Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Адренергическая регуляция иммунной системы при стрессе и взаимодействие агонистов адренорецепторов с глюкокортикоидами in vitro

005001737

ШИЛОВ Дмитрий Юрьевич

АДРЕНЕРГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРИ СТРЕССЕ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АГОНИСТОВ АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ С ГЛЮКОКОРТИКОИДАМИ IN VITRO

14.03.09 Клиническая иммунология, аллергология

1 О НОЯ 2011

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Пермь-2011

005001737

Работа выполнена в лаборатории экологической иммунологии и лаборатории биохимии микроорганизмов Учреждения Российской академии наук Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Пермь

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор,

академик РАН и РАМН Черешнев Валерий Александрович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Фурман Евгений Григорьевич доктор медицинских наук Гусев Евгений Юрьевич

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Защита состоится 2011 г. в часов на заседании

диссертационного совета ДМ ОО^.019.01 в Учреждении Российской академии наук Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13. Факс (342) 244 67 11.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан "¿У"

2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук , Ма

Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Адренергические соединения и глюкокорти-коиды, обладая выраженной иммуномодулирующей активностью, определяют уникальные иммунные сдвиги на местном и системном уровне, связанные с процессами адаптации [Козлов В.А. и др., 1982; Корнева Е.А. и др., 1988, 1998; Абрамов В.В.,1988, 1991, 1996; Рыбакина Е.Г., 2001; Хаитов P.M., 2001; Sanders V.M., 2006; Elenkov I.J., Chrousos G.P., 2006; Besedovsky И.О., del Rey A., 2007; Riether С. et al., 2011]. В условиях целостного организма катехоламины и глю-кокортикоиды проявляют выраженный синергизм, в основе которого могут лежать, с одной стороны, индуцированные глюкокортикоидами изменения экспрессии адренорецепторов и трансдукции с них сигнала в различных клетках-мишенях [Hancox R.J., 2006; Johnson M., 2004; Black J.L. et al., 2009], а с другой - модуляция катехоламинами экспрессии глюкокортикоидных рецепторов [Warner A. et al., 2010]. Тем не менее, описано и ингибирование агонистами ß-адренорецепторов передачи сигнала через глюкокортикоидные рецепторы [Nielson С.Р., Hadjokas N.E., 1998; Anderson G.P., 2000; Tse R. et al, 2003].

Функциональные последствия реализации взаимодействия глюкокорти-коидов и катехоламинов на уровне иммунной системы изучены недостаточно. Показано, что при введении крысам антагониста ß-адренорецепторов пропрано-лола гидрохлорида отменяется супрессивное действие 6-часового иммобилиза-ционного стресса на реакцию гиперчувствительности замедленного типа [Shilov Ju.I. et al., 2001], развивается выраженная активация функций циркулирующего пула фагоцитирующих клеток [Shilov Ju.I., Orlova E.G., 2003]. Введение крысам или мышам ß-адренергических блокаторов значительно нивелирует послеоперационную депрессию цитотоксической активности NK-клеток и снижает усиление метастазирования перевиваемых опухолей после экспериментальных оперативных вмешательств [Melamed R. et al., 2005; Glasner A. et al., 2010], отменяет супрессию пролиферативного ответа лимфоцитов при хирургическом стрессе [Nelson С.]., Lysle D.T., 1998]. Введение пропранолола гидрохлорида значительно снижает степень выраженности иммуносупрессивного действия гидрокортизона в периоде индукции и эффекторную фазу локального иммунного ответа на антителообразование в регионарном лимфатическом узле и развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа, нивелирует индуцированные введением гидрокортизона в эффекторную фазу иммунного ответа изменения функций фагоцитирующих клеток [Шилов С.Ю. и др., 2004, 2006; Shilov Ju.I. et al., 2005]. Показано участие адренергической регуляции во взаимосвязи с глюкокортикоидами в развитии стрессорной супрессии пролиферативного ответа лимфоцитов на фитогемагглютшшн в раннем травматическом периоде у пациентов с проникающим ранением глаза [Черешнев В.А. и др., 2010а, 20106].

В связи с тем что пропранолола гидрохлорид может частично проникать через гематоэнцефалический барьер [Pardridge W.M. et al., 1984; Johnson J.D. et al., 2008], представлялось целесообразным оценить иммуномодулирующее действие при стрессе антагониста ß-адренорецепторов периферического действия -соталола гидрохлорида. Ввиду комплексности нейроэндокринноиммунной регуляции в условиях целостного организма являлось необходимым сопоставление данных, полученных in vivo, с результатами моделирования взаимодействия адренергических соединений и глюкокортикоидов в иммуномодуляции в системе in vitro в культурах клеток практически здоровых людей.

Цель работы - исследование адренергической регуляции иммунной системы при стрессе и взаимодействия агонистов адренорецепторов с глюкокорти-коидами в системе in vitro.

Задачи исследования

1. Изучить иммуномодулирующее действие антагониста ß-адренорецепторов сатолола гидрохлорида при остром стрессе у крыс (24-часовая иммобилизация в сочетании с дозированной кровопотерей) в условиях развития локальной и системной форм иммунного ответа.

2. Оценить in vitro эффекты тербуталина сульфата на фагоцитарную активность нейтрофилов, моноцитов, эозинофилов интактных крыс и влияние адреналина гидрохолорида и гексопреналина сульфата на фагоцитарную активность нейтрофилов крыс в ранний период острого стресса и при блокаде ß-адренорецепторов.

3. Исследовать взаимодействие глюкокортикоидов и агонистов ß-, щ- и сь-адренорецепторов в системе in vitro в регуляции пролиферативного ответа лимфоцитов в культурах с Т- и B-клеточными митогенами и продукции иммуноглобулинов в культурах клеток практически здоровых людей-добровольцев с мито-геном лаконоса.

Научная новизна. На основании комплексного иммунологического исследования с экспериментальным моделированием общего адаптационного синдрома в условиях блокады периферических ß-адренорецепторов in vivo и анализом взаимодействия агонистов адренорецепторов и глюкокортикоидов в системе in vitro обоснована роль адренергической регуляции в изменении функций клеток иммунной системы при стрессе. Показано, что введение антагониста ß-адренорецепторов периферического действия соталола гидрохлорида при остром стрессе, развивающемся при 24-часовой иммобилизации в сочетании с дозированной кровопотерей, отменяет супрессию антителогенеза в селезенке при системном иммунном ответе и депрессию реакции гиперчувствительности замедленного типа при развитии локальной и системной форм иммунного ответа. Острый стресс и соталола гидрохлорид не влияют на антителообразование в регионарном лимфатическом узле при локальном иммунном ответе. Установлено,

что блокада периферических Р-адренорецепторов соталолом гидрохлоридом in vivo отменяет угнетающий эффект в системе in vitro адреналина гидрохлорида и гексопреналина сульфата на фагоцитарную активность нейтрофилов в ранний период общего адаптационного синдрома. Показано, что выраженность супрессивного эффекта адреналина гидрохлорида и селективных агонистов Р-, аг и а2-адренорецепторов и направленность их взаимодействия с глюкокортикоидами (усиление эффекта или антагонизм) в культурах с конканавапином А зависят от концентрации митогена, типа вовлекаемых в регуляцию стероидных адренало-вых и адренергических рецепторов. Установлено, что гидрокортизон, дексаме-тазона фосфат и адренергические агонисты статистически значимо не влияют на пролиферативный ответ лимфоцитов и продукцию иммуноглобулинов М и G в культурах с тимусзависимым поликлональным активатором В-лимфоцитов ми-тогеном лаконоса.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты работы расширяют представление о роли адренергической регуляции в изменении функций клеток иммунной системы при стрессе, взаимодействии агонистов ад-ренорецепторов и глюкокортикоидов в регуляции реакций неоиммунитета. Полученные данные необходимы для прогнозирования иммуномодулирующих эффектов адренергических соединений и глюкокортикоидов при их совместном применении в терапии, в том числе экстремальных состояний.

Результаты исследований используются в лекционных курсах «Иммунология», «Экспериментальные модели в патологии», «Иммунопатология», «Ней-роэндокринная регуляция иммуногенеза» кафедры микробиологии и иммунологии ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» (614600, г. Пермь, ул. Букирева, 15), при чтении лекций и на практических занятиях на кафедре иммунологии ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. академика Е.А. Вагнера» Минздравсоц-развития РФ (614000, г. Пермь, ул. Петропавловская, 26).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Введение антагониста p-адренорецепторов периферического действия соталола гидрохлорида при остром стрессе, вызванном 24-часовой иммобилизацией в сочетании с дозированной кровопотерей, приводит к отмене супрессии антителогенеза в селезенке при системном иммунном ответе и угнетения реакции гиперчувствительности замедленного типа при моделировании локальной и системной форм иммунного ответа. Острый стресс и соталола гидрохлорид не влияют на антителообразование в регионарном лимфатическом узле при локальном иммунном ответе.

2. Селективный агонист p-адренорецепторов тербуталина сульфат оказывает зависящий от концентрации агониста супрессивный эффект на фагоцитарную активность лейкоцитов крыс, наиболее выраженный по отношению к ней-

трофилам и моноцитам. Блокада периферических p-адренорецепторов сотало-лом гидрохлоридом in vivo отменяет угнетающий эффект в системе in vitro адреналина гидрохлорида и гексопреналина сульфата на фагоцитарную активность нейтрофилов в ранний период общего адаптационного синдрома.

3. Выраженность супрессивного эффекта адреналина гидрохлорида и селективных агонистов р-, а,- и а2-адренорецепторов в культурах с конканавали-ном А и направленность их взаимодействия с глюкокортикоидами в виде усиления эффекта или антагонизма зависят от концентрации митогена, типа вовлекаемых в регуляцию стероидных адреналовых и адренергических рецепторов. Гидрокортизон, дексаметазона фосфат и адренергические агонисты статистически значимо не влияют на пролиферативный ответ лимфоцитов и продукцию иммуноглобулинов М и G в культурах с тимусзависимым поликлональным активатором В-лимфоцитов митогеном лаконоса.

Апробация работы и основные публикации. Основные положения работы были представленны на конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» Пермь, 1999; Объединенном иммунологическом форуме (IV Съезд иммунологов России, IX Конгресс РААКИ, IV Конференция РЦО, III Конференция по иммунологии репродукции, XII Всероссийский форум «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»), Санкт-Петербург, 2008; VII Международной конференции «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет 1СЕР 2008», Пермь - Н. Новгород - Пермь, 2008.

По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них 4 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Диссертационная работа апробирована на расширенном заседании научной проблемной комиссии по клинической иммунологии, аллергологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (Пермь, 2011).

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 191 стр. машинописного текста, содержит 48 таблиц и 10 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 301 источник, из них 91 отечественный и 210 зарубежных.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований по теме «Исследование механизмов регуляции иммунитета, создание и усовершенствование методов его контроля» (номер госрегистрации 01200807513). Исследования поддержаны грантами РФФИ 08-04-00424-а, 08-04-00517-а и 10-04-96092-р-Урал-а, Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. Экспериментальные исследования в системе in

vivo выполнены на 136 половозрелых нелинейных белых крысах-самцах. Исследования в системе in vitro проведены на мононуклеарных лейкоцитах периферической крови, полученной от 19 практически здоровых мужчин-добровольцев в возрасте от 19 до 27 лет (средний возраст - 21 год). В результате исследования вегетативного тонуса по методу A.M. Вейна с соавт. [1991] лиц с резко выраженным преобладанием симпатических или парасимпатических реакций в обследуемой группе обнаружено не было.

Для оценки иммуномодулирующего действия стресса и фармакологической блокады ß-адренорецепторов при развитии локального и системного иммунного ответа использовали следующую схему эксперимента. У животных 1-й группы моделировали острый стресс 24-часовой иммобилизацией в положении на спине в пластиковых фиксаторах в сочетании с дозированной кровопотерей (забор по 1,5 мл крови из сосудов хвоста до иммобилизации, через 6 и 24 ч от ее начала). Крысам 2-й группы трехкратно с интервалом 12 ч вводили внутрибрю-шинно антагонист ß-адренорецепторов периферического действия соталола гидрохлорид («Sotalex», Bristol-Myers Squibb, Франция) по 5 мг/кг массы тела. Животным 3-й группы на фоне стресса (24-часовая иммобилизация и дозированная кровопотеря) по той же схеме вводили соталола гидрохлорид (1-я инъекция за 30 мин до начала иммобилизации). Крысам 4-й группы (контроль) вводили по той же схеме изотонический раствор NaCl. Сенсибилизацию для индукции локального иммунного ответа, развивающегося преимущественно на территории регионарного лимфатического узла, осуществляли введением 1x10 эритроцитов барана (ЭБ) подкожно в подошвенную поверхность правой стопы, а для индукции системного иммунного ответа с вовлечением в антителообразо-вание преимущественно селезенки - внутрибрюшинным введением 1x10' ЭБ. Антиген в обоих случаях вводили крысам 1-й и 3-й групп сразу после повторного забора крови через б ч от начала иммобилизации, а животным 2-й и 4-й групп - через 6,5 ч после первой инъекции соталола гидрохлорида или изотонического раствора NaCl. На 4-е сутки после сенсибилизации всем животным вводили разрешающую дозу антигена (1х109 ЭБ подкожно в подошвенную поверхность правой стопы, 0,1 мл изотонического раствора NaCl - левой). При выборе схемы иммунизации учитывали результаты исследования зависимости выраженности гуморального ответа и реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) от дозы и способа введения ЭБ мышам [Гусев Е.Ю., 1996] и крысам [Кеворков H.H. и др., 1993; Shilov Ju.I. et al., 2001, 2005]. Для выбора дозы антигена, использовавшейся для сенсибилизации на модели системного иммунного ответа, проведено дополнительное исследование зависимости выраженности гуморального ответа и реакции ГЗТ от дозы антигена при его внутрибрюшинном введении. Животным 1 -й группы для сенсибилизации при индукции системного иммунного ответа вводили 106 ЭБ, а 2-й, 3-й, 4-й и 5-й групп - соответственно 107,

10s, 109,Ю,0ЭБ внутрибрюшинно.

Через 24 ч после введения разрешающей дозы антигена (5-е сутки эксперимента) животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом. Оценивали выраженность воспаления при реакции ГЗТ путем регистрации толщины (инженерным микрометром) опытной и контрольной стопы [Toichi Е. et al., 1997; Shilov Ju.I. et al., 2001,2005], гуморальный ответ - по числу антителообра-зующих клеток (АОК) в регионарном (правом подколенном) и отдаленном (левом подколенном) лимфатических узлах, а также селезенке методом локального гемолиза в геле агарозы [Jerne N.K., Nordin A.A., 1963; White K.L. et al., 2010] в модификации [Shilov Ju.I. et al., 2005] и по уровню антител в плазме крови в реакции активной гемагглютинации [Silberman D.M. et al., 2004; Guan H. et al., 2009], число ядросодержащих клеток (ЯСК) в органах лимфомиелоидного комплекса общепринятым методом. Образцы крови, полученные в динамике эксперимента из сосудов хвоста, использовали для определения числа эритроцитов, лейкоцитов, показателей лейкоформулы общепринятыми методами, уровня гемоглобина гемиглобинцианидным методом, фагоцитарной активности лейкоцитов [Каплин В.Н., 1996; Shilov Ju.I., Orlova E.G., 2003], оценки в плазме крови иммуноферментным методом уровней кортикостерона («Correlate-EIA Corticosterone», США), кортизола (ООО «Хема-Медика», Россия) и дегидроэпи-андростерона сульфата (ООО «Хема-Медика», Россия). Для оценки влияния агонистов адренорецепторов in vitro на фагоцитарную активность лейкоцитов крови крыс смешивали 25 мкл крови с 12,5 мкл адреналина гидрохлорида (10"6 М, ФГУП «Московский эндокринный завод», Россия), гексопреналина сульфата (10~6М, «гинипрал®», Nycomed, Австрия) или тербуталина сульфата (Ю 6, Ю'10 М «бриканил», ASTRA, Венгрия) на забуференной среде (ЗС, среда 199 с добавлением 10 мМ HEPES и 2 мМ L-глутамина) или с 12,5 мкл ЗС (контроль). После инкубации при 37°С в течение 60 мин вносили по 12,5 мкл формалинизирован-ных эритроцитов барана (200x106 клеток/мл на ЗС) и через 20 мин инкубации при 37°С готовили препараты для микроскопии.

Мононуклеарные лейкоциты для исследования в системе in vitro выделяли в градиенте плотности фиколл-верографина (d=l,077 г/см3). Пролиферацию лимфоцитов оценивали в 72-часовых культурах с Т-клеточным митогеном -конканавалином А (Кон A, Boehringer Mannheim GmbH, No.1296779, Германия) в концентрациях 2,5, 10, 20 и 40 мкг/мл и без него, а также в 72- и 120-часовых культурах с тимусзависимым B-клеточным активатором - митогеном лаконоса (PWM, Sigma, L8777, США) в концентрации 2,5 мкг/мл и без него. Каждая культура содержала 2*105 мононукларных клеток в 0,2 мл среды 199 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 10 мМ HEPES, 100 мкт/мл гентамицина сульфата и 10% аутоплазмы на лунку круглодонного 96-луночного планшета. Метил-3Н-тимидин (Радиевый институт им. В.Г. Хлопина, Санкт-Петербург) вносили по 1

мкКи за 24 ч до окончания культивирования. Уровень радиоактивности оценивали на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Guardian» WinSpectral DSA 1414-03 («Wallac», Финляндия). Продукцию иммуноглобулинов М и G (IgM и IgG) исследовали в 288-часовых культурах мононуклеарных клеток с 2,5 мкг/мл PWM. Культивирование проводили по вышеописанному методу, но вместо ау-топлазмы использовали 10% сыворотку крови плодов коровы (SUS-B10L, Био-лот, Россия). В супернатантах определяли концентрацию IgM и IgG иммуно-ферментным методом (тест-системы ЗАО «Вектор-Бест», Россия). Для оценки взаимодействия агонистов стероидных адреналовых и адренергических рецепторов в регуляции пролифератнвного ответа лимфоцитов и продукции IgM и IgG in vitro в культуры вносили одномоментно с митогеном в разных комбинациях следующие соединения: агонист стероидных адреналовых рецепторов II типа дексаметазона фосфат (KRKA, Словения) и агонист стероидных адреналовых рецепторов I и И типов гидрокортизон (Sigma, Н-0888, США) в концентрациях 10~6 и 10"7 М для культур с PWM и I0"6 М для культур с Кон А; агонист всех типов адренорецепторов адреналина гидрохлорид (1(Гб М, ФГУП «Московский эндокринный завод», Россия), агонист ß-адренорецепторов гексопреналина сульфат (106 М, «гинипрал®», Nycomed, Австрия), агонист осг адренорецепторов фенилэфрина гидрохлорид (10~6М, «мезатон», Опытный завод ГНЦЛС, Харьков, Украина), агонист а2-адренорецепторов клонидина гидрохлорид (10" М, «клофелин», ОАО «Дальхимфарм», Россия). Контролем служили культуры без препаратов. Использованные концентрации глюкокортикои-дов сопоставимы с их уровнем при сильном стрессе [McGhee J.R. et al., 1999; Djordjevic J. et al. 2010], а адренергических соединений - с концентрацией кате-холаминов в органах лимфомпелоидного комплекса [del Rey А. et al., 1981; Ro-gausch H., etal. 2004].

Статистический анализ результатов проводили с использованием методов описательной статистики, одно- и двухфакторного дисперсионного анализа и апостериорного критерия Дункана для множественного сравнения между группами. Результаты в большинстве таблиц и рисунков представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±гп). Данные по числу АОК, пролиферации лимфоцитов, продукции IgM и IgG с учетом их log-нормального распределения предварительно преобразовывали в значения logio соответствующих показателей, а уровня антител - в log2 обратных титров. Для оценки связи между показателями использовали методы параметрического (по Пирсону) и непараметрического корреляционного анализа (по Спирмену и Кендаллу). Для оценки различий связанных попарно данных использовали при множественных сравнениях критерий Дункана для парных данных, а для двух попарно связанных выборок - парный ¿-критерий Стьюдента. Двухфакторный дисперсионный анализ для парных данных проведен совместно с доцентом кафедры при-

кладной математики Пермского национального исследовательского политехнического университета А.Р. Дывыдовым по разработанному им алгоритму. Различия или показатели связи считались статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Влияние соталола гидрохлорида при остром стрессе на антителообразование и реакцию гиперчувствительностн замедленного типа при локальной и системной формах иммунного ответа

Экспериментальная модель фармакологической блокады (1-адренорецепторов при остром 24-часовом шшобтизациониом стрессе в сочетании с дозированной кровопотерей при локальном иммунном ответе

Установлено, что дозированная кровопотеря, использованная для усиления стрессорного воздействия 24-часовой иммобилизации, приводит к снижению количества эритроцитов и уровня гемоглобина в крови. У животных 1-й группы число эритроцитов в исходном фоне составляет 6976000±325027, через 24 ч - 5632000±141082, на 5-е сутки - 5688000±300329 клеток/мкл, а концентрация гемоглобина в исходном фоне - 127,10±8,65, через 24 ч - 89,21±3,52, на 5-е сутки - 96,46±3,13 г/л (р<0,05 к исходному фону в оба срока для обоих показателей по парному критерию Дункана). У крыс 3-й группы число эритроцитов в исходном фоне составляет 7196000±214617, через 24 ч - 5440000±276100, на 5-е сутки - 5872000±396464 клеток/мкл, а концентрация гемоглобина в исходном фоне - 132,46±8,04, через 24 ч - 86,93±5,97, на 5-е сутки - 99,87±5,16 г/л (¿><0,05 к исходному фону в оба срока для обоих показателей по тому же критерию). Статистически значимых различий между показателями животных 1-й и 3-й групп не выявлено, что указывает на развитие у них умеренно выраженной постгеморрагической анемии одинаковой степени выраженности, которую можно рассматривать как фактор, усиливающий острое стрессорное воздействие.

Установлено, что уровень кортикостерона значительно увеличивается через 6 и 24 ч от начала иммобилизации у крыс 1 -й и 3-й групп, степень выраженности повышения этого гормона у крыс обеих групп статистически значимо не отличается между собой (рис. 1). Особенности экспрессии гена СУР17А1 определяют различия уровней кортикостерона и кортизола у взрослых грызунов и людей: у первых выше концентрация кортикостерона, у вторых - кортизола рЧ^еШ Б.е/ я/.,2006, ОЫг V. е1 а1, 2007, Missaghiatl Е. е1 а1., 2009]. Мутации гена СУР17А1 у людей Кавказского региона приводят к значительному повышению продукции кортикостерона [ОЫг V. е/ а1„ 2007]. Хотя изменение уровня кортизола у крыс в классических моделях острого стресса ранее не оценивалось, показано увеличение концентрации этого гормона у крыс при травме спинного мозга [Сегк1 А.К. е/ а!., 2009]. Значительное повышение концентрации кортизола у крыс (до 200 нг/мл), совпадающее с увеличением уровня мРНК 17-гид-

Уровень кортикостерона, нг/мл Уровень кортизола, нг/мл

Рис. 1. Изменение концентрации кортикостерона и кортизола в плазме крови крыс при остром стрессе (сплошная линия) и остром стрессе на фоне введения соталола гидрохлорида (пунктирная линия) в периоде индукции локального иммунного ответа.

По оси абсцисс: К - объединенный исходный фон; 6, 24 и 120 - время от начала иммобилизации, ч.; * — <0,05 по критерию Дункана к объединенному исходному фону.

роксилазы и размеров ретикулярной зоны коры надпочечников, а также концентрации андростендиона и 17-ОН-прогестерона отмечается и на 16-20-й дни по-стнатального периода и расценивается [Pignatelli D. et al., 2006] как проявление адренархе. В связи с тем что по степени выраженности действия на клетки крыс in vitro кортизол намного более активен, чем кортикостерон [McMaster A. et al., 2008], нами проведена оценка изменения концентрации и этого гормона. Установлено, что статистически значимое увеличение концентрации кортизола в условиях острого стресса регистрируется только через 24 ч, на фоне блокады р-адренорецепторов при остром стрессе происходит более быстрое увеличение уровня гормона, а на 5-е сутки концентрация кортизола уменьшается до показателей, близких к исходному фону (см. рис. 1). При изучении острого стресса необходимо учитывать действие дегидроэпиандростерона как антагониста глюко-кортикоидных гормонов, оказывающего защитное действие в условиях угнетения иммунной системы [Robinzon В., Cutolo М., 1999; Hazeldine J. et al., 2010]. Установлено, что уровень его метаболита - дегидроэпиандростерона сульфата -в плазме крови всех групп экспериментальных животных существенно не меняется (/»0,05 к контролю по критерию Дункана; данные не приводятся).

Развитие иммунного ответа при подкожной иммунизации сопровождается значительным увеличением клеточности регионарного лимфатического узла в сравнении с отдаленным (р<0,05 внутри каждой из групп при оценке по парному /-критерию Стьюдента), по-видимому, за счет рекрутирования иммуноком-петентных клеток и их пролиферации in situ [Drayson М.Т. et al., 1981; Martin-Fontecha A. et al., 2003]. Уровень антителообразования в регионарном лимфатическом узле на фоне всех экспериментальных воздействий при развитии иммунного ответа в условиях подкожной сенсибилизации существенно не изменя-

ется (табл. 1). Острый стресс приводит к значительной супрессии развития реакции ГЗТ. Введение соталола гидрохлорида животным 3-й группы полностью отменяет стрессорное угнетение реакции ГЗТ, в то время как у нестрессирован-ных крыс 2-й группы препарат не влияет на выраженность воспаления.

Таблица 1

Влияние острого стресса и блокады р-адренорецепторов соталола гидрохлоридом в периоде индукции локального иммунного ответа на число АОК в регионарном лимфатическом узле и выраженность реакции ГЗТ

Груп- Эксперимен- Число АОК в регионарном Выраженность реакции

па тальное лимфатическом узле ГЗТ

воздействие на 106 ЯСК, на орган, разность, индекс реак-

log 10 log 10 мм ции, %

1 Стресс 2,2229±0,1328 3,5492±0,1454 0,11±0,04" 2,60±1,0Г

(167,09) (3541,42)

2 Соталол 2,0534±0,1009 3,2841±0,1239 0,32±0,05а 7,47±1,24а

(113,09) (1923,67) 0,37±0,06*а 8,62±1,51*а

3 Стресс+ 2,0192±0,1316 3,2457±0,1307

соталол (104,51) (1760,87)

4 Введение рас- 2,3300±0,0674 3,6373±0,1399 0,36±0,04 8Д4±0,86

творителя (213,78) (4338,22)

Примечание. Число животных в каждой группе равно 10; в скобках - средняя геометрическая числа АОК; * - р<0,05 по критерию Дункана к 4-й группе; то же к 1 -й группе.

Выявленные закономерности подтверждаются при двухфакторном дисперсионном анализе (рис. 2). В сравнении с ранее опубликованными данными по отмене супрессии реакции ГЗТ пропраналолом гидрохлоридом в условиях 6-часового иммобилизационного стресса [Shilov Ju.I. et al., 2001], полученные нами результаты, с одной стороны, указывают на то, что блокада ß-адренорецепторов способна отменять супрессию реакции ГЗТ и при более тяжелой форме стресса, а с другой - на то, что этот эффект реализуется через периферические ß-адренорецепторы, т.к. соталола гидрохлорид не проникает через гематоэнцефалический барьер [Schneider A.M. et al., 2000]. Поскольку введение только ß-адреноблокатора не влияет на реакцию ГЗТ, этот эффект может быть связан с ранее описанным [Taylor D.R., Hancox R.J., 2000; Anderson G.P., 2000] повышением под действием глюкокортикоидов экспрессии ß-адренорецепторов и/или трансдукции с них регуляторного сигнала. С учетом данных литературы [Takahashi H.K. et al., 2003] о способности ß-адренергиче-ских агонистов в системе in vitro угнетать продукцию IL-18 и зависимых от него цитокинов (IL-12, TNF-a, IFN-7), играющих ключевую роль в развитии реакций ГЗТ, полученные в настоящей работе результаты подтверждают важное значение в условиях in vivo повышения чувствительности иммуноцитов к супрессив-

й 0,4

0,6

0,5

Рис. 2. Результаты двухфак-торного дисперсионного анализа для показателя разности при реакции ГЗТ.

ЗЕ Соталол 0 0 ЗЕ Соталол 1 Стресс

о

0,0

По оси абсцисс - градации фактора «стресс». Сплошная линяя — градация фактора «соталол»=0; прерывистая линия - градация фактора «соталол»=1. Представлены средние арифметические и доверительный интервал при />=0,05. Д1,36)=4,571; ¿>=0,0394 для фактора «стресс»; /\1,36)=5,531; р=0,0243 для фактора «соталол»; /г(1,36)=9,611; /з=0,0037 для взаимодействия двух факторов.

ному действию эндогенных катехоламинов через (З-адренорецепторы при остром стрессе в угнетении реакции ГЗТ.

Изменения числа АОК в селезенке и отдаленном лимфатическом узле, а также уровня антител при всех экспериментальных воздействиях отсутствуют (р>0,05; данные не приводятся). Стресс и введение нестрессированным животным соталола гидрохлорида не влияют на число ЯСК в костном мозге и тимусе на 5-е сутки от начала стрессорного воздействия (р>0,05; данные не приводятся), что связано со сроком исследования, т.к. максимальная стресс-индуцированная гипоплазия тимуса развивается на стадии тревоги общего адаптационного синдрома, т.е. через 6-24 ч.

Экспериментальная модель блокады /5-адренорецепторов при остром 24-часовом тшобттационном стрессе в сочетании с дозированной кровопотерей при системном иммунном ответе

Перед проведением основного эксперимента исследована зависимость доза-эффект развития при системном иммунном ответе реакции ГЗТ и антитело-продукции при внутрибрюшинной сенсибилизации крыс разными дозами эритроцитов барана (ЭБ). Хотя этот аспект детально изучен для разных линий мышей [Гусев Е.Ю., 1996], у крыс подобная зависимость исследована недостаточно. Установлено, что увеличение дозы антигена приводит к увеличению числа АОК в селезенке и уровня антител в плазме крови (рис. 3). При сопоставлении с локальным иммунным ответом обращает на себя внимание более высокий уровень абсолютного числа АОК в селезенке при внутрибрюшинной сенсибилизации даже самой низкой из исследованных доз антигена - 10б ЭБ (при системном ответе средняя геометрическая числа АОК: 1191,47; 1о§10 числа АОК: 3,0761 ±0,0887, а при локальной форме у животных контрольной группы - средняя геометрическая числа АОК: 209,47; 1о§]0 числа АОК: 2,3211±0,2240;

Рис. 3. Зависимость антите-лообразования и реакции ГЗТ от дозы антигена при сенсибилизации у крыс.

По оси абсцисс - доза эритроцитов барана для сенсибилизации (log(0 числа эритроцитов на животное); по левой оси ординат — выраженность воспаления при реакции ГЗТ по показателю индекса реакции (%) и уровень антител в плазме крови (log2 обратного титра антител); по правой оси ординат -

^гот . V/ „ средняя геометрическая числа АОК на

-♦-ГЗТ -к- Уровень антител АОК в селезенке ^

селезенку.

р=0,00574 между группами по /-критерию Стьюдента). Тем не менее, за счет ан-тителопродукции в регионарном лимфатическом узле уровень антител при внутрибрюшинной сенсибилизации животных 106 ЭБ (см. рис. 3) сопоставим с регистрируемым у крыс контрольной группы при локальном ответе (log2 обратного титра антител: 3,200±0,249; /»0,05 по отношению к системному ответу по ¿-критерию Стьюдента).

Максимальный и одинаковый по степени выраженности уровень реакции ГЗТ отмечен в диапазоне доз антигена: 106-107-108 ЭБ. Статистически значимая супрессия реакции ГЗТ регистрируется при сенсибилизации крыс в дозе 10 ЭБ. Развитие супрессии реакции ГЗТ может быть связано с формированием в селезенке клонов Т-лимфоцитов, способных к антигенспецифичной супрессии ГЗТ на территории регионарного лимфатического узла [Гусев Е.Ю., 1996], а также со взаимным антагонизмом дифференцировки наивных предшественников Т-хелперов в зрелые Thl- и ТЬ2-клетки [Ismail N., Bretscher P.A., 1999; Liew F.Y., 2002]. Важную роль может играть образование индуцибельных Treg-клеток и их взаимодействие с наивными Т-хелперами и с образующимися из них Th9-, Thl7-, TfH-клетками [Mills K.H.G., 2004; Corthay A., 2009; Wan Y.Y., Flavell R.A., 2009; Locksley R.M., 2009; Zotos D. et ai, 2010], но конкретные механизмы нуждаются в дальнейшем исследовании. Для дополнительной характеристики взаимоотношения между выраженностью антителообразования и реакции ГЗТ нами проведен корреляционный анализ. В результате выявлены статистически значимые отрицательные корреляционные связи между показателями выраженности реакции ГЗТ и антителообразования (данные не приводятся). Корреляционные связи между показателями уровня антител в крови и количества АОК в селезенке положительные (/?<0,05; данные не приводятся), что указывает на ведущую роль антителообразования в селезенке для повышения уровня антител

12

♦— —♦-- / -

--я— —в-Я-—

800000 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 о

10

при системном иммунном ответе. С учетом необходимости исследования влияния стресса и соталола гидрохлорида на реакцию ГЗТ выбрана доза антигена для сенсибилизации - 107 эритроцитов, при которой, с одной стороны, индуцируется выраженная реакция ГЗТ, а с другой - антителообразование в селезенке со слабой, но постоянной степенью выраженности.

Установлено, что, как и в предшествующей серии экспериментов, дозированная кровопотеря приводит к развитию у животных 1-й и 3-й групп умеренно выраженной постгеморрагической анемии одинаковой степени выраженности (данные не приводятся). Уровни кортикостерона и кортизола в плазме у крыс в условиях острого стресса и при остром стрессе на фоне введения соталола гидрохлорида повышаются через 6 ч и через 24 ч (рис. 4). На 5-е сутки эксперимента уровень кортизола приближается к объединенному исходному фону. При сопоставлении с результатами предшествующей серии экспериментов (см. рис. I) статистически значимых различий в уровне как кортикостерона, так и кортизола в соответствующие сроки между показателями двух серий эксперимента не выявлено, хотя обращает на себя внимание более раннее (статистически значимое в сравнении с контролем уже через 6 ч) повышение уровня кортизола у крыс 1 -й группы (см. рис. 4). Уровень дегидроэпиандростерона сульфата в плазме крови у животных 1-й и 3-й групп не меняется (р>0,05; данные не приводятся).

Уровень кортикостерона, нг/мл 1000

Уровень кортизола, нг/мл

■Стресс

' Стресс+ соталол

Рис. 4. Изменение концентрации кортикостерона и кортизола в плазме крови крыс при остром стрессе (сплошная линия) и остром стрессе на фоне введения соталола гндрохлорнда (пунктирная линия) в периоде индукции системного иммунного ответа.

По оси абсцисс: К - объединенный исходный фон; 6, 24 и 120 - время от начала иммобилизации, ч.; * -<0,05 по критерию Дункана к объединенному исходному фону.

Установлено, что острый стресс в периоде индукции системного иммунного ответа приводит к выраженной супрессии антителообразования в селезенке (табл. 2). Блокада р-адренорецепторов соталолом гидрохлоридом отменяет этот эффект стресса. Выявленные закономерности подтверждаются при двух-факторном дисперсионном анализе, при котором выявлен эффект взаимодейст-

Влияние острого стресса и блокады Р-адренорецепторов в перподе индукции системного иммунного ответа на число АОК в селезенке и выраженность реакции ГЗТ

Груп- Эксперимен- Число АОК в селезенке Выраженность реакции

па тальное ГЗТ

воздействие на 106 ЯСК, на орган, разность, индекс реак-

1оёю мм ции, %

1 Стресс -0,4402±0,0931 2,4458±0,1077 0,17±0,03* 3,66±0,69*

(0,36)* (279,16)*

2 Соталол 0,0594±0,1435 2,9521 ±0,1499 0,32±0,04*а 6,76±0,92*а

(1,15)а (895,60)а

3 Стресс+ 0,2988±0,0954 3,2110±0,0786 0,40±0,06а 8,90±1,36а

соталол (1,99)" (1625,62)а

4 Введение рас- 0,0255±0,1377 2,9412±0,1303 0,53±0,04 11,81±1,02

творителя (1,06) (873,40)

(контроль)

Примечание. Число животных в каждой группе равно 10; в скобках - средняя геометрическая числа АОК; - р<0,05 по критерию Дункана к 4-й группе;а - то же к 1-й группе.

вия двух факторов - «стресс» и «соталол» (/-"(1,36)^8,671; р=0,0056 для показателя числа АОК на 10б ЯСК и /г(1,36)=9,944; р=0,0033 для показателя АОК на селезенку). Острый стресс приводит к значительной супрессии развития реакции ГЗТ у крыс 1-й группы (см. табл. 2). При введении только соталола гидрохлорида крысам 2-й группы отмечено менее выраженное, но статистически значимое угнетение реакции ГЗТ. Введение соталола гидрохлорида животным 3-й группы приводит к повышению степени выраженности реакции ГЗТ до уровня контроля, т.е. при совместном действии двух экспериментальных факторов -стресса и блокатора Р-адренорецепторов — отмечается их выраженный антагонизм, подтверждаемый и двухфакторным дисперсионным анализом, при котором выявлен статистически значимый эффект взаимодействия двух факторов -«стресс» и «соталол» (/г(1,36)=23,337; />=0,0000 для показателя разности; /г(1,36)=24,675; />=0,0000 для показателя индекса реакции).

Установлено, что острый стресс приводит к снижению уровня антител на 5-е сутки иммунного ответа (рис. 5). Введение соталола гидрохлорида полностью отменяет указанные изменения у стрессированных крыс.

Таким образом, острый стресс в периоде индукции иммунного ответа приводит к угнетению выраженности реакции ГЗТ как при локальной, так и при системной его формах, не влияет на антителогенез в регионарном лимфатическом узле при локальном ответе и угнетает антителообразование в селезенке при системном ответе. Введение антагониста Р-адренорецепторов периферичес-

Рис. 5. Влияние острого стресса н блокады (3-адренорецепторов в периоде индукции системного иммунного ответа на уровень антител в плазме крови.

По оси абцисс: log2 обратных титров антител на 5-е сутки иммунного ответа; * -р<0,05 по критерию Дункана по отношению к контролю; а - то же к стрессу, кого действия соталола гидрохлорида отменяет эти изменения, что указывает на участие в их реализации иммуносупрессивных сигналов с периферических р-адренорецепторов в условиях стресса.

Влияние агонистов p-адренорецепторов на фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови крыс в системе in vitro

При сравнительной оценке влияния агониста Р-адренорецепторов тербу-талина сульфата в концентрациях 1(У6 и Ю~10 М на фагоцитарную активность нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов периферической крови интактных крыс in vitro выявлен статистически значимый и зависящий от концентрации агониста супрессивный эффект, наиболее выраженный по отношению к нейтрофилам и моноцитам (данные не приводятся).

Исследование влияния адреналина гидрохолорида и агониста Р-адренорецепторов гексопреналина сульфата на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови крыс (модель локального иммунного ответа) проведено in vitro в ранний период острого стресса, совпадающий по временным параметрам со стадией тревоги общего адаптационного синдрома по классификации Н. Selye [1936]. Установлено, что преинкубация клеток крови с гек-сопреналином сульфатом у интактных животных (объединенный исходный фон) приводит к выраженному статистически значимому снижению интегральных относительных показателей нейтрофильного фагоцитоза (табл. 3). В отличие от p-адренергического агониста адреналина гидрохлорид in vitro в концентрации 1(Гб М не влияет на фагоцитарную активность нейтрофилов интактных животных, что, по-видимому, связано с взаимной уравновешенностью ингиби-рующих (реализующихся через p-адренорецепторы) и стимулирующих (реализующихся через а-адренорецепторы) эффектов [Шилов Ю.И. и др., 2004а, 20046, 2005]. При исследовании влияния гексопреналина сульфата на клетки крови, полученной от крыс через 6 ч от начала иммобилизации, супрессивный эффект Р-адренергического агониста на нейтрофильный фагоцитоз сохраняется, а у адреналина гидрохлорида в этот срок появляется угнетающий эффект. При исследовании эффектов агонистов через 24 ч от начала иммобилизации снижение фагоцитарной активности нейтрофилов под действием гексопреналина

Влияние адреналина гидрохлорида (106 М) и гексопреиалина сульфата (10 б М) in vitro на показатели фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови крыс при остром стрессе и стрессе на фоне блокады р-адренорецепторов соталолом гидрохлорида

Показатели Контроль Адреналина Гексопреналина

гидрохлорид сульфат

Объединенный исходный фон

Ош. число объектов фагоцшоза/нешрофил Отн. число фагоцитирующих клеток, %

035Я),05 24,40±2,80

Стресс, 6 ч

Ош. число объектов фагоцигоза/нейтрофил Отн. число фагоцитирующих клеток, %

0,51±0,11 333*6,07

Стресс, 24ч

От число объектов фагоцитоза/нейтрофил Отн. число фагоцитирующих клеток, %

0,40±0,11 26,09¿6,59

032±0,06 22,55±3,74

0Д9±0,06 21,65±4,40*

0,41±0,12 25,39=6,56

Стресс на фоне блокады p-адренорецепторов, 6 ч

Ош. число объектов фагоцшюзакейтрофил Отн. число фагоцитирующих клеток, %

0,54±0,11 33,88±5,75

0,55±0,07 34,31 ±3,87

Стресс на фоне блокады p-адренорецепторов, 24 ч Отн. число объектов фагоцттэза'нейтрофил 0,42±0,13 0,55±0,08 Отн. число фагоцитирующих клеток, % 27,80^7,18 34,52±4,96

ОД I ±0,04 15,95±3,01 *

0,23=0,05 * 17,90±3,73 *

025±0,08 18,8(ЬЬ5,67*

0,43±0,07 28,0üt3,49

0,40tí),l2 25,97^6,93

Примечание. - р<0,05 по критерию Дункана для парных данных к контролю с 60-минутной преинкубацией при 37°С с забуференной средой.

сульфата in vitro сохраняется, но отменяется супрессивный р-адренергический эффект адреналина гидрохлорида, что, возможно, связано с повышением сигнализации с а-адренорецепторов.

При введении крысам на фоне стресса соталола гидрохлорида отмечается отмена угнетающих эффектов гексопреналина сульфата и адреналина гидрохлорида in vitro на нейтрофильный фагоцитоз через 6 и 24 ч от начала иммобилизации (см. табл. 3).

Таким образом, полученные результаты указывают на наличие фазных изменений чувствительности нейтрофилов к адренергической регуляции, что может быть связано с изменениями экспрессии соответствующих рецепторов и/или трансдукции с них регуляторных сигналов на внутриклеточном уровне.

Взаимодействие глюкокортикоидов и адренергических соединений в системе in vitro при оценке пролнферативного ответа лимфоцитов и продукции иммуноглобулинов

Для исследования взаимодействия глюкокортикоидов и агонистов (3-, аг и аг-адренергических рецепторов в регуляции активации, пролиферации и диффе-

ренцировки Т- и В-лимфоцитов представлялось целесообразным провести изучение изменения пролиферативного ответа лимфоцитов периферической крови практически здоровых людей в культурах с Т-клеточным митогеном конканава-лином А и тимусзависимым поликлональным активатором В-лимфоцитов митогеном лаконоса, а также продукции IgM и IgG в культурах с митогеном лаконо-са в условиях внесения соответствующих соединений в культуры. Для выяснения особенностей реализации взаимодействия с агонистами адренорецепторов глюкокортикоидов при вовлечении разных типов стероидных адреналовых рецепторов проведено сравнительное исследование эффектов селективного агони-ста стероидных адреналовых рецепторов II типа дексаметазона фосфата и неселективного агониста стероидных адреналовых рецепторов I и II типов гидрокортизона (синоним: кортизол).

Результаты исследования взаимодействия глюкокортикоидов и неселективного агониста всех типов адренорецепторов адреналина гидрохлорида в регуляции Кон А-индуцированной пролиферации лимфоцитов in vitro представлены в табл. 5. Установлено, что внесение в культуры адреналина гидрохлорида в концентрации 10"6 М приводит к статистически значимому угнетению пролиферативного ответа лимфоцитов только в культурах с концентрацией Кон А 10 и 40 мкг/мл. Гидрокортизон и дексаметазона фосфат (10"6 М) статистически значимо угнетают пролиферацию лимфоцитов в культурах со всеми концентрациями Кон А. При совместном внесении в культуры адреналина гидрохлорида и гидрокортизона выявляется выраженное усиление иммуносупрессивного действия препаратов, проявляющееся в появлении выраженного снижения уровня пролиферативного ответа лимфоцитов в культурах с Кон А в концентрации 40 мкг/мл. В культурах с субоптимальными концентрациями Кон А (2,5 и 5 мкг/мл) адреналина гидрохлорид снижает выраженность супрессивного действия гидрокортизона. При совместном внесении в культуры адреналина гидрохлорида и селективного агониста стероидных адреналовых рецепторов II типа дексаметазона фосфата выявляется снижение супрессивного действия дексаметазона фосфата в культурах с субоптимальной концентрацией Кон А 2,5 мкг/мл.

Таким образом, направленность взаимодействия неселективного агониста всех типов адренорецепторов адреналина гидрохлорида и глюкортикоидов в регуляции пролиферативного ответа лимфоцитов in vitro зависит от концентрации митогена. При низких концентрациях митогена адреналина гидрохлорид уменьшает или отменяет супрессию пролиферативного ответа лимфоцитов, индуцируемую гидрокортизоном, а при высоких усиливает ее. Подобная зависимость, возможно, связана с особенностями изменения гидрокортизоном функциональной экспрессии аг, а2- и p-адренорецепторов в условиях разной степени выраженности активационного митогенного сигнала [Cosentino М., et al. 2003]. С другой стороны, направленность взаимодействия глюкокортикоидов и

Влияние адреналина гидрохлорида, гидрокортизона и дексаметазона фосфата на пролиферативный ответ лимфоцитов периферической крови практически здоровых людей в культурах с Кон А

Гормон, Адренер- Безмитоге- Кон А, мят/мл

концен- гический на 2,5 5,0 10,0 20,0 40,0

трация агонисг

Гидро- сашни- 3,3461± 3,6603± 3,7296± 3,6008± 3,6467± 3,6788±

кортизон, сгом 0,1113 0,1196 0,1056 0,1089 0,1421 0,2042

10*М (2218,6) (4574,6)ь (5365,7)ь (3988,3)*" (4432,6)*а (4772,8)*аЬ

без агони- 3,2773± 3,3303± 3,3425± 3,6167± 3,8129± 4,0040±

ста 0,1430 0,1497 0,2345 0,1680 0,0667 0,1250

(1893,7) (2139,6)*" (2200,4)*а (4136,7)*а (6499,1)*а (10091,7)*

Дексамета- сашни- 3,3355± 3,5420± 3,5458± 3,5301± 3,6361± 3,5428±

зона фос- сгом 0,1781 0,1011 0,1054 0,1565 0,1640 0,2281

фат, 10*М (2165,4) (3483,4),аЬ (3513,7)*а (3389,3)*" (4326,0)*а (3490,0)*а

без агони- 3,1756± 3,3474± 3,5007± 3,5541± 3,5975± 3,6739±

ста 0,2228 0,1223 0,1367 0,1226 0,1386 0,1501

(1498,4) (2225,2)*" (3167,1)*а (3582,1)*" (3958,4)*а (4719,1)*а

Безглюко- сагони- ЗД968± 3,8335± 3,8312± 3,962&t 4,2289± 4Д637±

коршкои- сгом 0,2057 0,1150 0,1198 0,0821 0,0864 0,0634

дов (1980,5) (68163) (6779,9) (91783)* (16939,1) (18351,2)*

без аго- 3,4776± 3,9111± 3,9781± 4,1960± 4,2180± 4,4970±

ниста 0,1011 0,0839 0,0718 0,0932 0,0776 0,0718

(контроль) (3003,3) (8149,0) (9507,2) (15704,6)а (16520,5) (31401,8)а

Примечание. Здесь и в табл. 6-9: число обследованных людей равно 7; приведены значения М±т для показателей logio имп/мин, а в скобках - средние геометрические ими/мин; —р<0,05 по отношению к контролю по парному критерию Дункана; а - то же по отношению к культурам с внесением только адренергического агониста; ь - то же по отношению к культурам с внесением только глюкокортикоида.

адреналина зависит от типа вовлекаемого стероидного адреналового рецептора. Так, при совместном внесении в культуры с высокой концентрацией Кон А адреналина гидрохлорида и неселективного агониста стероидных адреналовых рецепторов I и II типа регистрируются усиление иммуносупрессивного эффекта, которое отсутствует в отношении агониста II типа.

Однофакторный дисперсионный анализ для парных данных выявил статистически значимое влияние всех градаций экспериментального воздействия во всех вариантах культур с митогеком. При проведении двухфакторного дисперсионного анализа для парных данных (фактор А - адренергическое соединение с градациями: 0 — отсутствие соединения и 1 - его наличие в культуре; фактор В - глюкокортикоид с теми же градациями) выявлен статистически значимый вклад в общую девиацию фактора В «глюкокортикоид» при всех вариантах.

Вклад фактора А «адреналин» статистически значим лишь для культур с гидрокортизоном при концентрации Кон А 40 мкг/мл (F(l,24)=4,69, /?=0,04). Статистически значимое взаимодействие факторов А и В отсутствует (/;>0,05).

Установлено, что внесение в культуры селективного агониста Р-адренорецепторов гексопреналина сульфата без глюкокортикоидов статистически значимо угнетает пролиферацию лимфоцитов только в культурах с концентрацией Кон А 10 мкг/мл (табл. 6). В культурах с самой низкой из субоптимальных концентраций Кон А (2,5 мкг/мл) гексопреналина сульфат нивелирует выраженность супрессивного действия гидрокортизона. В культурах с совместным внесением с дексаметазоном фосфатом гексопреналина сульфат снижает выраженность супрессии при концентрации Кон А 5 мкг/мл. В отличие от адреналина гидрохлорида усиление иммуносупрессии при взаимодействии с глюкокор-тикодами в исследованной экспериментальной системе in vitro отсутствует.

Таблица б

Влияние гексопреналина сульфата, гидрокортизона и дексаметазона фосфата на иролнферативный ответ лимфоцитов периферической крови практически здоровых люден в культурах с Кон А

Гормон, Адренер- Безмито- Кон А, мкг/мл

концен- гический гена 2,5 5,0 10,0 20,0 40,0

трация агонист

Гидро- сашни- 3,1766± 3,6407± 3,4385± 3,7090± 3,8580+ 3,9397±

кортизон, сгом 0,1756 0,0961 0,1790 0,0963 0,0882 0,1049

Ю^М (1501,7)*а (4372,3)ь (2744,6)* (5116,5)* (7211,6)*а (8704,6)*

без агони- 3,2773± 3,3303± 3,3425± 3,6167± 3,8129± 4,0040±

ста 0,1430 0,1497 0,2345 0,1680 0,0667 0,1250

(1893,7)*а (2139,6)*а (2200,4f (4136,7)*® (6499, if (10091,7)*

Дексамета- сагони- 3,4981± 3,4109± 3,6643± 3,5529± 3,8703± 3,9605±

зона фос- сгом 0,1136 0,1505 0,0738 0,1840 0,1457 0,1013

фат, Ю''М (3148,1) (2575,4)*а (4616,6)*аЬ (3572,1)*а (7418,If (9130,4)*

безагони- 3,1756± 3,3474± 3,5007± 3,5541± 3,5975± 3,6739±

ста 0,2228 0,1223 0,1367 0,1226 0,1386 0,1501

(1498,4) (2225,2)*а (3167, if (3582,1)*" (3958,4)*а (4719,1)*

Без глюко- сагони- 3,4626± 3,8534± 3,8537± 3,9555± 4,2283± 4,0987±

кортикои- стом 0,1332 0,0753 0,0485 0,0680 0,0596 0,2760

дов (2901,1) (7134,4) (7139,9) (9025,9)* (16915,6) (12551,8)

без аго- 3,4776± 3,9111± 3,9781± 4,1960± 4,2180± 4,4970±

ниста 0,1011 0,0839 0,0718 0,0932 0,0776 0,0718

(контроль) (3003,3) (8149,0) (9507,2) (15704,6)а (16520,5) (31401,8)

Установлено, что внесение одного агониста агадренорецепторов фени-лэфрина гидрохлорида статистически значимо угнетает пролиферативный ответ только в культурах с внесением 2,5 мкг/мл Кон А (табл. 7). В культурах с со-

вместным внесением гидрокортизона и фенилэфрина гидрохлорида агонист аг адренорецепторов не влияет на степень выраженности иммуносупрессивного эффекта глюкокортикоида. При совместном внесении в культуры агониста аг адренорецепторов и дексаметазона фосфата выявляется значительное усиление выраженности иммуносупрессии при концентрации Кон А 5 мкг/мл.

Таблица 7

Влияние фенилэфрина гидрохлорида, гидрокортизона и дексаметазона фосфата на пролиферативный ответ лимфоцитов периферической крови

практически здоровых людей в культурах с Кон А

Гормон, Адренер- Безмиго- Кон А мкг/мл

концен- гический гена 2,5 5,0 10,0 20,0 40,0

трация ашнисг

Гидро- сагони- 3,4097± 3,5522± 3,5658± 3,6904± 3,7301± 3,8662±

кортизон, сгом 0,1632 0,1111 0,1161 0,1382 0,0893 0,0509

10% (2568,5) (3566,5)* (3679,7)** (4902,1)*3 (5371,8)*а (7348,2)*а

без агони- 3,2773± 3,3303± 3,3425± 3,6167± 3,8129± 4,0040±

ста 0,1430 0,1497 0,2345 0,1680 0,0667 0,1250

(1893,7) (2139,6)*а (2200,4)*а (4136,7)*" (6499,1)*3 (10091,7)*а

Дексамета- сагоюь 3,3257± 3,4005± 3,0045± 3,5745± 3,6281± 3,2385±

зона фос- сгом 0,1409 0,0981 0,2725 0,1494 0,1785 0,3320

фат, 10% (2117,1) (2515,0)*а (1010,4)*аЬ (3753,8)*а (4247,2)*" (1731,6)*а

без агони- 3,1756± 3,3474± 3,5007± 3,5541± 3,5975± 3,6739±

ста 0,2228 0,1223 0,1367 0,1226 0,1386 0,1501

(1498,4)* (2225,2)*3 (3167,1)*а (3582,1)*а (3958,4)*3 (4719,1)*а

Безглюко- сагони- 3,3996± 3,7754± 3,9604± 4,0870± 4,2153± 4,4104±

корткои- сгом 0,0829 0,0938 0,0639 0,0747 0,0971 0,0896

дов (2509,4) (5961,4)* (9127,7) (12216,9) (16415,4) (25726,6)

без аго- 3,4776± 3,9111± 3,9781± 4,1960± 4,2180± 4,4970±

ниста 0,1011 0,0839 0,0718 0,0932 0,0776 0,0718

(контроль] (3003,3) (8149,0)а (9507,2) (15704,6) (16520,5) (31401,8)

При исследовании взаимодействия глюкокортикоидов и селективного агониста а2-адренорецепторов клонидина гидрохлорида установлено, что внесение одного клонидина гидрохлорида приводит к угнетению пролиферации лимфоцитов в культурах с Кон А в концентрации 20 мкг/мл (р<0,05; данные не приводятся). При совместном внесении в культуры клонидина гидрохлорида и гидрокортизона так же, как и в случае с адреналином гидрохлоридом, отмечается статистически значимая отмена угнетения пролиферативного ответа лимфоцитов в культурах с Кон А в концентраций 2,5 мкг/мл. В культурах с дексаметазо-ном фосфатом клонидина гидрохлорид статистически значимо не влияет на степень выраженности иммуносупрессии (р>0,05; данные не приводятся).

Таким образом, направленность эффекта взаимодействия агонистов адре-

норецепторов с глюкокортикоидами зависит от концентрации митогена, типа вовлекаемых стероидных адреналовых и адренергических рецепторов.

При оценке пролиферативного ответа лимфоцитов на тимусзависимый В-клеточный активатор митоген лаконоса (Р\УМ) установлено, что глюкокорти-коиды и все исследованные агонисты адренорецепторов не оказывают влияния на пролиферацию лимфоцитов при культивировании клеток в течение 72 ч и 120 ч (табл. 8). По нашим данным, приведенным выше, в условиях 24-часового

Таблица 8

Влияние гндрокортнзона, дексаметазона фосфата и адренергических соединений на пролифератнвный ответ лимфоцитов периферической крови

практически здоровых людей в культурах с PWM

Препарат, концен- 72-часовые культуры 120-часовые культуры

трация без митогена PWM,2,5 мкг/мл без митогена PWM, 2,5 мкт/мл

Гидрокортизон, 2,8845±02524 3,8502±02654 33520±0,1252 43538±0Д770

10"6М (766,5) (7083,1) (2248,8) (22581,9)

Гидрокортизон, 2,9342±Д2138 3,9241±0Д240 3,334710,1179 4,4450±0,1164

10"7М (859,5) (8397,4) (2161,4) (27858,1)

Дексаметазона 2,8375±0ДЮ7 3,9180±0^291 32996±0,1346 43454±02309

фосфат, 10"6М (687,9) (8278,6) (1993,6) (22149,9)

Дексаметазона 2,9633±0,2182 3,9017102259 32127+0,1788 43593±0,1972

фосфат, 10"7М (919,0) (79742) (1632,0) (22869,9)

Адреналина гид- 3,3741±0,1641 4,14021-02357 33290±03202 43139±02766

рохлорид, 10"6М (23662) (13809,6) (2133,1) (20603,7)

Гексопреналина 3,2571±0,1886 3,9983±02598 33139±029Ю 4,1996±02750

сульфат, 106М (1807,6) (99603) (2060,0) (15833,0)

Фенилэфрина 3,3174^2233 3^678±02181 33746±0,3505 3,8956±03233

гидрохлорид, 106М (2076,9) (9285,6) (23692) (7863,9)

Клонидина гид- 3,0049±0,1749 3,8775±02841 3215(Ш)3220 4,1668±02782

рохлорид, 10"бМ (10113) (75422) (1640,5) (14682,1)

Без препаратов 3,0330±0,1674 4,0713±0,1433 3,4259±0,1710 43344±02257

(контроль) (1109,5) (117832) (2666,5) (21598,7)

Примечание. Число обследованных людей равно 8; остальные обозначения те

же что и в табл. 5.

иммобилизационного стресса в сочетании с дозированной кровопотерей антите-лообразование в регионарном лимфатическом узле, несмотря на выраженную супрессию реакции ГЗТ, существенно не изменяется. При развитии системного иммунного ответа in vivo в той же модели острого стресса выявлено статистически значимое снижение количества антителообразующих клеток в селезенке и титра антител в плазме крови у крыс. По данным литературы, в культурах с PWM глюкокортикоиды могут стимулировать продукцию иммуноглобулинов [Cooper D.A. et al., 1979, 1981а, 1981b; Orson F.M. et al., 1983; Pryjma J. et al,

1989; Shannon E.J, Sandoval F., 2010], не влиять на пролиферацию лимфоцитов [Rupprecht R. et al., 1990-1991; Rupprecht M. et al., 1991] или угнетать продукцию иммуноглобулинов [Pryjma J. et al., 1989] и пролиферацию лимфоцитов [Gordon D., Nouri A.M.E., 1981; Pryjma J. et al., 1989; Rupprecht R. et al., 19901991]. Направленность эффекта глюкокортикоидов in vitro на пролиферацию лимфоцитов и продукцию иммуноглобулинов зависит от целого ряда факторов, в том числе от особенностей экспрессии глюкокортикоидных рецепторов при тех или иных заболеваниях, межклеточных взаимодействий Т- и В-клеток [Orson F.M. et al., 1983; Pryjma J. et al., 1989; Rupprecht R. et al., 1990-1991; Rupprecht M. et al., 1991].

Глюкокортикоиды и агонисты адренорецепторов не влияют на продукцию IgM и IgG в 288-часовых культурах мононуклеарных клеток с PWM (табл. 9). Не выявлено и их взаимодействия в этой системе (данные не приводятся).

Таблица 9

Влияние гидрокортизона и дексаметазопа фосфата на концентрацию иммуноглобулинов клетками периферической крови практически здоровых людей в супернатантах 288-часовых культурах с РХУМ

Препарат, концентрация Концентрация иммуноглобулинов

IgM IgG

Гидрокортизон, 2,6762±0,1244 2,7850±0,2197

10"6М (474,4) (609,5)

Гидрокортизон, 2,6568±0,1442 2,7236±0,1888

10"7М (453,8) (529,2)

Дексаметазона фосфат, 2,6621±0,1414 2,7516±0,1788

10"6М (459,3) (564,4)

Дексаметазона фосфат, 2,6769±0,1313 2,8239±0,2022

10"7М (475,3) (666,6)

Адреналина гид- 2,6260±0,1649 2,6822±0Д633

рохлорид, 10"6М (422,7) (481,1)

Гексопреналина 2,4325±0,2119 2,9226+0,1913

сульфат, 10"6М (270,7) (836,8)

Фенилэфрина 2,7271±0,1650 2,7579±0,1997

гидрохлорид, 10~&М (533,4) (572,7)

Клонидина гид- 2,726б±0,1329 2,8341±0,1719

. рохлорид, 10"6М (532,9) (682,5)

Без препарата 2,6087±0,1417 2,7350±0,2037

(контроль) (406,2) (543,2)

Примечание. Число обследованных людей равно 7; остальные обозначения те же что и в табл. 5.

В целом полученные результаты расширяют представление о роли адре-нергических соединений во взаимосвязи с глюкокортикоидами в регуляции функций клеток иммунной системы при процессах адаптации.

ВЫВОДЫ

1. В условиях экспериментального моделирования общего адаптационного синдрома и блокады периферических p-адренорецепторов in vivo, а также в результате исследования взаимодействия агонистов адренорецепторов и глкжо-кортикоидов в системе in vitro обоснована роль адренергической регуляции в изменении функций клеток иммунной системы при стрессе.

2. Установлено, что введение антагониста p-адренорецепторов периферического действия соталола гидрохлорида при остром стрессе (24-часовая иммобилизация в сочетании с дозированной кровопотерей) приводит к отмене супрессии антителогенеза в селезенке при системном иммунном ответе и угнетения реакции гиперчувствительности замедленного типа при моделировании локальной и системной форм иммунного ответа. Острый стресс и соталола гидрохлорид не влияют на антителообразование в регионарном лимфатическом узле при локальном иммунном ответе.

3. Показано, что селективный агонист p-адренорецепторов тербуталина сульфат оказывает зависящий от концентрации агониста супрессивный эффект на фагоцитарную активность лейкоцитов крыс, более выраженный по отношению к нейтрофилам и моноцитам. Блокада периферических p-адренорецепторов соталолом гидрохлоридом in vivo отменяет угнетающий эффект в системе in vitro адреналина гидрохлорида и гексопреналина сульфата на фагоцитарную активность нейтрофилов в ранний период общего адаптационного синдрома.

4. Установлено, что выраженность супрессивного эффекта адреналина гидрохлорида и агонистов р-, а,- и а2-адренорецепторов в культурах с конкана-валином А и направленность их взаимодействия с глюкокортикоидами в виде усиления эффекта или антагонизма зависят от концентрации митогена, типа вовлекаемых в регуляцию стероидных адреналовых и адренергических рецепторов.

5. Показано, что глюкокортикоиды и адренергические агонисты статистически значимо не влияют на пролиферативный ответ лимфоцитов и продукцию иммуноглобулинов М и G в культурах с тимусзависимым поликлональным активатором В-лимфоцитов митогеном лаконоса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ

1. Шилов Д.Ю., Шилов Ю.И., Черешнев В.А. Влияние соталола гидрохлорида на иммунный ответ при остром стрессе // Вести. Уральской медицинской академической науки. - 2009. - № 2/1 (24). - С. 63-64.

2. Шилов С.Ю., Шилов Ю.И., Шилов Д.Ю., Куделькина В.Г. Половые различия стрессорных изменений иммунного ответа и влияние на них овариэктомии и эстра-диола // Вестн. Уральской медицинской академической науки. - 2010. - № 2/1 (29). -С. 235-236.

3. Шилов Д.Ю., Годовалое А.П., Шилов Ю.И., Юркова Е.В. Влияние агониста бета-адренорецепторов гексопреналина сульфата на пролиферативный ответ лимфоцитов и продукцию иммуноглобулинов в присутствии тироксина и дексаметазона фосфата in vitro // Фундаментальные исследования. - 2011. — № 6. - С. 192-196.

4. Шилов Д.Ю., Черешнев В.А. Влияние агонистов адренорецепторов in vitro на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови крыс при остром стрессе и блокаде Р-адренорецепторов // Вестн. Уральской медицинской академической науки. - 2011. - № 2/1 (35). - С. 77-78.

Материалы международных и всероссийских конференций

5. Шилов Ю.И., Орлова Е.Г., Атнагузина А.Т., Шилов Д.Ю. Влияние адренер-гических соединений и модуляторов цАМФ-зависимого и фосфатидилинозитолового пути на функции фагоцитирующих клеток in vitro // Рецепция и внутриклеточная сигнализация: тез. докл. Междунар. конф. - Пущино, 1998. - С. 63-65.

6. Шилов Д.Ю. Влияние стимуляции бета-адренергических рецепторов тербута-лином сульфатом на фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови крыс в эксперименте in vitro II Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины: Материалы II Российской конф. молодых ученых России с международным участием, 24-28 аир. 2001 г., Москва. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001. - С. 197-198.

7. Шилов С.Ю., Шилов Ю.И., Шилов Д.Ю., Юркова Е.В. Адренергическая регуляция функций иммунной системы при стрессе // VII Междунар. конф. «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет ICEP 2008», 28 сентября - 4 октября 2008. - Пермь-Нижний Новгород, 2008. - С. 76-76.

8. Shilov Ju.I., Shilov D. Ju., Shilov S.Ju., Yurkova E.V. Beta-adrenergic regulation of Amotions of immune system under stress // II International Symposium « Interaction of the Nervous and Immune Systems in Health and Diseases» . June 16 - June 19 2009 Saint Petersburg, Russia: Abstracts. - Petersburg, 2009. - P. 67-67.

9. Шилов Д.Ю., Шилов Ю.И., Шилов С.Ю., Юркова Е.В. Бета-адренергические механизмы регуляции функций иммунной системы при стрессе // Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11, № 4-5. - С. 342-342.

10. Шилов Д.Ю., Шилов Ю.И., Черешнев В.А. Иммуномодулирующие эффекты соталола гидрохлорида при остром стрессе // Дни иммунологии в Сибири: Материалы Всеросс. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвященной 20-летнему юбилею Краснояр. краевого центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями. 1—3 марта 2010 г. — Красноярск: Изд-во КрасГМУ, 2010. — С. 271—273.

11. Шилов Д.Ю., Шилов Ю.И., Черешнев В.А. Иммуномодулирующее действие соталола гидрохлорида при остром стрессе в условиях развития локальной формы иммунного ответа // Вопр. патогенеза типовых патологических процессов: тр. II Всеросс. науч.-практ. конф. с междунар. участием. — Новосибирск, 2010. — С. 427-432.

12. Shilov J.I., Shilov D.J., Shilov S.J., Yurkova E.V. Beta-adrenergic modulation of immune system functions under stress // International Immunology. - 2010. - Vol.22, Sup-pi., Number 1. -PP-012-44.-P. i89-i89.

13. Шилов Ю.И., Шилов С.Ю., Шилов Д.Ю., Куделькина В.Г., Ибрагимова JI.P. Половые стероиды в модуляции иммунного ответа при стрессе // Российский иммунологический журнал. - 2010. - Т. 4(13), № 4. - С. 391-391.

14. Shilov Ju.I, Godovalov А.Р., Shilov D.Ju., Yurkova E.V. Effect of beta-adrenoceptor agonist hexoprenaline sulphate on the proliferative lymphocyte response and immunoglobulin production in the presence of thyroxine and dexamethasone phosphate in

vitro // III International Symposium «Interaction of the Nervous and Immune Systems in Health and Diseases» June 7 - June 10 2011 Saint Petersburg Russia Abstracts. - Petersburg, 2011.-P. 63-63.

Публикации в других изданиях

15. Шилов Ю.И., Шилов Д.Ю. Влияние стимуляции бета-адренергических рецепторов iu vitro тербуталином сульфатом на фагоцитарную активность нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов крыс // Вестн. Перм. ун-та. - 2001. - Вып. 4. - С. 220-226.

16. Шилов Д.Ю. Влияние бета-адренергического агониста тербуталина сульфата на фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови крыс в эксперименте in vitro II Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии: тез. докл. региональной конф. молодых ученых (1S—20 января 1999 г. Пермь, Россия). -Пермь, 1999.-С. 156-156.

Список основных сокращений

АОК - антителообразующие клетки

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа

Кон А - конканавалин А

ЭБ - эритроциты барана

ЯСК - ядросодержащие клетки

lFN-y - интерферон-у (англ. interferon-gamma)

is - иммуноглобулины (англ. immunoglobulins)

IL - интерлейкин (англ. interleukin)

PWM - митоген лаконоса (англ. pokeweed mitogen или lectin from Phytolacca

americana)

TNF-a - фактор некроза опухоли-a (англ. tumor necrosis factor)

Шилов Дмитрий Юрьевич

АДРЕНЕРГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРИ СТРЕССЕ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АГОНИСТОВ АДРЕНОРЕЦЕПТО-РОВ С ГЛЮКОКОРТИКОИДАМИI1V VITRO

АВТОРЕФЕРАТ Лицензия

Подписано в печать 21.10.2011. Тираж 120 экз. Уч. изд. л. 1,0 Формат 60x84/16. Набор компьютерный. Заказ № 694

Отпечатано на ризографе. ООО «Полиграф Сити» 614990, Пермский край, г. Пермь, ул. Ленина, 66 - 222

Актуальность проблемы. Адренергические соединения и глюко-кортикоиды, обладая выраженной иммуномодулирующей активностью, определяют уникальные иммунные сдвиги на местном и системном уровне, связанные с процессами адаптации [1, 2, 4, 36, 42, 44, 61, 68, 105, 148, 250, 256]. В условиях целостного организма катехоламины и глюкокорти-коиды проявляют выраженный синергизм, в основе которого могут лежать, с одной стороны, индуцированные глюкокортикоидами изменения экспрессии адренорецепторов и трансдукции с них сигнала в различных клетках-мишенях [110, 160, 175], а с другой - модуляция катехоламинами экспрессии глюкокортикоидных рецепторов [291]. Тем не менее, описано и ингибирование агонистами (3-адренорецепторов передачи сигнала через глюкокортикоидные рецепторы [94, 228, 285].

Функциональные последствия реализации взаимодействия глюко-кортикоидов и катехоламинов на уровне иммунной системы изучены недостаточно. Показано, что при введении крысам антагониста р-адренорецепторов пропранолола гидрохлорида отменяется супрессивное действие 6-часового иммобилизационного стресса на реакцию гиперчувствительности замедленного типа [267], развивается выраженная активация функций циркулирующего пула фагоцитирующих клеток [269]. Введение крысам или мышам р-адренергических блокаторов значительно нивелирует послеоперационную депрессию цитотоксической активности №С-клеток и снижает усиление метастазирования перевиваемых опухолей после экспериментальных оперативных вмешательств [154, 209], отменяет супрессию пролиферативного ответа лимфоцитов при хирургическом стрессе [227]. Введение пропранолола гидрохлорида значительно снижает степень выраженности иммуносупрессивного действия гидрокортизона в периоде индукции и эффекторную фазу локального иммунного ответа на антителообразование в регионарном лимфатическом узле и развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа, нивелирует индуцированные введением гидрокортизона в эффекторную фазу иммунного ответа изменения функций фагоцитирующих клеток [77, 78, 268]. Показано участие адренергической регуляции во взаимосвязи с глюкокортикоидами в развитии стрессорной супрессии пролиферативного ответа лимфоцитов на фитогемагглютинин в раннем травматическом периоде у пациентов с проникающим ранением глаза [74, 75].

В связи с тем что пропранолола гидрохлорид может частично проникать через гематоэнцефалический барьер [176, 235], представлялось целесообразным оценить иммуномодулирующее действие при стрессе антагониста ¡3-адренорецепторов периферического действия — соталола гидрохлорида. Ввиду комплексности нейроэндокринноиммунной регуляции в условиях целостного организма являлось необходимым сопоставление данных, полученных in vivo, с результатами моделирования взаимодействия адренергических соединений и глюкокортикоидов в иммуномодуля-ции в системе in vitro в культурах клеток практически здоровых людей.

Цель работы — исследование адренергической регуляции иммунной системы при стрессе и взаимодействия агонистов адренорецепторов с глюкокортикоидами в системе in vitro.

Задачи исследования

1. Изучить иммуномодулирующее действие антагониста (З-адрено-рецепторов соталола гидрохлорида при остром стрессе у крыс (24-часовая иммобилизация в сочетании с дозированной кровопотерей) в условиях развития локальной и системной форм иммунного ответа.

2. Оценить in vitro эффекты тербуталина сульфата на фагоцитарную активность нейтрофилов, моноцитов, эозинофилов интактных крыс и влияние адреналина гидрохлорида и гексопреналина сульфата на фагоцитарную активность нейтрофилов крыс в ранний период острого стресса и при блокаде p-адренорецепторов.

3. Исследовать взаимодействие глюкокортикоидов и агонистов (3-, аг и а2-адренорецепторов в системе in vitro в регуляции пролиферативного ответа лимфоцитов в культурах с Т- и В-клеточными митогенами и продукции иммуноглобулинов в культурах клеток практически здоровых людей-добровольцев с митогеном лаконоса.

Научная новизна. На основании комплексного иммунологического исследования с экспериментальным моделированием общего адаптационного синдрома в условиях блокады периферических Р-адренорецепторов in vivo и анализом взаимодействия агонистов адренорецепторов и глюко-кортикоидов в системе in vitro обоснована роль адренергической регуляции в изменении функций клеток иммунной системы при стрессе. Показано, что введение антагониста p-адренорецепторов периферического действия соталола гидрохлорида при остром стрессе, развивающемся при 24-часовой иммобилизации в сочетании с дозированной кровопотерей, отменяет супрессию антителогенеза в селезенке при системном иммунном ответе и депрессию реакции гиперчувствительности замедленного типа при развитии локальной и системной форм иммунного ответа. Острый стресс и соталола гидрохлорид не влияют на антителообразование в регионарном лимфатическом узле при локальном иммунном ответе. Установлено, что блокада периферических Р-адренорецепторов соталола гидрохлоридом in vivo отменяет угнетающий эффект в системе in vitro адреналина гидрохлорида и гексопреналина сульфата на фагоцитарную активность нейтрофилов в ранний период общего адаптационного синдрома. Показано, что выраженность супрессивного эффекта адреналина гидрохлорида и селективных агонистов р-, аг и сь-адренорецепторов и направленность их взаимодействия с глюкокортикоидами (усиление эффекта или антагонизм) в культурах с конканавалином А зависят от концентрации митогена, типа вовлекаемых в регуляцию стероидных адренало-вых и адренергических рецепторов. Установлено, что гидрокортизон, дексаметазона фосфат и адренергические агонисты статистически значимо не влияют на пролиферативный ответ лимфоцитов и продукцию иммуноглобулинов М и в в культурах с тимусзависимым поликлональным активатором В-лимфоцитов митогеном лаконоса.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты работы расширяют представление о роли адренергической регуляции в изменении функций клеток иммунной системы при стрессе, взаимодействии агонистов адренорецепторов и глюкокортикоидов в регуляции реакций неоиммунитета. Полученные данные необходимы для прогнозирования иммуномодулирующих эффектов адренергических соединений и глюкокортикоидов при их совместном применении в терапии, в том числе экстремальных состояний.

Результаты исследований используются в лекционных курсах «Иммунология», «Экспериментальные модели в патологии», «Иммунопатология», «Нейроэндокринная регуляция иммуногенеза» кафедры микробиологии и иммунологии ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» (614600, г. Пермь, ул. Букире-ва, 15), при чтении лекций и на практических занятиях на кафедре иммунологии ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. академика Е.А. Вагнера» Минздравсоцразвития РФ (614000, г. Пермь, ул. Петропавловская, 26).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Введение антагониста р-адренорецепторов периферического действия соталола гидрохлорида при остром стрессе, вызванном 24-часовой иммобилизацией в сочетании с дозированной кровопотерей, приводит к отмене супрессии антителогенеза в селезенке при системном иммунном ответе и угнетения реакции гиперчувствительности замедленного типа при моделировании локальной и системной форм иммунного ответа. Острый стресс и соталола гидрохлорид не влияют на антителообразование в регионарном лимфатическом узле при локальном иммунном ответе.

2. Селективный агонист Р-адренорецепторов тербуталина сульфат оказывает зависящий от концентрации агониста супрессивный эффект на

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АКТГ - адренокортикотропный гормон

АОК — антителообразующие клетки

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа

ЗС - забуференная среда

Кон А - конканавалин А

ЛПС - липополисахарид

ФГА - фитогемаглютинин

ФМА — форболмеристатацетат цАМФ - циклический 3', 5'-аденозинмонофосфат

ЯСК — ядросодержащие клетки

AF - активатор транскрипции (transcriptional activation function)

СВР - CREB связывающий белок (англ. CREB-binding protein)

CD - кластер дифференцировки (англ. cluster of differentiation) cPLA2 - цитоплазматическая фосфолипаза А2 (англ. cytoplasmic phospholi-pase А2)

CREB - связывающий цАМФ-отвечающий элемент (англ. cAMP-responseelement-binding protein) GILZ - глюкокортикоид-индуцированный протеин с лейциновой застежкой англ. glucocorticoid-induced leucine zipper protein) GM-CSF - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор англ. granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) GPCR семейство рецепторов, сцепленных с G белками (англ. G proteincoupled receptors)

GRE - глкжокортикоид-отвечающий элемент (англ. glucocorticoid response elements)

GRIP 1 - глюкокортикоид-рецептор взаимодействующий белок 1 (англ. glucocorticoid receptor-interacting protein-1) HAT - ацетилтрансфераза гистонов (англ. histone acetyltransferase) HEPES - 1^-2-гидроксиэтилпиперазин-М'-2-этансульфоновая кислота (англ. N-2~hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid) фагоцитарную активность лейкоцитов крыс, наиболее выраженный по отношению к нейтрофилам и моноцитам. Блокада периферических (3-адренорецепторов соталола гидрохлоридом in vivo отменяет угнетающий эффект в системе in vitro адреналина гидрохлорида и гексопреналина сульфата на фагоцитарную активность нейтрофилов в ранний период общего адаптационного синдрома.

3. Выраженность супрессивного эффекта адреналина гидрохлорида и селективных агонистов p-, ai- и а2-адренорецепторов в культурах с кон-канавалином А и направленность их взаимодействия с глюкокортикоида-ми в виде усиления эффекта или антагонизма зависят от концентрации митогена, типа вовлекаемых в регуляцию стероидных адреналовых и ад-ренергических рецепторов. Гидрокортизон, дексаметазона фосфат и адре-нергические агонисты статистически значимо не влияют на пролифера-тивный ответ лимфоцитов и продукцию иммуноглобулинов М и G в культурах с тимусзависимым поликлональным активатором В-лимфоцитов митогеном лаконоса.

Апробация работы и основные публикации. Основные положения работы были представлены на конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» Пермь, 1999; Объединенном иммунологическом форуме (IV Съезд иммунологов России, IX Конгресс РААКИ, IV Конференция РЦО, III Конференция rio иммунологии репродукции, XII Всероссийский форум «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»), Санкт-Петербург, 2008; VII Международной конференции «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет ICEP 2008», Пермь - Н. Новгород - Пермь, 2008.

По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них 4 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Диссертационная работа апробирована на расширенном заседании научной проблемной комиссии по клинической иммунологии, аллергологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (Пермь, 2011).

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 191 стр. машинописного текста, содержит 48 таблиц и 10 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 301 источник, из них 91 отечественный и 210 зарубежных.

ВЫВОДЫ

1. В условиях экспериментального моделирования общего адаптационного синдрома и блокады периферических Р-адренорецепторов in vivo, а также в результате исследования взаимодействия агонистов адре-норецепторов и глюкокортикоидов в системе in vitro обоснована роль ад-ренергической регуляции в изменении функций клеток иммунной системы при стрессе.

2. Установлено, что введение антагониста Р-адренорецепторов периферического действия соталола гидрохлорида при остром стрессе (24-часовая иммобилизация в сочетании с дозированной кровопотерей) приводит к отмене супрессии антителогенеза в селезенке при системном иммунном ответе и угнетения реакции гиперчувствительности замедленного типа при моделировании локальной и системной форм иммунного ответа. Острый стресс и соталола гидрохлорид не влияют на антителообра-зование в регионарном лимфатическом узле при локальном иммунном ответе.

3. Показано, что селективный агонист Р-адренорецепторов тербута-лина сульфат оказывает зависящий от концентрации агониста супрессивный эффект на фагоцитарную активность лейкоцитов крыс, более выраженный по отношению к нейтрофилам и моноцитам. Блокада периферических p-адренорецепторов соталола гидрохлоридом in vivo отменяет угнетающий эффект в системе in vitro адреналина гидрохлорида и гексо-преналина сульфата на фагоцитарную активность нейтрофилов в ранний период общего адаптационного синдрома.

4. Установлено, что выраженность супрессивного эффекта адреналина гидрохлорида и агонистов Р-, ар и аг-адренорецепторов в культурах с конканавалином А и направленность их взаимодействия с глюкокорти-коидами в виде усиления эффекта или антагонизма зависят от концентрации митогена, типа вовлекаемых в регуляцию стероидных адренало-вых и адренергических рецепторов.

5. Показано, что глюкокортикоиды и адренергические агонисты статистически значимо не влияют на пролиферативный ответ лимфоцитов и продукцию иммуноглобулинов М и О в культурах с тимусзависи-мым поликлональным активатором В-лимфоцитов митогеном лаконоса.