3 40±4 33±3 37±3 30±3

Общий белок г/л 75 61 67 59 69 51

Плазминоген % 105 86 115 96 . _

Фибриноген i/л 2,6 1,2 2,4 1,5 3,4 2,4

Гемоглобин г/дл 15,1 13,9 12,3 11,3 14,7 11,9

Гематокрит % 45 38 42 37 41 34

Данные приведены как среднее±т дпя 20 процедур

12 лет. Для всех больных отмечено значительное улучшение самочувствия, увеличение толерантности к физической нагрузке, снижение количества приступов стенокардии, стабилизация и регрессия атеросклеротических бляшек, отсутствие новых инфарктов и инсультов.

Таким образом, Лп(а) аферез может служить идеальной моделью для доказательства эффективности и целесообразности экстракорпоральной плазматерапии с использованием иммуносорбента.

Сочетанный аферез линидов. Использование специфических сорбентов открывает новую возможность использования экстракорпоральных методов с учетом индивидуальных особенностей пациента. В частности, существует группа больных с повышенным уровнем как ЛНП, так и Лп(а), для которых ни ЛНП аферез, ни Лп(а) аферез не решают задачу наиболее эффективной нормализации липидного спектра. В таких ситуациях, использование одновременно двух типов иммуносорбционных колонок, позволяет добиться результата Такие процедуры, названные нами -сочетанный аферез на колонках «ЛНП Липопак»® и «Лп(а) Липопак»® проводились больному с ИБС, имеющему уровень Лп(а) 100 мг/дл и ОХС - 300 мг/дл. За процедуру, включавшую три хроматографических цикла, снижение ОХС составляло 56+4%, ХС-ЛНП - 63+15%, Лп(а) - 65+16%, ЛОНП - 61± 33%, ТГ 75±15%, ХС-ЛВП - 3+3%.

На основании полученных нами данных, мы предложили общий принцип включения больных в аферез липидов (рис.12). Зная концентрацию ЛНП и Лп(а) в крови больного можно по приведенной номограмме определить какой оптимальный тип процедуры ему проводить для достижения максимальной эффективности лечения.

500 -,

400 ■

ЛНП аферез

Рис.12. Показания для включения в аферез липидов.

§ 300 ■

С 200 -

Сочетанный ЛНП и Лп(а) аферез

100

Лп(а) аферез

о

о

90

100

160

200

330

Лп(а), (мг/дп)

Глава 3 . Сорбент с иммобилизованными ЛНП плазмы крови человека

Существует целый ряд заболеваний, при которых в организме человека появляются и накапливаются аутоантитела различной специфичности или циркулирующие иммунные комплексы. В задачи данной работы входило изучение

коррекции таких нарушений методом терапевтического афереза с использованием сорбента с иммобилизованным антигеном

В 1986 году в нашем институте были проведены эксперименты по культивированию первичной культуры гладкомышечных клеток аорты человека в присутствии сыворотки крови здоровых доноров и больных ИБС Было показано, что содержание внутриклеточного холестерина в клетках возрастает в 2-5 раз при культивировании их в присутствии сыворотки крови больных коронарным атеросклерозом В то же время, добавление в культуральную среду сыворотки крови здоровых доноров практически не влияло на содержание внутриклеточного холестерина в органной культуре - это явление было названо «атерогенностью» [Тертов и др , 1986; Chazov et al., 1988] В дальнейшем было показано, что в сыворотке крови больных ИБС существует нелипидный компонент, способный взаимодействовать с ЛНП, в результате чего они приобретают атерогенные свойства Изучение природы фактора атерогенности показало, что он состоит, в основном, из иммуноглобулинов класса G, имеющих сродство к ЛНП (рис.13) Мы предположили, что они могут бьггь удалены с помощью аффинного сорбента с иммобилизованными ЛНП (ЛНП сорбент).

Данное предположение было подтверждено опытами in vitro Был получен ЛНП сорбент, через который пропускали сыворотку крови больных ИБС, обладающую атерогенностью После чего она теряла способность вызывать накопление холестерина клетками Элюат с ЛНП сорбента взаимодействовал с белокА сорбентом (рис 13).

старт

0,2 М глицин ®в рН 3,0

23 25 Объем (мл)

Рис. 13. Профиль аффинной хроматографии злюата с ЛНП сорбента на колонке с белокА-агарозой. (I) -несвязавшаяся фракция, (II) - элюат с белокА -агарозы.

Далее была

проведена работа по созданию сорбента для афереза фактора атерогенности и

проведения его клинических испытаний. Были отобраны 4 пациента, сыворотка крови которых обладала выраженным эффектом атерогенности на клеточных культурах. Все пациенты имели ангиографически подтвержденный атеросклероз, стенокардию П-Ш

II-III функционального класса, нормальный уровень холестерина - то есть показания для гиполипидемической терапии у них отсутствовали Для каждого пациента была изготовлена персональная колонка с ЛНП сорбентом, для приготовления которого использовались аутологичные ЛНП, выделенные из плазмы каждого больного, полученной при помощи плазмафереза. Каждому пациенту был проведен непродолжительный курс лечения (от 2 до 9 месяцев), состоящий из экстракорпоральных процедур на ЛНП сорбенте. В результате проведения процедуры атерогенный компонент сыворотки эффективно удалялся, концентрация его в плазме частично восстанавливалась в течение последующих 5 дней. В результате проведенной герагши у пациентов отмечали улучшение состояния - уменьшение приступов стенокардии, уменьшение количества принимаемых медикаментов, увеличение толерантности к физическим нагрузкам.

На примере сорбента с иммобилизованными ЛНП мы убедились в том, сорбент с иммобилизованным антигеном может быть использован в сшуациях, когда необходимо специфическое удаление аутоантител из организма человека. Таким образом, использование аффинных сорбенюв, способных связывать компоненты плазмы крови по принципу антиген-антитело, открывает новые возможности для высокоспецифичного удаления аутоантител из крови человека. Дополнительно была продемонстрирована возможность создания пациент-специфичных аффинных сорбентов с использованием аутологичных компонентов, выделенных из крови больного.

Глава 4. Иммуносорбент для афереза иммуноглобулинов у больных дилатадионной кардиомиопатией.

Дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) - одно из наиболее тяжелых и прогностически неблагоприятных заболеваний сердечной мышцы, характеризующееся дилатацией камер сердца и нарушением сократительных функций миокарда, связанной со снижением фракции выброса левого желудочка ДКМП часто возникает у людей молодого и среднего возраста и приводит к ранней инвалидизации. Идиопатическая дилатационная кардиомиопатия относится к числу заболеваний невыясненной этиологии К сожалению, не существует эффекшвной терапии этого заболевания. Прогноз заболевания, как правило, неблагоприятный и многие больные стоят на «листе ожидания» на пересадку сердца Получены данные, свидетельствующие о том, что довольно часто в крови больных ДКМП образуются и накапливаются аутоантитела против различных антигенов' мускариновых рецепторов, миозина, митохондриальных белков, актина, тубулина, АТФ-азы, саркоплазматического ретикулума, ßl-адренорецепторов. В настоящее время наиболее изученной является связь между ДКМП и аутоантителами против ßl-• адренорецепторов [Limas С et al., 1989; Wallukat G et al, 1991 ].

ßl-адренорецептор принадлежит к семейству мембранссвязанных G белков, которые имеют трансмембранные домены и участки полипептидной цепи, экспонированные на поверхности клеток. Изучение специфичности аутоантител к ßl-адренорецептору показало, что аутоантитела образуются против второй петли молекулы ßl-адренорецептора. Такие антитела обнаруживают у 30-80% больных ДКМП, и ряд авторов считает, что они могут использоваться как один из биохимических маркеров течения ДКМП [Wallukat et al., 1991J. Сравнительно недавно в Германии, для лечения больных с ДКМП, в крови которых обнаруживается высокий титр аутоантител к ßl-адренорецептору и другим антигенам сердечной мышцы, были апробированы методы терапевтического афереза.[Ми11ег et al., 1996; Felix et al., 1997]

В настоящее время известны попытки создания сорбентов с иммобилизованными пептидами, гомологичными участкам второй петли ßl-адренорецептора [Ronspek et al., 2002]. Однако клинические испытания таких сорбентов не выявили достоверного положительного эффекта при лечении больных ДКМП. Нами была проведена работа по созданию специфического сорбента для удаления всех иммуноглобулинов класса G. Синтез именно такого сорбента, на наш взгляд, оправдан тем, чю при ДКМП, также как и при большей части аутоиммунных заболеваний, в крови пациента обнаруживают не одно, а целый спектр аутоантител различной специфичности к собственным белкам и продуктам их модификации.

В качестве антигена использовали высокоочищенный препарата IgG человека. ПкАт к IgG выделяли из сыворотки крови баранов, после их иммунизации. Выделение проводили на колонке с IgG-агарозой. Чистота и специфичность полученных антител была подтверждена несколькими независимыми методами: электрофорез, иммуноэлектрофорез, ИФА, иммуноблотинг. В результате иммобилизации ПкАт к IgG был получен сорбент, селективно связывающий иммуноглобулины из плазмы крови человека. Изучение специфичности полученного сорбента показало, что наряду с иммуноглобулинами класса G, на него так же частично сорбируются из плазмы крови IgM, IgA, а также циркулирующие иммунные комплексы, что обусловлено структурным сходством молекул IgG, IgA и IgM. Поэтому процедуры с использованием такого сорбента получили название аферез иммуноглобулинов или Ig аферез.

При проведении Ig афереза возникает задача удаления больших масс вещества за одну процедуру (от 20 до 50 г белка иммуноглобулинов). Чтобы решить возникшую проблему, нам потребовалось изменить физико-химические свойства сорбента. При синтезе анти-Ig сорбента мы использовали новую матрицу, обладающую большей жесткостью по сравнению с ранее применявшимися. Использование сорбента с новыми физико-химическими характеристиками позволило уменьшить время контакта сорбента с плазмой в процессе процедуры, увеличить скорость тока регенерирующих буферных растворов через колонку с сорбентом, увеличить количество циклов сорбции-десорбции, проводимых в ходе одной процедуры, обеспечив, тем самым, необходимую эффективность и сорбционную емкость.

Для оптимизации проведения процедур Ig афереза с целью достижения максимального эффекта удаления иммуноглобулинов, нами был разработан алгоритм расчета параметров процедуры Ig афереза с учетом характеристик сорбента и

концентрации иммуноглобулинов в крови пациента. Это позволяет рассчитать не только оптимальный дизайн для каждой процедуры, но и прогнозировать оптимальный режим проведения лечения в целом. При расчете условий проведения процедуры мы учитывали уменьшение концентрации иммуноглобулинов в кровотоке по мере их удаления. Поэтому, время циклов сорбции менялось как в ходе одной процедуры, так и ходе всего цикла.

На рис. 14 представлены результаты теоретического расчета - кривая и реальные результаты проведения 5 процедур больному с ДКМП. Предложенная схема ^ афереза была применена для лечения 3 пациентов с ДКМП В результате курса процедур, проводимых ежедневно в течение 5 дней, достигалось 90% снижение уровня суммарных иммуноглобулинов. При этом, наряду с другими аутоантителами, полностью удалялись аутоантитела к (31-адренорецептору.

Двум пациентам было проведено по два цикла процедур, с интервалом от 10 месяцев до 1 года. Получены первые результаты эффективности лечения ДКМП 1§ аферезом.

В таблице 6 приведены данные эхокардиографии одного из пациентов, полученные в процессе лечения. В результате двух курсов процедур ^ афереза состояние больного стабилизировалось, увеличилась фракция выброса, уменьшились объемы полостей сердца.

Полученные предварительные данные позволяют надеяться, что аферез может стать новым перспективным методом лечения тяжелых форм дилатационной кардиомиопатии.

^ аферез, в отличие от других экстракорпоральных процедур с

использованием специфических сорбентов, имеет широкую область применения Это обусловлено тем,

что в процессе процедуры ^ афереза из плазмотока пациента удаляется весь пул 120 и ^М иммуноглобулинов, а также циркулирующие иммунные комплексы. То есть, в отличие от анти-Лп(а) сорбента или ЛНП сорбента. анти-1^ сорбент не является узкоспецифичным в отношении только одного компонента плазмы.

16 -т-

14-- "До

12 ^^ □После

:}11,1Тгт1т1н

1 2 3 4 5

номер процедуры

Рис. 14. Уровень /¿'С в течение курса процедур 1ц афереза у пациента Р. Теоретический расчет и практический результат.

Таблица 6. Динамика показателей сердечной функции пациента Р. в процессе лечения -аферезом._____

Период наблюдения Первичное обследование 4 месяца* 10 месяцев** 3 года

ФВ (%) 34 41 42 56

КДР ЛЖ (см) 7,2 7,6 7,2 6,3

ЛП (см) 4,7 4,7 4,1 3,9

КСО ЛП (мл) 65 - 62

КСО ПП (мл) 76 - 46 -

Аритмия Мерцательная Мерцательная Нет Нет

Толерантность к физической нагрузке (функциональный класс) 2 2 1 1

ФВ - фракция выброса, КДРЛЖ- конечный диастопическийразмер чевого жечудочка, ЛП - чевое предсердие, КСО ЛП - конечный систолический объе ч чевого предсердия, КСО ПП -конечный систочический объем правого предсердия, * после первого курса афереза ** после второго курса афереза

В настоящее время имеются сообщения об успешном применении процедур ^ афереза для лечения нефротических, неврологических, ревматологических заболеваний, для предотвращения отторжения пересаженных органов.

Глава 5. Вопросы безопасности и технология производства аффинных колонок для терапевтического афереза.

В процессе процедуры терапевтического афереза колонка с аффинным сорбентом подключается непосредственно к пациенту в экстракорпоральный контур (рис 1). Это означает, что к разработке и производству колонок, активным ингредиентом которых являются аффинные сорбенты, предъявляются особые требования. Основные параметры безопасности тестируются и достигаются на этапе разработки колонок, в процессе их лабораторных и доклинических испытаний.

При создании аффинных сорбентов особое внимание было уделено нами вопросам их биосовместимости. В частности, была исследована проблема неспецифической сорбции компонентов плазмы, подробно описанная в разделе «Сравнение сорбентов для ЛНП афереза» (Глава 1). Неспецифическая сорбция может быть причиной нарушения системы гомеостаза у пациента при длительном применении, поэтому она является одним из важных аспектов безопасности применения и биосовместимости различных сорбентов.

Не менее важным является вопрос о возможности смыва компонентов колонки или продуктов их деградации в процессе процедуры в кровоток пациента. В течение ряда лет в литературе обсуждался вопрос о возможном смыве антител с иммуносорбентов в процессе их применения. При попадании чужеродного белка (антител) в кровь больного должны появляться антитела против таких белков Изменение титра вторых антител может являться хорошим показателем для оценки возможного смыва. Нами был разработан специальный метод ИФА, который позволяет определять в плазме крови человека антитела к иммуноглобулинам барана (при использовании колонок с

ПкАт) или мыши (при использовании колонок с МкАт). Ввиду отсутствия положительного контроля, результаты были представлены как величина оптической плотности при 492 нм. В качестве отрицательного контроля использовали плазму новорожденных, тестируемые образцы крови отбирали в процессе длительного лечения пациента, за исходную точку брали образец плазмы больного до начала курса афереза Результаты тестирования уровня антител к иммуноглобулинам барана в образцах плазмы крови больных, получавших лечение ЛНП аферезом, в течение многих лет не выявили существенных различий в титре вторых антигел между исходным образцом и образцами, собранными в течение 17 лет наблюдения. Следует отметить, что в настоящее время проблема смыва антител потеряла актуальность, поскольку более чем 20 летний опыт использования иммуносорбентов не выявил ни одного побочного эффекта, связанного с иммунизацией пациента иммуноглобулинами барана.

Другим аспектом безопасности является возможность контаминации геля сорбента вирусами животного происхождения, которые могут присутствовать в сорбенте в количествах недетектируемых лабораторными методами, но достаточных, чтобы привести к заражению больного Для обеспечения безопасности применения аффинных колонок в клинике нами, была введена стадия пастеризации иммуносорбентов. Пастеризация - прогревание сорбента при 60°С в течение 10 часов является надежным способом инактивации вирусов.

В последние годы в литературе активно обсуждается опасность передачи прионной инфекции через продукты животного происхождения. Несмотря на отсутствие прямых доказательств такой возможности, методов инактивации прионов и надежных методов их прижизненного определения требует принятия особых мер предосторожности в работе с материалом животного происхождения. Согласно современным международным требованиям безопасность биологических объектов обеспечивается особыми условиями разведения, содержания и контроля животных

Синтез сорбента является лишь частью технолоши производства колонок, используемых в клинике. Основная сложность процесса выпуска колонок состоит в том, что необходимо решить задачу выпуска стерильного продукта без его стерилизации на конечной стадии. Все известные и утвержденные сегодня жесткие методы стерилизации изделий медицинской техники- автоклавирование, обработка перекисью водорода и облучение неизбежно приводит к денатурации антител. Нами была разработана уникальная технология асептического производства иммуносорбционных колонок, обеспечивающая выпуск стерильного апиротенного продукта, соответствующего Европейским стандартам качества.

Качество иммуносорбционных колонок обеспечивается соблюдением Системы качества производства, гарантирующей выпуск продукта строго соответствующего требованиям спецификации Система качества охватывает весь процесс производства колонок, начиная с получения антигена, содержания животных, производства сыворотки и заканчивая асептическим производством колонок. Все компоненты и условия производственного процесса тщательно контролируются. В 1997 году колонкам «ЛНП Липопак»®, «Лп(а) Липопак»® и «Ig Адсопак»®, присвоен знак соответствия Европейским стандартам качества - «СЕ mark».

Использование принципов аффинной хроматографии позволяет создавать сорбенты с заданными свойствами, которые могут быть с успехом использованы в терапевтическом аферезе для коррекции уровня различных компонентов крови. На примере антител и антигенов мы показали, что использование специфичных лигандов и биосовместимой матрицы позволяет получать высоко специфичные сорбенты. Очевидно, что помимо биологических лигандов, при синтезе сорбентов могут быть использованы синтетические соединения, такие как пептиды, полисахариды, рекомбинантные молекулы, полимеры и др. Большое значение при создании сорбентов для клинического применения имеет выбор матрицы. От свойств матрицы, в частности, зависит, может ли сорбент быгь использован для перфузии плазмы или цельной крови.

Результаты данной работы показывают, что использование аффинных сорбентов в экстракорпоральной терапии позволяет эффективно, с максимально возможным уровнем специфичности, и безопасно коррегировать концентрацию различных компонентов крови, а также дает возможность разработки индивидуального дизайна лечения пациента и с большой точностью прогнозировать результаты терапии, которая для многих больных является лечением выбора.

ВЫВОДЫ.

1. Синтезирован иммуносорбент с поликлональными ангителами к ЛНП, на основе которого созданы высокоспецифичные колонки для ЛНП афереза («ЛНП Липопак»®). На примере данного сорбента сформулированы основные принципы получения сорбентов с заданными свойствами, обеспечивающими их эффективное применение в экстракорпоральной терапии. Результаты длительного (более 18 лет) использования данного сорбента в клинической практике для лечения больных СГХС доказали эффективность и безопасность экстракорпоральной терапии с применением специфичных сорбентов.

2. Получена и охарактеризована панель моноклональных антител против ЛНП человека, с их помощью проведено картирование эпитопов экспонированной на поверхности частицы ЛНП участков молекулы аполипопротеинаВюо-

3. Синтезирован сорбент с МкАт к ЛНП. Показана принципиальная возможность использования одного МкАт для синтеза иммуносорбентов с высокой сорбционной емкостью. Сформулированы основные подходы к созданию сорбентов на основе МкАт для клинического применения. Доказана эффективность и безопасность использования данного сорбента в клинической практике.

4 Создана модель ЛНП афереза in vitro, с помощью которой показано снижение концентрации липидов в пораженных атеросклерозом участках аорты человека. Показана принципиальная возможность регрессии (обратного развития) атеросклеротических бляшек в коронарных артериях больных СГХС после длительного курса ЛНП афереза с использованием колонок «ЛНП Липопак»® и «Иммунолипосорбер МкАт».

5. В результате сравнения различных плазмо- и гемо - совместимых сорбентов для ЛНП афереза, показано, что сорбенты на основе антител максимально специфичны, биосовместимы и стабильны при многократном применении, такие сорбенты являются оптимальными в случае проведения длительного курса экстракорпоральной терапии больным с высоким содержанием ЛНП и резистентными к лекарственной терапии.

6 Показано, что концентрация Лп(а) в крови прямо связана с наличием и степенью выраженности атеросклероза в коронарных, сонных артериях, а также с частотой окклюзии аутовенозных шунтов после операции реваскуляризации миокарда. Лп(а) может рассматриваться как независимый фактор риска и биохимический маркер атеросклероза.

7 Синтезирован сорбент с поликлональными антителами к Лп(а), на основе которого созданы колонки «Лп(а) Липопак»® Длительное применение (более 12 лет) этого сорбента для лечения больных ИБС с повышенным уровнем Лп(а) и нормальным уровнем других липопротеидов продемонстрировало эффективность процедур специфичного Лп(а) афереза Получены доказательства участия Лл(а) в атерогенезе.

8 Синтезирован сорбент с иммобилизованными ЛНП человека. Доказана возможность использования в экстракорпоральной терапии сорбентов на основе иммобилизованных антигенов. Получены данные об участии аутоантител к ЛНП в патогенезе атеросклероза.

9. Создан и характеризован сорбент с ПкАт к IgG человека, способный высокоэффективно связывать различные аутоантитела Получены предварительные результаты возможности использования коротких курсов lg афереза для лечения тяжелых форм ДКМП. Созданы аффинные колонки для терапевтического афереза «Ig Адсопак»®.

10 Разработана универсальная технология производства колонок с аффинными сорбентами для терапевтического афереза, соответствующая международным требованиям к качеству производства продуктов медицинского назначения (GMP) Система качества разработки и производства таких колонок сертифицирована на соответствие стандартам ISO 9001 Трем продуктам, выпускаемым по данной технологии в России - колонкам «ЛНП Липопак»®, «Лп(а) Липопак»® и «Ig Адсопак»® присвоен знак соответствия Ивропейским стандартам качества - «СЪ mark».

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. ЛНП аферез с использованием специфичных сорбентов показан при лечении гомозиготных больных СГХС, а также больных с гетерозиготной и ненаследственной формами гиперлипидемий. в случаях неэффективности или невозможности использования медикаментозной терапии. Лечение юмозигогных Сильных следует начинать в раннем возрасте (6-7 лет) с целью предотвращения развития атеросхлеротических поражеьий.

2. Измерение уровня Лп(а) рекомендуется включить в перечень определяемых параметров липидного спектра, при обследовании больных в кардиологических и неврологических клиниках.

3. Лп(а) аферез с использованием специфичного анти-Лп(а) иммуносорбента рекомендуется пациентам с выраженным атеросклерозом и при нормальном уровне других показателей липидного спектра (ОХС и ХС-ЛНП).

4. ¡2 аферез с использованием сорбента, связывающего все иммуноглобулины плазмы может быть с рекомендован при лечении тяжелых больных ДКМП с повышенным титром аутоантител к антигенам сердечной мышцы.

5. Все виды процедур терапевтического афереза следует проводить в условиях специализированных клиник.

В работе использованы следующие сокращения:

GMP - Good Manufacturing Practice

JgA - иммуглобулины класса А

IgG - иммуноглобулины класса G

IgM - иммуноглобулины класса М

SDS - додецилсульфат натрия

апо(а) - апобелок(а)

апоВюо - апобелок В1(ю

ДКМП - дилатационная кардиомиопатия

ДС - декстрансульфат

ЕС- Европейское Сообщество

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИФА - иммуноферментный анализ

КДР ЛЖ - конечный диасшлический

размер левого желудочка

КДР ПЖ - конечный диастолический

размер правого желудочка

КСО ЛП - конечный систолический обьем

левого предсердия

КСО ПП - конечный систолический объем правого предсердия

ЛВП - липопротеиды высокой плотности

ЛНП - липопротеиды низкой плотности ЛОНП - липопротеиды очень низкой плотности

Лп(а) - липопротеид(а)

ЛП-левое предсердие

МкАт - моноклональные антитела

ОАЕ - Объединенные Арабские Эмираты

ОХС - общий холестерин

ПААГ - нолиакриламидный гель

ПкАт - поликлональные антитела

РИА - радиоизотопный анализ

СвХС - свободный холестерин

СГХС - семейная гиперхолестеринемия

ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания

ТГ - триглицериды

ФБ - фосфатный буфер

ФВ - фракция выброса,

ХС-ЛВП - холестерин ЛВП

ХС-ЛНП - холестерин ЛНП

ЭХС -эфиры холестерина

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Покровский С.Н., Адамова И Ю, ВабиЙ А В Теоретическое и экспериментальное обоснование процедуры иммуносорбции// Кардиоюгия -1986 -NslO -С 49-54

2 Хашимов X А , Орехов АН, Тертов В В , Курданов X А , Покровский С.Н. Снижение содержания ляпидов в атеросклеротической бляшке аорты человека под влиянием ЛНП-афереза (исследования in vitro)// Кардиология- 1987 -Ns] 1 -С 102-105

3 Адамова И Ю, Власик Т Н, Ковалева Е А, Покровский С.Н. Трахт И Н , Янушевская Е В Штамм гибридных культивируемых клеток животных, используемый для по пучения моноклональных антител к липоггротеидам низкой плотности плазмы крови человека// Авторское свидетельство №¡513030 от 8 июня 1989г

4 Адамова И Ю, Афанасьева О И , Беневоленская Г Ф , Покровский С.Н. Пол> ченис поликлональных «игтител специфичных к липопротеиду (а) плазмы крови человека //Иммунология 1990 N 4 С 71-73

5 Афанасьева О И , Адамова И Ю, Беневоленская Г Ф Сусеков А В , Покровский С.Н. Иммуносорбснт для выделения и удаления из плазмы крови человека липопротеида (а) //Доклады Академии наук 1991 T3I8N6C 1492 1495

6 Олофинская И Е , Волкова Ь И , Сусеков А В , Лякишев А А, Покровский С.Н. Липопротеид (а) у больных коронарным атеросклерозом// Кароиология-1991 -то-С 36-38

7 Афанасьева О И , Адамова И Ю , Беневоленская Г Ф, Покровский С.Н. Сравнение трех методов выделения липопротеида (а) из плазмы крови человека //бюллетень экспериментальной биоюгии и медицины 1992 N 3 С 268-270

8 Оюфинская И Е , Адамова И Ю , Сусеков А В Волкова Е Й Афанасьева О И Лякишев А А , Покровский С.Н., Савченко А П Корреляция уровня липопротеида (а) в сыворотке крови со степенью коронарного атеросклероза // Терапевтический архив 1992 N 7 С 100-103

9 Варакин Ю Я , Ощепкова Е В , Скворцов А В , Адамова И Ю , Джибаладзе Д Н , Арабидзе Г г Покровский С.Н. Атеросклероз магистральных артерий головы и содержание липопротеида(а) в плазме крови // Терапевтический архив - 1993 -Т 65 -N93 -С 54-56

10 Адамова ИЮ, Власик ТН, Ковалева ГА Покровский С.Н., Трахт И Н , Янушевская Е В ЛПамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus, используемый для получения моноклональных антител к липопротеидам низкой плотности плазмы крови человека// Патент №1513030 от 29 июня ¡993г

I / Сусеков А В Афанасьева О И , Адамова И Ю Лякишев А А, Кухарчук В В, Покровский С.Н. Применение иммуносорбента для селективного снижения уровня липопротеида (а) у больных с коронарным атеросклерозом /1Кардиоюгия 1993 7 32 N° 11-12 С 52-56

12 Афанасьева ОИ, Адамова ИЮ, Беневоленская Г Ф, Покровский С.Н. Иммунофсрментный метод определения липопротеида (а) //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины -1995 -№ 10 -

С 398-401

13 Агапов А А , Власова Э Г , Акчурин Р С , Ширяев А А , Савченко А П, Покровский С.Н. Результаты коронарного шунтирования на фоне дислилопротеидемии// Ангиоюгия и сосудистая хирургия-1996 'N9 1 -С 88-97

14 Ежов М В О И Афанасьева, О И Кононова, И Ю Миронова, А А Лякишев, С. Н Покровский Влияние аскорбиновой кис юты и лизина на повышенный уровень липопротеида(а) сыворотки крови больных ИБС // Кардиология -1996 - № 9 - С 31-33

15 Ежов МВ Афанасьева О И Беневоленская ГФ, А П Савченко, А А Лякишев, Покровский С. Н. Лилолротеид(а) как биохимический маркер коронарного атеросклероза //Терапевтический архив-19979 С 31-34

16 Попкова Г В , Покровский С.Н., Алекберова 3 С , Решстняк Т М , Фомичева О А , Александрова Е Н , Клюквина ИГ, Насонов ЬЛ Липопротеин(а) при системной красной волчанке// Клиническая медицина-1998-Т76-М-, С 21-24

17 Ежов МВ, Афанасьева О И Лякишев А А Покровский С.Н. Связь фенотипа апобелка (а) с наличием ишемической болезни сердца у мужчин в молодом возрасте// Кардиоюгия-1999 N° 4 С 12-15

18 Ильина Л Н , Афанасьева О И , Беневоленская Г Ф , Синииин В С, Савченко А П, Королев С В, Покровский С.Н , Акчурин Р С Связь уропня Лп(а) с проходимостью шунтов в течении первого юла после операции коронарною шунтирования //Кардиоюгия -¡999-Т 39-ЦЬ ¡0 -С 7-14

¡9 Ильина Л Н Афанасьева О И Покровский С Н , Акчурин Р С Изменение липидного профиля в течении двух первых месяцев после операции коронарною шунтирования //Ангиология и сосудистая хирургия -¡999-1 5 -№3 С 5-10

20 Коновалов Г А , Гоболов И Н , Чисюплясова Н А , Чебышев А Н Марды^ича Л А Ш^мрев В И, Ястребова Н Е Киселева Е Н , Афанасьева О И Адамова И Ю, Покровский С.Н. Первый опыт применения курса lg-aфepe¿a в лечении больных рассеянным склерозом// Кремчевская медицина ¡999-№ -С 48-52

21 Покровский С.Н., Афанасьева О И , Адамова И Ю , Ьжов М В Ильина Л Н , Арабидзе Гр Г (мл ), Акчурин Р С Липопротеид (а) и развитие атеросклеротических поражений в коронарных и сонных артериях// Материалы 11 Конгресса ассоциации кардиоюгов СНГ Бишкек 1999 Центрапьно-азиатский медицинский журнал Т V, 1999-С 27-30

22 Ежов М В . Афанасьева О И , Беневоленская Г Ф Савченко А П Балахонова Л В Лякишев А А Покровский С.Н. Связь липопротеида(а) и фенотипа апобелка (а) с атеросклерозом у мужчин с ишемической

болезнью сердца // Терапевтический архив -2000 -№1 -С 28-32

23 Коновалов Г А , Чебышев А Н , Звездкин П В , Хаютина Т Л, Абрамов С Ю, Смольников В С , Тоневицкий А Г, Покровский С.Н. Экстракорпоральные методы в лечении тяжелых форм атеросклероза, метаболического синдрома и дитатационной кардиомиопатий// Кремлевская медицина -2001 -М 4 -С 48-54

24 Бритарева В В , Афанасьева О И, Добровольский А Б Титаева F В , Карпов Ю А , Покровский С.Н. Липопротеид(а) и ишемическая болезнь сердца у больных гипертонической болезнью// Кардиология -2002 -№5-Т 42 -С 4-8

25 Покровский С.Н. / Аферез липндов с использованием колонок "ЛНП-Лилопак" и "Лп(а1-Липопак' в лечении больных ИБС с нарушениями пипидного обмена// Сборник трудов "Актуальные проб!ечы экстракорпорального очищения крови, нефроюгии и гемафереэа" Москва 2002 С164-165

26 Брнтарева В В , Афанасьева О И, Добровольский А Б Ежов М В, Титаева Е В , Карпов Ю А , Покровский С.Н. Липоиротеид(а) и изоформы апо(а) у бочьных с перемежающейся хромотой/7 Герапевттеский Архив -2002 -№12 -Т74 -С 49-52

27 Коновалов ГА, Беленков ЮН Звездкин II В, Чебышев А II, Семин С H , Кузнецова Ю В , Адамова И Ю, Кипор СI , Покровский С.Н. Аферез нммуноглобулииов-новый поход к лечению тяжелых форм дилатационной кардиомиопатии// Кардиология -2002 №6 -С 123-127

28 Чернядьева И Ф , Лопат Н С , Афанасьева О И , Покровский С.Н., Кухарчук В В Динамика соотношения уровней аполипопротеииа (а) и липидов плазмы крови человека при взаимодействии с поликлональными антителами барана к липопротеилу (а)// Ьюпетень экспериментальной биологии и медицины -2002-Т 133 -М>4 -С 354-356

29 Покровский С.Н. Технология терапевтического афереза обзор возможностей// Сборник трудов "Актуальные проблемы экстракорпорального очищения крови ирфртогии и гемафереэа" Москва 2002 С 173

30 Адамова И Ю , Афанасьева О И , Кузнецова Ю В Коновалов Г А, Покровский С.Н. Эффективность удаления патогенных компонентов в процедурах иммуносорбиии// Эфферентная терапия - 2003 - 79-№1 - С 51

31 Афанасьева ОИ, Адамова ИЮ Сусеков АВ, Кухарчук В В, Покровский С.Н. Специфический аферез липопротеида(а)новый подход к лечению больных с тяжелыми формами атеросклероза// Эфферентная терапия - 2003 -Т9- №1 - С 52

32 Покровский С.Н. Сорбциониые технологииитоги и перспективы// Эфферентная терапия -2003 -Т9 -Ml -С 42-47

33 Миррахимов Э М , Норузбаева А М Лунегова О С , Афанасьева М И , Адамова И Ю, Покровский С.Н., Порощай Е Н, Миррахимов М М. Этнические особенности в уровне аполипопротеина В при г иперлипидемиях у русских и киргто^У/Терапевтический архив -2004 -Т 76 -С 35-39

34 Покровский С.Н. Сорбционные технологии для лечения сердечно-сосудистых заболеваний Пленарная лекция // Сборник трудов международной конференции Актуальные аспекты очищения крови в интенсивной терапии, Москва 2004 -С 18-23

35 Orekhov А N , Misharin A Yu , Tertov V V, Khashimov Kh A , Pokrovsky S.N., Repin V S , Smirnov VN Artificial HDI as an anti-atherosclerotic drug// lancet -1984 -№8412-V2 -P 1149-1150

36 Tertov V V , Khashimov Kh A, Orekhov A N , Mukhin D N , Kurdanov Kh A , Chichinadze О M , Pokrovsky S.N. LDL-aphcresis and regression of atherosclerosis //Lancet -1985 -№437-V 1 -P 1108-1109

37 Orekhov A N , Khashimov Kh A , Mukhin D N, Tertov

V V , Kurdanov Kh A , Pokrovsky S.N., Smirnov V N } DL immunoapheresis and regression of atherosclerosis plaque studies m vitro// Proceedings of the International Symposium on Immune and Metabolic Aspects of Therapeutic Blood Purification Systems Trondheim (Norway)- May 14-16 1985-1 СSmeby, S Jorstad T-E Wideroe feds) S Karger AG, Basel Munich Paris, London, New-York, New Delhi Smgapure Tokio, Sydney -1986 P 356-362

38 Orekhov A N Khashimov Kh A , Mukhin D N Tertov

V V , Adamova I Yu , Pokrovsky S.N., Smimov V N Low-Density lipoprotein apheresis and regression of atherosclerotic plaque in vitro //Artificial Organs-1986-V10-Ms 6-P 466-469

39 Procazova N V , Mikhailenko I A , Preobrazhensky S N, Ivanov V O, Pokrovsky S.N., Timofeeva N G , Martinova M A Reprn V S and D Bergelson Interaction of Gangliosides with Plasma Low Density Lipoproteins// Ghcoconjugate J -1986 -№3 -P 273-286

40 Pokrovsky S.N. Synthesis and Characteristics of a monoclonal immunosorbent for LDL-apheresis// In Extracorporeal lipid extraction Saal SD Reprinted from ASAIO -October-December 1987-V10-, M> 4, P 814-820

41 Kukharchuk V V , Konovalov G A , Kurdanov Kh A , Vedemikov I N , Trakht I N , Pokrovsky S.N., Alferyev A M Immunopheresis of low density lipoproteins (LDL) using columns with monoclonal antibodies// Artificial Organs -VH-№4- 1987 - P 333

42 Adamova I Pokrovsky S Comparison of LDL removal selectivity by two types of affinity chromatography with immunosorbents and with heparin sepharose// Proceedings of the 6th International Dresden lipid Symposium -1988 -P 595-598

43 Chazov E I, Orekhov A N , Tertov V V , Pokrovsky S.N., Adamova I Yu , Lyakishev A A , Gratsiatsky N A , Nechaev A S , Perova N V , Khashimov Kh A , Kurdanov Kh A, Kukharchuk V V , Smirnov V N Atherogenicity of Blood Plasma from Patients with Coronary Atherosclerosis and Its Corrections// Atherosclerosis Reviews 1988-V 17 P 9-20

44 Konovalov G, Pokrovsky S., Trakht 1, Volkova E., Adamova I, Bokchubaev A . Parfenkova Q , Kukharchuk V Long-term use of monoclonal antibodies columns m treatment of patients with familial hypercholesterolemia (FH)// Proceedings of the 6th International Dresden lipid Symposium -1988 -P 574-576

45 Kukharchuk V , S.Pokrovsky, et al Long-term application of three types of sorbents for LDL-apheresrs //Plasma Iher Tramfus Techno1-1988-V9, P 45-47

46 Orekhov A N, Tertov V V , Pokrovsky S.N., Adamova

I Yu , Martsenyuk O N, Lyakishev A A , Smirnov V N Blood Serum atherogemcity Associated with coronary atherosclerosis Evidence for nonlipid factor providing Atherogemcity of LDL and an Approach to its Elimination //Circulation Research 1988-V 62 -P 421-429

47 Trakht I N , Kovaleva K A , Janushevskaya E V . Balmukhanov T S , Ptintseva O Yu,, Preobrazhensky S N , Peklo M M , Tsibulsky V P Pokrovsky S.N. Investigation of human blood plasma apoB-contaimng lipoproteins by means of monoclonal antibodies against tow density lipoproteins.// Atherosclerosis Revieus -1988-V I"' -Lipoproteins and atherosclerosis, edited by R 1 Lew et al P51-66

48 Yamamoto A M Tsushima, S Kojima, M Harada, S Nomura, S Yokoyama, T Bosch, S.Pokrovsky Evaluation of LDL-Apheresis Techniques Double-Membrane Filtration and the Adsorption System //Therapeutic Plasmapheresis -1989-VYII1-P 121-124

49 Pokrovsky S.N., Adamova I Yu, Bcnevolenskaya G F Immunosorbents for LDL-apheresis J/Btornaterials Artificial cells and Artificial Organs-1990-№5-VIX -P 623-628

50 Lebedin E, Gorchakov V D , Petrova E N , Kobylyansky A G , Raudla L A , Tatarsky A R , Bobkov E V , Adamova 1Y , Vasilov R G, Nasonov E L, Pokrovsky S.N., Chuchalin A G Ex vivo removal of IgE in atopic asthma by extracorporeal plasmoimmunoadsorption (TPIA) development of a clinical adsorbent //The Intern J of Artificial Organs 1991 №8 -V14 P 508-514

51 Orekhov A N , Tertov V V , Kabakov A E , Adamova [ Y Pokrovsky S.N., Smirnov V N Autoantibodies Against Modified Low Density Lipoprotein Nonlipid Factor Plasma I hat Stimulates Foam Cell Formation //Arteriosclerosis and Thrombosis 1991 -N>2 -V

II -P 3)6-326

52 Pokrovsky S.N., Adamova I Yu, Afanasieva OI, Benevolenskaya G F Immunosorbent for selective removal of lipoprotein (a) from human plasma in vitro study '/ Artificial Organs 1991M/2-V15P 136-146

j3 Yamamoto A, S Kojima, K Hatanaka, K Uchida, S Nomura M Sniba-Harada, S. Pokrovsky. Biocompatibihty of low-density-lipoprotem apheresis cffect on blood coagulation and the throm-bomodulation system // Therapeutic Plasmapheresis IX 1CAOT Press .Ve3I8 Cleveland 1991 P 189-194

04 Olofinskaya I, Lyakishev A , Volkova E, Sussekov A , Pokrovsky S Lipoprotein(a) in patients with coronary arthery disease documented bv angiography /Europ Heart / V12-1991 - P246

55 Pokrovsky S.N., Susekov A V , Adamova 1 Yu, Kukharchuk V V Treatment of Hypercholesterolemia by LDL-apheresis with immuno-sorbents //Abstracts of 4th International Symposium Treatment of Severe Dyshpoproiememia in the Prevention of Coronary Heart Disease Munich Germany 1992

56 Pokrovsky S.N., Susekov A V , Afanasieva O I, Adamova I Yu., Kukharchuk V V Treatment of patients with coronary athery dis-ease by Lp(a) apheresis //Abstracts

of 4th International Sympos-mm Treatment of ¡severe Dislipoproteinemia in the Prevention of Coronary Heart Disease Munich, Germany 1992

57 Pokrovsky S.N., Konovalov G A, Susekov A V , Adamova I Yu, Kukharchuk V V Treatment of hypercholesterolemia by LDL aphere-sis with immunosorbents.//Treatment of Severe Dyshpoproteinemia in the Prevention of Coronary Heart Disease 4 Editors A M Gotto Jr M Mancmi W O Richter P Schwandt Karger-1993 4th International Symposium, Munich 1992 P 139-148

58 Pokrovsky S N., Adamova I Yu Afanasieva O 1, Susekov A V Kukharchuk V V Affinity chromatography in the treatment of lipid metabolism disorders //Therapeutic Plasmapheresis -1992 -№XII-P 407-410

59 Kukharchuk V V , Chermadieva 1 F, Bokchubaev E T , Sraitzm V V, Bachov NI, Pokrovsky S.N., Biocompatibihty of Low Density Lipoprotein Apheresis Contact with Artificial Surfaces Leads to Complement Activation.// Therapeutic Plasmapheresis-1993 -M XII-P 44v-450

60 \omura S, Yamamura T, Yamamoto A, Haze K, Hiramon K , Hara H , Yamaguchi T , Pokrovsky S N. The association between Lipoprotein (a) and severity of coronary and cerebrovascular atherosclerosis, especially in non-hypercholesterolemic subjects// Cardiovascular Risk Factors-199} -№6 -V3-P 336-343

61 Pokrovsky S.N., Susekov A V, Afanasieva 01, Adamova I Yu 1 yakishev A A , Kukharchuk V V Extracorporeal immunoadsorption for the specific removal ot lipoprotein (a) (I.p(a) apheresis) preliminary clinical data// Chemistry and Physics of Lipids -1994 -Ms 67/68-P 323-330

62 Kukharchuk VV, Chemyadieva IF, Bolshakova NS, Lebedcv AV Pokrovsky SN Lp(a) apheresis shows preferential retention of vitamin F m the plasma ' Atherosclerosis, v 109 Ml 2 1994 P 276

63 Rothe G, Kovacs E, Ulrich H, Hankowitz J, Drobnik W. Pokrovsky S.N Schmitz G Cellular mechanisms fur the promotion of the atherosclerotic lesion by Lp(a) // Atherosclerosis, V 109, №1,2, 1994, P 288-289

64 Pokrovsky S LDL apheresis State of the art 1995 // The International J of Artificial Organs V 18 № 8 1995 PI 3-15

65 Sussekov A, C Neuwirth, i Deanfie'd, D Celeimajer, S Pokrovsky G R Effect of lipoprotein (a) apheresis on endotheliumdependent vasodilatation in subjects with raised lipoprotein (a) levels // Atherosclerosis V 115 199} S37

66 Rostopshova T V Schurigina N Y , Yarcvaya Y B Afanasieva O I, Pokrovsky S.N., Kukhaichuk V V Model analysis of different hypotheses of lipoprotein^) influx rate into plasma m vivo studies / Atherosclerosis V 115 1995, S87

67 Pokrovsky S.N., Sussekov A V , Adamova 1 Yu, Afanasieva O I, Benevolenskaya G F , Konovalov G A , Kukharchuk V V Development of Immunosorbents for apoB-Containing Lipoproteins Apheresis //Artificial Organs -1995 -Ne6-V19-P 500 >05

68 Yamamura T, S Nomura, Y Toyota M Sonobe, A Yamamoto, K Haze, K Hiramon, Ii Hara, T Yamaguchi, S.Pokrovsky, Lipoprotein (a) in Ischemic Disease and

Cerebrovascular Disease// J of Atherosclerosis and Thrombosis -/995 -February-V2,P 13-16

69 Kiseleva L A , Afanasieva OI, Kosheleva N A., Pokrovsky S.N. Immunosorbent for IgG apheresis an in vitro !>l\idyJ/Transfitsion Science -1996 -M4-V17 -P 519525

70 Kiseleva E.A , O I Afanasieva, N A Kosheleva, S.N.Pokrovsky Immunosorbent for IgG apheresis synthesis and characteristics // Japanese Journal of Apheresis 1996 V 15 Supplement, s50

71 Sussekov A, CNeuwinh, J Deanfield, D.Celermajer, S. Pokrovsky, G R Thompson Lipoprotein (a), endothelium dysfunction and possibility for extracorporeal correction // Japanese Journal of Apheresis,1996 V 15, Supplement, s39

72 frank Hans P, Pokrovskiy S.N. Adsorptionssäulell Patents Nr 195 40 431 -24 07 1997

73 Kiseleva £ A, Afanasieva OI, Kosheleva N A , Pokrovsky S.N. Synthesis and Characteristics of Immunosorbent for Immunoglobulins Apheresis// Japanese lournal of Apheresis -1997 -Mil-V16-P 246-247

"J Pokrovsky S., Sussekov A , Afanasieva O , Adamova I, Kukharchuk V Lp(a)-apheresis What we can say today' // Japanese Journal of Apheresis-1997 -Ml - V16-P 72-77

75 Sussekov A, C Neuwirth, J Deanfield, D Celermajer, S. Pokrovsky, G Thompson Lp(a) apheresis endothelial dysfunction and poten-tial for extracorporeal correction// Japanese Journal of Apheresis -1997 -Ml -V16-P 136-139

76 Sussekov A, MPfohl, RNaoumova, TRisier, G Schnauder, D Overkamp, C Neuwirth, 0 Afanasieva, S.Pokrovsky. G K Thompson Comparison of Lpfa) and LDL rebound rates after LDL-apheresis procedures in 5 pätients with familial hypercholesterolemia H Japanese Journal of Apheresis V 15 Supplement, s52

77 Ezhov M V, Lyakishev A A, Afanasieva O I, Benevolenskaya G F , Polevaya T Y , Pokrovsky S.N. Association of apolipoprotem phenotypes with premature coronary heart disease in men ¿/European Heart Journal v 19 1998. P 347

78 Sobel JH S.N.Pokrovsky, RECanfiled, J Jones Apohpoprotems E and B in VLDL are Factor XIII Substrates A Role for Transglutaminase-lndused Crosshnkmg in Atherogenes«' American Heart Association 71st Scientific Sessions, November 1998

79 Eznov M V , Lyakishev A.A, Afanasieva OI, Benevolenskaya G F, Pokrovsky S.N./ Association of apolipoprotein(a) phenotypes with history of myocardial infarction in young men// The Journal of Heart Disease 1999 V1,M1,P122

80 Fzhov M V, Lyakishev A A, Afanasieva OI, Benevolenskaya G F, Pokrovsky S.N7 High lipoproteinfa) level in coronary heart disease patients is there a need to lower it0// Journal of Cardiovascular Drugs and Therapy, 1999 V13 m,P 10

81 II'ma IN, Afanasieva OI, Ezhov M.V, Benevolenskaya G F , Akchunn R S , Pokrovsky S.N./ Changes in plasma lipid profile during the first two months after coronary artery bypass surgery //77ie Journal of Heart

Disease 1999, VI, № 1,P 203

82 Pokrovsky S / LDL apheresis What we have at the end of XX century^// Transfusion Science, V 23,1999, P 14

S3 Pokrovsky S, Afanasieva O, Adamova I, Benevolenskaya G , Sussekov A, Straube R, Kukharchuk V/ Lipoprotein (a) extracorporeal elimination by specific immunoadsorption for the treatment of CHD patients// Atherosclerosis V 151 M1,2000, P 249

84 Pokrovsky S , I Adamova , O Afanasieva, H Borberg"/ Comparison of two system for LDL-apheresis immunoadsorption and hole blood perfusion// Atherosclerosis V 151 MI 2000 P 284-285

85 Ezhov M, Lyakihev A , Afanasieva O, Benevolenskaya G, Balakhonova T, Pokrovsky S Caritid atherosclerosis and lipoprotein(a) levels in CHD patients// Atherosclerosis V151 Ml 2000 P 160

86 Ezhov M , Afanasieva O , Adamova I, Benevolenskaya G, Savchenko S., Lyakishev A, Pokrovsky S Lipoprotein(a) levels predict myocardial infarction in yang men//Atherosclerosis V151 Ml 2000 P 304

87 Pokrovsky S, ll'na L, Ezhov M, Afanasieva O, Sinitsin V, Savchenko S, Korolev S, Akchunn R / Lipoprotem(a) and potency of the grafts after coronary bypass sargery// Atherosclerosis V 151 MI P 249-250

88 Ezhov M, Y Matchm, A Savchenko, O Afanasieva, T Polevaya, V Naumov, S Pokrovsky Lipoprotein(a) is associated with angiographic restenosis after coronary stenting// Atherosclerosis Suppl V 3, A° 2, July 2002 P 106

89 Pokrovsky S.N., Afanasieva O 1, Adamova I Yu , Sussekov A V , Kukharchuk V V, Kipor S G , Konovalov G A Specific Lp(a) apheresis with immunoadsorption-new tool for the treatment of severe CHD palietits with elevated Lpfa) //Atherosclerosis Suppl V 3 №2, July 2002, P 140

90 Konovalov G, Cliebyshev A, Kukharchuk V, Adamova I, Afanasieva 0 , Kipor S , Pokrovsky S LDI. apheresis by immunoadsorption with"I.DL Lipopak"columns can lead stabilization and even regression of the atherosclerotic plaques m coronary arteries// Atherosclerosis Suppl V 3, № 2 July 2002, P 140

91 Pokrovsky S.N Therapeutic apheresis technology New trends and perspectives// Plenary lecture 9th Congress of the Wol Id Apheresis Assosiation, France Paris, 2002 P

92 Pokrovsky S.N., Afanasieva 01, Adamova I Yu , Sussekov A V , Kukharchuk V V , Kipor S G , Konovalov G A Specific Lp(a) Apheresis with immunoadsorption new tool for the treatment of severe CHD patients with elevated Lp(a)// // Atherosclerosis Suppl, V 3, № 2, July 2002 P 143

93 Pokrovsky S.N. Adsorption technology in the modern medicine //Plenary lecture Proceedings of 14th ESFH Congress, Check Republic, Prague, 2003

94 Pokrovsky S, Straube R , Afanasieva O , Kukharchuk V Lipoprotem(a) apheresis is the unique method for treatment of severe CHD patients / Atherosclerosis Supplements, V 4 №2 2003 P 292

95 Ezhov M , Naumov V , Afanasieva M , Pokrovsky S Homocysteine and premature coronary heart disease 1/ Atherosclerosis Supplements, V 4 №2 2003, P. 122.

96 Pokrovsky S.N., Ezhov MV, Il'jna LN, Afanasieva OI, Smitsyn V Y, Shinaev A A, Akchunn R.S Assosiation of lipoprotein(a) exess with early vien graft, occlusions in undergoing coronary bypass surgery// The lournal of Thoraric and Cardiovaskular Surgery -2003 -M4-V126-P 1071-1075

Принято к исполнению 16/12/2004 Исполнено 17/12/2004

Заказ № 523 Тираж' 150 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095) 318-40-68 www autoreferat ru

РНБ Русский фонд

2007-4 4403

Í \

Г е *

* с.

ч ,

- s

!

у i

2 2 ФЕВ 2005

История вопроса и актуальность проблемы. Появление и накопление в крови человека различных патогенных веществ приводит к возникновению и развитию многих заболеваний. Такими веществами могут быть: аутоантитела, циркулирующие иммунные комплексы, атерогенные липопротеиды, эндогенные и экзогенные токсины, прионы, вирусы, и микроорганизмы. Их полное удаление или снижение концентрации, как правило, дает положительный клинический эффект. В частности, одной из задач терапии атеросклероза, связанного с нарушением липидного обмена, является снижение концентрации атерогенных апоВ10о-содержащих липопротеидов в крови пациента. Основное направление терапии при аутоиммунных заболеваниях - удаление патогенных аутоантител или антигенов.

Традиционным подходом к лечению в ситуациях, когда необходимо снизить концентрацию тех или иных веществ, является лекарственная терапия. Однако, в ряде случаев, она имеет ограничения в применении. Кроме того, для некоторых патологий, лекарства, эффективно снижающие концентрацию патогенных веществ в крови, отсутствуют. Поэтому поиск и разработка новых эффективных способов снижения концентрации и выведения их из крови больных с использованием современных методов биохимии, иммунологии, молекулярной биологии и биотехнологии до сих пор остается актуальной задачей.

Существует много методов экстракорпорального очищения крови. Согласно классификации, предложенной в 1990 году ВогЬе^, указанные методы можно разделить по степени специфичности удаления патогенного компонента. Значительная часть методов относится к сорбционным технологиям, то есть базируется на использовании различных сорбентов.

Рис. /. Иерархия специфичности различных методов терапевтического афереза.

Наиболее простым методом является плазмаферез, при котором часть циркулирующей плазмы больного удаляется и замещается раствором альбумина, донорской плазмой или кристаллоидньши растворами.

11лазмаферез широко и успешно используется и в настоящее время, особенно при острых ситуациях. Вместе с тем, специфичностью этот метод не обладает. На рисунке 1 представлена иерархия специфичности различных экстракорпоральных методов. Следующие в пирамиде специфичности методы, основанные на принципах фильтрации, осаждения или ионообменной хроматографии, используются достаточно широко, но тоже имеют высокий процент неспецифического удаления различных компонентов крови. Максимальную специфичность можно достичь при использовании аффинных сорбентов, особенно при использовании высокоспецифичных белок-белковых взаимодействий типа: фермент-субстрат, лиганд-рецептор, пептид-лиганд, антиген-антитело. В основе работы аффинных сорбентов используется принцип хроматографии по сродству. Работа в области создания высокоспецифичных аффинных сорбентов привела к созданию иммуносорбентов (ИС) для клинического применения, которые занимают место на вершине иерархии специфичности (рис. 1).

В русскоязычной литературе существует много терминов, которые определяют область медицины, в которой используются различные технологии очищения крови. Это «гемосорбция» и «гравитационная хирургия крови» [Лопухин, 1978-1985], «эфферентная терапия» [Костючепко, Гуревич, Соколов 2003], «гемокоррекция» или «экстракорпоральная гемокоррекция» (те же авторы), «экстракорпоральные методы лечения» [Коновалов, 2001]. В настоящей работе мы будем пользоваться термином «терапевтический аферез», потому что за годы становления этой области термин «Therapeutic apheresis» стал общепризнанным в международной литературе.

Методы терапевтического афереза находят широкое применение в современной медицине. Накоплено немало примеров успешного применения сорбционных технологий для лечения сердечно-сосудистых и аутоиммунных заболеваний, печеночной недостаточности, в акушерстве и гинекологии, при трансплантации органов, в дерматологии, онкологии, ревматологии, при острой интоксикации и инфекции организма (рис.2.)

Трансплантация органов

Сердечно-сосудистые заболевания

Инфекции тоиммунный заболевания /

Акушерство и гинекология

Онкология

Интоксикация

Нарушение микроциркуляции

Клетки

Дерматология

Рис. 2. Показания к применению сорбционных технологий терапевтического афереза. ДАЛ диализ ассоциированный амшоидоз.

В результате становления и развития этого направления медицины, стало очевидным, что разработка высокоспецифичных сорбентов для клинического применения, которые могут быть успешно, безопасно и эффективно использованы для очистки крови имеет большое научнопрактическое значение. Наша работа посвящена созданию аффинных сорбентов для лечения больных с рефрактерными к иным видам терапии формами нарушений липидного обмена и дилатационной кардиомиопатией [ Покровский, 2004].

Пионерами в области сорбционных технологий очистки крови в России были Юрий Михайлович Лопухин и созданный им коллектив II МОЛГМИ им. Пирогова [ Лопухин, 1978; Лопухин и Молоденков, 1985]. В последнем абзаце книги «Холестериноз», вышедшей в 1983 году Юрий Михайлович Лопухин и соавторы писали: «Создание такого рода сорбентов (специфичных к ЛНП — примечание автора) позволит одномоментно удалять из крови почти полностью липопротеиды низкой плотности и таким образом способствовать выходу холестерина из клеток и тканевых депо. Эффективность подобного рода методов подтверждают и данные по использованию иммуносорбентов на апопротеиды липопротеидов низкой плотности в некоторых зарубежных клиниках. Вероятно, в ближайшем будущем именно на этом пути терапии атеросклероза клиницистов ждут наибольшие успехи» [Лопухин и др., 1983]. Фактически в то же время, в 1982 году, в КНЦ РАМН и была начата наша работа.

Цель и задачи работы. Цель настоящей работы — создать новое поколение высокоспецифичных аффинных сорбентов для экстракорпорального удаления из крови человека патогенных веществ и исследовать особенности их применения при лечении больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями, резистентными к лекарственной терапии.

Экспериментальные задачи:

1. Синтезировать, характеризовать и апробировать в клинике сорбент с моноспецифическими поликлональными (ПкАт) барана против липопротеидов низкой плотности (ЛНП) человека. Исследовать эффективность и безопасность использования такого сорбента в процедурах экстракорпорального удаления ЛНП (ЛНП аферез).

2. Получить и характеризовать панель моноклональных антител (МкАт) против ЛНП человека. Показать принципиальную возможность использования МкАт для синтеза иммуносорбентов с целью их применения в терапевтическом аферезе.

3. Создать in vitro модель ЛНП афереза и с помощью такой модели исследовать его эффективность на органной и клеточной культурах аорты человека.

4. Сравнить различные типы сорбентов для ЛНП афереза. Изучить особенности их взаимодействия с плазмой крови человека.

5. Исследовать связь липопротеида(а) [Лп(а)] с наличием и тяжестью атеросклеротических поражений артерий различных локализаций.

6. Синтезировать, характеризовать и провести клинические испытания иммуносорбента для специфического удаления из плазмы крови человека Лп(а). Изучить возможность и эффективность использования такого сорбента для лечения больных ИБС с повышенным содержанием Лп(а).

7. Изучить возможность и особенности синтеза аффинных сорбентов с иммобилизованными антигенами на примере сорбента с ЛНП человека.

8. Синтезировать, характеризовать и показать принципиальную возможность использования иммуносорбента для удаления патогенных аутоантител из крови больных дилатационной кардиомиопатией в процедурах эктракорпорального удаления иммуноглобулинов человека (Ig аферез).

9. Разработать технологию создания колонок с аффинными сорбентами для процедур терапевтического афереза.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Сорбционные технологии влечении сердечно-сосудистых заболеваний.

Сердечно-сосудистые заболевания занимают одно из первых мест в ряду причин смертности населения в развитых странах среди которых Россия, к сожалению, лидирует по этому показателю. (Рис.3.). Безусловно, основной причиной этих заболеваний является атеросклероз, на понимание механизмов возникновения которого и поиск методов борьбы направлены усилия ученых всего мира.

1000 к 1—1 X X ф

Рис.3. Смертность от сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и ИБС в ряде стран мира.

Гипотеза об основополагающей роли холестерина в возникновении и развитии атеросклероза, выдвинутая в начале XX века Аничковым Н.Н. и Халатовьш С.Н. [Anitschkow, 1913], воплотилась в настоящее время в практически общепризнанную «липидную теорию» патогенеза атеросклероза [Kannel et aL 1971, Myant 198!. Assmann et al. 1992,]. Основное положение этой теории базируется на утверждении, что повышение уровня холестерина атерогенных классов липопротеидов в крови приводит к возникновению. развитию и прогрессированию атеросклеротических поражений сосудов и является причиной возникновения сердечно-сосудистых заболеваний и преждевременной смерти от осложнений атеросклероза, даже в отсутствии других факторов риска.

Убедительным доказательством справедливости липидной гипотезы возникновения атеросклероза является семейная гиперхолестеринемия (СГХС). Это заболевание связано с мутацией гена, расположенного в 19 хромосоме и кодирующего белок-рецептор ЛНП [Goldstein and Brown, 1982, 1983]. В норме рецептор ЛНП играет основную роль в их катаболизме. Дефицит рецепторов приводит к накоплению ЛНП в плазме крови, что и наблюдается у больных СГХС практически с рождения. Уровень общего холестерина (ОХС) у гомозигот составляет 18.4-20.3 ммоль/л [Томпсон, 1989]. Если дефект гена имеется у одного родителя, то у детей возникает гетерозиготная форма СГХС - она встречается у 2 - 3 человек на тысячу среди населения развитых стран. Если генетический дефект присутствует у обоих родителей, то рождаются дети с гомозиготной формой СГХС, частота встречаемости которой - 1 на миллион населения. СГХС IIa типа - это природой созданная модель атеросклероза на человеке. Прогноз течения этого заболевания - неблагоприятный. Больные с гомозиготной формой обычно погибают в I - II декадах жизни от тягчайшего атеросклероза, а с гетерозиготной формой - во II — III декадах. Современная, даже агрессивная, гиполипидимическая лекарственная терапия, часто оказывается малоэффективной для нормализации уровня ОХС у таких больных. Гомозиготная форма СГХС характеризуется появлением уже в детском возрасте кожных ксантом и ксантом сухожилий, быстро прогрессирующим атеросклерозом и внезапной смертью в возрасте до 30 лет, как правило, от острой коронарной недостаточности.

Именно попытка решить проблему снижения уровня холестерина у больных СГХС, привела в 80-х годах прошлого века к возникновению области медицины, названной впоследствии терапевтическим аферезом. Все методы терапевтического афереза, разработанные для удаления ЛНП, их авторы и исследователи, которые внесли наибольший вклад в их развитие, представлены в таблице 1.

Таблица 1. Лферез липидов. Хронология

Автор, год Метод

De Gennes, 1967 Плазмообмен

Turnberg et al., 1972 Плазмообмен

Thompson et al., 1975 Плазмообмен

Lupien et al., 1976 Плазмосорбция на гепарин-сорбенте

Agishi et al., 1980 Каскадная плазмофильтрация

Stoffel et al., 1981 Плазмосорбция на иммуносорбенте с поликлональными антителами к ЛНП

Kikkawa etal., 1981 Каскадная плазмофильтрация

Baeyer, 1983 Каскадная плазмофильтрация

Armstrong et al., 1983 Преципитация ЛНП гепарином

Покровский и др., 1985 Иммуносорбция с поликлональными антителами

Yokoyama et al., 1985 Плазмосорбция на декстрансульфат целлюлозе

Mabuchi et al., 1987 Двойная фильтрация

Pokrovsky et al., 1987 Иммуносорбция с моноклональными антителами

Pokrovsky et al, 1991 Иммуносорбция липопротеида (а)

Bosh et al., 1997 Гемосорбция на полиакрилатном сорбенте (DALI)

Otto et al., 2003 Гемосорбция на декстрансульфат- сорбенте

Pokrovsky et al, 2004 Иммуносорбент для цельной крови

Первым и старейшим методом терапевтического афереза, не потерявшим однако свою актуальность до наших дней, является плазмаферез. Считается, что приоритет создания метода плазмафереза принадлежит группе американских ученых из Балтимора под руководством J. Abel, опубликовавших статью «Plasma removal with return of corpuscles

Plasmapheresis) в журнале «Journal Pharmacology», 5 том за 1913-1914 годы [Abel et a I., 1913-1914]. Однако, первой работой, описывающей принцип плазмафереза, была статья профессоров военно-медицинской академии Санкт-Петербурга Вадима Александровича Юревича и Николая Константиновича Розенберга: «К вопросам о промывании крови вне организма и о жизненной стойкости красных кровяных шариков», опубликованная годом раньше, в журнале «Русский врач» № 14 стр. 6. (Рис.4). Это - типичный пример, когда приоритет принадлежит авторам, которые публикуют работу в англоязычных журналах, в то время как бесспорно более ранние аналогичные работы наших ученых, опубликованные в русских журналах, к сожалению не цитируются [Соколов А.А., 2003[. ¡WirpAjj»». mm щз

Отдать {Й5орудооан1я лойораторШ

Водим Юревич (1872 -1963) vt> '1ЧКмм«<< Htli»« Щ

ТЕРАШИ ГОИНОРРЕМ I J htfb ki* lu b^vdnk | ^

TîQa. k>pcVh4v, и|м>ф. и M, к. Роэсиберп» Kt. тмцхку ^ n игючиынш 11КЛМ nul. onrattuwi.i it о aii wciiiioIi imilKKIH hpit'HUlb крОИИИШЬ Jil-IfiHht>ItЬ

Николой Роэеиберг (1876-1933) iwi I «tit пли «г«ш bm Dpr" v, tmaamittwt ммп Г1. А. НЛИЛСС KUHA

П**» |«a**eiiH IL llaiWaJiHHIl»

Рис. 4. Пионерская работа по плазмаферезу В.А.Юревича и Н.К.Розенберга.

Возможность использования плазмафереза для лечения больных СГХС была впервые показана во Франции, профессором De Germes [De Germes et al., 1967]. Впоследствии Thompson G.L. в Лондоне добился хороших результатов в лечении плазмаферезом больных гомозиготной СГХС [Thompson et al., 1975, 1980, 1985].

Однако невозможность удаления большого количества плазмы пациента ограничивала эффективность плазмафереза, а проблема замещения удаленной плазмы донорской или альбумином, по мере распространения заболеваний, передающихся с кровью, представляла все большую опасность для пациента. Тем не менее, успехи применения плазмафереза стимулировали развитие новых подходов и технологий терапевтического афереза. В течение короткого промежутка времени, чуть больше 10 лет, возник целый ряд разработок, который обеспечил новый виток развития этой области медицины. Новые разработки устраняли один из основных недостатков плазмообмена — необходимость использовать замещающие растворы альбумина или донорской плазмы и, в той или иной степени, решали проблему селективности удаления липопротеидов низкой плотности (ЛНП).

ЛНП аферез. Возникновение и развитие.

Новая эра в развитии терапевтического афереза ознаменовалась в начале 80-х годов появлением сообщений об использовании в клинике аффинного сорбента с иммобилизованным гепарином [Lupien et al., 1976], каскада из двух плазмофильтров [Agichi et al., 1980], сорбента с поликлональными антителами барана против апо В белка ЛНП [Stoffel et al., 1981], системы, позволяющей удалять ЛНП из плазмы путем осаждения их гепарином (HELP) [Wieland and Seidel, 1983], сорбента с иммобилизованным декстрансульфатом [Yokoyama et al, 1984].

Три из перечисленных методик были основаны на использовании сорбентов и стали прототипами современных сорбционных технологий, применяемых для очистки крови. В их основе лежит взаимодействие компонентов крови с лигандом, иммобилизованным на нерастворимую, инертную, биосовместимую матрицу. Лиганд обладает специфичностью в отношении одного или нескольких компонентов крови и обеспечивает специфичность работы сорбента. Матрица выполняет функции гемосовместимого носителя, удерживающего лиганд и обеспечивающего ток плазмы или крови. Помещенный в стеклянный или пластиковый корпус сорбент, представляет собой иммуносорбционную колонку - изделие медицинского назначения класса III, согласно классификации Комитета по медицинским изделиям стран Европейского сообщества (ЕС). [ЕС Council directive 93/42/ЕЕС].

Исторически, приоритет в создании сорбента для селективного удаления ЛНП принадлежит канадскому врачу-исследователю Dr. Paul Lupien. Основываясь на известном факте способности частиц ЛНП взаимодействовать с гепарином [Burstein, 1970; Burgstaler 1980], он синтезировал гепарин-агарозу и впервые использовал ее для лечения пациентов с гомозиготной формой СГХС [Lupien, 1976]. Метод был очень сложен технически и имел мало общего с тем, что сейчас называют терапевтическим аферезом. Кровь пациентов забиралась порциями, ex vivo инкубировалась с сорбентом, затем отфильтровывалась и возвращалась пациенту. Такая обработка проводилась многократно. Конечно, с современной точки зрения, эта процедура выглядела не просто технически несовершенной, но и опасной для пациента. Однако это была первая попытка лечения гомозиготных больных и Dr. Lupien получил весьма обнадеживающие результаты [Lupien, 1980]. По сравнению с общепринятым в то время методом лечения СГХС плазмаферезом, впервые был использован селективный метод, и в этом смысле первое применение гепарин-сорбента безусловно являлось серьезным шагом вперед. Однако его создание опередило возможности технической базы терапевтического афереза, и поэтому гепарин-сорбент не нашел в свое время широкого применения [Graisely et al., 1980; Lupien et al., 1980]. Одним из недостатков гепарин-сорбента был высокий вклад неспецифической сорбции. Помимо ЛНП он эффективно связывал такие важные компоненты как антиатерогенные липопротеиды высокой плотности (ЛВП), антитромбин III и ряд других [Stoffel et al., 1981].

Позднее, попытки сделать сорбент на основе гепарина были предприняты у нас в стране. В НИИ физико-химической медицины МЗ СССР был синтезирован гемосовместимый сорбент, содержащий гепарин, иммобилизованный на макропористом кремнеземном носителе [Лопухин и др., 1986; Lopukhin et al., 1990]. Сорбент для плазмасорбции на основе иммобилизованного гепарина был также разработан в НИИ экспериментальной кардиологии ВКНЦ АМН СССР Синицыным В.В. [Sinitsyn et al.,1990] и показал хорошие результаты при клинических испытаниях [Коновалов и др., 1988]. Однако во второй половине 80-х развитие экстракорпоральных методов проходило столь бурно, что гепарин-сорбент уже не мог соперничать с новыми методами [Адамова и др., 1988]. Тем не менее, идея использования сродства гепарина к ЛНП для целей экстракорпоральной терапии не пропала даром и была с успехом использована для создания другого метода, основанного на осаждении ЛНП в присутствии гепарина при рН 5.2. Метод получил название «Heparin Extracorporeal Lipoprotein Precipitation» (HELP) [Armstrong, 1983] и нашел широкое применение в клинической практике [Armstrong, 1989; Schuff-Werner et al., 1994, Susca, 2001].

Развитие сорбционных технологий шло в направлении поиска и создания высокоспецифичных лигандов. Объяснялось это тем, что метод экстракорпорального удаления ЛНП в 80-е годы по-прежнему разрабатывался как метод лечения гомозиготных больных СГХС и оставался для них лечением выбора. Снижение уровня ЛНП у таких больных требовало постоянного и частого, не реже одного-двух раз в неделю, проведения процедур. Очевидно, что удаление других, кроме ЛНП компонентов плазмы могло привести к нарушению гомеостаза у этих пациентов, поэтому проблема специфичности была очень актуальна. Задача создания специфичного метода удаления ЛНП была решена с появлением сорбента с иммобилизованными антителами к основному белку ЛНП - аполипопротеину Вюо- Именно разработчики этого метода, профессора Кельнского Университета W.Stoffel, K.Oette и H.Borberg, впервые, в 1981 году, предложили термин «ЛНП аферез» («аферез» в переводе с греческого — удаление), который впоследствии стал общепринятым для всего семейства методов удаления ЛНП [Stoffel et al., 1981]. Метод, в котором удаление компонента плазмы происходит за счет связывания его со специфическими антителами, получил название «иммуносорбция» (ИС).

Создатели ЛНП афереза впервые использовали принцип аффинной хроматографии с использованием иммуноглобулинов в клинической практике и открыли дорогу многим последующим разработкам. ' Интересно, что в то же время, в параллельном независимом исследовании, аналогичный метод был предложен для удаления антигенов групп крови, который однако не имел столь бурного дальнейшего развития, как ЛНП аферез [Bensinger et al., 1981].

Лабораторная разработка и доклинические испытания метода проводились с использованием животной модели - мини свиней [Stoffel et al., 1981]. ЛНП, выделенные из сыворотки крови свиньи были использованы для иммунизации баранов, с целью получения поликлональной иммунной сыворотки. Этот же препарат ЛНП был использован для приготовления аффинной колонки с иммобилизованными ЛНП, на которой путем хроматографии сыворотки крови барана были выделены специфические поликлональные антитела свиньи к ЛНП. Выделенные антитела иммобилизовали на агарозную матрицу.Таким образом, получали анти-ЛНП иммуносорбент - сорбент, специфически взаимодействующий с ЛНП свиньи. Сорбент был помещен в стеклянную колонку со стеклянным фильтром, обеспечивающим ток плазмы крови и буферов и препятствующий утечке сорбента. При пропускании плазмы крови через колонку, ЛНП сорбировались на колонке благодаря взаимодействию антиген-антитело, что приводило к их удалению из плазмы. Несмотря на проблемы этого эксперимента, связанные с малой производительностью и плохим качеством сепарации крови, эти испытания впервые продемонстрировали принципиальную возможность использования такого подхода.

В том же, 1981 году, Stoffel W. с соавторами опубликовали первые результаты использования анти-ЛНП иммуносорбента для лечения трех пациентов - одного с гомозиготной и двух с гетерозиготной формами СГХС. Для каждого пациента, по аналогичной схеме с использованием ЛНП человека в качестве антигена, были изготовлены две персональные колонки. Кровь пациента поступала в плазмасепаратор ценрифужного типа, который в непрерывном режиме разделял клетки и плазму. Плазма крови поступала в колонку, где происходила сорбция ЛНП. Насыщение колонки определяли визуально, по изменению цвета сорбента. Интересно отметить, что авторы использовали простой и эффективный способ для улучшения визуализации сорбции ano В содержащих липопротеидов на колонку: они рекомендовали больным накануне выпить морковный сок, что приводило к контрастированию желтым цветом частиц липопротеидов. После насыщения ток плазмы переключался на другую колонку. Колонки использовались поочередно и подвергались регенерации в процессе процедуры. После насыщения остатки плазмы вытеснялись из колонки физиологическим раствором. Затем через колонку пропускали глициновый буфер с pH 2,8 - 3,0, который диссоциировал комплекс антиген-антитело и регенерировал колонку. Таким образом, было проведено по 3-4 хроматографии на двух колонках каждому пациенту. Объем обработанной плазмы составил, в среднем? 7 л, продолжительность процедуры - 3-4 часа. Колонки использовались многократно. Уровень ОХС у трех пациентов был снижен за одну процедуру: у первого - с 290 мг/дл до 130 мг/дл; у второго - с 470мг/дл до 112 мг/дл; у третьего - с 450 мг/дл до 170 мг/д. Это было, безусловно, огромным достижением в лечении СГХС.

Работы Stoffel W., и Borberg H., показали, что комбинирование сорбционной колонки с плазмасепаратором, позволяющем вести процедуру в непрерывном режиме, дает возможность обрабатывать большой объем плазмы, удаляя из нее только заданный компонент, эффективно снижая его концентрацию в крови.

В своей статье, посвященной результатам первого применения ЛНП-афереза на трех больных СГХС, Stoffel W., Borberg Н. и Greve V. написали: « The evidence for these sings of reversal of the atherosclerotic progress in patients with long-standing hypercholesterolaemia has not yet been convincing with any mode of management. Our technique offers an attractive and feasible test of the lipid hypothesis.» [Stoffel et.al., 1981]. Именно эта статья и эти слова послужили толчком для начала нашей работы в Москве. В 1982 году в НИИ экспериментальной кардиологии ВКНЦ АМН СССР по инициативе профессора В.Н. Смирнова была создана новая научная группа «Аффинные сорбенты для медицины».

В том же году первые попытки использования иммуносорбентов для ЛНП афереза в клинике были предприняты в США, в Рогозинском институте, Нью-Йорк. В 1982 году, там была проведена первая процедура ЛНП-афереза. [Saal et al., 1986]. ЛНП аферез проводился с использованием иммуносорбционных колонок, выпущенных австрийской компанией «Immuno». Это был первый опыт промышленного производства колонок для ЛНП афереза. Впоследствии, работы по выпуску таких колонок в Германии проводились компанией «Baxter» GmbH, позднее «TheraSorb» GmbH, далее «PlasmaSelect» GmbH и сегодня «Miltenyi Biotec» GmbH.

В 1982 году в Кардиологическом Научном центре, Москва, Россия, нами были начаты работы по созданию иммуносорбентов для процедур ЛНП афереза. Уже в декабре 1983 года были проведены первые процедурыс использованием разработанных нами сорбентов и получены первые клинические результаты [Покровский и др., 1985].

Начиная с 80-х, применение ЛНП афереза активно расширялось в Германии [Borberg et al, 1983, 1988, 1990]. Так в 1983 году, в клинике Кельнского Университета, на лечении находилось 8 пациентов, а в 1986 уже 30. В 1989 в Германии были проведены многоцентровые клинические испытания метода, в которых участвовали клиники Бонна, Кельна и Мюнхена [Borberg et al., 1990, А. du Moulin, 1990]. В СССР в 1985 году ЛНП аферез с использованием наших иммуносорбционных колонок проводили 4 пациентам [Покровский и др, 1985], а к 1990 году на программном лечении находилось уже 24 пациента [Pokrovsky et al, 1995].

Использование метода в различных клиниках мира, рост числа пациентов, получающих лечение методом иммуносорбции, увеличение продолжительности лечения, позволили получить достаточное количество информации для того, чтобы объективно оценить результаты использования метода. Было показано, что при лечении гомозиготных больных регрессия ксантом может наблюдаться уже после 6-12 месяцев проведения ЛНП афереза, прекращаются приступы стенокардии, существенно улучшается самочувствие и качество жизни. Уровень ОХС в результате проведения процедуры удается снизить до 100-150 мг/дл, что позволяет поддерживать средний уровень ОХС в течение курса лечения 200-250 мг/дл даже у гомозиготных больных без применения медикаментов [Borberg et al, 1988, 1990]. Тогда же впервые было показано, что в результате такой стратегии лечения удается не только предотвратить дальнейшее образование атеросклеротических поражений сосудов, но и достичь их регрессии [Borberg et al, 1990, Pokrovsky et al, 1993].

В 1984 году в Японии был создан новый сорбент для ЛНП афереза. Этот сорбент представлял собой декстрансульфат, иммобилизованный на шариках целлюлозы. Как и в случае гепарин-сорбента, в основе связывания этим сорбентом ЛНП лежит принцип ионнообменного взаимодействия и сродство апоВ-содержащих липопротеидов к полианионитам. На животной модели, в качестве которой использовали кроликов Ватанабе, было показано, что при пропускании плазмы крови через колонку с сорбентом, ЛНП эффективно связываются с сорбентом, [Yokoyama et al., 1984]. Следует заметить, что более позднее изучение in vitro свойств сорбентов на основе полианионитов, таких как декстрансульфат целлюлоза (ДС) и гепарин-сорбент, показало, что их специфичность зависит от концентрации ЛНП в плазме [Pokrovsky et al., 1990]. Очевидно, что в плазме гомозиготных больных, где уровень ОХС может достигать 1000 мг/дл, ЛНП являются мажорным компонентом, несущим положительный заряд. Поэтому отрицательно заряженный сорбент будет достаточно селективно связывать ЛНП согласно принципу ионообменной хроматографии. По мере снижения концентрации ЛНП в плазме, селективность такого сорбента снижается, и при уровне ОХС 250 мг/дл, апоВ составляет не более 30% удаляемого белка , в то время как 70% приходится на другие белки плазмы [Pokrovsky et al., 1993]. Это свойство сорбентов на основе полианитов существенно ограничивает их применение, так как современный опыт ЛНП афереза доказывает, что для достижения регрессии атеросклероза необходимо, чтобы уровень ОХС в плазме больного после процедуры составлял < 100 мг/дл, а целевой уровень ХС ЛНП в 2004 году снижен до< 70 мг/дл.

Клинические испытания метода, в котором использовались колонки с декстрансульфатом (ДС), начались в 1984 году в Национальном центре сердечно-сосудистых заболеваний в Осаке, Япония [Yokoyama et al., 1985]. Сначала в методе использовалась одна колонка объемом 400 мл, которая, как оказалось, очень быстро насыщалась ЛНП и не решала задачи эффективного снижения уровня ОХС у пациента. В процессе развития метода одна колонка была заменена на две, объемом 150 мл, в результате чего возникла весьма эффективная одноразовая система, в которой 2 колонки используются многократно в одной процедуре. [ Mabuchi et al., 1987]. Регенерация колонок проводилась 0,7 М раствором NaCl. Колонки на основе ДС, названные

ЫроБОгЬег»® были первой одноразовой системой для ЛНП афереза, которая в и настоящее время успешно используется во многих клиниках [Higashikata е1 а1., 2003].

В 1976 году были открыты статины - ингибиторы гидроксиметил глутарил коэнзим А редуктазы, одного из ключевых ферментов синтеза холестерина (ХС). [Епс1о е1 а1., 1976]. Благодаря этому открытию, в 90-х годах на фармацевтическом рынке появились новые эффективные гиполиподемические препараты, что несколько снизило накал соперничества ученых, работающих в области создания сорбентов для ЛНП афереза. Но проблема не утратила своей актуальности. Медикаменты по-прежнему не решали задачу эффективного снижения уровня холестерина у больных с гомозиготной формой СГХС. Хотя использование статинов позволило в ряде случаев увеличить интервал между процедурами ЛНП афереза у этих больных от 3-4 дней до двух недель. Использование ЛНП афереза для больных гетерозиготной формой СГХС, устойчивой к действию медикаментов, для больных, которым противопоказаны по тем или иным причинам гиполипидемические препараты, по-прежнему остается актуальным вопросом терапии нарушений липидного обмена.

Логика развития ЛНП афереза ставила задачу создания сорбентов, не уступающих иммуносорбентам по специфичности, но более технологичных в производстве. В 1984 году в ВКНЦ АМН СССР была начата работа по созданию сорбента для ЛНП афереза на основе моноклональных антител (МкАт) [Трахт и др., 1985]. Было показано, что использование нативных ЛНП при гибридизации и последующем скрининге гибридом, синтезирующих моноклональные антитела к апоВюо, позволяет получить клоны, которые эффективно взаимодействуют с ЛНП не только в растворе, но и после иммобилизации [РокгоУБку е1 а1. 1987]. Полученные гибридомные клоны были адаптированы к выращиванию в биореакторе [Рокгоуэку ег а1., 1989]. Сорбент на основе МкАт обладал высокой ЛНП-связывающей активностью в процедурах ЛНП афереза. Применение данного сорбента в клинике для лечения 4 пациентов с различными формами СГХС впервые продемонстрировало принципиальную возможность, безопасность и эффективность использования сорбентов на основе моноклональных антител в клинике [Pokrovsky et al, 1995].

Дальнейшее развитие сорбционных технологий в области терапевтического афереза ознаменовалось появлением селективных сорбентов для ЛНП афереза, пригодных для перфузии цельной крови. В 1993 году были опубликованы результаты in vitro и ex vivo тестирования гемосовместимого сорбента на основе полиакрилата [Bosch et al, 1993]. Сорбент представлял собой полиакриламидные шарики, покрытые полиакрилатом с экспонированными на поверхности карбоксильными группами. Сорбция ЛНП на такой носитель также происходит по принципу ионообменной хроматографии, поэтому, как и в случае гепарин-сорбента или ДС не является специфической. Данный сорбент был использован немецкой фирмой «Fresenius» для создания первой системы для ЛНП афереза, пригодный для перфузии цельной крови - гемосорбции, получившей название «DALI»® -«Direct Adsorbtion and Lipoprotein Ilimination». Сначала, для проведения процедуры была разработана система, включающая одну колонку объемом 500 мл («DALI»®-500) [Bosch et al, 1997; Drager et al, 1998] . Однако, использование колонок DALI в клинике сразу продемонстрировало низкую сорбционную емкость системы, особенно в случаях, когда концентрация ОХС >300 мг/дл. Поэтому, были выпущены колонки большего объема 750 и 1000 мл («DALI»®-750 и «DALI»®-1000) [Jansen et al, 2000]. Колонки «DALI»® являются одноразовыми и не подлежат регенерации в процессе процедуры. Система «DALI»® прошла клинические испытания и достаточно широко используется в клинике, несмотря на: ограниченную сорбционную емкость, высокий вклад неспецифической сорбции, высокую стоимость процедуры и возникающие осложнения [Jansen et al, 2000, Baumbauer et al, 2003].

Как альтернатива системе «DALI»® в 2001 году для проведения ЛНП афереза в Японии были разработаны колонки для цельной крови на основе декстрансульфата, позволяющие проводить процедуры без плазмасепарации. Так называемый «Liposorber D»®, был апробирован для лечения пациентов [Otto et al., 2003], однако данных, позволяющих провести его сравнение с другими системами в настоящее время недостаточно.

Использование одноразовых колонок для гемосорбции упрощает проведение процедуры ЛНП афереза с технической точки зрения, так как не требует дорогостоящего оборудования для плазмасепарации крови и регенерации колонок, однако ограничивает ее возможности. В частности, количество ЛНП, которое можно удалить за процедуру, определено объемом колонки и объемом обработанной крови, и не может быть увеличено за счет увеличения числа хроматографических циклов. Кроме того, существующие системы содержат селективные, но не специфичные сорбенты, поэтому проблема неспецифического удаления «хороших» компонентов плазмы, которую мы обсудим далее, становится актуальной.

Помимо рассмотренных нами методов, основанных на сорбционных технологиях, начиная с 80-х годов в ЛНП аферезе достаточно широко используется система HELP и каскадная (двойная) плазмафильтрация позволяющая селективно фильтровать компоненты плазмы, размер которых меньше диаметра пор капиллярного плазмофильтра [Thompson, 2003; Bambauer et al., 2003]. Мы не будем подробно рассматривать эти системы, т.к. они не относятся к сорбционным.

Сравнительная характеристика методов ЛНП афереза.

Все методы, разработанные для ЛНП афереза с начала 80-х годов до последнего времени суммированы нами в Таблице 2. Часть методов использует строго одноразовые системы (HELP, каскадная плазмофильтрация, «DALI»®, «Liposorber DL-75»®), часть - одноразовые с возможностью регенерации в процессе процедуры (ДС), часть- многоразовые иммуносорбенты таблица 2). Для широкого клинического применения различных методов, прошедших все стадии клинических испытаний и регистрации, и перешедших в разряд рутинного лечения, рядом биотехнологических компаний налажен промышленный выпуск колонок. Производство колонок и других продуктов для экстракорпоральной терапии во всех странах является сложным, наукоемким производством, которое должно соответствовать международным требованиям ISO и национальным требованиям, предъявляемым к изделиям медицинского назначения.

Таблица 2. Системы для ЛНП афереза / статус ноябрь 2004.

Метод Название продукта для клинического применения и фирма-производитель

Неселективные Плазмоаферез

Селективные Гепарин-сорбент В настоящее время не производится

Декстрансульфат целлюлоза для плазмосорбции «Liposorber»® LA -15, LA-40, «Kaneka», Япония

Декстрансульфат сорбент для гемосорбции «Liposorber»® DL-75, «Kaneka», Япония

Полиакрилатный сорбент для гемосорбции «DALI»®, «Fresenius», Германия

Каскадная фильтрация «Kuraray», Kaneka, Япония

Осаждение гепарином HELP, «B.Braun», Германия

Специфичные Иммуносорбент на основе ПкАт к ЛНП. «ЛНП Липопак»®, «НПФ ПОКАРД», Россия; «LDL Therasorb»®, «Miltenyi Biotec» , Германия

Иммуносорбент на основе МкАт к ЛНП. "Иммунолипосорбер"МкАт, в настоящее время не производится

Каждый из методов терапевтического афереза, перешедших в разряд рутинного лечения, имеет достоинства и недостатки. Полемика между приверженцами различных методов ЛНП афереза идет вокруг вопросов об эффективности, специфичности, безопасности, простоты, времени использования, а также экономической целесообразности этих методов.

Работы многих авторов посвящены сравнению используемых методов [Knisel et al, 1994; Shaumann et al, 1996; Richter et al, 1999; Schaldienst et al, 2000, Parhofer et al, 2000; Bambauer et al, 2000, Bambauer 2002, Ritter 2003, Thompson 2003]. Объективно сравнить эффективность процедур ЛНП афереза, проведенного разными авторами с использованием различных методов, довольно сложно. Данные по снижению уровня ОХС, ХС-ЛНП и ХС-ЛВП, приводимые в научных публикациях, получены авторами in vivo, при лечении пациентов. Анализ этого материала показывает, что эти результаты отражают не столько эффективность методов, сколько различия в особенностях методик проведения процедур и обусловлены, в основном, различиями в объеме обработанной плазмы, степени разбавления плазмы при проведении антикоагуляционной терапии, составом крови больного и др. Более объективный in vitro анализ эффективности различных сорбентов, используемых в ЛНП аферезе, приведенный нами в «Экспериментальной части» данной работы показывает, что все сорбенты обладают близкими значениями сорбционной емкости в отношении ЛНП. Мета-анализ данных, полученных в 5 клиниках при проведении в общей сложности почти 7000 процедур, сделанный Thompson, подтверждает это. По данным Thompson, различные методы позволяют удалять, в среднем, около 60 % ХС-ЛНП за процедуру [Thompson, 2003]. Эффективность удаления ЛНП зависит, главным образом, от возможности регенерировать сорбент во время процедуры. Этой особенностью обладают, в первую очередь иммуносорбенты на основе ПкАт. Поэтому системы для ЛНП афереза с использованием двух иммуносорбционных колонок имеют практически неограниченную сорбционную емкость. Процедуры ИС позволяют достичь заданного конечного уровня ЛНП за счет проведения необходимого количества циклов сорбции [Borberg et al, 1990; Pokrovsky et al, 1995]. Необходимо подчеркнуть, что эффективность современных гемосовместимых систем для ЛНП афереза пока недостаточна, особенно в случаях лечения больных с высоким уровнем ОХС и ХС-ЛНП >300 нг/дл, резистентных к лекарственной терапии [Thompson, 2003].

Большое количество работ посвящено анализу специфичности методов ЛНП афереза, в частности их воздействия на систему гомеостаза. Пристальное внимание к вопросам специфичности объясняется тем, что они тесно связаны с безопасностью применения ЛНП афереза. Поскольку ЛНП аферез для больных с тяжелыми формами гиперлипедимии, подобно диализу, является продолжительным систематическим лечением, неспецифическое удаление компонентов плазмы может привести к серьезным нарушениям в организме пациента.

При сравнении различных методов ЛНП афереза анализируется, как правило, их воздействие на концентрацию антиатерогенных липопротеидов высокой плотности (ЛВП), иммуноглобулинов, на компоненты и показатели работы системы коагуляции, концентрацию электролитов, реологию крови.

Все авторы, вне зависимости от используемого ими метода ЛНП афереза, отмечают падение общего белка плазмы и концентрации всех анализируемых компонентов в среднем на 10-20% за процедуру. Этот эффект обусловлен техническими особенностями проведения процедуры: разведением плазмы раствором антикоагулянта, потерей некоторого количества плазмы при неполном вытеснении ее из колонок, при регенерации, разведением плазмы физиологическим раствором, заполняющим колонку. Эти потери зависят от типа плазмасепаратора (центрифужный или фильтрационный), опыта персонала, проводящего процедуру и количества циклов сорбции-десорбции за одну процедуру. Поэтому изменение в пределах 20% концентрации ряда параметров, обнаруживаемое различными авторами, является характерным для всех методов ЛНП афереза и не связано с характеристикой и свойствами сорбционных материалов. Сюда относится некоторое снижение уровня суммарного белка, уровня ХС-ЛВП и anoAI, иммуноглобулинов. Различия в степени падения концентрации этих компонентов, полученные в разных работах, объясняются различиями в методике проведения процедур, количестве обработанной плазмы и другими техническими особенностями.

Специфические различия, связанные с типом сорбента, использованного в процедуре, отмечены для показателей системы коагуляции, реологии крови и ряда других показателей.

Общим для всех методов ЛНП афереза является удаление анти-оксидантов, транспорт которых в организме осуществляют ЛНП. Показано, что ЛНП аферез снижает уровень витамина Е и |3-каротина на 50-60% [Assogba et al., 1995]. Причем снижение уровня этих антиоксидантов пропорционально уменьшению концентрации ОХС, при этом соотношение витамин Е/ОХС и (3-каротин/ОХС не меняется. В связи с этим, в литературе содержатся рекомендации относительно приема антиоксидантов пациентами, находящимися на длительном лечении ЛНП аферезом [Lepage et al, 1996]. Однако, с другой стороны, в ряде работ достоверно показано, что ЛНП аферез снижает уровень окисленных ЛНП и их способность к окислению [Tamai et al., 1997; Leitinger et al., 1996; Napoli et al., 1997]. Очевидно, что удаление окисленных ЛНП, которые обладают более выраженными, по сравнению с нативными ЛНП свойствами, является положительным, хотя клиническая значимость этого эффекта пока не доказана.

Проблема специфичности тесно связана с проблемой побочных эффектов при ЛНП аферезе. В настоящее время накоплено большое количество данных, и статистика показывает, что число побочных эффектов в процедурах ЛНП афереза в разных клиниках и на разных системах составляет от 4 до 12,5%. Большая их часть связана с техническими проблемами при проведении процедур: различными дисфункциями автоматических систем, осуществляющих плазмасепарацию и регенерацию, плохим венозным доступом у пациента. Как специфические, связанные непосредственно с сорбентами, авторами отмечаются следующие побочные эффекты: брадикардия и падение давления, гипогликемия, головная боль, тошнота, аллергические реакции. Количество таких реакций по данным разных авторов колеблется от 0 до 4% от общего числа проведенных процедур [Knisei et al., 1994; Liposorber study group, 1998; Richter et al., 1999; Schmaldienst et al, 2000; Baumbauer, 2003, Thompson, 2003, Ritter et al, 2003]. Наиболее тяжелые побочные реакции были отмечены при использовании сорбента с декстрансульфатом. При лечении пациентов, получающих ингибиторы АПФ ЛНП аферезом на колонках с декстансульфатом, были отмечены тяжелые анафилактические реакции [Olbricht et al, 1992; Kroon et al, 1992]. Эти реакции были вызваны нарушениями в работе кинин-брадикининовой системы вследствие контакта плазмы крови с отрицательно заряженной поверхностью сорбента, и выбросом в кровоток брадикинина. Побочные реакции возникали из-за влияния ингибиторов АПФ на катаболизм брадикинина [Kroon et al, 1992].

Много лет в литературе обсуждался вопрос о возможном смыве антител с иммуносорбентов в процессе их использования. Большое количество работ было посвящено проблеме поиска аутоантител к иммуноглобулинам барана в плазме крови пациентов, длительное время находящихся на лечении ЛНП-аферезом с использованием иммуносорбции [Richter et al, 1990; Keller, 1990; Gordon et al, 1990; Pokrovsky et al.,1993; Richter et al, 1993]. В настоящее время эта проблема потеряла свою актуальность, поскольку за более чем 20 летний опыт использования иммуносорбентов не было отмечено ни одного побочного эффекта, связанного с возможной иммунизацией пациентов антителами барана [ Ritter et al, 2003; Thompson, 2003].

Клинические аспекты применения ЛНП афереза. Известно, что все факторы риска возникновения и развития сердечнососудистых заболеваний делятся на две группы: - модифицируемые, к которым, в частности, относится уровень ОХС, ХС-ЛНП, ТГ, ХС-ЛВП, и немодифицируемые, такие как наследственная предрасположенность к сердечно-сосудистым заболеваниям, пол, возраст. Модифицируемые факторы риска подлежат коррекции. Попытки разработать общие подходы к коррекции нарушений липидного обмена привели к тому, что была определена последовательность введения терапевтических мер при лечении гиперхолестеринемии. Общепринятый сегодня алгоритм коррекции параметров липидного спектра пациента включает, в общем виде, проведение немедикаментозных мероприятий, таких как изменение образа жизни, соблюдение диеты, коррекция веса, повышение физической активности, отказ от курения. На следующем этапе проводится медикаментозная терапия. Если с помощью медикаментов не удается достичь целевых значений показателей липидного спектра, обсуждается вопрос о начале инвазивных методов лечения, включая методы плазматерапии, ангиопластики или реваскуляризации миокарда (коронарного шунтирования (КШ)) (Рис 5).

I Диета 300 мг холестерина/день

II Медикаменты: ингибирование абсорбции ингибирование синтеза, усиление катаболизма III Инвазивные методы плазмотерапия ангиопластика, КШ

Рис. 5. Основные этапы лечения гиперхолестеринемии.

Необходимо отметить, что вклад алиментарного холестерина в общий пул холестерина в организме человека не превышает 10-15%, поэтому с помощью даже самой строгой диеты можно достичь максимально 10-15% снижения концентрации ОХС в крови больного. Если с помощью диеты не удается скорректировать уровень ОХС и ХС-ЛНП, то назначается лекарственная гиполипидемическая терапия.

Применение современных гиполипидемических препаратов, таких как статины, позволяет снизить ХС-ЛНП на 20-60%. Из других, применяемых в настоящее время гиполипидемических препаратов, используются: фибраты, никотиновая кислота, секвестранты желчных кислот. Эти препараты менее эффективны, снижение ХС-ЛНП при их применении составляет 10-30%. Статины практически вытеснили ранее используемые антиоксиданты, гормонально-заместительные препараты. Длительный прием всех гиполиподемических средств, особенно в больших дозах, сопряжен с побочными эффектами. Часто применение этих препаратов вообще противопоказано больному. Кроме того, даже максимальные дозы лекарств не всегда приводят к желаемому результату - уровень холестерина не удается снизить до рекомендуемых значений.

Эпидемиологические исследования, проводимые в различных странах, позволили выработать концепцию лечения и профилактики атеросклероза и дислипидимий, основанную на достижении и поддержании в крови пациента целевых значений показателей липидного спектра. Такие работы были начаты в США под эгидой Национального института сердца, легких и крови в рамках «National Cholesterol Education Programm» (NCEP). Периодически, на основе результатов крупномасштабных исследований, группа экспертов вносила предложения по рекомендуемым «целевым» уровням ОХС, ХС-ЛНП и других параметров липидного спектра («Adult Treatment Panel» -ATP). После достижения консенсуса рекомендованные нормы становились правилом. Обычно спустя несколько лет аналогичные решения принимались и в Европе. На рис.6 представлена динамика снижения целевых уровней ХС-ЛНП, которых необходимо достигать для эффективного лечения сердечнососудистых заболеваний, у категории больных с диагнозом ИБС.

150 с ct

1 100 с: х с; 50 о х о

США

Европа

Рис 6 . Динамика «целевого» уровня ХС-ЛНП, принятого в США и в Европе, достижение которого рекомендуется при лечении сердечно-сосудистых заболеваний, ATP-Adult Treatment Panel.

Как видно из рисунка 6, на протяжении последних 3 декад целевые уровни ХС-ЛНП постоянно ужесточались, и все время пересматривались в сторону понижения. Сегодня, когда получены данные по снижению смертности от ССЗ и возникновению осложнений атеросклероза в виде фатальных инсультов и инфарктов в группах больных, получающих гиполипидемическую терапию по сравнению с группами сравнения, сделан принципиальный вывод о необходимости назначения гиполипидемической терапии всем больным ИБС вне зависимости от уровней ОХС и ХС-ЛНП.

Однако существует категория больных, которые по тем или иным причинам устойчивы к действию даже агрессивной лекарственной гиполипидемической терапии, или не могут ее получать в силу возникающих осложнений. К таким больным относятся: больные с гомозиготной и часть — с гетерозиготной формами СГХС ( в России около 300 тысяч больных с этим генетическим дефектом); больные с первичными и/или вторичными гиперлипидемиями, резистентные к лекарственной терапии; дети, которым противопоказан прием статинов и других гиполипидемических лекарств;

1988 1993 2001 ATP I ATP II ATP III 1994 1998 2003

2004 беременные женщины и др. Поэтому для перечисленных категорий больных методы ЛНП афереза остаются актуальным и сегодня.

ЛНП аферез по-прежнему остается единственным надежным и результативным методом лечения гомозиготных больных СГХС, а также больных гиперхолестеринемией резистентных к лекарственной терапии. Проведение ЛНП афереза с 1-2 недельным интервалом на фоне приема аторвастатина до 80 мг/день позволяет поддерживать уровень ОХС у гомозигот в пределах 6-10 ммоль/л [Thompson, 2003]. Лечение гомозиготных больных ЛНП аферезом рекомендуется начинать в возрасте до 7 лет. Опыт по лечению детей с СГХС показал, что проведение процедур с самого раннего возраста позволяет предотвратить образование стенозов и гарантировать жизнь этим пациентам. В настоящее время в мире имеется достаточно большой опыт лечения таких пациентов [Gordon et al, 1993; Zwiener et al, 1995; Gordon et al, 1998; Pokrovsky et al, 1995; Stefanutti et al, 1995; Коновалов и др., 2001; Konovalov, et al, 2002; Коновалов и др, 2004; ]. Максимальная продолжительность лечения ЛНП аферезом с использованием ИС составляет 18 лет. Лечение пациентки с гомозиготной СГХС было начато в 1985 году в Институте Клинической Кардиологии им. А.П. Мясникова в КНЦ АМН СССР, а в настоящее время проходит в ОБП МЦ УДП РФ. Наблюдение за развитием пациента не выявило никаких отклонений в развитии [Konovalov et al, 2002, Konovalov et. al, 2004]. Характерно, что для лечения детей, наиболее пригодными являются системы, использующие ИС и ДС, поскольку позволяют достичь максимальной эффективности при минимальном объеме экстракорпорального кровообращения.

Показания к применению ЛНП афереза в настоящее время расширены в связи с использованием этого метода для лечения пациентов, нуждающихся в коррекции уровня ЛНП во время беременности. Прием статинов противопоказан во время беременности и периода лактации. Результаты применения ЛНП афереза во время беременности показывают, что этот метод позволяет эффективно и безопасно снижать уровень ЛНП, избежать обострения ИБС в этот период даже без приема медикаментов [Кгооп, 1996; Cashin-Hemphil et al., 2000, Klingel et al., 2003].

Начиная с 90-х годов, активно проводились исследования с целью доказательства регрессии атеросклеротических поражений при агрессивном снижении уровня ЛНП у пациентов. Одно из первых сообщений о возможности регрессии коронарного атеросклероза появилось в Германии [Hombach et al., 1986; Oetto et al., 1988]. В настоящее время опубликованы данные 10 таких исследований, которые убедительно доказывают, что ЛНП аферез является терапией, позволяющей не только предотвратить развитие, стабилизировать, но и вызвать регрессию коронарного атеросклероза (таблица 3). Сравнение групп, получавших только лекарственную терапию и лекарственную терапию + ЛНП аферез показало достоверно более высокое снижение уровня ЛНП и достоверно более хорошие результаты при обследовании коронарографией.

Механизм, посредством которого ЛНП аферез улучшает прогноз при коронарном атеросклерозе обсуждается авторами с момента получения первых положительных результатов его применения. Еще в 1997 году была предложена гипотеза о положительном воздействии даже одной процедуры ЛНП афереза на эндотелий-зависимую функцию артерий [Tamai et al., 1997].

В данном исследовании, проведенном с использованием колонок с ДС, было показано также, что удаление окисленных ЛНП вследствие процедуры ЛНП афереза коррелирует с восстановлением функции эндотелия.

Другой механизм был предложен Кгооп et al, показавшими, что ЛНП аферез, проводимый в течение 2 лет, повышает толерантность к физической нагрузке благодаря улучшению региональной перфузии миокарда [Кгооп et al., 1996; Aegenvaeren et al., 1996]. В ряде работ было показано наличие корреляции между степенью улучшения кровотока сердечной мышцы и снижением уровня ЛНП [Mellwig et al., 1998; Kobayashi et al., 2002].

Таблица 3. Результаты коронарографических исследований, полученные при проведении JIi ЧП афереза в различных клиниках.

Автор [ссылка] Количество пациентов, включении х в исследован ие Метод ЛНП афереза + Медикаментозная терапия Период наблюд ения Результаты (по данным ангиографии)

LARS [Tatami, 1992] Hinz -7 Htz-25 Non FH-5 ДС + пробукол, правастатин 3 года Регрессия у 4 Ьтг и 10 Ыг.

HELP-study [Schuff-Werner, 1994] Htz -33 HELP + Секвестанты желчных кислот, фибраты 2 года Регрессия у 23 пациентов

LDL apheresis study, [Waidner, 1994] Htz-25 ИС 3 года Регрессия в 8 участках из 111 анализированных пораженных сосудов, прогресс в 11.

Osaka LDL apheresis Multicenter group. [Kitabatake, 19941 Htz-13 ДС + Пробукол, правастатин, секвестанты желчных кислот 1 год Регрессия в 33% анализированных пораженных сосудов, прогресс в 13%; 54% -без изменений.

FHRS [Thompson, 1995] Htz-20. ДС+ симвастатин, секвестанты желчных кислот 2,1 года Регрессия в 25% анализированных пораженных сосудов, прогресс в 10%; 65% -без изменений.

Htz-19. Симвастатин, секвестанты желчных кислот Регрессия в 21% анализированных пораженных сосудов, прогресс в 21%; 58% -без изменений.

LAARS [Kroon, 1996] Htz+non FH -21; ДС+ симвастатин 2 года Результаты схожи в обеих группах.

Htz+non FH -21; Симвастатин

Munich study [Richter, 1998] Htz -34 ИС, HELP, ДС + Симвастатин 8,6 года Регрессия - 4 пациентов, отсутствие прогрессии — 29 пациентов.

Duisburg study [Park, 1998] Гиперлипи демия -44 HELP + гиполипидемически е препараты 1,3 года Улучшение у 32 пациентов

Liposorber study [Gordon, 1998] Htz-39 Hmz-10 ДС 5 лет Улучшение клинической картины заболевания у всех пациентов

Таблица 3 (продолжение). Результаты коронарографических исследований, полученные при проведении ЛНП афереза в различных клиниках.

Нокипки-РН- ЬОЬ-арЬегез18 зШёу [МаЬисЫ, 1998] тг-130 ДС + гиполипидемиче ские препараты 6 лет Улучшение в 72% случаев

Ь-САРБ [МзЫтига, 1999] П&-25 ДС + Пробукол, симвастатин, секвестанты желчных кислот 2,1 года Регрессия в 16% анализированных пораженных сосудов, прогресс в 8%; 65% -без изменений.

2-11 Пробукол, симвастатин, секвестанты желчных кислот Регрессия в 0% анализированных пораженных сосудов, прогресс в 64%; 36% -без изменений.

Шт. - гетерозиготная форма СГХС, Нтг - гомозиготная форма СГХС, поп РНненаследственная СГХС.

Суммируя современные представления по вопросу механизма действия ЛНП афереза можно сказать, что помимо прямого воздействия на уровень атерогенных липопротеидов, ЛНП аферез воздействует на ряд других факторов. В числе этих факторов в настоящее время обнаружены: улучшение реологии крови, восстановление функции эндотелия, улучшение вазодилатации и ремоделирование стенки сосуда, удаление окисленных ЛНП, воздействие на кинин-брадикининовую систему [ТаБакь, 2003]. Благодаря действию этих механизмов достигается наблюдаемое при ЛНП аферезе улучшение функции эндотелия и увеличение резерва коронарного кровотока. Поэтому пришло время, когда помимо прямого эффекта ЛНП-афереза на снижение в крови ЛНП, можно говорить о его дополнительном - плейотропном действии, результатом которого является улучшение прогноза тяжелых больных ИБС, рефрактерных к другим видам терапии.

К атерогенным апоВ100 содержащим липопротеидам, помимо ЛНП, относятся также липопротеиды очень низкой плотности (ЛОНП) и липопротеид (а), о котором пойдет речь в следующем разделе.

Липопротеид(а) и сердечно-сосудистые заболевания.

Jln(a), как фактор риска возникновения и развития атеросклероза различных локализаций.

Липопротеид(а) [Лп(а)] был обнаружен норвежским ученым К. Berg в 1963 г. с помощью иммунологических методов как новый антиген плазмы крови [Berg, 1963]. На протяжении двух десятилетий ему не уделялось существенного внимания, однако в 1980-е годы было опубликовано несколько работ, установивших связь между концентрацией Лп(а) в крови и повышенным риском развития инфаркта миокарда [Kostner et al., 1981; Utermann, 1989]. Лп(а) представляет собой сферическую частицу диаметром около 260 Ä, состоящую из ЛНП-подобной частицы и одной молекулы апобелка(а), которая связана с апоВюо ковалентной дисульфидной связью [Utermann, 1989]. Уникальность белка апо(а) состоит в том, что он не обнаруживается более ни в одном из классов липопротеидов и имеет высокую степень гомологии (до 90%) с молекулой плазминогена [MacLean et al., 1987]. Ген, ответственный за синтез белка апо(а), локализован в длинном колене шестой хромосомы рядом с геном плазминогена [Frank et al., 1988]. Уровень Лп(а) выше 30 мг/дл встречается у 25-40% больных ИБС и признается пороговым, так как по данным ряда авторов, у пациентов с такой концентрацией Лп(а) в крови возрастает риск развития сердечно-сосудистых заболеваний [Seed , 1996].

В 90-е годы были представлены результаты 26 проспективных исследований связи Лп(а) с развитием ИБС или ее осложнений [Danesh et al., 2000]. Мета-анализ этих исследований показал, что риск возникновения не фатального инфаркта миокарда (ИМ) или смерти от ИБС при наличии высокой концентрации Лп(а) увеличивается на 60-70% [Danesh et al., 2000]. Результаты 7-летних наблюдений в Великобритании, в которые были включены 21520 мужчин, показали, что повышенный уровень Лп(а), аналогично повышенной концентрации апоВ10о и пониженной - anoAI, связан с риском возникновения ИМ [Wald et al., 1994]. Наблюдения за здоровыми мужчинами с повышенным

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА уровнем ХС-ЛНП (>4,9 ммоль/л) в течение 7 лет показали, что после исключения влияния возраста, курения, АД, массы тела, ХС-ЛНП и ХС-ЛВП, Лп(а) является независимым фактором риска развития ИБС [Schaefer et al., 1994]. Исследование Gottingen Risk Incidence and Prevalence Study (GRIPS) продемонстрировало, что наряду с общепризнанными факторами, такими как ХС-ЛНП, семейный анамнез ИМ, пониженный ХС-ЛВП и высокий уровень фибриногена, Лп(а) является фактором риска ИМ [Wald et al., 1994]. У лиц с низким ХС-ЛНП повышенный уровень Лп(а) (>30 мг/дл) также был связан с увеличением риска ИМ [Cremer et al., 1995]. Однако существуют исследования, где не подтверждается связь Лп(а) с ИБС и ее проявлениями. В частности, при наблюдении за 15000 американскими врачами в течение 5 лет - Physicians" Health Study- (PHS) не показано связи между уровнем Лп(а) и развитием фатального и не фатального ИМ [Ridker et al., 1993]. Интерпретация результатов этого исследования затруднена в связи с применением обследованными аспирина. Противоречия в результатах при исследовании связи Лп(а) и риска сердечно-сосудистых заболеваний были обнаружены также в случае, когда исследование были включены группы пациентов с невысоким (5,6 ммоль/л) и сильно повышенным уровнем ХС-ЛНП [Mäher et al., 1995]. Проспективное исследование среди больных с имеющейся ИБС - Scandinavian Simvastatin Survival Study (SSS Study) установило, что. Лп(а) является независимым предиктором как коронарных осложнений, так и общей смертности (относительный риск - 1,3) [Berg et al., 1997]

В многоцентровом европейском исследовании с участием 2587 больных было установлено, что у обоих полов все липидные показатели, включая Лп(а), связаны с ангиографически доказанным коронарным атеросклерозом, причем связь эта количественная, т.е. с увеличением концентрации ОХС, ХС-ЛНП и апоВ или снижением ХС-ЛВП и апо AI, возрастает количество пораженных артерий. Причем, было показано, что Лп(а) связан с ИБС в такой же степени, как и ОХС и ХС-ЛНП [Bolibar et al., 1995]. При исследовании 118 мужчин без

ИМ в анамнезе установлена положительная связь Jln(a) с коронарными индексами сосудов, стенозов и протяженности поражения коронарных артерий [Budde et al., 1994]. Корреляция концентрации Лп(а) в крови с наличием гемодинамически незначимых бляшек, обнаруженная в исследовании японских ученых позволяет предполагать, что Лп(а) участвует в атеросклеротическом процессе на ранней стадии его возникновения. Эти данные свидетельствуют о том, что Лп(а) может способствовать развитию нарушенного тонуса сосуда, действуя, вероятно, через факторы гемостаза на том этапе, когда видимые изменения в коронарных артериях еще отсутствуют.

W.Terres и соавт. (1995) с помощью повторных ангиографических исследований, проведенных с интервалом в 66 дней, продемонстрировали, что только концентрация Лп(а) связана с быстрым прогрессированием коронарного атеросклероза: у 21 больного с прогрессированием поражения, медиана уровня Лп(а) была в 4,5 раза выше, чем у 58 больных без прогрессирования (66 мг/дл и 13 мг/дл соответственно, р=0,01). Наблюдение за 85 больными ИБС в течение 2 лет с проведением повторной коронарографии показало, что прогрессирование атеросклероза без ИМ (группа 48 человек) связана с более высоким уровнем Лп(а) и более низкой концентрацией ХС-ЛВП [Tamura et al., 1995]. При изучении состава бляшек, полученных при атероэктомии, было обнаружено более высокое содержание Лп(а) при нестабильной, чем при стабильной стенокардии [Dangas et al., 1998], что позволяет предположить участие Лп(а) в росте бляшки. Итак, большая часть результатов современных исследований демонстрирует прямую связь уровня Лп(а) с наличием, прогрессированием и степенью выраженности коронарного атеросклероза. Существует предположение, что повышенный уровень Лп(а) может служить одним из предикторов смерти от ИБС мужчин в молодом и среднем возрасте [Sutton-Tyrrell et al., 1996]. Известно, что у этой категории больных первым клиническим проявлением коронарного атеросклероза становятся фатальный ИМ или внезапная смерть, которая в 50% случаях приводит к летальному исходу на догоспитальном этапе. Мы разделяем эту точку зрения [Лякишев и др,. 1991; Лякишев и др, 2001; Ежов и др, 1999; Ежов и др., 2000].

Гомология первичной структуры молекулы белка апо(а) с плазминогеном позволяет предполагать участие частицы Лп(а) в процессах тромбообразования. В экспериментальных работах показано, что Лп(а) подавляет связывание плазминогена с его рецепторами на клетках эндотелия, конкурирует с тканевым активатором плазминогена за связывание с фибрином [Loscalzo et al., 1990]. В предыдущих исследованиях была установлена связь высокого уровня Лп(а) с перенесенным ИМ у мужчин [Kostner et al, 1981; Kark et al, 1993]. Клинические данные свидетельствуют о связи Лп(а) с самыми начальными изменениями в коронарных артериях [Budde et al, 1994; Tsurumi et al, 1995; Takami et al, 1995]. В нескольких клинико-анатомических исследованиях показано, что примерно в половине случаев ИМ развивается в артериях, имевших стенозы диаметром менее 50%. [Fishbein, Siegel, 1996]. Кроме того, у больных с развивающимся ИМ и исходно повышенным уровнем Лп(а), вероятность спонтанной реперфузии пораженной коронарной артерии ниже по сравнению с больными с нормальным уровнем Лп(а) [Moliterno et al, 1993]. Учитывая эти данные, можно предполагать, что развитию инфаркта миокарда со стойкой окклюзией способствуют протромботические свойства апо(а) [Hervio et al, 1993]. Результаты британского проспективного 3-х летнего наблюдения за 266 больными с диагнозом острого ИМ [Stubbs et al, 1998] показали, что Лп(а) > 30 мг/дл связан с увеличением на 62% сердечной смертности в сравнении с группой с нормальным уровнем Лп(а). Многофакторный анализ выявил, что относительный риск смерти от кардиальных причин у больных с ИМ и Лп(а)>30 мг/дл составляет 2,16.

Таким образом, Лп(а), вероятно, участвует в развитии тромбоза коронарных артерий, и его высокий уровень связан с увеличением риска смерти у больных, перенесших ИМ. Строение частицы Лп(а) и ее схожесть с ЛНП, а также с плазминогеном, позволяет сделать предположение о том, что частица

Jln(a) может играть роль своеобразного «моста» между холестериновой гипотезой и процессами тромбообразования, т.е. активно участвовать в процессах атеротромбогенеза.

Существуют противоречивые данные о связи Лп(а) с наличием и развитием инсультов. В крупном популяционном исследовании Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC), концентрация Лп(а) была выше у больных, перенесших инсульты или транзиторные ишемические атаки. При этом риск развития цереброваскулярных осложнений при Лп(а)>30 мг/дл повышался на 17% [Schreiner et al., 1993]. Во французском исследовании среди 90 больных молодого возраста, перенесших инсульт, уровень Лп(а) был достоверно выше, чем в контрольной группе [Peynet et al., 1999], что подтвердило данные предыдущего исследования [Nagayama et al., 1994].

Корреляция между повышенной концентрацией Лп(а) и утолщением слоя интима-медиа сонных артерий была показана в исследовании ARIC [Schreiner et al., 1994]. Причем было показано, что на связь Лп(а) с бессимптомным каротидным атеросклерозом не влияют другие общепризнанные факторы риска [Schreiner et al., 1993]. Связь Лп(а) с тяжестью каротидного атеросклероза была показана в двух крупных исследованиях - the Bruneck Study ( в случайной выборке из 885 мужчин и женщин 40-79 лет [Willeit J et al., 1995]), и Systolic Hypertension in the Elderly Program (SHEP) [Sutton-Tyrrell et al., 1996]. Наши исследования также подтвердили связь между концентрацией Лп(а) и атеросклерозом сонных артерий [Nomira et al., 1993; Варакин и др., 1993; Покровский и др., 1999].

В исследовании SHEP было также выявлено, что только уровень Лп(а), независимо от других факторов риска, связан с наличием и тяжестью атеросклероза артерий нижних конечностей у пожилых мужчин и женщин [Sutton-Tyrrell et al., 1996]. Это наблюдение было подтверждено для молодых мужчин в возрасте до 45 лет с хронической ишемией нижних конечностей [Valentine et al., 1996] и ангиографически доказанным поражением нижних конечностей [Prior et al., 1995]. Итак, повышенный уровень Jln(a) является независимым фактором риска атеросклероза сонных и периферических артерий [Бритарева и др., 2002].

За последнее десятилетие была показана взаимосвязь Лп(а) с процессами рестенозирования у больных, перенесших операции коронарного шунтирования (КШ) или транслюминальной баллонной коронарной ангиопластики (ТБКА). Обнаружено повышенное содержание апо(а) и апоВюо в венозных шунтах [Cushing et al., 1989] и стенке восходящей аорты [Rath et al., 1988]. Отношение апо(а)/апоВюо в ткани было в 3 раза выше, чем в плазме у тех же пациентов [Cushing et al., 1989]. Накопление апо(а) в артериальной стенке позитивно коррелирует с уровнем Лп(а) сыворотки, что позволило сделать вывод о вкладе Лп(а) в развитие атеросклероза венозных шунтов и в формирование бляшки в стенке артерии [Rath et al., 1988]. Достоверная связь между окклюзией венозных шунтов после операции КШ и повышенным уровнем Лп(а) подтверждена и в клинических исследованиях [Hoff et al., 1988, Solymoss et al., 1993; Ильина и др., 1999; Pokrovsky et al., 2003].

Результаты клинических исследований роли Лп(а) в развитии рестеноза после стандартной коронарной ангиопластики можно суммировать следующим образом: 1) уровень Лп(а) достоверно выше в группах больных с рестенозом [Hearn et al., 1992; Tenda et al., 1993; Yamamoto et al., 1995]; 2) рестеноз достоверно чаще встречается в группе больных с уровнем Лп(а) более 30 мг/дл [Yamamoto et al., 1995]; 3) между уровнем Лп(а) и степенью рестеноза существует положительная корреляция [Tenda et al., 1993]; 4) другие липиды крови не связаны с частотой рестеноза [Hearn et al., 1992; Tenda et al., 1993]; 5) повышенный уровень Лп(а) коррелирует с возвратом клинических проявлений (стенокардии) после проведения ТБКА [Desmarais et al., 1995].

Таким образом, результаты проспективных популяционных исследований, опубликованные в 90-е годы, указывают на увеличение на 70% риска развития ИБС у лиц с высокой концентрацией Лп(а) [Danesh et al., 2000].

Также установлена связь Лп(а) с атеросклеротическим поражением коронарных, сонных и периферических артерий, окклюзией аутовенозных шунтов после операции КШ и баллонной ангиопластики.

Возможности коррекция повышенного уровня Jln(a).

Несмотря на структурное сходство между Лп(а) и ЛНП, ни диета [Lichtenstein et al. 1999, Vessby et al. 2001], ни основные, даже самые современные гиполипидемические лекарственные средства, применяемые в клинической практике, не влияют на уровень Лп(а). Это показано в клинических исследованиях действия статинов: симвастатина [Nishikawa et.al., 1999], ловастатина, [Alaupovic et.al., 1999] и флувастатин [Sasaki et.al., 1995].

Однако, по некоторым данным, длительное применение (в течение 3 лет) ловастатина, а также комбинированная терапия ловастатином и холестироламином приводит к незначительному снижению исходного уровня Лп(а) [Lener et.al., 1992]. Сообщение о влиянии правастатина на уровень Лп(а) [Schmidt et.al., 1992, 1993], не было подтверждено в дальнейшем [Hunninghake et.al., 1993]. Кроме того, в литературе имеются данные о том, что что прием статинов не только не снижает концентрацию Лп(а), но и приводит к ее умеренному повышению [Klausen et al., 1993]. Пробукол не влияет на уровень Лп(а) [Maeda et al., 1989].

Такие же противоречивые результаты были получены и для влияния высоких доз - N-ацетилцистеина [Gavish, Breslow, 1991; Kroon et.al., 1991; Wiklund, et.al., 1996]. Результаты исследований указывали, что уровень Лп(а) оставался резистентным к длительному приему N-ацетил-цистеина в дозах от 2,4 до 6 г в день у 2/3 больных. Для остальных 1/3 больных, включенных в исследование, удавалось снизить Лп(а), однако недостаточно эффективно (примерно на 20%).

Данные, представленные M.Rath, о снижении повышенной концентрации Лп(а) на 27%, достигаемой при приеме высоких доз аскорбиновой кислоты [Rath, Pauling, 1990] не нашли подтверждения ни в наших собственных исследованиях [Ежов 1996], ни в работах других авторов [Bostom et.al., 1995, Jenner, et.al., 2000].

Достоверно показано, что мегадозы никотиновой кислоты и ее производных могут снижать уровень Лп(а) на 30% [Tanaka, et.al., 1997], причем снижение Лп(а) достигается за счет уменьшения скорости его синтеза [Seed et.al., 1993].

Наиболее эффективным в настоящее время является снижение уровня Лп(а) методами терапевтического афереза.

Благодаря присутствию молекулы апоВюо в составе Лп(а), большинство методов ЛНП афереза позволяют снижать уровень Лп(а) за счет сочетанного удаления обеих частиц ЛНП и Лп(а). Такие широко применяемые методы терапевтического афереза как HELP, «DALI»®, иммуносорбция на анти-ЛНП колонках позволяют добиться снижения Лп(а) на 30-60 % [Thompson 2003, Bambauer R 2002; Pokrovsky, 1999] (Рис. 7).

HELP

Jlп(а) Липопак

DALI У

ЛНП-Липопак ZZZ1

LDL-TheraSorb

71

Liposorber

ПФ 0

20

40

60

80

100

Удаление (%)

Рис. 7. Снижение Jln(a) на различных системах для ЛНП афереза.

Armstrong с соавторами, показали, что уровень Лп(а) снижается более чем на 50% на процедуре HELP, основанной на преципитации апоВ-содержащих липопротеидов гепарином в кислой среде [Armstrong et.al, 1992, 1994]. ЛНП аферез на колонках с декстрансульфат целлюлозой «Liposorber»® снижает уровень Лп(а) в течении 1 процедуры почти на 40-60 % [Stefanutti et.al, 1995; Olbricht, 1996]. Использование системы «DALI»® для перфузии цельной крови позволяло снизить уровень Лп(а) до 60 % [Bosch et.al., 2001].

ЛНП-аферез, основанный на мембранной фильтрации, позволял снизить уровень Лп(а) на 50%. Однако при использовании этого метода наблюдается существенное удаление таких жизненно важных компонентов плазмы крови, как IgM (на 55%), IgG (на 27%), альфа 2-макроглобулина (на 49%), а также достоверное снижение антиатерогенных ЛВП (на 27%) за год проводимого лечения [Yamamoto et. al, 1989; Geiss et.al, 1999]. Это является существенными недостатками и ограничивает применение данного метода.

Проведение ЛНП афереза при помощи иммуносорбционных колонок «LDL TheraSorb»® и «ЛНП Липопак»® существенно повышает специфичность удаления апоВюо-содержащих липопротеидов, и увеличивает эффективность снижение уровня Лп(а), однако количественные данные о падении концентрации Лп(а) за процедуру достаточно противоречивы. Так Bambauer пишет, что уровень Лп(а) снижался на процедурах иммуносорбции на колонках «LDL TheraSorb»® на 26% [Bambauer et.al, 1996], тогда как Banyai опубликовал данные о возможности снижения Лп(а) этим методом на 74% [Banyai et.al, 1998]. Thompson в своем последнем обзоре существующих методов ЛНП афереза приводит следующие результаты среднего снижение Лп(а) различными методами: иммуносорбция - на 53%, HELP - 68%, DAL.I - 63%, «Liposorber» -51% [Thompson, 2003].

Существует мнение о нецелесообразности снижения уровня Лп(а), в случаях когда концентрация ХС-ЛНП снижена до 130 мг/дл том [Kitano et.al.

1997]. Однако существуют данные, опровергающие правильность этого мнения.

В частности, результаты исследования Low-Density Lipoprotein Apheresis Angioplasty Restenosis Trial. (L-ART), проведенного для выяснения эффективности снижения уровней Лп(а) и ХС-ЛНП при профилактике рестеноза после ТБКА. Было показано, что в группах больных после ТБКА, получавших и не получавших лечение методами ЛНП афереза, частота возникновения рестенозов составила 38% и 37% соответственно. Тогда как в группе, для которой ЛНП аферез сочетался с терапией никотиновой кислотой и правастатином, количество рестенозов было существенно меньше. При снижении уровня Лп(а) на 50%, частота возникновения рестенозов составила 21%, а в подгруппе больных с Лп(а)<30 мг/дл - только 12%. В случаях, когда не удавалось добиться снижения концентрации Лп(а) частота возникновения рестенозов составляла 50% [Daida et al., 1994].

Необходимым условием эффективности методов терапевтического афереза, и в частности ЛНП афереза, является снижения концентрации удаляемого компонента до нормального уровня. При уровне Лп(а) превышающем нормальное значение более чем в 2 раза (>60 мг/дл) использование методов ЛНП афереза не являются эффективным способом снижения Лп(а). Также не оправдано применение ЛНП афереза в тех в случаях, когда уровень ХС-ЛНП у больного не превышает границы нормы или корригируется при помощи гиполипидемической медикаментозной терапии [Pokrovsky, 1994; Pokrovsky, 1995].

Подводя итог, можно сказать, что обширная работа, проведенная по всему миру в последнее десятилетие, свидетельствует о том, что уровень Лп(а)>30 мг/дл является независимым фактором риска возникновения и развития сердечно-сосудистых заболеваний. Несмотря на отсутствие единого мнения о необходимости коррекции повышенного уровня Лп(а), снижение концентрации данного фактора, может быть полезным и целесообразным у больных ИБС. До настоящего времени не найдено способов эффективного снижения концентрации Лп(а).

Таким образом, разработка новых подходов для специфического удаления Лп(а) у пациентов с уровнем этого липопротеида, значительно превышающим верхнюю границу нормы является актуальной задачей. Поэтому нами была предпринята попытка создания специфического иммуносорбента для удаления Лп(а) из крови больных ИБС с повышенным уровнем Лп(а) и нормальными показателями других липидов.

Сорбционные технологии в лечении больных дилатационной кардиомиопатией.

Проблема лечения больных дилатационной кардиомиопатией (ДКМП) чрезвычайно актуальна. К сожалению, в настоящее время не существует эффективной терапии этого заболевания. Прогноз ДКМП, как правило, неблагоприятный - смертность достигает 50% на 5-7 год после установления диагноза ДКМП (Рис 8). До недавнего времени единственное, чем можно было помочь таким больным - это дорогостоящая, мало доступная во многих странах, в том числе и в России, и высоко рискованная операция по пересадке сердца. Однако очевидно, что хирургический метод может быть использован для очень ограниченного числа больных. В частности в России в последние годы были проведены лишь единичные операции по пересадке сердца. Это связано с общим уровнем медицины в стране, этическими нормами, проблемами поиска донора, типирования, наличия необходимой инфраструктуры, высокой стоимости операции и лечения по предупреждению отторжения пересаженного органа. Поэтому во всем мире ведутся интенсивные работы по исследованию причин возникновения данного заболевания и поиску новых эффективных способов его лечения.

0,25

0-1-1-1

5 /О

Время (годы)

Рис. 8. Смертность при кардиомиопатии (КМ). Идиопатическая КМ; — Ишемическая КМ (по данным Felker et al., 2000).

ДКМП представляет собой неоднородную группу хронических заболеваний миокарда, значительной частью которых является так называемая идиопатическая ДКМП - заболевание невыясненной этиологии [Амосова, 1999]. Возникновение ДКМП связывают с генетическими факторами [Komajda et al., 1999; Dec and Fuster, 1994], вирусной инфекцией [Liu and Mason, 2001], беременностью и родами, токсическими факторами, некоторыми алиментарными дефицитами [Амосова, 1999]. На стадии развития заболевания возникает воспалительный процесс, который, как правило, удается подавить применением медикаментов, однако явления нарушения сократительной функции сердечной мышцы продолжают нарастать. В настоящее время установлено, что этот период развития заболевания сопровождается аутоиммунными процессами, которые, как полагают, и приводят к проявлениям острой дисфункции сердечной мышцы.

Известно, что аутоиммунные процессы характеризуются, как правило, наличием целого спектра аутоантител к различным антигенам, состав которого варьирует у разных пациентов и у одного пациента, на разных стадиях развития заболевания. Исследованию различных типов аутоантител при ДКМП посвящено немалое количество работ. При этом усилия ученых концентрируются, главным образом, на вопросах, какие аутоантитела могут служить маркером этого заболевания, и какова их роль в патофизиологических механизмах развития ДКМП.

Наиболее изученными, из обнаруживаемых в крови некоторых больных ДКМП аутоантител, в настоящее время являются аутоантитела к G-белок рецепторам — семейству мембраносвязанных белков, имеющих трансмембранные домены и участки полипептидной цепи, экспонированные на поверхности клеток. [Wallukat, 2002]. В крови больных ДКМП найдены аутоантитела к двум белкам из этого семейства - ßi-адренорецептору и М2 мускариновому рецептору [Wallukat et al., 1991; Fu et al., 1993]. Изучение специфичности аутоантител к ß 1-адренорецептору показало, что аутоантитела образуются, как правило, против второй петли молекулы ßl-адренорецептора (Рис.9). [Magnusson et al., 1990]. Значительная часть исследований возможного патофизиологического механизма действия этих аутоантител была сделана с использованием полуколичественного метода, опубликованного в 1980 году [Wallukat et al., 1980]. Метод заключался в добавлении IgG фракции сыворотки крови больных к культуре неонатальных кардиомиоцитов крысы и последующей регистрации числа сокращений клеток в культуре. Позднее, благодаря разработке иммуноферментного метода определения аутоантител к ßl-адренорецептору с использованием синтетических пептидов, исследования расширились. Скрининг большого числа пациентов показал наличие этих антител у 80% пациентов с ДКМП [Wallukat et al., 1991]. Следует заметить, что авторы, используя разные методы, обнаруживают высокий титр аутоантител к ßl-адренорецептору, как правило, у 50-90% больных с ДКМП. Причем этот процент выше при использовании ELISA с синтетическими пептидами, соответствующими внеклеточным участкам полипептидной цепи рецептора. Однако, при использовании других методов, в частности с нативным рецептором, антитела были зафиксированы только у 20% пациентов [Jahns R. Et al, 1999]. В последние годы появилось мнение, что пациенты, у которых зафиксированы аутоантитела к ßl-адренорецептору, составляют отдельную группу больных ДКМП [Felix et al, 2000]. Таким образом, вопрос о том, являются ли аутоантител к ßl-адренорецептору биохимическим маркером этого заболевания пока нельзя считать окончательно решенным. 1

- г I .

Рис 9. Взаимодействие аутоантител со второй петлей внеклеточной полипептидной цепи Щ-адренорецептора ¡\УаНикаХ е1 а/., 2002/.

Среди множества других аутоантител, обнаруженных при обследовании больных с ДКПМ, наиболее изученными являются антитела к белку мускаринового М2 рецептора, являющегося другим представителем семейства С-белков рецепторов, адениннуклеотидному транслокатору, миозину, тропомиозину, актину (таблица 4), Каждый из перечисленных видов аутоантител найден у определенного процента больных ДКМП, но, как видно из таблицы 4, ни один не может считаться 100% маркером этого заболевания, хотя антитела к р1 адренорецептору могут служить неплохим маркером.

Еще в 80-е годы, когда только начиналось изучение связи ДКМП и различных аутоантител, высказывались предположения о том, что наличие и концентрация аутоантител свидетельствует о стадии развития заболевания. В частности, наблюдения, сделанные при обследовании семей с наследственной формой ДКМП [Graber et al., 1986] впоследствии показали, что уровень аутоантител к ß 1-адренорецептору у членов семей с развившимся заболеванием в 2 раза выше, чем у здоровых [Limas and Limas, 1993].

Таблица 4. Частота встречаемости аутоантител различной специфичности у больных ДКМП.

Антиген Частота встречаемости у пациентов с ДКМП (%) Источник аир цепи миозина 20-50 Caforio А. et al.„ 1992 Lauer В, et al., 1995 J.Goldman, 1995

Тропомиозин 76 Konstadoulakis M. et al., 1993

Ламинин 78 Wolff P. et al., 1989

Актин 66 Konstadoulakis M. et al., 1993

Адениннуклеотидный транслокатор 30-95 Liao Y, 1996 Schulze K. et al., 1990 Schultheiss H., 1989 i - адренорецептор 30-98 Limas C. Et al., 1989 Magnusson Y. Et al., 1994

Мускариновый М2 рецептор 28-94 Wallukat G, et al., 1999 Fu M. et al, 1996

Много исследований посвящено вопросу о том, способствует ли наличие антител развитию ДКМП и по какому механизму. Существующие на сегодня гипотезы носят спекулятивный характер и являются наиболее обоснованными для предполагаемых патофизиологичеких механизмов действия аутоантител к адениннуклетидному транслокатору и к Р1 -адренорецептору.

Предполагается, что аутоантитела к адениннуклетидному транслокатору способны ингибировать транспорт АТФ из митохондрий к сократительным белкам миокарда, что ведет к уменьшению потребления миокардом кислорода, снижению коронарного кровотока и сердечного выброса. [Schulze et al., 1990].

Л I

Обнаружено также взаимодействие этих аутоантител с белками Ca каналов, что вызывает увеличение поступления Са2+ внутрь миоцитов, их кальциевое повреждение этих клеток и лизис [Chen et.al, 1995].

Аутоантитела к к ß 1-адренорецептору, обладая свойствами ß агонистов, способны вызывать стойкую стимуляцию рецептора, ведущую к тахикардии и способствующую развитию аритмий. Таким образом, положительный хронотропный эффект, оказываемый аутоантителами к ßl -адренорецептору на кардиомиоциты, предположительно, и составляет их патофизиологическую роль в развитии ДКМП [Magnusson, 1994]. Однако эта гипотеза противоречит наблюдению, сделанному при обследовании пациентов, подключенных к аппарату «искусственное сердце». Уровень аутоантител к ß 1-адренорецептору этих пациентов существенно снижался после улучшения функции сердечной мышцы [Muller et al., 1997], что свидетельствует о том, что данный вид аутоантител является не более, чем маркером функционального статуса сердца.

Таким образом, роль различных аутоантител в возникновении и развитии ДКМП пока окончательно не выяснена, а вопрос о их участии в течении болезни остается открытым и мало изученным.

Несмотря на то, что данные о частоте встречаемости различных аутоантител и корреляции между их присутствием и тяжестью заболевания достаточно противоречивы, показано, что эти антитела не встречаются или встречаются достоверно реже в крови здоровых доноров и больных другими сердечно-сосудистыми заболеваниями. Таким образом, эти исследования косвенно свидетельствуют о многочисленных аутоиммунных процессах, которые, возможно, в конечном счете, и формируют фенотип ДКМП и дают основание полагать, что аутоантитела являются важным звеном патологического процесса.

Поэтому попытка вмешаться в течение этого процесса при помощи методов терапевтического афереза, впервые предпринятая в 1996 году в

Германии, является вполне обоснованной [Wallukat et al., 1996]. Приоритет в использовании метода Ig афереза для лечения больных с ДКМП принадлежит группе ученых из German Heart Zentrum, Берлин, Германия. В исследование были включены 8 пациентов с диагнозом ДКМП, в крови которых методом на клеточных культурах были обнаружены аутоантитела к ßl-адренорецептору. Удаление IgG из крови пациентов проводили методом плазмосорбции на колонках с иммобилизованными ПкАт барана против IgG человека («Ig Therasorb» , «Therasorb», Германия). Согласно разработанному протоколу, процедуры проводили ежедневно в течение 4-5 дней, при этом удаляли до 90% суммарной фракции иммуноглобулинов, включая IgG, IgM, IgA. Уровень аутоантител к ßl-адренорецептору при этом также значительно снижался.

Клиническая картина заболевания у пациентов, получавших Ig аферез, значительно улучшилась. В 7 случаях из 8 снизился функциональный класс сердечной недостаточности пациентов по NYHA. В течении 2-3 месяцев уровень аутоантител к ßl-адренорецептору у части пациентов восстановился, что сопровождалось увеличением класса NYHA. На основании этого, в целом успешного, опыта был сделан осторожный вывод о том, что Ig аферез может служить поддерживающей терапией в период ожидания трансплантации сердца, т.е. использоваться как «мост».

В течение последующих 6 лет опыт использования Ig афереза существенно расширился, было проведено 7 исследований, в том числе и у нас, в общей сложности примерно на 200 пациентах. Общая характеристика проведенных испытаний приведена в таблице 5. В России первые процедуры Ig афереза были проведены в 2000 году [Коновалов и др., 2001]. Получены предварительные данные, свидетельствующие о перспективности такого метода лечения больных ДКМП [Коновалов и др., 2002; Коновалов и др., 2004].

Ссылка Тип исследования Кол-во пациентов Время наблюдения Результаты

Wallukat et al., 1996 Неконтролируемое 8 4 месяца Снижение функционального класса сердечной недостаточности по ЫУНА, восстановление уровня аутоантител к Р1 -адренорецептору у части пациентов.

Dorffei et al., 1997 Неконтро лируемое 9 6 дней Улучшение функциональных параметров сердца, сердечного индекса, ударного индекса, общего периферического сопротивления.

Felix et al., 2000 Контролируемое 9/9 3 месяца Увеличение сердечного индекса, ударного индекса , ФВ ЛЖ*. Уровень аутоантител к р 1 -адренорецептору после лечения не восстановился.

Muller et al., 2000 Частично контролируемое 17/17 12 месяцев Увеличение ФВ ЛЖ, КДР ЛЖ**, снижение класса по ЫУНА. Уровень аутоантител к Р1 -адренорецептору после лечения не восстановился

Staudt et al., 2001 Рандомизированное Контролируемое 12/13 3 месяца Увеличение ФВ ЛЖ, снижение показателя инфильтрации лейкоцитов в биопсийном материале. Уровень аутоантител к Р1-адренорецептору после лечения не восстановился.

Felix et al., 2002 Неконтролируемое 11 3 дня Увеличение сердечного индекса, удаление аутоантител к Р1-адренорецептору.

Коновалов и др., 2002 Неконтролируемое 3 20 месяцев Уменьшение объема и полости ЛЖ, улучшение сократимости переднего отдела межжелудочковой перегородки и переднебоковой стенки ЛЖ, увеличение ФВ ЛЖ, уменьшение класса ИУНА.

ФВ ЛЖ - фракция выброса левого желудочка; КДР ЛЖ - конечный диастолический размер левого желудочка.

К сожалению, протоколы лечения в различных исследованиях отличались. Процедуры проводили ежедневно в течение 3-5 дней курсами, с перерывом от 1 месяца до полугода. По окончании курса процедур в части исследований пациентам вводили препарат IgG для предотвращения иммунодефицита [Felix et al., 2000]. Однако в той части исследований, где IgG не вводили, не сообщалось о каких-либо осложнениях.

По данным некоторых исследований аутоантител а к ßl-адренорецептору не детектировались в крови пациентов после 5 процедур иммуносорбции, и их уровень не восстанавливался в течение всего периода лечения [Felix et al., 2000; Muller et al., 2000] . Это наблюдение противоречит ранее полученным данным [Wallukat et al., 1996] и нашим собственным данным [Коновалов и др., 2002].

В результате во всех исследованиях показано, что состояние и параметры сердечной функции пациентов после лечения улучшались. В ряде случаев, улучшение состояния позволило снять пациентов с листа ожидания на пересадку сердца [Muller et al., 2000].

Наибольший объем исследования с периодом наблюдения 12 месяцев был сделан в немецком Центре Сердца Muller et al. Результаты лечения 17 пациентов Ig аферезом при сопоставлении с контрольной группой выявили продолжительный положительный эффект терапии. В группе пациентов, получавших Ig аферез, наблюдалось значительное увеличение фракции выброса левого желудочка по сравнению с контрольной группой после 9 и 12 месяцев наблюдения.

Наш опыт максимально длительного наблюдения одного пациента составляет 20 месяцев [Коновалов и др., 2002], и по неопубликованным данным того же исследования уже > 3 лет наблюдения свидетельствует о дальнейшем улучшении субъективного и объективного состояния пациента.

Положительный эффект, достигнутый при удалении IgG из плазмы крови пациента, подтвержденный наблюдениями разных авторов в различных клиниках, подтвердил факт, что аутоантитела участвуют в патологических процессах при ДКМП. Однако вопрос о том как, и в какой мере, по прежнему остается открытым.

В последние годы были предприняты попытки создания специфических сорбентов для удаления аутоантител к ßl-адренорецептору. Немецкая фирма "Affina", Берлин, Германия, разработала и в настоящее время проводит клинические испытания двух типов колонок с сорбентом на основе синтетических пептидных лигандов [Ronspeek, 2003]. Первый тип — колонки «Globaffin» на основе пептида PGAM146, который, как показано при взаимодействии с плазмой крови человека, связывает IgG, иммунные комплексы и частично, IgM и IgA. То есть данный сорбент по своим характеристикам идентичен анти-IgG сорбентам на основе антител и обладает широкой специфичностью по отношению к иммуноглобулинам человека. Колонка «Globaffin» содержит 250 мг пептида, иммобилизованного на Сефарозу CL-4B при помощи бромциана. Колонки «Globaffin» являются регенерируемой системой, использующей твиновую технологию. То есть в процедуре используются попеременно две колонки. Две колонки «Globaffin» предназначены для проведения одной процедуры.

Другой тип колонок - «Coraffin»- представляет принципиально новое направление в Ig аферезе. В качестве лиганда в колонках «Coraffin» используются два пептида, один из которых (PDCM349) соответствует первой внеклеточной петле ßl-адренорецептора, а второй (PDCM075) второй внеклеточной петле этого рецептора. То есть данный тип сорбента строго специфичен к аутоантителам к ßl-адренорецептору. Колонка содержит суммарно 7,5 мг иммобилизованных пептидов и предназначена для однократного применения при проведении одной процедуры.

В клиническое исследование колонок «Globaffin» и «Globaffin» были включены в общей сложности 40 пациентов. Из них 8 - получали лечение на колонках «Coraffin», 15 - на колонках «Globaffin». Контрольная группа из 17 пациентов находилась на консервативном лечение. Каждому пациенту был проведен один курс из 5 ежедневных процедур. Данных о режиме проведения процедур и объеме обработанной плазмы не сообщается. В настоящее время опубликованы предварительные результаты данного исследования [КопБреск е1 а1, 2003]. Показано, что в результате курса процедур, аутоантитела к Р1-адренорецептору удаляются на 95% с одинаковой эффективностью на колонках обоих типов. Клиническое обследование пациентов до начала лечения и спустя 12 месяцев после проведенной терапии показало, что ФВ ЛЖ у пациентов контрольной группы не изменилась, у пациентов получавших лечение на колонках «Coraffin», специфичных к аутоантителам к Р1-адренорецептору - увеличилась на 7% (р<0,05), у пациентов на колонках «Globaffín» - на 15 % (р<0,001). Побочных эффектов, связанных с использованием колонок, отмечено не было. Таким образом, в данном исследовании использование узкоспецифического сорбента не имело явных преимуществ по сравнению с обычным аферезом.

Таким образом, проведение работ по применению процедур афереза позволяет оптимистично оценивать возможности их использования для лечения больных ДКМП.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для выделения липопротеидов человека и тестирования сорбентов использовали кровь здоровых доноров и плазму крови, полученную при проведении процедур плазмафереза в лаборатории гемодиализа и плазмафереза Института клинической кардиологии (руководитель профессор Кухарчук B.B.) PK НПК МЗ и CP РФ, а также отделения экстракорпоральных методов лечения ОБП Медицинского центра УД президента РФ (руководитель профессор Коновалов Г.А.).

В работе использовали следующие реагенты.

При приготовлении сорбентов: матрицы Sepharose CL-2B, CL-4B, CL-6B, 6МВ, 4 Fast Flow («Amercham Bioscience», Швеция) и реактивы: бромциан, этаноламин, натрия метапериодат, натрия боргидрид («Fluka», Германия).

В культуральной работе: среды №199, RPMI1640, глутамат натрия, антибиотики (пенициллин, стрептомицин и фунгизон), фетальную телячью сыворотку - реактивы фирмы «Gibco», Англия.

При проведении электрофореза и иммуноблотинга: акриламид, бисакриламид - препараты «Serva», Германия; агароза IFI («Amercham Bioscience», Швеция); трисгидроксиаминометан - реактив «Sigma», США; этилморфолин - «Fluka», Германия; кумасси R-250, бромфеноловый синий -реагенты фирмы «Serva», Германия; нитроцеллюлозные фильтры (150X150 мм, 0,45 мкм) -« Schleicher & Schuell», Германия.

Для жидкостной хроматографии применяли носители: Sepharose CL-4B, Sephadex G-25 («Amercham Bioscience», Швеция) и целлюлозу DE-52 («Wathman», Англия).

В работе были использованы препараты белков: бычий сывороточный альбумин - продукт предприятия БелНИИЭМ, г. Минск; антисыворотка против сыворотки человеческого донора - производство Института Вакцин и

Сывороток, г.Санкт-Петербург; иммуноглобулины кролика к иммуноглобулинам мыши, иммуноглобулины кролика к иммуноглобулинам барана, конъюгированные с пероксидазой - производство «Имтек», Москва.

Общий холестерин, холестерин ЛВП и триглицериды измеряли с помощью энзиматических наборов фирмы «Boehringer», Германия. Белок по Лоури определяли с 2N реагентом Фолина ( «Sigma», США).

Тестирование пирогенности растворов и антител проводили с помощью реактивов « Associates of CAPE COD, Inc.», США.

В работе также использовали: соли, кислоты, щелочи - продукты «Sigma», США; «Analar», Англия; «Reanal», Венгрия; «Реахим», Россия (марок «хч», «осч»). Консерванты и антисептики: этилендиамин тетрауксусной кислоты натриевая соль - препарат фирмы «Analar», Англия; фенилсульфонид фторид («Мегск», Германия); азид натрия, тимеразол, апротинин - препараты фирмы «Sigma», США.

В качестве животных - доноров при получении поликлональных антител использовали баранов фермерского хозяйства НПФ «ПОКАРД». В качестве иммуностимуляторов использовали полный и неполный адъювант Фрейнда («Sigma», США). При продуцировании асцитной жидкости для выделения моноклональных анитител использовали мышей линии BALB/c из биоклиники РК НПК МЗ и CP РФ.

VI. выводы.

1. Синтезирован иммуносорбент с поликлональными антителами к ЛНП, на основе которого созданы высокоспецифичные колонки для ЛНП афереза («ЛНП Липопак»®). На примере данного сорбента сформулированы основные принципы получения сорбентов с заданными свойствами, обеспечивающими их эффективное применение в экстракорпоральной терапии. Результаты длительного (более 18 лет) использования данного сорбента в клинической практике для лечения больных СГХС доказали эффективность и безопасность экстракорпоральной терапии с применением специфичных сорбентов.

2. Получена и охарактеризована панель моноклональных антител против ЛНП человека, с их помощью проведено картирование эпитопов экспонированных на поверхности частицы ЛНП участков молекулы апол ипопротеинаВ юо

3. Синтезирован сорбент с МкАт к ЛНП. Показана принципиальная возможность использования одного МкАт для синтеза иммуносорбентов с высокой сорбционной емкостью. Сформулированы основные подходы к созданию сорбентов на основе МкАт для клинического применения. Доказана эффективность и безопасность использования данного сорбента в клинической практике.

4. Создана модель ЛНП афереза in vitro, с помощью которой показано снижение концентрации липидов в пораженных атеросклерозом участках аорты человека. Показана принципиальная возможность регрессии (обратного развития) атеросклеротических бляшек в коронарных артериях больных СГХС после длительного курса ЛНП афереза с использованием колонок «ЛНП Липопак»® и «Иммунолипосорбер МкАт».

5. В результате сравнения различных плазмо- и гемо - совместимых сорбентов для ЛНП афереза, показано, что сорбенты на основе антител максимально специфичны, биосовместимы и стабильны при многократном применении, такие сорбенты являются оптимальными в случае проведения длительного курса экстракорпоральной терапии больным с высоким содержанием ЛНП и резистентными к лекарственной терапии.

6. Показано, что концентрация Лп(а) в крови прямо связана с наличием и степенью выраженности атеросклероза в коронарных, сонных артериях, а также с частотой окклюзии аутовенозных шунтов после операции реваскуляризации миокарда. Лп(а) может рассматриваться как независимый фактор риска и биохимический маркер атеросклероза.

7. Синтезирован сорбент с поликлональными антителами к Лп(а), на основе которого созданы колонки «Лп(а) Липопак»®. Длительное применение (более 12 лет) этого сорбента для лечения больных ИБС с повышенным уровнем Лп(а) и нормальным уровнем других липопротеидов продемонстрировало эффективность процедур специфичного Лп(а) афереза. Получены доказательства участия Лп(а) в атерогенезе.

8. Синтезирован сорбент с иммобилизованными ЛНП человека. Доказана возможность использования в экстракорпоральной терапии сорбентов на основе иммобилизованных антигенов. Получены данные о наличии в крови некоторых больных ИБС фракции иммуноглобулинов класса в, имеющих сродство к ЛНП что может свидетельствовать о вкладе аутоиммунных процессов в патогенез атеросклероза.

9. Создан и характеризован сорбент с ПкАт к человека, способный высокоэффективно связывать различные аутоантитела. Получены предварительные результаты возможности использования коротких курсов афереза для лечения тяжелых форм ДКМП. Созданы аффинные колонки для терапевтического афереза Адсопак»®.

10. Разработана универсальная технология производства колонок с аффинными сорбентами для терапевтического афереза, соответствующая международным требованиям к качеству производства продуктов медицинского назначения (GMP). Система качества разработки и производства таких колонок сертифицирована на соответствие стандартам ISO 9001. Трем продуктам, выпускаемым по данной технологии в России - колонкам «ЛНП Липопак»®, «Лп(а) Липопак»® и «Ig Адсопак»® присвоен знак соответствия Европейским стандартам качества — «СЕ mark».

БЛАГОДАРНОСТИ.

Настоящая работа не могла быть проделана и завершена без активного участия многих экспериментаторов и клиницистов. Поэтому в заключении я хотел бы выразить слова глубокой благодарности: академикам В.Н.Смирнову и Е.И.Чазову за инициацию настоящей работы, интерес к ней, внимание и поддержку; моим сотрудникам и коллегам: Адамовой И.Ю., Афанасьева О.И.,

Афанасьевой М.И., Беневоленской Г.Ф., Ивановой Н.И., [Тертову В.В.|, Орехову А.Н., Янушевской Е.В., Чичинадзе О.М., Горбатюк Е.В., Разовой O.A.

Клиническая часть работы была выполнена совместно с замечательными врачами: [Арабидзе Г.Г|., Акчурину P.C., Кухарчуку В.В., Коновалову Г.А., Ежову М.В., Ильиной Л.Н., Сусекову A.B., Лякишеву A.A., Чебышеву А.Н., Звездкину П.В.

Освоение и налаживание технологии производства колонок с сорбентами было бы невозможно без активного участия Кипор С.Г., Кошелевой H.A., Люлиной Н.В., Сусековой И.В., Тимонина И.М., Гитинова М.М., Вихровой Е.Б.

Я признателен коллегам из-за рубежа с кем удалось организовать и провести совместные работы: Stoffel W., Oette К., Borberg H. из Кельнского университета; Yamamoto A., Yamamura Т. из национального центра сердечнососудистых заболеваний (Осака, Япония); Shmitz G., Ulrich H. из Университета Регенсбурга; Fruchart J.-C. и Bard J.-M. из Университета г. Нанси (Франция); Rubin A., Levine D., Gordon В., Saal S. Рогозинский институт (Нью-Йорк, США); Thompson G. Хаммерсмин госпиталь (Лондон, Англия).

Регистрация русских колонок в Европе была бы невозможна без помощи

Dr. H.P.Franck,

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Таким образом, в результате проделанной работы удалось получить новые знания и результаты, которые имеют практическое значение.

Научная новизна. Создано новое направление в отечественной биохимии и биотехнологии - «Аффинные сорбенты для медицины», которое в настоящее время успешно развивается. Впервые в стране разработаны и внедрены в клиническую практику аффинные сорбенты для лечения больных с нарушениями липидного обмена и ДКМП, резистентных к лекарственной терапии. Все сорбенты, представленные в работе, созданы впервые в России, а сорбенты для ЛНП афереза с МкАт, Лп(а) афереза и ЛНП сорбент получены впервые в мире и не имеют аналогов. Разработаны подходы к созданию высокоспецифичных аффинных сорбентов для процедур терапевтического афереза. Определены основные принципы, позволяющие синтезировать сорбенты с заданными свойствами для лечения различных патологий. Сорбенты для ЛНП, Лп(а) и Ig афереза успешно апробированы в клинике и разрешены к клиническому применению в России и за рубежом.

На примере больных СГХС На типа; гиперлипидемиями, устойчивыми к лекарствам; ИБС и повышенным уровнем Лп(а); ИБС и аутоантителами к ЛНП; ДКМП с высоким титром аутоантител к (31 -адренорецептору показана возможность эффективного удаления как патогенных антигенов [ЛНП и Лп(а)], так и антител (анти-ЛНП и анти-IgG) с помощью высокоспецифичных аффинных сорбентов.

Использование аффинных сорбентов открыло новые возможности исследования in vivo вопросов участия различных компонентов крови человека (антигены и/или антитела) в патогенезе различных заболеваний. Проведение процедур Лп(а) афереза позволило продемонстрировать атерогенность Лп(а) и открыло новые перспективы изучения различных аспектов метаболизма частиц Лп(а) in vivo, что было невозможно ранее.

Получены новые данные о клинической эффективности изолированного высокоспецифичного удаления Лп(а) у больных ИБС с повышенным уровнем Лп(а) и нормальным ХС-ЛНП и ОХС. Внедрение Лп(а) афереза позволило получить первые прямые доказательства участия частиц Лп(а) в формировании и развитии атеросклеротических поражений коронарных артерий.

Испытания колонок ЛНП сорбента позволили впервые получить экспериментальные данные о наличии в крови некоторых больных ИБС фракции иммуноглобулинов класса G, имеющих сродство к ЛНП, что может свидетельствовать о вкладе аутоиммунных процессов в патогенез атеросклероза.

Практическая значимость работы. Все сорбенты, описанные в работе, успешно прошли клинические испытания. Колонки на основе сорбентов с ПкАт и МкАт к ЛНП зарегистрированы МЗ СССР и разрешены к широкому применению в медицинской практике. Создана и внедрена в практику современная уникальная технология производства колонок с аффинными сорбентами, соответствующая правилам GMP (Good Manufacturing Practice). Впервые на территории бывшего СССР создан продукт, разработка и производство которого соответствуют международным требованиям, предъявляемым к Системе качества (получен сертификат ISO 9001). Колонкам «ЛНП Липопак»®, «Лп(а) Липопак»® и «Ig Адсопак»® присвоен «СЕ mark», что открывает возможность их использования без ограничений в странах Европейского сообщества. Созданные в результате настоящей работы колонки были апробированы и используются для лечения тяжелых, рефрактерных к другим способам терапии больных с нарушениями липидного обмена в клиниках России, Германии, США, Японии, Англии, Италии, Болгарии, Чехии, Турции, ОАЕ и Китая под зарегистрированными торговыми марками: «LDL Lipopak»®, «Lp(a) Lipopak»® и «Ig Adsopak»®.npn длительном использовании колонок с сорбентами для ЛНП афереза удалось продемонстрировать возможность не только стабилизации, но и обратного развития (регрессии) коронарного атеросклероза у больных СГХС. Доказано улучшение состояния больных тяжелыми формами атеросклероза при длительном курсе афереза липидов.

Показано, что Лп(а) может быть использован как биохимический маркер возникновения атеросклероза. Данные о концентрации Лп(а) в крови пациента могут в ряде случаев облегчить диагностику нарушений липидного обмена.

Использование колонок Адсопак»® в процедурах афереза для лечения больных с тяжелыми формами ДКМП открыло новые перспективы лечения.

На основе антител, полученных в ходе выполнения работы, разработан целый ряд иммунохимических методов количественного определения концентрации различных компонентов крови, таких как: аполипопротеинВюо -турбодиметрия; Лп(а) - радиальная иммунодиффузия и иммуноферментный анализ (ИФА); антитела человека против иммуноглобулинов барана и/или мыши - ИФА; суммарной фракции ^О-турбодиметрия. Все перечисленные методы успешно используются для определения концентрации указанных веществ в образцах крови человека.