Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Влияние антиген-активированных дендритных клеток на функциональные свойства мононуклеарных клеток периферической крови больных туберкулезом

На правах рукописи

00344500Ь

ШЕВЧЕНКО ЮЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ВЛИЯНИЕ АНТИГЕН-АКТИВИРОВАННЫХ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 4 ш0/7 2000

Новосибирск 2008

003445005

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор

Сергей Витальевич Сенников

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор

Александр Анатольевич Останин ГУ НИ Институт Клинической Иммунологии СО РАМН, г Новосибирск

доктор медицинских наук Анна Вениаминовна Шурлыгина

профессор ГУ НИ Институт клинической и

экспериментальной лимфологии СО РАМН, г Новосибирск

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет

Защита состоится «¿Г» С^Г

2008 г в _ часов на

заседании диссертационного совета Д 001 001 01 в ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу 630099, г Новосибирск, ул Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан «40 » 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук у ОТ Кудаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Туберкулез относится к числу социальных заболеваний характеризуется хроническим течением, многообразием клинических форм поражением различных органов [Урсов, 1997] В основе патогенеза туберкулеза леж| нарушение клеточного звена иммунного ответа, осуществляемое по нескольки механизмам длительная персистенция M tuberculosis внутри антиген-презентирукмщ клеток, нарушение презентации антигена, секреция иммуносупрессорных цитокинов появление иммуносупрессорных Т-клеток, избыточный апоптоз Т-клеток и подавлеш апоптоза инфицированных макрофагов [Маянский, 2001, Fernando, 2006]

В настоящее время развитие новых эффективных подходов к лечени инфекционных заболеваний связано с использованием собственных механизмов защит организма и их возможной модуляции [Гантиевская, 2001] Протективный иммунни ответ на M tuberculosis связан с индукцией эффекгорных функций Т хелперов 1 типа, ч1 в свою очередь зависит от представления им антигена и дифференцировки «наивных» г клеток, что осуществляется дендритными клетками (ДК) как основными антиги презентирующими клеточными элементами [Demangel, 2000,0ttenhoff, 2005]

В патогенезе туберкулеза ДК являются клетками-мишенями для M tubérculos [Lichtner, 2006] Инфицированные M tuberculosis ДК могут способствовав распространению заболевания и накапливаться в лимфоидных органах и грануломг инфицированных крыс и людей, что говорит об отсутствии или подавлении эффективнь механизмов уничтожения M tuberculosis и формировании ниш для долговременно! выживания микобактерий в участке инфицирования [Buettner, 2005]

В то же время дендритные клетки обладают уникальными механизмами захвш антигена и представления его наивным Т-клеткам, усиливают врожденный иммуните регулируют развитие специфического иммунного ответа, определяют направленность активность иммунных реакций, поэтому их все чаще используют для иммунотсрапи различных иболсваний [Кузнецова, 2003] Кроме того, показано, что ДК, полученные i vitro из моноцитов, культивированных с GM-CSF и IL-4, не поддерживак внутриклеточную репликацию M tuberculosis в отличие от макрофагов, полученных i тех же самых моноцитов [Tailleux, 2003]

Эффективность иммунного ответа при бактериальной инфекции также зависит и с иммунорегуляторных факторов, непосредственно определяющих состояние иммунно системы в норме и при патологии, в частности 1L-18 [Akira, 2000, Gracie, 2003] Пр микобактериальной инфекции IL-18 стимулирует продукцию IFN-y Т-клетками и № клетками, тем самым, способствуя активации макрофагов и уничтожению M tuberulost. инфицированных клеток [Barnes, 2000] Однако у пациентов, больных туберкулезо наблюдаете! значительное снижение продукции IL-18 и IFN-y При этом в ряде рабе отмечают роль IL-18 в дифференцировке наивных Т-клеток в Т-хелперы 1 типа вообще

в М ¿ибега/озю-индуцированном синтезе цитокина 1-го типа IFN-y в частности [Vankayalapati, 2 ООО]

Исходя из функциональной неполноценности дендритных клеток в патогенезе туберкулеза, а также роли дендритных клеток и IL-18 для реакций клеточного иммунитета, представлялось актуальным и значимым рассмотреть возможность стимуляции эффекгорных функции мононуклеарных клеток периферической крови больных туберкулезом под действием зрелых аутологичных ДК и IL-18 in vitro Цель работы

Изучить возможность модуляции антиген-специфического иммунного ответа с помощью аутологичных активированных дендритных клеток и интерлейкина-18 в культуре мононуклеарных клеток больных туберкулезом

В связи с поставленной целью предстояло решить следующие задачи

1 Исследовать фототипические и функциональные показатели дендритных клеток больных туберкулезом легких по сравнению с дендритными клетками здоровых доноров

2 Исследовать особенности прохождения дендритных клеток по клеточному циклу в процессе генерации под действием используемых факторов дифференцировки

3 Исследовать влияние антиген-специфических дендритных клеток и IL-18 на пролиферативную активность МНК в ответ на специфический антиген М tuberculosis ESAT-6

4 Исследовать влияние антиген-специфических дендритных клегок и IL-18 на количество IFN-у-продуцирующих клеток и продукцию IFN-y и IL-4 МНК в ответ на специфический антиген М tuberculosis ESAT-6

5 Исследовать влияние антиген-специфических дендритных клеток и IL-18 на экспрессию перфорина МНК в ответ на специфический антиген М tuberculosis ESAT-6

Научная новизна работы

Установлено, что использование рч1Ь-18 при совместном культивировании мононуклеарных клеток со зрелыми аутологичными ДК приводит к максимальной стимуляции антиген-индуцированной продукции IFN-y, достоверному повышению содержания IFN-y -продуцирующих клеток по сравнению с МНК, культивированными с ДК в отсутствии IL-18

Показана фенотипическая и функциональная состоятельность зрелых дендритных клеток, презентирующих специфический антиген М tuberculosis ESAT-6, полученных из

моноцитов периферической крови пациентов, больных туберкулезом легких пр использовании модифицированного «короткого» 48 часового протокола Теоретичес кая и практическая значимость работы

Полученные результаты расширяют представления об иммунорегуляторно потенциале дендритных клеток моноцитарного происхождения при туберкулезе легки демонстрируют возможность влияния цитокинов и антигенов на направленное! противоинфекционного иммунного ответа, предполагают возможность использован! антиген-активированных дендритных клеток, IL-18 и мононуклеарных клеток в качесп эффективного подхода к восстановлению специфического иммунного ответа in vivo больных туберкулезом легких Практическая значимость работы заключается экспериментальном обосновании способа модуляции клеточного иммунного ответа культуре МНК, который может быть основой клеточной технологии лечения туберкулез. Основные положения, выносимые на защиту

1 Зрелые аутологичные ДК стимулируют продукцию IFN-7 и цитотоксическм фактора перфорина мононуклеарными клетками пациентов, больных туберкулеза легких в ответ на специфический антиген ES АТ-6

2 Рекомбинантный человеческий IL-18 играет адъювантную роль в развитии антиге) специфического иммунного ответа при совместном культивировании зрель аутологичных ДК и мононуклеарных клеток

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации доложены и обсуждены на 1) Ежегодной конкурс-конференцр студентов и молодых ученых «Авиценна - 2005» Новосибирск, 2005, 2) Московсюс международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006), Российской научно-практической конференции «Современные технологии иммунологии иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006), 4) 1 Международной конференции "Фундаментальные науки - медицине" (Новосибирс 2007), 5) Межрегиональной научно-практической конференции «Дни иммунологии Сибири» (Омск, 2007) 6) Семинарах экспериментального отдела ГУ НИИ КИ СО РАМ (Новосибирск, 2006, 2007) 7) Объединенном иммунологическом форуме (Санк Петербург, 2008)

Публикации По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 1 статья издании, рекомендованном ВАК

Объем и структура работы Диссертация написана в традиционном стиле и состоит i введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводо Материал изложен на 120 страницах машинописного текста, включающего 14 рисунко

3 таблицы и 3 схемы Прилагаемая библиография содержит ссылки на 197 литературных источников, в том числе 191 иностранный

МЛ ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Объект исследования. Мононуклеарные клетки периферической крови (МНК ПК) пациентов, больных туберкулезом легких (55 человек) и условно здоровых доноров (30 человек)

Выделение клеток из периферической крови

1 Выделение МНК ПК осуществлялось в градиенте плотности фиколл-урографина согласно [Boyum, 1968]

2 Выделении моноцитов периферической крови проводилось методом адгезии на пластике [Wahl, 1995]

Получение зрелых антиген-активированных ДК

1 Дифференцировка моноцитов в незрелые ДК под действием GM-CSF (50 hi /мл) и IL-4 (100 нг/мл) в течение 24 часов [Obermaier, 2003]

2 Культивирование незрелых ДК в присутствии специфического антигена Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 (3 мкг/мл)

3 Получение зрелых дендритных клеток под действием LPS (5 мкг/мл) в течение 24 часов

Культивирование клеток проводилось в полной среде RPMI-1640, содержащей 10% FCS (РАА, Австрия), 2 мМ L-глютамина (ГНЦ ВБ «Вектор»), 10 мМ HEPES буфера (Sigma), 5 10"4 М 2-меркаптоэтанола (Sigma), 80 мкг/мл гентамицина (АО «Самсон» Санкт-Петербург), 100 мкг/мл ампициллина (ЗАО «Синтез» Курган) в атмосфере, содержащей 5% СО2, при 37°С

Анализ фенотипических и функциональных показателей дендритных клеток методом проточной цитометрич (FACSCalibur (BD))

1. Для анализа фенотипических характеристик дендритных клеток использовались моноклональные антитела anti-CD 83 РЕ (BD Pharmingen), anti-CD 86 FITC (BD Pharmingen), anti-HLA FITC («Сорбент», Москва)

2. Для оценки эффективности захвата антигена полученными дендритными клетками определялась их способность к рецептор-опосредованному эндоцитозу с помощью захвата FITC-декстрана (Sigma) при +4С и при +37С

3. Анализ клеточного цикла и уровня апоптоза проводили на основании измерения содержания ДНК с применением внутриядерного красителя 7AAD (Sigma)

Совместное культивирование МНК неприлипшей фракции и ПК

Полученные ДК подвергались совместному культивированию с мононуклеарным клетками неприлипшей фракции (нфМНК) в течение 48 часов для праймироваш специфического антигена (в соотношении ДК МНК=1 10) с добавлением 40 nr/v рекомбинантного человеческого 1L-18 (рч1Ь-18) (ООО «Центр инженернс иммунологии», г Новосибирск) или без него (группы нфМНК+ДК (ESAT-6) +IL-18 нфМНК+ДК (ESAT-6), соответственно) В качесгве контроля использовалис мононуклеарные клетки неприлипшей фракции, культивированные в тех же условия (группы нфМИК и нфМНК+1Ь-18), а также клетки, культивированные в присутствии Д1 которым не представлялся антиген ESAT-6 (группа нфМНК+ДК (без антигена))

После совместного культивирования МНК неприлипшей фракции и ДК присутствии или отсутствии IL-18, а также культивирования клеток контрольных груп клеточную суспензию отмывали, а затем культивировали полученные клетки (1 mhii/mj со специфическим антигеном ESAT-6 (1 мкг/мл) в течение 72 часов Для определен!' эффективности ответа на специфический антиген М tuberulom ESAT-6 через 72 час культивирования МНК, предварительно активированных зрелыми аутологичными ДК, мы использовали

1 Количественное определение клеток, продуцирующих IFN-y, с помощью технологи ELISpot (R&D Systems)

2 Определение продукции IFN-y и IL-4 в кондиционных средах с помощы иммуноферментного анализа («Вектор-Бэст», Новосибирск)

3 Определение пролиферативной активности МНК по включению 3Н-тимидина нуклеопротеидные фракции клеток. Н3-тимидин вносили по 1 (.iCi/лунка за 16-18 часс до конца культивирования

4 Определение содержания перфорин-позитивных клеток с помощью антител внутриклеточному белку перфорину (BD Pharmihgen) с последующим анализом и проточном цитометре FACSCahbur (BD)

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программ Statistica 6 0 Проверка выборки на нормальность распределения проводилась с помощы критерия Колмогорова-Смирнова При нормальном распределении выборки результат представлялись в виде среднего и ошибки среднего Статистическая достоверное! различий определялась с помощью t-критерия Стыодента при р<0,05 Если исследуемы выборки не подчинялись нормальному распределению, данные представлялись в вад медианы и диапазона значений квартилей ( 25% и 75%), а для проверки гипотез достоверности различии использовали непараметрические критерии Манна-Уитни Уилкоксона

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение зрелых антиген-активированных дендритных клеток из моноцитов периферической крови.

Поскольку ДК являются клетками-мишенями для М. tuberculosis в патогенезе туберкулеза, то первой задачей стоящей перед нами была необходимость получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток из моноцитов периферической крови пациентов, больных туберкулезом легких и сравнения их с ДК, полученными из моноцитов периферической крови здоровых доноров по фенотипическим и функциональным показателям. Для получения дендритных клеток из моноцитов периферической крови мы использовали протокол, предполагающий 24-часовое культивирование моноцитов ПК и терминальную дифференцировку полученных незрелых дендритных клеток в последующие 24 часа [Obermaier, 2003 ]. Незрелым ДК представлялся специфический антиген М. tuberculosis ESAT-6, а для терминальной дифференцировки ДК мы применяли бактериальный липополисахарид E.coli. На Рис. 1 и Рис. 2 представлены уровни экспрессии маркеров CD83, CD86 и HLA-DR на поверхности зрелых дендритных клеток по сравнению с незрелыми дендритными клетками и исходными мононуклеарными клетками прилипшей фракции пациентов больных туберкулезом и здоровых доноров.

^ В прилипающая фракция ■ незрелые ДК а зрелые ДК |

СО 83*/HLA-OR

Л

со вз.тл-ж

| и npiWimiBOmSH фрэщия ■нозронысДК Пфвшё )iy. j

Рис. 1. Уровень экспрессии поверхностных Рис. 2. Уровень экспрессии поверхностных

маркеров на дендритных клетках маркеров на дендритных клетках

больных туберкулезом (п=16). здоровых доноров (п-8)

Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего.

* - различия достоверны между незрелыми и зрелыми ДК

Клетки исходной популяции пациентов, больных туберкулезом легких отличались достоверно более высоким уровнем экспрессии активационных молекул СО 86 и НЬА-ГЖ (Таблица !). Такое состояние лимфоцитов может быть следствием «преактивации», возникающей из-за бактериальной нагруженное™ организма. Как у пациентов, больных туберкулезом, так и у здоровых доноров наблюдается достоверное повышение содержания зрелых ДК, несущих соответствующие маркеры дифференцировки и костимуляции, однако при несколько более сниженных показателях содержания клеток,

экспрессирующих НЬА-1Ж+ и СО 86+ у пациентов, больных туберкулезом легки (Таблица 1) В тоже время ДК здоровых доноров и пациентов, больных туберкулезом и отличаются по экспрессии СБ 83+ и СБ 83+/НЬА-011', а содержание клеток с фенотипо! СБ 837СО 86+ достоверно выше у пациентов, больных туберкулезом легких

Таблица 1 Сравнение уровней экспрессии поверхностных маркеров дендритных клеток пациентов, больных туберкулезом и здоровых доноров.

Данные представлены

в виде среднее

и ошиб>

среднего

*- различи достоверны между здоровыми донорами больными туберкулезом

Для исследования способности полученных незрелых дендритных клеток больны туберкулезом захватывать антиген мы провели оценку их активности в отношени рецептор-опосредованного эндоцитоза (с помощью захвата FITC-декстрана) при +4"С при +37°С При +4"С происходит неспецифическое связывание декстрана поверхностными рецепторами, а при +37°С связанный декстран проникает в клетк (эндоцитоз) Степень захвата FITC-декстрана дендритными клетками определялась п формуле delta MIF = MIF 37 с ~ MIF4 с, где где MIF37 с и MIF4 с— интенсивност флюоресценции меченых клеток при +37°С и +4"С соответственно

При сравнении этого показателя обнаружено, что интенсивность захвата антиген незрелыми дендритными клетками как здоровых доноров, так и пациентов, больны туберкулезом достоверно выше по сравнению со зрелыми дендритными клетками Эт свидетельствует об эффективном захвате антигена нецелыми ДК по механизм рецептор-опосредованного эндоцитоза и о сохранении способности зрелых ДК неспецифичгскому связыванию декстрана без проникновения его в клетку (Рис 3, Ри( 4)

Таким образом, незрелые ДК, полученные при 24 часах дифференцировк! моноцитов периферической крови, обладают высокой способностью к эндоцитозу i могут быть эффективно нагружены антигеном Через 24 часа созревания незрелые Д]

прилипшая фракция MHK незрелые ДК зрелые ДК

Доноры (n=8) ТВ-больные (n=16) Доноры (n=8) ТВ- больные (n=16) Доноры (n=&) ТВ-больные (п=16)

CD 83" 2,3 H0.2I 6,37+O.M* It,12i2,41 32.l9il.74' 40,9i 1,53 43,11 ±5 Д5

CD 86* I9.S3H.S 14.22i2.9l' 34,7I±3,62 29,65±2,69 6.1,3913,4 S0.2Si4.IS''

HLA-DR* 11,7610.74 41,94i6.00* 43.lit.4S 26.9Ш.М* 64.77i6.67 37,11417,46'

CD 83+/CD 86* t,S6iO,S6 S.97S±0.71* 15,14±3,71 19,65±3,05 I4JSH.66 12.44*4.24»

CD 837 HLA-DR+ 1,43±0,16 l,055±0,25 10,45±2,39 8,76*1,15 26,19±3,1 24,36±7,67

приобретают фенотип зрелых дендритных клеток, увеличивая экспрессию СГ)83 'С0Х6! НЬЛ-ОК1 при снижении способности к захвату антигена.

600 500 400 300 200 100 О----

¡зрелые ДК

зрелые ДК

500

U. 400

S

га 300

~аз ■о 200

100

0

незрелые ДК

зрелые ДК

Рис. 3. Эндоцитозная активность дендритных клеток пациентов, больных туберкулезом в зависимости от степени зрелости (п=15).

Рис. 4. Эндоцитозная активность дендритных клеток здоровых доноров в зависимости от степени зрелости (,,=15)

Достоверность различий определена с помощью 1- критерия Стьюдеита при р<0.05. * -различия достоверны между незрелыми и зрелыми ДК

Для определения особенностей прохождения дендритных клеток по клеточному циклу в процессе генерации под действием используемых цитокинов, LPS и специфического антигена М. tuberulosis ESAT-6 мы исследовали фазы клеточного цикла и уровень апоптоза полученных незрелых дендритных клеток, дендритных клеток после добавления антигена и после добавления фактора терминальной дифференцировки LPS (Рис. 5).

100

g 80

h 60

Mi

40

20

0

3?

незрелые ДК без антигена

100 г-------

□ апоптоэ

А.

К.

Рис. 5 Распределение по фазам клеточного цикла ДК пациентов больных туберкулезом(Л) (п=8) и ДК здоровых доноров (п=8) (Б). Данные представлены « виде среднего и ошибки среднего. Различия недостоверны

Таким образом, используемые цигокины, антиген и липополисахарид не оказывают цитотоксического эффекта на генерируемые ДК и не влияют на прохождение ДК по клеточному циклу. Подавляющее большинство клеток находится в 01/00 фазе клеточного цикла, что может свидетельствовать о процессах дифференцировки клеток. При этом у больных туберкулезом и здоровых доноров наблюдается сходная картина распределения дендритных клеток по фазам клеточного цикла.

Модуляция иммунного ответа с помощью зрелых_антиген-активированиы.

дендритных клеток.

Изучение влияния антиген-активированных ДК на распределение мононуклеарны. клеток по фазам клеточного цикла

Для тестирования функционального состояния полученных ДК и их способност модулировать специфический иммунный ответ мы проводили совместно культивирование антиген-активированных дендритных клеток с мононуклеарным клетками неприлипшей фракции (далее называемыми просто МНК) в соотношени ДК:МНК=1:10 в течение 48 часов. Целью данной процедуры является активаци направленной дифференцировки ТО клеток в Т-хелперы I типа и индукция созревани специфических цитотоксических клеток.

Для сценки влияния зрелых антиген-активированных ДК на мононуклеарны клетки мы определяли уровень апоптоза и распределение МНК по фазам клегочног цикла после культивирования со зрелыми ДК. У пациентов, больных туберкулез« достоверно снижалось содержание клеток, находящихся в 01/СЮ фазах клеточного циклг с одновременным повышением количества клеток в Б, 02/М фазах, что може свидетельствовать об активации пролиферативного потенциала (Рис. 6 А). В групп здоровых доноров подобного эффекта не обнаружено (Рис. 6 Б).

мнк+дк

;,С2/м

Рис. б.Влиянче антиген-активированных ДК на распределение по фазам клеточного цикла МП пациентов, больных туберкулезом легких (А) (п=8) и МНК здоровых доноров (Б) (п=8). Данны представлены в виде среднего и ошибки среднего

Достоверность различий определена с помощью ?- критерия Стьюдента при р<0.05.

При сравнении распределения клеток по фазам клеточного цикла показано, что исходной фракции мононуклеарных клеток пациентов, больных туберкулезом легки? наблюдается достоверное меньшее содержание клеток, находящихся в 8, 02/М фаз клеточного цикла, соответствующей пролиферативной активности, при достоверно боле высоком содержании клеток, находящихся в фазе 01/00 по сравнению мононуклеарными клетками здоровых доноров. После совместного культивировани мононуклеарных клеток с антиген-активированными дендритными клеткам! наблюдается сохранение достоверных различий между клетками здоровых доноров клетками, пациентов, больных туберкулезом (Таблица 2).

А [ о а поптоз ■ (31 /60 " О &, С2/м]

| о апоптоа шС1/50 о 5

Таблица 2 Распределение по фазам клеточного цикла мононуклеарных клеток пациентов больных туберкулезом и мононуклеарных клеток здоровых доноров до и после культивирования с антиген-

Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего

* - различия достоверны между здоровыми донорами и больными туберкулезом

Для определения эффективности модуляции противотуберкулезного иммунного ответа т vitro с помощью полученных ДК мы оценивали пролиферативную активность, количество IFN-7-продуцирующнх клеток, продукцию IFN-y и IL-4 и экспрессию перфорина МНК неприлипшей фракции, предварительно культивированными с антиген-активированными ДК, в ответ на специфический антиген М tuberculosis ESAT-6 через 72 часа Таким образом, процессы презентации антигена протекают в культуре дендритных клеток, а совместное культивирование МНК неприлипшей фракции и ДК способствует реализации эффекторных функций иммунокомпетентных клеток Временной промежуток в 72 часа был выбран исходя из того, что пик секреции IFN-y de novo приходится на 48-72 часа культивирования клеток т vitro [Malyguine, 2004]

Влияние антиген-активированных ДК на пролиферативную активность мононуклеарных клеток in vitro.

При исследовании пролиферативной активности МНК, предварительно культивированных с антиген-активированными ДК, в ответ на специфический антиген М tuberculosis ESAT-6 через 72 часа, показано, что и антиген-стимулированные ДК и ДК, не нагруженные антигеном, способны активировать пролиферативный потенциал мононуклеарных клеток пациентов, больных туберкулезом (Рис 7) Недостоверность различий между спонтанными и антиген-стимулироваными уровнями пролиферативной активности мононуклеарных клеток можно объяснить тем, что специфический антиген М tuberculosis ESAT-6 обладает слабым влиянием на пролиферативную активность мононуклеарных клеток [Ulrichs, 2000 ]

Для стимуляции и поддержания направленной дифференцировки наивных Т-клеток в Т-хелперы первого типа мы добавляли рч1Ь-18 при совместном культивировании зрелых антиген-активированных ДК и МНК IL-18 играет важную роль в формировании эффективного Т-клеточного иммунного ответа, который при бактериальных инфекциях, в частности при туберкулезе, связан с появлением IFN-у-секретирующих Т-клеток, что приводит к активации макрофагов и уничтожению инфицированных клеток [Akira, 2000]

активированными дендритными клетками

МНК мнк+дк

Здоровые ТВ-больные Здоровые ТВ-больные

(п=8) (пЩ (п=8) (п=8)

Апоптоз 2.№0.и ПАЛОМ* 2,36±0,51 1,23±0,26

Gl/G0 56.4215.56 91,44±U7* 63.84±5.37 84.63±1.95*

S.G2/M 4¡.78í5.62 34.22*5.08 14.32±1.95*

Добавление рч1Ь-18 при совместном культивировании дендритных клеток мононуклеарных клеток пациентов, больных туберкулезом не приводит к статисгическ значимому усилению пролиферативной активности МНК по сравнению с клеткам1 культивированными без IL-18, что может объясняться слабой способностью IL-18 влият на процессы пролиферации иммунокомпетентных клеток без дополнительных факторо! например таких, как IL-12 [Micallef, 1996].

Рис. 7. Влияние антиген активированных Д К и про л ифератнв ную а кт и в но cm мононуклеарных клеток пациенте больных туберкулезом легких ответ на антиген ESAT-6 in viti (п=16). Данные представлены в вш среднего и ошибки среднего.

# — по сравнению с интактным МНК (как спонтанная, так и ESA'i 6-стимулированная пролиферация).

1. нфМНК

2. нфМНК +IL-18

3. нфМНК+ДК (бел антигена)

5. нфМНК'гДК (ESAT-6)+lL-18

Таким образом, совместное культивирование зрелых антиген-активированных ДК МНК приводит к активации пролиферативной активности мононуклеарных клето пациентов, больных туберкулезом in vitro. Полученные ДК, вне зависимости о антигенной нагрузки, индуцируют приблизительно равный пролиферативный отве мононуклеарными клетками в ответ на повторную стимуляцию антигеном.

Влияние антиген-активированных ДК на количество IFN-у-продуцирующих клеток культуре мононуклеарных клеток in vitro.

Для тестирования способности полученных дендритных клеток индуцироват развитие Thl-иммунного ответа мы использовали технологию ELISpol, позволяющу1 провести количественную оценку клеток, продуцирующих IFN-y в ответ н специфический антиген ESAT-6. По литературным данным циркулирующие ESAT-f специфические клетки ке обязательно связаны с патологией тканей, скорее их рол заключается в сдерживании М. tuberculosis. Показано, что дендритные клети нагруженные антигеном, эффективно повышают количество IFN-у-продуцирующи клеток самостоятельно и еще более эффекгивно в ответ на антиген ESAT-6 по сравненш с исходной популяцией МНК. ДК, не нагруженные антигеном, также повышаю количество IFN-у-продуцируклцих клеток, однако, не происходит прирост

□ спонтанная пролиферация Ш ESAT-6 (1 мкг/мл) (

цитокинпродуцирующих клеток в ответ на антиген. Добавление рч1Ь-18 при культивировании ДК и МНК повышает количество IFN-y -продуцирующих клеток по сравнению с исходной фракцией МНК, при этом количество IFN-у-продуцирующих клеток значительно увеличивается в присутствии туберкулезного антигена ESAT-6 (Рис. 8). При сравнении количества IFN-у-продуцирующих клеток в популяции МНК, культивированных с ДК различной антигенной нагруженное™ показано, что антиген-активированные ДК не повышают достоверно уровень последующего иммунного ответа на антиген по сравнению с ДК, которым не представлялся используемый антиген. В присутствии IL-18 наблюдается достоверно большее количество IFN-у-продуцирующих клеток по сравнению с МНК, культивированными в присутствии ненагруженных антигеном ДК, и МНК, культивированных с антиген-активированными ДК без IL-18 (Рис.

Рис. 8. Влияние антиген-активированных ДК на количество IFN-y продуцирующих клеток в ответ на антиген ESAT-6 в культуре МНК пациентов, больных туберкулезом легких (п=16). Данные представлены в виде медианы и диапазона значений квартилей # - по сравнению с интактнымп МНК (как спонтанная, так и ESAT-6-стимулированная секреция).

I. нфМНК 2. нф MHK+1L-I8 3. нфМНК+ДК (без антигена)

4. нфМНК+ДК (ESA Т-6) 5. нфМНК+ДК (ESAT-6)+IL-18

Таким образом, совместное культивирование МНК и антиген-активированных ДК в присутствии 1L-18 приводит к увеличению количества IFN-у-продуцирующих клеток по сравнению с культивированием в отсутствии IL-18. При этом у больных туберкулезом не наблюдается достоверных различий между культивированием МНК с ДК различной антигенной нагрузки.

Влияние антиген-активированных ДК на продукцию IFN-y и IL-4 в культуре мононуклеарных клеток in vitro.

Для того, чтобы определить направленность иммунного ответа, возникающего под влиянием полученных дендритных клеток мы определяли концентрации IFN-y и оппозитного цитокина IL-4 в кондиционных средах активированных МНК больных туберкулезом в ответ на антиген ESAT-6. Культивирование мононуклеарных клеток с аутологичными ДК приводит к достоверно более высокому уровню как спонтанной продукции, так и продукции в ответ на ESAT-6 по сравнению с исходной популяцией МНК (рис.9).

с 2200 5 2000 = 1800 ä 1600 j 1400 - 1200 I 1000 g 800 £ 600 5 400 g 200 0

fiT* <-#-*->

<- ^ Ü ii <

1

□ спонтанная

IESAT-6

Рис. 9. Влиянь а и m и г e и активированных ДК i продукцию IF/V-y МН больных туберкулезе в ответ на антпг( ESAT-6 in vitro (п=10).

Данные представлен в виде медианы диапазона значена квартилей. # - различи достоверны п сравнению с группой нфМНК.

* - различия достоверны по сравнению с группой нфМНК+lL-lS (как спонтанная, так и ESAT-i стимулированная секреция).

1. нфМНК 2. нфМНК +IL-18 3. нфМНК+ДК (без антигена)

4. нфМНК+ДК(ESAT-6) 5. нфМНК+ДК(ESAT-6)+IL-l8

При культивировании МНК с антиген-активированными ДК наблюдается достоверно повышение секреции IFN-у по сравнению с продукцией цитокина, индуцируемо ненагружениыми антигеном ДК. При добавлении рч!Ь-18 при совместно культивировании МНК и ДК наблюдается максимальная секреция IFN-y, достоверн отличающаяся от продукции цитокина МНК, культивированными с ДК без IL-18. (Phi

9).

При определении содержания IL-4 в кондиционных средах МНК, предварительн активированных аутологичными ДК, в ответ на антиген ESAT-6 не выявлен достоверных различий в продукции Th-2 цитокина IL-4 в зависимости от нагруженност ДК антигеном и присутствия или отсутствия IL-18 (Рис. 10).

□ спонтанная

И ESAT-6

Рис. 10. Влияние антиге/ активированных ДК на продукцию Н 4 МНК больных туберкулезом ответ на антиген ESAT-6 in viti (п=10).

Данные представлены в виде медиан и диапазона значений квартилей.

1. нфМНК

2. нфМНК +IL-18

3. нфМНК+ДК (без антигена)

4. нфМНК+ДК (ESA Т-6)

5. нфМНК+ДК (ESAT-6)+lL-18

Таким образом, совместное культивирование МНК и антиген-активированных Д) приводит к увеличению уровня продукции №N-7 по сравнению с культивированием присутствии дендритных клеток, ненагруженных антигеном и не оказывае

достоверного влияния на продукцию Th2 цитокина IL-4 Под действием IL-18 добавленного при совместном культивировании антиген-активированных дендритных клеток и мононуклеарных клеток пациентов, больных туберкулезом наблюдается достоверное повышение уровня секретируемого IFN-y в ответ на специфический антиген ESAT-6, а продукция IL-4 не изменяется, что свидетельствует о влиянии IL-18 на формирование Т-клеточного ответа первого типа

Влияние антиген-активированных ДК па экспрессию перфорина мононуклеарными клетками in vitro

Пролиферативная активность и продукция IFN-y мононуклеарными клетками способствует реализации эффекгорных функций направленных на уничтожение инфицированных клеток Клеточно-опосредованная цитотоксичность является одним из механизмов лизиса зараженных макрофагов [Canaday, 2001] В связи с этим представлялось необходимым определить потенциальную цитотоксическую активность МНК после культивирования с антиген-стимулированными дендритными клетками Специфический антиген М tuberculosis ESAT-6 имеет в составе эпитопы, распознаваемые как CD 4+, так и CD 8+ Т-клетками [Cardoso, 2002], поэтому ДК, представляющие антиген ESAT-6, в равной мере будут способствовать появлению цитотоксических клеток В нашей работе мы исследовали цитотоксическую активность МНК по продукции ими внутриклеточного порообразующего белка перфорина, поскольку перфорин-гранзимный механизм считается более эффективным для лизиса макрофагов, зараженных М tuberculosis Экспрессия перфорина мононуклеарными клетками, предварительно культивированными с ДК, как нагруженными, так и ненагруженными антигеном, достоверно повышается по сравнению с интактными МНК При этом наблюдается достоверное повышение продукции перфорина МНК, культивированными в присутствии антиген-активированных ДК, по сравнению с МНК, культивированными с ДК, которым не представлялся антиген Добавление IL-18 при совместном культивировании дендритных и мононуклеарных клеток еще более выражено стимулирует проявление цитотоксической активности МНК по сравнению с ДК, которым не представлялся антиген, что может говорить о специфичности иммунного ответа При этом не наблюдается достоверного прироста перфорин-позитивных клеток в ответ на антиген ESAT-6, что может свидетельствовать о том, что применение нативного антигена in vitro не в полной мере стимулирует цитотоксическую активность МНК, но предполагает эффективную работу этого механизма in vivo или в ответ на цельные инфицированные клетки in vitro (Рис 11)

1 2 3 4 5

□ спонтанная секреция Q ESÄT-6 (1мкг/мл)

стимулированная секреция).

Рис. //. Влияние антига активированных ДК на ypoeei, экспрессии перфорина в ответ ь антиген ESAT-6 in vitro МН больных туберкулезом легки (п=8).

Данные представлены в вш медианы и диапазона значеш, квартилей.

# - различия достоверны п сравнению с группой нфМНК (ы спонтанная, так и ESAT- <

1. нфМНК 2. нфМНК+IL-1S З.нфМНК+ДК (без антигена)

4. нфМНК+ДК (ESA Т-6) 5. нфМНК+ДК (ESA T-6)+lL-18

Таким образом, показано, что совместное культивирование зрелых аутологичны ДК и нфМНК приводит к достоверному повышению содержания перфорин-позигивны клеток с потенциальной цитотоксической активностью. Применение рч1Ь-18 пр совместном культивировании нфМНК ПК и аутологичных активированных ДК н оказывает достоверного влияния на уровень экспрессии перфорина монокуклеарным клетками периферической крови

По результатам проделанной работы были сделаны следующие выводы.

ВЫВОДЫ

1. Используемые факторы дифференцировки ДК, такие как GM-CSF, IL-4 липополисахарид Е. coli, а также специфический антиген М. tuberculosis и стимулируют процессы апоптоза дендритных клеток, генерируемых в течение 4 часов из моноцитов периферической крови и не влияют на прохождение ДК п клеточному циклу.

2. Зрелые дендритные клетки больных туберкулезом легких, характеризуютс сниженным содержанием клеток с экспрессией HLA-DR+ и CD86+ и не отличаютс по содержанию клеток с фенотипом CD 83+ по сравнению с ДК здоровых доноров, также способны к захвату декстрана на ранних этапах созревания, чт свидетельствует о возможности генерации ДК при данной патологии в условия культивирования in vitro.

3. Повышение содержания IFN-y и отсутствие влияния на продукцию IL-4 в культур

мононуклеарных клеток больных туберкулезом под действием антиген-активированных ДК свидетельствует о способности зрелых аутологичных дендритных клеток сдвигать баланс Thl/Th2 в пользу формирования реакций ТЫ типа

4 Совместное культивирование мононуклеарных клеток больных туберкулезом со зрелыми аутологичными ДК в присутствии рекомбинантного человеческого IL-18 приводит к повышению количества IFN-у-продуцирующих клеток и уровня антиген-индуцированной продукции IFN-y мононуклеарными клетками по сравнению с культивированием в отсутствии IL-18, что свидетельствует об адъювантной роли IL-18 в развитии антиген-специфического иммунного ответа

5 Содержание лимфоцитов, экспрессирующих перфорин достоверно увеличивается при культивировании мононуклеарных клеток, предварительно стимулированных зрелыми антиген-активированными ДК, в присутствии специфического антигена М tuberculosis ESAT-6, что свидетельствует об индукции антиген-специфической цитотоксичности

6 Дендритные клетки, полученные из моноцитов периферической крови больных туберкулезом легких обладают характерными фенотипическими и функциональными свойствами данной популяции и способны модулировать антиген-специфический иммунный ответ т vitro как самостоятельно, так и в присутствии IL-18, путем усиления эффективности взаимодействия иммунокомпетентных клеток

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Шевченко Ю А , Якушенко Е В , Сенников С В , Козлов В А Оценка специфического иммунного ответа на туберкулезный антиген ESAT-6 мононуклеарными клетками больных туберкулезом на основе технологии ELISPOT // Материалы ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна-2005» Новосибирск, 2005 стр 115

2 Шевченко ЮА, Якушенко ЕВ, Романов ВВ, Сенников СВ, Козлов В А Применение технологии ELISpot для оценки специфического иммунного ответа на туберкулезный антиген ESAT-6 мононуклеарными клетками больных туберкулезом // Цитокины и воспаление - 2005 -т 4, №2 - стр 103 Материалы Всероссийского научного симпозиума «Цитокины Стволовая клетка Иммунитет» Новосибирск 19-21 июня 2005г

3 Сенников С В, Жеребцова Н О, Хрипко О П, Шевченко Ю А , Якушенко Е В , Облеухова И А, Гончаров М А , Романов В В , Пронкина Н В , Кожевников В С, Сизиков А Э, Бровкина Г И, Толоконская Н П, Позднякова JIJI, Красильникова И В , Козлов В А Модуляция специфического

иммунного огвета аутологичными активированными дендритными клетками in vitro // Материал Московской международной конференции «Биотехнология и медицина», 14-17 марта 2006 - ст] 141

4 Якушенко Е В, Хрипко О П, Шевченко Ю А, Пронкина Н В, Красилышкова И В, Романс ВВ, Сенников СВ, Козлов В А Модуляция противоинфекцион-ного иммунного oriei аутологичными активированными дендритными клетками при гепагите и туберкулезе легких 1 vitro// Russian Journal of Immunology - 2006 - v 9, suppl 3 - p 138 Материалы Россингкс научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологи! иммунодиагностика и иммунотерапия»

5 Шевчеш о Ю А, Хрипко О П, Якушенко Е В, Пронкина Н В, Кожевников В С, Романов В В Лаушкина Ж А, Тутов АА, Сенников СВ, Козлов В А Оптимизация протоколов получени антиген-активированных дендритных клеток дня стимуляции специфического иммунного ответ ш viti о при туберкулезе легких // Иммунология Урала.- 2006 - № 1 (5) -стр 181-182

6 ShevcherJco Y , Sennikov S, Laushkina J, Yakushenko E, Romanov V, Tugov A, Kozlov N Autologous dendritic cell for modulation of the specific antituberculosis immune response in vitro World Immune Regulation Meeting Final Programme and Abstracts p 143-144 11 - 15 April 200 Davos, S svitzerland

7 Шевченю Ю A, Сенников С В , Якушенко Е В , Лаушкина Ж А, Романов В В , Тутов А А Козлов В А Влияние аутологичных антиген-активированых дендритных клеток на формировани иммуннсго ответа т vitro при туберкулезе // Медицинская иммунология -,>007 - №2-3 - т 9 -1 253-254

8 ShevcherJco Y , Senmkov S V , Laushkina Z A , Yakushenko E V, Romanov V V , Tugov A A Kozlov \ A Modulation of the specific antituberculosis immune response in vino by means of antiger activated dendritic cells // 13th International Congress oflmmunology, Rio de Janeiro, Brazil, Aug 21-2' 2007 p 375-376

9 Шевченко Ю A , Якушенко E В, Лаушкина Ж A, Романов В В, Свистельиик А В , Сенников С В Козлов В А Аугологичные дендритные клетки как основа для модуляции специфическог противотуберкулезного клеточного иммунного ответа in vitro И Материалы III международно конференции «Фундаментальные науки - медицине» - Новосибирск 2-8 сентября 2007г - с 86

10 Шевченко Ю А, Якушенко Е В, Лаушкина Ж А , Романов В В, Свистельник А В , Сенников С В Козлов В А Индукция специфического противоинфекционного иммунного ответа с помощы аутологичных антиген-активированных дендритных клеток у пациентов, больных туберкулезом Омский научный вестник -2007-№ 3(61), приложение 2-с 142-144

11 Шевченко Ю А, Якушенко Е В, Сенников С В, Лаушкина Ж А, Романов В В, Свистельник А В Козлов В А Модуляция противотуберкулезного иммунного ответа ¡п vitro с помощью антиген активированных дендритных клеток // Проблемы туберкулеза и болезней легких -2008 - № 2 - с 33-35

Отпечатано в типографии Новосибирского государственного технического университета 630092, г Новосибирск, пр. К. Маркса, 20, тел./факс: (383) 346-08-57 формат 60 X 84/16, объем 1,25 п л., тираж 100 заказ №268 подписано в печать 09.07.08 г.

Туберкулез относится к числу так называемых социальных болезней и характеризуется хроническим течением, многообразием клинических форм и поражением различных органов, главным образом дыхательной системы. К факторам риска заболевания относятся иммуносупрессивные заболевания, дефицит питания, стресс, социальные условия, а также генетическая предрасположенность, обусловленная дефектом генов костимуляторных молекул, цитокинов и их рецепторов [5]. Одним из основных механизмов патогенеза туберкулеза является нарушение клеточного иммунитета, осуществляемое по нескольким механизмам:

- длительная персистенция М. tuberculosis внутри антиген-презентирующих клеток, таких как макрофаги и ДК

- нарушение презентации антигена

- секреция иммуносупрессорных цитокинов и появление иммуносупрессорных Т-клеток

- повышение апоптоза Т-клеток и подавление апоптоза инфицированных макрофагов [3, 53].

В настоящее время развитие новых эффективных подходов к лечению инфекционных заболеваний связано с использованием собственных механизмов защиты организма и их возможной модуляции. Протективный иммунный ответ на М tuberculosis связан с индукцией эффекторных функций Т хелперов 1 типа, что в свою очередь зависит от представления им антигена и дифференцировки «наивных» Т-клеток, что осуществляется дендритными клетками как основными антиген-презентирующими клеточными элементами.

В патогенезе туберкулеза дендритные клетки наряду с макрофагами являются клетками-мишенями для М. tuberculosis. Инфицированные М tuberculosis дендритные клетки могут способствовать распространению заболевания и накапливаться в лимфоидных органах и грануломах инфицированных крыс и людей, что говорит об отсутствии или подавлении эффективных механизмов уничтожения М. tuberulosis и формировании ниш для долговременного выживания микобактерий в участке инфицирования [110]. В то же время дендритные клетки обладают уникальными механизмами захвата антигена и представления его наивным Т-клеткам, усиливают врождённый иммунитет, регулируют развитие специфического иммунного ответа, определяют направленность и активность иммунных реакций, поэтому их все чаще используют для иммунотерапии различных заболеваний [2]. Кроме того, показано, что ДК, полученные in vitro из моноцитов, культивированных с GM-CSF и IL-4, не поддерживают внутриклеточную репликацию М. tuberculosis в отличие от макрофагов, полученных из тех же самых моноцитов [168].

Эффективность иммунного ответа при бактериальной инфекции также зависит и от иммунорегуляторных факторов, непосредственно определяющих состояние иммунной системы в норме и при патологии, в частности IL-18. При микобактериальной инфекции IL-18 стимулирует продукцию IFN-y Т-клетками и NK-клетками, тем самым, способствуя активации макрофагов и уничтожению М fwberw/os/s-инфицированных клеток. Однако у пациентов, больных туберкулезом наблюдается значительное снижение продукции IL-18 и IFN-y. При этом в ряде работ отмечают роль IL-18 в дифференцировке наивных Т-клеток в Т-хелперы 1 типа вообще ив М. ¿ибеги/от-индуцированном синтезе цитокина 1-го типа IFN-y в частности [182].

Исходя из функциональной неполноценности дендритных клеток в патогенезе туберкулеза, а также роли дендритных клеток и IL-18 для реакций клеточного иммунитета, представлялось актуальным и значимым рассмотреть возможность стимуляции эффекторных функции мононуклеарных клеток периферической крови больных туберкулезом под действием зрелых аутологичных ДК и IL-18 in vitro.

Цель работы:

Изучить возможность модуляции антиген-специфического иммунного ответа с помощью аутологичных активированных дендритных клеток и интерлейкина-18 в культуре мононуклеарных клеток больных туберкулезом. В связи с поставленной целью предстояло решить следующие задачи:

1. Исследовать фенотипические и функциональные показатели дендритных клеток больных туберкулезом легких по сравнению с дендритными клетками здоровых доноров.

2. Исследовать особенности прохождения дендритных клеток по клеточному циклу в процессе генерации под действием используемых факторов дифференцировки.

3. Исследовать влияние антиген-специфических дендритных клеток и IL-18 на пролиферативную активность МНК в ответ на специфический антиген М. tuberculosis ESAT-6.

4. Исследовать влияние антиген-специфических дендритных клеток и IL-18 на количество IFN-у-продуцирующих клеток и продукцию IFN-y и IL-4 МНК в ответ на специфический антиген М. tuberculosis ESAT-6.

5. Исследовать влияние антиген-специфических дендритных клеток и IL-18 на экспрессию перфорина МНК в ответ на специфический антиген М. tuberculosis ESAT-6.

Научная новизна работы.

Установлено, что использование рч1Ь-18 при совместном культивировании мононуклеарных клеток со зрелыми аутологичными ДК приводит к максимальной стимуляции антиген-индуцированной продукции IFN-y, достоверному повышению содержания IFN-y -продуцирующих клеток по сравнению с МНК, культивированными с ДК в отсутствии IL-18.

Показана фенотипическая и функциональная состоятельность зрелых дендритных клеток, презентирующих специфический антиген М. tuberculosis ESAT-6, полученных из моноцитов периферической крови пациентов, больных туберкулезом легких при использовании модифицированного «короткого» 48 часового протокола.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты расширяют представления об иммунорегуляторном потенциале дендритных клеток моноцитарного происхождения при туберкулезе легких, демонстрируют возможность влияния цитокинов и антигенов на направленность противоинфекционного иммунного ответа, предполагают возможность использования антиген-активированных дендритных клеток, IL-18 и мононуклеарных клеток в качестве эффективного подхода к восстановлению специфического иммунного ответа in vivo у больных туберкулезом легких. Практическая значимость работы заключается в экспериментальном обосновании способа модуляции клеточного иммунного ответа в культуре МНК, который может быть основой новой клеточной технологии лечения туберкулеза.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Зрелые аутологичные ДК стимулируют продукцию IFN-y и цитотоксического фактора перфорина мононуклеарными клетками пациентов, больных туберкулезом легких в ответ на специфический антиген ESAT-6.

2. Рекомбинантный человеческий IL-18 играет адъювантную роль в развитии антиген-специфического иммунного ответа при совместном культивировании зрелых аутологичных ДК и мононуклеарных клеток.

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

1. Ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна - 2005» Новосибирск, 2005

2. Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006)

3. Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006)

4. III Международная конференции "Фундаментальные науки -медицине" (Новосибирск, 2007)

5. Межрегиональной научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Омск, 2007)

6. Семинарах экспериментального отдела ГУ НИИ КИ СО РАМН (Новосибирск, 2006, 2007)

7. Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008). Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 1 статья в издании, рекомендованном ВАК.

Самостоятельность выполненной работы.

Результаты, представленные в данной работе, получены лично автором на базе лаборатории молекулярной иммунологии ГУ НИИ КИ СО РАМН и Центра коллективного пользования СО РАМН.

Большую признательность автор выражает научному руководителю работы профессору, д.м.н. C.B. Сенникову за подробное конструктивное 8 обсуждение полученных результатов, а также всем сотрудникам лаборатории молекулярной иммунологии за благожелательное отношение в ходе выполнения работы.

Большую признательность автор выражает сотрудникам лаборатории профессора, д.м.н. Кожевникова B.C. за доброжелательное отношение и помощь при получении данных с помощью прибора FACSCalibur, а также сотруднику Новосибирского НИИ туберкулеза к.м.н. Лаушкиной Ж.А. за помощь в формировании выборки пациентов, больных туберкулезом легких.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Используемые факторы дифференцировки ДК, такие как GM-CSF, IL-4 и липополисахарид Е. coli, а также специфический антиген М. tuberculosis не стимулируют процессы апоптоза дендритных клеток, генерируемых в течение 48 часов из моноцитов периферической крови и не влияют на прохождение ДК по клеточному циклу.

2. Зрелые дендритные клетки больных туберкулезом легких, характеризуются сниженным содержанием клеток с экспрессией HLA-DR+ и CD86+ и не отличаются по содержанию клеток с фенотипом CD 83+ по сравнению с ДК здоровых доноров, а также способны к захвату декстрана на ранних этапах созревания, что свидетельствует о возможности генерации ДК при данной патологии в условиях культивирования in vitro.

3. Повышение содержания IFN-y и отсутствие влияния на продукцию IL-4 в культуре мононуклеарных клеток больных туберкулезом под действием антиген-активированных ДК свидетельствует о способности зрелых аутологичных дендритных клеток сдвигать баланс Thl/Th2 в пользу формирования реакций Thl типа

4. Совместное культивирование мононуклеарных клеток больных туберкулезом со зрелыми аутологичными ДК в присутствии рекомбинантного человеческого IL-18 приводит к повышению количества IFN-у-продуцирующих клеток и уровня антиген-индуцированной продукции IFN-y мононуклеарными клетками по сравнению с культивированием в отсутствии IL-18, что свидетельствует об адъювантной роли IL-18 в развитии антиген-специфического иммунного ответа.

5. Содержание лимфоцитов, экспрессирующих перфорин достоверно увеличивается при культивировании мононуклеарных клеток, предварительно стимулированных зрелыми антиген-активированными ДК, в присутствии специфического антигена М. tuberculosis ESAT-6, что свидетельствует об индукции антиген-специфической цитотоксичности.

6. Дендритные клетки, полученные из моноцитов периферической крови больных туберкулезом легких обладают характерными фенотипическими и функциональными свойствами данной популяции и способны модулировать антиген-специфический иммунный ответ in vitro как самостоятельно, так и в присутствии IL-18, путем усиления эффективности взаимодействия иммунокомпетентных клеток.

Заключение

Обобщая результаты, можно заключить, что дендритные клетки, полученные из моноцитов периферической крови пациентов, больных туберкулезом легких обладают необходимыми функциональными и фенотипическими характеристиками в зависимости от стадии развития. Поверхностные маркеры и костимуляторные молекулы CD 83, CD 86, HLA-DR присутствуют на незрелых дендритных клетках и их содержание достоверно увеличивается при созревании. Дендритные клетки пациентов, больных туберкулезом характеризуются сниженной экспрессией молекул HLA-DR и CD86 по сравнению с клетками здоровых доноров, однако по экспрессии CD 83+ и CD 83+/HLA-DR+ ДК здоровых доноров и больных туберкулезом не отличаются, а содержание клеток с фенотипом CD 83+/CD 86+ достоверно выше у пациентов, больных туберкулезом легких, что может свидетельствовать о возможности генерации in vitro функционально полноценных ДК при данной патологии. Незрелые дендритные клетки характеризуются способностью к активному захвату антигена, при снижении этой способности при созревании дендритных клеток. Цитокины, используемые для дифференцировки дендритных клеток, антиген ESAT-6 и стимул терминальной дифференцировки LPS не оказывают цитотоксического эффекта на генерируемые клетки и не стимулируют процессы апоптоза и поддерживают клетки в состоянии дифференцировки.

При совместном культивировании зрелых аутологичных дендритных клеток и аутологчных мононуклеарных клеток пациентов, больных туберкулезом легких происходит эффективная активация эффекторных функций мононуклеарных клеток. Это проявляется в появлении пула активированных IFN-у-продуцирующих клеток, усилении продукции IFN-y и стимуляции антиген-стимулированной продукции перфорина в ответ на специфический антиген М. tuberulosis ESAT-6. Дендритные клетки, которым не представлялся антиген ESAT-6 актвируют механизмы неспецифической активации иммунокомпетентных клеток в ответ на специфический антиген ESAT-6. Использование рекомбинантного IL-18 приводит к повышению количества ESAT-6-стимулированных IFN-у-продуцирующих клеток и максимальной продукции IFN-y мононуклеарными клетками. Зрелые аутологичные ДК вне зависимости от антигенной нагруженности и присутствия IL-18 не стимулируют продукцию IL-4, что свидетельствует об эффективности применения ДК для индукции Thl иммунного ответа в ответ на специфический антиген М. tuberulosis ESAT-6. На основании полученных данных был разработан способ повышения эффективности антиген-специфического иммунного ответа in vitro путем усиления взаимодействия иммунокомпетентных клеток с помощью антиген-активированных аутологичных дендритных клеток и интерлейкина-18 в культуре мононуклеарных клеток.