Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Формирование антиинфекционной и противоопухолевой защиты при стимуляции врожденного иммунитета рекомбинантным белком теплового шока-70 в эксперименте.

На правах рукописи

ВОРОБЬЕВ Денис Сергеевич

ФОРМИРОВАНИЕ АНТИИНФЕКЦИОННОЙ И ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ЗАЩИТЫ ПРИ СТИМУЛЯЦИИ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА РЕКОМБИНАНТНЫМ БЕЛКОМ ТЕПЛОВОГО ЦЮКА-70 В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА - 2009

003479056

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских нау Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечников РАМН

Научные руководители:

Доктор медицинских наук Семенова Ирина Борисовна Доктор медицинских наук Доненко Федор Витальевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Ляшенко Всеволод Андреевич Доктор медицинских наук, профессор Пинегин Борис Владимирович

Ведущее учреждение: РГМУ им. Н.И. Пирогова

Защита диссертации состоится «29» октября 2009 г. в 12 часов на заседай диссертационного совета Д 001.035.01 при НИИ вакцин и сывороток им. И. Мечникова РАМН (105064 Москва, Малый Казенный пер., д.5а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сыворот им. И.И. Мечникова РАМН

Автореферат разослан <2б» «сентября» 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Яковлева И. В,

Актуальность темы. Согласно современным представлениям иммунная система состоит из элементов врожденного и приобретенного иммунитета. Толл-подобные рецепторы (Toll-like receptors - TLRs) играют ключевую роль в системе врожденного иммунитета, распознавая экзогенные и эндогенные сигналы опасности [R. Medzhitov, 1997; F. Romagne, 2007]. Не так давно началась интенсивная работа по созданию нового класса иммунобиологических препаратов - модификаторов (активаторов - агонистов; ингибиторов - антагонистов) функций TLRs и их сигнальных путей [R.S. Kornbluth, G.W. Stone, 2006; AJ.H. Gearing, 2007]. Полагают, что такие модификаторы станут эффективным средством иммунопрофилактики и иммунотерапии не только инфекционных болезней, но и аллергических, аутоиммунных, онкологических заболеваний [G. Trinchieri, A. Sher, 2007]. Модификаторы TLRs рассматривают как возможное средство защиты от пандемий и последствий биотеррористических актов.

В качестве модификаторов исследуют природные лиганды (патоген-ассоциированные молекулярные структуры (ПАМС) микроорганизмов) и их синтетические аналоги [G. Trinchieri, A. Sher, 2007; R.S. Kornbluth, G.W. Stone, 2006].

Обширная литература посвящена исследованию роли представителей большой группы многофункциональных белков теплового шока (БТШ), которые взаимодействуют с TLRs. В эту группу входят различающиеся по молекулярной массе и структуре члены семейств: БТШ90, БТШ70, низкомолекулярные БТШ (1535 Ша) и высокомолекулярные БТШ (М>110 kDa) [К.Д. Никитин, А.Ю. арышников, 2007]. Иммунотропная активность выявлена у БТШ70, gp96 семейство БТШ90), БТШ110 и БТШ170 [П.Г. Свешников и др., 2007].

Показано, что БТШ70 и gp96 являются элементами иммунологических обытий и патогенеза инфекций, аутоиммунных и онкологических процессов [Q. и, 2002; D.R. Ciocca, S.K. Calderwood, 2005; Z.-Y. Zhang et al„ 2009].

Молекулы БТШ70 и gp96 являются лигандами для рецепторов клеток рожденного иммунитета. Они активируют макрофаги и дендритные клетки (ДК), апускают экспрессию антигенпредставляющих и костимуляторных молекул [НА

Zheng, J. Dai et al., 2001; Y. Wang, C.G. Kelly et al., 2002; M-F. Tsan, B. Gao, 2004, 2009; A. Asea, 2005, 2007]; являются индукторами второго сигнала, который относится к необходимому компоненту формирования адаптивного иммунного ответа [A. Bolhassani, S. Rafati, 2008].

Белок теплового шока используют при конструировании ДНК-вакцин, пептидных вакцин в качестве адъюванта для эффективного представления связанного с ним антигена Т-лимфоцитам [Р.К. Srivastava et al., 1994; D. Arnold et al., 1995; A-M.T. Ciupitu et al., 1998; G. Multhoff, 2006; M. Peng et al., 2006; D. Toomey et al., 2008]. В частности, активно разрабатывается профилактическая вакцина против рака шейки матки на основе онкобелка Е7 и БТШ70 [В.И. Киселев и др., 2005]. Однако проведенные клинические испытания с индивидуальными аутологичными противоопухолевыми вакцинами следует признать не столь успешными [D.R. Ciocca, S.K. Calderwood, 2005].

В настоящее время значительно меньше уделено внимания антиинфекционной и противоопухолевой активности БТШ, как такового, без конъюгации его с пептидом [В. Javid, Р.А. MacAry, P.J. Lehner, 2007; M-F. Tsan, В. Gao, 2004, 2009].

Данное исследование проведено с рекомбинантным белком теплового шока-70 Mycobacterium tuberculosis1. Препарат содержал примесь липополисахарида (ЛПС) Escherichia coli, что обусловлено методом его получения, поэтому белок теплового шока, использовавшийся в нашей работе, описывали аббревиатурой рБТШ+ЛПС.

Цель работы. Исследовать способность рБТШ+ЛПС создавать у животных защиту против патогенов разных таксономических групп и оказывать влияние на развитие экспериментальных опухолей.

Задачи исследования.

1. Оценить резистентность мышей к Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae и вирусу гриппа птиц (H5N2) при различных схемах введения рБТШ+ЛПС.

1 Выражаем благодарность за предоставление препарата проф. В.И. Киселеву и проф. П.Г. Свешникову

2

2. Исследовать противоопухолевую (против меланомы В16 и карциномы яичника) активность рБТШ+ЛПС в экспериментах на мышах.

3. Установить роль ЛПС, входящего в состав рекомбинантного БТШ, при формировании у "животных невосприимчивости к инфекциям.

4. Изучить действие рБТШ+ЛПС на функциональную активность ДК, функциональные свойства и фенотип мононуклеарных клеток, а также продукцию цитокинов.

5. Экспериментально определить возможность образования аутоантител к органонеспецифическим антигенам у мышей при введении рБТШ+ЛПС.

Научная новизна. Впервые показано, что рБТШ+ЛПС при однократном введении создает у мышей быструю (через 48-72 ч) защиту против микроорганизмов разных таксономических групп - бактерий разных семейств (S. typhimurium, S. pneumoniae) и вируса гриппа птиц (H5N2). При трехкратном введении рБТШ+ЛПС в дозе 10 мкг/мышь формируется защита в течение всего срока наблюдения (21 день) от S. typhimurium.

Впервые выявлено, что наряду с антиинфекционной активностью рБТШ+ЛПС обладает способностью тормозить рост некоторых экспериментальных опухолей при пятикратной аппликации (меланома В16).

Впервые установлено, что примесь ЛПС в составе рекомбинантного белка теплового шока усиливает антиинфекционную активность БТШ70.

Изучено взаимодействие рБТШ+ЛПС с TLR2 и TLR4 человека, экспрессированными на перевиваемых клеточных линиях. При этом показана активация внутриклеточного ядерного фактора NF-кВ, который контролирует синтез цитокинов.

Показано, что в ответ на введение рБТШ+ЛПС у интактных мышей повышался уровень IL-6 и IFN-y в сыворотке, а у зараженных S. typhimurium животных уменьшался уровень IL-6 и TNF-a, но увеличивался синтез IFN-y.

Выявлено, что в системе in vitro рБТШ+ЛПС стимулировал созревание ДК мышей и усиливал цитотоксическую активность мононуклеарных лейкоцитов

(MHJI) периферической крови человека в отношении клеток эритробластного лейкоза. Под влиянием рБТШ+ЛПС возрастала экспрессия молекул CD25 и CD56 на МНЛ.

Впервые в эксперименте на мышах показано, что введение рБТШ+ЛПС не сопровождалось выработкой аутоантител к органонеспецифическим антигенам (ДНК, коллаген, эластин).

Практическая значимость. Результаты проведенных исследований открывают перспективу использования рекомбинантного БТШ+ЛПС в качестве модификатора функции TLRs, с помощью которого можно создавать защиту против широкого круга патогенов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В эксперименте на мышах показано, что рБТШ+ЛПС М. tuberculosis создает защиту против бактерий (S. typhimurium, S. pneumoniae), вируса гриппа птиц (H5N2), а также вызывает торможение роста опухоли меланомы В16.

2. Белок теплового шока, содержащий в своем составе примесь ЛПС, формирует более выраженную защиту от бактериальной инфекции по сравнению с белком, где ЛПС был инактивирован полимиксином В. Самостоятельно ЛПС Е. coli при однократном введении не защищал мышей от S. typhimurium в дозе, количественно сопоставимой с таковой в исследуемом препарате.

3. Рекомбинантный БТШ+ЛПС взаимодействует с TLR2 и TLR4 человека, активирует внутриклеточный ядерный фактор NF-кВ, который регулирует синтез цитокинов.

4. Цитотоксический эффект МНЛ in vitro в отношении опухолевых клеток К-562 определяется способностью рБТШ+ЛПС стимулировать активность натуральных киллеров, что подтверждается экспрессией молекулы CD56 на мембране МНЛ.

пробация работы. Материалы диссертации доложены на V Всемирном Конгрессе о иммунопатологии и аллергологии (апрель 2007, Москва), на II Международном онгрессе «Иммунитет и болезни» (27-29 июня 2007, Москва), на Российском едицинском форуме (октябрь 2007, Москва), на конкурсе «Умник» (ноябрь 2007, ущино), на Объединенном иммунологическом форуме (29 июня - 5 июля 2008, анкт-Петербург), на II научно-практической конференции в рамках Третьего естиваля науки в городе Москве и Биотехнологической выставки-ярмарки РосБиоТех-2008» (5-7 ноября 2008, Москва), на конференции, посвященной 100-етию со дня присуждения И.И. Мечникову Нобелевской премии (13-14 ноября 008, Москва). Апробация работы состоялась на конференции отдела иммунологии 1И вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, 23 июня 2009 г.

убликацин. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 8 — в риалах, рекомендованных ВАК РФ.

труктура и объем диссертации. Материалы работы изложены на420страницах омпьютерного текста и состоят из введения, обзора литературы, 5 глав бственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, иблиография включает 177 источников (15 отечественных и 162 зарубежных), иссертация иллюстрирована 23 таблицами и 6 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕРАБОТЫ АТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

спользованные препараты:

рекомбинантный белок теплового шока с молекулярной массой 70 kDa. Белок плового шока содержал примесь ЛПС в концентрациях 0,185 мкг/мл (I серия) и ,266 мкг/мл (II серия), поэтому препарат описывали аббревиатурой рБТШ+ЛПС; коммерческий антиген СА125, маркер рака яичников (ХЕМА, Россия); конъюгат БТШ с антигеном СА125: БТШ-СА125 (Всероссийский научный центр олекулярной диагностики и лечения);

- коммерческий ЛПС Е. coli К-235 (SIGMA®, Germany);

- коммерческий полимиксин В (polymyxin В sulfate, РМВ) (Fluka BioChemika, Denmark);

-моиоклональные антитела против дифференцировочных антигенов CD4, CD 16, CD25, CD56, CD40, CD80, CD83, CD86 и F4/80 («Caltag Laboratories», США). Лабораторные животные Опыты проводили на белых беспородных мышах массой 12-14 и 14-16 г, самцы (п=1200); мышах линии СВА массой 18-20 г, самцы (п=200), полученных из питомника ГУ НЦ Биомедицинских технологий РАМН «Андреевка»; мышах С57В1/6 весом 20-22 г, самцы (п=40) из питомника «Столбовая» Московской области. Штаммы микроорганизмов

В работе использовали штаммы £ typhimurium 415 f., S. pneumoniae m.3 N.3, полученные из коллекций культур НИИ им. И.И. Мечникова и вирус птичьего гриппа H5N2 (штамм любезно предоставлен Ю.А. Смирновым2). Метод культивирования и получения микробной взвеси для заражения мышей

Культивирование штаммов S. typhimurium и S. pneumoniae проводили соответственно в 0,2% сахарном бульоне и сывороточном бульоне, после чего пересевали S. typhimurium на питательный агар, a S. pneumoniae - на сывороточный агар. Выросшую микробную культуру смывали 0,9% раствором хлорида натрия и определяли концентрацию по оптическому стандартному образцу мутности (ОСО 42-28-85 П). Полученную микробную взвесь доводили до концентрации 1x10 микробных клеток/мл и делали последовательные 10-кратные разведения в 0,9% растворе хлорида натрия.

Метод оценки протективной активности рБТШ+ЛПС на экспериментальной модели бактериальной инфекции

Рекомбинантный БТШ+ЛПС вводили внутрибрюшинно однократно в широком диапазоне доз (от 1 до 400 мкг/мышь) или трехкратно (10 мкг/мышь) ежедневно. Через 24 часа после последнего введения препарата мышей заражали внутрибрюшинно летальными дозами S. typhimurium (106 микробных клеток) и S.

2 НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

pneumoniae (10 микробных клеток) в 0,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Для контроля заражающей дозы использовали интактных животных, которым вводили культуры S. typhimurium в дозах 106-10s-104 микробных клеток или S. pneumoniae в дозах 105-104-103 микробных клеток и определяли величину LD50 по формуле Кербера в модификации Ашмарина [И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев, 1962]. Наблюдение за животными проводили в течение 21 дня.

Метод оценки протективного действия рБТШ+ЛПС на экспериментальной модели ирусной инфекции

Для воспроизведения модельной вирусной инфекции на животных использовали ирус гриппа птиц H5N2 (A/Mallard/Pansil/1024/84 - H5N2), выделенный от уток и датированный к мышам.

Рекомбинантный БТШ+ЛПС вводили внутрибрюшинно однократно в дозах 100 кг/мышь или 400 мкг/мышь. После чего животным инокулировали интраназально ирус гриппа птиц H5N2 в дозе 10 LD50 в объеме 100 мкл (LD50 Для вируса гриппа пределяли в предварительном опыте титрованием на мышах). Для контроля спользовали интактных животных, которых заражали аналогичной дозой вируса . иппа птиц H5N2. Наблюдение за животными проводили в течение 14 дней.

етод оценки роли примеси ЛПС в рекомбинантном белке теплового шока-70 при оздании резистентности на модели инфекции, вызванной S. typhimurium

Мышам вводили внутрибрюшинно однократно или трехкратно ежедневно с нтервалом 24 часа: (1) рБТШ+ЛПС; (2) белок, обработанный полимиксином В РМВ) для связывания ЛПС по принятой методике [Н. Tsuzuki et al., 2001]; (3) репарат, в котором белок теплового шока был денатурирован кипячением в ечение 30 минут [Y. Bulut et al., 2005]; (4) ЛПС Е. coli 235 и (5) РМВ. Через 24 ч осле последней иммунизации мышей заражали внутрибрюшинно летальной дозой . typhimurium 10б микробных клеток в 0,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия, онтролем служили интактные животные, которых заражали S. typhimurium в дозах 06-105-104 микробных клеток. Наблюдение за животными проводили в течение 21 ня.

Определение противоопухолевой активности рБТШ+ЛПС

Противоопухолевую активность БТШ изучали на мышах-самцах линии C57BI/6 и СВА массой 18-20 г. В качестве моделей использовали клетки опухолей меланомы В16 и карциномы яичников СА01, полученные из банка опухолевых штаммов ГУ РОНЦ РАМН им. H.H. Блохина. Иммунизацию животных проводили по двум схемам: (1) рБТШ+ЛПС вводили внутрибрюшинно однократно в дозах 100 мкг/мышь или 400 мкг/мышь; трехкратно или четырехкратно в дозе 100 мкг/мышь с интервалом 2 недели; конъюгат БТШ-СА125 трехкратно с интервалом 2 недели; через 24 часа или 2 недели после последнего введения препарата опухолевые клетки СА01 имплантировали подкожно в 0,2 мл суспензии в дозе 500.000-1.000.000/мышь; (2) мышам подкожно вводили клетки перевиваемого штамма меланомы В16, а затем проводили пятикратную аппликацию препаратом рБТШ+ЛПС в дозах 20 мкг/мышь или 100 мкг/мышь. Противоопухолевый эффект оценивали по объему опухоли и торможению роста опухоли (ТРО). Измерение объема опухоли проводили в двух взаимно перпендикулярных положениях. Объем выражали в условных единицах и определяли по формуле V=a2b, где а - меньший, b - больший линейные размеры опухоли, выраженные в миллиметрах. Торможение роста опухоли рассчитывали по формуле: ТРО = Vep. „пыт - Vcp. ко„ТроЛь / Vcp. ко|,троЛ1,*100% Определение цитотоксической активности MHJI под влиянием рБТШ+ЛПС

Цитотоксическую активность МНЛ определяли на чувствительной к натуральным киллерам линии К-562 (эритробластный лейкоз человека). Опухолевые клетки (104 клеток/мл) инкубировали с МНЛ и рБТШ+ЛПС в концентрациях 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл и 10 мкг/мл (в соотношениях клетки-мишени/эффекторы 1:5, 1:2 и 1:1) в плоскодонных 96-луночных микропланшетах («Costar») 18 ч. Затем в лунки добавляли витальный краситель МТТ («Sigma») и по оптической плотности, измеряемой на мультискане MS («Labsystem»), рассчитывали процент лизиса опухолевых клеток (процент цитотоксичности).

Метод оценки взаимодействия рБТШ+ЛГТС с TLR2 и TLR4

Для определения специфичного связывания TLRs с исследуемым препаратом в аботе использовали линии клеток эмбриональной почки человека 293, стабильно кспрессирующие hTLR4/MD2-CD14 и hTLR2/CD14 [Д.В. -Щебляков, Д.Ю. огунов, 2008]. Контролем служили клетки 293-null, не экспрессирующие TLRs. летки культивировали в среде DMEM (Hyclone, США) с добавлением 10% етальной бычьей сыворотки, глютамина, пенициллина и стрептомицина. Через 24 аса после добавления к клеткам исследуемого препарата удаляли всю среду и риливали буфер с субстратом для р-галактозидазы (1 мМ MgCb; 0,25 М трис-НС1, Н 7,4; 0,02% NP40; 2 г/л о-нитрофенил-(3-Д-галактопиранозид). Уровень ктивности Р-галактозидазы определяли спектрофотометрически (414 нм) по онверсии о-нитрофенил-(3-Д-галактопиранозида. О способности рБТШ+ЛПС вязываться с TLR2 и TLR4 судили по цветной реакции на галактозидазу (ген алактозидазы находится под контролем транскрипционного фактора NF-kB). етод определения количественного содержания ЛПС в рекомбинантном белке еплового шока-70

Содержание эндотоксина в препарате определяли в гель тромб JIAJI (Limulus mebocyte lysate)- тесте PYROGENT® компании CAMBREX Bioscience (США), остановка теста выполнялась в соответствии с ОФС 42-0002-00 для оличественного определения содержания бактериальных эндотоксинов в спытуемом препарате. Метод получения ДК и MHJI in vitro Дендритные клетки получали из костного мозга мышей линии СВА по андартной методике [С.М. Ситдикова и др., 2009] с добавлением гранулоцитарно-акрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и интерлейкина-4 L-4). В качестве индуктора созревания ДК использовали белок теплового шока-70 TNF-a в качестве контроля. Мононуклеарные лейкоциты периферической крови овека выделяли с помощью одноступенчатого градиента плотности фиколл-ографина по методу A. Boyum [A. Boyum, 1968].

Метод оценки действия рБТШ+ЛПС на экспрессию поверхностных маркеров дендритных клеток

Рекомбинантный БТШ+ЛПС в дозах 0,1 мкг/мл, 1 мкг/мл и 10 мкг/мл добавляли к незрелым ДК и через трое суток оценивали экспрессию поверхностных молекул (CD40, CD80, CD83, CD86 и F4/80) в культуре клеток in vitro. В качестве контроля использовали незрелые и зрелые ДК (последние получали путем добавления к незрелым ДК TNF-a в дозе 100 нг/мл).

Метод определения цитокинов у интактных и зараженных мышей

Уровень цитокинов определяли в сыворотках мышей: (1) иммунизированных рБТШ+ЛПС, (2) рБТШ+ЛПС и зараженных S. typhimurium, (3) зараженных S. typhimurium и (4) интактных животных, методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-систем фирмы «Bender MedSystems®» (Австрия) в диапазоне детектируемых концентраций от 1 до 13 пкг/мл.

Метод проточной цитометрии ÍFASC-анализ)

Исследование проводили для определения экспрессии поверхностных маркеров мононуклеаров и ДК при помощи моноклональных антител («Caltag Laboratories», США) на проточном цитофлуориметре FascCalibur (Becton Dickinson, США). Результаты рассчитывали с помощью программы WinMdi 2.8. Метод определения аутоантител к органонеспецифическим антигенам

Для определения аутоантител в сыворотке мышей использовали твердофазный ИФА к ДНК (нативная, денатурированная) по методу, разработанному Н.Е. Ястребовой [Н.Е. Ястребова, Н.П. Ванеева, 1989], а также к коллагену (Serva, Германия) и эластину (INC Biomedical Inc, США). Сенсибилизирующая доза антигенов составляла 2,5-5 мкг/мл в карбонат-бикарбонатном буфере (рН=9,6). Сыворотки иммунизированных мышей анализировали в разведении 1:100. Отрицательным контролем служил пул сывороток от неиммунизированных мышей. Оптическую плотность измеряли на планшетном спектрофотометре «Эфос» (Россия) при длине волны 492 нм. Исследование проводилось в лаборатории иммунодиагностики НИИ им. И.И. Мечникова (зав. лаб. Н.Е. Ястребова).

Методы статистической обработки результатов

Статистическую обработку результатов проводили с помощью параметрической и непараметрической базовой статистики с использованием критерия Стьюдента, применяя стандартный пакет статистических программ Windows 2003 (StatSoft 6.0), Exel и WinMdi. Данные представлены как М±ш. Различия рассматривались как значимые при р<0,05. Выживаемость мышей в течение заданного срока рассчитывали по методу Гланца [С.А. Гланц, 1999]. Согласно современной теории статистики «к анализу выживаемости неприменимы обычные способы оценки различий, такие, как сравнение долей и средних величин». В основе анализа выживаемости лежит учет выбывания животных при сравнении опытной и контрольной групп [С.А. Гланц, 1999, табл. 11.6]. Выживаемость рассчитывали по формуле: z=Ul/Sul, где z - критерий значимости, определяемый по таблице [С.А. Гланц, 1999, табл. 4.1], Ul - это сумма разности наблюдаемого и ожидаемого числа умерших, a Sul _ стандартная ошибка.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Роль рБТШ+ЛПС в формировании защиты от бактерий и вирусов

Исходя из концепции, что врожденный иммунитет является первой линией защиты от патогенов, поскольку он обеспечивает быстрое распознавание микроорганизмов, их элиминацию и формирование адаптивного иммунитета, мы предположили, что активация нескольких TLRs может усилить реакцию врожденного иммунитета против микроорганизмов разных таксономических групп.

Одним из возможных модификаторов функций TLRs и активаторов врожденного иммунитета является рБТШ+ЛПС.

Изучение иммунотропных свойств рБТШ+ЛПС на первом этапе работы начали с экспериментов по заражению мышей летальными дозами S. typhimurium, S. neumoniae и вируса гриппа птиц H5N2, адаптированного к мышам. Белым беспородным мышам вводили однократно разные дозы рБТШ+ЛПС и через 24 часа

заражали летальными дозами S. typhimurium, S. pneumoniae и вируса гриппа птиц H5N2.

Было выявлено, что однократная иммунизация рБТШ+ЛПС обеспечивала формирование быстрой (через 48-72 ч) защиты при дозах 100 мкг/мышь в отношении S. typhimurium и 5. pneumoniae и 100 мкг/мышь или 400 мкг/мышь от вируса гриппа птиц H5N2. Защита сохранялась до 7 дня наблюдения (40-80% выживших мышей в опыте) при гибели 90-100% животных в контроле на 4-6 сутки (табл. 1, 2 и 3). В табл. 1 показано, что рБТШ+ЛПС создавал защиту, сопоставимую с защитой, которая развивалась после введения поликомпонентной вакцины Иммуновак, несущей лиганды для TLRs 1,2,4, 5, 6 и 9.

Таблица 1

Выживаемость мышей, иммунизированных внутрибрюшинно однократно

№№ групп животных Введено Доза, мкг/мышь Выживаемость в течение 7 суток Критерий значимости Z

1 рБТШ+ЛПС 1 1/10 1,4

2 10 2/10 1,4

3 100 4/10 2,2" '

4 Иммуновак" 200 5/10 2,7

5 Контроль (интактные мыши) - 0/10 -

Примечание:

* - через 24 часа после инокуляции рБТШ+ЛПС, заражающая доза составила 106 микробных клеток

" - поликомпонентная вакцина, несущая лиганды для ТЬЯз 1,2,4, 5,6 и 9.

- в числителе число выживших мышей на 7 день; в знаменателе - число зараженных животных

"** - достоверность разницы между опытом и контролем (р<0,05) при сравнении кривых выживаемости по Гланцу С.А.

Таблица 2

Выживаемость мышей при заражении 16 LD5q S. pneumoniae после виутрибрюшинного однократного введения рБТШ+ЛПС _

№№ групп животных ~ Введено Доза, мкг/мышь Выживаемость в течение 7 суток Критерий значимости Z

1 рБТШ+ЛПС 10 2/10 0,6

2 100 4/10 2,2

3 200 2/10 1,9

4 400 3/10 1,35

5 Иммуновак 200 3/10 1,4

6 Контроль (интактные мыши) - 1/10 -

Примечание:

* - через 24 часа после инокуляции рБТШ+ЛПС, заражающая доза составила 104 микробных клеток

- в числителе число выживших мышей на 7 день; в знаменателе - число зараженных животных

"* - достоверность разницы между опытом и контролем (р<0,05) при сравнении кривых выживаемости по Гланцу С.А.

Таблица 3

Выживаемость мышей при заражении* 101Л)5о вирусом гриппа птиц Н5К2 после виутрибрюшинного однократного введения рБТШ+ЛПС

№№ Введено Доза, Выживаемость Критерий

групп мкг/мышь в течение 6 значимости

животных суток Z

1 рБТШ+ЛПС 100 7/10 3,2"'

2 • 400 8/10 3,0*"

3 Контроль 0/10

(интактные мыши)

Примечание:

* - через 24 часа после инокуляции рБТШ+ЛПС

- в числителе число выживших мышей на 6 день; в знаменателе - число зараженных животных

- достоверность разницы между опытом и контролем (р<0,001) при сравнении кривых выживаемости по Гланцу С.А.

В дальнейших экспериментах изучали способность рБТЩ+ЛПС защищать животных от £ ¡урЫтигшт (1251Л35о) при трехкратной или однократной иммунизации {табл. 4). Выявлено, что наиболее эффективной дозой препарата при трехкратном введении оказалась 10 мкг/мышь. Она защищала 50% животных на протяжении всего опыта - 21 день наблюдения (р<0,05). При однократной инокуляции препарата эффективная доза составила 100 мкг/мышь. Она защищала 70% мышей на 5 день эксперимента при 90% гибели животных в контроле (р<0,05). Выявлено, что трехкратное введение рБТШ+ЛПС более эффективно, чем однократное, обеспечивая длительную защиту при использовании меньшей дозы.

Таблица 4

Выживаемость мышей при заражении 125 ЬО50 {урШтигшт после

внутрибрюшинного трехкратного или однократного введения рБТШ+ЛПС

№№ -групп живот ных Введено Доза, мкг/мышь Схема аппликации Выживаемость в течение Крите рий значи мости г на 5 сутки

5 суток 21 суток

1 рБТШ+ЛПС 10 3 раза ежедневно 5/10 5/10 3,26"

2 100 3 раза ежедневно 4/10 2/10 2,2***

3 10 однократно 2/10 1/10 1,9

4 100 однократно 7/10 0/10 2,9***

5 Контроль (интактные мыши) - - 1/10 0/10 -

Примечание:

- через 24 часа после последней инокуляции рБТШ+ЛПС - в числителе число выживших мышей на 5 и 21 сутки; в знаменателе -число зараженных животных

- достоверность разницы между опытом и контролем (р<0,05) при сравнении кривых выживаемости по Гланцу С. А.

На следующем этапе работы оценивали, как влияет примесь ЛПС в препарате на защиту мышей, инфицированных 5. 1урИтигшт. Для решения данной задачи мы остановились на двух схемах введения рБТШ+ЛПС, а именно: 10 мкг/мышь трехкратно ежедневно и 100 мкг/мышь однократно. Чтобы определить или исключить роль примеси ЛПС в препарате, белок денатурировали методом

14

кипячения или связывали ЛПС с помощью добавления к рБТШ+ЛПС полимиксина В. Инактивацию ЛПС определяли в ЛАЛ-тесте. Нами установлено, что 1 мг/мл рБТШ+ЛПС содержал 5320 ЕЭ/мл (эндотоксин связывающих единиц), а после добавления РМВ в дозах 0,266 мкг и 2,66 мкг - 273 и 34 ЕЭ/мл соответственно. В качестве референс-контроля использовали коммерческие препараты РМВ (Fluka BioChemika, Denmark) и ЛПС Е. coli (SIGMA®, Germany).

Мышам вводили: (1) рБТШ+ЛПС; (2) рБТШ+ЛПС, в котором белок денатурировали кипячением [рБТШ+ЛПС(К)]; (3) рБТШ+ЛПС, в котором действие ЛПС исключили РМВ [рБТШ+ЛПС(РМВ)]; коммерческими препаратами (4) РМВ и (5) ЛПС Е. coli, и заражали через 24 часа 63 LD50 S. typhimurium (табл. 5).

Таблица 5

Протектнвная активность рБТШ+ЛПС после денатурации белка или связывания ЛПС

№№ групп живот ных Введено Доза, мкг/мышь Схема аппликации Выжива емость в течение 21 дня Критерий значимости Z

1 рБТШ+ЛПС 10 3 раза ежедневно 8/10 Ä л ~ ***** 2,38

2 100 однократно 4/10 2,43

3 рБТШ+ЛПС 10 3 раза ежедневно 3/10 1,64

4 (К)" 100 однократно 2/10 1,53

5 рБТШ+ЛПС 10 3 раза ежедневно 4/10 2,27 \

6 (РМВ)"' 100 однократно 1/10 1,56

7 ЛПС£. coli 0,0266 однократно 2/10 1,75

8 РМВ**" 2,66 однократно 1/10 2,0

9 Контроль (интактные мыши) - 1/10 -

Примечание:

- Заражающая доза £ ¡урЫтипит 63 ЬО50, вводили через 24 часа после последней инокуляции рБТШ+ЛПС

- рБТШ+ЛПС(К), подвергнутая кипячению

- рБТШ+ЛПС(РМВ), в которой ЛПС связан полимиксином В "* - полимиксин В

- достоверность разницы между опытом и контролем (р<0,05) при сравнении кривых выживаемости по Гланцу С.А.

Показано, что рБТШ+ЛПС обеспечивал защиту животных при однократной и трехкратной аппликации. Эффективные дозы соответствовали 100 мкг/мышь и 10 мкг/мышь (р<0,05). Однако степень защиты оказалась в два раза выше при трехкратном введении, чем при однократном введении (80% выживших мышей против 40% на 21 день наблюдения). Рекомбинантный БТШ+ЛПС, подвергнутый кипячению, не обеспечивал значимой защиты опытных животных, также как и коммерческие препараты: РМВ и ЛПС Е. coli. Рекомбинантный БТШ+ЛПС, в котором ЛПС был связан РМВ, обладал меньшей протективной активностью, чем рБТШ+ЛПС не обработанный РМВ. Он защищал только 40% мышей при трехкратной инокуляции (р<0,05), в то время как при однократной инокуляции защита не индуцировалась.

Таким образом, выявлено, что наиболее эффективно защищал мышей от инфекции рБТШ+ЛПС по сравнению с БТШ, в котором действие ЛПС инактивировали РМВ. По-видимому, формирование большей степени защиты под влиянием рБТШ+ЛПС можно связать с тем, что оба компонента являются лигандами для TLR2 и TLR4, а сигналы, возникающие при действии двух модификаторов, суммируются.

Влияние рБТШ+ЛПС на рост экспериментальных опухолей

На следующем этапе работы изучали противоопухолевую активность рБТШ+ЛПС. На мышах проведены эксперименты с 2 типами опухолей - меланома В16 и карцинома яичника. Препарат рБТШ+ЛПС при 5-кратной схеме иммунизации вызывал значимое торможение роста опухоли (ТРО>50%) меланомы В16 в дозах 20 мкг/мышь и 100 мкг/мышь (табл. 6). На 14 день наблюдения ТРО составило 56% (20 мкг/мышь) и 59% (100 мкг/мышь), а на 21 день - 30% (20 мкг/мышь) и 65,5% (100 мкг/мышь). На модели карциномы яичника не выявлено противоопухолевой активности препарата.

Таблица 6

Влияние рБТШ+ЛПС на рост меланомы В16

№№ групп мышей с перевитой меланомой В16* Введено Схема аппликации Объем опухоли (усл.ед."1)

Срок наблюдения после перевивания опухоли, дни

0 11 14 18 21

1 рБТШ+ЛПС 100 мкг/мышь через 1 ч, 24 ч, 48 ч, 9 и 16 дней после имплантации опухоли И.о." 752 ±386 907*** ±468 2952 ±212 3327'" ±587

2 рБТШ+ЛПС 20 мкг/мышь И.о. 434 ±155 968*** ±243 2494 ±800 6765 ±628

3 Контроль (меланомаВ16) - Н.о. 649 ±92 2205 ±299 4803 ±1029 9644 ±1897

Примечание:

- опухоль перевивали подкожно в объеме 1 млн. опухолевых клеток

- не определяли

- статистически достоверное торможение роста опухоли (ТРО>50%)

Действие рБТШ+ЛПС на эффекторные клетки врожденного иммунитета

Определив антиинфекционную и противоопухолевую активность препарата, едставляло интерес выявить механизм действия рБТШ+ЛПС на эффекторные нкции врожденного иммунитета (созревание ДК, экспрессия цитокинов, тотоксическая активность МНЛ).

Однократная и трехкратная аппликации рБТШ+ЛПС приводили к активации ожденного иммунитета (рис. 1). Исследование иммунофенотипа ДК выявило щественное увеличение экспрессии молекул СБ80, С086, СБ83 и уменьшение спрессии маркера макрофагов Р4/80, что свидетельствовало о созревании ДК под иянием рБТШ+ЛПС.

Учитывая данные литературы об активации ТЬЯб с помощью БТШ, обходимо было оценить, взаимодействует ли данный рБТШ+ЛПС с ТЬЯб. Для ределения специфического связывания человеческих ТЬИб с исследуемым епаратом в работе использовали линии клеток эмбриональной почки человека 3, стабильно экспрессирующие ЬТЫ14/МВ2-СО14 и ЬТ1Л12/СВ14. Контролем ужили клетки 293-пи11, не экспрессирующие ТЪЯб (рис. 2).

г>С|»шР1С1»согз

вт: 45.84 СУ: 8.15

[400-1023)301 (24.1 %)

Ки ЮР 10 »0086

(Зт: 46.40 СУ: 5.67

[400-1023] 303 (24.1 %)

И !11 'Ж

10" 10' 10г 10' 10' 10" 10' 102 10' 10' 10" 10' 10г 10' 10' 10° 10' 10! 10' к

тс птс ре тс

ОС» + НЙР 10 + СЮ80

СУ: 16.79 [411-10231570 (45.6%)

10' 10' 10г 10' РЕ

Ил «ЮР 10 «НЛО

От: 96 49 СУ: 16.01

[400-1023] 640 (71.9%)

10° 10' 10! 10' 10' ПТС

КлкиЧгоЮЖЗ

бт 55.45 СУ: 12.49

(400-1023) 125 (7.1 %)

10е 10' 10* 10* 10'

НС/ коп1гс1 С1)8б

бт: 42.68 СУ: 3.80

[400-1023] 21 (13 %)

Г_т, _ | Г-5!!ч | |-^

10° 101 10!¡О110* птс

ОС! Ьп|го1 С080

От: 68.04 СУ: 13.61

[411-1023)414 (23.6%)

10° 10' 10а 10' 10'

DC.kintK.ir4/80

От: 162.29 СУ: 14 03

[<00-1023)1523 (92.4%)

10° 10' 101 10а 10' ПТС

Рис.1 Экспрессия поверхностных молекул зрелых ДК, полученных нз костного мозга мышей линии СВА с использованием рБТШ+ЛПС

Примечание: Дотплот - светорассеяние (популяция зрелых ДК в очерченной области), на гистограммах - флюоресценция клеток после окрашивания соответствующими антителами (РЬ-1Н — ИТС, РЬ-2Н — РЕ). По оси ординат - количество клеток, по оси абсцисс — интенсивность флюоресценции.

Препарат рБТШ+ЛПС в широком диапазоне доз (от 0,1 до 10 мкг/мл) взаимодействовал с ТЬЯ2 и ТЫ14, экспрессированными на клеточных линиях 293 эмбриональной почки человека, о чём судили по изменению окраски среды, отражающей активацию внутриклеточного ядерного фактора ОТ-кВ. После добавления рБТШ+ЛПС к клеткам линии 293-пи11 активации №-кВ не происходило.

3,5-г 3-

оптическая 2,5-плотность, 2-активация NF-KB

TLR4

TLR2

TLR-null

Ш рБТШ+ЛПС 10

мкг/мл □ рБТШ+ЛПС 1

мкг/мл 0 рБТШ+ЛПС 0,1 мкг/мл

Рис. 2 Результаты взаимодействия рБТШ+ЛПС с TLR2 и TLR4

Полученные результаты позволили предположить, что препарат рБТШ+ЛПС активировал одновременно TLR2 и TLR4, что проявлялось в усилении эффекторных функций врожденного иммунитета.

Введение рБТШ+ЛПС в ранние сроки усиливало синтез ряда цитокинов: IL-6, IFN-y, TNF-a. На фоне бактериальной инфекции, вызванной S. typhimurium, повышался уровень IL-6, IL-12p70, IFN-y, TNF-a. При аппликации мышам БТШ+ЛПС и последующим заражением S. typhimurium формировался менее •ыраженный пик провоспалительных (IL-6, TNF-a) и более выраженный пик егуляторных (IFN-y) цитокинов по сравнению с профилем цитокинов животных, араженных только S. typhimurium.

Рекомбинантный БТШ+ЛПС усиливал цитотоксическую активность МНЛ в тношении опухолевой линии клеток эритробластного лейкоза К-562 (табл. 7), а акже повышал на мембране МНЛ экспрессию молекул CD25, CD56, но не влиял на олекулы CD4, CD 16 (рис. 3). Это свидетельствовало о повышении

функциональной активности лимфоцитов в популяции лимфоцитов (СБ25) и о появлении натуральных киллеров (С056) - эффекторных клеток врожденного иммунитета.

Таблица 7

Влияние рБТШ+ЛПС на цитотоксическую активность (%) мононуклеарных лейкоцитов периферической крови в отношении перевиваемых клеток эритробластного лейкоза человека К-562

№№ групп животных Введено Доза, мкг/мл Соотношение клетки-мишени/эффекторы в %

1:1 1:2 1:5

1 рБТШ+ЛПС 0,1 66±4,3" 84±4,Г 97±4,2"

2 1,0 43±2,4 53±5,8 73±6,1

3 10 39±1,7 50±2,9 69±5,1

4 ЛАК' — 71±3,2" 89±2,8" 99±4,0"

5 Контроль (МНЛ) — 46±4,3 71 ±4,2 80±5,1

Примечание:

- Лимфокин-активированные киллеры (положительный контроль) - разница между опытной и контрольной группами статистически достоверна (р<0,05)

Исследование аутоантител у мышей, иммунизированных рБТШ+ЛПС

В литературе широко обсуждается вопрос появления аутоантител при введении экзогенного БТШ [А. Мепоге: е1 а1., 2000; Б.М. Тоёгук ег а1., 2003]. В связи с этим были проведены эксперименты по выявлению наличия аутоантител к органонеспецифическим антигенам (ДНК, коллаген, эластин) у мышей, иммунизированных рБТШ+ЛПС {табл. 8). Аппликация животных рБТШ+ЛПС и последующее заражение 5. ¡урЫтигшт не индуцировали выработку аутоантител к ДНК, коллагену и эластину.

МНККоп1то1

бт: 1.00 СУ: 0.00

[165-102310 СОЯ %)

10° 10* То1 10' 10'

НИН

МНК* Н5Р 0,1 СГ116

От: 10.2в СУ: 21.11

(165-1023160 (2.7 %) М1

10° 10' 10* 10' 10'

МЫК Ко»|го1

От: 1.00 СУ: 0.00

1245-1023)0 (0.0 %)

М1

10° 10' 10* 10' 10'

ьшк + н$р 0,1 пЛе/па СЬ4 От: 7.89 СУ: 20.40

.(165-1023)60 (3 .5 %)

и

10" 10' 101 10' 10' РЫН

МШС+1КР 0,1 падт1 СБ23 От 36.94 СУ: 12.76

|245-1023| 1152 (50.7%)

~10° 10* 103103 10' П-2Н

МЛК+ НЭР 0,1 тЬб/т1

соз<

От 21.34 СУ. 26.45

(245-1023(168 (7.5 %) М1

10° 10' 101 10' 10' а-2н

Рис.3 Влияние рБТШ+ЛПС (0,1 мкг/мл) на экспрессию поверхностных молекул МЛПК человека

Примечание: Дотплот - светорассеяние (популяция зрелых ДК в очерченной области), на гистограммах - флюоресценция клеток после окрашивания соответствующими антителами (РЬ-1Н - Р1ТС, РЬ-2Н - РЕ). По оси ординат - количество клеток, по оси абсцисс - интенсивность флюоресценции.

Таблица 8

Результаты определения антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных рБТШ+ЛПС и зараженных через 24 ч 5". ¡урктипит*

Введено

Доза рБТШ+ЛПС мкг/мышь

Кратность введения

Разница оптической плотности меж,-исследуемой сывороткой и контрольно __ОП49; нм__

Н-ДНК

Д-ДНК

Коллаген Эла

рБТШ+ ЛПС+S.

typhimuri

10

3-кратно

-0,178

-0,143

-0,05

100

однократно

-0,001

- 0,028

0,065

-о,

S.

typhimuri

um

0,041

- 0,043

- 0,004

0,0

Примечание:

- в качестве контроля исследовали пул сывороток интактных мышей - заражающая доза 5. ¡урЫтипит составила 63 ЬО50 "* - нативная ДНК

- денатурированная ДНК

Таким образом, проведенное исследование выявило перспективное направление - применение рБТШ+ЛПС в качестве активатора функций Т1Лб с целью создания неспецифической защиты против патогенов разных таксономических групп. Рекомбинантный БТШ+ЛПС целесообразно исследовать не только как средство для профилактики инфекционных заболеваний, но и как элемент комплексной терапии онкологических болезней.

ВЫВОДЫ

1. В опытах in vivo и in vitro изучена функция рекомбинантного белка теплового шока-70 Mycobacterium tuberculosis (рБТШ+ЛПС) как модификатора функций TLRs и показано, что он обладает антиинфекционной и противоопухолевой активностью.

2. Показано, что рБТШ+ЛПС при однократном введении создает быструю (через 48-72 ч), но непродолжительную защиту против широкого круга микроорганизмов: бактерий разных семейств (S. typhimurium, S. pneumoniae) и вируса гриппа птиц, адаптированного к мышам (H5N2). При трехкратном введении 10 мкг/мышь

22

рБТШ+ЛПС формируется длительная (в течение 21 дня наблюдения) защита от заражения S. typhimurium.

3. Выявлена способность рБТШ+ЛПС тормозить рост некоторых экспериментальных опухолей при многократном введении. Этот эффект зарегистрирован при работе с меланомой В16 и не обнаружен в отношении карциномы яичника.

4. Доказано, что примесь липополисахарида в рекомбинантном белке теплового шока-70 усиливает антиинфекционное действие БТШ.

5. Продемонстрировано взаимодействие рБТШ+ЛПС с человеческими TLR2 и TLR4, экспрессированными на перевиваемых клеточных линиях.

6. Установлено, что рБТШ+ЛПС индуцирует синтез IL-6 и IFN-y у интактных мышей. У зараженных S. typhimurium мышей после введения препарата снижается уровень сывороточных цитокинов IL-6 и TNF-a, но повышается уровень IFN-y.

7. Выявлено, что в системе in vitro рБТШ+ЛПС стимулирует созревание дендритных клеток мышей, о чём свидетельствует повышение уровня костимуляторных молекул CD80, CD86; маркера терминальной дифференцировки дендритных клеток CD83; и усиливает цитотоксическую активность мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека в отношении опухолевой линии клеток К-562 эритробластного лейкоза.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Воробьев Д.С., Семенова И.Б., Лученко И.М., Доненко Ф.В., Свешников П.Г. Изучение противоопухолевой и антибактериальной активности белка теплового шока. // Российский Биотерапевтический Журнал. - 2007. - Т.6. - №1. - С.91.

2. Воробьев Д.С. Рекомбинантный белок теплового шока (RHSP70) создает защиту против Salmortella typhimurium и вируса гриппа (H5N2) в эксперименте на мышах. // Аллергология и иммунология. - 2007. - Т.8. — №1. — С.71-72.

3. Воробьев Д.С., Семенова И.Б. Однократное и многократное применение рекомбинантного белка теплового шока (rHSP70) защищает мышей против бактериальной и вирусной инфекции. // Российский аллергологический журнал. -2007. - №3, приложение 1. - С.280.

4. Семенова И.Б., Воробьев Д.С., Свешников П.Г., Курбатова Е.А. Комплекс рекомбинантного белка теплового шока с ЛПС индуцирует быструю защиту

мышей против Salmonella typhimurium и авирулентного для человека вируса гриппа птиц H5N2. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2007. - №6. - С.54-57.

5. Воробьев Д.С., Семенова И.Б., Ахматова Н.К., Свешников П.Г. Рекомбинантный белок теплового шока-70 (БТШ70) кратковременно подавляет синтез ИЛ-10 (1-8ч) и не влияет на продукцию провоспалительных цитокинов у мышей, зараженных Salmonella typhimurium. II Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т.2( 11).- №2-3. - С. 131.

6. Воробьев Д.С. Белок теплового шока как биологическая платформа для разработки вакцины от бактериальной, вирусной инфекции и опухолей с помощью активации врожденного иммунитета. // Перспективы развития инноваций в биологии: Материалы II Научно-практической конференции в рамках Третьего Фестиваля науки в городе Москве и Биотехнологической выставки-ярмарки «Рос-Био-Тех-2008» (5-7 ноября 2008 года, г. Москва)/МГУ имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет. - М.: Инноватика, 2008. - С.25-27.

7. Воробьев Д.С., Семенова И.Б. Рекомбинантная конструкция БТШ70-ЛПС индуцирует защиту мышей от Salmonella typhimurium. Оценка протективной роли белка теплового шока-70 и липополисахарида. // Медицинская иммунология. -2009. -Т.П.- №4-5. -С.306.

8. Воробьев Д.С., Семенова И.Б., Курбатова Е.А. и др. Оценка протективного действия рекомбинантной конструкции белка теплового шока с липополисахаридом против инфекции Salmonella typhimurium у мышей. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009. - №3. - С.38-41.

9. Воробьев Д.С., Киселевский М.В., Чикилева И.О., Семенова И.Б. Влияние рекомбинантного белка теплового шока-70 микобактериального происхождения на цитотоксическую активность и иммунофенотип мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - Т. 148. - №7. - С.76-79.

Подписано в печать 24.09.09 Формат 60x84/16. Бумага офсетная. _Заказ № 703 Тираж 100 экз._

Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Актуальность темы. В 1996-98 гг. были описаны Толл-подобные рецепторы (Toll-like receptors - TLRs) врожденного иммунитета [103, 124]. После этого началась интенсивная работа по созданию нового класса иммунобиологических препаратов - модификаторов (активаторов — агонистов; ингибиторов — антагонистов) функций TLRs и их сигнальных путей [64, 91]. Полагают, что такие модификаторы станут эффективным средством иммунопрофилактики и иммунотерапии не только инфекционных болезней, но и аллергических, аутоиммунных, онкологических заболеваний [152]. Модификаторы TLRs рассматривают как возможное средство защиты от пандемий и последствий биотеррористических актов.

В качестве модификаторов исследуют природные лиганды (патоген-ассоциированные молекулярные структуры (ПАМС) микроорганизмов) и их синтетические аналоги [91, 152].

Обширная литература посвящена исследованию роли представителей большой группы многофункциональных белков теплового шока (БТШ), которые взаимодействуют с TLRs. В эту группу входят различающиеся по молекулярной массе и структуре члены семейств: БТШ90, БТШ70, низкомолекулярные БТШ (15-35 kDa) и высокомолекулярные БТШ (М>110 kDa), [9]. Иммунологическая активность выявлена у БТШ70, gp96 (семейство БТШ90), БТШ110 и БТШ 170 [12].

Показано, что БТШ70 и gp96 являются элементами иммунологических событий и патогенеза инфекций, аутоиммунных и онкологических процессов [47, 167, 172].

Молекулы БТШ70 и gp96 служат лигандами для рецепторов антигенпредставляющих клеток (АПК) и других клеток врожденного иммунитета. Они активируют макрофаги и дендритные клетки (ДК), запускают экспрессию антигенпредставляющих и костимуляторных молекул [20, 21, 153, 154, 164, 173]; являются индукторами второго сигнала, который является необходимым компонентом формирования адаптивного иммунного ответа [36].

Белки теплового шока используют при конструировании разных вакцин (ДНК, пептидные), применяя их в качестве иммуногенного антигена или адъюванта [12].

Мы исследовали антиинфекционную и противоопухолевую активность рекомбинантного белка теплового шока-70 Mycobacterium tuberculosis1. Препарат содержал примесь липополисахарида (ЛПС) Escherichia coli, поэтому БТШ описывали аббревиатурой рБТШ+ЛПС.

Изучена способность рБТШ+ЛПС создавать быструю (через 48-72 ч) защиту против патогенов разных таксономических групп: представителей разных семейств бактерий (Salmonella typhimurium 415 /, Streptococcus pneumoniae m.S N.3) и адаптированного к мышам вируса гриппа птиц (H5N2).

Определили роль примеси ЛПС при формировании антибактериальной защиты у мышей, иммунизированных рБТШ+ЛПС.

В специальной серии опытов установили, что рБТШ+ЛПС обладает противоопухолевым действием в отношении меланомы В16.

Цель работы. Исследовать способность рБТШ+ЛПС создавать у животных защиту против патогенов разных таксономических групп и оказывать влияние на развитие экспериментальных опухолей.

Задачи исследования.

1. Оценить резистентность мышей к S. typhimurium, S. pneumoniae и вирусу гриппа птиц (H5N2) при различных схемах введения рБТШ+ЛПС.

1 Препарат был любезно предоставлен сотрудниками НИИ молекулярной диагностики и лечения проф. В.И. Киселевым и проф. П.Г. Свешниковым

2. Исследовать противоопухолевую (против меланомы В16 и карциномы яичников) активность рБТШ+ЛПС в экспериментах на мышах.

3. Установить роль ЛПС, входящего в состав рекомбинантного БТШ, при формировании у животных невосприимчивости к инфекциям.

4. Изучить действие рБТШ+ЛПС на функциональную активность ДК, функциональные свойства и фенотип мононуклеарных клеток, а также продукцию цитокинов.

5. Экспериментально определить возможность образования аутоантител к органонеспецифическим антигенам у мышей при введении рБТШ+ЛПС.

Научная новизна. Впервые показано, что рБТШ+ЛПС М. tuberculosis при однократном введении создает у мышей быструю (через 48-72 ч) защиту против микроорганизмов разных таксономических групп - бактерий разных семейств (S. typhimurium, S. pneumoniae) и вируса гриппа птиц (H5N2). При трехкратном введении рБТШ+ЛПС в дозе 10 мкг/мышь формируется защита в течение всего срока наблюдения (21 день) от S. typhimurium.

Впервые выявлено, что наряду с антиинфекционной активностью рБТШ+ЛПС обладает способностью тормозить рост экспериментальных опухолей при пятикратной аппликации (меланома В16).

Впервые установлено, что примесь ЛПС в составе рекомбинантного белка теплового шока-70 усиливает антиинфекционную активность БТШ70.

Изучено взаимодействие рБТШ+ЛПС с TLR2 и TLR4 человека, экспрессированными на перевиваемых клеточных линиях. При этом показана активация внутриклеточного ядерного фактора NF-кВ, который контролирует синтез цитокинов.

Установлено, что в ответ на введение рБТШ+ЛПС у интактных мышей повышался уровень IL-6 и IFN-y в сыворотке, а у иммунизированных и зараженных S. typhimurium животных уменьшался уровень IL-6 и TNF-a, но увеличивался синтез IFN-y.

Выявлено, что в системе in vitro рБТШ+ЛПС стимулировал созревание ДК мышей и усиливал цитотоксическую активность мононуклеарных лейкоцитов (МНЛ) периферической крови человека в отношении клеток эритробластного лейкоза К-562. Под влиянием рБТШ+ЛПС возрастала экспрессия молекул CD25 и CD56 на мембране МНЛ.

Впервые в эксперименте на мышах показано, что введение рБТШ+ЛПС не сопровождалось выработкой аутоантител к органонеспецифическим антигенам (ДНК, коллаген, эластин).

Практическая значимость. Результаты проведенных исследований открывают перспективу использования рекомбинантного БТШ+ЛПС в качестве модификатора функций TLRs, с помощью которого можно создавать защиту против широкого круга патогенов.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

выводы

1. В опытах in vivo и in vitro изучена функция рекомбинантного белка теплового шока-70 Mycobacterium tuberculosis (рБТШ+ЛПС) как модификатора функций TLRs и показано, что он обладает антиинфекционной и противоопухолевой активностью.

2. Показано, что рБТШ+ЛПС при однократном введении создает быструю (через 48-72 ч), но непродолжительную защиту против широкого круга микроорганизмов: бактерий разных семейств (S. typhimurium, S. pneumoniae) и вируса гриппа птиц, адаптированного к мышам (H5N2). При трехкратном введении 10 мкг/мышь рБТШ+ЛПС формируется длительная (в течение 21 дня наблюдения) защита от заражения S. typhimurium.

3. Выявлена способность рБТШ+ЛПС тормозить рост некоторых экспериментальных опухолей при многократном введении. Этот эффект зарегистрирован при работе с меланомой В16 и не обнаружен в отношении карциномы яичников.

4. Доказано, что примесь липополисахарида в рекомбинантном белке теплового шока-70 усиливает антиинфекционное действие БТШ.

5. Продемонстрировано взаимодействие рБТШ+ЛПС с человеческими TLR2 и TLR4, экспрессированными на перевиваемых клеточных линиях.

6. Установлено, что рБТШ+ЛПС индуцирует синтез IL-6 и IFN-y у интактных мышей. У зараженных S. typhimurium мышей после введения препарата снижается уровень сывороточных цитокинов IL-6 и TNF-a, но повышается уровень IFN-y.

7. Выявлено, что в системе in vitro рБТШ+ЛПС стимулирует созревание дендритных клеток мышей, о чём свидетельствует повышение уровня костимуляторных молекул CD80, CD86; маркера терминальной дифференцировки дендритных клеток CD83; и усиливает цитотоксическую активность мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека в отношении опухолевой линии клеток К-562 эритробластного лейкоза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Общепризнано, что врожденный иммунитет является первой линией защиты от патогенов, поскольку он обеспечивает быстрое распознавание патогенов, их элиминацию и формирование адаптивного иммунитета [153, 176]. Распознавание микроорганизмов осуществляют несколько образ распознающих рецепторов (pattern-recognition receptors - PRRs), экспрессированные на мембране и в цитоплазме клеток врожденного иммунитета (дендритные клетки, фагоцитирующие клетки, тучные клетки, эпителиальные клетки и др.) [21, 102]. Наиболее изученными являются TLRs. Согласно современным представлениям индивидуальные TLRs способны распознавать лиганды нескольких микроорганизмов [152]. Так, TLR2 распознают лиганды бактерий, ряда вирусов, некоторых простейших и грибов [10]. Аналогичное многообразие распознавания выявлено у TLR4, TLR5, TLR9. Вероятно, распознавание у патогена разных лиганд является одним из факторов усиления реакций врожденного иммунитета, т.к. сигналы активированных TLRs вступают во взаимодействие между собой.

В настоящее время активно разрабатывается направление по созданию нового класса иммунобиологических препаратов — модификаторов (агонистов и антагонистов) функций TLRs. Исследователи полагают, что такие модификаторы будут активно защищать от инфекционных, аллергических, аутоиммунных и онкологических заболеваний [152].

Активация этих рецепторов инициирует врожденный иммунный ответ через внутриклеточный ядерный фактор NF-kB, который индуцирует синтез про- и противовоспалительных цитокинов [102]. В свою очередь, цитокиновые молекулы направляют дифференцировку Т-клеток либо по Th-1 (IFN-y, IL-12p70), либо по Th-2 (IL-4, IL-5, IL-13) пути, что в итоге способствует формированию адаптивного иммунитета.

Рядом исследователей [119] установлено, что вакцина против желтой лихорадки YF-17D создает эффективную защиту у людей, активируя TLR2, 7, 8 и 9 рецепторы на ДК человека. Другой группой ученых было показано, что иммунизация синтетическим олигодезоксинуклеотидом, содержащим в своем составе CpG-мотивы ДНК, вызывала резистентность у мышей против инфекции, вызванной Listeria monocytogenes [76]. Механизм такой защиты авторы связывают с активацией TLR9/MyD88-3aBHCHMoro сигнального пути, приводящего к синтезу IL-12 и IFN-y.

Одним из возможных модификаторов функций TLRs и активаторов врожденного иммунитета является БТШ. Мы исследовали способность рекомбинантного белка теплового шока-70 М. tuberculosis создавать защиту против микроорганизмов разных таксономических групп с помощью активации врожденного иммунитета.

В процессе эволюции эукариот некоторые БТШ приобрели функции, позволившие им интегрироваться в систему иммунитета. Роль БТШ в развитии реакций врожденного и приобретенного иммунитета определяется способностью активировать эффекторные клетки врожденного иммунитета, а также перехватывать антигенные пептиды и через взаимодействие с АПК представлять эти пептиды Т-лимфоцитам в контексте молекул ГКГС [79].

В настоящее время получены и продолжают активно разрабатываться и совершенствоваться профилактические и терапевтические БТШ-вакцины, предназначенные для борьбы с инфекционными и опухолевыми заболеваниями [12]. Прогрессу в создании таких вакцин способствуют успехи фундаментальной науки в исследовании биологических основ функционирования БТШ.

Большинство исследователей идет по пути создания БТШ-вакцин, применяя БТШ как адъювант для эффективного представления связанного с ним антигена Т-лимфоцитам [143, 17, 48, 107, 118, 151]. Однако немногие ученые используют БТШ как мощный активатор системы врожденного иммунитета, учитывая тот факт, что данный белок представлен во всех без исключения клетках биологических организмов.

Нам представлялось целесообразным изучить иммунотропные свойства БТШ, как такового, вне связи его с определенным антигеном. Белок теплового шока-70, с которым проводили эксперименты, как и многие другие продукты генно-инженерного происхождения, был контаминирован ЛПС микроба-донора. Поэтому правомерно говорить о сочетании рекомбинантного БТШ с ЛПС (рБТШ+ЛПС).

Изучение иммунотропных свойств рБТШ+ЛПС начали с экспериментов по заражению мышей летальными дозами S. typhimurium, S. pneumoniae и авирулентного для человека вируса гриппа птиц H5N2. Белым беспородным мышам вводили внутрибрюшинно однократно рБТШ-ЛПС в широком диапазоне доз (от 1 до 400 мкг/мышь) и через 24 часа заражали летальными дозами S. typhimurium, S. pneumoniae и вирусом гриппа птиц H5N2.

Было выявлено, что формировалась быстрая (через 48-72 ч), но непродолжительная защита при иммунизации дозами 100 мкг/мышь (S. typhimurium, S. pneumoniae) и 100 или 400 мкг/мышь (вирус гриппа птиц H5N2). Защита сохранялась до 10 дня наблюдения (40-50% выживших мышей в опыте) при гибели 80-100% животных в контроле на 4-6 сутки.

Для дальнейших экспериментов был выбран штамм S. typhimurium 415 f., поскольку сальмонеллезная инфекция является модельной инфекцией для мышей. Мы изучили способность рБТШ+ЛПС создавать защиту у животных от S. typhimurium (I25LD50) после трехкратной и однократной внутрибрюшинной иммунизации в дозах 10 и 100 мкг/мышь соответственно. Выявлено, что эффективная доза препарата при трехкратном введении составила 10 мкг/мышь. Она защищала 50% животных на протяжении всего опыта - 21 день наблюдения (р<0,05). При однократной инокуляции препарата эффективной дозой оказалась 100 мкг/мышь. Она защищала 70% мышей на 5 день эксперимента при 90% гибели животных в контроле (р<0,05). Таким образом, установлено, что рБТШ+ЛПС создает не только быструю (через 48-72 ч), но и длительную (21 день) защиту от S. typhimurium.

На следующем этапе работы важно было оценить, как влияет примесь ЛПС в препарате на защитные эффекты, полученные in vivo. Для решения данной задачи мы остановились на двух схемах иммунизации рБТШ+ЛПС, а именно: 10 мкг/мышь трехкратно ежедневно и 100 мкг/мышь однократно. Чтобы определить или исключить роль примеси ЛПС в препарате, белок денатурировали методом кипячения [42] или связывали ЛПС с помощью добавления к рБТШ+ЛПС полимиксина В (РМВ) по методу Н. Tsuzuki. Инактивацию ЛПС определяли в ЛАЛ-тесте. Нами было установлено, что 1 мг/мл БТШ содержал 5320 ЕЭ/мл, а после добавления РМВ в дозах 0,266 мкг и 2,66 мкг — 273 и 34 ЕЭ/мл соответственно. В качестве референс-контроля использовали коммерческие препараты РМВ (Fluka BioChemika, Denmark) и ЛПС Е. coli (SIGMA®, Germany).

Мышей иммунизировали (1) рБТШ+ЛПС; (2) рБТШ+ЛПС, в котором белок теплового шока был денатурирован методом кипячения [рБТШ+ЛПС(К)]; (3) рБТШ+ЛПС, в котором ЛПС был связан РМВ [рБТШ+ЛПС(РМВ)]; коммерческими препаратами (4) РМВ и (5) ЛПС Е. coli и через 24 часа заражали 63 LD50 S. typhimurium.

Показано, что рБТШ+ЛПС защищал мышей при однократной и трехкратной аппликации в дозах 100 мкг/мышь и 10 мкг/мышь соответственно (р<0,05). Однако степень защиты оказалась в 2 раза выше при трехкратном введении, чем при однократном введении препарата (80% выживших животных против 40% на 21 день наблюдения). Рекомбинантный БТШ+ЛПС, подвергавшийся кипячению, не защищал опытных животных также, как и коммерческие препараты: полимиксин В и ЛПС Е. coli. Рекомбинантный БТШ+ЛПС, в котором ЛПС инактивировали с помощью РМВ, защищал мышей только при трехкратной инокуляции в дозе 10 мкг/мышь (40% выживших животных, р<0,05), в то время как при однократном введении защита не формировалась.

По-видимому, формирование более выраженной защиты при иммунизации животных рБТШ+ЛПС можно связать с тем, что и БТШ и ЛПС являются лигандами для TLRs. Взаимодействуя одновременно с разными TLRs, эти вещества усиливают активацию врожденного иммунитета.

На 21 день наблюдения у животных изучали сыворотку крови с целью определения титров антител к ЛПС S. typhimurium. Выявлено, что у всех выживших опытных мышей титр антител к ЛПС S. typhimurium был выше по сравнению с интактными животными (титр 1:200) и отмечался на уровне оставшейся живой контрольной мыши (титр 1:3200).

Появление в сыворотке высоких титров антител к ЛПС S. typhimurium свидетельствует о формировании адаптивного иммунного ответа на фоне активации врожденного иммунитета рБТШ+ЛПС.

Исследована способность рБТШ+ЛПС стимулировать эффекторные функции врожденного иммунитета. Для этого изучили, как влияет препарат на созревание ДК и цитотоксическую активность мононуьслеарных лейкоцитов (МНЛ) периферической крови человека in vitro.

Однократная и трехкратная аппликация рБТШ+ЛПС приводила к активации врожденного иммунитета. Это подтверждалось следующими фактами. Исследование иммунофенотипа ДК выявило существенное увеличение экспрессии молекул CD80, CD86, CD83 и уменьшение маркера макрофагов F4/80, что свидетельствовало о созревании ДК под влиянием рБТШ+ЛПС.

Учитывая данные литературы о том, что БТШ связывается с TLRs, необходимо было определить, взаимодействует ли использовавшийся в нашей работе рБТШ+ЛПС с TLRs. Для определения специфичного связывания человеческих TLRs с исследуемым препаратом в работе использовали линии клеток эмбриональной почки человека 293, стабильно экспрессирующие hTLR4/MD2-CD14 и hTLR2/CD14 [14]. В качестве контроля служили клетки 293-null, не экспрессирующие TLRs. Нами показано, что рБТШ+ЛПС в широком диапазоне доз (от 0,1 до 10 мкг/мл) взаимодействовал с TLR2 и TLR4, экспрессированными на клеточных линиях 293 эмбриональной почки человека. Доказательством такого взаимодействия являлось изменение окраски среды, свидетельствовавшей об активации внутриклеточного ядерного фактора NF-kB. В контроле после добавления рБТШ+ЛПС к клеткам линии 293-null активации NF-kB не происходило.

На основании полученных результатов мы предположили, что рБТШ+ЛПС может индуцировать одновременно TLR2 и TLR4, что приводит к усилению эффекторных функций врожденного иммунитета. Механизм такой индукции свидетельствует о способности рБТШ+ЛПС опосредованно активировать внутриклеточный ядерный фактор NF-kB через взаимодействие с TLR2 и TLR4.

Изучение цитокинового профиля у мышей, иммунизированных рБТШ+ЛПС, выявило в ранние сроки увеличение синтеза IL-6, IFN-y, TNF-a. На фоне бактериальной инфекции, вызванной S. typhimurium, было отмечено повышение уровня IL-6, IL-12p70, IFN-y, TNF-a, однако пик этих цитокинов смещался во времени по сравнению с животными, получавшими только препарат. В то же время у мышей, иммунизированных рБТШ+ЛПС и зараженных S. typhimurium, отмечался менее выраженный пик провоспалительных (IL-6, TNF-a) и более выраженный пик регуляторных (IFN-y) цитокинов по сравнению с животными, зараженными только S. typhimurium.

Повышение регуляторных цитокинов IL-12p70 и IFN-y в сыворотках иммунизированных и/или зараженных мышей с учетом отсутствия динамики IL-4 может свидетельствовать об активации механизмов, поляризующих иммунный ответ по Th-1 типу. Таким образом, мы полагаем, что с одной стороны рБТШ+ЛПС, вызывая повышение уровня провоспалительных и регуляторных цитокинов, балансирует иммунный ответ. С другой стороны, рБТШ+ЛПС на фоне бактериальной инфекции, вызванной S. typhimurium, снижает выброс IL-6 и TNF-a, предохраняя тем самым организм от «цитокиновой бури». Повышение регуляторного цитокина IFN-y на поздних сроках инфекции, вероятно, способствует защите организма хозяина посредством активации Т-клеточного звена иммунитета.

Токсического действия препарата на белых беспородных мышах выявлено не было.

В настоящее время рядом исследователей доказано, что БТШ, расположенные на поверхности опухолевых клеток, активируют эффекторные клетки врожденного иммунитета и в ряде случаев способствуют лизису опухолевых клеток, маркерами которых они являются [62, 63, 106, 121, 128].

Srivastava с соавт. показали, что БТШ, выделенные из опухолей, вызывают противоопухолевый иммунитет в эксперименте на животных. Белки теплового шока, выделенные из здоровых тканей, таким действием не обладают. Авторы предположили, что с БТШ опухолевого происхождения связаны низкомолекулярные опухолевые пептиды, которые индуцируют специфический противоопухолевый иммунитет [26, 107]. Все это привело к разработке аутологичных противоопухолевых вакцин на основе БТШ. Однако проведенные в последующем клинические испытания не выявили существенной регрессии опухоли при иммунизации пациентов с разными онкологическими заболеваниями подобными вакцинами [116, 92, 160].

Это определило в нашей работе поиск альтернативных путей противоопухолевой активности данного препарата. Рекомбинантный БТШ+ЛПС усиливал цитотоксическую активность MHJI в отношении опухолевой линии клеток эритробластного лейкоза К-562, а также повышал на мембране МНЛ экспрессию молекул CD25, CD56, но не влиял на молекулы CD4, CD 16. Это свидетельствовало об увеличении функционально активных лимфоцитов в популяции лимфоцитов (CD25) и появлении натуральных киллеров (CD56) - эффекторных клеток врожденного иммунитета.

На мышах были проведены эксперименты с 2 типами опухолей -меланомой В16 и карциномой яичников. Мы обнаружили, что при 5-кратной схеме иммунизации рБТШ+ЛПС в дозах 20 мкг/мышь или 100 мкг/мышь вызывал значимое торможение роста опухоли меланомы В16, в то время как на модели карциномы яичников противоопухолевой активности препарата выявлено не было.

Подобный эффект, по-видимому, можно объяснить тем, что рБТШ+ЛПС с одной стороны усиливает воспалительную реакцию за счет выброса провоспалительных цитокинов IL-6 и TNF-a, создавая защитный инфильтрационный вал вокруг опухоли, а с другой - активирует эффекторные клетки врожденного иммунитета, натуральные киллеры, которые осуществляют непосредственный лизис опухолевых клеток. Однако остается не ясным, почему в отношении одних опухолей данный механизм срабатывает, а в отношении других — противоопухолевого эффекта достичь не удается.

Ряд исследователей полагает, что БТШ могут вызывать аутоиммунные и аллергические заболевания. В некоторых работах показано, что введение экзогенного БТШ вызывает образование аутоантител к различным органам и тканям [167, 150, 44]. Другие авторы считают, что освободившийся из клеток БТШ приобретает свойства аутоантигена, «сигнала опасности», мобилизующего иммунную систему [104]. Однако БТШ находится в кровотоке и у здоровых людей [176]. Следовательно, необходимо было установить, образуются ли аутоантитела в ответ на иммунизацию рБТШ+ЛПС. Мы изучили сыворотки мышей, иммунизированных рБТШ+ЛПС (в которых определялся высокий титр антител к БТШ), на наличие IG-аутоантител к некоторым органонеспецифическим антигенам (ДНК, коллаген, эластин). В итоге, таких антител обнаружено не было.

Проведенное исследование выявило перспективное направление создания неспецифической защиты против патогенов разных таксономических групп с помощью рБТШ+ЛПС. Очевидно, можно использовать рекомбинантный БТШ+ЛПС для активации внутриклеточных механизмов с поляризацией иммунного ответа и последующей активацией адаптивного иммунитета. Неизвестно, насколько эффективным будет данный препарат в клинической практике. Однако уже сейчас ясно, что рБТШ+ЛПС, действуя через TLRs врожденного иммунитета, активирует и балансирует иммунный ответ за счет уникальных возможностей, заложенных внутри клетки.

Изучив эти сложные механизмы на молекулярно-клеточном уровне, можно будет создавать с целью защиты целенаправленный иммунный ответ не только к разнообразным бактериальным и вирусным патогенам, но и к опухолевым антигенам, которые в настоящее время не являются качественными маркерами новообразований.